KR20150126739A - 세포 오스몰농도를 조절하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

세포 오스몰농도를 조절하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20150126739A
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래티시아 멀펫츠
앤드류 스노든
인 에이치. 육
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본 발명은 세포 내에서, 예를 들어, 생물반응기 내의 배양된 세포를 비롯한 배양된 세포 내에서 세포내 오스몰농도 (osmolarity)를 조절하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 적어도 하나의 삼투-반응성 전사 조절 요소 (OR-TRE)를 포함하는 핵산, 및 삼투-반응성 전사 조절 요소 (OR-TRE)를 함유하는 세포, 벡터, 제조품, 인공 장기 또는 임플란트 등을 제공한다.

Description

세포 오스몰농도를 조절하기 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR REGULATING CELL OSMOLARITY}
관련 출원에 대한 교차 참조
본원은 그 전문이 본원에 참조로 포함되는, 2008년 9월 15일 출원된 미국 특허 가출원 61/097,149을 기초로 한 우선권을 주장한다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 분자 및 세포 생물학, 세포 배양 시스템 및 생물반응기, 및 세포 배양액 내에서 폴리펩티드와 같은 생성물의 재조합 생산에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 세포 내에서, 예를 들어 생물반응기에서 배양된 세포를 비롯한 배양된 세포 내에서 세포내 오스몰농도 (osmolarity)를 조절하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
포유동물 세포를 배양하는 생물반응기는 재조합 단백질 약물, 예를 들어 성장 인자, 혈전용해제, 인터페론, 인터류킨, 에리트로포이에틴, 콜로니 자극 인자 및 다양한 다른 시토킨, 및 항체를 제조하기 위해 사용된다. 그러나, 생물반응기 내에서, 배양액의 오스몰랄농도 (osmolality)는 pH를 조절하기 위한 염기 첨가, 및 배양액에 필요한 에너지를 공급하기 위한 영양분 및 보충물의 급식의 결과로 증가한다. 일반적으로, 유가식 (fed-batch) 생물반응기 가동 내내, 오스몰랄농도는 약 300 밀리오스몰/kg (mOsm)에서 때때로 600 mOsm만큼 높은 값으로 증가한다. 300 mOsm 세포 배양액에 비해, 일정 범위의 오스몰랄농도 (340 mOsm 초과 및 400 내지 450 mOsm을 포함한 역치 미만) 내에서, 포유동물 세포의 특이적 생산성은 증가한 한편, 세포 성장 속도는 감소하고 세포 사멸 속도는 영향을 받지 않는 것으로 나타났다. 대부분의 세포주에 대해, 그를 초과할 때 오스몰랄농도에 따라 세포 사멸 속도가 극적으로 증가하는 오스몰랄농도 역치가 존재하는 것으로 보인다 (종종 역치는 400 내지 450 mOsm을 포함하는 것으로 보인다).
생물반응기 내에서, 증가된 오스몰랄농도는 증가된 긴장성 (tonicity) (증가된 NaCl)과 상호관련된다. 고 NaCl은 전사 인자 긴장성-반응성 인핸서-/삼투 반응 요소-결합 단백질 (TonEBP/OREBP, 여기서 TonE는 "긴장성 인핸서" 또는 "삼투 반응 요소"로도 불린다)를 활성화하고, 이는 TonE를 활성화하여 그의 프로모터가 그의 동족 (cognate) 결합 부위: 인핸서 ORE/TonE에 의해 제어되는 몇몇 보호 유전자의 전사를 증가시킨다.
TonEBP/OREBP 전사 활성의 조절은 복잡하다. 고장성에서 30분 내에, TonEBP/OREBP는 인산화되고 핵 내로 전위된다. 수시간 후에, TonEBP/OREBP mRNA 및 단백질 풍부도 (abundance)는 증가한다. 또한, 고장성은 그의 전사활성화 (transactivating) 도메인의 인산화와 연관된, TonEBP/OREBP의 전사활성화 활성을 증가시킨다. 보다 느리게, 고장성은 그의 mRNA 및 단백질 합성의 유도를 통해 TonEBP/OREBP 풍부도를 증가시킨다.
발명의 개요
본 발명은 (a) 전사 조절 서열에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 TonEBP-반응성 또는 NFATc-반응성 전사 인핸서를 포함하는 적어도 하나의 삼투-반응성 전사 조절 요소 (ORTRE); (b) (a)의 핵산 분자 (여기서, 전사 조절 서열은 진핵 세포 내에서 전사 활성이거나, 전사 조절 서열은 진핵 세포로부터 유래된다); (c) (a) 또는 (b)의 핵산 분자 (여기서, 전사 조절 서열은 척추동물, 포유동물, 인간, 곤충, 식물, 효모 또는 진균 세포, 또는 바이러스 내에서 전사 활성이거나, 전사 조절 서열은 척추동물, 포유동물, 인간, 곤충, 식물, 효모 또는 진균 세포 또는 바이러스로부터 유래되거나, 전사 조절 서열은 합성 서열이다); 또는 (d) (a)의 핵산 분자 (여기서, 전사 조절 서열은 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다)를 포함하는, 단리된, 합성 또는 재조합 핵산 분자를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 TonEBP-반응성 또는 NFATc 반응성 전사 인핸서 분자 (서열)는 센스 또는 안티센스 배향으로 프로모터의 5'에 위치하거나; 적어도 하나의 TonEBP-반응성 또는 NFATc 반응성 전사 인핸서 서열은 센스 또는 안티센스 배향으로 프로모터의 3'에 위치하거나; 적어도 하나의 TonEBP-반응성 또는 NFATc-반응성 전사 인핸서 서열은 센스 또는 안티센스 배향으로 프로모터의 5'에 위치하고, 제2, 제3 및/또는 추가의 TonEBP-반응성 또는 NFATc 반응성 전사 인핸서 서열은 센스 또는 안티센스 배향으로 프로모터의 3'에 위치한다.
또 다른 실시양태에서, OR-TRE는 TonEBP 반응성 또는 NFATc-반응성 전사 인핸서 서열에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 활성화인자 단백질-1 (AP-1)-반응성 전사 인핸서를 추가로 포함한다. 활성화인자 단백질-1 (AP-1)-반응성 전사 인핸서는 센스 또는 안티센스 배향으로 OR-TRE의 5'에 위치할 수 있거나; 활성화인자 단백질-1 (AP-1)-반응성 전사 인핸서는 센스 또는 안티센스 배향으로 OR-TRE의 3'에 위치할 수 있거나; 활성화인자 단백질-1 (AP-1)-반응성 전사 인핸서는 센스 또는 안티센스 배향으로 OR-TRE의 5'에 위치할 수 있고, 제2, 제3 및/또는 추가의 활성화인자 단백질-1 (AP-1)-반응성 전사 인핸서는 센스 또는 안티센스 배향으로 OR-TRE의 3'에 위치한다.
다른 측면에서, 활성화인자 단백질-1 (AP-1)-반응성 전사 인핸서는 센스 또는 안티센스 배향으로 프로모터의 5'에 위치하거나; 활성화인자 단백질-1 (AP-1)-반응성 전사 인핸서는 센스 또는 안티센스 배향으로 프로모터의 3'에 위치하거나; 활성화인자 단백질-1 (AP-1) 반응성 전사 인핸서는 센스 또는 안티센스 배향으로 프로모터의 5'에 위치하고, 제2 활성화인자 단백질-1 (AP-1)-반응성 전사 인핸서는 센스 또는 안티센스 배향으로 프로모터의 3'에 위치한다.
한 실시양태에서, 적어도 하나의 TonEBP-반응성 또는 NFATc-반응성 전사 인핸서 및/또는 적어도 하나의 활성화인자 단백질-1 (AP-1)-반응성 전사 인핸서는 진핵 (예를 들어, 척추동물, 포유동물, 인간, 곤충, 효모 또는 진균), 원핵, 식물, 바이러스 및/또는 합성 핵산 분자 서열을 갖거나 (포함하거나) 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 TonEBP-반응성 전사 인핸서는
Figure pat00001
(여기서, N은 임의의 핵산 잔기일 수 있다)의 핵산 서열을 포함하고/하거나; 적어도 하나의 NFATc-반응성 전사 인핸서는
Figure pat00002
, 또는
Figure pat00003
(여기서, N은 임의의 핵산 잔기일 수 있다)의 핵산 서열을 포함하고/하거나; 적어도 하나의 활성화인자 단백질-1 (AP-1)-반응성 전사 인핸서는
Figure pat00004
의 핵산 서열을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 TonEBP-반응성 전사 인핸서는
Figure pat00005
의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/하거나; 적어도 하나의 NFATc-반응성 전사 인핸서는
Figure pat00006
의 핵산 서열을 포함하고/하거나; 적어도 하나의 활성화인자 단백질-1 (AP-1)-반응성 전사 인핸서는
Figure pat00007
의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, OR-TRE는
Figure pat00008
, 또는
서열 7의 잔기 2 내지 12 (
Figure pat00009
에 상응함), 또는
Figure pat00010
(여기서, 서열 7 및 서열 8 내의 TonE 및 AP1 결합 부위는 굵은 글씨체로 표기한다)의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 삼투-반응성 구축물에서 사용된 TonEBP-반응성 전사 인핸서 요소 (서열)는 아미노산 잔기 모티프 RAHYETEG (서열 9)를 포함하는 단백질에 특이적으로 결합하는 핵산을 포함한다.
한 실시양태에서, 적어도 하나의 TonEBP-반응성 전사 인핸서는 적어도 하나의 활성화인자 단백질-1 (AP-1)-반응성 전사 인핸서의 5'에 위치하거나, 적어도 하나의 활성화인자 단백질-1 (AP-1)-반응성 전사 인핸서 서열은 적어도 하나의 TonEBP-반응성 전사 인핸서의 5'에 위치한다.
또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 TonEBP-반응성 전사 인핸서 서열은 적어도 하나의 활성화인자 단백질-1 (AP-1)-반응성 전사 인핸서의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400 또는 500개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 잔기 내에 위치한다.
또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 TonEBP-반응성 전사 인핸서는 프로모터의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400 또는 500개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 잔기 내에 위치한다.
또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 활성화인자 단백질-1 (AP-1)-반응성 전사 인핸서 서열은 프로모터의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400 또는 500개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 내에 위치한다.
또 다른 실시양태에서, 프로모터는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 합성 프로모터, 포유동물 프로모터, 세균 프로모터, 식물 프로모터, 효모 프로모터, 진균 프로모터, 바이러스 프로모터, 또는 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터이다.
또 다른 실시양태에서, OR-TRE는 하나 내지 열 (1 내지 10)개 또는 그 초과의 TonEBP-반응성 전사 인핸서를 포함하고/하거나 OR-TRE는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 또는 그 초과의 활성화인자 단백질-1 (AP-1)-반응성 전사 인핸서를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 핵산 분자는 세포, 예를 들어, 진핵 세포 내에서 전사 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 추가의 핵산 분자 (서열)를 추가로 포함한다. 추가의 핵산 분자(들) (서열들)은 하나 이상의 단백질-코딩 핵산 분자, 또는 하나 이상의 조절 핵산 (억제, 안정화 또는 상향조절 기능 또는 효과를 갖는 핵산)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조절 핵산은 하나 이상의 센스 또는 안티센스 핵산 분자 (서열)일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 추가의 핵산 분자는 (a) 단백질-코딩 핵산 분자; (b) 조절 핵산 분자; 또는 (c) (b)의 핵산 분자를 포함하고, 여기서, 조절 핵산 분자는 억제, 안정화 또는 상향-조절 핵산 분자, 또는 센스 또는 안티센스 서열이다.
또 다른 실시양태에서, 추가의 핵산 분자는 삼투-보호 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 핵산 분자 (서열)를 포함하거나; 추가의 핵산 분자는 항-세포자멸성 단백질; 세포에 산화 스트레스에 대한 저항성을 부여하는 단백질; 단백질 폴딩 (folding)의 용이화에 관련되는 샤페론 (chaperone) 단백질; 단백질의 세포외 분비에 관련되는 단백질; 해당 효소; 세포 주기 조절 단백질; 글리코실화 효소, 또는 그의 임의의 조합을 코딩하는 핵산 분자 (서열)를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 조절 핵산, 예를 들어 억제성 핵산 분자는 센스 서열, 안티센스 서열, 리보자임, 짧은 간섭 RNA (siRNA), 또는 마이크로RNA (miRNA)를 포함한다. 추가의 핵산 분자는 NFATc 또는 TonEBP 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있다.
본 발명은 (a) 핵산에 작동가능하게 연결된 본 발명의 적어도 하나의 OR-TRE (여기서, OR-TRE는 핵산의 전사를 조절 또는 유도한다); (b) (a)의 핵산 분자 (여기서, 전사된 핵산은 폴리펩티드-코딩 핵산 분자를 코딩한다 (포함한다)); (c) (b)의 핵산 분자 (여기서, 전사된 핵산은 (i) 삼투-보호 단백질 또는 펩티드, 또는 증가하는 오스몰랄농도의 환경에서 세포를 보호하거나, 고오스몰랄농도 (hyperosmolality) 또는 증가하는 고오스몰랄농도의 조건 하에 세포를 보호하는 단백질; (ii) 항-세포자멸성 단백질; (iii) 세포에 산화 스트레스에 대한 저항성을 부여하는 단백질; (iv) 단백질 폴딩의 용이화에 관련되는 샤페론 단백질; (v) 단백질의 세포외 분비에 관련되는 단백질; (vi) 해당 효소; (vii) 세포 주기 조절 단백질; (viii) 글리코실화 효소; 또는 (ix) (i) 내지 (viii)의 임의의 조합을 코딩한다); (d) (a)의 핵산 분자 (여기서, 전사된 핵산은 조절 핵산, 예를 들어, 억제, 안정화 또는 상향-조절 핵산 분자, 또는 센스 또는 안티센스 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다); (e) (d)의 핵산 분자 (여기서, 조절 핵산, 예를 들어, 억제, 안정화 또는 상향-조절 핵산 분자는 센스, 안티센스 서열, 리보자임, 짧은 간섭 RNA (siRNA), 또는 마이크로RNA (miRNA)를 포함한다); (f) (b)의 폴리펩티드-코딩 핵산 분자 (여기서, 전사된 핵산은 NFATc 폴리펩티드, AP-1 폴리펩티드, TonEBP 폴리펩티드, 칼시뉴린 폴리펩티드, 또는 그의 조합물을 코딩한다)를 포함하는, 단리된, 합성 또는 재조합 삼투-반응성 핵산 분자를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 삼투-보호 단백질 또는 펩티드는 프롤린 또는 글리신-베타인, 타우린 수송체 (transporter), 글리신 베타인-γ-아미노부티르산 수송체, 나트륨-미오 (myo)-이노시톨 공동수송체, 열 쇼크 단백질, 아쿠아포린, 또는 알도스 리덕타제이다. 항-세포자멸성 단백질은 Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, BHRF1, X-IAP, IAP1, IAP2, IEX-1L, Bfl-1 또는 Bcl-w일 수 있다. 세포에 산화 스트레스에 대한 저항성을 부여하는 단백질은 수퍼옥시드 디스뮤타제, 카탈라제, 글루타티온 퍼옥시다제, 퍼옥시레독신, 술피레독신, 티오레독신, 티오레독신 리덕타제, 티오레독신 퍼옥시다제, 티올트랜스퍼라제, 글루타레독신 또는 글루타티온 리덕타제일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 단백질 폴딩의 용이화에 관련되는 샤페론 단백질은 결합 면역글로불린 단백질 (BiP), 칼넥신, 칼레티쿨린, ERp57 또는 단백질 디술피드 이소머라제 (PDI)이다.
