KR20160007792A

KR20160007792A - 바실러스 서브틸리스를 이용한 가축의 장관벽 보호 방법

Info

Publication number: KR20160007792A
Application number: KR1020140081005A
Authority: KR
Inventors: 윤철희; 박성무; 구민정; 한승현
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2014-06-30
Filing date: 2014-06-30
Publication date: 2016-01-21
Also published as: KR101707920B1

Abstract

본 발명은 열 처리된 바실러스 서브틸리스를 유효성분으로 함유하는, 데옥시니발레놀(deoxynivalenol)에 의한 장관벽 손상으로부터 가축 장관벽을 보호하기 위한 조성물 및 상기 조성물을 가축에게 경구 투여하여 데옥시니발레놀에 의한 장관벽 손상으로부터 가축 장관벽을 보호하는 방법에 관한 것으로, 돈육 농가의 경제적 손실을 예방할 수 있다.

Description

바실러스 서브틸리스를 이용한 가축의 장관벽 보호 방법{Method for protecting livestock intestinal barrier using Bacillus subtilis}

본 발명은 바실러스 서브틸리스를 이용한 가축의 장관벽 보호 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 열 처리된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 유효성분으로 함유하는, 데옥시니발레놀(deoxynivalenol)에 의한 장관벽 손상으로부터 가축 장관벽을 보호하기 위한 조성물 및 상기 조성물을 가축에게 경구 투여하는 단계를 포함하는 데옥시니발레놀에 의한 장관벽 손상으로부터 가축 장관벽을 보호하는 방법에 관한 것이다.

장관 상피세포는 영양분 흡수를 위한 필터 작용뿐 아니라 장관에 들어온 병원균과 독소 같은 외래 항원에 대한 방어 작용도 수행한다. 상기 장관 상피세포로부터 독소 및 해로운 항원의 확산을 막기 위해 장관 상피세포의 정단부에는 흡착 단백질 복합체로 구성된 밀착연접(tight junction)이 형성되어 있다. 독소와 같은 외부자극에 의해서 장관 상피세포가 손상되어질 경우에 밀착연접의 변경으로 투과성(permeability)이 높아지고 장벽(barrier)의 결합이 떨어진다. 이에 독소 및 해로운 항원이 장관 상피세포로 확산되는 것은 밀착연접 형서을 개선하여 장관벽을 보호하는 방법 중의 하나로 여겨진다.

붉은 곰팡이균은 벼, 보리, 밀 등에 병을 일으켜 작물의 수확 및 품질을 저하시키고, 데옥시니발레놀(deoxynivalenol; DON) 같은 트라이코쎄신 (trichothecene) 독소를 생성하여 가축에 위해요소로 작용하여 문제가 되고 있다. 특히 돼지는 데옥시니발레놀에 민감하여 상기 독소에 오염된 사료를 섭취하였을 때 생장 및 면역성의 저하로 인한 양돈 농가의 경제적 손실을 야기시킨다. 기존의 연구(Diesing 등, 2011, PLoS One. 6:e17472)에서는 데옥시니발레놀이 위장관에 부착하여 빠르게 흡수되며 돼지의 상피세포 내 밀착연접 단백질 발현을 방해한다고 보고하였다. 이에 상기 독소로부터 돼지의 장관을 보호하려는 방법을 개발할 필요성이 제기되어진다.

바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)는 그람양성 세균으로 토양과 수중 부생균으로 내생포자를 형성하는 특징을 가지는 생균제로 알려져 있다. 그러나 상기 세균이 가축 장관벽을 보호하는 기능을 하는지는 아직 확실히 알려진 바가 없다.

한국공개특허 제2008-0073771호에는 '위장관 및 면역-관련 질환의 예방 및 치료를 위한 바실루스 PB6의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1046001호에는 '돼지유행성 설사 또는 돼지전염성 위장염에 대한 항체를 지닌 난황을 함유하는 자돈 사료용 첨가물 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 바실러스 서브틸리스를 이용한 진균감염으로부터 가축 장관벽을 보호하는 조성물 또는 방법에 대해서는 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 열 처리된 바실러스 서브틸리스를 돼지 장관의 상피세포에 처리함으로써, 바실러스 서브틸리스가 데옥시니발레놀(deoxynivalenol)에 의한 장관벽 손상에 대한 보호 기능을 가진다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 열 처리된 바실러스 서브틸리스를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 진균감염으로부터 가축 장관벽을 보호하기 위한 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 열 처리된 바실러스 서브틸리스를 유효성분으로 함유하는 조성물을 가축에게 경구 투여하는 단계를 포함하는 진균감염으로부터 가축 장관벽을 보호하는 방법을 제공한다.

