KR20150139855A - 개별화된 고순도 간세포 암종 줄기세포, 방법 및 그의 용도 - Google Patents

개별화된 고순도 간세포 암종 줄기세포, 방법 및 그의 용도 Download PDF

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가브리엘 니스토르
크레이그 티. 프레데릭슨
앤드류 콘포스
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네오스템 온콜로지, 엘엘씨
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Abstract

개시내용은 암, 예컨대 간세포 암종(HCC)에 대한 면역 반응을 자극하기 위하여 사용되는 암 줄기 세포를 제공한다. 암 줄기세포를 제조하고 정제하는 방법이 제공된다.

Description

개별화된 고순도 간세포 암종 줄기세포, 방법 및 그의 용도{INDIVIDUALIZED HIGH PURITY HEPATOCELLULAR CARCINOMA STEM CELLS, METHODS AND USE OF THE SAME}
관련 출원들에 대한 교차참조
본원은 2013년 3월 7일에 출원된 미국 임시특허 출원 제61/774,517호에 대한 이점을 35 U.S.C. §119(e) 하에 주장한다. 본원은 또한 2013년 8월 6일에 출원된 국제 출원 PCT/US2013/053850의 일부 계속이며, 이는 2012년 8월 15일에 출원된 미국 임시특허 출원 제61/683,477호 및 2012년 10월 25일자로 출원된 제61/718,643호에 대한 이점을 35 U.S.C. §119(e) 하에 주장한다. 이들 모두의 전체 내용은 본원에서 참고로 편입된다.
개시내용의 분야
본 개시내용은 간세포 암종 줄기세포, 그것으로부터 유도된 면역원성 조성물 및 제조 방법 및 그의 용도에 관한 것이다.
고형 종양에서, 작은 백분율의 세포는 모계 종양과 동일한 조직학적 이종성의 종양을 개시하는 수용력을 갖는다. 이들 세포는 암 줄기세포로 칭해지고 또한 종양-개시 세포 또는 암-개시 세포로 공지된다. 암 줄기세포는 특성의 클러스터에 의해 정의될 수 있다. 첫번째, 그것은 자체를 갱신하는 수용력을 갖는다. 두번째, 그것은 이식될 때 새로운 종양을 확립시킬 수 있다. 세번째, 그것은 휴면기 또는 서서히 주기화하는(세포 주기) 종양 세포로 특징이 있을 수 있다. 네번째, 그것은 화학요법 또는 방사선 요법에 대한 종양의 내성에 책임이 있을 수 있다. 다섯번째, 그것은 갱신하고, 더 분화된 선조 세포를 야기하는 그것의 능력을 유지하는 특이한 미세 환경에 의존하며, 환경은 암 줄기세포의 미분화된 상태를 유지한다. 이러한 미세환경은 간엽 줄기세포, 조직-연관된 섬유아세포, 및 내피 세포를 포함할 수 있다. 시험관내 배양으로 스페로이드를 형성하는 능력은 암 줄기세포로 특정한 세포의 확인에 기여할 수 있는 또 하나의 특징이다. 암 줄기세포의 하나의 비제한적인 정의는 모계 종양의 전체 이종성을 재생하고 다중 추이 후에도 연속적으로 성장할 수 있는 세포이다.
특이 암 줄기세포 집단은 신생물의 기원일 수 있고 치료되었던 암의 재발의 공급원일 수 있다. 또한, 조직 내의 암 줄기세포의 하위집단은 어떤 신호에 노출될 때, 성장 사이클을 재시작하고 종양을 재설정할 수 있는 세포를 생성할 수 있다. 암 줄기세포 틈새는 적절한 신호전달이 증식 사이클에서 재-진입을 촉발시킬 때까지 휴면기이다. 재-진입 신호는 국부 이벤트 예컨대 트라우마, 세포 손상, 미생물 공격(바이러스, 박테리아 또는 진균)에서 비롯하거나, 국부 성장 인자, 사이토카인 또는 세포간 연락에 의해 매개될 수 있다. 또한, 호르몬은 조직-특이 틈새 내의 줄기세포를 조정할 수 있다. 줄기세포 틈새의 결함 또는 돌연변이는 상기 기능의 작은 변화를 야기할 수 있다. 신생물은 그러한 작은 변화에서 기인할 수 있고, 이들은 세포 주기에 걸쳐 대조군에 영향을 미치는 랜덤 돌연변이를 포함한다. 암을 초래하는 돌연변이는 개인마다 변화한다. 그와 같은 가변성은 상이한 유형의 암, 예컨대 간암 대 흑색종 사이뿐만 아니라, 한 유형의 암으로 고생하는 사람들, 예컨대 한명의 유방암 환자 대 또 한명의 유방암 환자 사이에서 관측된다.
암에 대해 개발되고 있는 요법은 자가조직 면역 반응을 수반하는 접근법을 포함한다. 이들 접근법은 백신 벡터로 분해되고 제형화되는 새로 수확된 자가조직 종양 세포의 사용을 포함한다. 또 하나의 접근법은 수지상 세포 백신이며, 수지상 세포는 자가조직 종양 용해물로 펄스화된다. 또 하나의 접근법은 갈락토오스 폴리머를 갖는 환자의 종양 세포의 시험관내 변형이고, 변형된 종양 세포를 다시 환자로 주입하는 것이며, 갈락토오스-태그된 종양 세포는 항원-제시 세포(APC)에 의해 더 쉽게 차지되며, 이로써 항종양 반응을 증가시킨다. 자가조직 면역 요법을 수반하는 이들 접근법의 약점은 벌크 종양, 또는 벌크 종양 항원이 면역 자극제로 사용될 때 낮은 항원성 신호 대 잡음비이다. 대다수의 종양 세포는 정상 세포 예컨대 혈관 구성요소, 결합 조직, 분화된 종양 세포, 비-생존가능 및 괴저성 세포, 및 정상 숙주 조직과 상당히 분화되고 혼합된다. 암 줄기세포는 단지 종양 벌크의 작은 분획, 때때로 더 공격성 종양에서 최대 4%, 가장 통상적으로 1% 미만을 표현한다. 따라서 벌크 종양이 항원 공급원으로 사용될 때, 면역 반응은 줄기세포가 종양의 재발 또는 전이를 야기시키는 공격 및 가능성을 피하는 것을 허용하기 위해 더 분화된 세포에 대해 지향된다.
또 하나의 새로운 요법은 암에서 더 풍부하게 발현되는 정상 항원에 대한 단일 표적 항체이다. 특이적 항원-표적화된 요법(예컨대 항-CD133, 항-EpCAM, 항-CD44, 항-CD13, 등)은 비-차별적이고 암 세포와 함께 정상 세포에 영향을 미쳐, 환자에게 엄청난 역효과를 야기한다.
요약
간세포 암종(HCC) 암 줄기세포(CSC), HCC-CSC 세포주, 및 간세포 암종의 치료 동안 HCC-CSC-로딩된 수지상 세포를 포함하는 면역원성 조성물이 본원에서 개시된다.
특이적으로, 간세포 암종(HCC) 암 줄기세포(CSC)의 집단을 제조하는 방법이 본원에서 제공되며, 상기 방법은 HCC의 샘플을 수득하는 단계; 샘플의 세포를 해리하는 단계, 및 비-부착성 기질 상의 제한 배지에서 해리된 세포를 시험관내 배양하는 단계를 포함하며, 상기 제한 배지는 무혈청이고 미토겐 활성화된 단백질 키나아제(MAPK) 경로를 통해 작용하는 적어도 하나의 성장 인자로 보강되며, 이로써 HCC-CSC 스페로이드를 형성하고; HCC-CSC 스페로이드 집단 내의 세포의 적어도 약 80%는 바이오마커 알파 태아단백(AFP), EpCAM, Ov1, 및 OV6 중 2 이상을 발현한다. 또 하나의 구현예에서, HCC-CSC 스페로이드 집단 내의 세포의 적어도 약 80%는 바이오마커 CK7, CK19, 및 E-카드헤린 중 1 이상을 추가로 발현한다. 또 하나의 구현예에서, HCC-CSC 스페로이드 집단 내의 세포의 적어도 약 90%는 바이오마커 AFP, EpCAM, Ov1, 및 OV6 중 2 이상을 발현한다.
또 하나의 구현예에서, 방법은 부착성 기질 상의 제한 배지에서 HCC-CSC 스페로이드를 배양하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 제한 배지는 무혈청이고 MAPK 경로를 통해 작용하는 적어도 하나의 성장 인자로 보강되며, 이로써 초기 HCC-CSC의 집단을 형성하고, 초기 HCC-CSC 집단 내의 세포의 적어도 약 80%는 바이오마커 Nanog, Sox2, Oct3/4, 및 c-키트 중 2 이상을 발현한다. 또 하나의 구현예에서, 초기 HCC-CSC 집단 내의 세포의 적어도 약 80%는 바이오마커 EpCAM, E-카드헤린, Sox 7, Sox 17, Fox2A, Ov1, OV6, CD133, 및 CD90 중 1 이상을 추가로 발현한다. 또 하나의 구현예에서, 초기 HCC-CSC 집단 내의 세포의 적어도 약 90%는 바이오마커 Nanog, Sox2, Oct3/4, 및 c-키트 중 2 이상을 발현한다.
또 하나의 구현예에서, 방법은 부착성 기질 상의 제한 배지에서 HCC-CSC 스페로이드를 배양하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 제한 배지는 혈청을 함유하고 MAPK 경로를 통해 작용하는 적어도 하나의 성장 인자로 보강되며, 이로써 혼합된 HCC-CSC의 집단을 형성하고, 혼합된 HCC-CSC 집단 내의 세포의 적어도 약 80%는 바이오마커 AFP, CK7, CK19, EpCAM, E-카드헤린, Nanog, FoxA2 HNF4a, 및 ABCG2 중 2 이상을 발현한다. 또 하나의 구현예에서, 혼합된 HCC-CSC 집단 내의 세포의 적어도 약 90%는 바이오마커 AFP, CK7, CK19, EpCAM, E-카드헤린, Nanog, FoxA2 HNF4a, 및 ABCG2 중 2 이상을 발현한다.
또 하나의 구현예에서, 방법은 부착성 기질 상의 제한 배지에서 HCC-CSC 스페로이드를 배양하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 제한 배지는 혈청 공급원을 함유하고 MAPK 경로를 통해 작용하는 적어도 하나의 성장 인자로 보강되며, 이로써 배아-간엽 전이된(EMT)-HCC-CSC의 집단을 형성하고, EMT-HCC-CSC 집단 내의 세포의 적어도 약 80%는 바이오마커 NCAM, 슬러그/스네일(Slug/Snail), 및 트위스트(Twist) 중 2 이상을 발현한다. 또 하나의 구현예에서, EMT-HCC-CSC 집단 내의 세포의 적어도 약 80%는 바이오마커 AFP, N-카드헤린, CD44, 및 비멘틴 중 1 이상을 추가로 발현한다. 또 하나의 구현예에서, EMT-HCC-CSC 집단 내의 세포의 적어도 약 90%는 바이오마커 NCAM, 슬러그/스네일, 및 트위스트 중 1 이상을 발현한다.
또 하나의 구현예에서, 방법은 부착성 기질 상의 제한 배지에서 HCC-CSC 스페로이드, 혼합된 HCC-CSC, 또는 EMT-HCC-CSC를 배양하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 제한 배지는 무혈청이고 MAPK 경로를 통해 작용하는 적어도 하나의 성장 인자로 보강되며, 이로써 초기 HCC-CSC의 집단을 형성하고, 초기 HCC-CSC 집단 내의 세포의 적어도 약 80%는 바이오마커 Nanog, Sox2, Oct3/4, 및 c-키트 중 2 이상을 발현한다. 또 하나의 구현예에서, 초기 HCC-CSC 집단 내의 세포의 적어도 약 80%는 바이오마커 CK7, CK19, 및 E-카드헤린 중 1 이상을 추가로 발현한다. 또 하나의 구현예에서, 초기 HCC-CSC 집단 내의 세포의 적어도 약 90%는 바이오마커 Nanog, Sox2, Oct3/4, 및 c-키트 중 1 이상을 발현한다.
또 하나의 구현예에서, 방법은 부착성 기질 상의 제한 배지에서 HCC-CSC 스페로이드, 초기 HCC-CSC, 또는 EMT-HCC-CSC를 배양하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 제한 배지는 혈청 공급원을 함유하고 MAPK 경로를 통해 작용하는 적어도 하나의 성장 인자로 보강되며, 이로써 혼합된 HCC-CSC의 집단을 형성하고, 혼합된 HCC-CSC 집단 내의 세포의 적어도 약 80%는 바이오마커 AFP, CK7, CK19, EpCAM, E-카드헤린, Nanog, FoxA2 HNF4a, 및 ABCG2 중 2 이상을 발현한다. 또 하나의 구현예에서, 혼합된 HCC-CSC 집단 내의 세포의 적어도 약 90%는 바이오마커 AFP, CK7, CK19, EpCAM, E-카드헤린, Nanog, FoxA2 HNF4a, 및 ABCG2 중 2 이상을 발현한다.
또 하나의 구현예에서, 방법은 부착성 기질 상의 제한 배지에서 HCC-CSC 스페로이드, 초기 HCC-CSC, 또는 혼합된 HCC-CSC를 배양하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 제한 배지는 혈청 공급원을 함유하고 MAPK 경로를 통해 작용하는 적어도 하나의 성장 인자로 보강되며, 이로써 EMT-HCC-CSC의 집단을 형성하고, EMT-HCC-CSC 집단 내의 세포의 적어도 약 80%는 바이오마커 NCAM, 슬러그/스네일, 및 트위스트 중 2 이상을 발현한다. 또 하나의 구현예에서, EMT-HCC-CSC 집단 내의 세포의 적어도 약 80%는 바이오마커 AFP, N-카드헤린, CD44, 및 비멘틴 중 1 이상을 추가로 발현한다. 또 하나의 구현예에서, EMT-HCC-CSC 집단 내의 세포의 적어도 약 90%는 바이오마커 NCAM, 슬러그/스네일, 및 트위스트 중 1 이상을 발현한다.
일 구현예에서, 제한 배지는 표 2에 기재된 임의의 배지, 표 2 및 표 3의 조합으로부터의 임의의 배지, 표 2, 표 3, 및 표 4의 조합으로부터의 임의의 배지, 또는 표 2 및 표 4의 조합으로부터의 임의의 배치이다.
일 구현예에서, 성장 인자는 섬유아세포 성장 인자(FGF), 상피 성장 인자(EGF), 또는 액티빈 A 중 1 이상이다. 또 하나의 구현예에서, FGF는 염기성 FGF(bFGF)이다. 또 하나의 구현예에서, 제한 배지는 액티빈 A로 보강되지 않는다. 또 하나의 구현예에서, 제한 배지는 HCC 줄기세포의 자발적인 분화를 방지하는데 효과적인 양으로, 액티빈 A의 작용제로 보강된다. 또 하나의 구현예에서, 액티빈 A의 길항제는 액티빈 A에 특이적으로 결합하는 폴리스타틴 또는 항체이다.
또 하나의 구현예에서, 배지는 항산화제로 보강되지 않는다. 또 하나의 구현예에서, 항산화제는 수퍼옥사이드 디스무타제, 카탈라제, 글루타티온, 푸트레신, 또는 β-머캅토에탄올이다. 또 하나의 구현예에서, 제한 배지는 글루타티온으로 보강된다.
또 하나의 구현예에서, 부착성 기질은 부착 의존성 세포, 예컨대 섬유아세포에 부착하고, 그것을 수집하도록 구성된다. 또 하나의 구현예에서, 비-부착성 기질은 초저 부착성 폴리스티렌 표면이다. 또 하나의 구현예에서, 부착성 기질은 RGD 트리펩타이드 모티프가 풍부한 단백질로 코팅된 표면을 포함한다.
또한 본원에서 개시된 방법 중 어느 것에 의해 제조되는 정제된 HCC-CSC 세포의 집단이 본원에서 제공된다. 특정 구현예에서, 정제된 HCC-CSC 세포는 HCC-CSC 스페로이드, 초기 HCC-CSC, 혼합된 HCC-CSC, 또는 EMT-HCC-CSC이다.
또한 본원에서 개시된 방법 중 어느 것에 대한 방법에 의해 제조되는 HCC-CSC 세포주가 본원에서 제공된다. 특정 구현예에서, 정제된 HCC-CSC 세포는 HCC-CSC 스페로이드, 초기 HCC-CSC, 혼합된 HCC-CSC, 또는 EMT-HCC-CSC이다.
일 구현예에서, 본원에서 개시되는 정제된 HCC-CSC 세포 또는 HCC-CSC 세포주로부터 유도되는 종양 항원에 의해 생체외 활성화된 수지상 세포를 포함하는 면역원성 조성물이 본원에서 제공된다. 또 하나의 구현예에서, 종양 항원은 정제된 HCC-CSC 세포 또는 HCC-CSC 세포주의 세포 추출물을 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 종양 항원은 정제된 HCC-CSC 세포 또는 HCC-CSC 세포주의 용해물을 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 종양 항원은 HCC-CSC 세포주로부터의 무손상 정제된 HCC-CSC 세포 또는 무손상 세포를 포함한다.
또 하나의 구현예에서, 무손상 HCC-CSC 세포는 비-증식성으로 제공된다. 또 하나의 구현예에서, 무손상 세포는 조사에 의해 비-증식성으로 제공된다. 또 하나의 구현예에서, 무손상 세포는 핵 가교결합제에 대한 세포의 노출에 의해 비-증식성으로 제공된다.