해당 효소는 피루베이트 카르복실라제 또는 피루베이트 키나제일 수 있다. 세포 주기 조절 단백질은 시클린 또는 시클린-의존성 키나제, 또는 시클린 또는 시클린-의존성 키나제의 억제제일 수 있다.
본 발명은 표적화 핵산 분자를 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 삼투-반응성 전사 조절 요소를 포함하는, 단리된, 합성 또는 재조합 핵산 분자를 제공한다. 표적화 핵산 분자는 유즙분비 (lactogenic) 유전자 또는 유즙분비 메시지 (message) 또는 유즙분비 단백질의 발현을 감소시키기 위해, 유즙분비 유전자 또는 유즙분비 메시지 또는 유즙분비 단백질을 표적화하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 유즙분비 유전자는 락테이트 데히드로게나제일 수 있다. 유즙분비 유전자 또는 유즙분비 유전자 메시지를 표적화하는 핵산 분자를 포함하는 핵산은 짧은 간섭 RNA (siRNA), 마이크로RNA (miRNA), 안티센스 RNA 및/또는 리보자임 활성을 갖는 RNA를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 적어도 하나의 삼투-반응성 전사 조절 요소는 본 발명의 삼투-반응성 전사 조절 요소 (OR-TRE)를 포함한다.
한 측면에서, 삼투-반응성 핵산 분자는 5' 비번역 영역, 3' 비번역 영역, 또는 5' 비번역 영역 및 3' 비번역 영역 둘 다를 포함하는 전사체 (메시지)를 코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함한다. 한 측면에서, 삼투-반응성 핵산 분자는 한 실시양태에서 5' 비번역 영역 내에 위치할 수 있거나, 3' 비번역 영역 내에 위치할 수 있거나, 둘 다일 수 있는 적어도 하나의 전사 또는 번역 조절 서열을 추가로 포함한다.
본 발명은 (a) 본 발명의 핵산 분자, (b) 본 발명의 핵산, 및/또는 (c) 본 발명의 삼투-반응성 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 벡터는 발현 카세트, 재조합 바이러스, 플라스미드, 파지, 파지미드, 인공 염색체 또는 클로닝 벡터이거나; 벡터는 박테리오파지 P1-유래된 벡터, 세균 인공 염색체, 효모 인공 염색체, 또는 포유동물 인공 염색체이거나; 벡터는 염색체외 에피좀이다. 한 측면에서, 벡터는 통합 (integrating) 벡터이다.
본 발명은 (a) 본 발명의 핵산, (b) 본 발명의 핵산, 및/또는 (c) 본 발명의 삼투-반응성 핵산; 또는 (d) 본 발명의 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포, 인간 세포, 마우스 세포, 곤충 세포, 진균 세포, 세균 세포, 식물 세포, 불멸 세포, 또는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이다. 세포 내의 벡터는 염색체외 에피좀일 수 있거나, 벡터는 세포의 게놈 내로 안정하게 통합될 수 있다. 본 발명의 핵산은 에피좀성, 일시 발현 구축물, 또는 게놈에 통합된 발현 구축물일 수 있고, 이는 별법으로 안정한 게놈 삽입물일 수 있다.
본 발명은 본 발명의 세포를 포함하는 생물반응기, 배양 접시, 페트리 접시, 시험관, 회전병 등을 제공한다.
본 발명은 삼투-보호 단백질 또는 펩티드 또는 삼투-보호 조절 핵산 분자를 발현시키는 것을 포함하는, 증가하는 오스몰랄농도의 환경에서 또는 고오스몰랄농도 또는 증가하는 고오스몰랄농도의 조건 하에 세포를 보호하는, 또는 세포 내에서 오스몰랄농도 또는 오스몰농도를 유지하는 방법을 제공하고, 여기서 상기 방법은 (a) 본 발명의 핵산 분자 및/또는 본 발명의 삼투-반응성 핵산 분자, 또는 본 발명의 벡터를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하고 (여기서; 폴리뉴클레오티드는 삼투-보호 단백질 또는 펩티드를 코딩하거나, 그 자체가 삼투-보호 핵산 분자이다); (b) 삼투-보호 단백질 또는 펩티드 또는 삼투-보호 조절 핵산이 발현되어, 증가하는 오스몰랄농도의 환경에서 또는 고오스몰랄농도 또는 증가하는 고오스몰랄농도의 조건 하에 세포를 보호하도록 세포를 배양하는 것을 포함한다.
상기 방법의 다른 측면에서, 삼투-보호 단백질 또는 펩티드는 (i) 증가하는 오스몰랄농도의 환경에서 세포를 보호하는 (예를 들어, 고오스몰랄농도 또는 증가하는 고오스몰랄농도의 조건 하에 세포를 보호하는) 단백질; (ii) 항-세포자멸성 단백질; (iii) 세포에 산화 스트레스에 대한 저항성을 부여하는 단백질; (iv) 단백질 폴딩의 용이화에 관련되는 샤페론 단백질; (v) 단백질의 세포외 분비에 관련되는 단백질; (vi) 해당 효소; (vii) 세포 주기 조절 단백질; (viii) 글리코실화 효소; 또는 (ix) (i) 내지 (viii)의 임의의 조합을 포함한다.
본 발명은 (a) 재조합 단백질을 코딩하는 이종성 또는 재조합 핵산 분자를 제공하고; (b) 세포 내로 본 발명의 핵산 및/또는 본 발명의 삼투-반응성 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 안정적으로 또는 일시적으로 삽입하고 (여기서, 핵산 분자는 삼투-보호 단백질 또는 펩티드 또는 삼투-보호 조절 핵산을 코딩한다); 및 (c) 세포를 (b)의 삼투-보호 단백질 또는 펩티드 또는 삼투-보호 조절 핵산 및 (a)의 재조합 단백질이 발현되어, 세포 내에서 재조합 단백질의 생산을 증가시키거나 생산을 조절하는, 또는 세포 내에서 고오스몰랄농도의 조건 하에 정확하게 폴딩된 단백질 또는 정확하게 글리코실화된 단백질의 생산을 증가시키거나 생산을 조절하는 조건 하에 배양하는 것을 포함하는, 세포 (배양된 세포, 예를 들어, 생물반응기 내의 세포 포함) 내에서 재조합 단백질의 생산을 증가시키거나 생산을 조절하는, 또는 세포 (배양된 세포, 예를 들어, 생물반응기 내의 세포 포함) 내에서 고오스몰랄농도의 조건 하에 정확하게 폴딩된 단백질 또는 정확하게 글리코실화된 단백질의 생산을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 (a) 본 발명의 세포를 포함하는 생물반응기, 임플란트 또는 인공 장기를 제공하고 (여기서, 세포는 본 발명의 핵산 및/또는 본 발명의 삼투 반응 핵산 분자, 또는 본 발명의 벡터를 포함하고; 핵산 분자 또는 벡터는 삼투-보호 단백질 또는 펩티드를 코딩한다); (b) 세포를 삼투-보호 단백질 또는 펩티드 또는 삼투-보호 조절 핵산, 및 재조합 단백질이 발현되는 조건 하에 배양하는, 또는 생물반응기, 임플란트 또는 인공 장기를 세포에 의한 삼투-보호 단백질 또는 펩티드 또는 삼투-보호 조절 핵산, 및 재조합 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에 놓는 것을 포함하는, 세포 내에서 재조합 단백질의 생산을 증가시키거나 생산을 조절하는, 또는 세포 내에서, 생물반응기, 임플란트 또는 인공 장기 내에서 고오스몰랄농도의 조건 하에 정확하게 폴딩된 단백질 또는 정확하게 글리코실화된 단백질의 생산을 증가시키거나 생산을 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명은 세포에 본 발명의 핵산 및/또는 본 발명의 삼투-반응성 핵산 분자, 또는 본 발명의 벡터를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것을 포함하는 (여기서, 핵산 분자 또는 벡터는 삼투-보호 단백질 또는 펩티드 또는 삼투보호 조절 핵산을 코딩한다), 삼투 스트레스 또는 삼투 쇼크에 대한 세포의 적응성 또는 저항성을 추가 또는 향상시키는 방법을 제공한다. 다른 측면에서, 본원에서 사용될 때, 삼투 스트레스는 배양 시스템, 세포 등의 오스몰랄농도 (스트레스)의 점차적인 변화를 포함하는 것에 비해 삼투 쇼크는 배양 시스템, 세포 등의 오스몰랄농도 (스트레스)의 급성 변화 (쇼크)를 포함한다는 점에서, 삼투 스트레스는 삼투 쇼크와 상이하다.
상기 방법의 다른 측면에서, 방법은 고장성 삼투 스트레스 또는 고장성 삼투 쇼크에 대한 세포의 적응성 또는 저항성을 부가 또는 향상시키거나, 방법은 저장성 삼투 스트레스 또는 저장성 삼투 쇼크에 대한 세포의 적응성 또는 저항성을 부가 또는 향상시킨다.
본 발명은 (a) 재조합 단백질을 코딩하는 이종성 또는 재조합 핵산 분자를 제공하고; (b) 세포 내로 본 발명의 핵산 및/또는 본 발명의 삼투-반응성 핵산 분자, 또는 본 발명의 벡터를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 안정적으로 또는 일시적으로 삽입하고 (여기서, 핵산 분자 또는 벡터는 삼투-보호 단백질 또는 펩티드를 코딩한다); (c) 세포를 (b)의 삼투-보호 단백질 또는 펩티드 또는 핵산, 및 (a)의 재조합 단백질이 발현되는 조건 하에 배양하는 것을 포함하는, 세포 내에서 재조합 단백질의 생산을 증가시키거나 생산을 조절하는, 또는 세포 내에서 고오스몰랄농도의 조건 하에 정확하게 폴딩된 단백질 또는 정확하게 글리코실화된 단백질의 생산을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 (a) 재조합 단백질을 코딩하는 이종성 또는 재조합 핵산 분자를 포함하는 세포를 제공하고; (b) 세포 내로 본 발명의 핵산 및/또는 본 발명의 삼투-반응성 핵산 분자 또는 본 발명의 벡터를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 안정적으로 또는 일시적으로 삽입하고 (여기서, 핵산 분자는 삼투-보호 단백질 또는 펩티드 또는 삼투-보호 핵산 분자를 코딩한다); (c) 세포를 임플란트 또는 인공 장기 내에 삽입하고, 임플란트 또는 인공 장기를, 세포 내에서 삼투-보호 단백질 또는 펩티드 또는 삼투-보호 핵산 분자, 및 재조합 단백질의 발현을 허용하여, 임플란트 또는 인공 장기 내에서 재조합 단백질의 생산을 증가시키거나 생산을 조절하는 조건으로 유지하는 것을 포함하는, 임플란트 또는 인공 장기 내에서 재조합 단백질의 생산을 증가시키거나 생산을 조절하는, 또는 임플란트 또는 인공 장기 내에서 고오스몰랄농도의 조건 하에 정확하게 폴딩된 단백질 또는 정확하게 글리코실화된 단백질의 생산을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 (a) 생체분자를 생산할 수 있는 세포 내로 본 발명의 핵산 및/또는 본 발명의 삼투-반응성 핵산 분자, 또는 본 발명의 벡터를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 안정적으로 또는 일시적으로 삽입하거나 (여기서, 핵산 분자는 삼투-보호 단백질 또는 펩티드 또는 삼투-보호 핵산 분자를 코딩한다); (b) (a)의 방법 (여기서, 생체분자는 소분자, 폴리펩티드 및/또는 핵산이다); 또는 (c) (a) 또는 (b)의 방법 (여기서, 방법은 고수율의 적절하게 폴딩된 또는 바람직하게 폴딩된 (예를 들어, 야생형 폴딩, 야생형-패턴 폴딩) 또는 글리코실화된 폴리펩티드를 생성시킨다)을 포함하는, 치밀 또는 후기 세포 생산 시스템 내에서 생체분자의 효율적인 생산 방법, 또는 치밀 또는 후기 세포 생산 시스템 내에서 고수율의 총 생체분자 또는 고수율의 번역 후 프로세싱된 단백질을 얻는 방법을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 세포, 본 발명의 벡터, 및/또는 본 발명의 삼투-반응성 핵산 분자를 포함하는 인공 장기 또는 임플란트를 제공한다. 본 발명은 본 발명의 세포, 본 발명의 벡터, 및/또는 본 발명의 삼투-반응성 핵산 분자를 포함하는 제조품을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 세포, 본 발명의 핵산 분자, 본 발명의 벡터, 및/또는 본 발명의 삼투반응성 핵산 분자를 포함하는 키트를 제공한다. 한 측면에서, 키트는 본 발명의 방법을 실시하기 위한 지시서를 추가로 포함한다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명은 전사 조절인자에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 TonEBP-반응성 전사 인핸서 또는 NFATc-반응성 전사 인핸서, 및 상기 TonEBP-반응성 전사 인핸서 또는 NFATc-반응성 전사 인핸서에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 활성화인자 단백질 (AP-1)-반응성 전사 인핸서를 포함하는 적어도 하나의 삼투-반응성 전사 조절 요소 (OR-TRE)를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 전사 조절인자는 예를 들어 프로모터, 인핸서 또는 그의 조합물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 TonEBP-반응성 전사 인핸서 또는 NFATc-반응성 전사 인핸서는 프로모터의 5'에 위치하고, 제2 TonEBP-반응성 전사 인핸서 또는 NFAT-반응성 전사 인핸서는 프로모터의 3'에 위치한다. 일부 실시양태에서, 제1 활성화인자 단백질-1 (AP-1)-반응성 전사 인핸서는 OR-TRE의 5'에 위치하고, 제2 활성화인자 단백질-1 (AP-1)-반응성 전사 인핸서는 OR-TRE의 3'에 위치한다. 일부 실시양태에서, 활성화인자 단백질-1 (AP-1)-반응성 전사 인핸서는 전사 조절인자의 5'에 위치하고, 전사 조절인자는 프로모터이다. 다른 실시양태에서, 활성화인자 단백질-1 (AP-1)-반응성 전사 인핸서는 프로모터인 전사 조절인자의 3'에 위치한다. 또 다른 실시양태에서, 제1 활성화인자 단백질-1 (AP-1)-반응성 전사 인핸서는 전사 조절인자의 5'에 위치하고, 제2 활성화인자 단백질-1 (AP-1) 반응성 전사 인핸서는 전사 조절인자의 3'에 위치하고, 여기서 제1 전사 조절인자 및 제2 전사 조절인자는 모두 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 (a) 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 TonEBP-반응성 전사 인핸서; 또는 (b) 서열 2 또는 서열 4의 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 NFATc-반응성 전사 인핸서; 또는 (c) 서열 3의 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 활성화인자 단백질-1 (AP-1)-반응성 전사 인핸서 (여기서, N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있음)를 함유한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 OR-TRE는 서열 7, 서열 8, 또는 서열 9의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 핵산 분자는 전사 조절인자에 작동가능하게 연결된 추가의 핵산 분자를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 전사 조절인자는 진핵 세포 내에서 전사 활성인 프로모터이다. 추가의 핵산 분자는 단백질-코딩 핵산 분자 (예를 들어, 관심있는 단백질을 코딩하는) 또는 조절 핵산 분자 (예를 들어, 억제성 분자, 안정화 분자, 상향-조절 핵산 분자, 또는 안티센스 분자를 생산하는 것)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제성 핵산 분자는 안티센스 서열, 리보자임, 짧은 간섭 RNA (siRNA), 또는 마이크로RNA (miRNA)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가의 핵산 분자는 예를 들어 프롤린 또는 글리신-베타인, 타우린 수송체, 글리신 베타인-γ-아미노부티르산 수송체, 나트륨-미오-이노시톨 공동수송체, 열 쇼크 단백질, 아쿠아포린, 알도스 리덕타제, 또는 신경병증 표적 에스테라제 (NTE)와 같은 삼투-보호 단백질 또는 펩티드를 코딩한다. 다른 실시양태에서, 추가의 핵산 분자는 세포에서 발현되는 단백질에 유익한 특성을 부여하는 단백질 또는 펩티드를 코딩한다. 유익한 특성을 부여하는 단백질은 예를 들어, 항-세포자멸성 단백질 (예를 들어, Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, BHRF1, X-IAP, IAP1, IAP2, IEX-1L, Bfl-1 또는 Bcl-w); 세포에 산화 스트레스에 대한 저항성을 부여하는 단백질 (예를 들어, 수퍼옥시드 디스뮤타제, 카탈라제, 글루타티온 퍼옥시다제, 퍼옥시레독신, 술피레독신, 티오레독신, 티오레독신 리덕타제, 티오레독신 퍼옥시다제, 티올트랜스퍼라제, 글루타레독신 또는 글루타티온 리덕타제); 단백질 폴딩의 용이화에 관련되는 샤페론 단백질 (예를 들어, 결합 면연글로불린 단백질 (BiP), 칼넥신, 칼레티쿨린, ERp57 또는 단백질 디술피드 이소머라제 (PDI)); 단백질의 세포외 분비에 관련되는 단백질; 해당 효소 (예를 들어, 피루베이트 카르복실라제 또는 피루베이트 키나제); 세포 주기 조절 단백질 (예를 들어, 시클린 또는 시클린-의존성 키나제, 또는 시클린 또는 시클린-의존성 키나제의 억제제); 글리코실화 효소, 또는 그의 임의의 조합물일 수 있다. 다른 실시양태에서, 추가의 핵산 분자는 NFATc 또는 TonEBP 폴리펩티드를 코딩한다.
