KR20150127239A

KR20150127239A - 고온 스트레스에 대한 작물 식물의 내성을 증가시키고 고온 스트레스에 대한 증가된 내성을 갖는 작물 식물을 선별하는 방법

Info

Publication number: KR20150127239A
Application number: KR1020157028631A
Authority: KR
Inventors: 라메고우다 벤카테고우다; 앤디 페레이라
Original assignee: 더 보드 오브 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 아칸소
Priority date: 2013-03-13
Filing date: 2014-03-13
Publication date: 2015-11-16
Also published as: US20180320193A1; US9957520B2; US10801034B2; US20160032313A1; WO2014160152A1

Abstract

고온 스트레스에 대한 작물 식물의 내성을 증가시키는 방법 및 특히 최저 기온 상승 형태의 고온 스트레스 하에서 재배된 작물 식물의 곡물 수확량 및 품질을 개선시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 HYR의 발현이 증가된 식물을 선별하고,재배 계절 동안 25℃가 넘는 최저 기온을 경험할 것으로 예상되는 지역에서 이들 식물을 재배하는 것을 포함한다. 고온 스트레스에 대한 내성이 개선된 식물을 스크리닝하는 방법 및 최저 기온이 25℃ 이상인 지역에서 곡물을 생산하는 방법 또한 제공된다.

Description

고온 스트레스에 대한 작물 식물의 내성을 증가시키고 고온 스트레스에 대한 증가된 내성을 갖는 작물 식물을 선별하는 방법 {METHODS OF INCREASING RESISTANCE OF CROP PLANTS TO HEAT STRESS AND SELECTING CROP PLANTS WITH INCREASED RESISTANCE TO HEAT STRESS}

관련 출원에 대한 상호-참조

본 특허 출원은 2013년 3월 13일자로 제출된 미국 특허 가출원 번호 61/779,124의 우선권 이익을 주장하며, 해당 가출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

연방 지원 연구에 관한 진술

본 발명은 미국 농무성 지원기금 번호 2009-35900-05968 및 미국 국립 과학 재단 지원기금 번호 DBI-0922747로 수여된 미국 정부의 지원을 받아 이루어졌다. 미국은 본 발명에 대해 특정 권리를 가진다.

서열 목록

본 출원은 전자출원이며, .txt 형식으로 전자적으로 제출되는 서열 목록을 포함한다. .txt 파일은 2014년 3월 12일자로 생성되고 크기가 7.34 킬로바이트인 "2014-03-13 5658-00204_ST25.txt"라는 제목의 서열 목록을 담고 있다. 이 .txt 파일에 담긴 서열 목록은 명세서의 일부이며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

도입

본 발명은 식물에서 고온 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법 및 고온 스트레스에 대한 내성을 증가시키는데 관련된 추가의 서열을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

기온 상승은 3가지 성장 단계에 각기 다른 영향을 미쳐 벼의 수확량을 감소시키는 요인으로 인식되어 왔다: a) 영양생장 단계- 유수분화기의 확립 시; b) 생식생장 단계- 유수분화기에서 출수기까지; c) 등숙 단계- 출수기에서 곡물 성숙까지 (Welch 2010). 벼 수확량은 2가지 메커니즘을 통해 고온의 영향을 받을 수 있다: (i) 높은 최고 기온이 고습 상태와 결합하면 영화 불임 및 곡물 품질 저하를 유발할 수 있고, (ii) 야간 기온 상승은 동화산물 축적을 저하시킬 수 있다 (Wassman 등, 2009).

기후 변화는 식물에 스트레스를 유발할 수 있는 주간 및 야간 기온 상승을 유발하였다. 경작가능 지역에서 예상되는 기온 상승에 대응하는 데는 고온 스트레스에 대한 증가된 내성을 갖는 식물을 확인하는 수단과 양질의 곡물을 높은 수확량으로 재배 및 생산하는 능력이 필요하다.

고온 스트레스에 대한 작물 식물의 내성을 증가시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 대조군에 비해 서열 1, 3, 4, 그의 상동체, 또는 서열 1, 3, 또는 4에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 서열의 HYR 단백질의 증가된 발현에 대해 작물 식물을 선별하는 것을 포함한다. 상기 HYR 단백질의 발현 증가는 작물 식물의 고온 스트레스에 대한 증가된 내성과 상관관계를 가지며, 최저 기온이 25℃ 이상인 조건 또는 지역에서 작물 식물을 재배할 때 특히 상기 작물 식물의 곡물 품질 개선 또는 곡물 수확량 개선을 제공한다.

또 다른 측면에서, 고온 스트레스에 대한 작물 식물의 내성을 증가시킬 수 있는 작물 식물 단백질에 대한 스크리닝 방법이 제공된다. 먼저, HYR 단백질의 발현에 반응하여 발현이 증가되거나 감소되는 서열을 확인한다. 상기 HYR 단백질은 서열 1, 서열 3, 서열 4의 서열들, 이들 서열의 상동체, 또는 서열 1, 3 및 4 중 적어도 하나에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 서열로부터 선택된 폴리펩티드 서열을 갖는다. 다음으로, 상기 서열을 분석하여 식물 세포 또는 트랜스제닉 식물에서 고온 스트레스에 대한 내성에 상기 서열이 필수적인지를 판정한다. 고온 스트레스에 대한 내성에 필수적인 서열은 고온 스트레스에 대한 증가된 내성을 갖는 식물의 생성을 위한 유용한 표적이 될 수 있다.

추가 측면에서, HYR 단백질을 사용하여 식물의 고온 스트레스에 대한 내성을 조사하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 식물 세포에서 활성이고 대조군 식물에 비해 트랜스제닉 식물에서 HYR 단백질의 발현을 증가시킬 수 있는 프로모터 또는 전사 조절 서열에 작동가능하게 연결된 HYR 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 트랜스제닉 식물을 생성시키고, 상기 트랜스제닉 식물을 최저 야간 기온이 25℃ 이상인 고온 스트레스 조건에서 재배하는 것을 포함한다. 상기 트랜스제닉 식물은 작물 식물에서 최적의 고온 스트레스 반응에 필요한 다른 서열을 분석하고 확인하는데 사용할 수 있게 된다.