또 하나의 구현예에서, 면역원성 조성물은 추가로, 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 면역원성 조성물은 추가로, 보조제를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 보조제는 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자이다.
또 하나의 구현예에서, 면역원성 조성물은 수지상 세포 및 HCC-CSC 세포를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 정제된 HCC-CSC 세포 또는 HCC-CSC 세포주는 HCC-CSC 스페로이드, 초기 HCC-CSC, 혼합된 HCC-CSC, 또는 EMT-HCC-CSC의 형태이다.
또한 간세포 암종을 그것을 필요로 하는 대상체에서 치료하는 방법이 제공되며, 방법은 상기 대상체에 본원에서 개시된 면역원성 조성물의 투여를 포함한다. 일 구현예에서, 면역원성 조성물은 복수의 용량으로 투여되며, 각각의 용량은 약 5-20x106 세포를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 용량은 약 10x106 세포를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 용량은 2-5 용량에 대해 매주, 그 다음 3-6 용량에 대해 매달 투여된다. 또 하나의 구현예에서, 상기 대상체는 면역원성 조성물의 6-10 용량으로부터 수용한다.
또한 면역 반응을 간세포 암종에 대해 그것을 필요로 하는 대상체에서 자극하는 방법이 제공되며, 방법은 상기 대상체에 본원에서 개시된 면역원성 조성물, 본원에서 개시된 HCC-CSC, 또는 본원에서 개시된 HCC-CSC 세포주의 투여를 포함한다.
또한 간세포 암종의 치료 동안 본원에서 개시된 면역원성 조성물, 본원에서 개시된 HCC-CSC, 또는 본원에서 개시된 HCC-CSC 세포주의 용도가 제공된다.
또한 간세포 암종의 치료 동안 본원에서 개시된 면역원성 조성물, 본원에서 개시된 HCC-CSC, 또는 본원에서 개시된 HCC-CSC 세포주의 용도가 제공된다.
도 1은 절제된 종양(솔리드 박스 및 화살표)으로부터 또는 작은 샘플 예컨대 바늘 생검(대시기호로 된 박스 및 화살표)으로부터 스페로이드로 간세포 암종(HCC) 줄기세포(HCC-CSC)의 증식 및 수확을 단리하는 방법의 흐름도이다. 스페로이드의 발생 후에, HCC-CSC 하위집단을 생성하는 경로는 공통의 경로이다.
도 2는 스테로이드의 도식적 묘사이다.
도 3a 및 도 3b는 다양한 형상 및 크기의 스페로이드를 도시한다.
도 4는 증식 단계에서 HCC 줄기세포를 도시한다.
도 5는 초-저 부착성 기질에 부착되는 세포를 도시한다.
도 6은 액티빈 A에 비민감성인 HCC 줄기세포를 도시한다. 이들 세포는 밀착 콜로니에서 성장하고 정상 숙주 조직(섬유아세포)에 의해 둘러싸여진다. 더 분화된 종양 세포는 액티빈 A의 존재에 의해 제거된다.
도 7은 줄기세포에 특징적인 밀착 클로니에서 성장하는 액티빈 A에 대한 노출에 의해 선택된 HCC 줄기세포를 도시한다.
도 8은 작은, 자가-재생 세포를 함유하는 배아 줄기세포-유사 콜로니를 갖는 농축된 HCC 배양을 도시한다.
도 9는 부착성 기질 상에 평탄 배양한 후에 7일 동안, HCC 종양으로부터 바늘 생검의 효소에 의한 해리에서 기인하는 세포를 도시한다(위상 콘트라스트 10x).
도 10은 도 9의 세포의 성장의 14-21 일 후의 전형적인 밀한 콜로니 형성을 도시한다(위상 콘트라스트 10x).
도 11은 다중 추이 후의 확립된, 높은 증식성 HCC 줄기세포주를 도시한다(위상 콘트라스트 10x).
도 12a는 HCC 동일성을 확인하는, 핵 대조염색(비스벤지마이드)을 갖는 알파 태아단백(AFP)에 대한 HCC 세포주 염색 양성을 도시한다(표면형광, 20x). 도 12b는 AFP 염색에 대한 레드 채널 이미지에서 도 12a의 세포를 도시한다. 도 12c는 비스벤지마이드에 대한 블루 채널 이미지를 도시한다.
도 13a는 확립된 배양(핵 대조염색, 비스벤지마이드를 포함함)에서 초기 암 조상세포 표현형 선택을 확인하는, 신경 세포 접합 부착(NCAM) 염색의 높은 백분율을 갖는 세포를 도시한다(표면형광, 40x). 도 13b는 NCAM 염색에 대한 레드 채널 이미지에서 도 13a의 세포를 도시한다. 도 13c는 비스벤지마이드에 대한 블루 채널 이미지를 도시한다.
도 14a는 높은 전이성 잠재력을 갖는 암 줄기세포에 특이적인, CD44, 침습력의 마커에 대한 HCC 세포주 표지된 양성을 도시한다. 세포는 또한 핵 대조염색, 비스벤지마이드로 염색된다(표면형광, 40x). 도 14b는 CD44 염색에 대한 그린 채널 이미지에서 도 14a의 세포를 도시한다. 도 13c는 비스벤지마이드에 대한 블루 채널 이미지를 도시한다.
도 15a는 비스벤지마이드 핵 대조염색에서, EMT-HCC-CSC 세포주 내의 상피-간엽 전이 마커 비멘틴 및 슬러그/스네일을 도시한다. 도 15b는 슬러그/스네일 염색에 대한 레드 채널 이미지에서 도 15a의 세포를 도시한다. 도 15c는 비멘틴에 대한 그린 채널 이미지에서 도 15a의 세포를 도시한다. 도 15d는 비스벤지마이드에 대한 블루 채널 이미지를 도시한다.
본 개시내용은 고순도 암 줄기세포로 주로 구성되는 인간 간세포 암종(HCC) 종양으로부터 수득된 세포 집단을 제공한다. 구현예에서, 세포 집단의 순도는 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 암 줄기세포이다. 이들 암 줄기세포는 간세포 암종 조상세포이고 연속적 자가-재생 및 분화의 수용력을 어떤 수준으로 갖는다. 개시내용은 또한 암의 자가조직 면역 요법을 위한 항원 공급원으로서의 추가 사용을 위해, HCC-유도된 줄기세포의 정제된 집단을 생성하는 방법에 관한 것이다.
테스팅 및 스크리닝 구현예가 또한 포함된다. 본 개시내용은 개인화된 의약의 제형을 제공하는 독특한 변화를 확인하기 위해 유전적 분석을 위한 고순도 HCC 줄기세포 집단을 사용한다. 본 개시내용은 시험관내에서 변형되는 신규 세포주를 제공하며, 이러한 변형은 HCC의 면역 자극 특성을 증대시킨다. HCC 세포주는 그것이 우수한 항원성 신호 대 잡음비를 제공하므로, 조 종양 제제를 사용하는 유사한 기술에 대한 개선이다. 세포주는 오염물질 세포 집단, 예컨대 섬유아세포가 없으며, 그것은 시험관내 적용을 변경하거나 줄일 수 있다. 본 개시내용의 예시적인 세포주는 또한 HCC를 치료하는 약물의 제조를 위해 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 1 이상의 암 세포로부터 유도된 펩타이드의 맥락에서의 용어 “로부터 유도된”은 암 세포 또는 암 세포의 집단으로부터 펩타이드를 수득하는 임의의 방법을 포함한다. 암 세포는 예를 들면 균질기 또는 삼투 파열에 의해 파괴될 수 있어, 조 추출액을 야기한다. 조 추출액의 펩타이드, 올리고펩타이드, 및 폴리펩타이드는 수지상 세포에 노출되며, 그 다음 수지상 세포에 의한 펩타이드의 가공이 이어질 수 있다. 용어 “로부터 유도된”은 또한 무손상 암 세포를 포함하며, 암 세포는 살아 있거나, 암 세포는 조사로 치료되었지만 여전히 대사적으로 활성이거나, 암 세포는 핵산 가교결합제로 치료되었지만 여전히 대사작용으로 활성이고 따라서 여전히 펩타이드를 포함한다. “로부터 유도된”은 또한 암 세포 잔해, 암없는 세포 단백질, 및 조사된 암 세포의 혼합물을 포함하며, 그것은 따라서 암 세포로부터 유도된다.
"투여"는 그것이 인간, 포유동물, 포유동물 대상체, 동물, 수의적 대상체, 위약 대상체, 조사 대상체, 실험적인 대상체, 세포, 조직, 장기, 또는 생체액에 적용함에 따라, 상기 대상체, 세포, 조직, 장기, 또는 생체액 등에 외인성 리간드, 시약, 위약, 소분자, 약제, 치료제, 진단제, 또는 조성물의 접촉을 비제한적으로 언급한다. "투여"는 예를 들면 치료제, 약력학, 진단, 조사, 위약, 및 실험적인 방법을 언급할 수 있다. 투여는 인간 또는 동물 대상체의 생체내 치료를 언급할 수 있다. 세포의 치료는 유체에 시약의 접촉뿐만 아니라, 세포에 시약의 접촉을 포함하며, 유체는 세포와 접촉한다. "투여"는 또한 예를 들면 시약, 진단, 결합 조성물에 의해, 또는 또 하나의 세포에 의해, 세포의 시험관내 및 생체외 치료를 포함한다.
"효과적인 양"은 비제한적으로, 의료 병태 또는 장애의 적어도 하나의 증상 또는 징후를 개선하거나, 반전시키거나, 완화시키는, 방지하거나, 진단하는 양을 포함한다. 다르게, 명백하게 또는 맥락에 의해 지시되지 않으면, "효과적인 양”은 원하는 결과를 달성하기에 충분한 최소 양을 제한하고 원하는 결과를 달성하기에 충분한 최적의 양에 제한되지 않는다.
질환 또는 장애를 방지하거나, 치료하거나, 환화시키는 치료의 능력(원하는 결과를 달성함)뿐만 아니라, 질환 또는 장애의 중증도는 임의의 한계를 암시하는 것 없이, 바이오마커에 의해 또는 임상 파라미터에 의해 측정될 수 있다. 바이오마커는 혈액 수치, 혈청, 소변, 또는 뇌척수액 내의 대사물 수준, 종양 세포 수치, 암 줄기세포 수치, 종양 수준을 포함한다. 종양 수준은 RECIST(Response Evaluation Criteria In Solid Tumors) 기준(Eisenhauer 등(2009) Eur. J. Cancer. 45:228-247)에 의해 결정될 수 있다. 발현 마커는 mRNA 또는 유전자 증폭의 유전적 발현, 항원의 발현, 및 폴리펩타이드의 발현을 포함한다. 임상 파라미터는 임의의 한계를 암시하는 것 없이, 무진행 생존(PFS), 6-개월 PFS, 무병 생존(DFS), 진행까지의 시간(TTP), 원격 전이까지의 시간(TDM), 및 전체 생존을 포함할 수 있다.
"표지된”조성물은 분광, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 동위원소, 또는 화학적 방법에 의해, 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능하다. 예를 들면, 유용한 라벨은 예를 들면 효소-결합 면역검정, 또는 플루오렛(fluorettes)에 사용된 바와 같이, 32P, 33P, 35S, 14C, 3H, 125I, 안정한 동위원소, 에피토프 태그 형광성 염료, 전자 치밀 시약, 기질, 또는 효소를 포함한다(플루오렛에 관하여 그것이 개시하는 모두에 대해 본원에 참고로 편입되는 미국 제6,747,135호에 개시됨).
따라서, 암 줄기세포의, 정제된 스페로이드의 집단, 또는 스테로이드로부터 유도된 단일 세포의 제제를 제조하는 방법이 본원에서 개시되며, 상기 방법은 HCC의 생검을 수득하는 단계, 생검의 세포를 해리하는 단계, 기질 상의 제한 배지에 해리된 세포를 시험관내 배양하는 단계를 포함하며, 상기 제한 배지는 정제된 스페로이드의 집단, 또는 HCC 줄기세포의 단일 세포 제제를 산출하기 위해 미토겐 활성화된 단백질 키나아제(MAPK) 경로를 통해 작용하는 적어도 하나의 성장 인자로 보강된다. 정제된 스페로이드의 집단 또는 단일 세포 내의 암 줄기세포의 적어도 80%는 바이오마커 ATP-결합 카세트 아과 G 멤버 2(ABCG2; 유전자은행 수납 번호 AAG52982.1), 알파-태아단백(AFP), CD133, CD44, CD90, 사이토케라틴 19(CK19), 사이토케라틴 7(CK7), c-키트, E-카드헤린, 상피 세포 접합 부착(EpCAM; 유전자은행 수납 번호 NP_002345.2), 포크헤드 박스 A2(FoxA2), 간세포 핵 인자 4 알파(HNF4a), Ki-67, Nanog(유전자은행 수납 번호 NM_024865.2, NP_079141.20), N-카드헤린, 신경 세포 접합 부착(NCAM; CD56), Oct3/4(유전자은행 수납 번호 NP_002692.2; NP_976034.4; NP_001167002.1; NP_068812.10), Ov1, OV6, 슬러그(SNAI2)/스네일(SNAI1)(슬러그/스네일), Sox17, Sox2(유전자은행 수납 번호 NM_003106.3, NP_003097.1), Sox7, 트위스트, 및 비멘틴 중 1 이상, 또는 전부를 발현한다. 개시된 세포 집단의 형성의 흐름도는 도 1에 제시된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “스페로이드”는 무혈청 배지 내의 암 세포의 배향에 의해 형성된 암 줄기세포의 구형 응집물을 언급한다. 스페로이드를 형성하는 능력은 암 줄기세포의 특징이다.
특정 구현예에서, HCC-CSC 스페로이드 집단 내의 세포의 적어도 약 80%는 바이오마커 AFP, CK7, CK19, EpCAM, E-카드헤린, Ov1, 및 OV6 중 2 이상, 또는 전부를 발현한다. 다른 구현예에서, HCC-CSC 스페로이드 집단 내의 세포의 적어도 80%는 바이오마커 AFP, CK7, CK19, EpCAM, E-카드헤린, Ov1, 및 OV6 중 2 이상, 또는 전부를 발현한다. 또 하나의 구현예에서, HCC-CSC 스페로이드 집단 내의 세포의 적어도 80%는 바이오마커 AFP, EpCAM, Ov1, 및 OV6 중 2 이상, 또는 전부를 발현한다.
또한 암 줄기세포를 포함하는 정제된 스페로이드의 집단이 제공되며, 정제된 스페로이드의 집단 내의 암 줄기세포의 적어도 80%는 바이오마커 중 1 이상, 또는 전부를 발현한다: ABCG2, AFP, CD133, CD44, CD90, CK19, CK7, c-키트, E-카드헤린, EpCAM, FoxA2, HNF4a, Ki67, Nanog, N-카드헤린, NCAM(CD56), Oct3/4, Ov1, OV6, 슬러그/스네일, Sox17, Sox2, Sox7, 트위스트, 및 비멘틴.
스페로이드 집단은 배양 조건 예컨대 배지 조성물 및 기질을 변경함으로써 3개 상이한 하위집단 중 하나로 추가로 증식될 수 있다. 벌크 종양, 스페로이드, 초기, 혼합된, 및 EMT 집단의 특성은 표 1에 제시된다.
표 1. 벌크 HCC 종양으로부터 HCC 세포 집단을 생성하기 위해 사용되는 조건의 요약
Figure pct00001
더욱이, 초기 HCC-CSC, 혼합된 HCC-CSC, 또는 EMT-HCC-CSC 집단 중 어느 것은 표 1에 개시된 바와 같은 배지 및 조건을 변화시킴으로써 HCC-CSC 스페로이드, 초기 HCC-CSC, 혼합된 HCC-CSC, 또는 EMT-HCC-CSC로부터 수득될 수 있다.
일 구현예에서, HCC 스페로이드는 배아 줄기세포의 특성을 갖는 HCC-CSC의 “초기” 집단으로 본원에서 칭해지는 소세포를 갖는 콜로니를 산출하기 위해 액티빈 A, FGF, 및 무혈청 배지(선택 배지)가 있을 때 부착성 기질 상에 추가로 배양되고, 초기 HCC-CSC 집단 내의 세포의 적어도 80%는 바이오마커 EpCAM, E-카드헤린, Nanog, Sox2, Sox7, Sox17, Oct3/4, Fox2A, Ov1, OV6, c-키트, CD133, 및 CD90 중 2 이상, 또는 전부를 발현한다. 또 하나의 구현예에서, 초기 HCC-CSC 집단 내의 세포의 적어도 80%는 바이오마커 EpCAM, E-카드헤린, Nanog, Sox2, Sox7, Sox17, Oct3/4, Fox2A, Ov1, OV6, c-키트, CD133, 및 CD90 중 2 이상, 또는 전부를 발현한다. 또 하나의 구현예에서, 초기 HCC-CSC 집단 내의 세포의 적어도 90%는 바이오마커 Nanog, Sox2, Oct3/4, 및 c-키트 중 2 이상, 또는 전부를 발현한다.