일부 실시양태에서, OR-TRE는 유즙분비 유전자 (예를 들어, 락테이트 데히드로게나제), 유즙분비 메시지 또는 유즙분비 단백질의 발현을 감소시키기 위해, 예를 들어 유즙분비 유전자, 유즙분비 메시지 또는 유즙분비 단백질을 표적화하기 위한 핵산 분자와 같은 적어도 하나의 표적화 핵산 분자에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 유즙분비 유전자 또는 유즙분비 메시지를 표적화하는 이들 핵산 분자는 짧은 간섭 RNA (siRNA), 마이크로RNA (miRNA), 안티센스 RNA 및/또는 리보자임 활성을 갖는 RNA를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터, 및 상기 벡터를 함유하는 숙주 세포를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 (i) 전사 조절인자에 작동가능하게 연결된 세포 내에서 발현된 단백질에 유익한 특성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 추가의 핵산 분자 (여기서, 상기 전사 조절인자는 진핵 세포 내에서 전사 활성인 프로모터이다), 및 (ii) 세포 내에서 발현시킬 관심있는 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함하고, 여기서 (i)의 핵산 분자의 발현은 (ii)의 핵산 분자에 의해 코딩된 폴리펩티드에 상기 유익한 특성을 부여한다.
상기 실시양태에서, (i)의 분자는 항-세포자멸성 단백질; 세포에 산화 스트레스에 대한 저항성을 부여하는 단백질; 단백질 폴딩의 용이화에 관련되는 샤페론 단백질; 단백질의 세포외 분비에 관련되는 단백질; 해당 효소; 세포 주기 조절 단백질; 글리코실화 효소, 또는 그의 임의의 조합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 코딩한다.
본 발명은 또한
(a) (i) 삼투-보호 단백질 또는 펩티드 또는 조절 핵산 분자를 코딩하는 핵산 분자 및 (ii) 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2의 관심있는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하고;
(b) 삼투-보호 단백질 또는 펩티드, 또는 삼투-보호 조절 핵산 및 관심있는 단백질이 발현되어, 고오스몰랄농도의 조건 하에 세포를 보호하고 제2의 관심있는 단백질의 발현을 허용하도록 세포를 배양하는 것을 포함하는, 고오스몰랄농도의 조건 하에 세포를 보호하는 방법을 제공한다.
이들 실시양태에서, 삼투-보호 단백질 또는 펩티드는 예를 들어, 프롤린 또는 글리신-베타인, 타우린 수송체, 글리신 베타인-γ-아미노부티르산 수송체, 나트륨-미오-이노시톨 공동수송체, 열 쇼크 단백질, 아쿠아포린, 알도스 리덕타제, 또는 신경병증 표적 에스테라제 (NTE)일 수 있다.
본 발명은 또한
(a) (i) 발현된 단백질에 유익한 특성을 부여하는 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 및 (ii) 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2의 관심있는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하고;
(b) 상기 세포가 고오스몰랄농도의 조건 하에 성장될 때 (i)의 핵산 분자의 발현이 (ii)의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드에 상기 유익한 특성을 부여하도록 세포를 배양하는 것을 포함하는, 고오스몰랄농도의 조건 하에 세포 내에서 관심있는 단백질을 발현시키는 방법을 제공한다.
이들 실시양태에서, 세포 내에서 발현된 단백질에 유익한 특성을 부여하는 단백질 또는 펩티드는 예를 들어, 항-세포자멸성 단백질; 세포에 산화 스트레스에 대한 저항성을 부여하는 단백질; 단백질 폴딩의 용이화에 관련되는 샤페론 단백질; 단백질의 세포외 분비에 관련되는 단백질; 해당 효소; 세포 주기 조절 단백질; 글리코실화 효소; 또는 그의 임의의 조합물일 수 있다.
본 발명의 방법에서, 세포는 정상적인 배양 조건 (즉, 표준 긴장성 조건)으로 초기에 배양될 수 있고, 후속적으로 배양 조건은 오스몰랄농도를 상기 제2의 관심있는 단백질의 발현을 증가시키기에 충분한 양으로 증가시키도록 변경될 수 있다. 이것은 배양액을 상기 오스몰랄농도를 증가시키는 화합물로 스파이킹 (spiking)함으로서 달성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 배양액에서 후기에 단백질의 발현 (배양 조건이 오스몰랄농도를 증가시켰을 때)은 세포에 독성인 단백질, 불안정한 단백질, 또는 정상적인 배양 조건 하에 발현하기 어려운 단백질과 같은 단백질을 제조하기 위해 유익하다.
다른 실시양태에서, 초기 배양 조건은 표준 배양 조건이고, 배양액은 세포 배양의 과정에서 고삼투성으로 되어, OR-TRE의 제어 하에 있는 상기 제2의 관심있는 단백질의 발현을 증가시킨다. 이들 단백질은 세포에 독성인 단백질, 불안정한 단백질, 또는 정상적인 배양 조건 하에 발현하기 어려운 단백질일 수 있다.
본 발명은 세포에 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것을 포함하는, 삼투 스트레스 또는 삼투 쇼크에 대한 세포의 적응성 또는 저항성을 추가 또는 향상시키는 방법을 추가로 제공하고, 여기서 추가의 핵산 분자는 (a) 삼투-보호 단백질 또는 펩티드; 또는 (b) 삼투-보호 조절 핵산이다.
본 발명은 (a) TonEBP를 코딩하는 단백질-코딩 핵산 분자; 및 (b) 제2 OR-TRE에 작동가능하게 연결된 제2의 관심있는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 고오스몰랄농도의 조건 하에 세포 내에서 관심있는 단백질을 발현시키는 방법을 추가로 제공하고; 여기서, 증가된 오스몰랄농도의 조건 하에, (a)의 핵산 분자가 발현되어, TonEBP 단백질을 발현시키고, TonEBP 단백질은 TonEBP 및 상기 제2의 관심있는 단백질의 발현을 양성으로 조절한다. 이것은 양성 피드백 (feedback) 루프 시스템을 생성한다. 이들 실시양태에서, 제2의 관심있는 단백질은 예를 들어 삼투보호 단백질 (예를 들어, 프롤린 또는 글리신-베타인, 타우린 수송체, 글리신 베타인-γ-아미노부티르산 수송체, 나트륨-미오-이노시톨 공동수송체, 열 쇼크 단백질, 아쿠아포린, 알도스 리덕타제, 또는 신경병증 표적 에스테라제 (NTE)); 상기 세포에 의해 발현되는 폴리펩티드에 유익한 특성을 부여하는 단백질 (예를 들어, 항-세포자멸성 단백질; 세포에 산화 스트레스에 대한 저항성을 부여하는 단백질; 단백질 폴딩의 용이화에 관련되는 샤페론 단백질; 단백질의 세포외 분비에 관련되는 단백질; 해당 효소; 세포 주기 조절 단백질; 글리코실화 효소; 또는 그의 임의의 조합물)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 프로모터에 작동가능하게 연결된 제3의 관심있는 단백질의 발현을 포함할 수 있고, 여기서 유익한 특성을 부여하는 단백질은 제3의 관심있는 단백질에 대해 작용한다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태의 상세내용은 첨부 도면 및 아래 상세한 설명에 제시된다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 잇점은 상세한 설명 및 도면과 특허청구범위로부터 자명해질 것이다.
본원에 인용된 모든 공개, 특허, 특허 출원, GenBank 서열 및 ATCC 기탁물은 모든 목적을 위해 본원에 참조로 명백하게 포함된다.
도 1a 및 도 1b는 아래에 상세히 논의된 바와 같이, 본 발명의 삼투-반응성 전사 조절 요소 (OR-TRE)가 삼투-내성 (osmo-tolerance)을 증가시키는 방식을 개략적으로 보여준다.
도 2는 아래 실시예 1에서 상세히 설명된 바와 같이, 형질감염된 세포로부터의 상등액 내의 마커를 측정함으로써 구축물의 전사 상향-조절 활성을 입증하는 실험을 개략적으로 보여준다.
도 3은 아래 실시예 1에서 상세히 설명된 바와 같이, 본 발명의 예시적인 삼투-반응성 전사 조절 요소 (OR-TRE)를 개략적으로 보여준다.
도 4는 아래 실시예 1에서 상세히 설명된 바와 같이, 도 3에 예시된 본 발명의 예시적인 삼투-반응성 전사 조절 요소 (OR-TRE)의 생체내 삼투-보호 효능을 개략적으로 보여준다.
도 5는 아래 실시예 1에서 상세히 설명된 바와 같이, POR3- 및 POR7--유도된 발현 수준을 그들의 구성적 발현 수준으로 표준화시키는 것을 개략적으로 보여준다. 다양한 도면에서 유사한 참조 기호는 유사한 요소를 나타낸다.
도 6은 고장성 배지 내에서 단백질 생산에 대한 1, 3 또는 7개의 ORE의 효과를 보여준다.
본 발명은 세포 내에서, 예를 들어, 생물반응기에서 사용된 세포와 같은 배양된 세포 내에서 세포내 오스몰농도를 조절하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 배양된 포유동물 세포 내에서 세포내 오스몰농도를 조절하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 인공 (재조합) 삼투-감지 (osmo-sensing) 또는 "삼투-반응성" 유전자 발현 시스템, 및 그의 제조 및 사용 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 이들 삼투-감지 또는 "삼투-반응성" 유전자 발현 시스템을 세포 내로 포함시킴으로써, 본 발명은 또한 향상된 삼투-반응 또는 향상된 삼투-감지 메카니즘을 갖는 조작된 (engineered) 세포를 제공한다. 따라서, 한 측면에서, 이들 세포가 배양 시스템, 예를 들어, 생물반응기 내에서 사용될 때, 그들의 향상된 삼투-반응성 (예를 들어, 고장성 또는 저장성 삼투 스트레스에 대한 향상된 저항성)은 배양 시스템 또는 생물반응기 내에서 보다 우수한 세포 건강 및 생존과 증가된 또는 상승된 생성물 생산을 일으켰다.
