KR20150127570A - 항-Aβ 항체를 이용하여 뇌 아밀로이드 플락을 감소시키는 방법 - Google Patents

항-Aβ 항체를 이용하여 뇌 아밀로이드 플락을 감소시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 명세서는 뇌 아밀로이드 플락을 감소시키고, 또는 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 장기 투여 동안 미세출혈 발생을 최소화시키기 위하여 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 이용하는 것에 관계한다. 예를 들면, 본 명세서은 뇌 아밀로이드 플락을 감소시키는 방법에 관계하는데, 이 방법은 피험자에게 BIIB037 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여하는 것을 포함하며, 이때 상기 투여로 맥관 아밀로이드에 영향을 주지 않고 뇌에서 아밀로이드 플락을 감소시킬 수 있으며, 그리고 이때 BIIB037 항체는 Aβ의 아미노산 3-6이 포함된 에피토프에 결합한다.

Description

항-Aβ 항체를 이용하여 뇌 아밀로이드 플락을 감소시키는 방법{A METHOD OF REDUCING BRAIN AMYLOID PLAQUES USING ANTI-Aβ ANTIBODIES}
배경
발명의 분야
본 명세서는 항-Aβ 항체들을 이용하여 뇌 아밀로이드 플락(plaques)을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 명세서는 맥관 아밀로이드에 영향을 주지 않고, 뇌 아밀로이드 플락을 감소시키는 방법에 관계하는데, 이 방법은 피험자에게 BIIB037 항체와 동일한 에피토프에 결합하는, 또는 BIIB037 항체를 경쟁적으로 저해시키는 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여하는 것을 포함하며, 이때 상기 투여로 맥관 아밀로이드에 영향을 주지 않고, 뇌에서 아밀로이드 플락이 감소되며, 이때 BIIB037 항체는 Aβ의 아미노산 3-6이 포함된 에피토프에 결합한다. 더욱이, 본 명세서는 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 장기 투여 동안 미세출혈(microhemorrhage)의 발생을 최소화시키는 방법에 관한 것이다.
아밀로이드 베타 (Aβ) 펩티드는 알츠하이머 질환 (AD)을 앓는 개체들의 뇌 유조직에서 아밀로이드 플락(가령, 유조직(parenchymal) 아밀로이드 플락)의 주요 성분이다. 상기 플락의 형성은 아밀로이드 전구물질 단백질 (APP) 프로세싱에 의한 Aβ가 과다생산, 그리고 특정 조건하에서 Aβ가 이의 가용성 형태로부터 매우 정렬된 원섬유(fibrillar) 응집체(aggregates)로 전환하는 능력으로 인한 것이다. 뉴우런의 퇴행은 상기 아밀로이드 플락 주변에서 발생되지만, 원시섬유(protofibrils) 또는 단순 올리고머과 같은 중간생성물 또한 AD 발병기전에 관여하며, 발병 개시에서 더욱 신경독성 종이 되는 것으로 보인다고 일부 연구에서 제시되었다. 또한, 상이한 크기의 응집체의 독성 성질이 조사되었고, 획득된 결과들은 상이한 응집체 크기가 상이한 퇴행 경로를 유도할 수 있다는 가설을 뒷받침한다 (Di Carlo M., EuropeBiophysics Journal 39(6):877-888 (2010)).
알츠하이머 질환은 유조직 아밀로이드 플락 및 세포내 매듭(tangles)의 존재에 의해 특징화될 뿐만 아니라, 콩고필릭(congophilic) 아밀로이드 혈관병으로도 알려진 대뇌 아밀로이드 혈관병 (CAA)으로 알려진 상태로써, 혈관구조 안에 아밀로이드 침착 (가령, 맥관 아밀로이드 침착)의 존재로 특징화된다. 알츠하이머 질환 환자들과 유전자삽입 일부 마우스 모델 모두에서 관찰된 CAA는 주로 Aβ의 더 짧은 형태, Aβ1-40으로 구성되며, 실질에서 아밀로이드 침착의 대부분은 Aβ1-42로 구성된다. 치밀(compact) 아밀로이드 침착 또한 Aβ1-40을 포함한다(Wilcock et al., Journal of Neuroinflammation 1(24):1-11 (2004)).
하기에서 응집된 Aβ를 이용한 능동 면역화로 설명되는, 10여년 전에 출현된 알츠하이머 질환의 잠재적 치료법인 Aβ 면역요법의 개념은 AD-유사 병리의 발생을 감소시킬 수 있고 또는 APP 유전자삽입 마우스에서 기존 병리의 진행을 지연시킬 수 있으며, 또한 이들 동물에서 개선된 거동으로 이어질 수 있다(Schenk et al., Nature 400:173-177 (1999), Janus et al., Neurobiol Aging 21:541-549 (2000), Morgan et al., Nature 408:982-985 (2000)). 소집단의 환자들에서 수뇌막염과 같은 부작용의 발생으로 인하여 인간에서의 치료요법적 접근법으로 변형되는 것이 제한되었다 (Orgogozo et al., Neurology 61:46-54 (2003)). 추가적으로, 어쥬번트에 의한 T-세포 활성화, Aβ 펩티드 상에 T-세포 에피토프의 존재, 생리학적 APP 유도체들과의 교차-반응성 및 맥관 아밀로이드의 감소에 의한 혈관 붕괴가 포함된 상이한 잠재적 원인들이 논의되었다 (Schenk et al., Nat Rev Neurosci 3:824-828).
수동 면역화, 가령, 항-Aβ 항체들을 이용한 신경퇴행성 장애들, 가령, 알츠하이머 질환의 안전한 치료 방법이 필요하다.
간략한 요약
한 구체예는 피험자에게 BIIB037 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여하는 것을 포함하는 뇌 아밀로이드 플락을 감소시키는 방법에 관한 것으로써, 이때 상기 투여로 맥관 아밀로이드에 실질적인 영향을 주지 않고, 뇌의 아밀로이드 플락을 감소시킬 수 있고, 이때 BIIB037 항체는 Aβ의 아미노산 3-6이 포함된 에피토프에 결합한다.
피험자에게 BIIB037 항체를 경쟁적으로 저해시키는 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여하는 것을 포함하는 뇌 아밀로이드 플락을 감소시키는 방법을 또한 공개하는데, 이때 상기 투여로 맥관 아밀로이드에 실질적인 영향을 주지 않고, 뇌의 아밀로이드 플락을 감소시킬 수 있다.
항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 장기 투여 동안 미세출혈의 발생을 최소화시키는 방법을 또한 공개하는데, 이 방법은 피험자에게 BIIB037 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항-Aβ 항체를 투여하는 것을 포함하며, 이때 BIIB037 항체는 Aβ의 아미노산 3-6이 포함된 에피토프에 결합한다.
항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 장기 투여 동안 미세출혈의 발생을 최소화시키는 방법을 또한 공개하는데, 이 방법은 피험자에게 BIIB037 항체를 경쟁적으로 저해시키는 항-Aβ 항체를 투여하는 것을 포함한다.
테스트 피험자에게서 뇌 아밀로이드 플락의 양을 측정하는 방법을 또한 공개하는데, 이 방법은 다음을 포함한다: (a) BIIB037 항체와 동일한 형태학적 에피토프에 결합하는 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여한 후, 테스트 피험자의 뇌에서 발생된 신호를 측정하고, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 측정가능한 신호를 만들어내는 물질로 라벨되며; 그리고 (b) 상기 테스트 피험자에서 생성된 신호는 라벨된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 하나 또는 그 이상의 대조 피험자에게 투여시 생성된 신호와 비교하고; 이때 대조 피험자의 것과 비교하여 테스트 피험자에게서 생성된 신호의 증가는 뇌 아밀로이드 플락의 증가와 관련된다.
치료를 요하는 환자의 뇌 아밀로이드 플락에 의해 특징화된 신경퇴행성 질환을 치료하는 방법을 또한 공개하는데, 이 방법은 다음을 포함한다: (a) BIIB037 항체와 동일한 형태학적 에피토프에 결합하는 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 신경퇴행성 질환 치료를 요하는 환자에게 투여하고, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 측정가능한 신호를 만들어내는 물질로 라벨되며; (b) 상기 환자에게서 측정된 신호는 라벨된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 하나 또는 그 이상의 대조 피험자에게 투여한 후 측정된 신호와 비교할 때 상기 환자의 질환 상태를 평가하고; 이때 대조 피험자의 것과 비교하여 테스트 피험자에게서 생성된 신호의 증가는 뇌 아밀로이드 플락의 증가와 관련되며; 그리고 (c) 상기 환자는 환자의 질환 상태에 적합한 요법으로 치료한다.
한 구체예는 테스트 피험자에게서 뇌 아밀로이드 플락의 양을 측정하는 방법에 관계하는데, 이 방법은 다음을 포함한다: (a) 상기 테스트 피험자의 뇌에서 발생된 신호를 측정하고 BIIB037 항체를 경쟁적으로 저해하는 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 투여 후, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 측정가능한 신호를 만들어내는 물질로 라벨되며; 그리고 (b) 상기 테스트 피험자에서 생성된 신호는 라벨된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 하나 또는 그 이상의 대조 피험자에게 투여시 생성된 신호와 비교하며; 이때 대조 피험자의 것과 비교하여 테스트 피험자에게서 생성된 신호의 증가는 뇌 아밀로이드 플락의 증가와 관련된다.
치료를 요하는 환자의 뇌 아밀로이드 플락에 의해 특징화된 신경퇴행성 질환을 치료하는 방법을 또한 공개하는데, 이 방법은 다음을 포함한다: (a) BIIB037 항체를 경쟁적으로 저해하는 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 신경퇴행성 질환 치료를 요하는 환자에게 투여하고, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 측정가능한 신호를 만들어내는 물질로 라벨되며; (b) 상기 환자에게서 측정된 신호를 라벨된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 하나 또는 그 이상의 대조 피험자에게 투여한 후 측정된 신호와 비교할 때 상기 환자의 상태를 평가하고; 이때 대조 피험자의 것과 비교하여 테스트 피험자에게서 생성된 신호의 증가는 뇌 아밀로이드 플락의 증가와 관련된; 그리고 (c) 상기 환자를 환자의 질환 상태에 적합한 요법으로 치료한다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 대조 피험자는 보통의 건강한 개체들, 중증도가 다양한 신경퇴행성 장애들을 가진 개체들, 또는 이의 조합이다.
뇌 아밀로이드 플락에 의해 특징화되는 신경퇴행성 질환에 있어서 치료될 환자에게서 질환 진행을 평가하는 방법이 또한 공개되는데, 이 방법은 다음을 포함한다: (a) BIIB037 항체와 동일한 형태학적 에피토프에 결합하는 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 상기 신경퇴행성 질환 치료를 요하는 환자에게 투여되며이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 측정가능한 신호를 만들어내는 물질로 라벨되며, 이때 상기 투여후 상기 환자에게서 신호가 측정되며 ; (b) (a) 투여 후 하나 또는 그 이상의 시간 간격에서 라벨된 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 투여되며,, 이때 상기 투여후 상기 환자에게서 신호가 측정되며 ; (c) (a) 투여 후 1회 또는 그 이상의 시간 간격에서 상기 환자에게서 측정된 신호의 변화에 근거하여 상기 환자에서 질환 진행이 평가되며; 이때 신호의 증가는 상기 환자의 신경퇴행성 질환의 진행을 의미한다.
뇌 아밀로이드 플락에 의해 특징화되는 신경퇴행성 질환에 있어서 치료될 환자에게서 질환 진행을 평가하는 방법이 또한 공개되는데, 이 방법은 다음을 포함한다: (a) BIIB037 항체를 경쟁적으로 저해하는 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 신경퇴행성 질환 치료를 요하는 환자에게 투여하고, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 측정가능한 신호를 만들어내는 물질로 라벨되며, 이때 상기 투여후 상기 환자에게서 신호가 측정되며 ; (b) (a) 투여 후 1회 또는 그 이상의 시간 간격에서 상기 라벨된 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여하고, 이때 상기 투여후 상기 환자에게서 신호가 측정되며 ; (c) (a) 투여 후 1회 또는 그 이상의 시간 간격에서 상기 환자에게서 측정된 신호의 변화에 근거하여 상기 환자에서 질환 진행이 평가되며; 이때 신호의 증가는 상기 환자의 신경퇴행성 질환의 진행을 의미한다.
특정 구체예들은 질환 진행 수준에 근거하여 상기 환자 치료를 조정하는 것이 더 포함된, 본 명세서에서 설명된 바와 같은 방법을 포함한다.
일부 구체예들에 있어서, 환자의 질환 상태에 적합한 요법은 BIIB037 항체와 동일한 형태학적 에피토프에 결합하는 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 신경퇴행성 질환 치료를 요하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
특정 구체예들은 본 명세서에서 설명된 바와 같은 방법을 포함하는데, 이때 환자의 질환 상태에 적합한 요법은 BIIB037 항체를 경쟁적으로 저해하는 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 신경퇴행성 질환 치료를 요하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
청구항 6 또는 8중 임의의 한 항의 방법은 다음을 더 포함한다:(d) (a) 투여 후 1회 또는 그 이상의 시간 간격에서 상기 라벨된 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여하고, 이때 상기 투여후 상기 환자에게서 신호가 측정되며 ; 그리고 (e) (a) 투여 후 1회 또는 그 이상의 시간 간격에서 상기 환자에게서 측정된 신호의 변화에 근거하여 상기 환자에서 질환 진행이 평가되며; 이때 신호의 증가는 상기 환자의 신경퇴행성 질환의 진행을 의미한다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 물질은 하나 또는 그 이상의 방사능활성리간드(들)을 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 리간드는 125I이다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 물질에 의해 생성된 신호는 단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영에 의해 측정된다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 (VH)과 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하며, 그리고 이때 상기 VH는 서열 번호: 3의 상보결정부위-1 (VHCDR1) 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH와 VL을 포함하고, 그리고 이때 상기 VH는 서열 번호: 4의 상보결정부위-2 (VHCDR2) 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH와 VL을 포함하고, 그리고 이때 상기 VH는 서열 번호: 5의 상보결정부위-3 (VHCDR3) 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH와 VL을 포함하고, 그리고 이때 상기 VL은 서열 번호:6의 상보결정부위-1 (VLCDR1) 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH와 VL을 포함하고, 그리고 이때 상기 VL은 서열 번호:7의 상보결정부위-2 (VLCDR2) 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편 VH와 VL, 이때 상기 VL은 서열 번호:8의 상보결정부위-3 (VLCDR3) 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH와 VL을 포함하고, 그리고 이때 상기 VH는 서열 번호: 3, 4, 5의 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH와 VL을 포함하고, 그리고 이때 상기 VL은 서열 번호: 6, 7, 8의 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH와 VL을 포함하고, 이때 상기 VH는 열 번호: 3, 4, 5의 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열 번호: 6, 7, 8의 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH와 VL을 포함하고, 이때 상기 VH는 서열 번호: 1을 포함하고, 상기 VL은 서열 번호: 2를 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 BIIB037 항체의 항원-결합 영역을 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 선택적으로 Aβ 응집체에 결합한다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 A베타 원섬유(fibril)에 결합할 수 있지만, 실질적으로 A베타 모노머에 결합하지 않는다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 뇌 아밀로이드 플락을 감소시키는데 효과적인 양으로 혈액-뇌 장벽을 통과할 수 있다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 맥관 아밀로이드보다 더 큰 치화력으로 유조직 아밀로이드 플락에 결합한다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 유조직 아밀로이드 플락 보다는 적은 수준으로 콩고필릭 아밀로이드 혈관병 병소에 축적된다.
특정 구체예들에 있어서, 뇌에서 아밀로이드 플락의 감소는 Fc 수용체 참여와 관련된다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 항-Aβ 항체 항원-결합 단편은 단일 쇄 Fv 단편 (scFv), F(ab') 단편, F(ab) 단편, 또는 F(ab')2 단편이다. 한 구체예에 있어서 상기 항체는 인간이다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 항체는 키메라(chimeric)다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 피험자는 신경퇴행성 장애를 가진다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머 질환, 다운 증후군, 경도 인지 장애, 대뇌 아밀로이드 혈관병, 맥관 치매, 다발-경색 치매, 파킨슨 질환, 루이체(Lewy Bodies) 치매, 헝틴턴 질환, 크로이츠펠트-야곱 질환, 낭성섬유증, 또는 고오시에 질환으로 구성된 군에서 선택된다.
특정 구체예들은 알츠하이머 질환의 질행을 치료 또는 방지하기 위하여; 알츠하이머 질환과 연합된 증상들을 개선시키기 위하여; 알츠하이머 질환의 존재에 대해 피험자를 진단 또는 선별하기 위하여 또는 알츠하이머 질환 발병 위험을 피험자에게 측정하기 위하여 본 명세서에서 설명된 바와 같은 방법을 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 비경구(parenteral) 투여에 의해 투여된다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 말초(peripheral) 투여에 의해 투여된다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 비경구 투여에 의해 투여된다.
도 1 (a-d): 키메라 BIIB037 ("chBIIB037")는 선택적으로 Aβ 응집체에 결합한다. (a) chBIIB037 또는 3D6의 Aβ(1-42) 응집체에 결합. (b) ELISA 플레이트에 간접적으로 고정된 3D6에 의한 가용성, 모노머 Aβ(1-40)의 포획, 그러나 chBIIB037에 의해서는 포획안됨. (c) 응집된 (라인 2) 또는 모노머 Aβ(1-42) (라인 1)의 조제물은 BIIB037 또는 3D6을 이용하여 면역침전되었다. (d) FITC-접합된 chBIIB037을 이용한 인간 알츠하이머 질환 뇌 조직의 면역착색.
도 2 (a-d): Tg2576 유전자삽입 마우스에게 복막내 단일 투여 후 BIIB037의 뇌 침투 (a) 단일 투여(dose) (30 mg/kg) 후, 3주에 걸쳐 혈장 (μg/ml)과 뇌 (ng/g)에서 측정된 BIIB037 수준. (b) BIIB037 또는 3D6 항체의 단일 투여 후 혈장 Aβ 농도 (pmol/ml)가 측정되었다. (c) Tg2576 마우스에게 단일 투여 후 아밀로이드 침착에 BIIB037의 생체내 결합은 (d) 연속 단면의 pan-Aβ 항체 착색과 비교되었다.
도 3 (a-e): Tg2576 유전자 삽입 마우스에게 급성 투여 후 유조직 아밀로이드 플락에 대한 chBIIB037의 결합. 뇌에서 아밀로이드 침착에 대하여 (a) Cy3-라벨된 chBIIB037 또는 (c) Cy3-라벨된 3D6의 결합을 VISIOPHARMㄾ 소프트웨어를 이용하여 정량화되었다. (e) 하나 또는 다른 아밀로이드 구획과 연합된 Cy3 착색은 전체 뇌 영역 착색 비율로 나타내었으며, 맥관 아밀로이드와 비교하여 유조직 아밀로이드에 chBIIB037의 선호적인 결합이 설명되었다.
도 4 (a-c): Tg2576 유전자삽입 마우스에게 chBIIB037을 6개월의 장기 투여 후 노출 (a) 0.3, 1, 3, 10 및 30 mg/kg chBIIB037 치료 군에 있어서 최종 투여 후 24시간에 혈장에서 chBIIB037 농도가 측정되었다. PBS 군에서 탐지 한계 이상의 chBIIB037 수준은 이 분석에의해 측정된 내생성 항-Aβ 항체들로 인한 것이다. (b) chBIIB037 농도는 0.3, 1, 3, 10 및 30 mg/kg chBIIB037 치료 군에 있어서 DEA, (세척제-없는) 뇌 분획(fractions) 에서도 측정되었다. (c) 혈장 (개방형 원) 또는 뇌 (삼각형)에서 약물 농도와 투여된 투여 분량과의 상관관계. 각 기호는 한 가지 동물을 나타내며, 점선은 분석의 탐지 한계를 나타낸다.
도 5 (a-d): Tg2576 유전자삽입 마우스에게 chBIIB037을 6개월의 장기 투여 후 아밀로이드 부하(burden) 감소. PBS 대조 군과 비교하였을 때, 3, 10, 및 30 mg/kg chBIIB037 치료 군에 있어서 (a) 가용성 DEA 및 (c) 가용성 구아니딘 뇌 분획 모두에서 Aβ42 농도는 상당히 감소되었다. (b) 피질과 (d) 해마에서 총 뇌 아밀로이드 로드는 6E10 면역조직화학에 의해 밝혀졌고, VISIOPHARMㄾ 소프트웨어를 이용하여 정량화되었다. (데이터는 평균 ㅁ SEM으로 나타내며; 점선은 PBS-처리된 대조 군과 비교하였을 때 50% 감소를 나타낸다. 치료군과 대조군 사이의 차이는 등급에 근거한 Kruskall-Wallis 일원 분산 분석(one way analysis of variance) 후 Dunn's post-hoc 테스트에 의해 측정되었다. 비이클로부터 통계학적으로 유의미적인 차이는 별표 (*)로 나타낸다; p<0.05).
도 6 (a-d): Tg2576 유전자삽입 마우스에게 chBIIB037을 장기 투여 후 맥관 아밀로이드에 대한 chBIIB037의 결합 (a) 치밀 아밀로이드 플락 및 CAA의 티오플라빈 S (Thio-S) 착색은 형광 현미경에서 드러났고, 그리고 (b) VISIOPHARMㄾ 소프트웨어를 이용하여 맥관 침착으로부터 유조직 침착이 구별되었으며, 그리고 각 실체에 의해 점유된 영역이 정량화되었다. (c) 피질과 (d) 해마에서 chBIIB037의 3, 10, 및 30 mg/kg 투여에 대하여 맥관 아밀로이드 로드는 티오플라빈 S 착색에 의해 평가되었다. (e) Tg2576 마우스에서 0, 10, 70 및 500 mg/kg의 chBIIB037, 그리고 500mg/kg의 BIIB037의 i.v. 치료 후 13주 시점에서 Perls 착색에 의해 나타난 미세출혈 수준의 차이. (데이터는 평균 ㅁ SEM으로 나타내며; n=집단당 18-20마리의 동물).
도 7 (a-b): Tg2576 유전자삽입 마우스에게 chBIIB037을 6개월의 장기 투여 후 아밀로이드 부하(burden) 감소. (a) wt chBIIB037, 비당화된 (Agly) chBIIB037 또는 3D6는 Tg2576 마우스에게 매주 복막 주사를 통하여 3mg/kg으로 투여되었다. 뇌 균질화물(homogenates)로부터 준비된 불용성 (구아니딘) 분획에서 측정된 뇌 Aβ42 수준 (pmol/g)은 PBS-처리된 대조 군과 비교되었다. (치료군과 대조군 사이의 차이는 Dunn's post-hoc 테스트에 의해 측정되었다 p<0.01, n=집단당 12-14 마리; 평균 ㅁ SEM). (b) Thio-S 착색에 의해 정량화된 (착색된 영역 %) 피질의 치밀 아밀로이드 플락 로드는 wt chBIIB037, Agly chBIIB037, 및 3D6 치료 군에서 PBS 대조 군과 비교하여 Thio-S로 착색된 영역의 정량화에 의해 평가되었다. (치료군과 대조군 사이의 차이는 Dunn's post-h℃ 테스트에 의해 측정되었다; p<0.01, n=집단당 12-14 마리; 평균 ㅁ SEM). Agly chBIIB037 및 3D6은 치밀 아밀로이드 플락 로드에 영향을 주지 않았다.
도 8 (a-c): Tg2576 유전자삽입 마우스에게 chBIIB037을 장기 투여 후 아밀로이드 로드 감소는 모든 크기의 플락에게 영향을 준다. (a,b) 6E10으로 착색된 아밀로이드 플락은 VISIOPHARMㄾ 소프트웨어를 이용하여 정량화되었다. 플락의 크기는 면적에 의해 한정되었다: 플락 <125μm2 (#4), 125-250μm2 (#3), 250-500μm2 (#2) 그리고 >500μm2 (#1). (c) chBIIB037 치료 군에서 모든 크기 범위에서 플락 수가 측정되었고, PBS-처리된 대조군과 비교되었다. (t-테스트, *= p<.0.005).