또 하나의 구현예에서, HCC 스페로이드는 단일층으로 혼합된 콜로니를 산출하기 위해 FGF, EGF, 및 혈청-함유 배지(증식 배지)가 있을 때 부착성 기질 상에 추가로 배양되며 상기 세포는 이종성 형태학을 갖는다. 이들 세포는 혼합된 분화 프로파일을 갖는 HCC-CSC의 “혼합된” 집단으로 본원에서 칭해지고, 혼합된 HCC-CSC 집단 내의 세포의 적어도 80%는 바이오마커 AFP, CK7, CK19, EpCAM, E-카드헤린, Nanog, FoxA2, HNF4a, 및 ABCG2 중 2 이상, 또는 전부를 발현한다. 또 하나의 구현예에서, 초기 HCC-CSC 집단 내의 세포의 적어도 90%는 바이오마커 AFP, CK7, CK19, EpCAM, E-카드헤린, Nanog, FoxA2, HNF4a, 및 ABCG2 중 2 이상, 또는 전부를 발현한다.
또 하나의 구현예에서, HCC 스페로이드는 간엽-유사 HCC-CSC 또는 “EMT-HCC-CSC”(배아-간엽 전이된 [EMT] 암 줄기세포)으로 본원에서 칭해지는 스핀들- 또는 불규칙하게-형상화된 세포의 단일층을 산출하기 위해 FGF 및 혈청-함유 배지(증식 배지)가 있을 때 부착성 기질 상에 추가로 배양된다. 이러한 집단에서, 스페로이드는 상피 마커 CK7, CK19, EpCAM, 및 E-카드헤린 중 적어도 하나, 또는 전부에 대한 발현의 손실에 특징이 있는 EMT의 공정을 겪었다. 본원에서 사용된 바와 같이, 바이오마커의 발현의 손실은 검출불가능한 발현 또는 세포의 40%(이하)의 발현, 세포의 30%(이하)의 발현, 세포의 20%(이하)의 발현, 또는 세포의 10%(이하)의 발현을 언급한다. 추가로, EMT 공정은 관심있는 바이오마커(들)을 표현하는 집단 내의 세포의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%로 간엽 마커 슬러그/스네일, 트위스트, CD44, NCAM, N-카드헤린, 및 비멘틴 중 적어도 하나, 또는 전부에 대한 발현의 증가에 특징이 있다.
일 구현예에서, EMT-HCC-CSC 집단 내의 세포의 적어도 80%는 바이오마커 NCAM, 슬러그/스네일, 및 트위스트 중 2 이상, 또는 전부를 발현한다. 또 하나의 구현예에서, EMT-HCC-CSC 집단 내의 세포의 적어도 80%는 바이오마커 AFP, NCAM, N-카드헤린, 슬러그/스네일, 트위스트, CD44, 및 비멘틴 중 2 이상, 또는 전부를 발현한다. 또 하나의 구현예에서, EMT-HCC-CSC 집단 내의 세포의 적어도 90%는 바이오마커 AFP, NCAM, N-카드헤린, 슬러그/스네일, 트위스트, CD44, 및 비멘틴 중 2 이상, 또는 전부를 발현한다.
세포 집단의 특정 구현예에서, 세포는 명시된 바이오마커 중 1 이상을 발현한다. 다른 구현예에서, 세포는 명시된 바이오마커 중 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 또는 10 이상을 발현한다. 또 다른 구현예에서, 세포는 명시된 바이오마커 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25를 발현한다.
단일 세포, 세포의 집단, 또는 특이 구조 예컨대 단일층 또는 스페로이드에 위치한 세포의 집단에 의한 바이오마커의 발현은 바이오마커의 폴리펩타이드 형태 또는 바이오마커의 mRNA 형태의 발현을 측정함으로써 결정될 수 있다. 폴리펩타이드 발현은 표지된 항체를 사용하여 측정될 수 있는 반면, 핵산 발현은 숙련가에게 용도가능한, 하이브리드화 기술에 의해 측정될 수 있다. 폴리펩타이드 또는 핵산, 예컨대 올리고당 또는 소분자 대사물이 아닌 바이오마커는 또한 숙련가에게 용도가능한 방법에 의해 측정될 수 있다.
또한 HCC-CSC 스페로이드의 집단, 또는 그것으로부터 유도된 단일 세포가 제공되며, Ki-67을 발현하는 세포의 발현율은 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%이다.
또한 HCC-CSC 스페로이드의 집단, 또는 그것으로부터 유도된 단일 세포가 제공되며, AFP를 발현하는 세포의 백분율은 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%이다.
또한 HCC-CSC 스페로이드의 집단, 또는 그것으로부터 유도된 단일 세포가 제공되며, NCAM을 발현하는 세포의 백분율은 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%이다.
또한 EMT-HCC-CSC의 집단이 제공되며, 슬러그/스네일을 발현하는 EMT-HCC-CSC의 백분율은 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%이다.
또한 EMT-HCC-CSC의 집단이 제공되며, CD44를 발현하는 EMT-HCC-CSC의 백분율은 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%이다.
또한 EMT-HCC-CSC의 집단이 제공되며, N-카드헤린을 발현하는 EMT-HCC-CSC의 백분율은 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%이다.
또한 HCC-CSC 스페로이드의 집단, 또는 그것으로부터 유도된 단일 세포가 본원에서 포함되며, 바이오마커 CK7, CK19, EpCAM, E-카드헤린, 및 ABCG2의 1, 2, 3, 또는 4의 상기 발현은 검출불가능하거나 세포의 40%(이하)에서 발현되거나, 세포의 30%(이하)에서 발현되거나, 세포의 20%(이하)에서 발현되거나, 세포의 10%(이하)에서 발현된다.
또한 상기의 임의의 조합, 예를 들면 구형체 또는 단일 세포의 집단이 제공되며, Ki67을 발현하는 세포의 백분율은 적어도 30%이고, CK19을 발현하는 백분율은 40%이고, NCAM을 발현하는 백분율은 적어도 80%이고, CK7을 발현하는 백분율은 10% 미만이다.
또한 다양한 크기(1 밀리그램 내지 그램)의 간 종양 샘플로부터 단리된 HCC 줄기세포의 순수 집단을 수득하는 방법이 본원에서 개시된다. 종양 샘플은 신선하거나 냉동될 수 있거나, 기계적 및/또는 효소에 의한 치료에 의해 해리되거나, 최소 기계적 단편화로 직접적으로 배양된다.
또한 본원에서 개시된 바와 같이, 비-부착성 기질은 항-바이오파울링 특성을 갖는 임의의 생체적합성 물질 또는 공통의 배양 표면에 도포되는 항-바이오파울링 특성을 갖는 코팅이다(습식 표면 상에서 세포의 축적을 감소시킴). 코팅은 코팅제 예컨대 아미노-실란을 사용하여 도포될 수 있다. 비-부착성 또는 항-바이오파울링 기질이 있으면, 이러한 기질은 약 0-25 일, 예컨대 0-21 일, 5-20 일, 5-10 일, 10-20 일, 또는 제로와 25 일 사이의 임의의 기간 동안 사용될 수 있다.
부착성 기질을 사용하는 방법의 또 하나의 구현예에서, 부착성 기질은 RGD(Arg-Gly-Asp) 트리펩타이드 모티프(예를 들면, 콜라겐, 젤라틴, 매트리겔®(MATRIGEL®))가 풍부한 것일 수 있다. 부착성 기질은 부착 의존성 세포에 부착하고, 그것을 수집하도록 구성된 표면이다. 게다가, 기질은 섬유아세포인 부착 의존성 세포에 부착하고 그것을 수집하도록 구성된 부착성 기질일 수 있다. RGD 펩타이드는 또한 폴리머 골격 예컨대 폴리스티렌, 하이알루로난, 폴리-락트산, 또는 이들의 조합 상에 그라프팅될 수 있다. 골격은 프로테오글리칸을 추가로 가질 수 있다. 프로테오글리칸은 성장 인자 예컨대 섬유아세포 성장 인자(FGF), 상피 성장 인자(EGF), 액티빈 A 또는 폴리스타틴을 가질 수 있다.
비-부착성 기질은 암 줄기세포를 갖는 배양의 빠르고 효율적인 농축을 야기할 수 있다. 비-부착성 기질은 충분히 큰 샘플이 예시적인 수술로 절제된 종양을 위해 제공될 때 사용될 수 있어, HCC-CSC의 정제가 즉시 시작될 수 있다. 샘플이 매우 작으면, 예컨대 바늘 흡입 또는 복막 세척, 및 비-부착성 배양이 실현가능하지 않으면, 부착 배양은 초기 증식, 그 다음 비-부착성 기질 상의 정제 단계, 그 다음 부착 조건 하의 또 하나의 증식을 위해 사용될 수 있다. 대안적인 가공 방법은 도 1(단속선 및 박스) 및 아래에 상세히 실증된다.
어떤 배양 구현예에서, 배양의 제 1 기간은 부착성 기질 상에 제공되며, 그 다음 배양의 제 2 기간은 비-부착성 기질 상에 제공된다. 또한 배양의 제 1 기간이 비-부착성 기질 상에, 그 다음 배양의 제 2 기간이 부착성 기질 상에 제공된다. 기간은 예를 들면 1 일의 반, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 15 일 등, 또는 그것의 임의의 범위 예컨대 2-4 일, 또는 8-10 일 등일 수 있다. 추가로, 사이클은 예컨대 부착 배양 그 다음 비-부착성 배양 그 다음 부착 배양 등을 반복할 수 있다. 또 하나의 구현예에서, 사이클은 예컨대 비-부착성 배양 그 다음 부착 배양, 그 다음 비-부착성 배양 등을 반복할 수 있다.
또 하나의 구현예에서, 제한 배지는 미토겐 활성화된 단백질 키나아제(MAPK) 경로를 통해 작용하는 적어도 하나의 성장 인자로 보강된다. 일 구현예에서, 성장 인자는 FGF 및 EGF 중 하나 또는 둘 모두, 또는 그것의 유사체이다 일 구현예에서, FGF는 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)이다. 또 하나의 구현예에서, 제한 배지는 액티빈 A로 보강된다. 또 하나의 구현예에서, 제한 배지는 액티빈 A로 보강되지 않는다. 또한 HCC 줄기세포의 자발적인 분화를 방지하는데 효과적인 양으로, 액티빈 A의 작용제로 보강되는 제한 배지가 개시된다.
또한 환자의 일차 간 종양으로부터 수득된 각각의 환자에게 독특한 HCC 줄기세포주가 제공되며, 그것은 (a) 자가-재생 및 만능분화능의 줄기세포 특성 및 구별 능력을 갖고; (b) 세포의 대다수, 예컨대 50% 초과에서 독특한 게놈 암성 서명(cancerous signature)을 갖는다.
본 개시내용은 핵산, 유전자 생성물, 폴리펩타이드, 및 펩타이드 단편을 포함하며, 동일성은 실용명에 의해 단독으로 상당히 확립될 수 있다. 또한 특정한 유전자은행 수납 번호에 기초하여, 핵산, 유전자 생성물, 폴리펩타이드, 및 펩타이드 단편이 포함되며, 핵산, 폴리펩타이드 등은 생화학적 기능, 또는 생리적 기능이 기능과 관계없이, 적어도 부분적으로, 또는 대안적으로, 공유되는 유전자은행 번호의 것에 대해, 적어도 50% 서열 동일성, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성 서열 동일성을 갖는다.
대상체의 암에 대한 면역 반응이 본원에서 개시된 조성물 중 하나로 자극되는 방법이 제공된. 자극된 면역 반응은 CD4+ T 세포 반응, CD8+ T 세포 반응, 및 B 세포 반응 중 1 이상을 포함한다. 특정 구현예에서, CD4+ T 세포 반응, CD+ T 세포 반응, 또는 B 세포 반응은 당해분야의 숙련가에 의해 공지되는 검정에 따라, ELISPOT 검정에 의해, 세포내 사이토카인 염색(ICS) 검정에 의해, 사량체 검정에 의해, 또는 항원-특이적 항체 생산을 검출함으로써 측정될 수 있다. 면역 반응은 생존 시간 예컨대 2년 전체 생존(OS)을 포함할 수 있고, 2년 전체 생존은 적어도 60%이다. 면역 반응은 또한 객관적 반응(RECIST 기준), 전체 생존, 무진행 생존(PFS), 무질환 생존, 원격 전이까지의 시간, 6-개월 PFS, 12-개월 PFS 등을 포함하는, 종양학 임상시험에서 사용되는 종료점에 의해 평가될 수 있다.
또한 간세포 암종의 요법에서의 사용을 위해 HCC 줄기세포로 생체외 자극되는 수지상 세포, 또는 그것으로부터 유도되는 항원이 본원에서 개시된다. HCC-CSC 생체외로 로딩된(그것에 노출된) 수지상 세포를 포함하는, 면역원성 조성물, 예컨대 백신 조성물이 본원에 포함된다. 특정 구현예에서, 수지상 세포 및 종양 세포는 동일한 인간 대상체에서 나오지만 수지상 세포 및 HCC 세포가 상이한 대상체에서 나오는 구현예는 본 개시내용의 범위 내에 있다.
수지상 세포는 전체의 세포, 세포 용해물, 세포 추출물, 조사된 세포 또는 HCC 종양 세포의 임의의 단백질 유도체를 포함하는 HCC 종양 세포 항원으로 로딩될 수 있다. 수지상 세포 면역원성 조성물이 제조되고, 당해분야의 숙련가에게 공지된 바와 같은 1 이상 투여 경로에 의해 인간 대상체에게 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, HCC-CSC 세포는 수지상 세포로 로딩하기 전에, 세포 분열을 방지하기 위해 조사되거나, 그 반대 가공된다. 방사선에 대한 대안은 세포 분열을 방지하는 핵산 가교결합 제조를 포함한다. 또한 상기 개시된 바와 같이, 자가조직 면역 요법을 위한 항원의 공급원으로서, HCC 줄기세포 집단을 사용하는 방법이 제공되며, 예를 들면 HCC 줄기세포는 복사 에너지(예를 들면, 감마, UV, X), 온도(예를 들면, 뜨거운 또는 차가운), 또는 화학적(예를 들면, 세포증식억제성, 알데하이드, 알코올) 방법, 또는 이들의 조합에 의해 불활성화된다. 다른 구현예에서, HCC 줄기세포는 수지상 세포의 생체외 활성화를 위한 항원의 공급원으로 사용된다.
본 개시내용은 제조된 HCC 세포를 제공하고, 제조된 HCC 세포로 로딩된 DC를 제공하고, 제조된 HCC 세포를 로딩한 수지상 세포를 포함하는 면역원성 조성물(또는 백신)을 제공한다. 임의의 한계를 암시하는 것 없이, 본 개시내용의 면역원성 조성물은 HCC 스페로이드로 로딩되고, 스페로이드를 포함하는 세포의 집단으로 로딩되고, DC 상에 로딩하기 전에 스페로이드로부터 유도되었고 부착 표현 상에 증식되었던 세포의 집단으로 로딩되고, DC 상에 로딩하기 전에 균질화 또는 초음파처리를 받았던 스페로이드로 로딩되고, DC 상에 로딩하기 전에 균질화 또는 초음파처리를 받았던 증식된 세포의 집단으로 로딩되는 등하는 DC를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, DC는 초기 HCC-CSC, 혼합된 HCC-CSC, 또는 EMT-HCC-CSC로 로딩된다.
또한 HCC-CSC의 집단이 본원에서 개시되며, 그것은 적어도 하나의 HCC-특이적 항원을 발현하는 세포에 대해 효과적인 면역 반응을 자극할 수 있으며, 상기 HCC-CSC 집단은 적어도 하나의 수지상 세포와 접촉되고, 상기 HCC-CSC 집단은 수지상 세포에 의해 생체내 또는 생체외 가공되고, 효과적인 면역 반응은 대상체에 적어도 하나의 수지상 세포의 투여에 반응하여 상기 대상에에서 발생한다.
개시된 조성물의 면역 자극 양은 비제한적으로, 측정가능한 양만큼 ELISPOT 검정 결과를 증가시키고, 측정가능한 양만큼 ICS 검정 결과를 증가시키고, 측정가능한 양만큼 사량체 검정 결과를 증가시키고, 측정가능한 양만큼 항원-특이 CD4+ T의 혈액 집단을 증가시키고, 측정가능한 양만큼 항원-특이 CD8+ T의 혈액 집단을 증가시키는 양이거나, 증가는 적합한 대조군과 비교할 때 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 1.5-배, 2.0-배, 3.0-배 등만큼이다. 적합한 대조군은 대조군 조성물일 수 있으며, 수지상 세포는 HCC 세포로 로딩되지 않거나, HCC 세포로부터 유도된 펩타이드로 로딩되지 않는다.
개시내용은 또한 의약품, 시약, 진단 키트를 포함하는 키트를 제공하며, 상기 의약품, 시약, 및 키트는 수지상 세포(DC), 항체, 또는 항원을 포함한다. 또한 적어도 하나의 수지상 세포 및 적어도 하나의 항원을 포함하는 조성물을 투여하는 방법, 항체 형성을 자극하는 방법, 항체-의존적 세포독성(ADCC)을 자극하는 방법, 보체-의존적 세포독성을 자극하는 방법, 및 환자 적합성을 결정하고, 임상시험 또는 보통의 의료 치료의 맥락에서 환자 포함/배제 기준을 결정하고, 약제학적 또는 시약에 대한 반응을 예측하는 방법 및 키트가 제공된다. 개시내용의 약제학적 조성물, 시약, 및 관련된 방법은 CD83 양성 수지상 세포를 포함하며, CD83은 IFN-감마-가공된, 또는 미가공된 암 세포로 로딩함으로써 유도된다. 개시내용의 CD83 측면에서, CD83은 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10% 등만큼 유도된다. 또 하나의 측면에서, DC 시약, 또는 DC-관련된 방법이 제외되며, 수지상 세포 상의 CD83은 IFN-감마로 로딩함으로써 검출불가능하게 유도된다.