한 실시양태에서, 본 발명의 구축물은 유도성 핵산 및/또는 폴리펩티드 발현 시스템으로서 사용되고, 여기서 본 발명의 구축물 (예를 들어, 본 발명의 구축물 내의 핵산)의 전사를 유도 또는 감소시키는 신호는 세포의 세포내 및/또는 세포외 환경 내에서, 예를 들어, 생물반응기, 배양 접시, 페트리 접시, 시험관, 회전병, 임플란트, 인공 장기 등 내에서와 같은 배양 유체 내에서 오스몰농도, 오스몰랄농도 및/또는 긴장성의 변화 (예를 들어, 고오스몰랄농도의 조건을 유발하거나 고오스몰랄농도의 정도를 증가시키는 변화)이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 세포에 삼투-보호 표현형을 제공하므로, 이들 조성물 및 방법은 "발현하기 어려운" 분자, 폴리펩티드 및/또는 핵산, 예를 들어, 세포에 독성인, 예를 들어, 고유한 숙주 세포 독성을 갖는 분자, 폴리펩티드 및/또는 핵산의 생성 (제조)을 증가 또는 상승시키기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 제공되는 조성물 및 방법은 또한 예를 들어, 후기 또는 세포 치밀 배양 환경에서와 같이, 예를 들어 삼투 스트레스가 가해진 배양 또는 생물반응기 조건에서와 같이, 예를 들어, 삼투 스트레스가 가해진 조건 (예를 들어, 고오스몰랄농도의 조건)에 감수성인 번역 후 메카니즘을 갖는 세포 내에서 적절한 번역 후 처리를 증가 또는 상승시키기 위해, 예를 들어 폴리펩티드의 적절한 폴딩 및/또는 바람직한/요구되는 글리코실화 (예를 들어, 야생형 글리코실화 패턴)를 증가 또는 상승시키기 위해, 적절하게 또는 바람직한/요구되는 (예를 들어, 야생형 폴딩 패턴) 바와 같이 "발현하기 어려운"의 문맥에서 "발현하기 어려운", "발현하기 어려운" 폴리펩티드의 발현 (제조)을 증가 또는 상승시키기 위해 사용된다. 다른 실시양태에서, 본원에서 제공되는 조성물 및 방법은 또한 예를 들어, 후기 또는 세포 치밀 배양 환경에서와 같이, 예를 들어 삼투 스트레스가 가해진 배양 또는 생물반응기 조건에서와 같이 삼투 스트레스가 가해진 조건 (예를 들어, 고오스몰랄농도의 조건)에서 적절하게 또는 충분한 수율로 번역 후 프로세싱될 수 없는 단백질의 문맥에서 "발현하기 어려운", "발현하기 어려운" 폴리펩티드, 예를 들어, 삼투 스트레스가 가해진 조건에서 충분한 수율로 또는 정상적으로 폴딩되거나 글리코실화되지 않는 단백질의 발현을 증가 또는 상승시키기 위해 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 고수율의 정확하게 번역 후 변형된, 예를 들어, 글리코실화된 또는 폴딩된 폴리펩티드가 본원에서 제공되는 조성물 및 방법을 실시함으로써 생성되기 때문에, 생성물 품질이 후기 또는 세포 치밀 배양 환경, 예를 들어 생물반응기 내에서 유지된다. 예를 들어, 한 측면에서, 본원에서 제공되는 조성물 및 방법을 실시하는 것은 제조 공정에서 재조합 단백질 품질을 유지시키고, 예를 들어, 특히 생성물 품질이 후기 또는 세포 치밀 배양 환경, 예를 들어 생물반응기 내에서 손상될 때 제조 공정에서 FDA 승인된 재조합 단백질 품질을 유지시킨다.
다른 실시양태에서, 또한 본 발명의 조성물 및 방법은 세포에 삼투-보호 표현형을 부여하므로, 이들 조성물 및 방법은 예를 들어 세포 배양액, 또는 생물반응기, 배양 접시, 페트리 접시, 시험관, 회전병, 임플란트, 인공 장기 등 내의 치밀 또는 후기 성장 세포를 포함한 치밀 또는 후기 세포 생산 시스템에서 생성 (제조)를 증가 또는 상승시키기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본원에서 제공되는 조성물 및 방법의 사용은 치밀 또는 후기 세포 생산 시스템 내에서 생체분자의 효율적인 생산을 허용하고, 예를 들어 고수율의 총 생체분자 (예를 들어, 소분자, 폴리펩티드 및/또는 핵산), 또는 고수율의 번역 후 프로세싱된 단백질, 예를 들어, 고수율의 적절하게 폴딩된 또는 바람직하게 폴딩된 (예를 들어, 야생형 폴딩) 또는 글리코실화된 폴리펩티드를 허용한다.
유사하게, 본 발명의 조성물 및 방법은 최적 세포 밀도가 달성된 후의 배양 조건을 포함한 배양 조건 동안 세포 내에서 재조합 단백질 발현을 유도하기 위해 또는 적절한 단백질 폴딩 및/또는 글리코실화의 정도를 증가시키기 위해 사용될 수 있다; 유도 - 예를 들어, 본 발명의 OR-TRE에 의한 전사의 증가는 세포의 세포내 및/또는 세포외 환경 내에서 오스몰랄농도, 오스몰랄농도 및/또는 긴장성의 변화 (예를 들어, 증가) (예를 들어, 고오스몰랄농도의 조건을 유발하거나 고오스몰랄농도의 정도를 증가시키는 변화)에 의해 촉발된다. 본 발명의 조성물 및 방법은 세포 발현 시스템, 예를 들어, 임플란트, 인공 장기, 생물반응기, 배양 배지 등에서 세포 성장 및 재조합 단백질 발현을 분리하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 고오스몰랄농도의 조건, 또는 높은 오스몰농도, 오스몰랄농도 및/또는 긴장성 조건 하에 유도성 전사 또는 프로모터 시스템으로서 사용될 수 있다.
배양액 내에서 세포에 의한 그의 생산이 본 발명의 방법 및/또는 조성물에 의해 증가되는, 배양된 세포에 의해 생산된 생성물은 재조합 폴리펩티드, 다당류, 소분자, 예를 들어 폴리케타이드 (예를 들어, 항생제), 핵산, 비리온 및 패키징된 (packaged) 바이러스 입자 (예를 들어, 배양된 세포인 "생산자 세포"를 사용한 경우와 같이) 등을 포함한다.
본 발명의 조작된 세포는 삼투 스트레스 (예를 들어, 고오스몰랄농도의 조건, 예를 들어 고장성 또는 저장성 삼투 스트레스에 대한 향상된 조항성)에 보다 잘 저항할 수 있고, 증가하는 오스몰랄농도 (예를 들어, 고오스몰랄농도의 조건)의 면에서 보호되고, 또 다른 실시양태에서 정상 (생리학적) 오스몰랄농도 초과 또는 미만에서 성장 및 높은 생활력을 모두 유지할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 삼투-감지 또는 "삼투-반응성", 또는 "고오스몰랄농도-반응성" 유전자 발현 시스템 및 세포의 사용은 예를 들어, 삼투 스트레스가 가해진 조건에서 세포 독성을 감소시키고 재조합 단백질 생성물 및/또는 적절하게 폴딩된 또는 바람직하게 폴딩된 (예를 들어, 야생형 폴딩) 또는 글리코실화된 단백질일 수 있는 배양된 세포 생성물의 충분한 양 및 일관된 품질을 보장함으로써, "발현하기 어려운" 단백질에 대해 보다 우수한 배양액 또는 생물반응기 수율을 허용한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 고오스몰랄농도-감수성, 삼투-감지 또는 삼투-반응성 유전자 발현 시스템을 제공함으로써 삼투 스트레스가 가해진 배양 조건에서 세포에 의한 감소된 생성물 수율에 대한 해결책을 제공하고; 본 발명은 본 발명의 이들 고오스몰랄농도-감수성, 삼투-감지, 삼투-반응성 시스템을 포함하는 세포를 제공하고, 여기서 본 발명의 세포는 향상된 생존, 및 고오스몰랄농도의 조건, 저오스몰랄농도 또는 임의의 삼투 스트레스가 가해진 조건(들), 예를 들어 고장성 또는 저장성 삼투 스트레스의 음성 효과에 대한 저항성을 가진다. 본 발명은 생물반응기와 같은 배양 시스템에서 고오스몰랄농도 또는 증가된 오스몰랄농도, 예를 들어, 증가된 긴장성 조건과 상호관련된 (연관된) 고오스몰랄농도 (예를 들어, 증가된 염, 예를 들어 증가된 나트륨 또는 칼륨 염, 예를 들어, NaCl)에 의해 유발된 문제를 방지 또는 개선하기 위한 조성물, 세포 및 방법을 제공한다. 본 발명은 생물반응기와 같은 배양 시스템에서 저오스몰랄농도 또는 감소된 오스몰랄농도, 예를 들어, 감소된 긴장성과 상호관련된 (연관된) 감소된 오스몰랄농도 (예를 들어, 감소된 염, 감소된 나트륨 또는 칼륨 염, 예를 들어, NaCl)에 의해 유발된 문제를 방지 또는 개선하기 위한 조성물, 세포 및 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 고오스몰랄농도 또는 증가된 오스몰랄농도에 의해 유발된 문제, 또는 저오스몰랄농도 또는 감소된 오스몰랄농도에 의해 유발된 문제를 방지 또는 개선하기 위한 조성물, 세포 및 방법을 제공하고, 여기서 고오스몰랄농도 또는 저오스몰랄농도는 예를 들어 무기 염 및 광물, 예를 들어 염화나트륨, 염화칼슘, 황산구리, 질산철, 황산제1철, 염화칼륨, 황산마그네슘, 염화마그네슘, 제1인산나트륨, 제2인산나트륨 및/또는 황산아연; 또는 미량 원소, 예를 들어 암모늄 파라몰리브데이트, 암모늄 바나듐 옥시드, 황산망간, 염화니켈, 셀렌산, 메타규산나트륨 및/또는 염화주석; 또는 버퍼 또는 버퍼 성분, 예를 들어 인삼염 (예를 들어, 인산일나트륨, 인산이나트륨 포함), 탄산염 및/또는 중탄산염 (예를 들어, 탄산나트륨 및/또는 중탄산나트륨), HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산) 및/또는 부티르산나트륨; 또는 오스몰랄농도를 증가 및/또는 감소시킬 수 있는 임의의 배양액 구성분 또는 성분, 예를 들어 탄수화물, 예를 들어 글루코스 및/또는 갈락토스, 임의의 천연 또는 합성 아미노산, 뉴클레오티드 및/또는 보조인자, 대사 중간체, 예를 들어 히포잔틴, 리놀렌산, 리포산, 푸트레신 이염산염, 나트륨 피루베이트 및/또는 티미딘, 또는 비타민 또는 낮은 농도로 요구되는 임의의 다른 유기 화합물, 예를 들어 비오틴, D-칼슘 판토테네이트, 콜린 클로라이드, 시아노코발라민, 폴산, i-이노시톨, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 호르몬 및/또는 보조인자, 예를 들어 인슐린, 트랜스페린 및 상피 성장 인자, 또는 펩티드, 단백질 및/또는 조직 가수분해물 (예를 들어, 펩톤), 또는 항생제, 예를 들어, 겐타미신 황산염, 또는 지방산, 예를 들어 리놀레인산, 알파 토코페롤, 지질/EtOH, 또는 소포제, 습윤제, 분산제, 증점제, 유화제, 계면활성제, 삼투보호제, 예를 들어 프롤린, 글루타메이트, 소르비톨, 베타인, 이노시톨, 타우린 및/또는 글리세롤-포스포콜린으로서 기능할 수 있는 블록 공중합체, 예를 들어 에틸렌 옥시드 및 프로필렌 옥시드 기반 중합체, 예를 들어, 플루로닉(PLURONIC)™ (바스프 (BASF, 미국 뉴저지주 플로람 파크))를 포함한 임의의 배양액 또는 버퍼 시스템의 성분, 구성분 또는 요소의 각각 증가된 또는 감소된 수준 (양)에 의해 유발된다.
한 실시양태에서, 하나 이상의 삼투보호제 화합물은 본 발명을 실시하는 삼투보호 효과를 증대하기 위해 본 발명의 조성물 및/또는 방법을 실시할 때 사용되고; 예를 들어, 본 발명의 조성물 및/또는 방법은 하나 이상의 삼투보호제 화합물, 예를 들어 프롤린, 글루타메이트, 소르비톨, 베타인, 이노시톨, 타우린 및/또는 글리세롤 포스포콜린의 사용을 포함한다 (이루어진다).
본 발명의 조성물, 예를 들어, 본 발명의 삼투-반응성 전사 조절 요소 (OR-TRE)는 적어도 하나의 긴장성 인핸서 결합 단백질 (TonEBP) ("삼투 반응 요소-결합 단백질 (OREBP)" 또는 "NFAT5"로도 알려짐)-반응성 전사 인핸서 서열 (ORE/TonE 인핸서 서열)을 포함하고/하거나 본 발명의 OR-TRE는 NFATc 긴장성-반응성 전사 인자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 고 염 (고 나트륨 또는 칼륨 염, 예를 들어, NaCl) 조건에 의해 유발된 고오스몰랄농도의 조건을 포함하는 삼투 스트레스는 인산화 (본 발명이 임의의 특정 작용 메카니즘에 의해 제한되지 않지만)에 의해 전사 인자 긴장성-반응성 인핸서/삼투 반응 요소-결합 단백질 (NFATc 또는 TonEBP/OREBP)을 활성화시키고, 인산화된 TonEBP/OREBP는 세포질로부터 핵으로 전위하여, 본 발명의 삼투-반응성 전사 조절 요소 (OR-TRE) 및 내인성 삼투-반응성 전사 조절 요소 모두의 전사를 증가시킨다.
내인성 삼투-반응성 전사 조절 요소의 활성화는 그의 프로모터가 인핸서 ORE/TonE에 의해 제어되는 몇몇 보호 핵산, 예를 들어, 유전자, 예를 들어 타우린 수송체 (TauT), 글리신 베타인-γ-아미노부티르산 수송체 (BGT1), 나트륨-미오-이노시톨 공동수송체, 열 쇼크 단백질 70 (HSP70), 아쿠아포린 2 (AQP2) 및 알도스 리덕타제 유전자 (AR)의 발현 (전사)을 증가시키고; 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 삼투-반응성 핵산은 이들 삼투-반응성 내인성 핵산, 예를 들어, 유전자의 코딩 서열(들)을 포함한다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 예를 들어, 타우린 수송체 (TauT), 글리신 베타인-γ-아미노부티르산 수송체 (BGT1), 나트륨-미오-이노시톨 공동수송체, 열 쇼크 단백질 70 (HSP70), 아쿠아포린 2 (AQP2) 및/또는 알도스 리덕타제 유전자 (AR)를 포함한 본 발명의 조성물 내로 포함된 (조작된), 삼투-반응성 내인성 핵산, 예를 들어, 유전자의 삼투-반응성 발현에 의해 세포에 삼투-저항성을 부여한다.