도 9 (a-b): Tg2576 유전자삽입 마우스에게 chBIIB037을 장기 투여 후 아밀로이드 플락의 소교세포(Microglia)-중재된 중재된 제거. (a) PBS- 또는 chBIIB037-처리된 마우스의 뇌 단면은 Aβ (6E10-연회색)과 소교세포의 표지 (Iba1-진회색)에 대해 면역착색되었다. (b) 대식세포에 의해 ≥ 70% 에워싸인 둘레를 가진 플락이 계산되었고, 플락 크기에 근거하여 계층화되었다. 소교세포에 의해 70% 에워싸인 플락의 비율은 플락 ≥ 250μm2 (t-테스트, *= p<.0.005)의 경우에서 chBIIB037-처리된 군 (투명 막대)과 PBS 대조 군 (회색 막대)간에 비교되었다.
도 10 (a-b): BIIB037/Aβ 복합체의 구조 (A) Aβ2-9와 함께 인간 BIIB037.산소는 연회색, 질소는 진회색, 그리고 탄소는 흰색으로 나타낸 막대 형태의 Aβ2-9 펩티드. 상기 펩티드와 접촉하는 CDRs: VHCDR1 (H1), VHCDR2 (H2), VHCDR3 (H3), VLCDR1 (L1), VLCDR2 (L2), 및 VLCDR3 (L3). 상기 펩티드와 접촉하는 CDRs 만을 나타낸다. (b) BIIB037 (백색)과 W02 (중회색)의 구조에 Aβ (3-6) 펩티드 기본골격의 중첩
도 11 (a-b): BIIB037의 마우스 Aβ에 결합 (a) 인간 및 마우스 Aβ (1-42) 서열의 배열. (b) 인간과 마우스 Aβ (1-16) 펩티드에 BIIB037의 결합
도 12 (a-c): (a) [125I]chBIIB037을 이용하여 Tg2576 (Tg)과 WT 마우스 CNS에서 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영 (SPECT) 영상 데이터의 개괄; 이어서 상기 라벨된 항체의 정맥태 투여후 7일(b) 및 14일(c)의 영상 데이터.
도 13 (a-c): (a) Tg2576 (a)과 WT (b) 마우스의 CNS 안으로 [125I]chBIIB037의 표준화된 취입의 대표적인 시상면(sagittal) 예시 (b) Tg2576 마우스의 CNS 안으로 [125I]chBIIB037의 생체내 축적의 대표적인 48일차 영상 (c) (a) Tg 및 (b) WT 마우스 뇌에서 [125I]chBIIB037의 평균 표준화된 뇌 취입.
도 14 (a-c): Tg 및 WT 마우스 뇌와 혈액 푸울(pool)에서 [I25I]chBIIB037의 생체내 취입. 도 14a는 Tg2576 (L)과 WT (R) 마우스에서 48일차(D48)에 평균 뇌 취입을 나타내며, 그 다음 PBS로 관류 후 비교되었다(관류후 D48). 도 14 b-c는 28일차 데이터로부터 생성된 관심 영역 (ROI) 플롯을 나타낸다. 방사능활성 농도 (μCi/mm3)는 혈액 푸울과 조직 사이에서 측정된다.
도 15 (a-g): Tg2576 마우스 뇌의 SPECT 영상 데이터의 개괄; (a) 1 mg/kg [125I]Agly-chBIIB037 (22 월령의 Tg2576), (c) 1 mg/kg [125I]huBIIB037 F(ab')2 (22 월령의 Tg2576), 또는 (d) 1 mg/kg [125I]huBIIB037 F(ab')2 (3 월령의 WT) 투여 후. (b) 나이든 (22 월령) Tg2576 마우스에서 생체내 [125I]Agly-chBIIB037 결합의 정량적 뇌 환추(atlas) 분석 (e) 나이든 Tg2576 과 WT 마우스 뇌에서 생체내 [125I]huBIIB037F(ab')2 결합의 관심 영역의 정량적 분석 (f) Tg 마우스 영상에서 [125I]huBIIB037F(ab')2의 생체내 취입 및 유지를 보여주기 위하여 임의로 등급화된 선택 시상면과 관상 영상의 비교 (g) 나이든 Tg2576과 야생형 마우스 뇌에서 생체내 [125I]huBIIB037 F(ab')2 결합의 정량적 ROI 분석의 전반적인 요약 데이터는 4가지 촬영 시점에 걸쳐 소뇌에서의 것에 대해 표준화된 피질에서의 %ID/g로 나타낸다.
도 16: Tg2576 나이든 마우스 뇌의 CNS 안으로 [125I]Agly-chBIIB037 (1 및 10mpk)의 생체내 축적을 보여주는 48일차 대표 영상 어린 Tg2576 마우스 뇌에서 뿐만 아니라 [125I]P1.17 라벨된 동형(isotype) 대조 (10mpk)에서 CNS-특이적 생체내 축적이 또한 테스트되었다.
도 17: Ab에 대한 5F3 면역착색과 24시간 획득시 SPECT 영상(좌)은 낮은 취입과 높은 취입 동물을 나타낸다. 우측의 플롯은 영상 촬영된 모든 동물에서 피질과 생체외 아밀로이드 영역 (동물당 2개 단면)에서 정량적 SPECT ROI의 상관관계를 보여준다.
도 18: 조직학적 그리고 자가방사능사진 분석을 위한 마우스 뇌 샘플링.
도 19: Tg 마우스 101과 WT 마우스 201의 해마 영역에서 마이크로방사선사진촬영(mARG).
도 20: Tg 마우스 101에서 mArg와 해마 영역에서 인접 단면에서 Aβ에 대한 면역조직화학 (IHC) 착색.
도 21: Tg 마우스 101에서 mARG와 해마 영역에서 인접 단면에서 Aβ에 대한 티오플라빈-S 착색.
도 22: Tg 및 WT 마우스에서 장기당 표적 및 비-표적 조직에서 [125I]chBIIB037의 생체분포 데이터는 조직에서 %ID/g로 나타냄.
도 23: Tg2576와 WT 마우스에서 생체내 [125I]huBIIB037F(ab')2의 전신 SPECT 영상
도 24: 나이든 Tg2576과 어린 WT 마우스의 비-표적 조직에서 [125I]huBIIB037F(ab')2의 생체내 분포의 정량적 전신 분석. 데이터는 Tg2576 (검정 막대)과 WT (줄무늬 막대) 마우스의 조직에서 %ID/g로 나타냄. [H, 심장; K, 신장; L, 간; Lu, 폐; M, 근육; S, 위; T, 갑상선; WB, 전신].
I. 정의
용어 단수("a" 또는 "an") 엔터티는 하나 또는 그 이상의 엔터티(entity)를 지칭하며; 예를 들면, "항-Aβ 항체"는 Aβ에 특이적으로 결합하는 하나 또는 그 이상의 항체들을 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 단수("a" (또는 "an")), "하나 또는 그 이상의", 그리고 "최소한 하나"는 본 명세서에서 호환될 수 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "신경퇴행성 질환"은 알츠하이머 질환, 경도 인지 장애, 전두-측두엽 치매, 루이(Lewy)-체 질환, 파킨슨 질환, 픽 질환, 빈스완거 질환; 콩고필릭 아밀로이드 혈관병, 대뇌 아밀로이드 혈관병, 다운 증후군, 다발-경색 치매, 헝틴턴 질환, 크로이츠벨트-야코프 질환, AIDS 치매 복합체, 우울, 불안 장애, 공포, 벨 마비, 간질, 뇌염, 다발성 경화증; 신경근 장애들, 신경종양 장애들, 뇌 종양, 뇌졸중을 포함하는 신경맥관 장애들, 신경면역학적장애들, 신경이과학적(neurootological) 질환, 척수손상이 포함된 신경외상, 신경병적 통증이 포함된 통증, 소아과 신경학적 그리고 신경정신학적 장애들, 수면 장애들, 투어렛 증후군, 경도 인지 장애, 맥관 치매, 다발-경색 치매, 낭성섬유증, 고오시에 질환, 일반적으로 중추신경계(CNS)의 기타 운동성 장애들 및 질환을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 언급이 없는 한, "신경퇴행성", "신경학적" 또는 "신경정신학적" 용어들은 본 명세서에서 호환된다.
다른 언급이 없는 한, "장애", "질환" 및 "병" 용어들은 본 명세서에서 호환된다.
다른 언급이 없는 한, "Aβ", "A베타" 및 "베타-아밀로이드" 용어들은 본 명세서에서 호환된다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "결합 분자" 또는 "항원 결합 분자"는 광의적 의미에서 항원성 결정인자에 특이적으로 결합하는 분자를 말한다. 항원 결합 분자의 비-제한적 예들은 항원-특이적 결합을 유지하는 항체 및 이의 단편들, 뿐만 아니라 Aβ에 결합하는 기타 비-항체 분자들, 가령 호르몬, 수용체들, 리간드들, 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자들, 샤프롱(chaperones) 이를 테면 열쇼크 단백질들 (HSPs) 뿐만 아니라 세포-세포 흡착 분자들 이를 테면 캐드헤린, 인테그린, C-유형 렉틴 및 면역글로불린 (Ig) 슈퍼패밀리의 구성요소들을 포함하나, 이에 한정되지 않은 비-항체 분자들이다. 따라서, 오직 명료함을 위하여, 그리고 본 명세서의 범위를 제한시키지 않고, 다음 구체예들의 대부분에서 치료요법적 그리고 진단학적 물질들의 개발을 위하여 결합 분자들을 대표하는 항체 및 항체-유사 분자들에 대하여 논의된다. 또다른 구체예에 있어서, 공개된 결합 분자는 항체 분자의 최소한 하나 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함한다. 또다른 구체예에 있어서, 공개된 결합 분자는 하나 또는 그 이상의 항체 분자들의 최소한 2개의 CDRs을 포함한다. 또다른 구체예에 있어서, 공개된 결합 분자는 하나 또는 그 이상의 항체 분자들의 최소한 3개의 CDRs을 포함한다. 또다른 구체예에 있어서, 공개된 결합 분자는 하나 또는 그 이상의 항체 분자들의 최소한 4개의 CDRs을 포함한다. 또다른 구체예에 있어서, 공개된 결합 분자는 하나 또는 그 이상의 항체 분자들의 최소한 5개의 CDRs을 포함한다. 또다른 구체예에 있어서, 공개된 결합 분자는 하나 또는 그 이상의 항체 분자들의 최소한 6개의 CDRs을 포함한다.
맥관 아밀로이드에 영향을 주지 않고 뇌 아밀로이드 플락을 감소시키는 방법이 공개되는데, 이 방법은 피험자에게 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여하는 것을 포함한다. 온전한-크기의 항체들 이를 테면 자연적으로 생성되는 항체들을 구체적으로 언급하지 않는 한, 용어 "항-Aβ 항체"는 온전한-크기의 항체들 뿐만 아니라 이러한 항체들의 항원-결합 단편들, 변이체들, 유사체들, 또는 유도체들, 가령, 자연적으로 생성되는 항체 또는 면역글로불린 분자들 또는 항체 분자들과 유사한 방식으로 항원에 결합하는 조작된(engineered) 항체 분자들 또는 단편들을 포괄한다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 본원 명세서에서 호환된다. 항체 또는 면역글로불린은 중쇄의 최소한 가변 도메인을 포함하며, 보통은 중쇄와 경쇄의 최소한 가변 도메인들을 포함한다. 척추 동물계의 기본 면역글로불린 구조는 상대적으로 잘 이해되고 있다. 가령, Harlow et al. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press) 참고.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "면역글로불린"은 생화학적으로 구별되는 다양한 광범위한 부류의 폴리펩티드를 포함한다. 당업자는 중쇄는 감마, 뮤(mu), 알파, 델타, 또는 입실론, (γ, μ, α, δ, ε)으로 분류되며, 그중에서 일부 하위부류(가령, γ1-γ4)도 있다는 것을 인지할 것이다. 상기 항체의 "분류(class)는 차례로 IgG, IgM, IgA IgG, 또는 IgE로 결정되는 쇄의 특징이다. 상기 면역글로불린 하위분류 (동형(isotype)s) 가령, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 등등은 잘 특징화되어 있으며, 기능적 상세를 부여하는 것으로 알려져 있다. 이들 각 분류 및 동형의 변형된 형태는 본 명세서 분야의 당업자들이 용이하게 식별할 수 있고, 따라서, 본 명세서의 범위내에 있다. 모든 면역글로불린 분류는 명백하게 본 명세서의 범위내에 있다. 다음의 논의는 IgG 분류의 면역글로불린 분자들에 일반적으로 지향될 것이다. IgG에 있어서, 표준 면역글로불린 분자는 분자량이 대략적으로 23,000 달톤인 동일한 2개의 경쇄 폴리펩티드들과, 분자량 53,000-70,000인 동일한 2개의 중쇄 폴리펩티드들을 포함한다. 상기 4개의 쇄는 전형적으로 "Y" 형상으로 이황화결합에 의해 연결되며, 이때 경쇄는 상기 "Y"의 입에서 시작되고, 가변 영역을 통하여 연속되는 중쇄에 묶이게 된다.
경쇄는 카파 또는 람다 (κ, λ)로 분류된다. 각 중쇄 분류는 카파 또는 람다 경쇄에 결합될 수 있다. 일반적으로, 경쇄와 중쇄는 서로 공유적으로 결합되며, 상기 면역글로불린이 하이브리도마, B 세포들 또는 유전공학적으로 조작된 숙주 세포들에 의해 생성될 때, 두 중쇄의 "꼬리" 부분은 공유 이황화물 링키지 또는 비-공유 링키지에 의해 서로 결합된다. 중쇄에서 아미노산 서열들은 Y 형성의 포크 단부의 N-말단에서부터 각 쇄의 하부에 있는 C-말단으로 이어진다.
경쇄와 중쇄는 모두 구조적 그리고 기능적 상동성 영역들로 분리된다. 용어 "불변(constant)" 및 "가변(variable)"은 기능적으로 이용된다. 이 점에 있어서, 경쇄와 중쇄 모두의 가변 도메인 (경쇄: VL 또는 VK; 중쇄: VH) 부분들은 항원 인지와 특이성을 결정하는 것으로 인지될 것이다. 역으로, 경쇄와 중쇄의 불변 도메인들(경쇄:CL; 중쇄: CH1, CH2 또는 CH3)은 중요한생물학적 성질들 이를 테면 분비, 태반경유 운동성, Fc 수용체 결합, 보체 결합, 그리고 이와 유사한 것들을 부여한다. 관례상, 불변 영역 도메인들의 번호매김은 항체의 항원 결합 부위 또는 아미노-말단으로부터 더욱 멀어질 수록 증가된다. N-말단 부분은 가변 영역이며, C-말단 부분은 불변 영역이며; CH3과 CL 도메인들은 실제로, 각각 중쇄와 경쇄의 카르복시-말단을 포함한다.
상기에서 나타낸 것과 같이, 가변 영역은 항체가 항원에 있는 에피토프를 선택적으로 인지하고, 특이적으로 결합하는 것을 허용한다. 즉, 항체의 VL 도메인 및 VH 도메인, 또는 이들 가변 도메인 안에 있는 상보결정부위 (CDRs)의 하위집단이 복합되어, 3차원 항원 결합 부위를 특정짓는 가변 영역이 형성된다. 이러한 항체의 4차 구조는 Y의 각 팔의 단부에 있는 항원 결합 부위를 형성한다. 더 구체적으로, 상기 항원 결합 부위는 상기 VH와 VL 쇄들의 각각에 있는 3개의 CDRs에 의해 특정된다. 일부 경우들에 있어서, 가령, 낙타과종으로부터 유도된 특정 면역글로불린 분자들 또는 낙타과 면역글로불린에 기초된 조작된 특정 면역글로블린 분자들, 완전한 면역글로불린 분자는 경쇄 없이 중쇄 만으로 구성될 수 있다. 가령, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993) 참고.
자연적으로 생성되는 항체들에 있어서, 각 항원 결합 도메인에 존재하는 6개의 "상보결정부위" 또는 "CDRs"은 짧고, 비-연속 아미노산 서열로써 이들은 특이적으로 위치되어 항체가 수성 환경에서 3차원 형상을 추정하는 항원 결합 도메인을 형성한다. 상기 항원 결합 도메인에 있는 "틀구조(framework)" 영역이라고 불리는 나머지 아미노산은 분자간 가변성이 덜하다. 상기 틀구조 영역들은 대개 β-쉬트 입체형태를 취하고, CDRs은 연결되는 루프를 형성하고, 일부 경우에는 β-쉬트 구조의 일부를 형성한다. 따라서, 틀구조 영역은 CDRs들이 쇄간 비-공유 상호작용에 의해 정확한 방향으로 자리잡을 수 있도록 하는 스캐폴드(scaffold)가 형성되도록 작용한다. 자리잡은 CDRs들에 의해 형성된 항원 결합 도메인은 면역반응성 항원에서 에피토프에 상보적인 표면을 특정짓는다. 이 상보성 표면은 상기 항체가 이의 동족(cognate) 에피토프에 비-공유 결합되는 것을 촉진시킨다. 당업자는 임의의 주어진 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인에 있어서 차례로 CDRs과 틀구조 영역이 포함된 아미노산은 이미 정확하게 특정된 바 있기 때문에(하기 참고)용이하게 식별할 수 있을 것이다.
당분야에서 이용되거나 및/또는 수용되는 정의가 2개 또는 그 이상으로 있는 경우에, 본 명세서에서 이용된 바와 같은 용어의 정의는 명시적으로 상충되는 내용이 없다면 이러한 모든 의미를 포함하는 의도를 가진다. 특정 예로는 중쇄와 경쇄 폴리펩티드 모두의 가변 영역 안에서 발견되는 비-연속성 항원 복합 부위를 설명하기 위하여 용어 "상보결정부위" ("CDR")를 사용하는 것이다. 이 특정 영역은 Kabat et al. (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" and by Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)(본 명세서에 참고자료에 편입됨)에 의해 설명되었는데, 여기에서 상기 정의는 서로 비교될 때 아미노산 잔기의 중첩 또는 하위집단을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 이들 정의가 항체 또는 이의 변이체들의 CDR에 적용되는 경우 본 명세서에서 정의되고 이용된 용어의 범위내에 있는 것으로 의도된다. 상기 참고자료 각각에서 정의된 바와 같이 CDRs을 포괄하는 적절한 아미노산 잔기들은 비교용으로 하기 표 1에 제시된다. 특정 CDR을 포괄하는 정확한 잔기 번호는 이 CDR의 서열 및 크기에 따라 변화될 것이다. 당업자는 항체의 가변 영역 아미노산 서열이 제공되면, 어떤 잔기들이 특정 CDR을 포함하는지를 통상적으로 결정할 수 있다.
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Kabat et al. 는 임의의 항체에 적용가능한 가변 도메인 서열들의 번호매김 체계도 특정하였다. 당업자는 서열 자체의 임의의 실험적 데이터에 의존하지 않고, 임의의 가변 도메인 서열에 "Kabat 번호매김" 체계를 분명하게 할당시킬 수 있다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, "Kabat 번호매김(numbering)"은 Kabat et al. (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest."에서 제시된 번호매김 체계를 말한다. 명시적으로 다른 언급이 없는 한, 본 명세서의 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체에서 특이적 아미노산 잔기의 번호매김은 Kabat 번호매김 체계에 따른다.
본 명세서의 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들, 변이체들, 또는 유도체들은 다클론, 단클론, 다중특이적, 인간, 인간화된, 영장류화된, 또는 키메라 항체들, 단일-쇄 항체들, 에피토프-결합 단편들, 가령, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, Fvs, 단일-쇄 Fvs (scFv), 이황화물-연계된 Fvs (sdFv), VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편들, Fab 발현 라이브러리에 의해 만들어진 단편들, 그리고 항-이디오티픽 (항-Id) 항체들을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. ScFv 분자들은 당분야에 공지되어 있으며, 가령, U.S. 특허 5,892,019에서 설명된다. 본 명세서의 면역글로불린 또는 항체 분자들은 임의의 유형 (가령, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 분류 (가령, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2, 등), 또는 면역글로불린 분자의 하위분류일 수 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "중쇄 부분"은 면역글로불린 중쇄로부터 유도된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 중쇄 부분이 포함된 폴리펩티드는 다음중 최소한 하나를 포함한다: VH 도메인, CH1 도메인, 힌지 (가령, 상위, 중간, 및/또는 하위 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 이의 변이체 또는 단편. 예를 들면, 본 명세서에서 이용되는 결합 폴리펩티드는 CH1 도메인을 포함하는 폴리펩티드 쇄; CH1 도메인, 힌지 도메인의 최소한 일부분, 그리고 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드 쇄; CH1 도메인 그리고 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 쇄; CH1 도메인, 힌지 도메인의 최소한 일부분, 그리고 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 쇄, 또는 CH1 도메인, 힌지 도메인의 최소한 일부분, CH2 도메인, 그리고 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 쇄를 포함할 수 있다. 또다른 구체예에 있어서, 본 명세서의 폴리펩티드는 CH3 도메인이 포함된 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 또한, 본 명세서에서 이용되는 결합 폴리펩티드는 CH2 도메인의 최소한 일부분 (가령, CH2 도메인의 전부 또는 일부)가 결핍될 수 있다. 상기에서 제시된 바와 같이, 이들 도메인들 (가령, 중쇄 부분)이 변형되어, 자연적으로 생성되는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열이 가변적일 수 있음을 당업자는 인지할 수 있을 것이다.
특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 공개된 항-Aβ 항체들, 또는 이의 항원-결합 단편들, 이의 변이체들, 또는 이의 유도체들, 다량체의 한 개 폴리펩티드 쇄의 중쇄 부분은 다량체의 제 2 폴리펩티드 쇄에 있는 중쇄 부분과 동일하다. 대안으로, 본 명세서의 중쇄 부분-포함된 모노머들은 동일하지 않다. 예를 들면, 각 모노머는 상이한 표적 결합 부위를 포함하여, 예를 들면, 이중특이적 항체를 형성할 수 있다.
본 명세서에서 공개된 방법에 사용되는 결합 분자의 중쇄 부분들은 상이한 면역글로불린 분자들로부터 유래될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드의 중쇄 부분은 IgG1 분자에서 유도된 CH1 도메인과 IgG3 분자에서 유도된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또다른 실시예에 있어서, 중쇄 부분은 IgG1 분자로부터 일부 유도되고 IgG3 분자로부터 일부 유도된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또다른 실시예에 있어서, 중쇄 부분은 IgG1 분자로부터 일부 유도되고, IgG4 분자로부터 일부 유도된 키메라 힌지 영역을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "경쇄 부분"은 면역글로불린 경쇄, 가령, 카파 또는 람다 경쇄로부터 유도된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 경쇄 부분은 최소한 하나의 VL 또는 CL 도메인을 포함한다.
앞서 나타낸 것과 같이, 다양한 면역글루불린 분류의 불변영역의 하위단위 구조들과 3차원 형상은 공지되어 있다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "VH 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 아미노 말단 가변 도메인을 포함하고, 용어 "CH1 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 처음 (가장 먼 아미노 말단) 불변 영역 도메인을 포함한다. CH1 도메인은 VH 도메인에 인접하며, 면역글로불린 중쇄 분자의 힌지 영역에 대하여 아미노 말단이다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이 용어 "CH2 도메인"은 통상적인 번호매김 제도에 따르면, 가령, 항체의 대략 잔기 244에서 잔기 360까지 연장된 중쇄 분자 부분을 포함한다 (Kabat 번호매김 체계에 따르면 잔기들 244에서 360까지, 그리고, EU 번호매김 체계에 따르면 잔기들 231-340; Kabat EA et al. op. cit. 참고. CH2 도메인은 독특하여, 또다른 도메인과 밀접하게 쌍이 형성되지 않는다. 오히려, 2개의 N-연계된 가지형 탄수화물 쇄가 고유한 상태의 IgG 분자의 2개 CH2 도메인 사이에 끼어있다. CH3 도메인은 CH2 도메인으로부터 IgG 분자의 C-말단까지 뻗어있고, 대략적으로 108개 잔기를 포함한다는 것은 잘 알려진 사실이다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "힌지 영역"은 CH1 도메인을 CH2 도메인에 결합시키는 중쇄 분자의 부분을 포함한다. 이 힌지 영역은 대략적으로 25개 잔기들을 포함하며, 유연성이 있고, 따라서 2개의 N-말단 항원-결합 영역의 독립적 움직임이 허용된다. 힌지 영역들은 3개의 별개 도메인: 상위, 중간, 그리고 하위 힌지 도메인들로 세분될 수 있다(Roux et al., J. Immunol. 161:4083 (1998)).