일 구현예에서, 본원에서 개시된 방법에 따라 종양 샘플로부터 HCC-CSC 스페로이드, 초기 HCC-CSC, 혼합된 HCC-CSC, 및/또는 EMT-HCC-CSC를 생성하는 모든 시약 및/또는 HCC-CSC 스페로이드, 초기 HCC-CSC, 혼합된 HCC-CSC, 및/또는 EMT-HCC-CSC를 특성화하는 시약, 및 HCC-CSC 스페로이드, 초기 HCC-CSC, 혼합된 HCC-CSC, 및/또는 EMT-HCC-CSC를 생성하고/하거나 특성화하는 설명서를 키트가 제공된다. 또 하나의 구현예에서, 키트는 추가로, 또는 대안적으로, 수지상 세포를 단리하고/하거나, 수지상 세포를 HCC-CSC로 로딩하고/하거나, 및/또는 DC-HCC 조성물을 대상체에 투여하는 시약 및 설명서를 포함한다.
종양 샘플 가공
본 개시내용의 간세포 암종(HCC) 줄기세포 집단은 환자 종양의 신선한 또는 냉동된 샘플에서 비롯될 수 있다. 종양 샘플은 종양-함유 조직의 생검 또는 세척일 수 있다. HCC 줄기세포는 바늘 생검 및 세척 유체로부터 단리된다.
종양 샘플은 약 7.4(+/- 0.6)의 pH 예컨대 RPMI, DMEM, F12, 윌리엄스, 또는 단백질 공급원 예컨대 동물 또는 인간 혈청을 농도 0 내지 100%로 또는 알부민을 0에서 0.5%까지의 농도로 또는 생리적 삼투압을 보장하는 거대분자를 함유하는 조합을 갖는 포괄적인 완충된 배지에 수송될 수 있다. 천연 또는 인공 거대분자의 예는 비제한적으로, 하이알루로난, 덱스트란, 폴리비닐 알코올이다. 항생제 예컨대 페니실린, 스트렙토마이신, 젠트라미신은 항진균 예컨대 암포테리신 B, FUNGIZONE®(Life Technologies, Carlsbad, CA)과의 임의의 조합으로, 항미생물 특성을 제공하고 수송 동안 오염의 위험을 감소시키는 배지에 사용될 수 있다.
종양 샘플은 배지 온도를 2 내지 30℃로 감소시킴으로써 대사성 활성 상태 아래에서 유지될 수 있으며, 따라서 가공 전에 제한된 시간(0 내지 72 시간 사이) 동안에 생존력 유지를 허용한다. 패키징(예를 들면, 절연된 패키징)은 수송 동안 적절한 온도 제어를 보장하기 위해 사용될 수 있다.
그 다음, 고형 종양 조직은 작은, 1 mm 미만(임의의 치수에 대해) 단편으로 날카로운 칼날 또는 조직 그라인더 디바이스를 사용하는 기계적 해리에 의해 가공된다.
고형 조직은 효소에 의한 해리에 의해 임의의 추가로 가공된다. 다양한 효소는 단일 세포를 단리시키기 위해 사용될 수 있다. 비특이적 단백분해 효소 예컨대 트립신 및 펩신은 성공적으로 사용될 수 있다. 콜라게나제, 디스파제, 엘라스타제, 또는 이들의 조합을 포함하는, 표적화 최소 세포막 손상 특이 효소는 개시된 방법에 사용될 수 있다. 데옥시리보뉴클레아제(DNAse)는 세포 제제의 원치않는 점착성에 책임이 있는 세포 쇄설물로부터 유리 DNA를 저하시키기 위해 사용될 수 있다. 해리 후에, 서스펜션 내의 세포는 완충된 염수(PBS, HBSS) 또는 세포 배양 배지에서 50-100 μm 메쉬 및 반복된 원심분리를 통해 변형(straining)함으로써 과잉의 효소 및 잔해로부터 세정된다.
세포 배양 조건 및 스페로이드 생산
상기 기재된 단일 세포 현탁액은 단리, 줄기세포의 증식 및 분화된 및/또는 정상 세포의 억제를 촉진하는 배양 조건에서 이동된다. 이것은 신체 조건, 화학적 환경, 및 조작의 조화에 의해 달성된다.
세포 현탁액은 세포 부착을 허용하지 않는 비-부착성(항-바이오파울링(anti-biofouling)) 기질에 노출된다. 성숙한 세포는 적절한 부착성 기질가 제공되지 않을 때 통상적으로 정착 의존적이고 빠르게 제거된다. 항-바이오파울링 기질은 상업적 생성물 예컨대 초저 부착 플라스크(Corning, Corning, NY), 천연 소수성 특성(폴리비닐, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 플루오로-폴리머)을 갖는 폴리머 또는 천연 탄수화물 폴리머 예컨대 한천, 전분을 갖는 코팅 등을 용도할 수 있다.
암 줄기세포는 고순도 암 줄기세포를 함유하는 스페로이드 형성(도 2)으로 응집하고/하거나 클론적으로 증식할 것이다. 다양한 크기의 쉽게 확인가능한 스페로이드 구조를 갖는 암 줄기세포 응집물의 배양물은 도 3a 및 도 3b에 도시된다. 성숙한 세포는 단리된 및 비-부착성을 유지할 것이다. 차별적인 중력 분리는 적시의 수직 침강 또는 단시간 작은 힘 원심분리(100xG 미만)을 간단히 허용함으로써, 단일 세포로부터 더 큰 스페로이드를 선택하기 위해 사용될 수 있다. 기재된 선택 방법은 하기를 달성하도록 설계된다: (a) 일반적으로, 성숙한 정상 세포인 부착 의존성 세포를 제거하는 것; (b) 정착 독립적인 신생 줄기세포의 작은 클럼프 또는 스페로이드에서 클론 증식을 촉진하는 것; (c) 줄기세포의 클론 증식의 결과로서 국부 자가분리 활성을 촉진하는 것; 및 (d) 정상 섬유아세포 또는 간세포에 의해 분비되는 액티빈 A의 자가분비 공급원을 제거하는 것.
구형체를 형성하는 세포의 능력은 인테그린으로 칭해지는 세포-표면 단백질에서 부분적으로 기인한다. 세포의 표면 상에 발현되는 특이항체 인테그린은 동일한 유형의 세포가 "함께 머무는" 것을 보장한다. 구형체는 배양물의 맨 처음에 단일 세포 현탁액인 효소 소화 산물로부터 직접 형성되거나, 임의의 시간에 냉동된 샘플 또는 현존하는 부착된 배양으로부터 형성된다. 효소 소화 산물 파종은 특이 표면 특성을 갖는 세포를 편입하는 이러한 구형 형성을 야기한다.
섬유아세포는 예를 들면 스페로이드로 편입되지 않고 중력 공급 동안 배양물로부터 제거된다. 사용된 배지는 특이항체 특성을 갖지 않는 세포의 비-특이적 응집을 방지하고 배양 용기 표면에 대한 부착을 방지하기 위해 부착을 촉진하는 분자가 없다. 그와 같은 세포 접합 부착(CAM)은 통상적으로 동물 또는 인간 혈청에서 발견된다. 따라서 무혈청인 배지 조성물은 비-부착성 스페로이드의 배양에 적합하다.
무혈청 배지 배양에서, 배지에 대한 보충재는 성장 및 유지, 또는 세포 생리학 및 기능의 다른 원하는 측면을 지원하는데 필요한 임의의 호르몬, 영양소, 미네랄, 및 비타민을 포함할 수 있다. 일부 사례에서 미토겐성 활성, 예컨대 FGF 패밀리 및 EGF를 소유하는 성장 인자의 양의 부가 또는 조정으로 줄기세포 증식을 자극하고 지속할 수 있다.
암 줄기세포의 구형체를 포함하는, 세포(스페로이드)의 구형체는 표지된 항체로 고정하고 염색하며, 그 다음 공초점 현미경검사로 보는 것으로 바이오마커 발현에 관하여 특징이 있을 수 있다. 바이오마커는 또한 다른 면역화학 방법, 예를 들면 유세포측정에 의해 측정될 수 있다. 구형체는 예를 들면 신선한 종양으로부터 수득된 서스펜션으로부터, 또는 부착 세포로 성장하도록 적응된 세포로부터 제조될 수 있다. 구형체의 형태학, 예를 들면, 크고 불규칙 대 아주 작고 조밀은 배지의 선택에 영향을 받을 수 있다.
또 하나의 구현예에서, 항-바이오파울링 코팅에 대한 세포 집단 부착은 단백질 키나아제 B(AKT)에 의해 매개되는 음파 고슴도치(sonic hedgehog) 신호전달 및 초점 부착 키나아제(FAK) 신호전달의 비정상적인 활성화에 기초하여 단리될 수 있다. 이들 현상은 해리(트립신/콜라게나제)에 사용된 효소 예컨대 메탈로프로테아제 또는 효소에 의해 유도되는 막의 변형에 의해 증대될 수 있다. 그와 같은 세포 집단은 빠른 증식성 및 침습성 종양과 연관될 수 있다. 도 5는 초저 부착 표면에 부착되고 증식되는 대표적인 세포 집단을 도시한다. 음파 고슴도치(sonic hedgehog) 신호전달의 정상적인 또는 비정상적인 활성화를 평가하는 방법은 당해분야의 숙련가에게 용도가능하고 공지된다.
세포 배양에 사용된 배지
HCC 줄기세포를 단리시키기 위해 사용되는 제한 배지는 세포 생존을 촉진하고 선택을 위해 특이적으로 제형화된다. 배지는 탄수화물 및 지질이 풍부하지만 최소 양의 단백질(0.1% - 3% 알부민 또는 1%-5% 혈청)을 갖는다. 그것은 1.5 mMol 미만의 총 칼슘을 함유하고, 무기 철 화합물을 함유하지 않으며; 오히려, 철은 수송체 예컨대 트랜스페린에 완전히 결합된다. 배지에는 과잉의 필수적인 및 비-필수적인 아미노산 및 필수적인 지질(알파-리놀렌 및 리놀레산)이 제공된다(표 4). 임의로, 배지는 액티빈 A를 함유하지 않고 액티빈 A 수용체 차단제 예컨대 폴리스타틴을 함유할 수 있다. 또한 임의로, 배지는 항산화제 예컨대 수퍼옥사이드 디스무타제(superoxide dismutase)(SOD) 또는 카탈라제를 함유하는 것이 아니라, 티올성 항산화제 예컨대 글루타티온을 함유한다.
배양 배지는 표 2에 묘사된 바와 같은 기저 제형 예컨대 DMEM, F12, 윌리엄스, RPMI, 단백질(어떤 제형에서)로 보강된 리보비츠, 아미노산, 항산화제, 정력적인 기질(글루코오스, 갈락토오스, L-글루타민), 비타민(B12), 호르몬(갑상선 호르몬, 인슐린) 및 성장 인자(FGF, EGF)에 있다.
단백질은 0.1-0.5%의 농도의 알부민, 0.5%-20%의 우태 혈청(FBS)일 수 있다. 단백질은 범위가 0.1%에서 0.5%에 이르는 농도로 거대분자 예컨대 덱스트란, 하이알루로난, 폴리-비닐 알코올로 치환될 수 있다. 그러한 배지의 조성물은 표 2, 표 3, 및 표 4에 열거된다. 보충재는 배지로 부가되고 세포 배양을 공급하기 위해 혼합된다.
표 2. 암 줄기세포에 대한 기초 배지 조성물 선택:
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
표 3. 계통 줄기세포 보충재(기초 배지의 1 L에서 재구성을 위한 50 mL 단위)
Figure pct00006
표 4. 지질 혼합
Figure pct00007
지질 혼합은 플루로닉 F68, 포스파티딜 콜린, 트윈 80, 사이클로덱스트린, 또는 이들의 조합을 사용하여 o/w 에멀젼에 의해 이루어진다
배지는 증식이 빠르면, 3 일의 주 계획(예를 들면, 월요일 ― 수요일 ― 금요일), 또는 더 자주, 예를 들면 하루 걸러 또는 매일 교체될 수 있다. 연속적 공급 또는 마이크로-배치 공급 생물반응기는 증식 단계에 사용될 수 있다.
배지는 MAPK 경로 예컨대 FGF 및 EGF를 통해 작용하는 성장 인자를 함유한다. 이들 성장 인자의 농도는 0.1 내지 100 ng/mL 사이에서, 통상적으로 약 10 ng/mL에서 변할 수 있다.
일 구현예에서, 배지는 약 0.1 내지 100 ng/mL, 약 0.5-50 ng/mL, 약 1-40 ng/mL, 약 2-30 ng/mL, 약 3-20 ng/mL, 약 5-15 ng/mL, 약 6-14 ng/mL, 약 7-13 ng/mL, 약 8-12 ng/mL, 약 9-11 ng/mL, 또는 약 10 ng/mL에서 FGF로 보강된다. 다른 구현예에서 FGF는 약 5 ng/mL, 약 6 ng/mL, 약 7 ng/mL, 약 8 ng/mL, 약 9 ng/mL, 약 11 ng/mL, 약 12 ng/mL, 약 12 ng/mL, 약 14 ng/mL, 또는 약 15 ng/mL에서 배지에 존재한다.
또 하나의 구현예에서, 배지는 약 0.1 내지 100 ng/mL, 약 0.5-50 ng/mL, 약 1-40 ng/mL, 약 2-30 ng/mL, 약 3-20 ng/mL, 약 5-15 ng/mL, 약 6-14 ng/mL, 약 7-13 ng/mL, 약 8-12 ng/mL, 약 9-11 ng/mL, 또는 약 10 ng/mL에서 EGF로 보강된다. 다른 구현예에서 EGF는 약 5 ng/mL, 약 6 ng/mL, 약 7 ng/mL, 약 8 ng/mL, 약 9 ng/mL, 약 11 ng/mL, 약 12 ng/mL, 약 12 ng/mL, 약 14 ng/mL, 또는 약 15 ng/mL에서 배지에 존재한다.
또한 수퍼옥사이드 디스무타제(SOD) 또는 카탈라제의 하나 또는 둘 모두로 보강되지 않은 배지가 제공된다. 항산화제의 사용은 양성 및 음성 결과 둘 모두를 가질 수 있다. 암 줄기세포는 유리 라디칼 및 당분해 대사에 대한 정상 세포보다 훨씬 더 내성이 있다. 따라서 차선 배양 예컨대 고밀도, 드문 배지 재배치, 배지 대사물의 고농도에서, 정상 민감성 세포가 우선 제거될 가능성이 가장 크다. 배지에 황산화제를 포함하지 않음으로써, 정상 세포보다 더 내성있는, 암성 기원이 될 가능성이 있는 세포의 집단이 선택될 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 항산화제, 예컨대 SOD의 카탈라제 및 억제제는 배양 배지에 부가되고 다른 구현예에서, 이들 화합물은 배양 배지로부터 생략된다.
대안적인 방법에서, 액티빈/폴리스타틴 시스템은 매우 초기의 암 줄기세포를 단리시키기 위해 사용될 수 있다. 액티빈 A의 부가는 액티빈 A-내성있는 HCC 줄기세포의 하위집단을 선택할 수 있다. 7-14 일 동안 액티빈 A에 대한 노출 후에 수득된 초기 HCC 줄기세포의 콜로니는 도 6, 도 7, 및 도 8에 도시된다. 이러한 하위집단은 HCC 및 조기(덜 분화된) 암 줄기세포의 더 많은 공격성 형태와 연관된다. 폴리스타틴은 특히 액티빈 A를 내인성으로 분비하는 상당수의 세포, 예컨대 섬유아세포 및 정상 간세포가 존재할 때, 액티빈 A 수용체를 차단하고 HCC 줄기세포의 자발적인 분화를 방지하기 위해 사용된다. 폴리스타틴의 사용은 세포가 액티빈 A에 또는 폴라스타틴이 내인성으로 분비될 수 있는 고순도 HCC 줄기세포 집단에서 비민감성이면 어떤 효과도 갖지 않는다.
액티빈 A는 형질전환 성장 인자-베타(TGF-베타) 슈퍼패밀리의 멤버인 단백질이다. 배양 배지에 부가되거나 포함될 때, 액티빈은 줄기세포 만능분화능 및 자가-재생을 유지하는 것을 돕는다. 그러나, 액티빈 A는 수용적인 신생 간세포 및 암 세포의 성숙 및 분화를 촉진한다. 따라서, 초기 목표는 또한 배양에서 적절한 자가분비 환경을 생성함으로써 암 줄기세포의 증식을 지속하는 종양의 시험관내 빠른 증식이다. 액티빈 A는 매우 신생의 암 줄기세포의 하위집단을 선택할 수 있지만, 제조 시에 초기에 적용되는 그와 같은 조건은 벌크에서 매우 저농도의 간 암 줄기세포가 주어지면 증식을 크게 지연시킬 것이다. 예를 들면, “빠른 증식”은 소비(예를 들면 pH의 변화)의 명백한 징후를 갖는 배양 용기에서 배지를 야기하는 증식이고 세포의 수는 증가된 밀집도에 의해 반영되는 것보다 매일 분명히 더 높아진다.