그러나, 다른 측면에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 그가 삽입된 세포에 이종성인 핵산, 예를 들어, 유전자 (및 단백질)의 삼투-반응성 발현에 의해 세포에 삼투-저항성을 부여한다. 예를 들어, 타우린 수송체 (TauT), 글리신 베타인-γ-아미노부티르산 수송체 (BGT1), 나트륨-미오-이노시톨 공동수송체, 열 쇼크 단백질 70 (HSP70), 아쿠아포린 2 (AQP2) 및/또는 알도스 리덕타제 유전자 (AR)는 세포에 이종성일 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 또한 프롤린 또는 글리신-베타인, 또는 타우린 수송체, 또는 글리신 베타인-γ-아미노부티르산 수송체, 또는 나트륨-미오-이노시톨 공동수송체, 또는 열 쇼크 단백질, 또는 열 쇼크 단백질 70, 또는 아쿠아포린 (물 채널로서 작용하는 막 세공 단백질), 또는 아쿠아포린 2, 또는 알도스 리덕타제와 같은 내인성 또는 이종성 삼투-보호 단백질 또는 펩티드의 삼투-반응성 발현에 의해 세포에 삼투-저항성을 부여할 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 또한 내인성 또는 이종성 삼투 보호성 항-세포자멸성 단백질, 예를 들어 Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, BHRF1, X-IAP, IAP1, IAP2, IEX-1L, Bfl-1 또는 Bcl-w의 삼투-반응성 발현에 의해 세포에 삼투-저항성을 부여할 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 또한 수퍼옥시드 디스뮤타제, 카탈라제, 글루타티온 퍼옥시다제, 퍼옥시레독신, 술피레독신, 티오레독신, 티오레독신 리덕타제, 티오레독신 퍼옥시다제, 티올트랜스퍼라제, 글루타레독신 또는 글루타티온 리덕타제와 같은 세포에 산화 스트레스에 대한 저항성을 부여하는 내인성 또는 이종성 단백질의 삼투-반응성 발현에 의해 세포에 삼투-저항성을 부여할 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 비제한적으로 비폴딩된 또는 미스폴딩된 (misfolded) 단백질 등과 같은 불리한 결과를 개선 또는 방지하기 위해 세포를 삼투 스트레스에 대해 보호하고, 예를 들어, 고오스몰랄농도의 조건에 대해 보호한다. 따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 배양된 세포를 포함한 세포가 단백질 또는 정확한 폴딩 상태 및/또는 보다 우수한 (정상, 야생형) 글리코실화 프로필을 갖는 단백질 등을 포함한 보다 많은 내인성 생성물을 생성하고 분비할 수 있도록 한다. 한 측면에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 결합 면역글로불린 단백질 (BiP) (글루코스 조절 단백질 78, 또는 Grp78로도 불림), 칼넥신, 칼레티쿨린, ERp57, 또는 단백질 디술피드 이소머라제 (PDI)와 같은, 소위 비폴딩된 단백질 반응 (또는 비폴딩된 또는 미스폴딩된 단백질의 축적에 의해 촉발된 세포자멸 또는 프로그래밍된 (programmed) 세포 사멸을 방지하기 위해 비폴딩된 또는 미스폴딩된 단백질의 축적에 반응하여 활성화되는 "UPR")을 포함한 단백질 폴딩의 용이화에 관련되는 내인성 또는 이종성 샤페론 단백질의 삼투-반응성 발현에 의해 세포에 삼투-저항성을 부여할 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 또한 단백질의 세포외 분비에 관련되는 내인성 또는 이종성 단백질의 삼투-반응성 발현에 의해 세포에 삼투-저항성을 부여할 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 또한 내인성 또는 이종성 해당 효소, 예를 들어, 피루베이트 카르복실라제 또는 피루베이트 키나제의 삼투-반응성 발현에 의해 세포에 삼투-저항성을 부여할 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 또한 내인성 또는 이종성 세포 주기 조절 단백질, 예를 들어, 시클린 또는 시클린-의존성 키나제 (CDK), 또는 시클린 또는 시클린-의존성 키나제의 억제제의 삼투-반응성 발현에 의해 세포에 삼투-저항성을 부여할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 삼투-반응성 핵산 서열은 예를 들어, 삼투 스트레스에 후속적인 세포 스트레스를 개선함으로써 포유동물 세포 배양에서 재조합 단백질 생산을 향상/증가시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 이들 삼투-반응성 핵산 서열을 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 관심있는 단백질이 증가된 오스몰랄농도의 조건 하에 발현될 수 있도록, 관심있는 유전자의 발현이 삼투반응 요소의 제어 하에 있는 핵산을 제공한다. 이들 경우에, OR-TRE는 관심있는 유전자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된다. 이들 실시양태에서, 핵산은 또한 OR-TRE 제어된 삼투-저항성 유전자 또는 핵산, 및/또는 예를 들어, 세포의 대사, 분비, 생활력 또는 성장에 대한 효과일 수 있는 또는 정확한 폴딩, 번역 후 변형 등과 같은, 발현된 단백질의 품질에 대해 유익한 효과를 갖는 것일 수 있는 유익한 효과를 발현된 단백질에 부여하는 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 핵산을 함유할 수 있다.
본 발명은 또한 이어서, 단백질이 TonEBP의 추가의 발현을 유도할 수 있도록 OR-TRE가 TonEBP의 발현을 유도하는 양성 피드백 메카니즘을 제공한다. OR-TRE의 제어 하에 다른 유전자와 함께 사용될 때, 양성 피드백은 이들 유전자의 발현을 유도하는 효과를 또한 가진다. 양성 피드백은 고오스몰랄농도에 대한 세포의 향상된 적응성을 제공할 수 있다.
특정 특성을 최적화하기 위해 단백질 생산 시간으로 조절된 예측가능한 방식으로 OR-TRE의 제어 하에 유전자의 발현을 유도하기 위해 배양액의 오스몰랄농도를 인공적으로 증가시킬 수 있다. 별법으로, 유전자의 발현을 OR-TRE의 제어 하에 놓음으로써, 유전자가 오스몰랄농도가 자연적으로 증가할 때 배양 단계에서 후기에 발현될 수 있다. 이들 방법은 세포에 독성인 단백질, 불안정한 단백질, 및 표준 배양 조건 하에 단순히 발현하기 어려운 단백질을 발현시키는데 유용할 수 있다.
본 발명은 또한 긴장성-반응성 유전자 발현을 가능하게 하는 다양한 신규한 인공 프로모터 및 재조합 단백질 제조를 위한 그의 가능한 용도를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명의 핵산은 삼투-반응성 포유동물 프로모터를 포함하고; 별법으로, 하나의 측면에서, 본 발명의 핵산은 관심있는 핵산 서열의 삼투-감수성 발현을 위한 TonEBP mRNA의 삼투-반응성 비번역된 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 최소 진핵 프로모터의 상류에 클로닝된 TonEBP/OREBP 인핸스오좀 (enhanceosome)의 특이적인 하나 또는 다수의 오퍼레이터 (operator) 모듈(들)을 포함하는 TonEBP/OREBP 반응성 프로모터를 포함한다. 한 측면에서, 위치 -1053에 TonE 및 위치 -1014에 활성화인자 단백질 1 (AP-1) 부위를 함유하는, 마우스 알도스 리덕타제 프로모터의 뉴클레오티드 서열 -1053 내지 -1007 (예를 들어, [Daoudal (1997) J. Biol. Chem. Jan 31; 272(5):2615-2619] 참조)이 사용된다.
다른 측면에서, 본 발명의 핵산은 도입유전자 (transgene)의 발현을 유도하여, 오스몰랄농도가 증가할 때 그의 전사 활성을 증가시키는 프로모터 서열의 상류 또는 그 내에 하나의 또는 다수의 삼투-반응 요소의 삽입에 의해 재조합 단백질 생산에 대한 증가된 오스몰랄농도의 효과를 상쇄한다. 예를 들어, 천연 시스템에서, 거의 모든 긴장성 반응성 유전자는 TonE의 35 bp 내에 하나 이상의 활성화인자 단백질-1 (AP-1)-반응성 부위를 갖고; 다른 측면에서, 본 발명의 핵산은 TonE 부위의 유사한 거리 (보다 많은, 보다 적은 또는 동일한) 내에 하나 또는 다수의 AP-1 부위 (AP-1 결합 서열)을 포함한다. 본 발명의 핵산 내에 하나 이상의 AP-1 반응성 모티프의 존재는 높은 NaCl-유도된 반응성에 기여하고, 예를 들어, 상기 측면에서, 본 발명의 AP-1 반응성 모티프-함유 삼투-반응성 전사 조절 요소 (ORTRE)는 삼투-스트레스 조건에 보다 민감성 또는 보다 반응성 (보다 긴장성-반응성)이고, 예를 들어, 고 염 (예를 들어, 나트륨 또는 칼륨 염, 예를 들어, NaCl) 배양 조건에 보다 민감성 또는 보다 반응성이다. 본 발명은 도입유전자 ("관심있는 유전자") 발현 수준을 목적하는 수준으로, 예를 들어, 기초 발현에서부터 삼투 스트레스가 가해진 (예를 들어, 저장성 또는 고장성) 조건에서 보다 높은 또는 최대 발현으로 미세조정하기 위해, 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 삼투 반응 요소, 예를 들어, TonE 및/또는 AP-1의 수를 변화시킴으로써 가능하게 된 다양한 도입유전자 발현 대안 또는 창을 이용한다.
한 실시양태에서, 세포 고오스몰랄농도-반응성 (예를 들어, 긴장성-반응성)의 증가는 전사 단위의 프로모터에 의해 매개/제어될 때 핵산 분자, 예를 들어 도입유전자, 또는 "관심있는 유전자"의 전사 속도를 증가시키는 본 발명의 핵산에 의해 매개된다. 예를 들어, 한 측면에서, 고오스몰랄농도-반응성 (예를 들어, 긴장성-반응성) NFATc/OREBP 또는 TonEBP/OREBP 유전자 전사활성화 활성의 증가는 본 발명의 삼투-반응성 전사 조절 요소 (OR-TRE)의 프로모터에 의해 매개된다. 또 다른 실시양태에서, 진핵 세포 내에서 전사 활성인 임의의 프로모터, 예를 들어, 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터를 포함하거나 그로 이루어진 프로모터, 또는 합성 프로모터, 또는 포유동물, 식물, 곤충, 세균, 효모, 진균 또는 바이러스 프로모터, 또는 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 예를 들어, 인간 CMV 프로모터의 단편으로 이루어진 최소 프로모터가 본 발명의 삼투-반응성 전사 조절 요소 (OR-TRE)에서 사용될 수 있다. 한 측면에서, 핵산 분자 (예를 들어, 도입유전자 또는 관심있는 유전자)를 가장 효율적으로 발현하기 위해 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 최소 전사 단위, 예를 들어, 최소 또는 스트립 다운 (stripped down) 버전의 발현 벡터가 사용된다.
본 발명은 임의의 특정 작용 메카니즘에 의해 제한되지 않지만, 하나의 측면에서, 본 발명의 삼투-반응성 전사 조절 요소 (OR-TRE)는 도 1a 및 도 1b에 개략적으로 예시된 바와 같이 TonEBP 발현에 대한 세포의 TonEBP-유도된 양성 피드백 루프 때문에 삼투-내성을 증가시킨다.
본 발명의 조성물 및 방법은 증가된 긴장성 (증가된 염, 예를 들어 나트륨 또는 칼륨 염, 예를 들어, NaCl)과 상호관련된 증가된 오스몰랄농도를 개선한다. 한 측면에서, 배양 환경 내의 고 염 (나트륨 또는 칼륨 염)은 본 발명의 전사 인자 긴장성-반응성 인핸서/삼투 반응 요소 결합 단백질 (TonEBP/OREBP)을 활성화하여, 본 발명의 구축물에 통합된 삼투-보호 유전자의 증가된 전사를 일으킨다. 이들 구축물에서, 프로모터는 예를 들어, 삼투-반응성 전사 조절 요소 (OR-TRE), 또는 인핸서 ORE/TonE에 의해 제어되고, 이는 한 측면에서 하나 이상의 AP-1 단백질 결합 서열을 포함한다.
본 발명은 임의의 특정 작용 메카니즘에 의해 제한되지 않지만, 한 측면에서, TonEBP/OREBP 전사 활성의 조절은 도 1a에 개략적으로 제시된 바와 같고; 상기 도면은 핵-세포질 통행 (trafficking), 전사활성화 및 인산화를 포함한다. 한 측면에서, 고장성에서 30분 내에, TonEBP/OREBP는 인산화되고, 그의 핵 분포, 즉 핵 분획 내의 양 대 세포질 분획 내의 양의 비는 증가한다. 한 측면에서, TonEBP의 전사활성화는 긴장성에 의존성이고: TonEBP의 전사 활성은 등장성 조건 하에 양성이고, 저장성에서 감소하고, 고장성에서 증가한다.
도 1a는 TonEBP가 고장성에 의해 자극되고 하나 또는 다수의 TonEBP의 동족 결합 부위(들): ORE/TonE을 함유하는 프로모터의 전사를 유도하는 방식을 개략적으로 보여준다. 한 실시양태에서, 임의의 내인성 TonE (긴장성 인핸서, 또한 삼투 반응 요소로도 불림) 함유 프로모터는 향상된 생물약제 생산을 위한 재조합 단백질의 발현을 유도하기 위해 사용될 수 있다.
도 1b는 TonEBP의 삼투 의존 활성의 적용의 예를 개략적으로 보여준다: 삼투-반응성 양성 피드백 루프. 그러나, 본 발명은 임의의 특정 작용 메카니즘에 의해 제한되지 않지만, 도 1b는 많은 가능한 예시적인 작용 메카니즘 중 하나: TonEBP-반응성 양성 피드백 루프를 보여주고: 여기서, TonEBP는 그 자신의 발현을 전사활성화하여, 긴장성이 증가할 때, TonEBP는 그 자신의 자극을 합성 방식으로 증폭시키고: TonEBP의 삼투-반응성 활성화가 클수록, 더 많은 TonEBP가 생산되어, 보다 큰 피드백을 생성시킨다.
본 발명의 구축물을 설계할 때, 본 발명의 삼투-반응성 전사 조절 요소 (OR-TRE)는 다양한 삼투보호 유전자를 전사활성화할 수 있어서, 세포가 높은 오스몰랄농도에 적응할 수 있도록 한다. 하나의 예시적인 메카니즘에서, 그러한 삼투-반응성 양성 피드백 루프는 삼투 스트레스에 대한 포유동물 세포의 적응성을 가속화시키고 증폭시킬 수 있다. 이것은 구성적 과다발현의 단점 없이 높은 오스몰랄농도에 대한 그들의 내성을 증가시킬 것이다.