본 명세서에서 이용된 바와 같이 용어 "이황화물 결합"은 2개의 황 원자 사이에 형성된 공유 결합을 포함한다. 아미노산 시스테인은 제 2 티올기와 함께 이황화물 결합 또는 다리를 형성할 수 있는 티올기를 포함한다. 대부분 자연적으로 생성되는 IgG 분자들에서, CH1 그리고 CL 영역들은 이황화물 결합에 의해 연계되며, 2개의 중쇄는 Kabat 번호매김 체계에 따르면 239와 242에 상응하는 위치 (위치 226 또는 229, EU 번호매김 체계)에서 2개의 이황화결합에 의해 연계된다.
본 명세서에서 공개된 항-Aβ 항체들, 또는 이들의 항원-결합 단편들, 변이체들, 또는 유도체들은 항원의 에피토프(들) 또는 부분(들)에 의해 설명되거나 또는 특정될 수 있는데, 가령, 항체들이 인지하거나 또는 특이적으로 결합하는 본 명세서에서 공개된 표적 폴리펩티드 (가령, Aβ)에 의해 설명되거나 또는 특정될 수 있다. 항체의 항원 결합 도메인과 특이적으로 상호작용하는 표적 폴리펩티드 부분은 "에피토프", 또는 "항원성 결정인자"다. 표적 폴리펩티드는 단일 에피토프를 포함할 수 있지만, 그러나 전형적으로 최소한 2개의 에피토프를 포함하며, 그리고 항원의 크기, 입체형태, 그리고 유형에 따라 임의의 갯수의 에피토프를 포함할 수 있다. 더욱이, 표적 폴리펩티드상에 있는 "에피토프"는 비-폴리펩티드 요소들이거나 또는 포함할 수 있는데, 가령, 에피토프는 탄수화물 측쇄를 포함할 수 있다.
항체를 위한 펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프의 최소 크기는 약 4 내지 5개의 아미노산으로 간주된다. 펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프는 가령, 최소한 7개, 최소한 9개 또는 최소한 약 15 내지 약 30개의 아미노산을 포함할 수 있다. CDR은 삼차원 형태의 항원성 펩티드 또는 폴리펩티드를 인지하기 때문에, 에피토프를 포함하는 아미노산은 인접할 필요가 없으며, 일부 경우에서는 동일한 펩티드 쇄 상에 있지 않을 수 있다. 본 명세서의 항-Aβ 항체들에 의해 인지되는 펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프는 Aβ의 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 최소한 8개, 최소한 9개, 최소한 10개, 최소한 15개, 최소한 20개, 최소한 25개, 또는 약 15개 내지 약 30개의 연속 또는 비-연속 아미노산을 포함할 수 있다.
"특이적으로 결합한다"는 것은 항체가 이의 항원 결합 도메인을 통하여 에피토프에 결합하고, 그리고 이 결합은 항원 결합 도메인과 에피토프 사이에 일부 상보성을 수반한다는 의미다. 이 정의에 따르면, 항체가 무작위의, 무관한 에피토프에 결합하는 것보다 더 용이하게 이의 항원 결합 도메인을 통하여 에피토프에 결합할 때, 에피토프에 "특이적으로 결합한다"라고 한다. 용어 "특이성"은 특정 항체가 특정 에피토프에 결합함으로써 상대적 친화력을 취득할 때 이용된다. 예를 들면, 항체 "A"은 항체 "B"보다는 주어진 에피토프에 더 높은 특이성을 가지는 것으로 간주될 수 있으며, 또는 항체 "A"는 관련된 에피토프 "D"보다 더 높은 특이성으로 에피토프 "C"에 결합된다라고 말할 수 있다.
"선호적으로 결합한다"란 항체가 관련된 유사한, 상동성 또는 유사 에피토프에 결합하는 것보다 좀더 용이하게 에피토프에 특이적으로 결합된다는 것을 의미한다. 따라서, 주어진 에피토프에 항체가 "선호적으로 결합한다"는 것은 이러한 항체가 관련된 에피토프와 교차-반응을 할 수 있지만, 관련된 에피포트보다는 이 에피토프에 좀더 결합을 잘할 것이다라는 의미다.
비-제한적 예로써, 항체의 제 2 에피토트에 대한 해리상수(KD)보다 적은 해리상수 (KD)로 제 1 에피토프에 결합한다면, 이 항체는 제 1 에피토프에 선호적으로 결합하는 것으로 간주된다. 또다른 비-제한적인 예로써, 항체의 제 2 에피토트에 대한 KD보다 최소한 한자리수 적은 친화력으로 제 1 에피토프에 결합한다면, 이 항체는 제 1 항원에 선호적으로 결합하는 것으로 간주된다. 또다른 비-제한적인 예로써, 항체의 제 2 에피토트에 대한 KD보다 최소한 두자리수 적은 친화력으로 제 1 에피토프에 결합한다면, 이 항체는 제 1 에피토프에 선호적으로 결합하는 것으로 간주된다.
또다른 비-제한적인 예로써, 항체의 제 2 에피토트에 대한 해리속도 (k(off))보다 적은 해리속도(k(off))로 제 1 에피토프에 결합한다면, 이 항체는 제 1 에피토프에 선호적으로 결합하는 것으로 간주된다. 또다른 비-제한적인 예로써, 항체의 제 2 에피토트에 대한 해리속도 (k(off))보다 최소한 한 자리수 적은 친화력으로 제 1 에피토프에 결합한다면, 이 항체는 제 1 에피토프에 선호적으로 결합하는 것으로 간주된다. 또다른 비-제한적인 예로써, 항체의 제 2 에피토트에 대한 해리속도 (k(off))보다 최소한 두 자리수 적은 친화력으로 제 1 에피토프에 결합한다면, 이 항체는 제 1 에피토프에 선호적으로 결합하는 것으로 간주된다.
본 명세서에서 공개된 항체 또는 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 본 명세서에서 공개된 표적 폴리펩티드(가령, Aβ ) 또는 이의 단편 또는 변이체에 5 X 10-2 sec-1, 10-2 sec-1, 5 X l0-3 sec-1 또는 l0-3 sec-1 에 대등한 또는 이 미만의 해리속도(k(off))로 결합할 수 있다고 말 할 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 본 명세서의 항체는 본 명세서에서 공개된 표적 폴리펩티드(가령, 인간 Aβ) 또는 이의 단편 또는 변이체에 5 X 10-4 sec-1, 10-4 sec-1, 5 X 10-5 sec-1, 또는 10-5 sec-1, 5 X 10-6 sec-1, 10-6 sec-1, 5 X 10-7 sec-1 또는 10-7 sec-1에 대등한 또는 이 미만의 해리속도(k(off))로 결합할 수 있다고 말 할 수 있다.
본 명세서에서 공개된 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 본 명세서에서 공개된 표적 폴리펩티드(가령, Aβ) 또는 이의 단편 또는 변이체에 103 M-1 sec-1, 5 X 103 M-1 sec-1, 104 M-1 sec-1 또는 5 X 104 M-1 sec-1에 대등한 또는 이 이상의 결합 속도(k(on))로 결합할 수 있다고 말 할 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 본 명세서의 항체는 본 명세서에서 공개된 표적 폴리펩티드(가령, Aβ) 또는 이의 단편 또는 변이체에 105 M-1 sec-1, 5 X 105 M-1 sec-1, 106 M-1 sec-1, 또는 5 X 106 M-1 sec-1 또는 107 M-1 sec-1에 대등한 또는 이 이상의 결합 속도(k(on))로 결합할 수 있다고 말 할 수 있다.
기준 항체가 에피토프에 결합하는 것을 어느 정도 차단시킬 수 있는 수준으로 한 항체가 선호적으로 이 에피토프에 결합한다면, 이 항체는 주어진 에피토프에 기준 항체가 결합하는 것을 경쟁적으로 저해시킬 수 있다고 말한다. 경쟁적 저해는 당분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들면, 경쟁 ELISA 분석에 의해 결정될 수 있다. 항체는 주어진 에피토프에 기준 항체가 결합하는 것을 최소한 90%, 최소한 80%, 최소한 70%, 최소한 60%, 또는 최소한 50% 경쟁적으로 저해할 수 있다고 말한다. 본 명세서에서 설명된 바와 같은, 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 BIIB037 항체를 경쟁적으로 저해시킨다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "친화력"은 면역글로불린 분자의 CDR에 개별 에피토트의 결합 강도의 척도를 지칭한다. 가령, Harlow et al. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.) pages 27-28 참고.
본 명세서에서 공개된 바와 같이 항-Aβ 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들, 변이체들, 또는 유도체들은 맥관 아밀로이드에 대한 친화력보다 더 큰 친화력으로 유조직 아밀로이드 플락에 결합한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "항원항체결합력(avidity)"은 면역글로불린과 항원 집단 사이의 복합체의 전반적인 안전성을 말하는데, 즉, 면역글로불린 혼합물과 항원의 기능적 복합 강도를 말한다. 가령, Harlow 페이지 29-34, 참고. 항원항체결합력은 개체 면역글로불린 분자들이 특이적 에피토프와의 친화력, 그리고 상기 면역글로불린과 상기 항원의 원자가(valencies) 모두에 관련된다. 예를 들면, 이가(bivalent) 단클론 항체와 상당히 반복되는 에피토프 구조를 가진 항원, 이를 테면 폴리머 사이의 상호작용은 높은 항원항체결합력중 하나일 수 있다.
본 명세서에서 공개된 바와 같이 항-Aβ 항체들 또는 항원-결합 단편들, 변이체들, 또는 유도체들은 또한 이들의 교차-반응성에 의해 설명되거나 또는 특정될 수 있다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "교차-반응성(cross-reactivity)" 은 하나의 항원에 특이적인 항체가 제 2 항원에 결합하는 능력을 지칭하는데; 이는 상이한 2개의 항원 물질 사이의 관련성의 척도가 된다. 따라서, 항체가 이의 형성을 유도한 에피토프 이외의 에피토프에 결합한다면, 이 항체는 교차-반응성이다. 상기 교차-반응성 에피토프은 일반적으로 유도 에피토프와 동일한 상보적 구조적 특징중 많은 것을 포함하며, 일부 경우에는 고유한 것보다 더 우수하게 실질적으로 잘 맞을 수 있다.
예를 들면, 특정 항체들은 어느 정도의 교차-반응성을 보유하는데, 이때 항체는 관련된, 그러나 비-동일 에피토프, 가령, 기준 에피토프와 비교하여 최소한 95%, 최소한 90%, 최소한 85%, 최소한 80%, 최소한 75%, 최소한 70%, 최소한 65%, 최소한 60%, 최소한 55%, 그리고 최소한 50% 동일한 (당분야에 공지된 그리고 본 명세서에서 설명된 방법들에 의해 산출된) 에피토프에 결합한다. 항체가 기준 에피토프와 비교하여 95% 미만, 90%미만, 85%미만, 80%미만, 75%미만, 70%미만, 65%미만, 60%미만, 55%미만, 그리고 50%미만의 동일성 (당분야에 공지된 그리고 본 명세서에서 설명된 방법들에 의해 산출된) 에피토프에 결합하지 않는 다면, 이 항체는 교차-반응성이 없거나 또는 거의 없다고 말할 수 있다. 항체가 특정 에피토프의 임의의 기타 유사체, 이종상동체(ortholog), 또는 상동체(homolog)에 결합하지 않는다면, 이 특정 에피토프에 대해 "매우 특이적"이라고 간주될 수 있다.
본 명세서에서 설명된 바와 같은 항-Aβ 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들, 변이체들 또는 유도체들은 또한 본 명세서의 폴리펩티드, 가령, Aβ에 대한 이들의 결합 친화력으로 설명되거나, 또는 특정될 수 있다. 결합 친화력은 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10-15 M, 또는 10-15 M 미만의 해리 상수 또는 Kd를 가진 것들을 포함할 수 있다.
단일-쇄 항체들이 포함된 항체 단편들은 가변 영역(들)만을 포함하거나 또는 다음의 실제 또는 이의 일부와 복합될 수 있다: 힌지 영역, CH1, CH2, 그리고 CH3 도메인들. 가변 영역(들)과 힌지 영역, CH1, CH2, 그리고 CH3 도메인들과의 임의의 조합이 포함된 항원-결합 단편들이 또한 포함된다. 본 명세서에서 공개된 결합 분자들, 가령, 항체들, 또는 이의 항원-결합 단편들은 새와 포유류가 포함된 임의의 동물 기원으로부터 유래될 수 있다. 상기 항체들은 인간, 뮤린, 당나귀, 토끼, 염소, 기니아 피그, 낙타, 라마, 말, 또는 닭 항체들이 될 수 있다. 또다른 구체예에 있어서, 가변 영역은 고유한 상태의 콘드릭토이드(condricthoid) (가령, 상어의)일 수 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "키메라 항체"란 면역반응성 영역 또는 부위는 첫번째 종에서 얻거나 또는 유도되며, 불변 영역 (본 명세서에 따르면 고유하거나, 부분적으로 또는 변형된)은 제 2 종으로부터 획득된 임의의 항체를 의미할 수 있다. 예를 들면, 상기 표적 결합 영역 또는 부위는 비-인간 원천 (가령, 마우스 또는 영장류)으로부터 유도되며, 상기 불변 영역은 인간의 것으로부터 유도될 수 있다. 대안으로, 온전한 인간 결합 영역이 비-인간 (가령, 마우스) 불변 영역과 복합될 수 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "뮤린화된(murinized) 항체" 또는 "뮤린화된 면역글로불린"이란 본 명세서의 인간 항체의 하나 또는 그 이상의 CDRs을 포함하고; 그리고 마우스 항체 서열에 근거하여 아미노산 치환 및/또는 결손 및/또는 삽입이 포함된 인간 틀구조 영역을 포함하는 항체를 지칭한다. CDRs을 제공하는 인간 면역글로불린을 "부모(parent)" 또는 "수용자(acceptor)"라고 불리며, 틀구조 변화를 제공하는 마우스 항체는 "기증자(donor)"라고 불린다. 불변 영역들이 존재할 필요는 없지만, 그러나 존재한다면, 이 불변 영역들은 마우스 항체 불변 영역들과 보통 실질적으로 동일한데, 가령 최소한 약 85-90% 또는 약 95% 또는 그 이상 동일하다. 따라서, 일부 구체예들에 있어서, 전장의 뮤린화된 인간 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린은 마우스 불변 영역, 인간 CDRs, 그리고 "뮤린화된" 아미노산 치환 일부를 보유한 실질적인 인간 틀구조를 포함한다. 전형적으로, "뮤린화된 항체"는 뮤린화된 가변 경쇄 및/또는 뮤린화된 가변 중쇄가 포함된 항체다. 예를 들면, 뮤린화된 항체는 가령, 전형적인 키메라 항체를 포괄하지 않을 수 있는데, 그 이유는 키메라 항체의 전체 가변 영역이 마우스의 것이 아니기 때문이다. "뮤린화" 공정에 의해 "뮤린화된" 변형 항체는 CDRs을 제공하는 부모 항체와 동일한 항원에 결합하고, 부모 항체와 비교하였을 때, 마우스에서 보통 면역원성이 더 약하다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "조작된 항체"란 중쇄 또는 경쇄 또는 이 둘 모두에서 가변 도메인이 공지의 특이성을 가진 항체로부터 하나 또는 그 이상의 CDRs의 최소한 부분적 대체에 의해 변경되고, 필요하다면, 부분적 틀구조 영역 대체 및 서열 변화에 의해 변경된 항체를 말한다. 틀구조 영역이 유도된 항체와 동일한 분류 또는 심지어 하위분류의 항체로부터 CDRs이 유도될 수 있지만, 상이한 분류의 항체, 가령, 상이한 종의 항체로부터 유도될 수 있다는 것도 생각할 수 있다. 공지의 특이성을 가진 비-인간 항체의 하나 또는 그 이상의 "기증자" CDRs이 인간 중쇄 또는 경쇄 틀구조 영역에 접목된 조작 항체는 본 명세서에서 "인간화된(humanized) 항체"라고 지칭한다. 하나의 가변 도메인에서 또다른 도메인으로 항원 결합 능력을 전달하기 위하여 모든 CDRs을 기증자 가변 도메인의 완전한 CDRs로 대체될 필요는 없다. 오히려, 표적 결합 부위의 활성을 유지시키는데 필수적인 잔기들의 전달만이 필요할 수 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, "인간" 또는 "완전한 인간" 항체들은 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 보유한 항체들을 포함하고, 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 단리된 항체들 또는 하나 또는 그 이상의 인간 면역글로불린에 대하여 유전자삽입된 그러나 내생성 면역글로불린을 발현시키지 않는 동물들의 항체들을 포함한다(하기에서 설명된, 예를 들면, U.S. 특허 5,939,598, Kucherlapati et al.에서 설명됨). "인간" 또는 "온전한 인간" 항체들은 중쇄의 최소한 가변 도메인, 또는 중쇄와 경쇄의 최소한 가변 도메인들이 포함된 항체들을 또한 포함하는데, 이때 가변 도메인(들)은 인간 면역글로불린 가변 도메인(들)의 아미노산 서열을 가진다.
"인간" 또는 "온전한 인간" 항체들은 본 명세서에서 설명된 항체 분자들 (가령, 상기 VH 영역 및/또는 VL 영역) 의 변이체들(유도체들 포함)을 포함하는, 기본적으로 구성된, 또는 구성된 본 명세서에서 설명된 바와 같은 "인간" 또는 "온전한 인간" 항체들을 또한 포함하는데, 항체들 또는 이의 단편들은 Aβ 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 변이체에 면역특이적으로 결합한다. 당분야에 숙지된 기술을 가진 자에게 공지된 표준 기술, 가령, 아미노산 치환이 초래되는 부위-지향된 돌연변이생성과 PCR-중재된 돌연변이생성을 포함하나 이에 국한되지 않는 표준 기술을 이용하여 인간 항-Aβ 항체가 인코드된 뉴클레오티드 서열 안에 돌연변이를 도입시킬 수 있다. 특정 구체예들에 있어서 상기 변이체들(유도체들 포함)은 기준 VH 영역, VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VL 영역, VLCDR1, VLCDR2, 또는 VLCDR3과 비교하여 50개 미만의 아미노산 치환, 40개 미만의 아미노산 치환, 30개 미만의 아미노산 치환, 25개 미만의 아미노산 치환, 20개 미만의 아미노산 치환, 15개 미만의 아미노산 치환, 10개 미만의 아미노산 치환, 5개 미만의 아미노산 치환, 4개 미만의 아미노산 치환, 3개 미만의 아미노산 치환, 또는 2개 미만의 아미노산 치환을 인코드한다.
한 측면에 있어서, 본 명세서의 항체는 인간 B 세포들에서 유도된 인간 단클론 항체다. 임의선택적으로, 인간 항체의 틀구조 영역이 배열되고, 데이터베이스, 가령, 관련 인간 생식계 가변 영역 서열에 따라 적용된다. 가령, Vbase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/), MRC Centre for Protein Engineering (Cambridge, UK) 참고. 예를 들면, 진성(true) 생식계 서열로부터 유도된 것이라고 간주되는 아미노산은 클로닝 프로세스 과정 동안 통합된 PCR 프라이머 서열때문일 수도 있다. 인위적으로 생성된 인간-유사 항체들, 이를 테면 파아지 디스플레이 항체 라이브러리 또는 이종발생(xenogeneic) 마우스의 단일 쇄 항체 단편들 (scFvs)과 비교하였을 때, 본 명세서의 인간 단클론 항체는 (i) 대리 동물의 면역 반응이 아니라 인간 면역 반응을 이용하여 획득된 것이며, 가령, 상기 항체는 인간의 신체에서 관련 입체 형태의 천연 Aβ에 반응되어 생성된 것이며, (ii) Aβ의 존재에 대하여 개체를 보호하거나 또는 최소한 유의미적이며, 그리고 (iii) 상기 항체는 인간 기원이기 때문에, 자체-항원에 대항하여 교차 반응성 위험이 최소화되는 것을 특징으로 한다. 따라서, 본 명세서에 따르면, 용어 "인간 단클론 항체", "인간 단클론 자가항체", "인간 항체" 그리고 이와 유사한 것들은 Aβ 결합 분자가 인간 기원의, 가령, 인간 세포 이를 테면 B 세포 또는 이의 하이브리도마로부터 단리되었거나 또는 이의 cDNA가 인간 세포, 예를 들면 인간 기억 B 세포의 mRNA에서 직접 클론되었다는 것을 나타낼 때 이용된다. 인간 항체는 가령, 항체의 결합 특징을 개선시키기 위하여 항체에 아미노산 치환이 만들어진 경우라 하더라도, 여전이 "인간"이다.
인간 면역글로불린 라이브러리로부터 유도된 항체들 또는 하나 또는 그 이상의 인간 면역글로불린에 대해 유전자 삽입된, 그러나 내생성 면역글로불린을 발현시키지 않는 동물에서 유도된 항체들(예를 들면 US 특허 5,939,598, Kucherlapati et al.,에서 설명된)은 본 명세서의 진정한 인간 항체들과 구별하기 위하여 인간-유사 항체들로 명시한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 모두 치료요법적 치료와 예방적 또는 방지적 수단 모두를 지칭하며, 이때 바람직하지 않는 생리학적 변화, 감염, 또는 장애를 방지 또는 지연(경감)시키는 것이 목적이다. 유익한 또는 바람직한 임상 결과는 탐지가능하거나 또는 탐지불가능한 증상의 개선 질환 심각성의 감소, 질환 상태의 안정화 (예컨데, 악화되지 않음), 피험자에서 감염성 물질의 제거 또는 감소, 질환 진행의 지연 또는 감속, 질환 심각성의 개선 또는 경감, 그리고 진정(부분적이건 또는 전체적이건)이 포함되나 이에 국한되지 않는다. "치료"는 치료를 받지 않을 경우 예측되는 생존과 비교하였을 때 생존의 연장을 또한 의미할 수 있다. 치료를 요하는 자들은 이미 이상 또는 장애를 가진 자들 뿐만 아니라, 이러한 이상 또는 장애에 걸리기 쉬운 자들 또는 이러한 상태 또는 장애를 방지해야하는 자들도 포함한다.
"피험자" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유류"는 진단, 예후 또는 요법이 요원한 임의의 피험자, 구체적으로 포유류 피험자를 의미한다. 포유류 피험자는 인간, 가축 동물, 농장 동물, 그리고 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 이를 테면 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 랫(rats), 마우스, 말, 소, 곰 등등을 포함한다.
II. 항-Aβ 항체들
본 명세서에서 공개된 바와 같이, 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 BIIB037 항체와 동일한 에피토프에 결합하고, 이때 BIIB037 항체는 Aβ의 아미노산 3-6이 포함된 에피토프에 결합한다. 인간 BIIB037 항체는 국제 공개 번호 WO2008/081008(본 명세서의 참고자료에 이의 전문이 편입됨)에서 공개된 NI-101.12F6A로 설명된다. 다른 언급이 없는 한, 용어 "12F6A", "hu12F6A" 및 "BIIB037"은 본 명세서에서 호환된다. 본 명세서에서 공개된 바와 같이 용어 "chBIIB037"는 BIIB037의 뮤린 키메라 형태다.