추가 측면에서, 최저 기온이 25℃ 이상인 지역에서 곡물을 생산하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 대조군 식물에 비해 HYR 단백질의 발현이 적어도 2배 증가된 작물 식물을 선별하고, 상기 작물 식물의 재배 계절 동안 최저 기온이 25℃ 이상일 것으로 예상되거나 그럴 위험이 있는 지역에 식재하는 것을 포함한다. 이들 식물은 식물당 또는 식재 면적당 기준으로 더 많은 곡물 수확량을 보일 것으로 예상되고 곡물의 품질이 우수하여 대조군 식물에 비해 심복백 (chalkiness)의 정도가 낮을 것으로 예상된다.

도 1은 벼 HYR 과발현 계통의 온도 스트레스 반응을 대조군과 비교하여 보여주는 그래프 세트이다. A) 수확량; B) 영화 불임률; 및 C) 종자 중량에 대한 온도 스트레스의 효과를 도시한다. 수잉기 초기의 식물을 생리적 성숙기까지 36/26℃의 높은 주간/야간 기온에 노출시키고 (온도 스트레스) 28/20℃의 상온 조건 하의 식물 (관수 양호)과 대비하였다. 수치는 평균 ± SE (n>6)이며, '*'는 t-검정에서 P≤ 0.05로 야생형과 유의한 차이가 있음을 표시한다.
도 2는 벼 품종 니폰베어(Nipponbare) 야생형과 HYR 계통에 대한 높은 야간 기온의 효과를 보여주는 사진이다. 사진은 수잉기에서부터 성숙기까지 높은 야간 온도의 영향을 보여주는 것이다. 야생형은 심복백을 보이는데, HYR 과발현 계통에서는 약 15-20% 감소되어 있다.

가뭄, 고온, 추위 및 염분과 같은 환경 스트레스는 식물의 생존과 성장에 영향을 미친다. 식물은 유전자 발현 및 생리적 반응의 변화를 통해 이러한 스트레스에 반응하여 스트레스를 견디거나 그에 적응할 수 있다. 전사 인자는 정상적인 생육 및 발달 뿐만 아니라 환경의 신호에 대한 반응을 조절한다. 가뭄, 추위, 및 고온과 같은 환경 스트레스를 겪는 식물은 전사 인자 및 식물의 반응을 협동적으로 조절할 수 있는 기타 조절 유전자의 발현을 변화시켜 신속하게 반응한다. 스트레스 반응성 전사 인자는 식물이 스트레스 요인에 적응하거나 견디는 것을 도울 수 있는 단계적 유전자 발현 사슬을 조절한다 (Qin et al., 2011). 따라서 전사 인자는 특정 스트레스 또는 여러 가지 스트레스에 대해 내성이 있는 식물을 얻기 위해 모델 및 작물 식물에서 과발현 연구에 이용되어 왔다.

상기한 바와 같이, 기온 상승은 3가지 성장 단계에 각기 다른 영향을 미쳐 벼의 수확량을 감소시키는 요인으로 인식되어 왔다: a) 영양생장 단계 - 유수분화기의 확립 시; b) 생식생장 단계 - 유수분화기에서 출수기까지; c) 등숙 단계 - 출수기에서 곡물 생리적 성숙기까지 (Welch 2010). 벼 수확량은 2가지 메커니즘을 통해 고온의 영향을 받을 수 있다: (i) 높은 최고 기온이 고습 상태와 결합하면 영화 불임 및 곡물 품질 저하를 유발할 수 있고, (ii) 야간 기온 상승은 동화산물 축적을 저하시킬 수 있다 (Wasseman et al., 2009).

기후 변화는 식물에 스트레스를 유발할 수 있는 주간 및 야간 기온 상승을 유발하였다. 이 효과를 계량하기 위해, IRRI에서 보유한 1979-2003 기간의 기온 데이터를 분석하였을 때 (Peng et al., 2004) 연간 평균 최고 기온 및 최저 기온이 각각 0.35 및 1.13℃만큼 상승하였으며, 벼 곡물 수확량과 평균 최저 (야간) 기온 사이의 밀접한 상관관계를 보였다. 최저 기온이 1℃ 상승할 때마다 곡물 수확량이10% 저하되었고, 최고 기온의 영향은 미미하였다. 더욱 최근, 집중관리한 벼논을 분석한 결과 (Welch et al., 2010) 기온이 벼 작물의 영양생장기와 등숙기 모두에 영향을 주며, 높은 최저 기온은 수확량을 감소시키고 높은 최고 기온은 수확량을 증가시키는 것으로 나타났다.

벼의 영양 생장 단계는 약 35/25℃ 주간/야간 체제까지 고온을 견딜 수 있으며, 이 임계 수준보다 높은 기온에서는 식물의 키, 분얼 수, 총 건조 중량 및 수확 잠재력이 저하된다 (Yoshida et al., 1981). 광합성은 출수기에서 중간 등숙기에 이르는 동안 온도가 상온보다 3.6℃ 및 7.0℃ 높은 경우 11.2% 및 35.6% 감소하는 것으로 나타났다 (Ohe et al., 2007). 광합성에 미치는 효과는 틸라코이드 조직화, 엽록체 내 그라나 적층 또는 엽록체 팽윤 능력에 영향을 미침으로 인한 것으로 나타났다 (Wahid et al., 2007). 고온은 광합성 기관의 막들 간의 결합을 느슨하게 만들어 지질층의 유동성이 증가하고 (Savchenko et al., 2002) 용질 누출이 증가하게 할 수 있다. 따라서 전해질 누출이나 세포 막의 열안정성을 작물의 내열성의 척도로 사용할 수 있다 (Prasad et al., 2006; Tripathy et al., 2000).

벼의 생식 생장기는 영양 생장기보다 열에 민감하며 (Yoshida et al., 1981), 개화기가 가장 민감한 과정이고 그 다음이 화분형성 과정이다. 35℃ 초과의 고온은 화분 활력을 감소시키고 영화 불임를 초래할 수 있다 (Matsui et al., 2000). 사분포자 형성 및 어린 소포자 형성 과정의 감수분열 단계는 미소포자형성 과정에서 고온에 대해서 (Yoshida et al., 1981), 뿐만 아니라 가뭄 (Sheoran and Saini, 1996) 및 저온 스트레스 (Imin et al., 2004)에도 가장 민감하다.