일부 측면에서, TonEBP의 구성적 과다발현은 등장성 조건에서 세포에 대한 에너지의 불필요한 고갈을 나타낼 수 있지만; 본 발명은 임의의 재조합 단백질을 발현하는 임의의 세포에 삼투-저항성 표현형을 생성할 수 있는 삼투-반응성 전사 조절 요소 (OR-TRE)를 포함하므로, 일부 상황 하에 본 발명의 구축물 또는 세포는 세포에 일정 정도의 삼투-저항성을 제공하는 유전자를 구성적으로 발현하도록 설계될 수 있음이 생각된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 구축물은 세포내 및/또는 세포외 오스몰랄농도, 오스몰랄농도 및/또는 긴장성을 증가 또는 감소시키기 위해 반응성일 수 있는 점에서 삼투-반응성이다. 또 다른 실시양태에서, 삼투-반응성은 오스몰랄농도 또는 오스몰농도의 임의의 변화, 예를 들어, 오스몰랄농도 또는 오스몰농도의 임의의 감소 또는 증가, 예를 들어, 고오스몰랄농도 또는 저오스몰랄농도의 임의의 변화 (예를 들어, 그의 증가하는 또는 감소하는 조건)을 포함한 몰랄농도의 임의의 변화를 의미한다. 한 측면에서, "오스몰랄농도"는 수용액 내의 용해된 용질 입자의 삼투압의 척도이다. 용질 입자는 이온 및 비-이온화된 분자 모두를 포함한다.
오스몰랄농도는 1 kg의 물에 용해된 삼투 활성 입자의 농도 (즉, 오스몰)로서 표현된다 (38℃에서 1 mOsm/kg H2O는 19 mm Hg의 삼투압과 동등하다). "오스몰농도"는 1 리터의 용액에 용해된 용질 입자의 수를 의미한다. 그의 오스몰랄농도를 증가시키도록 배양 배지에 첨가될 수 있는 용해질은 단백질, 펩티드, 아미노산, 비-대사 중합체, 비타민, 이온, 염 (예를 들어, 나트륨 또는 칼륨 염), 당, 대사산물, 유기산, 지질 등을 포함한다. 한 실시양태에서, 배양 배지 내의 아미노산 및 염, 예를 들어, 나트륨 또는 칼륨 염 (예를 들어, NaCl)의 농도는 본원에서 제시된 요구되는 오스몰랄농도 범위를 달성하기 위해 증가된다. 본원에서 사용될 때, 약어 "mOsm"은 "밀리오스몰/kg H2O"를 의미한다.
예를 들어, 한 실시양태에서, 본원에서 제공되는 조성물 및 방법은 예를 들어, 생물반응기 내에서 발견되는 세포 배양 배지를 약 210 내지 350 밀리오스몰 (mOsm)의 범위, 또는 약 260 내지 320 밀리오스몰 (mOsm)의 범위의 오스몰농도를 갖도록 유지하기 위해, 또는 또 다른 실시양태에서 약 280, 290, 300 또는 310 mOsm/kg의 세포 배양 오스몰농도를 표적화하도록 사용된다.
또 다른 실시양태에서, 본원에서 제공되는 조성물 및 방법은 세포 배양 배지를 비교적 낮은 오스몰농도로 유지하기 위해, 예를 들어, 세포 배양 배지가 약 248 mOsm 내지 약 280 mOsm의 오스몰농도를 갖도록 유지하기 위해 사용된다 (예를 들어, 미국 특허 (USPN) 5,747,341 참조). 또 다른 실시양태에서, 본원에서 제공되는 조성물 및 방법은 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 20050272124에 기재된 바와 같이 세포 배양 배지를 약 280 내지 330 mOsm, 또는 약 400 내지 600 mOsm로 유지하기 위해 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 본원에서 제공되는 조성물 및 방법은 예를 들어 USPN 5,705,364에 기재된 바와 같이 세포 배양 배지를 약 250 내지 약 600 mOsm로 유지하기 위해 사용된다.
환경 또는 스트레스 저항성 단백질
본 발명은 삼투-보호 단백질 또는 펩티드; 항-세포자멸성 단백질; 세포에 산화 스트레스에 대한 저항성을 부여하는 단백질; 단백질 폴딩의 용이화에 관련되는 샤페론 단백질; 단백질의 세포외 분비에 관련되는 단백질; 해당 효소; 세포 주기 조절 단백질; 또는 그의 임의의 조합물을 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 본 발명의 삼투-반응성 전사 조절 요소를 포함하는 삼투-반응성 핵산을 제공한다.
삼투-보호 유전자
본 발명은 포유동물 세포의 물 함량 및/또는 삼투능 (osmotic potential)에 유리한 영향을 주는 단백질을 코딩하는 삼투-반응성 핵산을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 핵산은 포유동물 세포의 물 함량 및/또는 삼투능에 영향을 주는 임의의 단백질, 예를 들어, 프롤린 및 글리신-베타인, 및/또는 당과 같은 다른 삼투 활성 용질의 수준에 영향을 주는 단백질의 생합성을 코딩하는 핵산을 삼투-반응 방식으로 발현할 수 있다.
본 발명의 핵산은 삼투 저항성을 개선하고 상보성 작용 방식을 갖는 다수의 유전자를 삼투-반응 방식으로 발현할 수 있다. 본 발명의 핵산에 의해 발현되는 이들 유전자의 조합은 세포, 예를 들어, 포유동물 세포에서 삼투 저항성을 개선하는데 있어서 상가적 및/또는 상승적 효과를 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 이익은 하나 이상의 이들 유전자의 구성적 발현을 통해, 및/또는 또한 예를 들어, 본 발명의 삼투-반응성 전사 및/또는 전사후 발현 시스템을 이용하여 삼투-반응성 방식으로 하나 이상을 발현함으로써 부여된다. 조작된 세포에 향상된 삼투-반응 또는 향상된 삼투-감지 메카니즘을 제공하는 단백질의 발현에서 구성적 및 삼투-유도된 증가 모두의 다양한 조합을 제공함으로써, 본 발명은 고오스몰농도 또는 저오스몰농도의 스트레스를 보다 잘 견디도록 임의의 재조합 단백질을 발현하는 임의의 세포, 예를 들어, 임의의 포유동물 세포에 적합한 삼투-감수성 발현 패턴을 설계하거나 그를 갖도록 맞추어질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 및 방법은 예를 들어, 배양 시스템 또는 생물반응기 내에서 배양 조건을 산성화하는 락테이트 생산을 개선 또는 방지하기 위해 사용될 수 있다. 대부분의 배양 시스템 및 생물반응기 내에서 배지의 pH를 유지하기 위해, 염기를 첨가하고, 결과로서 오스몰랄농도가 증가한다.
유가식 생물반응기에서 락테이트 축적과 감소된 세포 성장 및 생활력 사이에 상관성이 존재한다. 따라서, 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 해당 효소, 예를 들어 피루베이트 카르복실라제, 피루베이트 키나제 및 다른 효소를 삼투-반응성으로 과다발현하면 형질전환된 세포, 예를 들어, 포유동물 세포를 락테이트 생산으로부터 락테이트 소비로 전환시킬 수 있다. 해당 효소(들)의 상기 과다발현의 결과는 세포에 의한 생활력의 유지, 및 예를 들어, 포유동물 세포에 의한 증가된 재조합 단백질 생산이다.
핵산 및 벡터의 생성 및 조작
본 발명은 삼투-반응성 전사 조절 요소 (OR-TRE), 삼투-반응성 핵산, 및 이들을 포함하는 발현 카세트, 벡터, 재조합 바이러스, 플라스미드, 파지, 파지미드, 인공 염색체 및 클로닝 벡터를 포함하는 핵산을 제공한다. 본 발명은 학술 및 특허 문헌에 잘 기술되어 있는 당업계에 공지된 임의의 방법 또는 프로토콜 또는 장치와 함께 실시될 수 있다.
본 발명은 삼투-반응성 전사 조절 요소 (OR-TRE), 또는 삼투-반응성 핵산을 포함하는 "핵산" 또는 "핵산 서열"을 제공하고, 또한 RNAi, 예를 들어 siRNA 또는 miRNA, 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 임의의 단편, 예를 들어 게놈 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA (예를 들어, mRNA, rRNA, tRNA)을 포함하고, 이들은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고 펩티드 핵산 (PNA), 또는 예를 들어, iRNA, 리보핵단백질 (예를 들어, iRNP)을 포함한 천연 또는 합성 기원의 임의의 DNA-유사 또는 RNA-유사 물질에 센스 또는 안티센스 가닥을 나타낼 수 있다. 본 발명의 핵산은 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 코딩할 수 있고, 코딩 서열뿐만 아니라 리더 서열 또는 전구단백질 서열, 및 비-코딩 서열, 예를 들어 인트론 또는 코딩 서열의 5' 및/또는 3'의 비-코딩 서열을 또한 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드에 대한 코딩 서열, 및 추가의 코딩 및/또는 비코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일반적인 기술
본 발명을 실시하기 위해 사용되는 삼투-반응성 전사 조절 요소 (OR-TRE), 본 발명의 삼투-반응성 핵산, 또는 RNA, iRNA, 조절 핵산 (억제, 안정화 또는 상향조절 기능 또는 효과를 갖는 핵산), cDNA, 게놈 DNA, 벡터, 바이러스 또는 이들의 하이브리드 여부와 상관없이 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 핵산은 다양한 공급원으로부터 단리되고, 유전자 조작되고, 증폭되고/되거나 발현되고/재조합 방식으로 생성될 수 있다.
재조합 핵산 및/또는 폴리펩티드를 개별적으로 단리하거나 클로닝하고, 요구되는 활성에 대해 시험할 수 있다. 세균, 포유동물, 효모, 곤충 또는 식물 세포 발현 시스템을 포함하는 임의의 재조합 발현 시스템이 사용될 수 있다.
별법으로, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 핵산은 예를 들어 문헌 [Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661]; [Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444]; [Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380]; [Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896]; [Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90]; [Brown (1979) Meth. Enzymol. 68:109]; [Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859]; USPN 4,458,066에 기재된 바와 같은 공지된 화학적 합성 기술에 의해 시험관 내에서 합성될 수 있다.
핵산 조작을 위한 기술, 예를 들어, 서브클로닝, 표지 프로브 (예를 들어, Klenow 중합효소, 닉 (nick) 번역, 증폭을 사용하는 랜덤-프라이머 표지), 서열결정, 혼성화 등이 학술 및 특허 문헌에 잘 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook, ed., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ND ED.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)]; [CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997)]; [LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993)]을 참조한다.
본 발명을 실시하기 위해 사용되는 핵산을 얻고 조작하는 다른 유용한 수단은 게놈 샘플로부터 클로닝하고, 요구될 경우, 예를 들어, 게놈 클론 또는 cDNA 클론으로부터 단리 및 증폭된 삽입물을 스크리닝 및 재클로닝하는 것이다. 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 핵산의 공급원은 예를 들어 포유동물 인공 염색체 (MAC) (예를 들어, 미국 특허 5,721,118; 6,025,155 참조); 인간 인공 염색체 (예를 들어, [Rosenfeld (1997) Nat. Genet. 15:333-335] 참조); 효모 인공 염색체 (YAC); 세균 인공 염색체 (BAC); P1 인공 염색체 (예를 들어, [Woon (1998) Genomics 50:306-316] 참조); P1-유래 벡터 (PAC) (예를 들어, [Kern (1997) Biotechniques 23:120-124] 참조); 코스미드 (cosmid), 재조합 바이러스, 파지 또는 플라스미드에 포함된 게놈 또는 cDNA 라이브러리를 포함한다.
전사 및 번역 제어 서열
본 발명의 핵산 서열은 RNA 합성/발현을 유도 또는 조정하기 위해 단백질 코딩 서열 또는 조절 핵산, 예를 들어, 억제, 안정화 또는 상향-조절 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 프로모터 및 인핸서를 포함한다. 예를 들어, 하나의 측면에서, 본 발명은 진핵 세포 내에서 전사 활성인 프로모터 서열에 상류 (그의 5')에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 긴장성 인핸서-결합 단백질 (TonEBP)-반응성 전사 인핸서 서열을 제공한다. 추가의 인핸서 서열이 또한 본 발명의 삼투-반응성 전사 조절 요소 (OR-TRE)에 작동가능하게 연결될 수 있다.
진핵 세포, 예를 들어, 포유동물 세포에서 작동가능한 임의의 전사 조절 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서 서열이 본 발명을 실시하기 위해 사용될 수 있고, 예를 들어 본 발명의 핵산 구축물에 사용될 수 있다. 예를 들어, 또 다른 실시양태에서 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 프로모터는 최소 프로모터 ("코어 (core) 프로모터"로도 불림), 유도성 프로모터, 또는 구성적 프로모터이다. 전사 조절 서열, 예를 들어, 프로모터 및 인핸서 서열은 프로모터에서 전사를 개시하는 RNA 중합효소가 코딩 서열을 RNA, 예를 들어 mRNA로 전사할 때 전사되는 서열, 예를 들어, 단백질 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 것이다. 한 실시양태에서, 본원에서 사용되는 프로모터는 전사되는 핵산 또는 유전자의 상류에 (즉, 센스 가닥의 5' 영역에) 위치하는, 핵산, 예를 들어 DNA 또는 유전자의 (내의) 조절 영역이고, 따라서, 프로모터는 핵산 또는 유전자의 전사를 개시한다 (허용한다).
또 다른 실시양태에서, 전사 조절 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서 서열은 프로모터 또는 인핸서가 전사되는 서열에 가깝지 (인접하지) 않을 경우에도, 전사되는 서열, 예를 들어, 단백질 코딩 서열, 또는 조절 핵산, 예를 들어 억제, 안정화 또는 상향-조절 핵산 분자, 또는 안티센스 또는 다른 억제성 서열 (예를 들어 miRNA 또는 siRNA)에 "작동가능하게 연결된" 것일 수 있다; 즉, 전사 조절 서열 (예를 들어, 인핸서, 예를 들어 AP-1 또는 TonEBP-반응성 전사 인핸서로서)이 전사되는 서열까지의 (서열에 대해 위치하는) 거리 (예를 들어, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 또는 500개 또는 그 초과의 잔기)에 대한 제한은 존재하지 않고, 구축물 상의 그의 배치 (구축물에 또는 그 내부의)에 대한 제한이 존재하지 않고; 일부 실시양태에서는, 전사 조절 서열이 전사되는 서열에 대해 시스 (cis) 형태이지만, 다른 측면에서는 전사되는 서열에 트랜스 (trans) 형태이다.