본 명세서에서 설명된 바와 같이, 인간 및 키메라 항-Aβ 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들은 Aβ 및 이의 에피토프 그리고 Aβ의 다양한 입체형태 및 이의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 예를 들면, Aβ 응집체에 선택적으로 결합하는 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들이 본 명세서에서 공개된다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, Aβ에 "선택적으로 결합하는", "특이적으로 결합하는", 또는 "선호적으로 결합하는" 항체는 기타 무관한 단백질에는 결합하지 않는 항체를 지칭한다. Aβ 이형태체(conformer)에 "선택적으로 결합하는" 또는 "특이적으로 결합하는" 항체는 Aβ의 모든 입체 형태에 결합하지 않는 항체, 가령, 최소한 하나의 다른 Aβ 이형태체에 결합하지 않는 항체를 지칭한다. 예를 들면, Aβ의 모노머와 응집된 형태를 구별할 수 있는, 가령, Aβ 원섬유에는 결합하지만, Aβ 모노머에는 결합하지 않는 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들이 본 명세서에서 공개된다.
특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 제공된 방법에 유용한 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 BIIB037 항체항체의 아미노산 서열에 대해 최소한 약 80%, 약 85%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 또는 약 95% 서열 동일성을 가진다. 추가 구체예에 있어서, 상기 결합 분자는 BIIB037 항체에 대하여 최소한 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100% 서열 동일성을 공유한다. 특정 구체예들에 있어서, 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 BIIB037 항체와 동일한 Aβ 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예들에 있어서, 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 면역글로불린 중쇄 가변 영역 (VH)과 면역글로불린 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는데, 이때 표 2에 나타낸 바와 같이, 상기 VH는 서열 번호: 1에 대해 최소한 80%, 85%, 90% 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 가지며, 상기 VL은 서열 번호: 2에 대해 최소한 80%, 85%, 90% 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 가진다.
일부 구체예들에 있어서, 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 VH와 VL을 포함하고, 이때 표 2에 나타낸 바와 같이, 상기 VH는 서열 번호: 1과 동일한 또는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상의 아미노산 치환을 제외하고, 서열 번호: 1과 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL은 서열 번호: 2와 동일한 또는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상의 아미노산 치환을 제외하고, 서열 번호: 2과 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예들은 본 명세서에서 제시된 방법에 유용한, VH가 포함된 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하는데, 이때 표 3에 나타낸 바와 같이, 상기 VH의 VHCDR1, VHCDR2 또는 VHCDR3 영역중 하나 또는 그 이상은 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5중 하나 또는 그 이상의 아미노산 서열의 기준 중쇄 VHCDR1, VHCDR2 및/또는 VHCDR3에 대하여 최소한 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일하다.
본 명세서에서 제시된 방법에 유용한, VH가 포함된 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체가 또한 공개되는데, 이때 표 3에 나타낸 바와 같이, 상기 VH의 VHCDR1, VHCDR2 또는 VHCDR3 영역중 하나 또는 그 이상은 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5중 하나 또는 그 이상의 아미노산 서열의 기준 중쇄 VHCDR1, VHCDR2 또는 VHCDR3에 대하여 동일한 또는 4개, 3개, 2개, 또는 1개의 아미노산 치환을 제외하고 동일하다.
본 명세서에서 제시된 방법에 유용한, VL이 포함된 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체가 또한 공개되는데, 이때 표 3에 나타낸 바와 같이, 상기 VL의 VLCDR1, VLCDR2 또는 VLCDR3 영역중 하나 또는 그 이상은 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8중 하나 또는 그 이상의 아미노산 서열의 기준 중쇄 VLCDR1, VLCDR2 또는 VLCDR3의 아미노산 서열에 최소한 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일하다.
일부 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 제시된 방법에 유용한 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 VL을 포함하는데, 이때 표 3에 나타낸 바와 같이, 상기 VL의 VLCDR1, VLCDR2 또는 VLCDR3 영역중 하나 또는 그 이상은 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8중 하나 또는 그 이상의 아미노산 서열의 기준 중쇄 VLCDR1, VLCDR2 또는 VLCDR3의 아미노산 서열에 동일하거나, 또는 4개, 3개, 2개, 또는 1개의 아미노산 치환을 제외하고 동일하다.
기타 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 제시된 방법에 유용한 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 표 2에 나타낸 바와 같이, 서열 번호: 1과 서열 번호: 2에 최소한 80%, 85%, 90% 95% 또는 100% 동일한 VH와 VL 아미노산 서열을 포함하거나, 기본적으로 구성되거나 또는 구성된다.
일부 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 제시된 방법에 유용한 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 BIIB037 항체를 포함한다.
Figure pct00002
Figure pct00003
본 명세서에서 설명된 방법들에서 이용되는 본 명세서에서 설명된 바와 같은 항-Aβ 항체들, 또는 이의 항원-결합 단편들, 변이체들, 또는 유도체들이 인코드된 폴리펩티드들, 이러한 폴리펩티드들을 인코드하는 폴리뉴클레오티드, 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터들, 그리고 이러한 벡터 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포들, 본 명세서에서 설명된 방법들에서 이용하기 위한 항-Aβ 항체들, 또는 이의 항원-결합 단편들, 변이체들, 또는 유도체들을 만들어내는 모든 것들이 또한 포함된다.
본 명세서에서 설명된 바와 같은 항-Aβ 항체들의 적합한 생물학적 활성 변이체들이 본 명세서의 방법에 이용될 수 있다. 이러한 변이체들은 부모 항-Aβ 항체의 바람직한 결합 성질들을 보유할 것이다. 항체 변이체들을 만드는 방법들은 당 분야에서 일반적으로 이용가능하다.
돌연변이생성 및 뉴클레오티드 서열 변형을 위한 방법은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들면, Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985); Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987); Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, N.Y.); U.S. Pat. No. 4,873,192; 그리고 이들에 언급된 참고자료 참조; 이들 모두 본 명세서의 참고자료에 편입됨. 관심 폴리펩티드의 생물학적 활성에 영향을 주지 않는 적절한 아미노산 치환에 대한 지침은 Dayhoff et al. in Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), pp. 345-352 (1978)의 모델에서 찾아볼 수 있으며, 이의 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다. Dayhoff et al.의 모델은 적절한 보존적 아미노산 치환을 결정하기 위하여 Point Accepted Mutation (PAM) 아미노산 유사성 매트릭스 (PAM 250 매트릭스)를 이용한다. 보존적 치환, 이를 테면 하나의 아미노산을 유사한 성질을 가진 또다른 아미노산으로 교환하는 치환이 만들어질 수 있다. Dayhoff et al. 모델의 PAM 250 매트릭스에 의해 교시되는 보존적 아미노산 치환의 예는 다음을 포함하나, 이에 국한되지 않는다: Gly↔Ala, Val↔Ile↔Leu, Asp↔Glu, Lys↔Arg, Asn↔Gln, 그리고 Phe↔Trp↔Tyr.
항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 결합 특이성을 측정하는 방법들은 다음을 포함하나, 이에 국한되지 않는다: 표준 경쟁적 결합 분석, T 세포들 또는 B 세포들에 의한 면역글로블린 분비를 관찰하기 위한 분석, T 세포 증식 분석, 자가사멸 분석, ELISA 분석, 그리고 이와 유사한 것들. 예를 들면, WO 93/14125; Shi et al., Immunity 13:633-642 (2000); Kumanogoh et al., J Immunol 169:1175-1181 (2002); Watanabe et al., J Immunol 167:4321-4328 (2001); Wang et al., Blood 97:3498-3504 (2001); 그리고 Giraudon et al., J Immunol 172(2):1246-1255 (2004)에서 공개된 분석, 이들 모두 본 명세서의 참고자료에 편입됨. 용어 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드서열 사이의 "서열 동일성 비율"은 비교 창을 통하여 서열이 공유하는 동일한 정합 위치 수를 말하는 것으로, 2개 서열의 최적 배열을 위하여 추가 또는 결손(가령, 갭)이 도입되는 것이 고려되어야 한다. 정합된 위치는 표적 서열과 기준 서열 모두에 동일한 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산이 제시되는 임의의 위치다. 표적 서열에 존재하는 갭은 뉴클레오티드 또는 아미노산이 아니므로 카운트되지 않는다. 유사하게, 표적 서열의 뉴클레오티드 또는 아미노산이 카운트되기 때문에, 기준 서열에 존재하는 갭은 기준 서열로부터 유래된 뉴클레오티드 또는 아미노산이 아니므로, 카운트되지 않는다.
서열 동일성 백분율은 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 잔기 또는 핵산 염기가 발생된 위치의 수를 결정하고, 비교 창에서 정합된 위치의 수를 전체 위치 수로 나누고, 이 결과에 서열 동일성 백분율을 얻기 위하여 100을 곱하여 산출된다.
본 명세서에서 논의된 바와 같이, 본 명세서에서 공개된 불변 영역들, CDRs, VH 도메인 또는 VL 도메인들이 포함된 임의의 특정 폴리펩티드가 또다른 폴리펩티드에 대해 최소한 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 심지어 약 100% 동일한 지를 판단할 때, 온라인 및 다운 로드 모두 이용가능한 소프트웨어를 이용하여 두 서열 사이의 비교 및 서열 상동성 백분율 측정이 이루어질 수 있다. 다양한 원천으로부터, 그리고 단백질과 뉴클레오티드 서열 모두의 배열에 있어서 적합한 소프트웨어 프로그램이 이용가능하다. 서열 동일성 비율을 결정하는데 한 가지 적합한 프로그램은 U.S. 정부의 National Center for Biotechnology Information BLAST 웹사이트 (blast.ncbi.nlm.nih.gov)에서 이용가능한 BLAST 프로그램중 일부인 bl2seq이다. B12seq는 BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘을 이용하여 두 서열의 비교를 실행한다. BLASTN을 이용하여 핵산 서열을 비교하고, 한편 아미노산 서열을 비교하는데 BLASTP가 이용된다. 가령, 다른 적합한 프로그램은 EMBOSS 생물정보학 프로그램의 일부인 Needle, Stretcher, Water, 또는 Matcher인데, 이는 www.ebi.ac.uk/Tools/psa에서 EuropeBioinformatics Institute (EBI)로부터 또한 이용가능하다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 기준 서열과 배열되는 단일 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 표적 서열 안에 상이한 영역들은 고유의 서열 동일성 백분율을 가질 수 있다. 서열 동일성 백분율 값은 가장 근사한 10분의 1값으로 반올림(반내림)한다. 예를 들면, 80.11, 80.12, 80.13, 및 80.14는 80.1로 반내림하고, 80.15, 80.16, 80.17, 80.18, 및 80.19는 80.2로 반올림한다. 길이 값은 통상 정수가 된다.
당업자는 서열 동일성 백분율의 산출을 위하여 서열 배열의 생성은 주요 서열 데이터에 의해 배타적으로 구동되는 이원성 서열-서열 비교에 제한되지 않음을 인지할 것이다. 다중 서열 배열로부터 서열 배열이 구동될 수 있다. 다중 서열 배열을 만드는 한 가지 적합한 프로그램은 www.clustal.org에서 이용가능한 ClustalW2이다. www.drive5.com/muscle/에서 이용가능한 또다른 적합한 프로그램이 MUSCLE이다. ClustalW2 및 MUSCLE 대안으로 가령, EBI에서 대안으로 이용가능하다.
이종성 원천, 이를 테면 구조적 데이터 (가령, 결정학적단백질 구조들, 기능적 데이터 (가령, 돌연변이의 위치), 또는 계통발생학적 데이터에서 얻은 데이터들과 서열 데이터를 통합하여 서열 배열이 만들어질 수 있음을 또한 인지할 것이다. 다중 서열 배열을 만들기 위하여 이종성 데이터를 통합하는 적합한 프로그램은 www.tcoffee.org에서 이용가능한 T-Coffee이며, 대안으로 가령, EBI에서도 이용가능하다. 또한 서열 동일성 백분율을 산출하는데 이용되는 최종 배열은 자동으로 또는 수작업에 의해 큐레이드(curate)될 수 있음을 또한 인지할 것이다.
변이체는 예를 들면, 기준 항-Aβ 항체와 겨우 1 내지 15개의 아미노산 잔기, 겨우 1 내지 10개의 아미노산 잔기, 이를 테면 6-10개, 겨우 5개, 겨우 4개, 3개, 2개, 또는 심지어 1개 아미노산 잔기만 차이가 있을 수 있다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 하전을 가진 측쇄를 보유한 아미노산 잔기로 대체된 치환이다. 유사한 하전을 가진 측쇄를 보유한 아미노산 잔기들의 패밀리는 당분야에 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄들을 가진 아미노산 (가령, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄들을 가진 아미노산 (가령, 아스파르트산, 글루탐산), 전하를 띄지 않는 극성 측쇄들을 가진 아미노산 (가령, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄들을 가진 아미노산 (가령, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분기된 측쇄들을 가진 아미노산 (가령, 트레오닌, 발린, 이소류신)과 방향족 측쇄들을 가진 아미노산 (가령, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 대안으로, 돌연변이는 코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위로 도입될 수 있는데, 이를 테면 포화 돌연변이생성에 의해 도입될 수 있으며, 그리고 생성된 돌연변이체들은 활성을 유지하는 (가령, Aβ 폴리펩티드에 결합하는 능력) 돌연변이체들을 식별하기 위한 생물학적 활성에 대하여 선별될 수 있다.
예를 들면, 항체 분자의 틀구조 영역에서만 또는 CDR 영역에서만 돌연변이를 도입시키는 것이 가능하다. 도입된 돌연변이는 침묵 또는 중립 미스센스(missense) 돌연변이, 가령, 항원에 결합하는 항체의 능력에 영향이 없거나 또는 거의 없을 수 있다. 이러한 유형의 돌연변이는 코돈 용도의 최적화 또는 하이브리도마의 항체 생산을 개선시키는데 유용할 수 있다. 대안으로, 비-중립 미스센스 돌연변이는 항원에 결합하는 항체의 능력을 변경시킬 수 있다. 당업자는 바람직한 성질들, 이를 테면 항원 결합 활성에 변화없는 또는 결합 활성에 변화없는 (가령, 항원 결합 활성의 개선 또는 항체 특이성의 변화) 돌연변이 분자들을 기획하고, 이를 테스트할 수 있다. 돌연변이생성 후, 인코드된 단백질은 통상적으로 발현될 수 있으며, 인코드된 단백질의 기능적 및/또는 생물학적 활성(가령, Aβ 폴리펩티드의 최소한 하나 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 능력)은 본 명세서에서 설명된 기술 또는 당분야에 공지된 기술을 통상적으로 변형시켜 측정될 수 있다.
III. 항-Aβ 항체들을 이용한 치료 방법들
본 명세서는 뇌 아밀로이드 플락을 감소시키는 방법 또는 항-Aβ 또는 이의 항원-결합 단편의 장기 투여 동안 미세 출혈의 발생을 최소화시키는 방법에 관계하는데, 이 방법은 피험자에게 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 투여를 포함한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이 용어 "최소화시키는"이란, 감소, 방지, 일정하게 유지, 증가되지 않게 하는 등등의 의미를 가진다.
특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 설명된 바와 같은 상기 방법들은 뇌 아밀로이드 플락을 감소시키는 것에 관한 것으로, 이 방법은 피험자에게 BIIB037 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여하는 것을 포함하고, 이때 상기 투여로 맥관 아밀로이드에 실질적인 영향을 주지 않고, 뇌의 아밀로이드 플락을 감소시킬 수 있으며, 그리고 이때 BIIB037 항체는 Aβ의 아미노산 3-6이 포함된 에피토프에 결합한다.
일부 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 설명된 바와 같은 상기 방법들은 뇌 아밀로이드를 감소시키는 것에 관한 것으로, 이 방법은 피험자에게 BIIB037 항체를 경쟁적으로 저해시키는 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여하는 것을 포함하며, 이때 상기 투여로 맥관 아밀로이드에 실질적인 영향을 주지 않고, 뇌의 아밀로이드 플락을 감소시킬 수 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이 용어 "맥관 아밀로이드에 실질적인 영향 없이 뇌 아밀로이드 플락을 감소시키는"것은 대조 (가령, 처리안된) 군과 비교하였을 때, 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편 치료에 의해 맥관 아밀로이드 침착의 양이 실질적으로 감소되거나 증가되지 않는다는 것을 의미한다.
뇌 아밀로이드 플락을 감소시키는 방법이 또한 제시되는데, 이때 뇌에서 아밀로이드 플락의 감소는 Fc 수용체 참여와 관련된다. 하나 또는 그 이상의 Fc 수용체들은 소교세포, 성상세표, 핍지교세포 그리고 뉴런에서 발현된다. Fc 수용체들은 신경학적 장애들에서 이들의 관련성에 대해 더욱더 인지된다. 상기 항-Aβ 항체/Aβ 면역 복합체들은 소교세포의 Fc-의존적 활성화에 이어서 Aβ 침착의 식작용 (Wilcock et al., J Neurosci. 23(9):3745-3751 (2003)) 또는 Fc-독립적 기전 (Das et al., J Neurosci. 23(24):8532-8538 (2005))에 의해 제거될 수 있다.
일부 구체예들에 있어서 본 명세서에서 설명된 바와 같은 상기 방법들은 본 명세서에서 설명된 항원-결합 단편들, 변이체들, 및 이의 유도체들이 포함된 항-Aβ 항체들의 사용에 관한 것이다. 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 장기 투여 동안 미세출혈의 발생을 최소화시키는 방법이 더 제공되는데, 이 방법은 피험자에게 BIIB037 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항-Aβ 항체를 투여하는 것을 포함하며, 그리고 이때 BIIB037 항체는 Aβ의 아미노산 3-6이 포함된 에피토프에 결합한다. 특정 구체예들에 있어서 본 명세서에서 설명된 바와 같은 상기 방법들은 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 장기 투여 동안 미세출혈의 발생을 최소화시키는데, 이 방법은 피험자에게 BIIB037 항체를 경쟁적으로 저해시키는 항-Aβ 항체를 투여하는 것을 포함한다. 추가 구체예에서, 본 명세서에서 설명된 바와 같은, 항-Aβ 항체들의 항원-결합 단편들, 이의 변이체들, 그리고 유도체들이 포함된 항-Aβ 항체들은 개체에서 신경퇴행성 장애를 진단 또는 선별하는 방법에 또한 이용될 수 있는데, 테스트되는 개체로 부터 체내 유체 시료를 얻고, 이때 시료는 혈액 시료, 림프 시료, 또는 임의의 기타 체내 유체 시료가 될 수 있으며, 그리고 항체-항원 복합체들이 형성가능한 조건하에서 상기 체내 유체 시료에 본 명세서에서 설명된 바와 같은 항-Aβ 항체를 접촉시켜 진단 또는 선별된다. 이러한 복합체들의 수준은 당분야에 공지된 방법들, 가령, ELISA, 면역형광, 형광-활성화된 세포 분류기 (FACS), 자석 세포 분류기에 의해 측정되는데, 대조 시료에서 형성된 것보다 유의미적으로 더 높은 수준은 테스트 개체에서 해당 질환을 나타낸다. 동일한 방식에서, 본 명세서에서 설명된 바와 같은 항-Aβ 항체들에 의해 결합된 특이적 항원이 또한 이용될 수 있다. 따라서, 본 명세서는 항-Aβ 결합 분자, 가령, 본 명세서의 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 포함된 시험관내 면역분석에 관한 것이다.
추가 구체예에서, 본 명세서에서 설명된 바와 같은, 항-Aβ 항체들의 항원-결합 단편들, 이의 변이체들, 그리고 유도체들이 포함된 항-Aβ 항체들은 개체에게서 신경퇴행성 장애를 치료 또는 방지하기 위한 방법 또는 신경퇴행성 장애와 연합된 증상의 개선을 위한 방법에 또한 이용될 수 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 모두 치료요법적 치료와 예방적 또는 방지적 수단 모두를 지칭하며, 이때 바람직하지 않는 생리학적 변화, 감염, 또는 장애를 방지 또는 지연(경감)시키는 것이 목적이다. 유익한 또는 바람직한 임상 결과는 탐지가능하거나 또는 탐지불가능한 증상의 개선, 질환 심각성의 감소, 질환 상태의 안정화 (예컨데, 악화되지 않음), 피험자에서 감염성 물질의 제거 또는 감소, 질환 진행의 지연 또는 감속, 질환 심각성의 개선 또는 경감, 그리고 진정 (부분적이건 또는 전체적이건)이 포함되나 이에 국한되지 않는다. "치료"는 치료를 받지 않을 경우 예측되는 생존과 비교하였을 때 생존의 연장을 또한 의미할 수 있다. 치료를 요하는 자들은 이미 이상 또는 장애를 가진 자들 뿐만 아니라, 이러한 이상 또는 장애에 걸리기 쉬운 자들 또는 이러한 상태 또는 장애를 방지해야 하는 자들도 포함한다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이 용어 "치료 방법"은 개체에게서 신경퇴행성 장애를 치료 또는 방지하기 위한 방법 또는 신경퇴행성 장애와 연합된 증상의 개선을 위한 방법에 항-Aβ 항체들의 항원-결합 단편들, 이의 변이체들, 그리고 유도체들이 포함된 항-Aβ 항체들의 사용을 포함한다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이 용어 "치료 방법"은 개체에게서 신경퇴행성 장애를 치료 또는 방지하기 위하여 또는 신경퇴행성 장애와 연합된 증상의 개선하기 위하여 본 명세서에서 설명된 항-Aβ 항체들의 항원-결합 단편들, 이의 변이체들, 그리고 유도체들이 포함된 항-Aβ 항체들의 사용을 또한 포함한다.
특이적 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 설명된 바와 같은 상기 방법들은 알츠하이머 질환을 치료 또는 진행을 방지하기 위하여; 알츠하이머 질환과 연합된 증상들을 개선시키기 위하여; 알츠하이머 질환의 존재에 대해 피험자를 진단 또는 선별하기 위하여 또는 알츠하이머 질환 발병 위험을 피험자에게 측정을 위한 것에 관한 것이다.
Aβ의 수준은 당분야에 공지된 임의의 적절한 방법에 의해 평가될 수 있는데, 가령, 웨스턴 블랏, 면역침전, 효소-연계된 면역흡착분석 (ELISA), 방사능면역분석 (RIA), 형광 활성화된 세포 분류 (FACS), 2-차원 겔 전기영동, 질량 분광법 (MS), 매트릭스-지원된 레이져 탈착/이온화-비행시간-MS (MALDI-TOF), 표면-강화된 레이져 탈착 이온화-비행시간 (SELDI-TOF), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 신속한 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC), 다중차원 액체 크로마토그래피 (LC) 이어서 텐덤 질량 분광학 (MS/MS), 그리고 레이져 밀도측정에서 측정된 하나 또는 그 이상의 기술에 의해 Aβ가 분석된다. 특정 구체예들에 있어서, Aβ의 생체내 영상은 양전자방출단층촬영 (PET), 단일 광자 방출 단층촬영(SPECT), 근적외선 (NIR) 광학 영상 또는 자석 공명 영상 (MRI)을 포함한다.
의료 분야에 잘 공지된 바와 같이, 임의의 한 환자를 위한 투여량은 상기 환자의 체격, 체표면적, 연령, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 전반적인 건강 및 동시에 투여되는 기타 약물들이 포함된 많은 인자들에 따라 달라진다.
특정 구체예들에 있어서, 항체-기반의 어레이(array)가 이용될 수 있는데, 예를 들면 Aβ를 특이적으로 인지하는 본 명세서의 항-Aβ 항체들 또는 등가의 항원-결합 분자들이 로딩된 어레이가 된다. 마이크로어레이 면역분석의 기획은 Kusnezow et al., Mol. Cell Proteomics 5:1681-1696 (2006)에 요약된다. 따라서, 본 명세서는 본 명세서의 공개에 따라 식별된 항-Aβ 결합 분자들이 로딩된 마이크로어레이에 또한 관련된다.