개화기 동안의 고온 스트레스는 비가역적 결과를 가져와서 이삭 건조 중량이 감소한다 (Ohe et al., 2007). 그러나, 벼 유전형은 계절 중 온도가 낮은 시기에 출수하거나, 이른 아침 온도가 낮은 시간에 개화하거나, 증산작용으로 냉각을 증진시킴으로써 개화기 동안의 고온을 피할 수 있다. 감열성 생리적 과정인 개열, 수분, 암술머리 상에서의 화분 발아, 화분관 신장 또는 수정 초기 사건은 모두 불임을 유발할 수 있다. 5-7일의 개화기 동안, 노출 지속 시간에 따라 영화 개화에 미치는 영향이 달라질 수 있다.

내열성 공여체를 위한 스크리닝에서는 내열성으로 드러난 특정 품종이 없었으며 (Prasad et al., 2006), Aus 품종 N22이 개화기에 고온에 내성을 보였다 (Jagadish et al., 2008). N22는 또한 가뭄에도 높은 내성을 지닌 것으로 밝혀졌는데, 반응성 산소 스캐빈지 효소 수준이 증가되어 가뭄상태에서 H₂O₂ 축적 수준이 더 낮았다.

벼 등숙기 중의 고온은 주로 곡물 수확량 및 품질에 영향을 주는데, 곡물 중량, 크기, 등숙도, 아밀로스 함량이 낮아지고 심복백이 있는 벼가 증가한다 (Osada et al., 1973; Yoshida et al., 1981, Yamakawa et al., 2007; Zhu et al., 2005). 이러한 현상은 고온 하에서 발육하는 종자의 호흡 요구량을 맞추기 위한 과도한 에너지 소비(Tanaka et al., 1995), 또는 단축된 등숙 기간에 따른 높은 곡물 건물 축적률 (Kobata and Uemuki, 2004)에 의해 유발될 수 있다. 그러나, 식물 밀도의 감소는 동화산물 생산을 증가시키는 것으로 나타났다 (Kobata and Uemuki, 2004). 고시히까리 (Koshihikari) 품종은 등숙 과정에서 곡물 건물 축적이 증가한 것으로 확인되었으며 고온에서 유백색 중심을 갖는 비율이 더 낮다 (Kobata and Uemuki, 2004). 이것은 재배 방식 또는 유전형의 차이에 의한 탄수화물 동화의 증가가 심복백 곡물의 형성과 곡물 중량 감소에 대해 보호 효과를 가질 수 있음을 지시한다.

HYR로 명명되는 벼 AP2/ERF 부류의 전사 인자는 벼에서 과발현시켰을 때 물 이용 효율, 광합성, 곡물 수확량 및 가뭄 내성을 개선시키는 것으로 나타난 바 있다 (Pereira et al. 국제 특허 공개 WO 2012/ 158594 A2, 이는 본원에 그 전문이 참조로 포함됨). HYR 단백질은 또한 고염도 및 저온에 대한 내성을 부여하는 것으로 밝혀졌으나 높은 최저 기온에 대한 내성을 증가시키는 것에 대한 HYR 단백질의 효과는 보고된 바 없다.

본 발명에서, 높은 야간/주간 기온 하에서 재배된 HYR 과발현 벼는 형질전환되지 않은 대조군 식물에 비해 높은 최저기온 하에서 현저히 높은 수확량을 보였다. 또한, 곡물의 심복백으로 판단한 곡물 품질에 있어서도 심복백을 보이는 곡물의 수와 곡물 당 심복백의 수준 2종 모두에 대해 형질전환되지 않은 대조군 식물에 비해 낮은 심복백 정도를 보여 현저히 높은 품질을 보였다. 높은 야간 기온에 반응하는 벼의 이러한 특성, 수확량 및 곡물 품질 개선은 벼 작물 생산을 위해 가치있는 것이며 기후 변화와 관련된 온도 상승에 따라 중요성이 더 커진다.

이에, 본 명세서에서는 고온 스트레스에 대한 작물 식물의 내성을 증가시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 서열 1, 3, 4, 그의 상동체, 또는 서열 1, 3, 또는 4에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 동일성을 갖는 서열의 HYR 단백질의 증가된 발현에 대해 작물 식물을 선별하는 것을 포함한다. 서열 1, 3, 및 4는 벼 및 수수 유래의 3종 HYR 단백질의 아미노산 서열이다. HYR은 다양한 종의 식물에 동족체 또는 상동체가 존재하는 전사 인자이다. 본 명세서에 있어서 용어 동족체는 동일하거나 유사한 기능을 가지나 한 종 내에서 별개로 진화되어 온 2종의 핵산 서열을 가리킨다. 본 명세서에 있어서 용어상동체는 동일하거나 유사한 기능을 공유하며 동일한 조상 유전자로부터 종의 분화를 통해 진화해 온 것으로 보이는 서로 다른 종에서 얻어진 2종의 핵산을 가리킨다.

본 명세서에서 설명하는 방법에서, HYR 단백질의 발현 증가는 작물 식물의 고온 스트레스에 대한 내성 증가, 특히 최저 또는 야간 기온 상승에 대한 내성 증가, 및 곡물 품질 개선 (심복백 감소) 또는 식물당 또는 면적당 곡물 수확량 개선과 상관관계를 보인다. 발현 증가는 식물의 세포 내, 특히 식물의 광합성 세포 내 HYR mRNA 증가 또는 HYR 단백질 발현 증가로 측정할 수 있다. 발현 증가는 니폰베어와 같은 대조 식물을 두고 상대적으로 평가한다. 대조 식물은 고온 스트레스에 대한 내성을 위해, 그리고 특히 최저 기온이 25℃를 초과하는 지역에서 생장하고 곡물을 생산하는 능력을 위해 선별되거나 유전적으로 변형되지 않은 식물이다. HYR 단백질의 발현 수준은 일반적으로 대조 식물에서의 HYR 단백질 발현에 비해 2배 이상 더 높다. 적합하게는, 상기 발현이 니폰베어와 같은 대조 식물에 비해 2 내지 20배, 적합하게는 2 내지 10배, 또는 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배 또는 그 초과만큼 증가된다.