또 다른 실시양태에서, 전사 조절 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서 서열 (예를 들어, AP-1 또는 TonEBP-반응성 전사 인핸서)은 전사되는 서열에 센스 또는 안티센스 배향으로, 또는 전사되는 서열에 동일한 가닥 또는 반대쪽 가닥 상에 존재할 수 있다.
임의의 최소 프로모터, 예를 들어 전사를 적합하게 개시하기 위해 요구되는 프로모터 서열 또는 모티프의 최소 부분인 코어 프로모터 또는 최소 프로모터가 사용될 수 있다. 한 측면에서, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 최소 또는 코어 프로모터는 인간 CMV 프로모터의 단편이거나 이 단편을 포함하고; 최소 프로모터 (코어 프로모터) 및 이를 확인하고 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Baliga (2001) Biol. Proceed. Online 3:64-69]; [Hettiarachchi (2003) Nucleic Acids Res. 31(18):5256-5265] 참조). 예를 들어, TATA 박스를 함유하고 -90 위치에서 전사 출발 부위 +1까지 연장되는 CaMV 35S 프로모터의 도메인 A의 일부가 "최소 프로모터"로서 사용될 수 있다. RNA 중합효소 II의 결합 부위인 TATA 박스와는 별도록, 상기 최소 프로모터는 적어도 3개의 CAAT-유사 박스를 함유하고, 이 서열은 상류 서열의 활성을 강화하고 프로모터 활성의 효율에 영향을 준다. 한 측면에서, 상기 CAAT-유사 박스는 단독으로 사용되거나 본 발명의 구축물의 발현을 유도하기 위해 이종성 프로모터 영역에 부착된다. 본 발명을 실시하기 위해 사용될 수 있는 다른 예시적인 "최소 프로모터"는 예를 들어 문헌 [Bassel-Duby (1992) Mol. Cell Biol. 12(11): 5024-5032]에 기재된 CCCACCCCC (CCAC 박스) 서열을 포함하는 프로모터; 또는 예를 들어 문헌 [Juven-Gershon (2008) Curr. Opin. Cell Biol. 20(3):253-9. Epub 2008 Apr 22]; [Juven-Gershon (2006) Biochem. Soc. Trans. 34(Pt 6):1047-50]에 기재된 RNA 중합효소 II 코어 프로모터; 또는 미오신 중쇄 유전자로부터의 최소 프로모터 (-164 내지 +16) (예를 들어, [Smith (1998) Am. J. Physiol. 274(5 Pt 1):C1188-95] 참조)를 포함한다.
본 발명을 실시하기 위해 사용될 수 있는 예시적인 진핵 프로모터는 CMV 극초기, HSV 티미딘 키나제, 초기 및 후기 SV40, 레트로바이러스로부터의 LTR, 마우스 메탈로티오네인 I, 열 쇼크 프로모터, 초기 및 후기 SV40 프로모터, 레트로바이러스로부터의 LTR, 및 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터를 포함한다. 원핵 또는 진핵 세포 또는 그들의 바이러스에서 유전자의 발현을 제어하는 것으로 알려진 임의의 프로모터도 사용될 수 있다. 본 발명을 실시하기 위해 사용될 수 있는 프로모터는 또한 이. 콜라이 (E. coli) lac 또는 trp 프로모터, lacI 프로모터, lacZ 프로모터, T3 프로모터, T7 프로모터, gpt 프로모터, 람다 PR 프로모터, 람다 PL 프로모터, 해당 효소, 예를 들어 3-포스포글리세레이트 키나제 (PGK)를 코딩하는 오페론으로부터의 프로모터 및 산 포스파타제 프로모터; 진균 프로모터 등을 포함한다.
본 발명을 실시하기 위해 사용될 수 있는 예시적인 식물 프로모터는 유도성 및 구성적 프로모터, 예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 전사 개시 영역, 아그로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)의 T-DNA로부터 유도된 1'- 또는 2'- 프로모터와 같은 구성적 프로모터; 및/또는 예를 들어 식물 호르몬, 예를 들어 옥신에 노출시에 유도성 프로모터; 및 공지의 식물 유전자로부터의 다른 전사 개시 영역을 모두 포함한다.
또한, 원핵 또는 진핵 세포 또는 그들의 바이러스에서 유전자의 발현을 제어하는 것으로 알려진 임의의 인핸서 및/또는 프로모터가 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본원에서 사용되는 바와 같이 인핸서는 활성화인자, 또는 인핸서 결합 단백질로 언급될 수 있는 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산, 예를 들어 DNA의 짧은 영역이다. 한 측면에서, 상기 인핸서 영역에 대한 활성화인자의 결합은 단백질 코딩 서열, 예를 들어, 유전자의 전사를 개시하거나, 프로모터의 활성에 영향을 미칠 (개시, 중지, 증가 또는 감소시킬) 수 있다. 인핸서에 의해 영향받거나 또는 인핸서에 "작동가능하게 연결된" 프로모터 및/또는 유전자는 인핸서로부터 상당히 먼 거리에 위치할 수 있거나, 또는 심지어 상이한 벡터 또는 염색체 상에 위치할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 프로모터에 대해 인핸서에 의해 초래되는 전사의 증가 또는 감소는 전사에 필요한 다른 단백질, 예를 들어 RNA 또는 DNA 중합효소의 결합을 향상시킬 수 있는 추가의 "전사 인자"를 직접 또는 간접적으로 프로모터 상의 인핸서에 동원하는, 인핸서에 결합된 활성화인자에 의한 것일 수 있다.
한 측면에서, 진핵 세포에서 발현된 본 발명의 발현 카세트, 벡터, 재조합 바이러스, 플라스미드, 파지, 파지미드, 인공 염색체 및 클로닝 벡터는 발현 수준을 증가시키기 위해 추가의 인핸서를 함유할 수 있다. 인핸서는 그의 전사를 증가시키기 위해서 프로모터에 대해 작용하는, 대체로 길이가 약 10 내지 약 300 bp인 DNA의 시스 작용 (cis-acting) 요소이다. 그 예는 복제 기점 하류 쪽의 SV40 인핸서 (bp 100 내지 270), 시토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점 하류 쪽의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 또한 SV40 바이러스 복제 기점을 포함하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 얻는다 ([Fiers et al., Nature, 273:113 (1978)]; [Mulligan and Berg, Science, 209:1422-1427 (1980)]; [Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:7398-7402 (1981)]). 인간 시토메갈로바이러스의 극초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 얻는다 (Greenaway et al., Gene, 18:355-360 (1982)). 소 파필로마 바이러스를 벡터로서 사용하는 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템은 미국 특허 4,419,446에 기재되어 있다. 이 시스템의 변형은 미국 특허 4,601,978에 기재되어 있다. 또한, 원숭이 세포에서 면역 인터페론을 코딩하는 cDNA의 발현에 대해서는 문헌 [Gray et al., Nature, 295:503-508 (1982)]을 참고하고, 단순 포진 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 조절 하에 마우스 세포에서 인간 β-인터페론 cDNA의 발현에 대해서는 문헌 [Reyes et al., Nature 297: 598-601 (1982)]을 참조하고, 배양된 마우스 및 토끼 세포에서 인간 인터페론 β1 유전자의 발현에 대해서는 문헌 [Canaani (1982) Proc. Natl Acad. Sci. USA 79:5166-5170]을 참조하고, 프로모터로서 라우스 (Rous) 육종 바이러스 긴 말단 반복체를 사용하여 CV-1 원숭이 신장 세포, 닭 배아 섬유모세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포, HeLa 세포, 및 마우스 NIH-3T3 세포에서 세균 CAT 서열을 발현하는 것에 대해서는 문헌 [Gorman (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777-6781]을 참조한다.
재조합 척추동물 세포 배양에서 관심있는 폴리펩티드의 합성에 적용하기 적합한 다른 방법, 벡터, 및 숙주 세포는 문헌 [Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981)]; [Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979)]; EP 117,060 및 EP 117,058 (Levinson et al.)에 기재되어 있다. 한 실시양태에서, 임의의 핵산 또는 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 조성물의 포유동물 세포 배양 발현을 위해 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 플라스미드는 pRK5 (EP 특허 공개 307,247) 또는 pSVI6B (1991년 6월 13일 공개된 PCT 공개 WO 91/08291)이다.
발현 벡터 및 클로닝 비히클
본 발명은 본 발명의 핵산 (본 발명의 삼투-반응성 전사 조절 요소 (OR-TRE) 포함), 및/또는 본 발명의 삼투-조절 핵산을 포함하는 본 발명의 삼투-반응성 핵산을 포함하는 발현 카세트, 벡터, 재조합 바이러스, 플라스미드, 파지, 파지미드, 인공 염색체 및 클로닝 벡터를 제공한다. 바이러스 입자, 바큘로바이러스, 파지, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 포스미드 (fosmid), 세균 인공 염색체, 바이러스 DNA (예를 들어, 우두, 아데노바이러스, 계두 바이러스, 위광견병 및 SV40의 유도체), P1계 인공 염색체, 효모 플라스미드, 효모 인공 염색체, 및 관심있는 특이적 숙주 (예를 들어 포유동물 세포)에 특이적인 임의의 다른 벡터가 본 발명을 실시하기 위해 사용될 수 있다. 한 측면에서, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 발현 카세트, 벡터, 재조합 바이러스, 플라스미드, 파지, 파지미드, 인공 염색체 및 클로닝 벡터는 염색체, 비-염색체 및 합성 DNA 서열을 포함할 수 있다. 매우 많은 적합한 벡터가 당업자에게 알려져 있고, 상업적으로 이용가능하다.
예시적인 벡터는 진핵 벡터, 예를 들어 pXT1, pSG5 (스트라타진 (Stratagene)), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40 (파마시아 (Pharmacia))를 포함한다. 그러나, 임의의 다른 플라스미드 또는 다른 벡터도 숙주에서 복제가능하고 생존가능하다면 사용될 수 있다. 저 카피수 또는 고 카피수 벡터가 본 발명에서 사용될 수 있다.
본 발명을 실시하기 위해 사용되는 발현 카세트, 벡터, 재조합 바이러스, 플라스미드, 파지, 파지미드, 인공 염색체 및 클로닝 벡터는 프로모터, 번역 개시를 위한 리보좀 결합 부위 및 전사 종결자를 포함할 수 있고; 발현을 증폭하기 위한 적절한 서열을 또한 포함할 수 있다. 포유동물 발현 벡터는 복제 기점, 임의의 필요한 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 (splice) 공여자 및 수용자 부위, 전사 종결 서열, 및 5' 인접 비-전사 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, SV40 스플라이스로부터 유도된 DNA 서열 및 폴리아데닐화 부위를 사용하여 요구되는 비-전사 유전자 요소를 제공할 수 있다.
한 측면에서, 발현 벡터는 2개의 유기체에서, 예를 들어 발현을 위한 포유동물 또는 곤충 세포에서 및 클로닝 및 증폭을 위한 원핵 숙주에서 벡터가 유지되도록 하는 2 복제 시스템을 가질 수 있다. 또한, 발현 벡터의 통합을 위해, 발현 벡터는 숙주 세포 게놈에 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 발현 구축물의 측면에 인접하는 2개의 상동성 서열을 포함할 수 있다. 통합 벡터는 벡터에 포함시키기 위한 적절한 상동성 서열을 선택함으로써 숙주 세포 내의 특이적인 로커스로 유도될 수 있다.
벡터 통합을 위한 구축물은 당업계에 공지되어 있다. 예시적인 진핵 프로모터는 CMV 극초기, HSV 티미딘 키나제, 초기 및 후기 SV40, 레트로바이러스로부터의 LTR 및 마우스 메탈로티오네인-I를 포함한다. 적절한 벡터 및 프로모터의 선택은 당업자의 기술 수준에서 잘 수행할 수 있다. 발현 벡터는 또한 번역 개시를 위한 리보좀 결합 부위 및 전사 종결자를 포함한다. 또한, 벡터는 발현을 증폭하기 위한 적절한 서열을 포함할 수 있다. 프로모터 영역은 클로람페니콜 트랜스퍼라제 (CAT) 벡터 또는 선택가능한 마커가 존재하는 다른 벡터를 사용하여 임의의 요구되는 유전자로부터 선택될 수 있다. 또한, 발현 벡터는 바람직하게는 형질전환된 숙주 세포의 선택을 위한 표현형 특질, 예를 들어 진핵 세포 배양을 위한 디히드로폴레이트 리덕타제 또는 네오마이신 내성, 또는 이. 콜라이에서 테트라시클린 또는 암피실린 내성을 제공하는 하나 이상의 선택가능한 마커 유전자를 포함한다.
또한, 포유동물 발현 벡터는 복제 기점, 임의의 필요한 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여자 및 수용자 부위, 전사 종결 서열 및 5' 인접 비-전사 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, SV40 스플라이스로부터 유도된 DNA 서열 및 폴리아데닐화 부위를 사용하여 요구되는 비-전사 유전자 요소를 제공할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명의 핵산, 예를 들어, 본 발명의 삼투-반응성 전사 조절 요소 (OR-TRE), 및/또는 삼투-반응성 핵산을 포함하는 핵산은 에피좀성이거나 또는 세포, 예를 들어, 배양할 세포의 게놈 내로 안정하게 통합된다.
본 발명의 핵산 구축물의 안정한 통합을 위해, 임의의 적합한 담체 또는 비히클, 예를 들어 의사형 (pseudotyped) 렌티바이러스 벡터를 설명하고 있는 USPN 7,311,907; 7,262,049; 세포 성장을 향상시키고 렌티바이러스-감염 숙주 세포를 함유하는 세포 배양액의 밀도를 증가시키는 방법을 설명하고 있는 USPN 7,250,299; 7,226,780; 7,220,578; 7,211,247; 7,160,721; USPN 7,078,031; 7,070,993; 7,056,699; 6,955,919에 기재된 바와 같은 렌티바이러스 벡터 및/또는 패키징 시스템이 사용될 수 있으며, 이들은 본 발명을 실시하기 위해 사용될 수 있는 극히 소수의 벡터 및 패키징 시스템을 제시하고 있다.