IV. 항-Aβ 항체들을 이용한 진단 또는 추적 방법
본 명세서는 테스트 피험자의 뇌에서 아밀로이드 플락 양을 측정하고, 치료될 환자에서 신경퇴행성 질환의 질환 진행을 평가하고 또는 치료를 요하는 환자에서 뇌 아밀로이드 플락에 의해 특징화된 신경퇴행성 질환의 치료를 위하여 항-Aβ 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들, 변이체들, 또는 유도체들의 용도를 제공한다.
일부 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 제공된 방법들에서 유용한 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 치료요법적 물질, 프로드럭, 펩티드, 단백질, 효소, 바이러스, 지질, 생물학적 반응 변형제들, 약제학적 물질들, 또는 PEG에 접합될 수 있다.
통상적인 항체들이 포함된 면역독소인 접합체들은 당분야에서 광범위하게 설명된다. 독소는 통상적인 커플링 기술에 의해 항체에 결합될 수 있거나 또는 면역독소 포함된 단백질 독소 부분은 융합 단백질로써 만들어질 수 있다.
상기 본 명세서에서 공개된 바와 같이 면역요법을 위하여 항-Aβ 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들, 변이체들, 또는 유도체들에 결합될 수 있는 치료요법적 물질의 예로는 약물, 방사능동위원소, 렉틴 및 독소다.
가령, 본 명세서에서 제공된 방법들에 유용한 방사능동위원소에 접합된 항-Aβ 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들, 변이체들, 또는 유도체들을 면역요법으로 사용함에 있어서, 백혈구 분포 뿐만 아니라 안전성 및 방출과 같은 인자들에 따라 특정 동위원소들이 선택될 수 있다. 자가면역 반응에 따라, 일부 방출체(emitters)가 이용될 수 있다. 일반적으로, α와 β 입자 방출 방사능동위원소들이 면역요법에 이용된다. 특정 구체예들에 있어서, 짧은 범위의, 고에너지 α 방출체 이를 테면 212Bi 가 이용될 수 있다. 치료목적을 위하여 본 명세서의 항-Aβ 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들, 변이체들, 또는 유도체들에 결합될 수 있는 방사능동위원소의 예는 123I, 124I, 125I, 131I, 89Zr, 90Y, 67Cu, 64Cu, 111In, 212Bi, 212At, 211Pb, 47Sc, 109Pd, 및 188Re를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 본 명세서에서 공개된 결합 분자, 가령, 항-Aβ 항체들 또는 항원-결합 단편들, 변이체들, 또는 유도체들에 결합될 수 있는 다른 치료 물질들, 뿐만 아니라 생체외 및 생체내 치료요법적 프로토콜은 공지되어 있거나, 또는 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다. 적절한 경우에, 당업자는 상기에서 설명된 항체들, 항원중 임의의 것을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 이용하거나 또는 단백질 물질 자체 대신 대응하는 벡터를 이용할 수 있다.
당업자는 접합되는 선택 물질에 따라 다양한 기술을 이용하여 접합제들이 또한 어셈블리될 수 있다는 것을 인지할 수 있다. 예를 들면, 바이오틴의 활성화된 에스테르 이를 테면, 바이오틴 N-히드록시숙시니미드 에스테르와 결합 폴리펩티드의 반응에 의해 바이오틴과의 접합체(conjugates)가 만들어진다. 유사하게, 커플링 물질 존재하에, 가령, 이소티오시아네이트, 가령, 형광물질-이소티오시아네이트와의 반응에 의해 형광표지를 가진 접합체가 만들어질 수 있다. 본 명세서의 항-Aβ 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들, 변이체들, 또는 유도체들의 접합체들 또한 유사한 방식으로 만들어진다.
테스트 피험자에게서 뇌 아밀로이드 플락의 양을 측정하는 방법들이 더 제공되는데, 이 방법은 다음을 포함한다: (a) BIIB037 항체와 동일한 형태학적 에피토프에 결합하는 또는 BIIB037 항체를 경쟁적으로 저해시키는 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 투여 후, 상기 테스트 피험자의 뇌에서 발생된 신호를 측정하고, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 본 명세서에서 설명된 바와 같은 측정가능한 신호를 만들어내는 물질로 라벨되며; 그리고 (b) 상기 테스트 피험자에서 생성된 신호는 라벨된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 하나 또는 그 이상의 대조 피험자에게 투여시 생성된 신호와 비교하고; 이때 대조 피험자의 것과 비교하여 테스트 피험자에게서 생성된 신호의 증가는 뇌 아밀로이드 플락의 증가와 관련된다.
상기 물질에 의해 생성된 신호는 예를 들면, 단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영 (SPECT) 또는 양전자방출단층촬영 (PET)에 의해 측정될 수 있다.
진단학적 또는 치료요법적 물질에 접합된 항-Aβ 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들, 변이체들, 또는 유도체들이 또한 본 명세서에서 공개된다. 항-Aβ 항체들 또는 항원-결합 단편들, 변이체들, 또는 유도체들을 탐지가능한 물질, 가령, 측정가능한 신호를 만들어내는 물질에 결합시켜 탐지가 실행될 수 있다. 탐지가능한 물질의 예로는 다양한 효소, 보결분자단(prosthetic group), 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질, 방사능활성물질, 다양한 양전자 방출 기술을 이용한 양전자 방출 금속, 그리고 비방사능활성 상자석 금속 이온들을 포함한다. 가령, 본 명세서에 따라 진단물질로 이용하기 위하여 항체에 접합될 수 있는 금속 이온의 경우 U.S. 특허 4,741,900 을 참고한다. 적절한 효소의 예로는 홍당무과산화효소, 알칼리인산분해효소, β-갈락토시데이스, 또는 아세틸콜린에스테라아제를 포함하고; 적절한 보결분자단군 복합체들의 예로는 스트렙토아비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴을 포함하고; 적절한 형광 물질의 예로는 움벨리페론, 형광물질, 형광물질 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 형광물질, 염화 단실 또는 피코에리트린을 포함하고; 발광 물질의 예로는 루미놀을 포함하고; 생물발광 물질의 예로는 루시페라제, 루시페린, 그리고 에퀴노린을 포함하며; 그리고 적절한 방사능활성물질의 예로는 125I, 131I, 111In 또는 99Tc를 포함한다.
"대조 피험자(들)"은 임의의 보통의 건강한 피험자 (또는 피험자의 모둠), 질환의 정도가 상이한 피험자 또는 피험자들, 또는 심지어 질환의 초기 단계에 있는 실제 테스트 피험자를 의미한다.
뇌 아밀로이드 플락에 의해 특징화되는 신경퇴행성 질환에 있어서 치료될 환자에게서 질환 진행을 평가하는 방법이 더 제공되는데, 이 방법은 다음을 포함한다: (a) BIIB037 항체와 동일한 형태학적 에피토프에 결합하는 또는 BIIB037 항체를 경쟁적으로 저해시키는 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 상기 신경퇴행성 질환 치료를 요하는 환자에게 투여하고, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 본 명세서에서 설명된 바와 같이 측정가능한 신호를 만들어내는 물질로 라벨되며, 이때 상기 투여후 상기 환자에게서 신호가 측정되며; (b) (a) 투여 후 하나 또는 그 이상의 시간 간격에서 라벨된 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 투여되며,, 이때 상기 투여후 상기 환자에게서 신호가 측정되며 ; (c) (a) 투여 후 1회 또는 그 이상의 시간 간격에서 상기 환자에게서 측정된 신호의 변화에 근거하여 상기 환자에서 질환 진행이 평가되며; 이때 신호의 증가는 상기 환자의 신경퇴행성 질환의 진행을 의미한다.
본 명세서에서 공개된 라벨된 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 예를 들면, 주어진 치료 및/또는 방지 섭생의 효과를 측정하기 위하여 임상 테스트 절차의 일부로써, 신경퇴행성 질환의 발생 또는 진행을 감시하기 위하여 진단학적으로 이용될 수 있다. 상기 환자의 치료는 신경퇴행성 질환 진행 수준에 근거하여 조정될 수 있다.
치료를 요하는 환자의 뇌 아밀로이드 플락에 의해 특징화된 신경퇴행성 질환을 치료하는 방법이더 제공되는데, 이 방법은 다음을 포함한다: (a) BIIB037 항체와 동일한 형태학적 에피토프에 결합하는 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 신경퇴행성 질환 치료를 요하는 환자에게 투여하고, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 측정가능한 신호를 만들어내는 물질로 라벨되며; (b) 상기 환자에게서 측정된 신호는 라벨된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 하나 또는 그 이상의 대조 피험자에게 투여한 후 측정된 신호와 비교할 때 상기 환자의 질환 상태를 평가하고; 이때 대조 피험자의 것과 비교하여 테스트 피험자에게서 생성된 신호의 증가는 뇌 아밀로이드 플락의 증가와 관련되며; 그리고 (c) 상기 환자는 환자의 질환 상태에 적합한 요법으로 치료한다.
환자의 상태에 적합한 요법은 BIIB037 항체와 동일한 형태학적 에피토프에 결합하는 또는 BIIB037 항체를 경쟁적으로 저해시키는 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 신경퇴행성 질환 치료를 요하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 본 명세서에서 공개된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플락을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환을 치료하는 방법은 다음을 더 포함한다:(d) (a) 투여 후 1회 또는 그 이상의 시간 간격에서 상기 라벨된 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여하고, 이때 상기 투여후 상기 환자에게서 신호가 측정되며 ; 그리고 (e) (a) 투여 후 1회 또는 그 이상의 시간 간격에서 상기 환자에게서 측정된 신호의 변화에 근거하여 상기 환자에서 질환 진행이 평가되며; 이때 신호의 증가는 상기 환자의 신경퇴행성 질환의 진행을 의미한다.
V. 조성물 및 투여 방법들
항-Aβ 항체들, 또는 이의 항원-결합 단편들, 변이체들, 또는 유도체들을 준비하는 방법 및 이를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 방법들은 당업자에게 공지되어 있거나, 또는 당업자가 용이하게 결정할 수 있다. 항-Aβ 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 투여 경로는 예를 들면, 말초, 경구, 비경구, 흡입에 의해 또는 국소가 될 수 있다.
본 명세서에서 논의된 바와 같이, 항-Aβ 항체들, 또는 이의 항원-결합 단편들, 변이체들, 또는 유도체들은 투여를 용이하게 하고, 활성 물질의 안전성을 촉진시키도록 제형화될 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 약제학적으로 수용가능한, 비-독성, 멸균된 운반체 이를 테면 생리학적 염수, 비-독성 완충액, 보존제 그리고 이와 유사한 것들을 포함한다. 본 출원의 목적으로 위하여, 항-Aβ 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 약제학적으로 유효량은 표적에 효과적인 결합을 이루며, 장점, 가령, 맥관 아밀로이드에 영향을 주지 않고, 뇌 아밀로이드 플락을 감소시키기 위하여, 또는 상기 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 장기 투여 동안 미세출혈의 발생을 최소화시키는데 충분한 양을 의미할 것이다. 일부 구체예들에 있어서, 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체은 뇌 아밀로이드 플락을 감소시키는데 효과적인 양으로 혈액-뇌 장벽을 통과할 수 있다.
본 명세서에서 이용된 약제학적 조성물은 가령, 이온교환체, 알루미나, 스테아레이트 알루미늄, 레시틴, 혈청 단백질, 이를 테면 인간 혈청 알부민, 완충 물질들 이를 테면 인산염, 글리신, 소르브산, 소르베이트 칼륨, 포화된 식물성 지방산의 부분적 글리세리드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 이를 테면 프로타민황산염, 수소 인산이나트륨염, 수소 인산 칼슘염, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 트리실리케이트 마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로오스-기반 물질들, 폴리에틸렌 글리콜, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 폴리아크릴레이트, 밀랍, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜, 그리고 양모지를 포함하는, 약제학적으로 수용가능한 운반체를 포함한다.
다양한 항균 및 항곰팡이 물질, 이를 테면 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티레로살 및 이와 유사한 것들이 포함됨으로써 미생물의 작용이 예방될 수 있다. 많은 경우들에 있어서, 등장성 물질들, 예를 들면, 슈가, 다가알코올, 이를 테면 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨이 조성물에 포함될 수 있다. 흡수를 지연시키는 물질, 이를 테면 알루니늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 물질이 조성물에 포함됨으로써 주사가능한 조성물의 연장된 흡수를 가져올 수 있다.
비경구 제형은 단일 볼루스 투여, 주입 또는 로딩 볼루스 투여되며, 이어서 유지 투여가 있을 수 있다. 이들 조성물은 특정하게 고정 또는 가변 간격을 두고 가령, 일일 일회 또는 "필요"에 따라 투여될 수 있다.
비경구 투여용 조제물은 멸균된 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액, 그리고 에멸젼을 포함한다. 비-수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일 이를 테면 올리브유, 그리고 주사가능한 유기 에스테르, 이를 테면 에틸 올레이트다. 수성 운반체는 물, 알코올성/수성 용액, 에멸젼 또는 염수 및 완충된 배지가 포함된, 현탁액을 포함한다. 비경구 비이클은 염화나트륨 용액, Ringer의 덱스트로즈, 덱스트로즈 및 염화나트륨, 유산염화된 Ringer액, 또는 고정된 오일을 포함한다. 정맥내 비이클은 유체 및 영양소 보충물, 전해질 보충물 (이를 테면 Ringer의 덱스트로즈에 기반된 것들), 그리고 이와 유사한 것들을 포함한다. 보존제 및 기타 첨가제, 이를 테면, 예를 들면, 항균제, 항산화제, 킬레이팅 물질들, 그리고 불활성 가스 그리고 이와 유사한 것들이 또한 존재할 수 있다. 더욱이, 본 명세서의 약제학적 조성물은 약제학적 조성물의 의도된 용도에 따라 이를 테면 도파민 또는 정신약리학적 약물을 더 포함할 수 있다. 더욱이, 상기 약제학적 조성물은 본 명세서의 약제학적 조성물이 수동 면역화를 위하여 항-Aβ 항체를 포함한다면, 백신으로 또한 제형화될 수 있다.
본 명세서에서 공개된 바와 같이, 특정 약제학적 조성물은 가령, 캡슐, 테블릿, 수성 현탁액 또는 용액을 포함하는 수용가능한 투약형에 의해 경구로 투여될 수 있다. 특정 약제학적 조성물은 비강 에어로졸 또는 흡입에 의해 또한 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 벤질 알코올 또는 기타 적절한 보존제, 생물이용성을 강화시키기 위한 흡수 촉진제, 및/또는 기타 통상적인 가용화 또는 분산 물질들을 이용하여 염수에서 용액으로 조제될 수 있다.
단일 투약형을 만들기 위하여 운반체 물질과 복합되는 항-Aβ 항체, 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체의 양은 치료될 숙주 및 특정 투여 방식에 따라 가변적일 것이다. 상기 조성물은 단일 투여, 다중 투여 또는 주입의 경우 정해진 시간에 걸쳐 투여될 수 있다. 최적의 바람직한 반응 (가령, 치료요법적 또는 예방적 반응)을 제공하기 위하여 투약 섭생 또한 조정될 수 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이 용어 "말초 투여"는 가령, 정맥내, 동맥내, 복막내, 근육내, 피하, 직장, 또는 질 투여를 포함한다. 모든 형태의 투여가 본 명세서의 범위내에 있는 것으로 명백하게 간주되지만, 투여를 위한 예시적인 형태는 주사용으로, 특히 정맥내 또는 동맥내 주사 또는 점적주입을 위하여 용액이 될 것이다. 주사용으로 적절한 약제학적 조성물은 완충제 (가령, 아세트산염, 인산염 또는 시트르산염 완충제), 계면활성제 (가령, 폴리소르베이트), 임의선택적으로 안정제 물질 (가령, 인간 알부민), 등을 포함할 수 있다. 말초 투여를 위한 조제물은 멸균된 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액, 및 에멸젼을 포함한다. 비-수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일 이를 테면 올리브유, 그리고 주사가능한 유기 에스테르, 이를 테면 에틸 올레이트다. 수성 운반체는 가령, 물, 알코올성/수성 용액, 에멸젼 또는 염수 및 완충된 배지가 포함된, 현탁액을 포함한다. 공개 내용에서, 약제학적으로 수용가능한 운반체는 0.01-0.1 M 인산염 완충액 또는 0.8% 염수를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 기타 통상적인 비경구 비이클은 인산나트륨 용액, Ringer의 덱스트로즈, 덱스트로즈 및 염화나트륨, 유산염화된 Ringer액, 또는 고정된 오일을 포함한다. 정맥내 비이클은 유체 및 영양소 보충물, 전해질 보충물, 이를 테면 Ringer의 덱스트로즈에 기반된 것들, 그리고 이와 유사한 것들을 포함한다. 보존제 및 기타 첨가제, 이를 테면, 예를 들면, 항균제, 항산화제, 킬레이팅 물질들, 그리고 불활성가스 그리고 이와 유사한 것들이 또한 존재할 수 있다.
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본 명세서의 실행에서 다른 언급이 없는 한, 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 유전자삽입 생물학, 미생물학, 재조합 , A, 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이며, 이는 모든 당분야의 기술 범위내에 있다. 이러한 기술은 문헌에서 상세하게 설명된다. 예를 들면, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., Sambrook et al., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., ed., Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1992), DNA Cloning, D. N. Glover ed., Volumes I and II (1985); Oligonucleotide Synthesis, M. J. Gait ed., (1984); Mullis et al. U.S. 특허 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984); Transcription And Translation, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984); Culture Of Animal Cells, R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., (1987); Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press, (1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology, Academic Press, Inc., N.Y.; Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, J. H. Miller and M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1987); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology, Mayer and Walker, eds., Academic Press, London (1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV, D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., (1986); Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); 그리고 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989) 참고.
면역학의 일반적인 원리를 제시하는 표준 참고 작업은 Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein, J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, New York (1982); Roitt, I., Brostoff, J. and Male D., Immunology, 6th ed. London: Mosby (2001); Abbas A., Abul, A. and Lichtman, A., Cellular and Molecular Immunology, Ed. 5, Elsevier Health Sciences Division (2005); 그리고 Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)을 포함한다.
본 발명은 현재 일반적으로 설명되었지만, 본 발명의 측면들과 구체예들의 설명을 위한 목적으로 포함된 실시예를 참고하면 더 용이하게 이해될 것이지만, 본 발명을 이들 실시예에 국한시키는 것은 아니다. 본 명세서에서 언급된 모든 특허 및 공개내용은 참고자료에 편입된다.
실시예들
통상적인 방법들, 이를 테면, 본 명세서에서 이용된 방법들의 상세한 설명은 언급된 문헌들에서 찾아볼 수 있다. 하기에서 명시적으로 언급되지 않는 한, 관심 특이성을 나타내는 Aβ-특이적 B 세포들의 확인 및 분자 클로닝 뿐만 아니라 이들의 재조합발현 및 기능적 특징화는 국제 출원 PCT/EP2008/000053(WO2008/081008로 공개됨), 및 국제 출원 PCT/EP2009/009186(WO2010/069603으로 공개됨)의 실시예 및 보충 방법에서 설명된 것과 같이 실행될 수 있으며, 이의 내용은 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다.
실시예 1: 인간 BIIB037 ("BIIB037")와 키메라 BIIB037 ("chBIIB037")의 일반화 및 시험관내 특징 본 실시예는 BIIB037과 chBIIB037 항체 생성을 설명한다. 추가로, 본 실시예는 Aβ에 대한 BIIB037과 chBIIB037 항체의 결합 친화력 및 선택성을 설명하는데, 이들은 본 명세서에서 설명된 일련의 생화학 방법들을 이용하여 평가되었다.
뛰어난 인지 능력을 가진 또는 경도 인지 장애 (MCI)가 완화된 또는 알츠하이머 질환 (AD)이 시작된 건강한 노년 피험자 코호트는 Aβ-반응성 기억 B 세포들에 대해 선별되었다. 양성 B-세포 클론은 cDNA 클로닝 및 재조합 발현을 거쳐 WO2008/081008에서 이미 설명된 바와 같이, Aβ에 대항하는 인간 단클론 항체들이 만들어졌다. AD 및 APP 유전자삽입 마우스 뇌 단면 모두에서 조직 플락 면역반응성 (TAPIR) 분석을 이용하여 시험관내 응집된 Aβ와 생체외 아밀로이드 플락을 모두 인지하는 능력에 의해 후보 항체들이 선택되었다 (Hock et al., Neuron 38:547-554 (2003)). 이러한 후보 항체중 하나인 인간 IgG1/카파 단클론 항체, BIIB037은 인간 AD 뇌 또는 APP 유전자삽입 마우스의 조직 단면에서 시험관내 응집된 Aβ와 생체외 아밀로이드 플락을 인지하는 이의 능력에 근거하여 추가 특징화를 위하여 선택되었다 (Hock et al., Nature Medicine 8(11):1270-1275 (2002)). BIIB037의 키메라 형태(가령, chBIIB037)가 만들어졌는데, 이때 중쇄와 경쇄의 불변 영역들은 뮤린 IgG2a와 뮤린 카파 쇄 서열에 의해 차례로 대체되었다. 이 키메라 분자 (chBIIB037)는 APP 유전자삽입 마우스에서 장기 투여 연구에 이용되었다. chBIIB037의 mIgG2a 기본골격은 마우스 Fcγ 수용체들에 높은 친화력으로 결합하여, 이 항체가 면역 작동(effector) 세포들, 이를 테면 뇌에 있는 소교세포를 모집하는 능력을 가지게 된다.
Aβ에 대한 BIIB037과 chBIIB037의 결합 친화력 및 선택성은 일련의 생화학 방법들을 이용하여 평가되었다. WO2008/081008에서 설명된 바와 같이, Aβ(1-42) 응집체는 37℃에서 항온처리되고, ELISA 플레이트에 바로 피복시켜 준비되었다. Aβ의 사전형성된 원섬유 응집체가 ELISA 플레이트에 피복될 때, chBIIB037은 잘 특징화된 항체 3D6에 필적하는 0.1 nM의 EC50으로 결합된다 (Bard et al., Nature Medicine 6:916-919 (2000)), (도 1a). chBIIB037이 고정되고, 새로 준비된 가용성 모노머 Aβ(1-40)를 포획하는데 이용될 때, 1 nM의 EC50으로 가용성 Aβ(1-40)을 포획하는 3D6과는 대조적으로 신호가 관찰되지 않았다 (도 1b). Aβ의 가용성 모노머 형태에 결합하지 못하는 BIIB037의 능력은 새로 준비된 모노머 Aβ1-42 또는 사전형성된 Aβ의 원섬유 응집체의 조제물을 이용한 면역침전 연구에 의해 확인되었다(도 1c). 구체적으로, 응집된 또는 모노머 Aβ(1-42) 조제물은 BIIB037 또는 3D6과 함께 항온처리되었고, 단백질 A 세파로즈 비드를 이용하여 포획되었다 상기 비드는 세척되었고, 디티오트레톨이 포함된 SDS-PAGE 시료 완충액에 재현탁되고, 가열되었고, 그리고 상청액은 16% 트리신 SDS-PAGE 상에 로딩되었다. 니트로셀룰로오스 블랏이 준비되었고, 제조업자가 권장하는 희석액에서 마우스 항-베타 아밀로이드 단클론 항체 6E10 (Covance, Princeton, NJ)을 이용하여 웨스턴 블랏팅에 의해 전체 Aβ에 대해 착색되었다. 합성 Aβ1-42 (Aβ42) 펩티드(AnaSpec, Fremont, CA)는 1 mg/mL의 농도로 헥사플로오르이소프로판올에서 재구성되었고, 공기-건조되어 필름이 형성되었으며, 그리고 DMSO에 1 mg/mL의 농도로 용해되었다. Aβ42 아밀로이드 원섬유는 DMSO-재구성된 모노머 Aβ42를 100 μg/mL의 농도로 PBS에 희석시키고, 그리고 37℃에서 최소한 24 h 동안 항온처리함으로써 준비되었다. 새로 준비된 모노머 또는 원섬유 Aβ42의 시료는 BIIB037 또는 3D6와 함께 항온처리되었고, 그리고 단백질 A 세파로즈 비드를 이용하여 포획되었다. 상기 비드는 세척되었고, 디티오트레톨이 포함된 SDS-PAGE 시료 완충액에 재현탁되고, 가열되었었고, 그리고 상청액은 16% 트리신 SDS-PAGE 겔 상에 로딩되었고, 니트로셀룰로오스 막에 블랏시켰고, 그리고 Aβ42는 마우스 단클론 항체 6E10 (Covance, Princeton, NJ)을 이용하여 탐지되었다.