고온 스트레스에 대한 내성은 작물 식물이 높은 최저 및 최고 주간/야간 기온에 대해, 특히 높아진 최저 기온에 대해 증가된 내성을 보인다는 것을 나타낸다. 고온 스트레스에 대한 내성은 작물 식물이 고온 스트레스 조건 하에서 생육될 때 곡물 수확량의 감소가 없는 것으로 입증할 수 있다. 고온 스트레스 조건의 예로는 작물 식물이 최저 야간 기온이 25℃ 이상, 적합하게는 26℃ 이상, 또는 심지어 27℃인 야간 기온에 노출되는 조건에서 식물을 생육시키는 것을 들 수 있다. 주간 기온이 상기한 바와 같은 경우는 일반적으로 최저 또는 야간 기온 상승과 동일한 부정적 영향을 끼치지 않는다. 특히, 작물 식물은 식물의 생육 주기 중 생식 생장기와 등숙기 동안에 고온 스트레스에 의한 영향을 가장 크게 받는다. 벼의 경우, 최저 기온 상승과 고온 스트레스는 식물이 수잉기에서부터 생리적 성숙기에 이르는 사이에 상승된 온도에 노출될 때 곡물 수확량과 품질에 가장 현격한 영향을 미친다.

곡물 수확량은 총수확량/면적 또는 식물당 수확량으로 측정할 수 있다. 실시예에서 보이는 바와 같이, HYR 단백질 발현이 증가된 식물에서 식물당 곡물 수확량은 고온 스트레스 조건에서 재배했을 때 대조군에서 4g/식물인 데 비해 5g/식물을 초과할 수 있다. 적합하게는, 상기 곡물 수확량은 고온 스트레스의 수준, 스트레스 시기 및 노출기간의 길이에 따라 5g/식물 초과, 6g/식물 초과, 7g/식물 초과, 또는 심지어 그 초과일 수 있다. 고온 스트레스에 대한 내성은 또한 본 명세서에서 정의된 고온 스트레스에 대한 노출 후에도 곡물 품질이 유지되는 것으로 입증할 수도 있다. 곡물은 고온에 노출된 후에는 크기가 작거나 곡물 심복백이 증가할 수 있다. HYR 단백질의 과발현은 작물 식물의 곡물 품질이 저하되는 것을 막아줄 수 있다. 실시예에서 보이는 바와 같이, 곡물은 심복백이 되는 경향이 더 낮았고 심복백이 있는 곡물도 HYR 단백질을 과발현하지 않는 대조군 식물의 곡물보다 심복백이 덜 하였다. 실시예에서, 벼의 경우 고온 스트레스 하에서 재배했을 때 야생형 식물에 비해 HYR 트랜스제닉 식물에서 심복백이 15-20% 더 낮았다. 적합하게는, 고온 스트레스 하에서 재배했을 때 식물의 곡물 심복백가 7%, 8%, 9%, 10% 11%, 12%, 14%, 15%, 16%, 18%, 또는 심지어 20% 감소할 정도로 곡물 품질이 개선된다. 곡물 심복백의 감소는 고온 스트레스의 수준, 그러한 스트레스에 대한 노출의 지속기간 및 시기에 따라 달라질 것이다.

HYR 단백질을 사용하는 방법도 제공된다. 상기 방법은 서열 1, 서열 3, 서열 4, 또는 서열 1, 3 및 4 중 적어도 하나에 대해 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 이들 서열의 상동체인 HYR 단백질을 과발현하도록 유전자조작된 트랜스제닉 식물을 생성시키는 것을 포함한다. 상기 트랜스제닉 식물은, 식물 세포에서 활성이고 해당 식물 세포에서 원래의 단백질 발현에 비해 상기 HYR 단백질의 발현을 증가시킬 수 있는 프로모터 또는 전사 조절 서열에 작동가능하게 연결된 HYR 단백질을 포함한다. 다음으로 상기 트랜스제닉 식물을 재배 계절의 적어도 일부 동안 고온 스트레스 또는 25℃ 초과, 적합하게는 26℃ 이상의 최저 야간 기온을 겪게 될 것으로 예상되는 조건 또는 지역에서 재배한다. 상기 트랜스제닉 식물은 대조군 비트랜스제닉 식물에 비해 고온 스트레스를 겪는 지역에서 곡물 수확량이 더 양호할 것으로 기대될 것이다.

실시예에 기재된 HYR 유전자를 발현하는 벼 계통은 온도 내성 및 곡물 품질이라는 식물 표현형에 관련된 유전자 및 단백질 발현에 변화가 있는 것이다. HYR 단백질 전사 인자에 의해 발현이 조절되는 유전자 중 일부는 따라서 이들 개선된 특성을 가져오는 것이다. 이들 유전자 중 일부가 상이한 대립형질을 가진 일부 변종 및 품종의 고온 내성이라는 특성을 가져오는 것이라고 예상된다. HYR에 의해 조절되고 내열성을 부여하는 유전자의 확인은 벼 및 기타 작물 식물의 고온 내성 및 곡물 품질을 개선시키기 위한 분자 표식을 제공할 것이다.

따라서, 고온 스트레스에 대한 작물 식물의 내성을 증가시킬 수 있는 작물 식물 단백질에 대한 스크리닝 방법이 본 명세서에서 제공된다. 먼저, HYR 단백질의 발현에 반응하여 발현이 증가되거나 감소되는 서열을 확인한다. 상기 HYR 단백질은 서열 1, 서열 3, 서열 4, 이들 서열의 상동체, 또는 서열 1, 3 및 4 중 적어도 하나에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 서열로부터 선택된 폴리펩티드 서열을 갖는다. 다음으로, 상기 서열을 분석하여 식물 세포 또는 트랜스제닉 식물에서 고온 스트레스에 대한 내성에 상기 서열이 필수적인지를 판정한다. 고온 스트레스에 대한 내성에 필수적인 서열은 고온 스트레스에 대한 증가된 내성을 갖는 식물의 생성을 위한 유용한 표적이 될 수 있다.