본 발명의 열 처리된 바실러스 서브틸리스를 유효성분으로 포함하는 조성물은 진균감염으로부터 돼지 장관벽을 보호함으로써, 돼지 생장 저하를 막을 수 있으며 더 나아가, 돈육 농가의 경제적 손실을 예방할 수 있다.

도 1은 바실러스 서브틸리스를 1 시간 처리한 돼지 장관 상피세포주인 IPEC-J2(intestinal porcine epithelial cells from jejunum) 내의 밀착연접 단백질들의 발현량을 웨스턴 블랏(A)과 면역세포화학법(B)으로 분석하여 나타낸 것이다[CON; 음성 대조구, LTA(lipoteichoic acid)-BS; 양성 대조구, BS(바실러스 서브틸리스); 실험구].
도 2는 바실러스 서브틸리스와 데옥시니발레놀을 처리한 돼지 장관 상피세포주인 IPEC-J2 내의 전기적 저항(transepithelial electrical resistance; TEER)을 시간별(0, 1, 24, 48시간) 측정하여 나타낸 것이다(DON; 데옥시니발레놀). TEER 수치는 평균±표준오차(n=3)로 표기하였다(*p<0.05, ***p<0.001).
도 3은 바실러스 서브틸리스와 데옥시니발레놀을 처리한 돼지 장관 상피세포주인 IPEC-J2 내의 밀착연접 단백질들의 발현량을 웨스턴 블랏(A-D)과 면역세포화학법(E)으로 분석하여 나타낸 것이다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 열 처리된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 유효성분으로 함유하는, 데옥시니발레놀(deoxynivalenol)에 의한 장관벽 손상으로부터 가축 장관벽을 보호하기 위한 조성물을 제공한다.

상기 진균은 데옥시니발레놀을 생성하는 붉은 곰팡이균으로, 일 예로 푸사리움 그래미네아룸(Fusarium graminearum) 또는 푸사리움 쿨모룸(F. culmorum)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 바실러스 서브틸리스는 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 HB3 (ATCC 55569)을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 열 처리된 바실러스 서브틸리스는

(1) 바실러스 서브틸리스를 배지에 접종한 후 배양하는 단계;

(2) 상기 단계 (1)에서 배양된 바실러스 서브틸리스를 수득하는 단계; 및

(3) 상기 단계 (2)에서 수득한 바실러스 서브틸리스를 열처리하는 단계를 포함하여 제조할 수 있다.

상기 단계 (1)에서 바실러스 서브틸리스는 공지의 배양 기술에 따라 적당한 온도에서 적당한 기간 동안 배양되며, 바람직하게는 20 내지 50℃에서 10시간 내지 4일간 배양하여 얻을 수 있다.

상기 단계 (2)에서 배양한 바실러스 서브틸시스는 공지의 수득 방법에 따라 수득하며, 바람직하게는 원심분리방법을 통해 상등액을 제거하고 펠렛을 회수하여 사용할 수 있다.

상기 단계 (3)에서 열처리는 바실러스 서브틸리스의 안정성을 갖게 하고, 보존기간(shelf-life)를 연장시켜 저장 또는 수송에 유리하게 하기 위한 것이다. 상기 열처리 온도는 70 내지 140℃에서 증자(steaming), 고압증기멸균(autoclave), 건열처리(dry heat) 방법으로 수행될 수 있고, 100 내지 130℃에서 수행되는 것이 바람직하다. 상기 열처리는 온도에 따라 다르지만 15분 내지 90분 동안 수행되는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 상기 바실러스 서브틸리스는 돼지 장관 상피세포의 투과성을 감소시킬 수 있다.

본 발명에 따른 상기 바실러스 서브틸리스는 돼지 장관 상피세포에서 클라우딘(claudin), 오클루딘(occludin), 또는 ZO-1(zonula occludens-1)을 포함하는 밀착연접(tight junction) 단백질의 발현을 증가시킬 수 있다. 바람직하게는 ZO-1의 발현을 증가시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 열 처리된 바실러스 서브틸리스를 유효성분으로 포함하는 조성물을 가축에게 경구 투여하는 단계를 포함하는, 진균감염으로부터 가축 장관벽을 보호하는 방법을 제공한다.