응집체에 대한 상기 항체의 높은 결합 항원항체결합력과 일관되게, chBIIB037은 AD 뇌 조직에서 아밀로이드 플락에 면역착색되었다 (도 1d). 조직은 포르말린-고정된 파라핀에 내장되었으며, 5μm으로 절단되고, 파라핀제거되고, EDTA-붕산염 기반 열-유도된 에피토프 회수 (VentanCC1)가 이용되었다. 후속적으로, FITC-라벨된 chBIIB037은 조직에 제공되었으며 (1.7 μg/ml), 1:50 희석비로 양-항-FITC 항체와 후속 항온처리되었다. 그 다음 조직은 헤마토실린으로 착색되었다.
실시예 2: Tg2576 유전자삽입 마우스에게 단일 복막내 투여 후 BIIB037의 뇌 침투
본 실시예는 뇌로 침투하여, Aβ에 결합하는 BIIB037의 능력을 설명한다. 22 월령의 암컷 Tg2576 마우스 (Kawarabayashi et al., J Neurosci 21(2):372-381 (2001))에서 급성 투여 가령, BIIB037 30 mg/kg으로 복막으로 급성 단일 투여 후, 뇌 안으로의 BIIB037 침투가 평가되었다.
BIIB037 혈장 및 뇌 농도는 상기 항체의 단일 투여 후, 1 일과 3 일차, 그리고 1, 2, 및 3 주차에 ELISA에 의해 측정되었다(도 2a). 구체적으로, 냉동된 뇌는 프로테아제 저해제들과 함께 50 mM NaCl, 0.2% 디에틸아민 (DEA)이 포함된 용액 10배 용적(10 mL/g 습조직)에서 균질화되었고, 얼음위에서 대략적으로 15-20 초 동안 초음파파쇄되었다. 그 다음 시료는 4℃, 100,000 g에서 30분간 원심분리되었다. 상청액은 DEA 추출된 가용성 Aβ 분획으로 유지되었다. 남아있는 펠렛은 10 배 용적의 5M 구아니딘-염산염 (Gu-HCl)에 재현탁되었고, 초음파파쇄되고, 그리고 상기와 같이 원심분리되었다. 생성된 상청액은 구아니딘-추출된 불용성 Aβ 분획으로 유지되었고, 그리고 남아있는 펠렛은 버렸다. 혈장 및 뇌의 BIIB037 농도의 경우, 96 웰 마이크로플레이트 (Nunc Maxisorp, Corning Costar)는 4℃에서 하룻밤 동안 냉각 피복 완충액에서 5 ug/mL의 농도로 Aβ(1-42) 펩티드(Aβ42)에 의해 피복되었다. 혈장 또는 DEA 추출된 (가령, 세척제-없는) 뇌 균질화물 시료는 최종 작업 농도로 희석되었고, 실온에서 2시간 동안 항온처리되었다. 홍당무과산화효소 (HRP)-접합된 염소 항인간 다클론 항체 (Jackson ImmunoResearch)를 이용하여 결합이 측정되었고, 기질 TMB를 이용하여 HRP 활성이 측정되었다. 정제된 항체들을 이용하여 생성된 표준 곡선과 비교하여 농도가 결정되었다. 혈장내 Cmax는 181 μg/ml이었으며, 반감기는 2.5 일이었다. 뇌에서 Cmax는 조직 g 당 1062 ng이었으며, 반감기는 13 일이었다. 도 2b에서 나타낸 것과 같이, BIIB037의 단일 투여 후 혈장 Aβ 농도는 변화되지 않았다. 뇌에서 BIIB037 수준의 감소는 혈장에서의 감소와 나란하지 않았고, 이는 뇌에서 약물은 축적되지만, 혈장에서는 약물이 청소됨을 암시한다. 대조적으로, 3D6 항체는 혈장 Aβ 스파이크(spike)를 촉진시켰다.
바이오티닐화된 항-인간 2차 항체를 이용하여 Tg2576 마우스에게 단일 투여 후 Aβ 침착에 대한 BIIB037의 생체내 결합이 드러났고, 연속 단면 상에서 생체외에서 실행된 pan-Aβ 항체 5F3을 이용한 착색과 비교되었다. 전신으로 투여된 BIIB037은 전형적으로 유조직 아밀로이드 플락에 높은 친화력으로 결합한다 (도 2c). BIIB037에 의한 실질 플락의 착색은 주사 후 1일차에 관찰되었지만, 그러나 주사 후 3일차에 분명하게 나타났고, 그 다음 pan-Aβ 항체 5F3을 이용한 착색과 유사하였다 (도 2d). 조직은 포르말린-고정된 파라핀에 내장되었으며, 5μm으로 절단되고, 파라핀제거되고, EDTA-붕산염 기반 열-유도된 에피토프 회수 (VentanCC1)가 이용되었다. 후속적으로, 염소 항-인간 2차 항체가 1:500 희석비로 조직에 제공되었다. 그 다음 조직은 헤마토실린으로 착색되었다.
실시예 3: Tg2576 유전자 삽입 마우스에게 급성 투여 후 유조직 아밀로이드 플락에 대한 chBIIB037의 결합.
본 실시예는 차등적 chBIIB037 결합을 또한 설명한다. 22월령의 Tg2576 유전자 삽입 마우스에게 급성 투여 후 유조직 아밀로이드 플락에 대한 chBIIB037의 결합. Tg2576 유전자삽입 마우스의 복막내로 Cy3-라벨된 chBIIB037, 또는 Cy3-라벨된 3D6의 단일 투여 (30mg/kg)가 투여되었고, 투여 후 18 일차에 뇌가 수집되었다. 냉동된 뇌 단면은 혈관을 나타내기 위하여 평활근 α-액틴 (SMA)에 대하여 면역착색되었고, 실시예 2에서 설명된 것과 같이 획득되었다. Aβ 침착에 대한 항체의 결합은 상이한 유형의 아밀로이드 침착에 대한 Cy3-chBIIB037 결합을 직접적으로 보여주는 형광 현미경 하에서 드러났다 (도 3a). Cy3-라벨된 3D6 항체는 본 연구의 비교측정물로 이용되었다 (도 3c). 상기 라벨된 항체들에 의해 탐지되는 실질 아밀로이드 침착과 맥관 아밀로이드 침착의 총 면적은 VISIOPHARMㄾ 소프트웨어 (Visiopharm A/S, Hoersholm, Denmark)에 의해 작성된 알고리즘을 이용한 정량적 영상 분석에 의해 측정되었다. (도 3b, d, 및 e). 하나 또는 다른 아밀로이드 구획과 연합된 Cy3 착색은 전체 뇌 영역 착색 비율로 나타내었으며, 맥관 아밀로이드와 비교하여 유조직 아밀로이드에 chBIIB037의 선호적인 결합이 설명되었다. (a, b 및 e). 비교를 위하여, 3D6은 유조직 아밀로이드 플락보다는 맥관 아밀로이드 침착에 선호적으로 결합되었다 (c, d 및 e). 야생형 마우스의 치료 후 chBIIB037 또는 3D6의 결합은 탐지되지 않았다 (e).
실시예 4: Tg2576 유전자삽입 마우스에게 chBIIB037을 6개월의 장기 투여 후 노출
Tg2576 유전자삽입 마우스에게 6개월의 장기 투여 후 노출 후 아밀로이드 부하 감소에 있어서 chBIIB037의 효과. 0.3, 1, 3, 10, 및 30 mg/kg의 상기 항체, 또는 PBS의 투여분량이 복막 주사를 통하여 매주 투여되었다. 마우스 항-인간 항체 반응의 생성을 최소화시키기 위히여, BIIB037의 뮤린 키메라 형태, chBIIB037이 동물에게 투여되었다. 혈장 및 뇌 약물 수준은 실시예 2에서 설명된 바와 같이 ELISA에 의해 측정되었다. 혈장 시료는 최종 투여 후 24h에 수집되었고, chBIIB037 수준 측정에서 노출은 투여와 일차 관계에 있음을 보여주었다 (도 4a, 4c). PBS 집단에서 탐지 한계 이상의 chBIIB037 수준은 상기 분석에서 측정된 내생성 항-Aβ 항체들 때문이다. 디에틸아민 (DEA)-추출된 분획에서 측정된 평균 뇌 약물 농도는 투여된 투여분량과 이에 상응하는 혈장 약물 농도에 비례하였다 (도 4b, 4c). 뇌 농도가 정확하게 산출될 수 있을 때 (3-30 mg/kg) 투여 집단에 있어서 평균 혈장 농도에 대한 평균 뇌 약물 농도의 비율은 0.7-1.0 %이었다.
실시예 5: Tg2576 유전자삽입 마우스에게 chBIIB037을 6개월의 장기 투여 후 아밀로이드 부하 감소.
본 실시예는 실시예 2에서 설명된 것과 같이, 뇌 균질화물 분획을 이용하여 ELISA로 측정되었을 때 뇌 Aβ 로드에서 투여-의존적 감소를 설명한다. 개체 Aβ 종 (Aβ1-38 (Aβ38), Aβ1-40 (Aβ40), 및 Aβ1-42 (Aβ42))의 농도는 DEA 분획, 그리고 멀티-스팟 인간 (4G8) A베타 삼중 분석 (Meso Scale Discovery, MD)을 이용하여 제조업자의 지침에 따라 Gu-HCl 분획에서 측정되었다. Aβ42 농도는 3, 10, 및 30 mg/kg chBIIB037 치료 군에 있어서 가용성 DEA (도 5a)과 구아니딘 분획 (도 5c)에서 모두 유의미적으로 감소되었고, 감소 비율은 PBS 대조와 비교하였을 때 39 내지 50% 범위 안에 있었다. 유의미적인 감소 또는 Aβ40의 감소를 지향하는 경향은 3 mg/kg 및 더 높은 투여분량에서 관찰되었다.
피질과 해마에서 전체 뇌 아밀로이드 로드는 면역조직화학에 의해 나타났다. 구체적으로, 뇌를 절단하고, 10% 중립 완충된 포르말린에 48 내지 72 h 동안 침잠시켜 고정되었다. 고정된 뇌는 수평 방향으로 프로세스 및 내장되었다. 300개의 연속 5μm 단면 (슬라이드당 3개 단면)이 획득되는 시점에서 해마가 확인될 때까지 각 블록이 절단되었다. 6E10 및 티오플라빈-S 착색 모두의 경우에, 매 14번째 슬라이드가 착색되었다 (225 μm 마다 대략 1개 단편). 뇌 아밀로이드를 분명하게 나타내기 위하여 면역조직화학은 1차 항체로써 1:750 희석비에서 마우스 항-Aβ 1-16 단클론 항체 (Clone 6E10, Covance, Princeton, NJ)와 Ultramap 항-마우스 알칼리인산분해효소 키트(Ventana Medical Systems, Tucson, AZ)를 이용하였으며, 본 명세서에서 설명된 바와 같이 VISIOPHARMㄾ 소프트웨어를 이용하여 정량화되었다. 슬라이드는 88% 포름산 용액으로 사전처리된 후, Ventana Discovery XT 면역착색기에 배치되었다. 슬라이드는 Ventana 헤마토실린 (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ)으로 반대착색되었고, 덮개유리를 덮고, 하룻밤동안 대기 건조되었다.
6E10 면역착색 후, 제조업자의 지시에 따라 Aperio XT (Aperio Technologies, Inc., Vista, CA) 전체 슬라이드 영상 시스템으로 20x 확대 하에서 슬라이드는 스캔되었다. 디지털 영상을 검토하였으며, 각 슬라이드에서 3가지중 최고의 단편이 확인되었다. 이 단편으로부터 해마와 피질은 수기로 별도의 마스크로 주석이 달리며, VISIOPHARMㄾ 소프트웨어에 의해 기록된 알고리즘을 이용하여 분석되었다. 이 알고리즘은 10x의 실제 확대 하에서 주석이 달린 해마 또는 피질 그리고 이들 해부학적 영역내 실질 아밀로이드와 맥관 아밀로이드 영역을 결정하였다. 50개 슬라이드 세트에서 소프트웨어 훈련이 실행되었다.
슬라이드는 또한 이미 설명된 바와 같이 티오플라빈-S (Thio-S)로 또한 착색되었으며 (Bussiere et al., Am J Pathol 165:987-995 (2004)), VECTASHIELDㄾ 탑재 배지와 DAPI (Vector Laboratories Burlingame, CA)로 덮게 슬라이드를 덮었다. 티오플라빈-S 착색 후, 슬라이드들을 검토하였으며, 각 슬라이드에서 3개 단편중 최고 영상은 제조업자의 지시에 따라 Aperio FL(Aperio Technologies, Inc., Vista, CA) 형광 전체 슬라이드 영상 시스템으로 20x 확대 하에서 슬라이드는 스캔되었다. 6E10를 이용한 것과 같이, 해마 또는 피질은 수기로 별도의 마스크로 주석이 달리며, VISIOPHARMㄾ 소프트웨어에 의해 기록된 그리고 형광에 대하여 개작된 알고리즘을 이용하여 분석되었다. 이 알고리즘은 10x의 실제 확대 하에서 해마와 피질 그리고 이들 해부학적 영역내 실질 아밀로이드와 맥관 아밀로이드 영역을 결정하였다. 10개 슬라이드 세트에서 소프트웨어 훈련이 실행되었다.
착색된 침착에 의해 점유의 총 면적은 10 및 30 mg/kg 투여의 경우에 상당히 감소되었으며, 감소 비율은 PBS 대조와 비교하였을 때 49 내지 70% 범위 안에 있었다. (도 5b와 5d). Thio-S 착색에 의해 평가된 치밀 아밀로이드 플락에서, 치밀 플락은 30mg/kg의 최대 투여시 해마에서 최대 63% 감소되었으며 (도 5b), 피질에서 최대 53% 감소되었다 (도 5d).
실시예 6: Tg2576 유전자삽입 마우스에서 맥관 아밀로이드에 있어서 chBIIB037의 장기 투여 효과
본 실시예는 Tg2576 유전자삽입 마우스에서 chBIIB037의 장기 투여 후 맥관 아밀로이드와 미세출혈에 대한 효과를 검사한다. 치밀 아밀로이드 플락과 CAA의 Thio-S 착색은 형광 현미경 하에서 드러났고 (도 6a), 상기 실시예 5에서 설명된 바와 같이, VISIOPHARMㄾ 소프트웨어를 이용하여 정량화되었다 (도 6b). 실시예 5에서 설명된 바와 같이, 3, 10, 및 30 mg/kg 투여 경우에 있어서, Thio-S 착색에 의해 피질 (도 6c)과 해마 (도 6d) 에서 맥관 아밀로이드 로드가 평가되었다. 도 6 a-d에서 설명된 바와 같이, Tg2576 유전자삽입 마우스에서 chBIIB037의 장기 투여는 맥관 아밀로이드 로드에 영향을 주지 않았다.
실질 및 혈관구조 모두에 방대한 아밀로이드 병리를 가진 22월령의 Tg2576 유전자삽입 마우스에서 미세출혈이 평가되었다. 마우스는 0, 10, 70, 100 또는 500 mg/kg(한 집단에 성별 9 내지 10마리)에서 chBIIB037, 500mg/kg의 BIIB037 (한 집단에 성별 10마리 마우스), 또는 PBS (대조 군)로 정맥내(i.v.) 치료에 의해 13주 동안 장기 처리되었다. 부검시, 뇌를 수거하였고, 포르말린 고정되었으며, 뇌의 횡단으로 지향된 5개의 상이한 블록으로 정리되었다. 블록당 3개의 5μm 조직 단면을 슬라이드 상에 두고, Perls 착색으로 착색되어, 핵의 신속한 적색 카운터 착색되었다. 미세출혈의 점수는 이미 설명된 바에 근거하였지만(Racke et al., J Neurosci 25:629-636 (2005)), Perls 양성 플로파일은 2개의 연속 단편에서 기록된 것으로 식별되었다. 도 6e에서 나타낸 것과 같이, 10 및 70 mg/kg의 치료군과 대조군 간에 p≤0.05 수준에서 미세출혈 수준의 통계학적 유의미적인 차이는 없었다. chBIIB037 또는 BIIB037을 500 mg/kg까지 투여분량-상승시 상승된 수준을 따르는 비-유의미적인 경향이 관찰되었다.
실시예 7: Tg2576 유전자삽입 마우스에게 chBIIB037을 6개월의 장기 투여 후 아밀로이드 부하 감소.
본 실시예는 10 월령된 Tg2576 유전자삽입 마우스에게 chBIIB037을 6개월의 장기 투여 후 아밀로이드 부하 감소를 설명한다. 구체적으로, 야생형 (wt) chBIIB037 또는 chBIIB037-Agly는 3mg/kg으로 복막내 주사를 통하여 매주 Tg2576 마우스에게 투여되었고, 그리고 실시예 2와 5에서 설명된 바와 같이, 상이한 생화학 또는 조직학적 종점이 측정되었다. Fc 영역의 N-당화를 제거하고, Fc 감마 수용체 결합을 상당히 감소시킨 단일 점 돌연변이 (N297Q, 표준 Kabat EU 번호매김을 이용)가 혼입된 chBIIB037의 비당화된 변이체(chBIIB037-Agly)는 Tao and Morison, J Immunol. 143:2595-2601 (1989)에서 설명된 것과 같이 생성되었다. 동물 집단은 비교측정 항체, 3D6 또는 PBS 대조의 동일 투여 분량으로 처리되었다. 뇌 균질화물로부터 준비된 불용성 (구아니딘) 분획에서 측정된 뇌 Aβ42 수준은 PBS-처리된 대조와 비교하였을 때 최대 55% 상당히 감소된 반면, 비당화된 (Agly) chBIIB037 및 3D6은 효과가 없었다 (도 7a). 실시예 5에서 설명된 바와 같이 Thio-S로 착색된 면적의 정량화에 의해 평가되었을 때, Thio-S 착색에 의해 정량화된 피질성 치밀 아밀로이드 플락은 wt chBIIB037 치료 군에서 상당히 감소되었다. chBIIB037-Agly 및 3D6은 치밀 아밀로이드 플락 로드에 효과가 없었다 (도 7b).
실시예 8: 9.5 월령의 Tg2576 유전자삽입 마우스에게 chBIIB037을 장기 투여 후 아밀로이드 로드 감소는 모든 크기의 플락에게 영향을 준다.
미만성(diffuse) 및 치밀성(compact) 실질 베타-아밀로이드 플락 뿐만 아니라 맥관 아밀로이드 또는 CAA가 포함된 전체 아밀로이드 로드는 6E10 면역조직화학 (도 8a)에 의해 드러났고, 실시예 5에서 설명된 바와 같이, VISIOPHARMㄾ 소프트웨어 (도 8b)를 이용하여 정량화되었다. Aβ-착색된 침착에 의해 점유의 총 면적은 10 및 30 mg/kg 투여의 경우에 상당히 감소되었으며, 감소 비율은 비이클과 비교하였을 때 49 내지 70% 범위 안에 있었다. 0.3, 1, 및 3 mg/kg의 더 낮은 투여분량에서 더 낮은 아밀로이드 로드를 따르는 경향이 관찰되었다. 아밀로이드 플락은 크기에 근거하여 4개 범주로 분류되었다: 플락 <125μm2 (4), 125-250μm2 (3), 250-500μm2 (2)과 >500μm2 (1) (도 8b). 도 8c에서 나타난 것과 같이, chBIIB037 치료는 PBS-처리된 대조군과 비교하였을 때 모든 크기 범위에서 플락 수의 상당한 감소와 연합되었다.
실시예 9: 9.5 월령의 Tg2576 유전자삽입 마우스에게 chBIIB037을 장기 투여 후 아밀로이드 플락의 소교세포(Microglia)-중재된 제거
PBS- 또는 BIIB037-처리된 마우스의 뇌 단면은 Aβ (6E10-연회색)과 소교세포의 표지 (Iba1-진회색)에 대해 면역착색되었다. 항-Aβ 항체들 6E10을 이용한 면역착색에서 PBS 대조 군과 비교하였을 때, chBIIB037-처리된 군에서 상이한 형태의 아밀로이드 플락이 나타났다. 한편 대조 동물에서, 아밀로이드 플락의 윤곽은 불규칙적으로 흐릿한 "퍼지(fuzzy)" 모서리를 가지고, 치료 6개월 후 뇌에 남아있는 대부분의 플락은 선명하게 한정된 경계를 가진 치밀한 코어로 구성된다. (도 9a). 활성화된 소교세포 표지 Iba-1을 이용한 공동-면역 착색에서 소교세포들은 치밀 플락과 밀접하게 연합되었으며, 대개 상기 플락에 의해 완벽하게 에워싸여있는 것으로 나타났다. 이들 세포들은 아메바모양을 하였으며, 신경망으로의 가지형성은 거의 없었다. 대조적으로, PBS-처리된 대조 군에서 소교세포는 거의 플락에 의해 에워싸이지 않았으며, 신경망으로 연장된 풍부한 가지형성이 대개 존재하였다. VISIOPHARMㄾ 소프트웨어를 이용한 분석으로 개체 아밀로이드 플락 면적이 산출되었고, 그리고 Iba1-착색된 소교세포는 2개 범주로 분류되었다: 플락에 의해 에워싸인 것 (25μm의 플락 이내) 또는 플락과 연합되지 않는 것 (플락으로부터 >25μm ). (B) 대식세포에 의해 ≥ 70% 에워싸인 둘레를 가진 플락이 계산되었고, 플락 크기에 근거하여 계층화되었다. 소교세포에 의해 70% 에워싸인 플락의 비율은 플락 ≥ 250μm2 의 경우 PBS-처리된 대조 군 (회색 막대)과 비교하였을 때 chBIIB037-처리된 군 (투명 막대)에서 상당히 더 크다(* = p<.0.005) (도 9b).