상기 서열의 발현은 마이크로어레이 분석, rtPCR, 실시간 정량적 rtPCR, 노던 블롯 분석, RNA-서열결정, 웨스턴 블롯 분석, 또는 RNA 또는 단백질 발현 수준에서 상기 서열의 발현을 평가할 수 있는 임의의 다른 수단을 비제한적으로 포함하는 통상의 기술자가 사용할 수 있는 임의의 수단을 사용하여 평가할 수 있다. 그런 다음 작물 식물에서 고온 스트레스에 대한 내성을 매개하는데 관련된 핵심 서열은 HYR 단백질의 과발현에 반응하는 상기 서열의 발현을 HYR이 상기 식물 세포에 의해 발현되지 않거나 과발현되지 않을 때의 상기 서열의 발현과 비교함으로써 확인할 수 있다.

HYR 단백질의 발현 변동에 의해 발현에 영향을 받는 서열은 고온 스트레스에 대한 내성을 매개하는 서열의 후보이다. 고온 스트레스에 대한 작물 식물의 내성을 증가시키는 개별적 또는 단체적 능력에 대해 이들 후보 서열을 분석할 수 있다. 통상의 기술자라면 영향을 받은 서열의 발현을 조작하여 작물 식물 또는 작물 식물 세포에서 고온 스트레스에 대한 내성에 관련된 하나 이상의 표현형을 바꾸는 해당 서열의 능력을 조사할 수 있는 식물 세포 또는 트랜스제닉 식물에서 이 단계를 수행할 수 있다는 것을 충분히 이해할 것이다.

영향을 받은 서열의 발현은 트랜스제닉, 또는 서열의 과발현을 매개하는 다른 재조합 기술, 또는 녹-아웃(knock-out) 또는 녹-다운(knock-down) (즉 miRNA 기법)을 비제한적으로 포함하는 통상의 기술자가 사용할 수 있는 다양한 기술을 사용하여 식물, 식물 부분 또는 식물 세포에서 변경시켜 감소된 발현의 결과를 시험할 수 있다. 그러면 HYR 발현을 증가시킬 수 없는 세포에서 상승된 온도에 대한 노출 후 바이오매스, 엽록체, 광합성, 뿌리, 광 강도에 대한 반응 중 적어도 하나의 증가, 또는 종자 중량 증가, 종자 수확량 증가, 또는 심복백 부재를 비제한적으로 포함하는 고온 스트레스와 연관된 하나 이상의 표현형에 이들 영향을 받은 서열의 달라진 발현이 미치는 영향을 평가할 수 있다.

최저 기온이 25℃ 이상인 지역에서 곡물을 생산하는 방법도 제공된다. 대조군 식물에 비해 상기한 바와 같은 HYR 단백질의 발현이 적어도 2배 또는 그 초과만큼 증가된 작물 식물을 선별하고 재배 계절 동안 최저 기온이 25℃ 이상일 것으로 예상되거나 그럴 위험이 있는 지역에 식재한다. 상기 방법은 곡물 수확량을 감소시키기 쉬운 온도가 될 위험이 있는 지역에서 양호한 작물 수확량을 보장한다. 상기 작물 식물은 HYR 단백질에 대해 트랜스제닉임로써 증가된 발현을 보일 수도 있고, 교잡과 같은 전통적인 육종을 통해 얻어질 수도 있다. 재배 계절 동안의 최저 기온은 수잉기에서부터 생리적 성숙기까지 노출될 수도 있고 이 기간의 일부 동안만 노출될 수도 있다. 기온은 최저 기온이 26℃ 이상일 수 있다.

본 명세서에 개시된 HYR 서열은 벼, 수수, 애기장대, 카놀라, 콩, 보리, 해바라기, 아마, 밀 또는 옥수수를 비제한적으로 포함하는 식물체로부터 얻어진 것이다. 따라서 상기 작물 식물은 제아(Zea), 오리자 (Oryza), 트리티쿰(Triticum), 솔라눔(Solanum), 호르데움(Hordeum), 브라시카(Brassica), 글리신(Glycine), 파세올루스(Phaseolus), 아베나(Avena), 소르굼(Sorghum), 사카룸(Saccharum), 고시피움(Gossypium), 포풀루스(Populus), 퀘르쿠스(Quercus), 살릭스(Salix), 미스칸투스(Miscanthus) 및 파니쿰(Panicum) 중 적어도 하나로부터 선택될 수 있다.

식물체는 전체 식물체, 뿌리, 잎, 줄기, 종자, 꼬투리, 꽃, 세포, 조직 또는 식물 생식질또는 그의 자손과 같은 식물의 일부를 포함하지만 그에 한정되지 않는 식물의 임의의 부분을 포함한다. 식물은 또한 트랜스제닉 식물 및 유전자 조작되지 않은 식물을 포함한다. 생식질은 한 개체 또는 개체군, 또는 계통, 품종, 변종 또는 재배군에서 유래한 클론에서 얻어진 유전 물질을 가리킨다. 벼 식물체는 전체 벼 식물체, 또는 식물 세포, 식물 원형질, 식물 종자, 식물 조직 배양 세포 또는 유합조직을 비제한적으로 포함하는 그의 일부분을 말한다. 식물 세포는 식물체의 임의의 부분에서 수거되거나 유래한 세포, 또는 식물 조직 배양 세포 또는 유합조직을 말한다. 식물체 부분은 줄기, 뿌리, 배주, 수술, 잎, 배아, 수술주변 부위, 유합 조직, 배우체, 포자체, 화분, 미소포자 등을 비제한적으로 포함한다.

HYR 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 국제 특허 공개 WO2012/158594에 기재된 것과 같은 통상적인 재조합 기술을 사용하여 식물 세포 내로 형질도입되고 발현될 수 있다. 상기 핵산은 식물 세포에서 기능하는 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 상기 프로모터는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 특이적 프로모터 또는 발달 조절형 프로모터일 수 있다. 실시예에서는, HYR의 발현을 구동시키는데 구성적 프로모터인 CaMV35S를 사용하였다.