빠른 증식에 대해, 액티빈 A는 그것이 배양 성장을 둔화시키기 때문에, 생략되고 부가되지 않는 것이 바람직하다. 일부 적용에 대해 관심은 매우 초기 줄기세포 집단을 수득하는 것이고 액티빈 A의 사용은 그러한 세포 집단을 선택할 것이다. 따라서, 일 구현예에서, 액티빈 A-함유 증식이 개시되고 제 1 조성물은 액티빈 A-활성화된 배양 세포를 포함하는 대상체에 투여되고, 그 다음 액티빈-A 무배양에서 액티빈 A-비민감성 세포의 단리 및 상기 대상체에 액티빈 A 무배양 세포를 포함하는 제 2 조성물의 투여가 이어진다.
일 구현예에서, 배지는 약 0.01 내지 10 ng/mL, 약 0.05-9 ng/mL, 약 0.1-8 ng/mL, 약 0.5-7 ng/mL, 약 1-6 ng/mL, 약 1-5 ng/mL에서 액티빈 A로 보강된다. 다른 구현예에서, 액티빈 A는 약 0.5 ng/mL, 약 0.7 ng/mL, 약 0.9 ng/mL, 약 1 ng/mL, 약 1.25 ng/mL, 약 1.5 ng/mL, 약 1.75 ng/mL, 약 2 ng/mL, 약 2.25 ng/mL, 약 2.5 ng/mL, 약 2.75 ng/mL, 약 3 ng/mL, 약 3.5 ng/mL, 약 4 ng/mL, 약 4.5 ng/mL, 약 5 ng/mL, 약 6 ng/mL, 약 7 ng/mL, 약 8 ng/mL, 약 9 ng/mL, 또는 약 10 ng/mL에서 배지에 존재한다.
또한 구현예가 개시되며 상기 배지는 액티빈 A의 길항제, 예컨대 비제한적으로, 액티빈 A에 특이적으로 결합하는 폴리스타틴 또는 항체로 보강된다.
또 하나의 구현예에서, 배지는 약 0.1 내지 100 ng/mL, 약 0.5-50 ng/mL, 약 1-40 ng/mL, 약 2-30 ng/mL, 약 3-20 ng/mL, 약 5-15 ng/mL, 약 6-14 ng/mL, 약 7-13 ng/mL, 약 8-12 ng/mL, 약 9-11 ng/mL, 또는 약 10 ng/mL에서 폴리스타틴으로 보강된다. 다른 구현예에서, 폴리스타틴은 약 5 ng/mL, 약 6 ng/mL, 약 7 ng/mL, 약 8 ng/mL, 약 9 ng/mL, 약 11 ng/mL, 약 12 ng/mL, 약 12 ng/mL, 약 14 ng/mL, 또는 약 15 ng/mL에서 배지에 존재한다.
미토겐(예를 들면, FGF/EGF), 액티빈 A, 및 부착성 기질의 조합은 정상 세포 예컨대 섬유아세포 또는 성상세포의 증식의 증가를 야기할 수 있다. 따라서, 조건은 영양 또는 캡슐화 특성(예를 들면, 섬유아세포, 성상세포)을 갖는 세포에 의해 구성된 풍부한 환경 또는 “스트로마”에서 액티빈 A에 비민감성인 매우 초기 HCC 줄기세포 또는 조상세포의 증식을 촉진하기 위해 생성된다. HCC의 콜로니는 계속 발육하고 세포 배양의 다음 수일 내지 수주 동안에 스트로마를 공간적으로 변위시키기 위해 점진적으로 관측된다(도 7 및 8). 이러한 방법에 사용된 배지는 표 2, 표 3 및 표 4에 기재된 제형의 조합이다.
FGF, EGF, 및 액티빈 A, 및 “매우 초기 HCC 암 줄기세포”사이의 관계가 있다. FGF 및 EGF는 매우 초기 것을 포함하는 임의의 분화 상태에서 HCC 줄기세포의 증식을 야기한다. 액티빈 A가 세포 배양 배지에 있는 경우에, 액티빈 A는 액티빈 A에 비민감성인 매우 초기 HCC 줄기세포의 증식을 위해 배타적으로 허용된다(그것을 허용함). HCC 줄기세포가 민감성이면, 증식은 액티빈 A에 의해 정지되거나 감소될 것이다.
FGF 및 EGF에 대한 무감각은 공통이 아니고 천연 차단제가 없다. 액티빈 A에 대한 무감각은 폴리스타틴, 액티빈 수용체의 천연 차단제에 의해 매개될 수 있다. 폴리스타틴은 동일한 종양 세포에 의해 또는 종양을 둘러싸는 세포에 의해 분비될 수 있다. 액티빈 A는 전형적으로 종양을 둘러싸는 세포에 의해 분비되며, 따라서 종양의 증식은 둘러싸여지는 세포(억제)에 및 종양(증식을 촉진함)에 의해 의존적인 것이 가능하다. 액티빈 A에 대한 수용체의 결핍, 매우 초기 미분화된 암 줄기세포의 특징은 둘러싸여지는 조직에 의해 종양의 대조군을 방지할 수 있다.
시험관내 배양은 배아 줄기세포-유사 콜로니를 함유할 것이다. 이들 콜로니는 기질 세포에 의해 둘러싸여질 수 있으며, 그것은 정상 섬유아세포, 분화된 종양 세포, 또는 간엽 전이된 종양 세포일 수 있다. 그와 같은 배양은 도 7에 묘사된다.
본 개시내용은 HCC-CSC를 제조하는 방법을 제공하며 조작 예컨대 배지의 변화, 재평탄 배양(replating), 원심분리, 및 침전을 위해 필요한 시간을 포함하는 총 배양 시간은 5 개월 미만, 4 개월 미만, 3 개월 미만, 2 개월 미만, 1 개월 미만, 150 일 미만, 120 일 미만, 90 일 미만, 60 일 미만, 30 일 미만, 또는 150 일(+/-20 일)미만, 120 일(+/-20 일) 미만, 90 일(+/-20 일) 미만, 60 일(+/-20 일) 미만, 30 일(+/-20 일) 미만이다. 배제 구현예에서, 본 개시내용은 암 줄기세포를 제조하는 임의의 방법, 및 그러한 방법에 의해 제조되는 암 줄기세포의 임의의 집단을 배제할 수 있으며, 조작을 위해 필요한 시간은 상기 개시된 시간-프레임 중 하나보다 더 크다. 또한 상기 시간-프레임 중 하나에 의해 명시되는 부착 배양의 시간이 제공된다. 또한 상기 시간-프레임 중 하나인 비-부착성 배양의 시간이 제공된다. 게다가, 상기 시간-프레임 중 하나에 의해 확인되는 부착 배양 및 비-부착성 배양의 조합된 시간이 제공된다.
상피- 간엽 전이( EMT )
상피 기원의 종양은 간엽 상태로 퇴보 또는 초과-미분화하기 위해 공지된다. 상피 표현형은 불가동이고, 기원 조직에 제한된 종양의 용적 성장에 기여하고 전형적으로 더 분화된다. EMT가 발생할 때, 세포는 이동도를 얻고 인접한 조직 침윤 및 원격 전이를 생성한다. 전이된 세포는 또한 줄기세포-유사 표현형을 얻으며, 복제하고 미분화하는 능력은 기원(일차) 종양의 특성을 갖는 숙주 조직에서 새로운 종양(전이)을 야기한다. EMT에 의해, 종양 세포는 추가로 면역억제성 능력, 약물 펌프 및 방사성 저항성을 얻는다.
배지 조성물 및 물리적 선택 방법은 시험관내 EMT 현상을 촉진한다. 면역원으로서 EMT 전이된 집단을 사용하는 이점은 종양 재발의 예방이다. EMT 암 세포의 항원은 면역계가 전이를 야기하는 이동 암 세포를 인식하고 파괴가능할 수 있다. 전이의 과정에서 이들 세포는 아주 낮은 수로 이동하고, 숙주 조직을 심고, 상피 표현형(MTE 전이)으로 복귀하고, 원발성 종양과 유사한 특성을 갖는 새로운 종양을 성장시키고 형성한다. 시험관내 EMT를 야기하는데 필요한 조건은 무혈청 배지 내의 스페로이드 형성, bFGF를 갖는 자극, 그 다음 RGD(Arg-Gly-Asp) 펩타이드 모티프(예를 들면, 콜라겐, 젤라틴 등)를 함유하는 부착성 기질 상의 평탄 배양이다.
EMT-HSC-CSC 하위집단은 표 1 및 도 1에 기재된 바와 같은 배양 조건 하에, HCC 스페로이드, 또는 초기 HCC 또는 혼합된 HCC를 배양함으로써 수득된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “HCC-CSC”는 일반적으로 HCC-CSC 스페로이드, 초기 HCC-CSC, 혼합된 HCC-CSC, 또는 EMT-HCC-CSC를 언급한다.
종양(바늘 생검 )의 작은 공급원으로부터의 HCC - CSC의 수득
HCC 줄기세포 선택을 위한 대안적인 방법은 샘플 세포의 수가 작을 때 사용된다. 실례에 대해, 종양으로부터 수득된 소수의 생존 세포는 효소에 의한 해리 후에 10x106 미만 생존 세포이다. 이러한 개시내용의 목적을 위해 작은 샘플은 예를 들면 절제된 종양으로부터 수득된 샘플과 대조적으로, 바늘 생검 또는 코어 생검으로부터 수득하는 샘플을 언급하며, 이는 전형적으로 작은 샘플로 간주되고 적어도 0.5 내지 5-10 그램의 무게가 나간다. 코어 생검은 18 또는 16 또는 14 게이지 바늘로 수행되어, 5-50 mg 샘플을 야기한다. 진공 보조 생검으로 칭해지는 비교적 새로운 절차는 또한 11 게이지 바늘, 진공 보조 디바이스(VAD)로 수행된다. 진공 보조 디바이스와 쌍으로 된 11 게이지 프로브는 전형적으로 각각의 코어 샘플에서 94 mg을 픽업한다. 진공 도움을 갖는 14 게이지 바늘은 전형적으로 37 mg을 픽업하지만, 자동화된 생검 건과 쌍으로 될 때 17 mg만을 픽업한다. 도 1에 묘사된 이러한 대안적인 방법에서, 종양 샘플로부터 수득된 세포는 해리 전 또는 후에, RGD(Arg-Gly-Asp) 풍부 화합물(예를 들면, 콜라겐, 젤라틴 또는 매트리겔®(MATRIGEL®))을 함유하는 부착성 기질로 및 본원에서 기재된 선택(무혈청) 배양 배지가 있을 때 이동된다. 기재된 선택 방법은 (a) 작은 수로 존재하는 개별적인 암 줄기세포의 초기 클론 증식을 촉진하고, 및 (d) 줄기세포의 클론 증식으로서 국부 자가분비 활성을 촉진하도록 설계된다.
부착성 기질은 단백질 예컨대 콜라겐 또는 젤라틴이 풍부한 RGD이다. 기질은 단백질 또는 펩타이드를 다양한 물질 예컨대 폴리스티렌 폴리카보네이트, 사이클릭 올레핀 공중합체 또는 유리에 부착함으로써 구성될 수 있다. RGD 펩타이드는 폴리머 골격 예컨대 하이알루론산, 폴리락트산 및 조합 상에서 그라프팅될 수 있다. 그와 같은 폴리머는 성장 인자 예컨대 프로테오글리칸(예를 들면, 헤파린 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 케라틴 설페이트, 등)에 대한 담체 종료로 추가로 증대될 수 있다.
세포 배양 표면은 직접적으로 또는 코팅제 예컨대 아미노실란을 사용하여 사용될 수 있다. 코팅은 세포에 대한 부착 특성(기질)을 갖는 화합물이고 성장 용기의 물질의 상단 상에 도포된다. 그것은 천연 화합물 예컨대 콜라겐 또는 젤라틴일 수 있고 언급된 라디칼/종료를 갖는 더 많은 합성 폴리머로 구성될 수 있다. 코팅제(접착제, 예컨대 실란)는 배양 용기 물질(예를 들면 유리)에 코팅의 부착을 개선하기 위해 사용될 수 있다. 실란은 그것이 원하는 라디칼 또는 말단기를 함유하면 단독으로 사용될 수 있다.
이러한 방법 및 제형의 경우, 다수의 세포는 상대적으로 짧은 기간에 수득될 수 있다. 수 밀리그램에서 개시하여, 조직 샘플의 배양, 예컨대 103 내지 106 세포를 함유하는 바늘 생검은 3-4 주 내에 약 108 세포로 증식될 수 있다.
HCC 줄기세포 배양의 증식 및 하위 집단의 발생
HCC-CSC는 줄기세포의 추가의 특징으로서, 규정되지 않게 전파되고 증식될 수 있다. 부착성 기질 상의 증식 배양이 도 4에 표현된다.
더욱이, HCC-CSC는 부분 또는 완전히 분화될 수 있다. 줄기세포 증식 조건이 제거되면, HCC 줄기세포는 증식을 늦추거나 정지시키고, 형태학 및 표현형을 더 분화된 세포형으로 변화시킬 수 있다. 형태학은 다중 핵 ― 더 성숙한 간세포 또는 성상 세포의 특징을 갖는 평면, 상피모양 또는 성상이 될 수 있다.
부착 배양은 정착 의존적 분화된 세포를 제거하기 위해 단일 세포 현탁액에서 해리되고 비-부착성(항-바이오파울링) 조건으로 이동될 수 있다. 2-3 일 후에, 줄기세포는 차별적인 침강에 기초하여 단일 세포로부터 분리될 수 있는 작은 스페로이드로 응집하고 클론적으로 증식하는 경향이 있다. 스페로이드는 부착 상태에서 재-평판 배양되고 더 번식될 수 있다. 이러한 방법은 배양이 분화된 세포 또는 정상 세포 예컨대 섬유아세포에 의해 추월되면, 배양 줄기세포 함량을 1-30% 내지 90-99% 줄기세포 함량으로 정화할 것이다. 방법은 줄기세포 순도를 회복하기 위해 필요한 만큼 다수 회 반복될 수 있다.
작은 스페로이드는 일반적으로 0.1 mm와 2 mm 사이의 치수를 갖는다. 크기 분포는 작은 스페로이드 당 세포의 수에 관하여, 일반적으로 10 세포와 10,000 세포 사이에 있다. 작은 스페로이드의 형상은 구형 또는 타원형일 수 있고, 또한 구형 또는 타원형 구조의 집합체로 발생할 수 있다(도 2 및 3).
환자-특이 HCC-CSC 세포주는 동일한 환자로부터의 정상 조직과 비교될 때 신생물성 형질전환에 책임이 있는 게놈 돌연변이를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 게놈 돌연변이는 분화의 모든 단계에서 발현되지 않을 수 있다. 일부 조절 단백질, 또는 전사 인자는 단지 일시적으로 발현되고 성숙 동안에 사라질 수 있어, 기형 세포를 야기하지만 정상 단백질을 갖는다. 돌연변이를 최대로 발현시키고 이러한 집단을 면역계에 노출시키는 세포 집단의 확인은 면역-요법에 대한 항원 공급원으로 암 줄기세포를 사용하는 주요 이점일 수 있다.
게놈 돌연변이를 확인함으로써, 개인화된 제형은 암 치료, 예를 들면 소분자, DNA 서열, 안티센스 RNA 또는 조합을 위해 생성될 수 있다.
그와 같은 세포주는 약물 발견을 위한 스크리닝 플레이트(예를 들면 96 웰들)를 생성하기 위해 추가로 사용될 수 있다. 다양한 환자로부터의 다중 라인은 개인 사이에서 가변성을 해결하기 위해 단일 플레이트에서 조합될 수 있다.
간세포 암종 암 줄기세포는 발생 조직의 일부 특성 예컨대 단백질, 성장 인자 및 호르몬(기능적 종양)의 분비를 유지할 수 있다. 이들 특성은 동일한 환자(예를 들면 알부민, 형질전환 성장 인자(TGF), 인슐린, 글루카곤, DOPA 등)을 위해 사용될 수 있는 “자기” 단백질을 생성하기 위해, 세포주의 불멸 특성이 주어지면 용도될 수 있다. 세포는 동일한 환자 사용을 위해 수집되고, 정제되고 보관되는 작은 생물반응기 및 분리 생성물에 도입될 수 있다. 이러한 방법은 환자가 면역 내성 예컨대 더 전통적 바이오시밀러를 발달시키지 않을 것이라는 점에서 특히 유리하다.
수지상 세포의 로딩
환자로부터 수득된 개별적인 HCC-CSC 세포주는 면역 요법을 위한 항원을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 정제된 줄기세포주를 사용하는 이점은 더 나은 신호 대 잡음비에 있다. 종양으로부터 더 성숙한 세포는 항원성을 마스킹할 수 있고 면역계에 의해 확인될 수 없는 보상 기전을 가질 수 있다. 항원 공급원으로서, HCC-CSC는 활동 상태로 사용되거나, 유사분열로 불활성이거나, 생존불가능하거나 단편화될 수 있다. 다양한 방법은 최적의 항원 노출을 위해 세포를 변형하기 위해 사용될 수 있다: 복사 에너지(예를 들면, 감마, UV, X), 온도(예를 들면, 뜨거운 또는 차가운), 또는 화학적(예를 들면, 세포증식억제성, 알데하이드, 알코올) 또는 조합.