실시예 10: Aβ 인지의 기조적 근간
항원 인지의 분자 기본을 이해하기 위하여, Aβ(1-11) 펩티드와의 복합체에서 BIIB037의 Fab 단편이 결정화되었다. BIIB037의 Fab 단편은 전체 항체를 파파인으로 절단을 통하여 생성되었다. 간략하게 설명하자면, 40 mg의 BIIB037 항체는 1 mL의 고정된 파파인 비드 (Thermo Scientific) 존재하에서 37℃에서 18 h 동안 회전 혼합시키면서 절단 완충액(20 mM 인산나트륨염, pH7.2, 10 mM EDTA 및 20 mM 시스테인-HCl)에서 항온처리되었다. 상기 비드는 원심분리에 의해 제거되었고, 절단된 항체 용액은 인산염-완충된 염수에 대하여 투석되었다. 그 다음 상기 용액은 5 mL 단백질 A 세파로즈 컬럼에 로딩되어, 절단된 Fc 단편을 격감시키고, 정제된 BIIB037 Fab 단편이 획득되었다. BIIB037 Fab는 297 K 온도에서 나노방울 증기 확산 방법에 의해 200 nL의 7.6 mg/mL BIIB037 Fab 용액 (10 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl)과 19% PEG 3350, 300 mM 황화 리튬, 그리고 100 mM 아세테이트 나트륨, pH 4가 포함된 200 nL의 저장기 용액을 혼합시킴으로써 결정화되었다. Apo BIIB037 Fab 결정은 글루타알데히드와 교차-연계되었으며, 19% PEG 3350, 100 mM HEPES pH 7, 그리고 10 mM Aβ1-11 (DAEFRHDSGYE; 서열 번호: 9)이 포함된 담금(soaking) 용액으로 이동되었고, 24시간 동안 담그고, 수거한 후, 액화 질소에서 섬광 냉동되었다. 반사 강도를 측정하기 위하여 180ㅀ의 진동 범위와 함께 굴절 데이터는 Raxis-4++ 영상-플레이트 영역 탐지기 (Rigaku Americas, Houston, Texas, USA)를 이용하여 100K에서 FR-E SuperBright 구리 회전-음극 X-선 생성기 (Rigaku Americas, Houston, Texas, USA)상에서 수집되었다. 데이터들이 통합되었고, 변형되었고, 그리고 HKL2000을 이용하여 등급화되었다. BIIB037 Fab:Aβ1-11 결정은 단사정계 공간 집단(monoclinic space group) C2에서 색인화되었다. BIIB037 Fab:Aβ1-11 구조는 프로그램 MolRep과 함께 조사 모델로써 apo BIIB037 Fab 구조를 이용하여 분자 대체에 의해 2.55 Å 해상도로 결정되었다. Aβ1-11의 잔기 Ala2 내지 Gly9에 대하여 뚜렷한 전자 밀도가 관찰되었는데, 이는 Coot에 의해 수작업으로 구축되었다. Aβ의 Asp1 또는 Tyr10 내지 Glu11에 대하여 모델화될 수 있는 결합 홈 외부에는 전자 밀도가 관찰되지 않았다. 구조 세분(refinement)은 REFMAC 프로그램을 이용하여 실행되었다. 최종 모델은 비대칭 단위내 1개 Fab 분자 (H 및 L 쇄), Aβ2-9 펩티드(Q 쇄), 그리고 124 개의 물 분자를 포함하였다. 모델 세분 진행 과정은 교차-인증 Rfree에 의해 모니터되었는데, 이는 데이터의 5%가 포함된 무작위로 할당된 테스트 세트로부터 산출되었다. 최종 R 인자는 19.4%이며, Rfree 인자는 23.8%이다. Ramachandran 플롯 분석에서 모든 잔기들은 허용된 영역 안에 있는 것으로 나타났다.
Aβ의 Asp1 또는 Tyr10 내지 Glu11의 경우에 전자 밀도는 관찰되지 않았다. 구조에서 Aβ 2-9는 N-말단에서부터 C-말단까지 20 Å 뻗어있는 가장 연장된 입체 형태를 채택하고, 이는 Asp7과 Ser8이 포함된 짧은 턴으로 끝나는 것으로 나타났다 (도 10a). Aβ 상의 주요 접촉 잔기들은 Glu-3, Phe-4, Arg-5, 및 His-6을 포함하는데, N- 및 C-말단 절두된 펩티드들을 이용하여 생성된 에피토프 메핑 데이터를 확인시켜준다. BIIB037 Fab와 Aβ2-9의 상호작용은 CDRs L1, L3, H2 및 H3으로 구성된 항원-결합 루프중 4개에서 발견되었다. 특히, 잔기 Phe4와 His6는 CDRs H2, H3, 및 L3 안에 잘-특정된 포켓 안에서 결합한다. Aβ2-9 펩티드는 1157 Å2의 총 표면적으로 보유하는데, 이중 46% (530 Å2)는 높은 모양 상보성(0.75%)을 가진 항체의 인터페이스에 묻혀있다.
아미노산 4-10은 Aβ상의 면역 우성 에피토프로 설명되었다 (McLaurin, Nature, 8: 1263 (2002); Town, T. et al., Neuroscience Lett., 207(2):101-4 (2001)). 따라서, 몇몇 단클론 항체들은 Aβ 서열의 이 영역 안에 유사한 선형 에피토프에 결합하는 것으로 보고되었다. 이들에는 다음이 포함된다: a) 일부 CDRs내에 눈에 띄는 수준의 서열 유사성을 가지고, Aβ (3-7) 영역 안에 유사한 3차 구조를 가진 Aβ에 모두 결합하는 (Basi et al. JBC, (2010)) 항체들 세트 (12A11, 10D5, 12B4, PFA1, PFA2, 및 WO2), 그리고 b)12A11 패밀리보다 상이한 전체적인 구조를 가진 Aβ의 잔기 1-11에 결합하는 간테네루무마브(gantenerumab) (Bohrmann et al., J. Alz. Disease, 26: 1-21 (2011)). 이들 항체에 의해 인지되는 유사한 선형 에피토프에도 불구하고, 이들은 모노머와 응집된 Aβ 간 구별을 하지 못하는 것들 (가령, 12B4)과 응집된 Aβ에 선택적으로 결합하는 것들 (가령 10D5, 12B4, 및 간테네루무마브)이 포함된 일정 범위의 형태학적 선택성을 나타낸다. BIIB037의 구조는 또한 항체-펩티드 인터페이스의 3차 구조와, 결합된 Aβ 펩티드 자체의 입체 형태 모두에서 12A11 패밀리와 간테네루무마브 모두와 상이하다 (도 10b).
실시예 11: 항체 BIIB037의 에피토프 메핑
BIIB037에 대한 에피토프는 Aβ 펩티드의 합성 단편들을 이용하여 ELISA에 의해 확인되었다. N-말단 절두된 Aβ 펩티드들의 경우, 테그안된 펩티드들이 이용되었다. ELISA의 경우, 펩티드들은 피복 완충액 (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9.6)에서 5 마이크로그램/mL의 농도로 4℃에서 하룻밤동안 96 웰 마이크로플레이트를 피복하는데 이용되었다. 플레이트는 세척되었고, 비-특이적 결합 부위는 25℃에서 2% BSA 포함된 PBS로 1시간 동안 차단되었다. 분석 완충액(2% BSA 포함된 PBS)에 희석된 항체가 추가되었고, 상기 플레이트는 25℃에서 2h 동안 항온처리되었다. 결합은 홍당무과산화효소-접합된 염소 항-인간 다클론 항체 (Jackson ImmunoResearch)와 항온처리하고, 기질 TMB를 이용한 HRP 활성의 측정에 의해 결정되었다.
C-말단 절두된 Aβ 펩티드들의 경우, 바이오틴-접합된 펩티드들이 이용되었다. 바이오틴은 비-고유 리신 잔기의 혼입에 의해 단백질의 카르복시 말단에 합성에 의해 부착되었다. ELISA의 경우, 바이오틴-접합된 펩티드들은 분석 완충 액 안에 5 마이크로그램/mL의 농도로, 그리고 뉴트라비딘 (Thermo Scientific Reacti-Bind 플레이트)이 사전-피복된 플레이트와 함께 25℃에서 1h 동안 항온처리되었다. 플레이트들은 세척되었고, 분석 완충액에 희석된 항체가 추가되었고, 상기 플레이트는 25℃에서 2h 동안 항온처리되었다. 결합은 홍당무과산화효소-접합된 염소 항-인간 다클론 항체 (Jackson ImmunoResearch)와 항온처리하고, 기질 TMB를 이용한 HRP 활성의 측정에 의해 결정되었다.
표 4에서 나타낸 것과 같이, Aβ의 잔기 Glu-3을 넘어서 N-말단 절두, 그리고 잔기 His-6를 넘어서 C-말단 절두는 친화력의 상당한 상실로 이어졌다. BIIB037의 주요 결합 부위는 인간 Aβ의 잔기 3-6을 포함한다는 것을 이들 결과에서 나타낸다.
Figure pct00004
BIIB037의 에피토프는 인간과 마우스 Aβ 펩티드들에 대한 상대적 결합을 측정함으로써 또한 조사되었다. 인간과 마우스 Aβ 펩티드 서열은 위치 5, 10, 및 13에서 3개 아미노산이 상이하다 (도 11a). 상기에서 설명된 바와 같이, Aβ (1-16) 서열에 상응하는 바이오티닐화된 합성 펩티드들이 ELISA에 의한 BIIB037의 결합을 측정하는데 이용되었다 (도 11b). 이 펩티드는 인간과 마우스 서열 간의 3개 차이 모두를 포함하지만, 그러나 BIIB037 에피토프 (펩티드 단편들을 이용한 결합 연구를 통하여 확립된 Aβ 잔기들 3-6)안에, 위치 5에서 한 개 아미노산 차이가 있다. 인간과 마우스 Aβ의 EC50 값은 차례로 0.5 및 43 nM이었다. 마우스 펩티드에서 결합 EC50의 ~90배 증가는 인간 Aβ에 선택적으로 결합하며, 잔기 Arg-5는 결합의 주요한 결정인자임을 나타낸다.
실시예 12: [ 125 I]chBIIB037, [ 125 I] Agly-chBIIB037, 그리고 [ 125 I] 인간 BIIB037 F(ab')2'를 이용하여 Tg2576 및 WT 마우스 CNS에서 SPECT 영상 데이터의 검토
단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영 (SPECT) 영상을 이용하여 야생형 (WT)과 Tg2576 (Tg) 마우스의 뇌 안으로 BIIB037 항체의 뮤린 키메라 및 인간 변이체들의 진입을 추적하였다. BIIB037, Agly-chBIIB037 및 인간 BIIB037 F(ab')2의 요오드화는 Iodogen 방법의 변형된 형태(Thermo-Scientific/Pierce Biotechnology, Rockford, IL)에 의해 Agly-chBIIB037은 50μg의 Iodogen (Pierce Iodination Reagent; 튜브당 150μg chBIIB037, Agly-ch12F6A 또는 인간 BIIB037 F(ab')2 및 5mCi 125I-NaI) 및 Tris 요오드화 완충액 (25mM Tis-HCl, 0.4mM NaCl pH7.5 그리고 총 항온처리 용적은 200μl으로 함)으로 사전-피복된 4개의 Pierce 요오드화 튜브에서 20mCi 125I-NaI로 처리되었다. 실온에서 9분 동안 튜브를 부드럽게 교반시킨 후, 50μl의 소거(scavenging) 완충액 (Tris 요오드화 완충액 ml 당 10 mg의 티로신)이 추가되었고, 혼합물은 추가 5분간 부드럽게 교반된 후, 4개 각 튜브에 1ml 25mM Tris-HCl, 0.4mM NaCl pH7.5, 5mM EDTA, 0.5% 아지드 나트륨이 추가되었다. 후속적으로, 4개 튜브로부터 복합된 산물은 Centricon 30K 한외여과 유닛에 추가되었고, 5분 동안 6000 rpm에서 원심분리되었다. 그 다음 컬럼은 4 x 1 ml 염수로 세척되었다. 10μl의 시료는 OD 측정을 위하여 0.5ml으로 희석되었고, 100μl 의 시료는 HPLC 분석을 위하여 1ml로 희석되었다. 나머지도 연구에 이용가능하였다. 이들 연구에서, 5mCi의 [125I]를 이용하여 대략적으로 80% 라벨링 효능에서 0.15mg chBIIB037 또는 Agly-chBIIB037 을 라벨시켜, 항체당 대략적으로 1.8 요오드가 되었다. 상기 라벨된 항체의 활성은 동일한 조건하에 비-방사능활성 요오드로 나란이 라벨된 시료를 만들고, ELISA를 이용하여 Aβ 에 대한 결합 친화력을 측정함으로써 확인되었다.
22-월령의 암컷 Tg2576 (Tg, n = 14)과 비-유전자삽입 C57/BL/6 (WT, n = 14) 마우스에게 표 5에서 표시된 바와 같이, 0, 7, 14 및 21일 차에 꼬리 정맥 주사를 통하여 [125I] chBIIB037 (1.25 - 1.5 mCi), 10 mg/kg, 0.1 ml이 추가된 운반체가 투여되었다. 마우스의 갑상선에서 유리 요오드의 취입을 감소시키기 위하여 요오드화 칼륨(0.2 g/L)이 포함된 음용수가 마우스에게 제공되었다. 표 5에서 표시된 바와 같이 7일 및 14일차 그리고 28일, 48일 그리고 49일차에 또한 방사능라벨된 항체의 후속 주사에 앞서 SPECT/컴퓨터 단층촬영 (CT) 영상화가 실행되었다. SPECT/CT 영상화를 위하여, 100% 산소내 2-3% 이소플루란으로 마우스들이 마취되었다. 1.4 mm 직경의 구멍 바늘구멍 조준기 (x9)가 구비된 작은 동물 전용 NanoSPECT/CT 카메라 (Bioscan/Mediso)를 이용하여 스캔이 실시되었다. SPECT 데이터의 배취(batch) 처리된 재구성은 inviCRO LLC (Boston, MA)에 의해 실행되었고, SPECT 재구성의 CT 공동-등록과 복합된 독점적 마우스 뇌 환추 분석 프로토콜을 이용하여 분석되었다. 동물 103 및 111 (Tg)과 동물 205 및 210 (WT)에게 방사성-요오드를 대신하여 임상적으로 수용되는 방사성동위원소를 이용하여 사전-비교로써 요오드-라벨된 연구 종료시 [111In]chBIIB037이 또한 투여되었다 (표 5).
Figure pct00005
SPECT 데이터의 배취(batch) 처리된 재구성은 inviCRO LLC (Boston, MA)에 의해 실행되었고, SPECT 재구성의 CT 공동-등록과 복합된 독점적 마우스 뇌 환추 분석 프로토콜을 이용하여 분석되었다.
생체내 [125I]chBIIB037 항체 취입은 Tg2576 및 WT 마우스 (n = 집단당 14 마리 동물)의 뇌에서 평가되었다. 이 연구의 모든 동물에서 평균화된 데이터의 SPECT 영상의 개요는 도 12a에 나타내며, Tg2576에서 생체내 피질의 [125I]chBIIB037 취입을 나타내지만, 야생형 마우스에서는 취입을 보이지 않는다. [125I]chBIIB037 항체의 정맥 투여 후 7, 21, 28 및 48일차에 획득된 데이터는 WT 대조와 비교하여 Tg2576 마우스의 CNS에서 방사능활성의 시간- 및 누적된 투여분량-의존적 축적을 보여주었다 (도 12b-e). 이 데이터는 조직 g 당 주사된 투여분량 비율 (% ID/g), 농도 (μCi/mm3) 또는 소뇌(가치없는 조직)에 있는 농도로 표준화된 관심 영역에서의 농도 비율로 나타낸다. 연구 과정에 걸쳐 뇌에서 방사능활성의 양은 모든 영역에 걸쳐 2 내지 10nCi/mm3 범위에 있었다.
도 12 b-c는 연구 14일차 (도 12c)와 7일차(도 12b)의 비교로써, 1.5mCi 방사능라벨의 2회 i.v. 주사 후 시상면(b), 수평(c) 및 관상(d) 면에서 나타낸 Tg2576 마우스 피질 안으로 유사한 규모의 [125I]chBIIB037의 생체내 누적 혼입을 나타낸다. 각 패널에서 영상 (a)는 방사능활성 축적의 후속 정량화를 위한 SPECT 영상과 뇌 환추 (inviCRO LLC)의 공동-등록을 위하여 이용된 CT 영상을 나타낸다. Tg2576 (좌측)과 WT (우측) 마우스에서 [125I]chBIIB037의 높은 수준 취입을 나타내는 7일차 및 14일차 SPECT 대표 영상에서 Tg2576 마우스 뇌의 피질 영역에서는 생체 취입을 나타내지만, 그러나 WT 마우스 뇌에서는 취입을 보이지 않는다.
Tg2576 마우스에서 [125I]chBIIB037 축적은 취입을 고, 중, 저 수준으로 3가지 부류로 분류(임의적)될 수 있다 (도 13). 도 13a-b에서 시간의 경과에 따라 Tg2576 마우스의 CNS 격실 안으로 [125I]chBIIB037의 생체내 취입 및 축적을 보여주는데, 이는 WT 마우스에서는 없으며, 이를 저, 중 및 고 농도의 방사능 수준으로 마우스를 등급화시킬 수 있다. 도 13c는 4주 동안 매 7일마다 반복 투여 후 48일간에 걸쳐 마우스 뇌에서 [125I]chBIIB037의 평균된 정상화된 취입을 나타낸다. Tg 마우스 및 WT 마우스에서 7일차 그리고 Tg 마우스에서 28일차에 표시된 화살표들은 갑상선 안으로 라벨된 유리 요오드의 취입을 나타낸다. Tg 마우스에서 48일차에 나타낸 화살표는 Tg2576 (a) 마우스의 CNS 격실안으로의 취입을 나타내는데, WT 대조 뇌 (b)에서는 취입이 없다.
도 14는 Tg 및 WT 마우스 뇌와 혈액 푸울(pool)에서 [I25I]chBIIB037의 생체내 취입을 보여준다. 상위 패널은 Tg2576 (L)과 WT (R) 마우스에서 48일차(D48)에 평균 뇌 취입을 나타내며, 그 다음 PBS로 관류 후 (관류후 D48) 비교되었다. 하위 패널은 28일차에 데이터로부터 플롯에서 생성된 관심 영역 (ROI)을 나타내는데, Tg2576 마우스의 뇌에서 취입은 혈액 푸울 때문이 아님을 나타내는데, 그 이유는 WT 마우스에서 혈액 푸울과 조직 사이에 방사능활성의 측정된 농도 (μCi/mm3)에서 유의적인 차이가 없기 때문이다.
도 15-18은 [125I]Agly-chBIIB037 및 [125I]huBIIB037 F(ab')2의 생체내 SPECT 영상을 나타낸다. 구체적으로, 22-월령 (n=15)의 암컷 Tg2576 (Tg)과 3-월령 (n=4)의 암컷 WT 마우스에게 0일차에 꼬리 정맥 주사를 통하여 0.1ml 용적에서 [125I]Agly-chBIIB037 (1.3 mCi) 1 mg/kg (n=5) 또는 [125I]huBIIB037 F(ab')2 1mg/kg (n=7마리 Tg 및 4 마리 WT)이 추가된 운반체가 투여되었다 (표 6). 마우스의 갑상선에서 유리 요오드의 취입을 감소시키기 위하여 요오드화 칼륨(0.2 g/L)이 포함된 음용수가 마우스에게 제공되었다. SPECT/CT 영상은 표 6에 나타낸 것과 같이 [125I]Agly-chBIIB037의 경우 7, 10, 14, 및 21일차에 실시되었다. [125I]huBIIB037 F(ab')2의 경우 SPECT/CT 영상촬영은 방사능라벨된 물질의 i.v. 투여후 4, 24, 72 및 168 h 후 실시되었다 (표 6). 모든 경우에서 마우스들은 마취되었고, 스캔은 상기에서 설명된 것과 같이 실시되었다.
Figure pct00006
집단 2와 4의 경우, 집중적인 뇌 SPECT 스캔은 대략적으로 30 분간 실행되었고, 이어서 다음 시간대에서 CT 스캔이 실행되었다: 주사 후 4, 24, 72, 및 168 시간. 집단 3과 5의 경우, 전신 뇌 SPECT 스캔은 대략적으로 30 분간 실행되었고, 이어서 다음 시간대에서 CT 스캔이 실행되었다: 주사 후 4, 24, 72, 및 168 시간. 스캔 후, 투여 측정기(calibrator)를 이용하여 전신 활성이 카운트되었다. 14일차 또는 168시간 영상촬영 후, 동물은 희생되었다. 영상촬영에 앞서, 품질 관리 척도로써 시스템에서 해상도, 보정 및 정량화 연구가 실행되었다. 영상촬영을 위하여 13마리의 마우스가 선택되었다.
125I-라벨된 Agly-chBIIB037 및 huBIIB037 F(ab')2의 방사능화학 순도가 표 7에 제시된다.
Figure pct00007
생체내 [125I]Agly-chBIIB037 취입은 22월령의 Tg2576 마우스 (n = 5)의 뇌에서 평가되었다. 집단 1의 모든 동물의 평균화된 데이터 영상에서 CNS에서 1 mg/kg [125I]Agly-chBIIB037의 방사능라벨이 생체내 취입되며 유지됨을 나타낸다(도 15a). 데이터는 CT 스캔과 공동-등록되고, 각 영상의 99번째 백분율로 표준화시킨 연구 시간동안 집중된 머리 스캔의 시상면 영상을 나타낸다. 동물 1001-1003은 방사능라벨된 생물의 중간 취입 동물로 분류되었으며, 동물 1004는 방사능라벨된 생물의 높은 취입 및 유지된 동물로 분류되었다. 동물 1005는 관찰된 신호가 3번째 뇌실에 있는 방사능라벨에서 나온 것이라는 가능성에 근거하여 낮은 취입 동물로 분류되었다.
각 시간대에 걸쳐 도 15 a에 나타낸 데이터의 관심 영역 (ROI) 분석에서 선조체와 시상의 경우 약 2.0의 표적/소뇌 비율과 비교하였을 때, 21일차 5 마리 동물의 데이터의 평균으로 뇌들보(corpus callosum), 피질, 해마, 뇌실, 후각망물(olfactory bulb) 및 백질에서 대략 2.5의 최대 신호:노이즈 비율을 나타내었다. 분석된 기타 영역들은 1미만의 비율을 가졌다 (도 15b).
집단 2와 3의 6 마리 동물에서 [125I]huBIIB037 F(ab')2의 생체내 취입의 집중화된 뇌 스캔이 평가되었다. 도 15c는 CT 스캔과 공동-등록되고, 각 영상의 99번째 백분율로 표준화시킨 연구 시간동안 집중된 머리 스캔의 시상면 영상을 나타낸다. 상기 데이터는 나이든 Tg2576 마우스 뇌에서 [125I]huBIIB037 F(ab')2의 취입 및 유지를 나타낸다. 동물 1006-1010은 낮은/중간 취입 동물로 분류된 동물 1008을 제외하고 낮은 취입/무취입 동물로 분류되었다. 동물 1011은 방사능라벨된 생물의 높은 취입 및 유지된 동물로 분류되었다. 이 동물에서, 높은 유지는 방사능라벨의 투여 후 168h과 같이 긴 시간 동안 관찰되었다.
어린 (3 월령) WT 마우스 뇌에서 [125I]huBIIB037F(ab')2의 취입 및 유지가 측정되었다. 도 15d는 낮은 또는 높은 유지의 분류를 좀더 명확하게 한정하기 위하여 CT 스캔과 공동-등록되고, 각 영상의 99번째 백분율로 표준화시킨 연구 시간동안 집중된 머리 스캔의 시상면 영상을 나타낸다. 어린 WT 마우스는 [125I]huBIIB037 F(ab')2의 낮은/무(no) 취입 및 유지를 나타낸다.
동물 1008 및 1011의 분류는 도 15e에서 나타낸 ROI 정량화에 의해 또한 확인되었다. 좌측 패널은 4개의 영상촬영 시점에 걸쳐 소뇌의 데이터로 표준화시킨 피질내 평균화된 %ID/g로 나타낸 데이터로써, WT 마우스 뇌와 비교하였을 때, Tg2576 마우스 뇌의 피질에서 더 높은 유지를 나타낸다. 우측 패널은 개별적 취입 데이터를 나타내는데, 2마리의 Tg2576 마우스, 1008과 1011은 WT (적색선)과 나머지 4마리 Tg2576 (흑색선) 마우스를 비교하였을 때, [125I]huBIIB037 F(ab')2를 더 높이 유지하였다는 것을 나타낸다.
Tg2576 마우스에서 [125I]huBIIB037F(ab')2의 생체내 취입 및 유지를 보여주기 위하여 대표 영상이 선택되었다. 도 15f는 방사능활성의 공간적 위치를 좀더 분명하게 시각화하기 위하여 배경신호를 감소시키도록 각 동물에 대해 임의적으로 등급화되고, CT 스캔과 함께 공동-등록된 집중화된 머리 스캔으로부터 시상면과 관상영상을 나타낸다. 동물 1011은 2시간 내지 168시간에 걸쳐 뇌에서 상대적으로 높은 방사능활성의 축적과 유지를 나타낸다. 동물 1008은 연구기간에 걸쳐 동물 1011과 비교하였을 때 소뇌에 대하여 피질 비율이 비록 낮지만 유사한 정량화를 나타내었고, 다시 어느 정도의 취입 및 유지를 나타낸다. 대조적으로, 동물 1007은 최소한 정량화가능한 신호를 나타내었고, 이 임의적 등급화하에 방사능수준의 유의적인 취입 또는 유지는 없었다.