HYR 단백질의 발현은 통상의 기술자가 사용할 수 있는 다수의 방법에 의해 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 재조합 DNA 기술을 사용하여, 예컨대 강한 프로모터를 사용하여 HYR 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현 증가를 추진함으로써 발현을 증가시킬 수 있다. 다른 방법으로는, HYR 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 사본 수를 식물체 내 또는 식물체 세포 내에 증가시킬 수 있다. 다른 방법으로는, HYR 단백질이 이미 더 높은 수준으로 발현되고 있는 식물체를 확인함으로써 HYR 단백질의 발현을 증가시킬 수 있다. 그 다음 이러한 식물체를, HYR 단백질의 발현이 증가된 교잡물을 생성시키는 등으로 전통적인 육종에 사용할 수 있다. HYR 단백질의 발현을 증가시키는 다른 메커니즘은 전사 활성화 인자의 발현을 증가시키는 것, 전사 억제 인자의 발현을 감소시키는 것, HYR 단백질의 발혐을 증가시킬 수 있는 인핸서 영역을 부가하는 것, mRNA 안정성을 증가시키는 것, 관련 유전자 부근에서 DNA 메틸화 변경, 히스톤 아세틸화 또는 기타 후성적 또는 염색질 수식, 또는 단백질 또는 폴리펩티드 안정성을 증가시키는 것을 비제한적으로 포함한다.

HYR 단백질의 발현 증가를 통한 고온 스트레스에 대한 내성 증가와 같은 관심 특성을 지닌 식물 품종을 발생시키는 비-트랜스제닉 수단은 통상의 기술자가 사용할 수 있는 것들이며, 전통적인 육종 외에도, 화학 약품 유발 염색체 배수화 및 다배수체의 인공적 구조에 이은 염색체 소실, DNA 복구 메커니즘의 녹-아웃 또는 염색체 파단의 발생에 의한 재조합 또는 유전자 중복 가능성의 증가와 같은 염색체 이상을 발생시키는 화학적 또는 기타 수단을 포함한다. HYR 폴리뉴클레오티드 또는 단백질의 발현 또는 사본 수를 비-트랜스제닉적으로 증가시키는 다른 수단에는 다음과 같은 것들이 포함된다: HYR 발현에 영향을 주는 miRNA 또는 기타 소형 RNA, 또는 기타 유전자 요소를 코딩하는 식물 DNA의 돌연변이를 스크리닝; 고온 스트레스에 대한 내성, 상기한 바와 같은 사본 수 또는 기타 유전자 또는 단백질 발현 특성을 표적으로 한 식물 스크리닝에 의해 HYR 유전자의 사본 수 또는 서열에 자발적 변이가 있는 대량의 재배지 또는 육종 개체군 스크리닝; 상이하거나 동일한 HYR 유전자를 함유하면서 그 어느 한 쪽에 뚜렷한 다형성을 가진 계통을 교배시킨 다음 HYR 유전자에 이웃한 2종의 뚜렷한 유전형으로부터 얻어지는 분자 표지를 사용하여 재조합체를 선별하는 것; 화학적 또는 방사능 돌연변이 유발 또는 염색체 불안정 또는 유전자 발현 변화를 초래하는 식물 조직 배양/재생에 이어 고온 스트레스에 대한 내성이 있는 개체를 얻기 위한 식물의 스크리닝; 또는 게놈 불안정성을 조장하거나 증가시키는 비-트랜스제닉 좌위의 전통적 유전자 교배에 의한 도입에 이어 고온 스트레스 내성에 대해 식물의 스크리닝. 게놈 불안정성을 조장하는데 사용할 수 있는 좌위의 예에는 활성 트랜스포존 (자연적 또는 인공적으로 다른 종에서 도입), 내인성 트랜스포존을 활성화시키는 좌위 (예컨대 애기장대에서 met1으로의 균등 돌연변이 또는 옥수수에서 mop1과 같이 DNA 메틸화 또는 소형 RNA 프로세싱에 영향을 주는 돌연변이), 효모의 Sgs1 헬리카제 또는 대장균의 RecQ에 상동체이거나 기능상 유사한 것들과 같이 DNA 복구에 영향을 주거나 원칙에 어긋나는 재조합을 억제하는 식물 유전자의 돌연변이, 또는 원칙에 어긋나는 재조합을 매개하는 효모의 RAD50 또는 RAD52와 같은 유전자의 과발현이 포함된다. 통상의 기술자는 트랜스제닉 또는 비-트랜스제닉 수단을 통해 HYR 단백질의 발현을 증가시키는 또 다른 트랜스제닉 및 비-트랜스제닉 방법을 찾을 수 있을 것이다.

본 개시내용은 본 명세서에 나열된 구조, 성분 배열, 또는 방법 단계의 구체적 세부사항으로 한정되지 않는다. 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법은 이하의 개시내용에 비추어 통상의 기술자에게 자명해질 다양한 방식으로 제조, 실시, 사용, 수행 및/또는 형성될 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 및 기술방식은 설명을 위한 것일 뿐, 특허청구범위의 범위를 제한하는 것으로 보아서는 안 된다. 발명의 상세한 설명과 특허청구범위에서 다양한 구조 및 방법 단계를 가리키는데 사용된 제1, 제2 및 제3과 같은 서수 지시어는, 어떤 특정한 구조 또는 단계, 또는 그러한 구조 또는 단계의 어떤 특정한 순서 또는 구성을 지시하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 명세서에 기재된 모든 방법은 본 명세서에 그와 달리 지시되거나 맥락상 명백히 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행할 수 있다. 본 명세서에 제시된 모든 예 또는 예시적 표현 (예, "와 같은")의 사용은 개시를 돕기 위한 것일 뿐, 특허청구범위에 다르게 기재되지 않는 한 개시내용의 범위에 대한 제한을 내포하지 않는다. 명세서 중의 어떤 표현도, 그리고 도면에 보인 어떤 구조도 특허청구범위에 기재되지 않은 어떤 요소가 개시된 사항의 실시에 필수적임을 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 명세서에서 용어 "포함하는" 또는 "갖는" 및 이들의 각종 변형을 사용하는 것은 그 앞에 나열된 구성요소들과 그의 균등물 뿐만 아니라 추가의 구성요소까지도 포괄하기 위한 것이다. 어떤 구성요소들을 "포함하는" 또는 "갖는" 것으로 언급된 실시양태는 해당 구성요소들로 "실질적으로 구성되는" 경우와 "구성되는" 경우 역시 상정한 것이다. 단수 명사로 표시된 용어는 특정하여 기재된 경우가 아니라면 단수 뿐만 아니라 복수도 뜻할 수 있다.