본 발명에서, 상기 가축은 돼지, 소, 말, 닭, 개 등일 수 있으며, 바람직하게는 돼지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물을 제조하기 위하여, 상기 바실러스 서브틸리스는 경구 투여용 제제의 형태로 사용될 수 있다. 직접 제제화하거나 사료용 원료와 함께 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있다. 상기 조성물은 돼지의 음용수 및 사료를 통해 투여할 수 있다. 바람직하게는 돼지의 사료를 통해 투여한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 세포 배양 및 바실러스 서브틸리스, LTA-BS, 또는 데옥시니발레놀 시료 준비

돼지 장관 상피세포주인 IPEC-J2(DSMZ, 독일)는 5% FBS, 1% ITS-X(insulin-transferrin-selenium-X), 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 5% CO₂가 포함된 37℃ 배양기에서 배양하였다.

바실러스 서브틸리스 HB3 (ATCC 55569)는 37℃에서 12시간동안 TS 한천배지(trypticase soy agar; BD Biosciences, 미국)에서 배양하여 단일 콜로니를 접종한 후 TS 액체배지에서 37℃, 15시간동안 배양하였다. 배양된 세균은 4000 g 로 15분동안 원심분리한 후 PBS로 2번 세척하였다. 120℃에서 30분간 열처리한 후, 실험에 1X10⁹ cfu/mL 농도로 사용하였다. 바실러스 서브틸리스가 가지는 구성요소인 LTA(lipoteichoic acid, Invivogen, 미국)-BS는 바실러스 서브틸리스의 양성 대조구로서, 10 ㎍/mL 농도로 세포에 동일 시간 사용하였다. 데옥시니발레놀(시그마, 미국)은 에탄올에 희석하여 2 ㎍/mL 농도로 실험에 사용하였다.

실시예 2. 바실러스 서브틸리스에 의한 돼지 장관 상피세포 내 ZO -1 및 오클루딘 발현량의 증가 확인

배양액(CON; 음성 대조구), 바실러스 서브틸리스(BS; 실험구) 또는 LTA(LTA-BS; 양성 대조구)로 각각 1시간동안 처리한 IPEC-J2 세포 내의 밀착연접 단백질 발현량을 비교분석하기 위하여 웨스턴 블랏(도 1A)으로 ZO-1, 오클루딘 및 클라우딘-3의 발현량을 측정하였다. 각기 처리를 완료한 세포는 하기와 같이 웨스턴 블랏을 수행하였다. 수확한 세포는 용해 완충액(20 mM 트리스-염산, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% 트립톤 X-100)으로 용해한 후 총 단백질량을 측정하여 동량의 단백질 추출물을 10% 트리스-글라이신 폴리아크릴아마이드젤에 로딩하여 전기영동 후 PVDF 막으로 옮겼다. 막은 5% 탈지분유가 포함된 TBS-T 용액으로 90분 동안 4℃에서 블로킹하였다. 5% 탈지분유가 포함된 TBS-T(20 mM 트리스-염산, 100 mM NaCl, 0.05% 트윈 20)에 1차 항체(토끼 항-클라우딘-3 항체, 항-오클루딘 항체, 항-ZO-1 항체 또는 마우스 항-β-액틴 항체)를 밤새 반응시키고 2차 항체를 1:10000으로 희석하여 첨가한 후 1시간 동안 반응시켰다. ECL 용액(Enhanced Chemiluminescent solution; GE Healthcare, 미국)을 첨가하였고, ChemiDoc XRS(Bio-rad, 미국)으로 분석하여 결과를 얻었다. 블로팅 강도는 MultiGauge 소프트웨어(후지필름, 일본)을 사용하여 정량화하였다. 도 1A에서 보이는 바와 같이 ZO-1 및 오클루딘은 대조구에 비해 상향조절되었다.

면역세포화학법(도 1B)으로 세포 내 밀착연접 단백질의 발현분포를 조사하였다. 배양액(CON; 음성 대조구), 바실러스 서브틸리스(BS; 실험구) 또는 LTA(LTA-BS; 양성 대조구)로 각각 처리한 IPEC-J2 세포를 PBS로 세척한 후, 4% 파라포름알데하이드로 37℃에서 20분간 고정시켰고, 10% FBS가 들어있는 블로킹 완충액으로 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 1차 항체(토끼 항-오클루딘 항체, 항-ZO-1 항체)를 블로킹 완충액에 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후 2차 항체 (염소 항-토끼 IgG-Alexa fluor 488; BD biosciences, 미국)를 첨가하여 반응시켰다. 핵을 염색하기 위해 DAPI를 사용하였다. 해당 단백질의 세포 내 분포는 공초점 레이저 스캔 현미경 LSM700(Carl Zeiss, 독일)으로 분석하였다. 공초점 현미경 관찰결과는 세포 내 ZO-1 및 오클루딘 발현이 증가함을 확인하였다(도 1B). 특히 바실러스 서브틸리스에 처리한 세포에서는 ZO-1이 세포의 바깥 경계선을 형성함을 관찰하였다.