도 15g는 나이든 Tg2576 마우스 및 야생형 마우스 뇌에서 생체내 [125I]huBIIB037 F(ab')2 결합의 관심 영역의 정량적인 분석의 전체적인 결과를 보여준다. 4가지 촬영 시점에 걸쳐 소뇌의 것으로 정상화시킨 피질에서의 %ID/g으로 나타낸 데이터는 WT (하위 패널) 마우스 뇌와 비교하였을 때 Tg2576 (중간 패널) 마우스 뇌의 피질, 해마 및 선조체에서 [125I]huBIIB037 F(ab')2의 더 높은 유지를 보여준다. 상위 패널은 동일한 영역들에서 [125I]Agly-chBIIB037의 생체내 축적을 보여주는 기존 데이터를 확인시킨다.
도 16은 Tg2576 나이든 마우스 뇌의 CNS 안으로 [125I]Agly-ChBIIB037 (1 및 10mpk)의 생체내 축적을 보여주는 48일차 대표 영상을 보여준다. 어린 Tg2576 마우스 뇌에서 [125I]P1.17 라벨된 동형(isotype) 대조 (10mpk)를 이용하였을 때 CNS-특이적 생체내 축적은 관찰되지 않는다.
도 17은 3마리 동물중 3마리에서 낮은 플락 부하를 성공적으로 나타내었으며, 3마리 동물중 2마리에서 높은 플락 부하를 보여준다. 한 마리 높은 플락 부하 동물은 가음성 (높은 플락 부하, 낮은 SPECT 신호)으로 제시되었다.
실시예 13: Tg2576과 WT 마우스 뇌에서 에서 [ 125 I]chBIIB037의 면역조직화학 및 조직학적 착색 대(vs) 마우스 뇌 단면 마이크로방사선사진촬영 (mARG)
본 실시예는 Tg2576 및 WT 마우스 뇌에서 [125I]chBIIB037의 면역조직화학 및 조직학적 착색, 뿐만 아니라 뇌 조직의 방사능사진 평가를 공개한다.
조직 샘플링을 위하여 이용된 프로토콜은 MPI Research Laboratories, Mattawan, MI에서 제공되었다. 기본적으로, 해부 후 뇌를 제공받았으며, 10% 중립 완충된 포르말린에 담구었다. 그다음 고정된 뇌는 처리되고, 파라핀에 내장되었다. 전체적으로 처리된 뇌의 경우, 조직은 관상 단편으로 지향되었다. 관상적으로 정리된 뇌의 경우, 블럭은 뇌의 전방 표면에서 시작하여 숫자로 라벨된다 (가령, 블록 1 = 전뇌, 블록 7 = 후뇌). 5 및/또는 10 μm 연속 단면은 뇌를 통하여 최저 6개 레벨로부터 획득되었다. 각 레벨에서 IHC용으로 1개 단편 그리고 ARG용으로 2개 단편이 최소 획득되었다. Aβ IHC 착색을 위하여, 뇌의 각 레벨(대략적으로 250-500μm 마다)로부터 한 개 슬라이드가 착색되었다 . 연구 데이터에 레벨간 특정 두께, 단편의 수 및 거리가 기록되었다(도 18).
뇌 아밀로이드를 특정하기 위한 면역조직화학 (IHC)은 1차 항체로 Covance 마우스 항-인간 베타 아밀로이드 1-16 단클론 항체 (Clone 6E10, SIG-39320)를 최종 농도 2μg/ml로 이용하였다. Biocare MM-AP 중합체는 2차 항체로 이용되었으며, VulcFast Red는 색소원(chromogen)으로 이용되었다. 간략하게 설명하자면, 슬라이드는 88% 포름산 용액에 3 분간 담궈두었고, 그 다음 5분간 증류수로 헹궈내고, 완충액으로 이동시킨 후 수작업에 의해 착색되었다. 동형(isotype) (IgG1) 음성 대조가 동시에 운용되었다. 슬라이드는 Richard Allen 헤마토실린 2로 반대착색되었고, 덮개유리를 덮고, 하룻밤동안 대기 건조되었다.
MPI Research Laboratories 프로토콜로부터, 냉동 마우스 사체로부터 머리는 2% 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 매트릭스에 내장시키고, -20℃에서 유지된 박절기 스테이지에 탑재시켰다. 절단에 앞서 4개의 품질 대조 표준(단편 두께 품질 대조)을 냉동 블럭에 배치시켰다. 피질의 40μm 두께 단편이 절단되었고, 접착 테이프 상에 붙여두었다.
뇌 단면 mARG는 Tg2576 마우스 101, 102 및 106 그리고 WT 마우스 201 및 206에서 준비된 슬라이드를 위하여 MPI/inviCRO)와 접촉하에 QPS (Delaware, MD)에 의해 평가되었다. Mattawan, MI의 MPI 연구 설비에서 각 마우스의 뇌가 수거되었고 냉동되었다. 냉동된 뇌는 드라이아이스로 이동되었고, 절단때까지 -70℃에서 보관되었다. 핵 측중격(nucleus accumbens), 복내측(ventromedial hypothalamus), 배내측 뇌하수체(dorsomedial hypothalamus), 배후 솔기(dorsal raphe), 고립속계 핵(nucleus of the solitary tract), 그리고 맨뒤구역(area postrema)이 포함된 단편을 얻는 것이 가능할 때마다, 각 뇌의 6개 해부학적 영역으로부터 관상 횡단면이 획득되었다. mARG 단면에서 뇌 Aβ를 국소화시키기 위한 IHC 착색 절차가 실행되었고, Aβ 및 방사능라벨된 테스트 물질의 공동-국소화가 가능한지를 확인하기 위하여 결과들이 평가되었다.
2마리 Tg와 2마리 WT 마우스는 28일차 (n=2 Tg, n = 1 WT) 또는 7일차 (n= 1 WT)에 희생되어, 생체외에서 방사능활성이 관련 뇌 영역(들)에서 표적 (아밀로이드 플락)에 국소화되었는지를 측정하였다. 대표적인 데이터는 WT 마우스에서 취한 유사한 영역에서 비-특이적 활성과 비교하였을 때 Tg 마우스의 뇌 해마 층에서 방사능활성이 집중 존재함을 보여준다 (도 19).
도 20는 Tg2576 뇌의 인접 단면에서 6E10-유도된 Aβ 면역착색과 mARG-유도된 방사능활성의 공동-국소화를 보여준다. 더욱이, mARG 단면을 이용하여 해마 영역에서 인접 단편에 있는 Aβ의 티오플라빈-S 착색은 애매한 결과를 나타내었다(도 21).
실시예 14: [ 125 I]chBIIB037 및 [ 125 I] 인간 BIIB037 F(ab')2'를 이용한 생체분포 연구
연구 종료시 2마리 WT와 3마리 Tg 마우스를 이용하여 몇몇 조직에서 [125I]chBIIB037의 생체 분포를 평가하였다(표 5). 이들 동물은 방사능라벨된 항체의 최종 i.v. 투여 후 7일, 연구 28일차에 희생되었다. 비장, 전체 뇌, 신장, 근육, 간, 방광, 폐, 위, 내장 및 혈액이 포함된 장기 및 조직이 제거되었다. 장기 및 조직 시료의 중량을 재고, 자동화 감마 카운터를 이용하여 방사능활성이 측정되었다. 주사된 투여 분량 백분율 (%ID)은 희석된 표준 용액과 부패(decay)-보정된 주사 투여분량을 이용하여 산출되었다. 따라서 방사능활성 농도는 습 조직 g 당 주사된 투여분량 백분율 (%ID/g)로 나타내었다 (표 8 및 도 22).
Figure pct00008
표 8과 도 22는 조직에 걸쳐 %ID/g로 표시된 데이터를 나타내는데, WT 마우스 뇌와 비교하였을 때 Tg 에서 방사능활성의 생체내 축적이 더 높은 것으로 나타나, 뇌 조직에서 최저의 그러나 선택적 축적을 보여준다.
비-표적 말단 장기에서 연구 시간 경과에 따른 [125I]huBIIB037F(ab')2의 생체 분포는 이들 장기의 ROI 분석을 이용하여 측정되었다. 도 23은 Tg2576과 WT 마우스에서 생체내 [125I]huBIIB037 F(ab')2의 전신 SPECT 영상을 나타낸다. 뇌에서 최대 [125I]huBIIB037F(ab')2를 보인 동물 1011 (좌측)의 경우 전신 최대 강도 투사(MIPs)는 WT 마우스 A1014 (우측)와 비교된다. 영상은 2 세트의 MIPs로 제시되는데, 데이터는 첫번째 영상(상부)의 최대 복셀(voxel)의 99번째 백분위수로 표준화되거나 또는 각 영상의 최대 복셀의 99번째로 표준화된다(하부).
도 24는 나이든 Tg2576과 어린 WT 마우스의 비-표적 조직에서 [125I]huBIIB037 F(ab')2의 생체내 분포의 정량적 전신 분석을 보여준다. Tg2576 마우스의 갑상선 조직에서 축적은 시간의 경과에 따른 WT (n = 2) 마우스와 비교하여 방사능활성의 생체내 축적이 더 높다(n = 3)는 것을 나타낸다 신장 축적은 방사능라벨된 물질의 신장 제거를 반영하여 시간의 경과에 따라 감소된다.
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본 명세서는 본 명세서의 개별 측면의 단일 설명으로 의도된 특정 구체예에 의해 그 범위가 제한되지 않으며, 기능적으로 등가인 임의의 조성물 또는 방법은 본 명세서의 범위내에 있다. 또한, 본 명세서에서 설명되고, 보여진 것들에 추가하여 본 명세서의 다양한 변형은 전술한 설명 및 첨부 도면으로부터 당업자들에게 자명할 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위 안에 속한다.
본 명세서에서 언급된 모든 공개 및 특허 출원은 각각의 공개 또는 특허 출원이 참고자료에 특이적으로 개별적으로 편입되는 것과 같은 수준으로 본 명세서에서 참고자료에 편입된다.
SEQUENCE LISTING <110> Biogen Idec International Neuroscience GMBH <120> A METHOD OF REDUCING BRAIN AMYLOID PLAQUES USING ANTI-AMYLOID BETA ANTIBODIES <130> 2159.387PC02/EJH/BMB <140> To be assigned <141> Herewith <150> 61/734,799 <151> 2012-12-07 <150> 61/773,794 <151> 2013-03-06 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Thr Lys Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Gly Ile Gly Ala Arg Arg Gly Pro Tyr Tyr Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHCDR1 <400> 3 Ser Tyr Gly Met His 1 5 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHCDR2 <400> 4 Val Ile Trp Phe Asp Gly Thr Lys Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHCDR3 <400> 5 Asp Arg Gly Ile Gly Ala Arg Arg Gly Pro Tyr Tyr Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VLCDR1 <400> 6 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VLCDR2 <400> 7 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VLCDR3 <400> 8 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr 1 5 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Abeta 1-11 <400> 9 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu 1 5 10

Claims (43)

  1. 뇌 아밀로이드 플락을 감소시키는 방법에 있어서, 이 방법은 피험자에게 BIIB037 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여하는 것을 포함하며, 이때 상기 투여로 맥관 아밀로이드에 실질적인 영향을 주지 않고, 뇌의 아밀로이드 플락을 감소시킬 수 있으며, 그리고 이때 BIIB037 항체는 Aβ의 아미노산 3-6이 포함된 에피토프에 결합하는, 방법.
  2. 뇌 아밀로이드 플락을 감소시키는 방법에 있어서, 이 방법은 피험자에게 BIIB037 항체를 경쟁적으로 저해시키는 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여하는 것을 포함하고, 이때 상기 투여로 맥관 아밀로이드에 실질적인 영향을 주지 않고, 뇌의 아밀로이드 플락을 감소시킬 수 있는 방법.
  3. 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 장기 투여 동안 미세출혈의 발생을 최소화시키는 방법에 있어서, 아 방법은 피험자에게 BIIB037 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항-Aβ 항체를 투여하는 것을 포함하고, 이때 BIIB037 항체는 Aβ의 아미노산 3-6이 포함된 에피토프에 결합하는, 방법.
  4. 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 장기 투여 동안 미세출혈의 발생을 최소화시키는 방법에 있어서, 피험자에게 BIIB037 항체를 경쟁적으로 저해시키는 항-Aβ 항체를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  5. 다음을 포함하는, 테스트 피험자에게서 뇌 아밀로이드 플락의 양을 측정하는 방법:
    (a) BIIB037 항체와 동일한 형태학적 에피토프에 결합하는 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여한 후, 테스트 피험자의 뇌에서 발생된 신호를 측정하고, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 측정가능한 신호를 만들어내는 물질로 라벨되며;
    (b) 상기 테스트 피험자에서 생성된 신호는 라벨된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 하나 또는 그 이상의 대조 피험자에게 투여시 생성된 신호와 비교하며; 이때 대조 피험자의 것과 비교하여 테스트 피험자에게서 생성된 신호의 증가는 뇌 아밀로이드 플락의 증가와 관련된다.
  6. 다음을 포함하는, 치료를 요하는 환자의 뇌 아밀로이드 플락에 의해 특징화된 신경퇴행성 질환을 치료하는 방법:
    (a) BIIB037 항체와 동일한 형태학적 에피토프에 결합하는 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 신경퇴행성 질환 치료를 요하는 환자에게 투여하고, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 측정가능한 신호를 만들어내는 물질로 라벨되며;
    (b) 상기 환자에게서 측정된 신호를 라벨된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 하나 또는 그 이상의 대조 피험자에게 투여한 후 측정된 신호와 비교하여 상기 환자의 질환 상태를 평가하고; 이때 대조 피험자의 것과 비교하여 테스트 피험자에게서 생성된 신호의 증가는 뇌 아밀로이드 플락의 증가와 관련되며; 그리고
    (c) 상기 환자를 환자의 질환 상태에 적합한 요법으로 치료한다.
  7. 다음을 포함하는, 테스트 피험자에게서 뇌 아밀로이드 플락의 양을 측정하는 방법:
    (a) BIIB037 항체를 경쟁적으로 저해하는 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 투여 후 상기 테스트 피험자의 뇌에서 발생된 신호를 측정하고, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 측정가능한 신호를 만들어내는 물질로 라벨되며; 그리고
    (b) 상기 테스트 피험자에서 생성된 신호는 라벨된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 하나 또는 그 이상의 대조 피험자에게 투여시 생성된 신호와 비교하며; 이때 대조 피험자의 것과 비교하여 테스트 피험자에게서 생성된 신호의 증가는 뇌 아밀로이드 플락의 증가와 관련된다.
  8. 다음을 포함하는, 치료를 요하는 환자의 뇌 아밀로이드 플락에 의해 특징화된 신경퇴행성 질환을 치료하는 방법:
    (a) BIIB037 항체를 경쟁적으로 저해하는 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 신경퇴행성 질환 치료를 요하는 환자에게 투여하고, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 측정가능한 신호를 만들어내는 물질로 라벨되며;
    (b) 상기 환자에게서 측정된 신호를 라벨된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 하나 또는 그 이상의 대조 피험자에게 투여한 후 측정된 신호와 비교하여 상기 환자의 질환 상태를 평가하고; 이때 대조 피험자의 것과 비교하여 테스트 피험자에게서 생성된 신호의 증가는 뇌 아밀로이드 플락의 증가와 관련되며; 그리고
    (c) 상기 환자를 환자의 질환 상태에 적합한 요법으로 치료한다.
  9. 청구항 5 내지 8중 임의의 한 방법에 있어서, 이때 상기 대조 피험자는 보통의 건강한 개체들, 중증도가 다양한 신경퇴행성 장애들을 가진 개체들, 또는 이의 조합인, 방법.
  10. 다음을 포함한, 뇌 아밀로이드 플락에 의해 특징화되는 신경퇴행성 질환에 있어서 치료될 환자에게서 질환 진행을 평가하는 방법:
    (a) BIIB037 항체와 동일한 형태학적 에피토프에 결합하는 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 상기 신경퇴행성 질환 치료를 요하는 환자에게 투여되며 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 측정가능한 신호를 만들어내는 물질로 라벨되며, 이때 상기 투여후 상기 환자에게서 신호가 측정되며 ;
    (b) (a) 투여 후 1회 또는 그 이상의 시간 간격에서 상기 라벨된 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여하고, 이때 상기 투여후 상기 환자에게서 신호가 측정되며 ;
    (c) (a) 투여 후 1회 또는 그 이상의 시간 간격에서 상기 환자에게서 측정된 신호의 변화에 근거하여 상기 환자에서 질환 진행이 평가되며; 이때 신호의 증가는 상기 환자의 신경퇴행성 질환의 진행을 의미한다.
  11. 다음을 포함한, 뇌 아밀로이드 플락에 의해 특징화되는 신경퇴행성 질환에 있어서 치료될 환자에게서 질환 진행을 평가하는 방법:
    (a) BIIB037 항체를 경쟁적으로 저해하는 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 신경퇴행성 질환 치료를 요하는 환자에게 투여하고, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 측정가능한 신호를 만들어내는 물질로 라벨되며, 이때 상기 투여후 상기 환자에게서 신호가 측정되며 ;
    (b) (a) 투여 후 1회 또는 그 이상의 시간 간격에서 상기 라벨된 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여하고, 이때 상기 투여후 상기 환자에게서 신호가 측정되며 ;
    (c) (a) 투여 후 1회 또는 그 이상의 시간 간격에서 상기 환자에게서 측정된 신호의 변화에 근거하여 상기 환자에서 질환 진행이 평가되며; 이때 신호의 증가는 상기 환자의 신경퇴행성 질환의 진행을 의미한다.
  12. 청구항 10 또는 11의 방법에 있어서, 질환 진행 수준에 근거하여 상기 환자 치료를 조정하는 것이 더 포함된, 방법.
  13. 청구항 6, 8, 9-10, 또는 12중 임의의 한 방법에 있어서, 이때 환자의 질환 상태에 적합한 요법은 BIIB037 항체와 동일한 형태학적 에피토프에 결합하는 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 신경퇴행성 질환 치료를 요하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  14. 청구항 6, 8, 9, 또는 11-12중 임의의 한 방법에 있어서, 이때 환자의 질환 상태에 적합한 요법은 BIIB037 항체를 경쟁적으로 저해하는 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 신경퇴행성 질환 치료를 요하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  15. 청구항 6 또는 8중 임의의 한 항에 있어서, 다음을 더 포함하는, 방법:
    (d) (a) 투여 후 1회 또는 그 이상의 시간 간격에서 상기 라벨된 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여하고, 이때 상기 투여후 상기 환자에게서 신호가 측정되며 ; 그리고
    (e) (a) 투여 후 1회 또는 그 이상의 시간 간격에서 상기 환자에게서 측정된 신호의 변화에 근거하여 상기 환자에서 질환 진행이 평가되며; 이때 신호의 증가는 상기 환자의 신경퇴행성 질환의 진행을 의미한다.
  16. 청구항 5 내지 15중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 물질은 하나 또는 그 이상의 방사능활성리간드(들)을 포함하는, 방법.
  17. 청구항 5 내지 16중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 리간드는 125I인, 방법.
  18. 청구항 5 내지 17중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 물질에 의해 생성된 신호는 단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영에 의해 측정되는, 방법.
  19. 청구항 1 내지 18중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 (VH)과 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하며, 그리고 이때 상기 VH는 서열 번호:3의 상보결정부위-1 (VHCDR1) 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  20. 청구항 1 내지 19중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH와 VL을 포함하고, 그리고 이때 상기 VH는 서열 번호:4의 상보결정부위-2 (VHCDR2) 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  21. 청구항 1 내지 20중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH와 VL을 포함하고, 그리고 이때 상기 VH는 서열 번호:5의 상보결정부위-3 (VHCDR3) 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  22. 청구항 1 내지 21중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH와 VL을 포함하고, 그리고 이때 상기 VL은 서열 번호:6의 상보결정부위-1 (VLCDR1) 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  23. 청구항 1 내지 22중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH와 VL을 포함하고, 그리고 이때 상기 VL은 서열 번호:7의 상보결정부위-2 (VLCDR2) 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  24. 청구항 1 내지 23중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편 VH와 VL, 그리고 이때 상기 VL은 서열 번호:8의 상보결정부위-3 (VLCDR3) 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  25. 청구항 1 내지 24중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH와 VL을 포함하고, 그리고 이때 상기 VH는 서열 번호: 3, 4, 5의 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  26. 청구항 1 내지 25중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH와 VL을 포함하고, 그리고 이때 상기 VL은 서열 번호: 6, 7, 8의 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  27. 청구항 1 내지 26중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH와 VL을 포함하고, 그리고 이때 상기 VH는 서열 번호: 3, 4, 5의 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열 번호: 6, 7, 8의 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  28. 청구항 1 내지 27중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH와 VL을 포함하고, 그리고 이때 상기 VH는 서열 번호: 1을 포함하고, 상기 VL은 서열 번호: 2를 포함하는 방법.
  29. 청구항 28에 있어서, 이때 상기 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 BIIB037 항체의 항원-결합 영역을 포함하는, 방법.
  30. 청구항 1 내지 29중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 선택적으로 Aβ 응집체에 결합하는, 방법.
  31. 청구항 1 내지 30중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 A베타 원섬유에 결합할 수 있지만, 그러나 A베타 모노머에는 실질적으로 결합하지 않는, 방법.
  32. 청구항 1 내지 31중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 뇌 아밀로이드 플락을 감소시키는데 효과적인 양으로 혈액-뇌 장벽을 통과할 수 있는, 방법.
  33. 청구항 1 내지 32중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 맥관 아밀로이드보다 더 큰 치화력으로 유조직 아밀로이드 플락에 결합하는, 방법.
  34. 청구항 1 내지 33중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 유조직 아밀로이드 플락 보다는 적은 수준으로 콩고필릭 아밀로이드 혈관병 병소에 축적되는, 방법.
  35. 청구항 1 내지 34중 임의의 한 항에 있어서, 이때 뇌에서 아밀로이드 플락의 감소는 Fc 수용체 참여와 관련된, 방법.
  36. 청구항 1 내지 35중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항-Aβ 항체 항원-결합 단편은 단일 쇄 Fv 단편 (scFv), F(ab') 단편, F(ab) 단편, 또는 F(ab')2 단편인, 방법.
  37. 청구항 1 내지 36중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간인, 방법.
  38. 청구항 1 내지 37중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항-Aβ 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 키메라인, 방법.
  39. 청구항 1-5, 또는 7중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 피험자는 신경퇴행성 질환을 가진, 방법.
  40. 청구항 6, 또는 8-39중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머 질환, 다운 증후군, 경도 인지 장애, 대뇌 아밀로이드 혈관병, 맥관 치매, 다발-경색 치매, 파킨슨 질환, 루이체(Lewy Bodies) 치매, 헝틴턴 질환, 크로이츠펠트-야곱 질환, 낭성섬유증, 또는 고오시에 질환으로 구성된 집단에서 선택된, 방법.
  41. 청구항 1 내지 26중 임의의 한 항에 있어서, 알츠하이머 질환의 질행을 치료 또는 방지하기 위하여; 알츠하이머 질환과 연합된 증상들을 개선시키기 위하여; 알츠하이머 질환의 존재에 대해 피험자를 진단 또는 선별하기 위하여또는 알츠하이머 질환 발병 위험을 피험자에게 측정하기 위한, 방법.
  42. 청구항 1 내지 41중 임의의 한 항에 있어서, 이때 투여는 말초 투여인, 방법.
  43. 청구항 1 내지 42중 임의의 한 항에 있어서, 이때 투여는 비경구 투여인, 방법.
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