예시적인 실행에서, 본 개시내용은 수지상 세포(DC)를 보조제 예컨대 CD40 작용제, 예를 들면 CD40-리간드, 또는 사이토카인, 인터페론-감마, 프로스타글란딘 E2 등뿐만 아니라, 1 이상 면역 보조제, 예컨대 톨(toll)-유사 수용체(TLR) 작용제, 예를 들면 CpG-올리고뉴클레오타이드(TLR9), 이미퀴모드(TLR7), 폴리(l:C)(TLR3), 글루코피라노실 지질 A(TLR4), 무레인(TLR2), 플라젤린(TLR5)으로 활성화하는 시약 및 방법을 포함한다. 예를 들면, 미국 특허 제7,993,659호; 미국 제7,993,648호; 미국7,935,804호를 참조하며, 이들 각각은 DC를 활성화하는 것에 관하여 개시하는 모든 것에 대해 본원에 참고로 편입된다. 본 개시내용은 상기 보조제 시약 중 1 이상으로 DC의 생체외 치료, 또는 또한, 또는 대안적으로, 인간 대상체, 동물 대상체, 또는 수의적 대상체에 보조제의 투여를 포함한다.
면역계는 세포성 면역력, 체액성 면역, 및 보체 반응을 포함한다. 세포성 면역력은 수지상 세포, CD8+ T 세포(세포독성 T 세포; 세포독성 림프구), 및 CD4+ T 세포(헬퍼 T 세포)를 수반하는 세포 및 이벤트의 네트워크를 포함한다. 수지상 세포(DC)는 폴리펩타이드 항원을 수득하며, 이들 항원은 DC의 외부로부터 수득되거나, 또는 감염 유기체에 의해 DC의 내부에서 생합성될 수 있다. DC는 폴리펩타이드를 가공하여, 길이로 약 10 아미노산의 펩타이드를 야기하고, 펩타이드를 복합체를 형성하기 위해 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II에 전달하고, 복합체를 DC의 표면으로 왕복시킨다. MHC 클래스 I/펩타이드 복합체를 함유한 DC가 CD8+ T 세포와 접촉할 때, 결과는 CD8+ T 세포의 활성화 및 증식이다. MHC 클래스 II의 역할에 관해, MHC 클래스 II/펩타이드 복합체를 함유한 DC가 CD4+ T 세포와 접촉할 때, 결과는 CD4+ T 세포의 활성화 및 증식이다. 항원을 T 세포에 제공하는 수지상 세포가 그러한 T 세포를 "활성화" 할 수 있지만, 활성화된 T 세포는 효과적인 면역 반응을 개시가능하지 않을 수 있다. CD8+ T 세포에 의한 효과적인 면역 반응은 종종 수많은 상호작용 중 1 이상에 의한 DC의 사전 자극을 필요로 한다. 이들 상호작용은 DC에 대한 CD4+ T 세포의 직접 접촉(CD4+ T 세포의 CD40 리간드를 DC CD40 수용체에 접촉시키는 것에 의함), 또는 수지상 세포의 톨(toll)-유사 수용체(TLRs) 중 하나에 대한 TLR 작용제의 직접 접촉을 포함한다.
체액성 면역은 B 세포 및 항체를 언급한다. B 세포는 형질 세포로 형질전환되고, 형질 세포는 항체를 발현하고 분비한다. 미접촉 B 세포는 그들이 마커 CD27을 발현하지 않는 반면, 항원-특이 B 세포는 CD27을 발현한다는 점에서 구별된다. 분비된 항체는 차후에 종양 세포의 표면 상에 상주하는 종양 항원에 결합할 수 있다. 결과는 감염된 세포 또는 종양 세포가 항체로 태그되는 것이다. 감염된 세포 또는 종양 세포에 항체의 결합의 경우, 결합된 항체는 감염된 세포 또는 종양 세포의 살해를 매개하며, 살해는 NK 세포에 의한 것이다. NK 세포는 특이 표적 항원을 인식하도록 구성되지 않지만, T 세포가 표적 항원을 인식하도록 구성되는 방식으로, 항체의 불면 영역에 결합하는 NK 세포의 능력은 NK 세포가 항체로 태그된 세포를 특이적으로 살해할 수 있게 한다. 항체의 NK 세포의 인식은 항체의 Fc 부분에 결합하는 (NK 세포의) Fc 수용체에 의해 매개된다. 이러한 유형의 살해는 항체-의존적 세포 세포독성(ADCC)으로 칭해진다. NK 세포는 또한 ADCC의 기전과 독립적으로 세포를 살해할 수 있으며, 이러한 살해는 MHC 클래스의 발현이 표적 세포에서 분실되거나 결핍되는 것을 필요로 한다.
임의의 특정한 기전에 구속되고자 하는 것 없이, 개시내용은 암 줄기세포 항원의 투여, 또는 암 줄기세포 항원으로 로딩된 수지상 세포의 투여를 포함하며, 항원은 암 줄기세포 항원 중 1 이상을 특이적으로 인식하는 항체의 생산을 자극하고, 항체는 ADCC를 매개한다. 항원으로 로딩된 어구는 생존 세포를 포획하거나, 괴저성 세포를 포획하거나, 죽은 세포를 포획하거나, 폴리펩타이드를 포획하거나, 펩타이드를 포획하는 등하는 수지상 세포의 능력을 언급한다.
교차-제시에 의한 포획은 본 개시내용에 의해 포함된다. 또한 수지상 세포, 예컨대 대식세포 또는 B 세포가 아닌 항원-제시 세포의 사용이 포함된다.
"지연된 유형 과민증 반응"의 기술은 세포성 면역력을 주로 수반하거나 체액성 면역을 주로 수반하는 면역 반응을 구별하기 위해 사용될 수 있다. 지연된 유형 과민증 반응으로부터의 양성 신호는 세포성 반응을 표시한다.
본 개시내용은 조성물 및 방법을 제공하며, 종양 세포는 예를 들면 방사선, 핵산 가교결합제, 폴리펩타이드 링커, 또는 이들의 조합에 의해 불활성화된다. 가교결합은 사슬의 어떤 탄소 원자를 일차 화학 결합에 의해 연결하는 요소, 그룹, 또는 화합물로 구성되는, 브릿지에 의한 폴리머 분자의 2개 사슬의 부착이다. 가교결합은 케라틴 또는 인슐린, 3가 피리디놀린 및 성숙한 콜라겐의 피롤 교차-가교, 및 혈전 글루타민 잔류물의 감마-카복시-아민 그룹과 라이신 잔류물의 엡실론-아미노 그룹 사이의 공유 엡실론-(감마-글루타밀)라이신 교차-가교를 수반하는 혈전 내의 교차-가교에서와 같이, 2개의 시스테인 잔기를 수반하는 디설파이드 결합에 의해 연결되는 폴리펩타이드 사슬로 구성되는 물질에서 본질적으로 발생한다.
가교결합은 화학적 물질(가교결합제)을 추가하거나, 폴리머를 고-에너지 방사선을 받게 함으로써, 단백질에서 인공적으로 영향을 받을 수 있다. 정착액 및 열-유도된 응집을 갖는 가교결합은 증식을 완전히 억제할 뿐만 아니라 면역 반응을 증대키는 것으로 나타났다. 표면 상에서 교차-가교 단백질로 사용되고, 따라서 HCC-CSC의 증식을 방지할 수 있는 물질은 비제한적으로, 10% 중성-버퍼 포르말린, 4% 파라포름알데하이드, 1% 글루타르알데하이드, 0.25-5mM 디메틸 수베르이미데이트, 빙랭 100% 아세톤 또는 100% 메탄올을 포함한다. 추가로, 0.1 M 포스페이트 완충 용액에서 1% 글루타르알데하이드 및 4% 파라포름알데하이드의 조합이 또한 사용될 수 있다.
포름알데하이드 및 글루타르알데하이드는 T 헬퍼 유형 1 및 2형 세포의 활성화를 유도하는 것으로 둘 모두 제시되었다. 특히, 항원의 열 유도된 응집은 또한 세포독성 T 림프구의 생체내 프라이밍을 증대시키는 것으로 제시되었다. 3,3'-디티오비스(설포석신이미딜프로피오네이트)에 의한 항원의 가교결합은 수지상 세포에 항원의 증가된 결합을 야기하고 가교결합된 항원은 항원 전달을 위한 프로테오소말 경로를 통해 가공된다. 더욱이, 포르말린 고정된 간세포 암종 종양 세포는 증식의 증거가 없는 임상시험에서 사용되었다.
일 구현예에서, 전체의 HCC-CSC는 가교결합 제조로 고정되고, 그 다음 수지상 세포와 조합으로 항원 공급원으로 사용된다.
또 하나의 구현예에서, 세포의 핵산은 가교결합된다. 예시적인 핵산 알킬화제는 베타-알라닌, N-(아크리딘-9-일), 2-[비스(2-클로로에틸)아미노]에틸 에스테르이다. 예시적인 가교결합제, 예컨대 소랄렌은 종종 자외선(UVA) 조사와 조합으로, DNA를 교차-가교하지만 단백질을 비변형 상태로 방치하는 능력을 갖는다. 예를 들면, 핵산 표적 화합물은 4'-(4-아미노-2-옥사)부틸-4,5',8-트리메틸소랄렌(S-59)일 수 있다. 세포는 150 μM 소랄렌 S-59 및 3 J/cm2 UVA 광(FX 1019 irradiation device, Baxter Fenwal, Round Lake, IL)으로 불활성화될 수 있다. UV 광에 의한 S-59와의 불활성화는 광화학적 치료로 언급되며, 치료 조건은 세포 분열이 완전히 예방되는 정도로 가교결합된 DNA에 조정되거나 적정될 수 있지만, 폴리펩타이드 항원을 포함하는 폴리펩타이드에 대한 손상이 최소화된다. 세포는 소랄렌 S-59의 0, 1, 10, 100, 및 1000 nM를 함유하는 5 mL의 염수에서 현탁될 수 있다. 샘플은 대략 2 J/cm2의 용량에서 UVA 조사될 수 있다. 그 다음, 각각의 샘플은 15 mL 튜브로 이동되고, 원심분리되고, 상청액 제거되고, 그 다음 5 mL 염수로 세정되고, 원심분리되고 상청액 제거되고 0.5 mL의 염수에서 최종 펠렛에서 현탁될 수 있다. 미국 특허 제7,833,775호 및 제7,691,393호를 참조하며, 이는 그것이 세포의 불활성화에 관해 논의하는 모든 것에 대해 본원에 참고로 편입된다.
가교결합제로 가공되는 임의의 세포 제제에 대해, 분열하는 능력은 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4주, 적어도 5주, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월 등 동안 표준 배지에서 인큐베이팅하거나 배양함으로써 숙련가에 의해 시험될 수 있다. 세포 분열은 염색체를 드러내고, 세포 분열이 발생하고 있거나, 발생하고 있지 않다는 것을 드러내는 착색제에 의해 평가될 수 있다. 세포 분열은 또한 계수 세포에 의해 측정될 수 있다. 따라서, 배양판의 세포의 수는 2주, 1개월, 또는 2개월 등의 기간 동안 안정하게 잔존하는 경우에, 세포가 분열할 수 없는 결론이 상당히 내려질 수 있다.
일 구현예에서, 수지상 세포 면역원성 조성물은 피하로(SC) 투여된다. 추가 구현예에서, 각각의 용량은 범위가 약 5백만에서 2천만 로딩된 DC에 이르며, 일련의 6-10 용량으로 반복된다. 특정 구현예에서, 용량은 2, 3, 4, 5 또는 6 용량에 대해 매 5일, 매주, 매 10일, 격주, 또는 매 셋째 주 투여되며, 그 다음 총 6-10 용량에 대한 추가 용량의 2, 3, 4, 5 또는 6 용량에 대해 매 2주, 매 3주, 매 4주, 매월, 매 5주, 또는 매 6주에 대해 용량의 투여가 이어진다. 일 구현예에서, 제1의 4개 주사는 1개월 동안 매주 제공되고, 그 다음에 다음 4개 주사에 대해 1개월에 1회 제공된다. 대안적인 구현예에서, 투여는 총 8 투여에 대해 3주 동안 1주 1회이며 그 다음 5개월 동안 1개월 1회이다.
각각의 용량은 약 5-20x106 로딩된 DC, 약 5-17x106 로딩된 DC, 약 6-16x106 로딩된 DC, 약 7-15x106 로딩된 DC, 약 7-14x106 로딩된 DC, 약 8-13x106 로딩된 DC, 약 8-12x106 로딩된 DC, 또는 약 9-11x106 로딩된 DC를 포함한다. 추가 구현예에서, 각각의 용량은 약 8x106 로딩된 DC, 약 9x106 로딩된 DC, 약 10x106 로딩된 DC, 약 11x106 로딩된 DC, 또는 약 12x106 로딩된 DC를 포함한다. 로딩된 DC는 DC 및 DC에 의해 차지되지 않았던 잔류 HCC-CSC의 혼합물을 포함한다. 투여된 용량은 이들 세포의 혼합물을 포함하고 용량은 이러한 혼합물을 반영한다.
또 하나의 구현예에서, 로딩된 DC는 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제로 투여된다. 본원에서 기재된 약제학적으로 허용가능한 부형제, 예를 들면 비히클, 보조제, 담체 또는 희석제는 당해 기술분야의 숙련자에 공지되어 있고 공공에게 쉽게 용도가능하다. 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제는로딩된 DC에 화학적으로 불활성인 것 및 사용의 조건 하에 해로운 부작용 또는 독성을 갖지 않는 것인 것이 바람직하다.
부형제 또는 담체의 선택은 조성물을 투여하기 위해 사용된 특정한 방법에 의해서뿐만 아니라, 특정한 치료적 조성물에 의해 부분적으로 결정될 것이다. 본원에서 기재된 제형은 단지 예시적이고 결코 제한이 아니다.
종종 생리적으로 허용가능한 담체는 수성 pH 완충된 용액이다. 생리적으로 허용가능한 담체의 예는 비제한적으로, 염수, 용매, 분산매, 세포 배양 배지, 수성 버퍼 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저분자량(약 10 잔류물 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코오스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트제 예컨대 EDTA; 당 알코올 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온 예컨대 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제 예컨대 TWEEN™, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 및 플루로닉스™(PLURONICS™)을 포함한다.
일부 예시적인 실행에서, 부스트 보조제(GM-CSF)는 모든 용량으로 동시에 주어진다. 특정 구현예에서, 세포 용량은 GM-CSF를 함유하는 담체에서 현탁된다. 대안적인 예시적인 실행에서, GM-CSF 부스트 보조제가 주어지지만, 매번 단회 용량으로는 아니다. 다른 예시적인 실행에서, GM-CSF 부스트 보조제는 전혀 없다.
비제한적으로, 수지상 세포(예를 들면, 자가조직 또는 동종이계 수지상 세포)는 세포 용해물, 산 용출, 세포 추출물, 부분적으로 정제된 항원, 정제된 항원, 단리된 항원, 부분적으로 정제된 펩타이드, 정제된 펩타이드, 단리된 펩타이드, 합성 펩타이드, 또는 이들의 임의의 조합으로 암 줄시세포 항원과 접촉된다. 그 다음, 수지상 세포는 대상체, 예를 들면 HCC를 갖는 대상체, 또는 HCC를 갖지 않는 대조군 대상체에 투여된다. 예시적인 실행에서, 수지상 세포는 창자 내강 등으로의 적용에 의해, 피하, 복강내, 결절내(intranodal), 근육내, 정맥내, 비강내, 흡입, 경구 경로 중 1 이상과 접촉되거나, 그들로 주사되거나, 그들에 의해 투여된다. 추가로, 면역원성 조성물은 종양 또는 전이의 부위에 직접적으로 투여될 수 있다.
실시예
실시예 1
바늘 흡인 생검으로부터의 HCC 암 줄기세포의 단리 및 증식
간세포 암종(HCC) 종양 샘플은 정상 실질, 기질 및 혈관 세포와 함께, 다소 분화된 암 세포로 구성되는, 조직학적으로 이종성이다. 여기서 제공되는 방법의 목적은 작은 HCC 샘플로부터 유도된 암 줄기세포의 집단을 단리하고 증식시키는 것이다. 게다가, 이들 세포는 HCC의 재발의 치료 및 예방을 위한 자가조직 요법을 제조하기 위해 사용된다.
절차 및 시약은 전형적인 줄기세포를 지속하고, 분화된 간세포, 담도성 상피, 혈관 내피 세포, 평활근 세포, 또는 섬유아세포의 잔존/증식을 시험관내에서 지속하지 않도록 설계되었다. 문헌 예컨대 코르티코스테로이드 및 혈청에 기재된 전형적인 성분은 생략되었으며; 그 대신 단백질로 보강된 아미노산 및 비타민의 특이 비율을 갖는 기초 배지 제형이 사용되었다.
바늘 흡인 생검은 거시적으로 확인된 병리적 분야로부터 간 종양으로 진단된 동의된 환자로부터 수득되었다. 생검은 수송 배지 내의 폐쇄된 용기에 즉시 이동되었고 조절된 온도(4-8℃)에서 조직 처리 시설에 전달되었다. 그 다음, 생검은 30분 동안 콜라게나제 IV(4 mg/mL)의 용액에서 해리되었다. 수득한 세포 현탁액은 원심분리 후에 0.1% 젤라틴으로 코팅된 폴리스티렌 배양 플라스크에 이동되었고 약 2-4 주 동안 증식하도록 허용되었다. 이틀마다 배양물은 줄기세포에 대한 기저 제형으로 구성되는 새로운 배지에 공급되었고 단백질/성장 인자 혼합물로 보강되었다. 제형은 표 2, 3 및 4에서 재생산된다. 추가로, 10 ng/mL에서의 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 및 10 ng/mL에서의 EGF는 공급 시간에 혼합물에 포함되었다.