본 명세서에서 수치 범위의 언급은 본 명세서에 달리 지시되지 않는 한 해당 범위에 들어오는 별개의 수치 각각을 개별적으로 언급하는 단순화한 방법으로 쓰인 것일 뿐이며, 별개의 수치 각각은 본 명세서에 개별적으로 언급된 것처럼 명세서에 포함된다. 예컨대, 농도 범위가 1% 내지 50%로 제시되면, 2% 내지 40%, 10% 내지 30%, 또는 1% 내지 3% 등과 같은 수치가 본 명세서에 명시적으로 기재된 것으로 보아야 한다. 상기 수치는 구체적으로 의도된 바의 예에 불과하며, 기재된 최저 수치와 최고 수치를 포함하여 그 사이의 수치로 가능한 모든 조합이 본 개시내용에 명시적으로 언급된 것으로 보아야 한다. 특정한 언급된 수량 또는 수량 범위를 서술하는데 용어 "약"을 사용하는 것은 언급된 수량에 아주 근접한 수치, 예컨대 제조상의 허용오차, 측정 과정의 기기 및 인간 오차 등으로 인한 것으로 설명할 수 있거나 설명하는 것이 마땅한 수치가 해당 수량에 포함된다는 것을 나타내고자 함이다. 수량을 가리키는 백분율은 모두 달리 지시되지 않는 한 중량 기준이다.

하기 실시예는 예시를 위한 것일 뿐이며, 본 발명 또는 첨부된 특허청구범위의 범위에 대한 제한을 의미하지 않는다. 본 명세서에 인용된 모든 참고문헌, 즉 특허, 특허공개 및 비특허 문헌 등은 그 전체를 본 명세서에 포함시키는 것으로 한다. 참고문헌의 기재 내용과 본 명세서의 기재 내용이 상충되는 경우에는 본 명세서의 기재 내용을 우선으로 해야 한다.

실시예

온실에서 재배하고 생육실에서 온도 스트레스에 대한 반응을 시험하는 복제 실험에서 CaMV35S 프로모터의 조절 하에 HYR 유전자를 과발현하는 벼 유전형을 형질전환되지 않은 니폰베어 대조 식물과 비교하였다. HYR 트랜스제닉 식물의 개발에 대한 설명은 국제 공개 번호 WO2012/158594를 참조한다. 주목할 것은, 상기 식물은 상기 국제 공개에서 증가된 가뭄 내성, 염분 및 저온 스트레스에 대한 내성을 가진 것으로 설명되어 있다. 상승된 최저 기온에 대한 내성은 알려지지 않았다. 감광기의 주간/야간 사이클은 생육실과 온실 모두 14 h/10 h였다.

영양생장기의 고온 스트레스를 위해서는, 50일령 HYR 계통과 니폰베어 대조군 식물 한 조를 10일간 주간/야간 기온을 34/24℃로 설정한 환경 통제 생육실 (콘바이론 (Conviron) 모델 PGW36) 내로 옮겼다. canopy 위 60 cm에서 측정한 광 강도는 600 μmol/m2/s였고, 상대 습도는 70%였다. 생식생장기 동안에는 수잉기 초기의 식물을 36/26℃의 주간/야간 고온 스트레스에 20일 동안 노출시켰다.

영양생장기와 생식생장기 모두에서 비스트레스 조건을 위해서는, HYR 계통과 니폰베어 대조군 식물 또 하나의 조를 주간/야간 기온이 26/22℃인 온실에 유지하였다. 온실 내에서 측정한 광 강도는 800 μmol/m2/s였으며 상대습도는 70%였다.

고온 처리 하의 2종의 독립적인 HYR 계통의 복제 시험을 분석한 결과 형질전환되지 않은 야생형 니폰베어에 비해 HYR 계통이 총 곡물 수확량에서 ~50%의 현저한 증가를 보이는 것으로 나타났다 (도 1A). 그러나 수확량 구성요소인 임실률과 100 종자 중량은 고온 하에서 야생형에 비해 HYR 계통에서 지속적으로 더 높지는 않았다 (도 1B/C).

심복백으로 판단한 곡물 품질의 추가 분석 (도 2)에서는 온도 스트레스 하의 HYR 계통이 더 작은 수의 심복백 곡물과 더 낮은 백분율의 곡물 심복백을 보이는 것으로 나타났다. 따라서, 고온 스트레스에 대한 노출 후 대조군 계통에 비해 HYR 계통에서 곡물 수확량과 곡물 품질 모두 개선되었다.