실시예 3. 바실러스 서브틸리스에 의한 돼지 장관 상피세포의 투과성 변화 확인

데옥시니발레놀이 세포생장율에 미치는 효과를 조사한 결과 48시간동안 2 ㎍/mL로 첨가하였을 경우 세포 손상을 유도할 뿐 죽음을 유도하지는 않음을 확인하였다. 바실러스 서브틸리스의 세포 내 투과성(permeability)에 미치는 효과를 알아보기 위해 전기적 저항성(TEER) 실험을 수행하였다. 상기 전기적 저항성(TEER) 실험은 상피 볼트옴 미터(epithelial voltohm meter; World precision instruments, 미국)를 사용하여 상피세포의 정단면과 기저면 사이의 통합성 변화를 조사하는 방법이다. 각 TEER 수치에서 배양액에서의 TEER 수치를 값을 빼서 정규화하였다. 도 2에서 보는 바와 같이 아무 처리를 하지 않은 세포에 비해 바실러스 서브틸리스(BS)를 처리한 세포의 TEER 수치가 증가하였다. 또한 바실러스 서브틸리스는 데옥시니발레놀(DON)로 처리된 세포의 TEER 수치를 증가시켰으므로, 세포의 투과성을 감소시킴을 알 수 있었다.

실시예 4. 바실러스 서브틸리스를 처리하여 데옥시니발레놀에 의해 손상된 돼지 장관 상피세포 내 ZO -1 발현량의 증가 확인

바실러스 서브틸리스에 1시간 전처리 후 데옥시니발레놀에 48시간 반응시킨 돼지 장관 상피세포의 세포 내 밀착연접 단백질인 ZO-1, 오클루딘 및 클라우딘-3의 발현을 조사하기 위하여 상기 실시예 2와 동일한 분석 방법을 수행하였다. 데옥시니발레놀 없이 바실러스 서브틸리스를 처리한 세포에서는 대조구와 달리 ZO-1(도 3A, B) 및 클라우딘-3(도 3A, D)이 증가하였고, 데옥시니발레놀 처리구 세포에서는 ZO-1 단백질이 증가하였다(도 3A, B). 특히 바실러스 서브틸리스 전처리시 ZO-1 단백질은 다른 단백질에 비해 현저히 증가량이 많았으며, 도 2E에서 보이는 TEER 수치가 높다는 점과 더불어 도 3에서는 밀착연접 단백질의 세포 바깥 경계선 형성을 보여주고 있다는 점이 ZO-1을 매개로 한 돼지 장관벽 보호기능을 제시하였다. 따라서 바실러스 서브틸리스가 데옥시니발레놀에 의한 장관벽 손상에 대한 보호 기능을 가짐을 확인하였다.

Claims

열 처리된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 유효성분으로 함유하는, 데옥시니발레놀(deoxynivalenol)에 의한 장관벽 손상으로부터 가축 장관벽을 보호하기 위한 조성물.
제1항에 있어서, 상기 열 처리는 바실러스 서브틸리스 배양액을 100~130℃에서 15~90분 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 데옥시니발레놀은 데옥시니발레놀 생성 붉은 곰팡이균으로부터 생성되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제3항에 있어서, 상기 데옥시니발레놀 생성 붉은 곰팡이균은 푸사리움 그래미네아룸(Fusarium graminearum) 또는 푸사리움 쿨모룸(Fusarium culmorum)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 바실러스 서브틸리스는 돼지 장관 상피세포의 투과성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 바실러스 서브틸리스는 돼지 장관 상피세포에서 밀착연접(tight junction) 단백질의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제6항에 있어서, 상기 밀착연접 단백질은 ZO(zonula occludens)-1인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 가축은 돼지인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 가축에게 경구 투여하는 단계를 포함하는, 데옥시니발레놀(deoxynivalenol)에 의한 장관벽 손상으로부터 가축 장관벽을 보호하는 방법.