강력한 배양 확립 후에 그리고 배양이 60-100% 밀집도에 도달한 때, 배양물은 프로테올리틱 효소(트립신, TrypLE)로 해리되었고 다음 2-6 추이 동안 1:2 내지 1:10의 비율에서 더 큰 표면 상에 재-평판 배양되었다. 그 다음, 세포는 이미지화 챔버에서 평판 배양되었고 간세포 암종에 특이한 항체로 염색되었다.
배양물은 첫번째에서 서서히 성장하기 시작했으며(도 9), 약 14-21 일 후에 콜로니 재조립 구조가 확인되었다(도 10). 효소에 의한 해리 및 이들 콜로니의 추이는 강렬하게 증식하는 배양물의 단일층에 대해 수득되었다(도 11). 콜라게나제 IV로의 추이 동안의 해리는 단일층 배양물의 확립을 예방하였다.
2 내지 6 추이 후에, 세포주는 사이토케라틴(Ck19, Ck7), 종양 특이적 마커(알파 태아-단백질[AFP], ABCG2), 접합 부착(EpCAM, NCAM, CD44), 증식 마커(Ki67), 및 상피-간엽 전이(EMT) 마커(슬러그/스네일, 트위스트)에 대해 면역-세포화학적으로 분석되었다.
이 결과가 나타내는 바와 같이, 간 암 마커(AFP)는 가변으로 발현되지만(도 12a-도 12c 및 표 5), NCAM(또한 신경 세포 접합 부착, CD56으로 공지됨)의 존재는 (표 5의 Ki67에 의해 제시되는 바와 같이) 높은 증식 지수를 갖는 샘플의 100%로 보여진다(도 13a-도 13c, 표 5). NCAM은 세포-대-세포 부착을 허용하고 종양의 침투성 능력을 설명하는 특이성 및 비특이성 특성을 갖는 접합 부착이다. 이전의 조사는 조작된 사례로부터의 8.3% 신선한 종양만이 NCAM에 대해 양성인 것을 나타낸다. 따라서, 배양 조건은 HCC-CSC의 양성 선택 및 농축을 야기하였다. HCC 세포의 더 분화된 표현형이 배양 조건에 의해 지속되지 않는 것을 제안하는 상피 마커(EpCAM, 사이토케라틴)의 손실은 현저하다. 일차 HCC 내의 NCAM의 존재는 증가된 악성종양 및 전이성 잠재력을 나타낸다.
표 5. 바늘 생검으로부터의 종양 샘플의 면역-세포화학적 특성규명.
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표면 항원 CD44, 하이알루로난 수용체는 종양 세포의 이동도 및 전이성 특성과 공지된 연관을 갖는다. 분석된 샘플에서 대다수의 세포(90-100% 이상)는 CD44에 대해 양성이다(도 14a-도 14c).
슬러그/스네일 및 비멘틴 마커의 존재는 상피 마커(사이토케라틴, EpCAM)의 손실이 종양 세포가 종양 줄기세포 특성(CD44, NCAM)을 수득하는 상피-간엽 전이 과정에 의해 야기되는 것을 나타낸다(도 15a-도 15d).
이러한 데이터는 제공된 무혈청 배지 제형, 기질 및 전파 방법이 작은 바늘 생검으로부터 수득된 최초 혼합된 종양 집단으로부터 암 줄기세포 조상세포의 선택 및/또는 전이를 야기한 것을 나타낸다. 혈청 함유 배지(0.5-5%) 내의 증식 및 전파는 1-2 추이 후에 증식 단계를 가속화할 수 있지만; 콜라겐 기반 기질(젤라틴, RGD 펩타이드) 및 성장 인자 예컨대 FGF 및 EGF와의 조합은 선택 단계 동안에 지속할 수 있는 섬유아세포 또는 근아세포의 원치않는 증식을 야기할 수 있다.
실시예 2
로딩된 수지상 세포 조성물의 생산
항원 공급원은 환자의 신선한 종양 조직으로부터 유도된 연속적으로 증식, 자가-갱신하는 세포로부터의 자가조직 종양 세포이다. 이들 세포는 종양 줄기세포의 특성을 갖는다. 항상 수술 및 병리학 설정에서, 생검은 샘플이 멸균되는 것을 보장하기 위해 멸균 프로토콜에 대해 엄격한 부착으로 처리된다.
병리학자는 환자의 종양의 생검으로부터 신선한 조직을 수득한다. 멸균된 메스 및 겸자를 사용하여, 시료는 10 mm 슬라이스로 절단되고 수송 배지를 포함하는 운송 튜브로 이동되어, 시료 건조를 회피하기 위해 빠르게 작업한다. 시료는 수술 절제의 48 시간 내에 제조 시설에 속달로 운송된다.
제조 시설에서, 샘플은 클린 룸에서 단일 세포 현탁액으로 해리되고 HCC-CSC를 풍부하게 하고 증식시키도록 설계된 세포 배양 조건에 배치된다. 종양 시료의 가공 동안에, 정상 세포 예컨대 림프구, 기질 세포 및 결합 조직이 제거된다. 증식 및 정제 단계가 완료되면, 농축된 증식 HCC-CSC(종양 세포, TC)는 조사(항원 제시 세포에 대한 항원 노출을 용이하게 하는 세포자멸사)에 의해 불활성화 되고 증기상 액체 질소 보관에 배치된다. 이러한 과정은 종양 시료의 양 및 품질에 따라, 최대 8주 걸릴 수 있다.
종양 세포 생성물이 허가된 품질 보장을 가지면, 환자는 백혈구분리반출법(보통 6 리터 절차)으로 칭해지는 절차를 받는 것을 통지받는다. 이러한 과정은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 수집하기 위해 혈액의 필터링을 수반한다. 수집된 PBMC는 정화로 칭해지는 역류 밀도 원심분리에 의한 추가 정제를 위해 제조 시설에 속달로 운송된다. 정화는 단핵구가 항원 제시 세포 또는 수지상 세포로 바뀔 수 있는 세포를 풍부하게 하기 위해 다른 림프구로부터 정제되는 공정이다. 수지상 세포를 생성하기 위해, 정화된 단핵구는 6일 동안 사이토카인 GM-CSF 및 인터루킨-4(IL-4)으로 인큐베이션된다.
6일째에, 정제된 종양 세포 생성물은 냉동보관으로부터 제거되고, 해동되고 18-24 시간 동안 수지상 세포와 조합된다. 이러한 공정은 DC의 "항원 부하"를 야기한다. 최종 생성물은 전적으로 DC이거나 일부 잔류 조사된 TC(허용되는 것으로 간주됨)를 포함할 수 있고, DC-TC로 언급된다. 조합된 수지상 세포/종양 세포 혼합물은 수집되고, 수지상 세포의 생존력을 유지하기 위해 냉동보존되고 증기상 액체 질소에 보관된다.
품질관리 검정의 완료 및 자가조직 세포 요법 생성물의 출시에 따라, 배치는 증기상 액체 질소 조건 하에 치료 시설로 운송된다. 도착 후에, 세포 요법 생성물은 투여를 위해 제조될 때까지 증기상 액체 질소 조건 하에 보관된다.
실시예 3
단계 I 간세포 암종을 갖는 B형 간염-양성 환자에서 자가조직 조사된 종양 줄기세포로 펄싱된 자가조직 수지상 세포에 의한 특이 면역요법의 시도
간세포 암종은 진단에서 검출불가능한 미세전이성 질환 때문에 표준 요법에 의해 좀처럼 경화되지 않는다. 더욱이, HCC는 종종 B형 간염 바이러스(HBV) 감염의 증거와 연관되며, 이는 환자가 간 이식에 적합하지 않게 한다. 자가조직 수지상 세포가 자가조직 종양 줄기세포로부터의 항원으로 로딩되는 활성 특이 면역요법(ASI)은 전이성 흑색종을 갖는 환자에서 유망한 장기간 생존 결과와 연관되었지만, HBV를 갖는 환자는 그런 시도로부터 제외되었다. 이러한 ASI 접근법은 HCC를 포함하는 다른 종양 유형에서 평가할 가치가 있다. 수술 절제는 많은 환자에 대한 표준 요법의 일부이며, 이로써 자가조직 종양 세포주의 발생에 대한 종양의 공급원을 제공한다. ASI는 이전의 임상 연구(흑색종, 단계 1, 및 2)에서 유의미한 독성과 연관되지 않았지만, 이론적으로 ASI는 HBV에 대해 내인성 면역 반응을“전환시키고”, 따라서 바이러스성 감염의 악화를 초래할 수 있다. 이러한 이유로 단계 I 안전성 시도는 HCC 및 HPB를 갖는 환자에서 단계 II 효능 시도의 고려 전에 보증되었다.
방법: 환자 등록을 위한 주요 적격성 기준은 수술 절제를 잘 받아들이는 이전에 치료되지 않은 일차 간세포 암종(> 5 cm 고립성 병변 또는 다중 병변 ≥ 3cm), 간 이식에 대한 후보가 아닌 HBV의 이력, 백혈구분리반출법을 받는 능력, 간 트랜스-카테터 동맥 화학색전술(TACE)에 대한 후보자격, A, ECOG 0-1의 차일드 푸 등급(Child-Pugh Rating), 및 적절한 혈구 수치를 포함했고, 알부민 ≥ 3.5 mg/dl, 및 아미노기전달효소의 최대 3-배 상승을 포함하는 신장 및 간 기능이 허용되었다.
30-60 분 동안 종양 샘플의 콜라게나제 소화에서 기인하는 세포 현탁액은 증식하는 HCC-CSC 스페로이드의 라인을 생성하기 위해, 10 ng/mL bFGF 및 10 ng/mL EGF로 보강된 표 2, 표 3 및 표 4의 배양 배지 내의 초-저 부착 플라스크(Corning)로 이동되고 14일 동안 그것에서 유지되었다.
100 내지 대략 10,000 세포로 구성되는 스페로이드는 공급에서 차별적인 중력에 의해 형성되고 정제되었다. 그 다음, 스페로이드는 0.1% 젤라틴 코팅된 플라스크로 이동되었고 부착되고 증식되도록 허용되었다. 또 하나의 3-4 주의 기간 동안, 배양물은 효소에 의한 해리에 의해 점진적으로 증식되었고 매 3-7 일에 더 큰 표면 상에 평탄 배양되었다. 배지는 추가로 이러한 단계에서 5% 우태 혈청(FBS)으로 보강되었다. 최종 수확에서, 세포는 코발트-60 공급원 방사선 조사기에서 100 Gy 방사선에 노출되었다. 조사 효율은 각 경우에 비-증식성 검정으로 확인되었다.
수지상 세포(DC)는 종양 샘플과 동일한 환자로부터 백혈구분리반출법에 의해 수득된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 유도되었다. 그 다음, HCC-CSC(TC)는 냉동보존되었던 DC/HCC-CSC 조성물을 생성하기 위해 밤새(18 내지 24시간) DC로 인큐베이션되었다. 그 동안에, 환자는 TACE의 하나의 코스를 받았고 6-8 주 후에 DC/TC 조성물 상에서 시작되었다. 치료 시에, DC/TC 조성물은 3주 동안 매주 피하 주사를 위해 500 ㎍ 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)에서 융해 및 현탁되고 환자는 추가 5주 동안 독성에 대해 감시되었다.
결과: 종양은 18명의 환자로부터 수집되었고 세포주는 이들 18명의 환자 샘플로부터 확립되었다. 특징화된 HCC-CSC의 표현형은 표 6에 포함된다. HCC-CSC 표현형은 AFP 및 NCAM의 풍부한 존재, 크게 증식하는(Ki67) 능력, 및 다른 특이 마커(EpCAM, CK19, CK7, ABCG2)의 다양한 수준 및 양에 의해 정의되었다. AFP의 존재, 간 악성종양에서 임상 사용을 위해 현재 권고된 현재 마커만이 모든 조사된 샘플에서 확인되었다. 이러한 데이터는 환자-유도된 세포주 상에서 AFP 및 NCAM의 존재에 의하여 특징화되는 HCC-CSC의 양성 선택을 증명하고 상피 마커(EpCAM 및 사이토케라틴)의 낮은 발현에 근거하여 상피-간엽 전이 과정을 제안한다.
표 6. HCC-CSC 세포주에서 성공적으로 수득된 종양 샘플의 면역-세포화학적 특성규명.
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8명의 환자가 DC/TC 조성물로 치료되었고 모든 8명은 계획된 3 주사를 받았다. 치료된 환자는 포함된 1명의 남성 및 7명의 여성을 포함했다. 중위 연령은 범위가 37에서 73에 이르는 56.5년이었다. 치료 시에, 모든 환자는 0의 ECOG를 가졌다. 주사는 심각한 급성 독성을 갖지 않는 것으로 잘-용인되었다. 정량적 HBV DNA 분석을 포함하는 완벽한 정량적 바이러스 테스팅에 의해 입증된 바와 같은 간 아미노기전달효소 또는 B형 간염 바이러스혈증의 증가가 없었다. 심각한 또는 생명 위협(등급 4 또는 5) 독성이 기록되지 않았다.
결론: B형 간염과 연관되는 HCC로부터 단리된 자가조직 DC/TC 조성물을 갖는 치료는 B형 간염의 악화와 연관되지 않는다.
달리 지적되지 않으면, 명세서 및 청구항에 사용되는 성분의 양, 특성 예컨대 분자량, 반응 조건 등을 표현하는 모든 수는 용어 “약”에 의해 모든 경우에 변형되는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용된 바와 같이 용어들 "약" 및 “대략”은 10 내지 15% 내, 바람직하게는 5 내지 10% 내를 의미한다. 따라서, 상반되게 지적되지 않으면, 명세서 및 부가된 청구항들에 진술되는 대수적 파라미터는 본 발명에 의해 수득되도록 추구되는 원하는 특성에 따라 변할 수 있는 근사치이다. 적어도, 그리고 균등론의 적용을 청구항의 범위에 제한하는 시도가 아니라, 각각의 대수적 파라미터는 보고된 유효숫자의 수를 고려하여 그리고 보통의 반올림 기법을 적용함으로써 적어도 해석되어야 한다. 넓은 범위의 본 발명을 진술하는 수치 범위 및 파라미터가 근사치임에도 불구하고, 구체적인 예에 진술되는 수치는 가능한 한 정확하게 보고된다. 그러나, 임의의 수치는 본질적으로 그것의 각각의 테스팅 측정에서 발견되는 표준 편차에서 필연적으로 기인하는 어떤 오차를 포함한다.
본 발명을 설명하는 맥락(특히 하기 청구항들의 맥락)에 사용되는 용어들 하나의(“a”, “an”), 상기(“the”) 및 유사한 지시대상은 본원에 달리 지적되지 않거나 맥락에 의해 명확히 부정되지 않으면, 단수 및 복수 둘 모두를 망라하도록 해석되어야 한다. 본원에서 값의 범위의 설명은 범위 내에 있는 각각의 개별 값을 개별적으로 언급하는 속기 방법의 역할을 하도록 단지 의도된다. 본원에서 달리 지적되지 않으면, 각각의 개별적인 값은 그것이 본원에서 개별적으로 인용되었다면 명세서로 편입된다. 본원에서 기재된 모든 방법은 본원에서 달리 지적되지 않거나 맥락에 의해 달리 명확히 부정되지 않으면 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 제공된 임의의 및 모든 예, 또는 예시적인 언어(예를 들면, “예컨대”)의 사용은 본 발명을 더 좋게 설명하도록 단지 의도되고 달리 청구된 본 발명의 범위에 한계를 제기하지 않는다. 명세서 내의 언어는 본 발명의 실시예 필수적인 임의의 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되지 않아야 한다.
본원에서 개시된 본 발명의 요소 또는 구현예의 그룹화는 한계로 해석되지 않아야 한다. 각 그룹 멤버는 개별적으로 또는 본원에서 발견되는 그룹의 다른 멤버 또는 다른 요소와 임의의 조합으로 언급되고 청구될 수 있다. 그룹의 1 이상 멤버는 편리 및/또는 특허성의 이유로 그룹에 포함되거나, 그룹으로부터 삭제될 수 있는 것으로 기대된다. 임의의 그러한 포함 또는 결실이 발생할 때, 명세서는 변형된 바와 같은 그룹을 포함하는 것으로 간주되며 따라서 부가된 청구항들에 사용된 모든 마쿠쉬 그룹의 서면 설명을 이행한다.
본 발명을 수행하는 발명자들에게 공지된 최상의 방식을 포함하는, 본 발명의 특정 구현예가 본원에서 기재된다. 물론, 이들 기재된 구현예에 관한 변화는 이전의 설명을 판독하면 당해분야의 숙련가에게 분명할 것이다. 발명자는 숙련가가 그러한 변화를 적절하게 용도하는 것을 기대하고, 발명자들은 본 발명이 본원에서 특이적으로 기재된 것과 다르게 실시되도록 의도한다. 따라서, 본 발명은 준거법에 의해 허용되는 바와 같이 여기에 첨부되는 청구항들에 인용된 요지의 모든 변형 및 균등물을 포함한다. 게다가, 그것의 모든 가능한 변화 내의 상기-기재된 요소의 임의의 조합은 본 발명 본원에서 달리 지적되지 않거나 맥락에 의해 달리 명확히 부정되지 않으면 본 발명에 의해 포함된다.
본원에서 개시된 특정 구현예는 언어로 구성되거나 본질적으로 구성되는 것을 사용하는 청구항들에서 추가로 제한될 수 있다. 청구항들에서 사용될 때, 보정서마다 제출되거나 부가되든지, 이행 용어 “로 구성되는”은 청구항들에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계, 또는 성분을 배제한다. 이행 용어 “본질적으로 구성되는”은 청구범위를 명시된 물질 또는 단계 및 기초적이고 새로운 특징(들)에 물질적으로 영향을 미치지 않는 것들에 제한한다. 그렇게 청구된 본 발명의 구현예는 본원에서 본질적으로 또는 명확히 기재되고 가능하다.