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Claims

니폰베어(Nipponbare) 품종에서의 HYR 단백질 발현과 비교하여 서열 1, 3, 4, 그의 상동체, 또는 서열 1, 3, 또는 4에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 서열의 HYR 단백질의 증가된 발현에 대해 작물 식물을 선별하고, 상기 작물 식물을 평균 최저 기온이 25℃보다 높을 위험이 있는 지역에서 재배하는 것을 포함하며, 여기서 HYR 단백질의 발현 증가는 작물 식물의 고온 스트레스에 대한 내성 및 곡물 품질 개선 또는 곡물 수확량 증가와 상관관계를 갖는 것인, 고온 스트레스에 대한 작물 식물의 내성을 증가시켜 작물 식물의 곡물 품질 또는 곡물 수확량을 개선시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 작물 식물이 HYR 단백질을 과발현하도록 유전자조작된 트랜스제닉 식물인 방법.
제2항에 있어서, 상기 트랜스제닉 식물이 HYR 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하며 상기 폴리뉴클레오티드가 상기 식물의 세포에서 기능하는 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 방법.
제3항에 있어서, 상기 프로모터가 구성적 프로모터, 유도성 프로모터 조직 특이적 프로모터 또는 발달 조절형 프로모터인 방법.
제1항에 있어서, 작물 식물이 유전적으로 변형되지 않은 식물인 방법.
제5항에 있어서, 작물 식물이 HYR 단백질의 발현이 증가되어 있는 계통을 교잡함으로써 선별된 교잡물인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, HYR 단백질의 발현이 니폰베어에서의 HYR 단백질 발현에 비해 2배 이상 증가되는 것인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 선별된 작물 식물이 25℃ 이상의 최저 기온에 내성이 있는 것인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 곡물 수확량이 HYR 단백질의 발현이 증가하지 않은 작물 식물과 비교하여 개선되는 것인 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 작물 식물이 오리자(Oryza) 종인 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작물 식물이 제아(Zea), 트리티쿰(Triticum), 솔라눔(Solanum), 호르데움(Hordeum), 브라시카(Brassica), 글리신(Glycine), 파세올루스(Phaseolus), 아베나(Avena), 소르굼(Sorghum), 사카룸(Saccharum), 고시피움(Gossypium), 포풀루스(Populus), 퀘르쿠스(Quercus), 살릭스(Salix), 미스칸투스(Miscanthus) 및 파니쿰(Panicum) 종 중 적어도 하나로부터 선택되는 것인 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 고온 스트레스에 대한 내성이 작물 식물이 개화기에서 생리적 성숙기에 이르기까지 26℃ 이상의 야간 기온에 노출될 때 수확량의 증가에 의해 나타나는 것인 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 곡물 수확량이 5 g/식물 이상인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 곡물 품질이 종자 중량 또는 종자의 심복백, 또는 이들 둘 다에 의해 측정되는 것인 방법.
제14항에 있어서, 작물 식물이 수잉기에서부터 생리적 성숙기에 이르기까지 25℃ 이상의 야간 기온에 노출될 때 종자 품질이 손상되지 않는 것인 방법.
식물 세포에서 활성이고 대조군 식물에 비해 트랜스제닉 식물에서 HYR 단백질의 발현을 증가시킬 수 있는 프로모터 또는 전사 조절 서열에 작동가능하게 연결된, 서열 1, 서열 3, 서열 4, 이들 서열의 상동체 또는 서열 1, 3, 및 4 중 적어도 하나에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 서열의 HYR 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 트랜스제닉 식물을 생성시키고, 상기 트랜스제닉 식물을 최저 야간 기온이 26℃ 이상인 고온 스트레스 조건에서 재배하는 것을 포함하는, HYR 단백질의 사용 방법.
서열 1, 서열 3, 서열 4, 이들 서열의 상동체 또는 서열 1, 3, 및 4 중 적어도 하나에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 서열을 갖는 HYR 단백질의 발현에 반응하여 발현이 증가되거나 감소되는 서열을 확인하고; 상기 서열이 고온 스트레스에 대한 내성에 필수적인지를 분석하는 것을 포함하는, 고온 스트레스에 대한 작물 식물의 내성을 증가시킬 수 있는 작물 식물 단백질에 대한 스크리닝 방법.
제17항에 있어서, 서열이 마이크로어레이, RNA-서열결정 또는 정량적 역전사효소 PCR로부터 임의로 선택되는 유전자 발현 변화를 검정하는 방법을 사용하여 확인되는 것인 방법.
제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 서열이, HYR 단백질의 과발현에 반응하는 상기 서열의 발현을 HYR이 발현되지 않거나 과발현되지 않을 때의 상기 서열의 발현과 비교함으로써 확인되는 것인 방법.
제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 작물 식물의 세포에서 수행되는 것인 방법.
제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작물 식물이 제아, 오리자, 트리티쿰, 솔라눔, 호르데움, 브라시카, 글리신, 파세올루스, 아베나, 소르굼, 사카룸, 고시피움, 포풀루스, 퀘르쿠스, 살릭스, 미스칸투스 및 파니쿰 종 중 적어도 하나로부터 선택된 것인 방법.
제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석 단계가 식물 세포에서 HYR 발현에 반응하여 상향조절되는 서열을 과발현시키거나 또는 HYR 발현에 반응하여 하향조절되는 서열을 녹-아웃시키고, 고온 스트레스에 반응하는 상기 식물 세포내 하나 이상의 표현형을 분석하는 것을 포함하는 것인 방법.
제22항에 있어서, 상기 식물 세포가 트랜스제닉 식물 또는 식물 부분 내에 있는 것인 방법.
제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 표현형이 바이오매스, 엽록체, 광합성, 뿌리 생산, 및 광 강도에 대한 반응 중 적어도 하나의 증가로부터 선택되는 것인 방법.
서열 1, 서열 3, 서열 4, 이들 서열의 상동체 또는 서열 1, 3, 및 4 중 적어도 하나에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 HYR 단백질의 발현이 대조군 식물에 비해 두 배 이상 증가된 작물 식물을 선별하고; 식물의 재배 계절 동안 최저 기온이 25℃ 이상일 것으로 예상되거나 그럴 위험이 있는 지역에 상기 작물 식물을 식재하는 것을 포함하는, 최저 기온이 25℃ 이상인 지역에서 곡물을 생산하는 방법.
제25항에 있어서, 상기 식물이 HYR 단백질의 발현이 증가된 교잡종 또는 트랜스제닉 식물인 방법.
제26항에 있어서, 상기 작물 식물이 제아, 오리자, 트리티쿰, 솔라눔, 호르데움, 브라시카, 글리신, 파세올루스, 아베나, 소르굼, 사카룸, 고시피움, 포풀루스, 퀘르쿠스, 살릭스, 미스칸투스 및 파니쿰 종 중 적어도 하나로부터 선택된 것인 방법.
제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지역에서 수잉기에서부터 생리적 성숙기까지의 재배 계절 동안 최저 기온이 26℃ 이상일 위험이 있는 것인 방법.