더욱이, 수많은 참조문헌은 본 명세서 도처에서 특허들 및 인쇄된 공보에 이루어졌다. 각각의 상기-인용된 참조문헌 및 인쇄된 공보는 그 전체가 참고로 본원에 개별적으로 편입된다.
끝으로, 본원에서 개시된 본 발명의 구현예는 본 발명의 원리를 예증한다는 점이 이해되어야 한다. 용도될 수 있는 다른 변형은 본 발명의 범위 내에 있다. 따라서, 한계가 아닌 예로써, 본 발명의 대안적인 입체배치는 본원에서의 교시에 따라 용도될 수 있다. 따라서, 본 발명은 도시되고 기재된 바와 같은 것에 정확하게 제한되지 않는다.
따라서, 예시적인 실행에 적용된 바와 같은 개시내용의 근본적인 새로운 특징 및/또는 그것의 측면이 도시되고 기재되고 지적되었지만, 예시적인 실행, 개시내용 및 그것의 측면의 형태 및 세부사항에서 다양한 누락, 재입체배치 및 치환 및 변화는 개시내용 및/또는 청구항들의 사상으로부터 벗어나는 것 없이 당해분야의 숙련자에 의해 이루어질 수 있다는 점이 이해될 것이다. 예를 들면, 동일한 결과를 달성하는 실질적으로 동일한 방식으로 실질적으로 동일한 기능을 수행하는 그들 요소 및/또는 방법 단계의 모든 조합은 개시내용의 범위 내에 있도록 명확히 의도된다. 게다가, 임의의 개시된 형태 또는 실행과 관련하여 도시되고/되거나 기재된 구조 및/또는 요소 및/또는 방법 단계는 디자인 선택의 일반적인 문제로 임의의 다른 개시된 또는 기재된 또는 제안된 형태 또는 실행에 편입될 수 있다는 점이 인식되어야 한다. 따라서, 그것은 개시내용의 범위를 제한하지 않도록 의도된다. 모든 그와 같은 변형은 이에 첨부된 청구항의 범위 내에 있도록 의도된다.
본 명세서에서 인용된 모든 공보, 특허들, 특허 적용, 참조문헌, 및 서열목록은 본원에 완전히 진술되어 있는 것처럼 본원에 이러한 참조에 의해 편입된다.
요약은 독자가 기술 기술내용의 특성 및 요지를 빠르게 확인하는 것을 허용하기 위해 37 CFR §1.72(b)에 따라 제공된다. 요약은 청구항들의 범위 또는 의미를 해석하거나 제한하기 위해 사용되지 않는다는 조건으로 제출된다.

Claims (71)

  1. 정제된 간세포 암종(HCC) 암 줄기세포(CSC)의 집단으로부터 유도된 종양 항원에 의해 생체외 활성화되는 수지상 세포를 포함하는, 면역원성 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 종양 항원은 상기 HCC-CSC의 세포 추출물을 포함하는, 면역원성 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 종양 항원은 상기 HCC-CSC의 용해물을 포함하는, 면역원성 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 종양 항원은 무손상 HCC-CSC를 포함하는, 면역원성 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 무손상 세포는 비-증식성으로 되는, 면역원성 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 무손상 세포는 조사(irradiation)에 의해 비-증식성으로 되는, 면역원성 조성물.
  7. 제 4항에 있어서, 상기 무손상 세포는 핵 가교결합제에 대한 상기 세포의 노출에 의해 비-증식성으로 되는, 면역원성 조성물.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 보조제를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 보조제는 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자인, 면역원성 조성물.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 활성화된 수지상 세포 및 HCC-CSC를 포함하는, 면역원성 조성물.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HCC-CSC는 HCC-CSC 스페로이드의 형태인, 면역원성 조성물.
  13. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HCC-CSC는 초기 HCC-CSC의 형태인, 면역원성 조성물.
  14. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HCC-CSC는 혼합된 HCC-CSC의 형태인, 면역원성 조성물.
  15. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HCC-CSC는 EMT-HCC-CSC의 형태인, 면역원성 조성물.
  16. 치료를 필요로 하는 대상체에서 간세포 암종을 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물의 투여를 포함하는, 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 복수의 용량으로 투여되며, 각각의 용량은 약 5-20x106 세포를 포함하는, 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 용량은 약 10x106 세포를 포함하는, 방법.
  19. 제 16항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용량은 2 내지 5 용량에 대해 매주, 그 다음 3 내지 6 용량에 대해 매달 투여되는, 방법.
  20. 제 16항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 면역원성 조성물의 6 내지 10 용량으로부터 수용하는, 방법.
  21. .
  22. 간세포 암종의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서의, 제 1항 내지 제 15 4항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물의 용도.
  23. 간세포 암종의 치료를 위한, 제 41항 내지 제 15항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물의 용도.
  24. 간세포 암종(HCC) 암 줄기세포(CSC)의 집단을 제조하는 방법으로서,
    HCC의 샘플을 수득하는 단계;
    상기 샘플의 세포를 해리하는 단계, 및
    비-부착성 기질 상의 제한 배지에서 상기 해리된 세포를 시험관내 배양하는 단계로서, 상기 제한 배지는 무혈청이고 미토겐 활성화된 단백질 키나아제(MAPK) 경로를 통해 작용하는 적어도 하나의 성장 인자로 보강되며, 이로써 HCC-CSC 스페로이드를 형성하는 상기 단계를 포함하며;
    여기서 상기 HCC-CSC 스페로이드 집단 내의 상기 세포의 적어도 80%는 바이오마커 알파 태아단백(AFP), EpCAM, Ov1, 및 OV6 중 2 이상을 발현하는, 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 HCC-CSC 스페로이드 집단 내의 상기 세포의 적어도 80%는 바이오마커 CK7, CK19, 및 E-카드헤린 중 1 이상을 추가로 발현하는, 방법.
  26. 제 24항에 있어서, 상기 HCC-CSC 스페로이드 집단 내의 상기 세포의 적어도 90%는 바이오마커 AFP, EpCAM, Ov1, 및 OV6 중 2 이상을 발현하는, 방법.
  27. 제 24항에 있어서,
    부착성 기질 상의 제한 배지에서 상기 HCC-CSC 스페로이드를 배양하는 단계를 추가로 포함하고,
    여기서 상기 제한 배지는 무혈청이고 상기 MAPK 경로를 통해 작용하는 적어도 하나의 성장 인자로 보강되며, 이로써 초기 HCC-CSC의 집단을 형성하고, 상기 초기 HCC-CSC 집단 내의 상기 세포의 적어도 80%는 바이오마커 Nanog, Sox2, Oct3/4, 및 c-키트 중 2 이상을 발현하는, 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 상기 초기 HCC-CSC 집단 내의 상기 세포의 적어도 80%는 바이오마커 EpCAM, E-카드헤린, Sox 7, Sox 17, Fox2A, Ov1, OV6, CD133, 및 CD90 중 1 이상을 추가로 발현하는, 방법.
  29. 제 27항에 있어서, 상기 초기 HCC-CSC 집단 내의 상기 세포의 적어도 90%는 바이오마커 Nanog, Sox2, Oct3/4, 및 c-키트 중 2 이상을 발현하는, 방법.
  30. 제 24항에 있어서,
    부착성 기질 상의 제한 배지에서 상기 HCC-CSC 스페로이드를 배양하는 단계를 추가로 포함하고,
    여기서 상기 제한 배지는 혈청을 함유하고 상기 MAPK 경로를 통해 작용하는 적어도 하나의 성장 인자로 보강되며, 이로써 혼합된 HCC-CSC의 집단을 형성하고, 상기 혼합된 HCC-CSC 집단 내의 상기 세포의 적어도 80%는 바이오마커 AFP, CK7, CK19, EpCAM, E-카드헤린, Nanog, FoxA2 HNF4a, 및 ABCG2 중 2 이상을 발현하는, 방법.
  31. 제 30항에 있어서, 상기 혼합된 HCC-CSC 집단 내의 상기 세포의 적어도 90%는 바이오마커 AFP, CK7, CK19, EpCAM, E-카드헤린, Nanog, FoxA2 HNF4a, 및 ABCG2 중 2 이상을 발현하는, 방법.
  32. 제 24항에 있어서,
    부착성 기질 상의 제한 배지에서 상기 HCC-CSC 스페로이드를 배양하는 단계를 추가로 포함하고,
    여기서 상기 제한 배지는 혈청 공급원을 함유하고 상기 MAPK 경로를 통해 작용하는 적어도 하나의 성장 인자로 보강되며, 이로써 배아-간엽 전이된(EMT)-HCC-CSC의 집단을 형성하고, 상기 EMT-HCC-CSC 집단 내의 상기 세포의 적어도 80%는 바이오마커 NCAM, 슬러그/스네일(Slug/Snail), 및 트위스트(Twist) 중 2 이상을 발현하는, 방법.
  33. 제 32항에 있어서, 상기 EMT-HCC-CSC 집단 내의 상기 세포의 적어도 80%는 바이오마커 AFP, N-카드헤린, CD44, 및 비멘틴 중 1 이상을 추가로 발현하는, 방법.
  34. 제 32항에 있어서, 상기 EMT-HCC-CSC 집단 내의 상기 세포의 적어도 90%는 바이오마커 NCAM, 슬러그/스네일, 및 트위스트 중 1 이상을 발현하는, 방법.
  35. 제 24항, 제 30항, 또는 제 32항 중 어느 한 항에 있어서,
    부착성 기질 상의 제한 배지에서 상기 HCC-CSC 스페로이드, 상기 혼합된 HCC-CSC, 또는 EMT-HCC-CSC를 배양하는 단계를 추가로 포함하고,
    여기서 상기 제한 배지는 무혈청이고 상기 MAPK 경로를 통해 작용하는 적어도 하나의 성장 인자로 보강되며, 이로써 초기 HCC-CSC의 집단을 형성하고, 상기 초기 HCC-CSC 집단 내의 상기 세포의 적어도 80%는 바이오마커 Nanog, Sox2, Oct3/4, 및 c-키트 중 2 이상을 발현하는, 방법.
  36. 제 35항에 있어서, 상기 초기 HCC-CSC 집단 내의 상기 세포의 적어도 80%는 바이오마커 CK7, CK19, 및 E-카드헤린 중 1 이상을 추가로 발현하는, 방법.
  37. 제 35항에 있어서, 상기 초기 HCC-CSC 집단 내의 상기 세포의 적어도 90%는 바이오마커 Nanog, Sox2, Oct3/4, 및 c-키트 중 1 이상을 발현하는, 방법.
  38. 제 24항, 제 27항, 또는 제 32항 중 어느 한 항에 있어서,
    부착성 기질 상의 제한 배지에서 상기 HCC-CSC 스페로이드, 상기 초기 HCC-CSC, 또는 EMT-HCC-CSC를 배양하는 단계를 추가로 포함하고,
    여기서 상기 제한 배지는 혈청 공급원을 함유하고 상기 MAPK 경로를 통해 작용하는 적어도 하나의 성장 인자로 보강되며, 이로써 혼합된 HCC-CSC의 집단을 형성하고, 상기 혼합된 HCC-CSC 집단 내의 상기 세포의 적어도 80%는 바이오마커 AFP, CK7, CK19, EpCAM, E-카드헤린, Nanog, FoxA2 HNF4a, 및 ABCG2 중 2 이상을 발현하는, 방법.
  39. 제 39항에 있어서, 상기 혼합된 HCC-CSC 집단 내의 상기 세포의 적어도 90%는 바이오마커 AFP, CK7, CK19, EpCAM, E-카드헤린, Nanog, FoxA2 HNF4a, 및 ABCG2 중 2 이상을 발현하는, 방법.
  40. 제 24항, 제 27항, 또는 제 30항 중 어느 한 항에 있어서,
    부착성 기질 상의 제한 배지에서 상기 HCC-CSC 스페로이드, 상기 초기 HCC-CSC, 또는 혼합된 HCC-CSC를 배양하는 단계를 추가로 포함하고,
    여기서 상기 제한 배지는 혈청 공급원을 함유하고 상기 MAPK 경로를 통해 작용하는 적어도 하나의 성장 인자로 보강되며, 이로써 EMT-HCC-CSC의 집단을 형성하고, 상기 EMT-HCC-CSC 집단 내의 상기 세포의 적어도 80%는 바이오마커 NCAM, 슬러그/스네일, 및 트위스트 중 2 이상을 발현하는, 방법.
  41. 제 40항에 있어서, 상기 EMT-HCC-CSC 집단 내의 상기 세포의 적어도 80%는 바이오마커 AFP, N-카드헤린, CD44, 및 비멘틴 중 1 이상을 추가로 발현하는, 방법.
  42. 제 40항에 있어서, 상기 EMT-HCC-CSC 집단 내의 상기 세포의 적어도 90%는 바이오마커 NCAM, 슬러그/스네일, 및 트위스트 중 1 이상을 발현하는, 방법.
  43. 제 24항 내지 제 42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제한 배지는 표 2에 기재된 임의의 배지인, 방법.
  44. 제 24항 내지 제 42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제한 배지는 표 2 및 표 3의 조합으로부터의 임의의 배지인, 방법.
  45. 제 24항 내지 제 42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제한 배지는 표 2, 표 3, 및 표 4의 조합으로부터의 임의의 배지인, 방법.
  46. 제 24항 내지 제 42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제한 배지는 표 2 및 표 4의 조합으로부터의 임의의 배지인, 방법.
  47. 제 24항에 있어서, 상기 성장 인자는 섬유아세포 성장 인자(FGF), 상피 성장 인자(EGF), 또는 액티빈 A 중 1 이상인, 방법.
  48. 제 25항에 있어서, 상기 FGF는 염기성 FGF(bFGF)인, 방법.
  49. 제 24항 내지 제 48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제한 배지는 액티빈 A로 보강되지 않는, 방법.
  50. 제 24항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제한 배지는 HCC 줄기세포의 자발적인 분화를 방지하는데 효과적인 양으로, 액티빈 A의 작용제로 보강되는, 방법.
  51. 제 27항에 있어서, 상기 액티빈 A의 길항제는 액티빈 A에 특이적으로 결합하는 폴리스타틴 또는 항체인, 방법.
  52. 제 24항 내지 제 51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 항산화제로 보강되지 않는, 방법.
  53. 제 52항에 있어서, 상기 항산화제는 수퍼옥사이드 디스무타제, 카탈라제, 글루타티온, 푸트레신, 또는 β-머캅토에탄올인, 방법.
  54. 제 24항 내지 제 51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 글루타티온으로 보강되는, 방법.
  55. 제 24항 내지 제 54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부착성 기질은 부착 의존성(anchorage dependent) 세포에 부착하고, 이를 수집하도록 구성된, 방법.
  56. 제 55항에 있어서, 상기 부착 의존성 세포는 섬유아세포인, 방법.
  57. 제 24항 내지 제 54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-부착성 기질은 초저 부착성 폴리스티렌 표면인, 방법.
  58. 제 57항에 있어서, 상기 부착성 기질은 RGD 트리펩타이드 모티프가 풍부한 단백질로 코팅된 표면을 포함하는, 방법.
  59. 제 24항 내지 제 58항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되는 정제된 HCC-CSC 세포의 집단.
  60. 제 59항에 있어서, 상기 정제된 HCC-CSC 세포는 HCC-CSC 스페로이드인, 정제된 HCC-CSC 세포의 집단.
  61. 제 59항에 있어서, 상기 정제된 HCC-CSC 세포는 초기 HCC-CSC인, 정제된 HCC-CSC 세포의 집단.
  62. 제 59항에 있어서, 상기 정제된 HCC-CSC 세포는 혼합된 HCC-CSC인, 정제된 HCC-CSC 세포의 집단.
  63. 제 59항에 있어서, 상기 정제된 HCC-CSC 세포는 EMT-HCC-CSC인, 정제된 HCC-CSC 세포의 집단.
  64. 제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되는 HCC-CSC 세포주.
  65. 제 64항에 있어서, 상기 HCC-CSC는 HCC-CSC 스페로이드인, HCC-CSC 세포주.
  66. 제 64항에 있어서, 상기 HCC-CSC는 초기 HCC-CSC인, HCC-CSC 세포주.
  67. 제 64항에 있어서, 상기 HCC-CSC는 혼합된 HCC-CSC인, HCC-CSC 세포주.
  68. 제 64항에 있어서, 상기 HCC-CSC는 EMT-HCC-CSC인, HCC-CSC 세포주.
  69. 면역 반응의 자극을 필요로 하는 대상체에서 간세포 암종에 대한 면역 반응을 자극하는 방법으로서, 상기 대상체에 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물, 제 59항 내지 제 63항 중 어느 한 항의 HCC-CSC 세포, 또는 제 64항 내지 제 68항 중 어느 한 항의 HCC-CSC 세포주의 투여를 포함하는, 방법.
  70. 간세포 암종의 치료를 위한 약제의 제조에서의 제 59항 내지 제 63항 중 어느 한 항의 HCC-CSC 세포 또는 제 64항 내지 제 68항 중 어느 한 항의 HCC-CSC 세포주의 용도.
  71. 간세포 암종의 치료를 위한, 제 59항 내지 제 63항 중 어느 한 항의 HCC-CSC 세포 또는 제 64항 내지 제 68항 중 어느 한 항의 HCC-CSC 세포주의 용도.
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