본 발명의 핵산 구축물의 에피좀성 전달을 위해, 임의의 적합한 담체 또는 비히클, 예를 들어 USPN 7,294,505에 기재된 안정한 핵 에피좀성 벡터; USPN 6,808,923에 기재된 요구되는 유전자의 에피좀성 복제를 위한 렌티바이러스 벡터 시스템; USPN 6,797,494에 기재된 조직-특이적 유전자 발현을 위한 에피좀성 발현 벡터; USPN 6,605,281에 기재된 에피좀성 형질도입 인간 유두종바이러스 벡터; USPN 6,479,279 또는 6,410,314에 기재된 에피좀성 벡터가 사용될 수 있고, 이들은 본 발명을 실시하기 위해 사용될 수 있는 극히 소수의 벡터 및 패키징 시스템을 제시하고 있다.
본 발명을 실시하기 위해 사용될 수 있는 다른 발현 카세트, 벡터, 재조합 바이러스, 플라스미드, 파지, 파지미드, 인공 염색체 또는 클로닝 벡터 및 시스템은 예를 들어 USPN 7,371,570에 기재된 복제-전능성 아데노바이러스 벡터; USPN 7,348,178에 기재된 아데노바이러스 (Ad) 기반 트랜스-패키징 시스템; USPN 7,323,177; 7,319,033; 7,318,919; 또는 7,306,793에 기재된 아데노바이러스를 포함하고, 본 발명을 실시하기 위해 사용될 수 있는 극히 소수의 벡터 및 패키징 시스템을 제시하고 있다.
마커 유전자
한 측면에서, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 발현 카세트, 벡터, 재조합 바이러스, 플라스미드, 파지, 파지미드, 인공 염색체 및 클로닝 벡터는 본 발명의 핵산을 포함하는 숙주 세포, 예를 들어, 포유동물 세포의 선택을 허용하는 하나 이상의 선택가능한 마커 유전자를 포함한다.
예시적인 선택가능한 마커는 디히드로폴레이트 리덕타제를 코딩하는 유전자 또는 진핵 세포 배양을 위해 네오마이신 내성을 부여하는 유전자, 테트라시클린 또는 암피실린 내성을 부여하는 유전자를 포함한다. 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 발현 카세트, 벡터, 재조합 바이러스, 플라스미드, 파지, 파지미드, 인공 염색체 및 클로닝 벡터는 또한 형질전환된 세포의 선택을 허용하는 선택가능한 마커 유전자, 예를 들어 세균을 약물, 예를 들어 암피실린, 클로람페니콜, 에리트로마이신, 카나마이신, 네오마이신 및 테트라시클린에 대해 내성으로 만드는 유전자를 포함할 수 있다. 또한, 선택가능한 마커는 히스티딘, 트립토판 및 류신 생합성 경로에서와 같은 생합성 유전자를 포함할 수 있다.
한 측면에서, 형질감염된 세포를 확인하는 능력을 개선하기 위해서, 하나 이상의 선택가능한 또는 스크리닝가능한 마커 핵산이 관심있는 발현가능 유전자로서 또는 그에 추가로 사용된다. "마커 유전자" 또는 "마커 핵산"은 마커 유전자/핵산을 발현하는 세포에 특유한 표현형을 부여하여, 형질감염된 세포를 마커를 갖지 않는 세포와 구분되도록 하는 핵산이다.
"마커 유전자" 또는 "마커 핵산"은, 마커가 화학적 수단에 의해, 즉, 선택제 (예를 들어 항생제 등)의 사용을 통해 "선택"할 수 있는 특질을 부여하는지, 또는 단순히 관찰 또는 시험, 즉 "스크리닝"에 의해 확인할 수 있는 특질인지에 따라 선택가능한 또는 스크리닝가능한 마커를 코딩할 수 있다. 예를 들어, 녹색 형광 단백질 또는 임의의 다른 형광 단백질, 루시퍼라제 종류의 생체발광 단백질 등이 사용될 수 있다. 적합한 마커 유전자의 많은 예는 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 실시에 사용될 수 있다.
"마커 유전자" 또는 "마커 핵산"은 또한 그 분비가 형질감염된 세포를 확인하거나 선택하는 수단으로서 검출될 수 있는 "선택가능한 마커"를 코딩할 수 있다. 그 예는 항체 상호작용에 의해 확인될 수 있는 선택가능한 항원, 또는 심지어 그 촉매 활성에 의해 검출될 수 있는 선택가능한 효소를 코딩하는 마커를 포함한다. 선택가능한 단백질은 예를 들어 ELISA에 의해 검출가능한 작은 확산가능 단백질; 세포외 용액에서 검출가능한 작은 활성 효소 (예를 들어, 분비된 알칼린 포스파타제, 분비된 루시퍼라제, 바실러스 스테아로테르모필루스 (Bacillus stearothermophilus)-유래 분비된 a-아밀라제 (SAMY), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)-유래 크실라나제 유도체) 및 막 결합된 또는 일시적으로 막 결합된 단백질을 비롯하여 많은 클래스로 분류된다. 임의의 선택가능한 마커가 본 발명을 실시하기 위해 사용될 수 있고, 세포 형질감염, 예를 들어 포유동물 세포 형질감염에 적합한 선택가능한 마커가 당업계에 공지되어 있다. 그러한 마커는 다음을 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다: 아데노신 데아미나제, 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 (네오마이신과 조합됨), 블레오마이신 내성 유전자 (플레오마이신 또는 블레오마이신 또는 제오신과 조합됨), 시토신 데아미나제 (N-(포스폰아세틸)-L-아스파르테이트, 이노신, 및 시토신과 조합됨), 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) (메토트렉세이트와 조합됨), 히스티디놀 데히드로게나제 (히스티디놀과 조합됨), 히그로마이신-B-포스포트랜스퍼라제 (히그로마이신과 조합됨), 티미딘 키나제 및 잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제. 아데노신 데아미나제 마커를 사용할 때, 유전자를 포함하는 세포는 저농도의 ADA 억제제 2'-데옥시코포르마이신와 세포독성 농도의 아데노신 또는 그의 유사체 9-β-D-자일로푸라노실 아데닌의 존재 하에서의 성장에 의해 선택될 수 있다.
숙주 세포 및 형질전환된 세포
본 발명은 또한 본 발명의 핵산 구축물, 예를 들어, 본 발명의 삼투-반응성 전사 조절 요소 (OR-TRE), 또는 본 발명의 삼투-반응성 또는 삼투-조절 핵산을 포함하는 형질전환된 또는 형질감염된 세포를 제공한다. 숙주 세포는 원핵 세포, 진핵 세포, 예를 들어 세균 세포, 진균 세포, 효모 세포, 포유동물 세포, 곤충 세포, 또는 식물 세포를 비롯하여 당업자에게 잘 알려진 임의의 숙주 세포일 수 있다. 예시적인 세균 세포는 속 에셔리키아 (Escherichia), 바실러스, 스트렙토미세스 (Streptomyces), 살모넬라 (Salmonella), 슈도모나스 (Pseudomonas) 및 스타필로코커스 (Staphylococcus) 내의 임의의 종, 예를 들어, 에셔리키아 콜라이, 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens)를 포함한다. 예시적인 진균 세포는 아스페르길루스 (Aspergillus)의 임의의 종을 포함한다. 예시적인 효모 세포는 피키아 (Pichia), 사카로미세스 (Saccharomyces), 쉬조사카로미세스 (Schizosaccharomyces), 또는 쉬바니오미세스 (Schwanniomyces)의 임의의 종, 예를 들어 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris), 사카로미세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 또는 쉬조사카로미세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe)를 포함한다. 예시적인 곤충 세포는 스포돕테라 (Spodoptera) 또는 드로소필라 (Drosophila)의 임의의 종, 예를 들어 드로소필라 S2 및 스포돕테라 Sf9를 포함한다. 예시적인 동물 세포는 CHO, COS 또는 Bowes 흑색종 또는 임의의 마우스 또는 인간 세포주를 포함한다. 적절한 숙주는 당업자가 용이하게 선택할 수 있다. 매우 다양한 고등 식물 종의 형질전환 기술은 당업계에 공지되어 있고, 기술 및 학술 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Weising (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477]; USPN 5,750,870을 참조한다.
본 발명의 발현 카세트, 벡터, 재조합 바이러스, 플라스미드, 파지, 파지미드, 인공 염색체 또는 클로닝 벡터는 형질전환, 형질감염, 형질도입, 바이러스 감염, 유전자 총, 또는 Ti-매개 유전자 전달을 비롯한 임의의 다양한 기술을 사용하여 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 특정 방법은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염, 리포펙션, 또는 전기천공을 포함한다 (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).
한 측면에서, 본 발명의 구축물은 스크리닝을 위해 세포 내로 도입되고, 따라서, 핵산은 핵산의 후속 발현에 적합한 방식으로 세포에 도입된다. 도입 방법은 주로 표적 세포 종류에 의해 결정된다. 예시적인 방법은 CaPO4 침전, 리포좀 융합, 리포펙션 (lipofection) (예를 들어, LIPOFECTIN™), 전기천공, 바이러스 감염 등을 포함한다. 본 발명의 구축물은 숙주 세포의 게놈 내로 안정하게 통합될 수 있거나 (예를 들어, 레트로바이러스 도입을 이용하여), 또는 예를 들어 표준 조절 서열, 선택 마커 등을 이용하는 전통적인 플라스미드의 사용을 통해 세포질 내에 일시적으로 또는 안정적으로 존재할 수 있다.
적절한 경우에, 본 발명의 조작된 숙주 세포는 프로모터를 활성화시키거나, 형질감염체를 선택하거나, 본 발명의 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양될 수 있다. 적합한 숙주 균주의 형질전환 및 숙주 균주의 적절한 세포 밀도로의 성장 후에, 선택된 프로모터는 적절한 수단 (예를 들어, 온도 변화 또는 화학적 유도)에 의해 유도될 수 있고, 세포는 요구되는 재조합 폴리펩티드를 생산하도록 허용하는 추가의 기간 동안 배양될 수 있다.
본 발명의 구축물을 함유하는 숙주 세포는 프로모터를 활성화시키거나, 형질감염체를 선택하거나, 유전자를 증폭시키기 위해 적합하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양될 수 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 대해 이전에 사용된 것일 수 있고, 당업자에게 자명할 것이다.
형질감염 방법, 예를 들어, CaPO4 및 전기천공이 당업자에게 알려져 있다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 상기 세포에 적절한 표준 기술을 사용하여 수행된다. 문헌 [Sambrook et al., 1989, 상기 문헌]에 기재된 바와 같은 염화칼슘을 사용한 칼슘 처리, 또는 전기천공은 일반적으로 원핵세포 또는 실질적인 세포-벽 장벽을 포함하는 다른 세포에 대해 사용된다. 상기 세포벽이 없는 포유동물 세포의 경우에는, 문헌 [Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)]의 칼슘 포스페이트 침전 방법이 사용될 수 있다. 포유동물 세포 숙주 시스템 형질전환의 일반적인 측면은 미국 특허 4,399,216에 기재되어 있다. 효모 내로의 형질전환은 일반적으로 문헌 [Van Solingen et al., J. Bact, 130:946 (1977)] 및 [Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)]의 방법에 따라 수행된다. 그러나, 핵 미세주사, 전기천공, 무손상 세포와의 세균 원형질체 융합, 또는 다가양이온, 예를 들어, 폴리브렌 또는 폴리오미틴에 의한 것과 같은 DNA를 세포 내로 도입하기 위한 다른 방법도 사용될 수 있다. 포유동물 세포의 형질전환을 위한 다양한 기술에 대해서는, 문헌 [Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)] 및 [Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988)]을 참조한다.
조절 핵산 서열
한 실시양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 조절 핵산, 예를 들어, 억제, 안정화 또는 상향-조절 핵산 분자를 포함하는 삼투-반응성 및 삼투-조절 핵산을 제공한다. 한 실시양태에서, 유전자 메시지, 예를 들어, 유즙분비 유전자 또는 유즙분비 유전자 메시지를 표적화하는 서열이 사용된다. 한 실시양태에서, 서열은 억제성이고, 예를 들어 짧은 간섭 RNA (siRNA), 마이크로RNA (miRNA), 안티센스 RNA 및/또는 리보자임 활성을 갖는 RNA를 포함한다. 따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 유전자, 메시지 (mRNA) 또는 단백질의 발현 및/또는 활성을 증가, 향상, 감소 또는 제거하기 위해 유전자, 메시지 (mRNA) 또는 단백질을 "표적화"할 수 있는 핵산을 포함하는 조절 (억제, 안정화 또는 상향-조절) 핵산의 용도를 제공한다.
한 실시양태에서, 상기 조절 (예를 들어, 억제성) 핵산은 예를 들어 천연 뉴클레오티드의 공지의 유사체를 포함하는 올리고뉴클레오티드, 천연 생성 핵산, 합성 핵산, 및/또는 재조합 핵산이다. 본 발명은 합성 백본을 갖는 핵산-유사 구조의 사용을 포함한다 (예를 들어, [Mata (1997) Toxicol. Appl Pharmacol 144:189-197]; [Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692-8698]; [Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156] 참조). 본 발명은 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 조절 핵산 (억제, 안정화 또는 상향조절) 데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) 또는 리보뉴클레오티드 (RNA)의 용도를 제공한다. 본 발명은 천연 뉴클레오티드의 공지의 유사체를 포함하는 핵산의 용도를 제공한다. 본 발명은 포스포디에스테르 연결을 통해 DNA 부분에 접합된 2'-O-알킬 치환체를 보유하는 RNA 부분을 포함하는 조절 (예를 들어, 억제성) 혼합 올리고뉴클레오티드의 용도를 제공한다 (예를 들어, USPN 5,013,830 참조). 본 발명은 합성 백본을 갖는 핵산-유사 구조의 용도를 제공한다. 본 발명에 의해 제공되는 DNA 백본 유사체는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트, 알킬 포스포트리에스테르, 술파메이트, 3'-티오아세탈, 메틸렌 (메틸이미노), 3'-N-카르바메이트, 모르폴리노 카르바메이트, 및 펩티드 핵산 (PNA)을 포함한다 ([Oligonucleotides and Analogues, a Practical Approach, edited by F. Eckstein, IRL Press at Oxford University Press (1991)]; [Antisense Strategies, Annals of the New York Academy of Sciences, Volume 600, Eds. Baserga and Denhardt (NYAS 1992)]; [Milligan (1993) J. Med. Chem. 36:1923-1937]; [Antisense Research and Applications (1993, CRC Press)] 참조). 본 발명은 비-이온성 백본, 예를 들어 N-(2-아미노에틸) 글리신 단위를 포함하는 PNA의 용도를 제공한다. 포스포로티오에이트 연결은 예를 들어 USPN 6,031,092; 6,001,982; 5,684,148에 기재되어 있고; 또한, WO 97/03211; WO 96/39154; [Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197]을 참조한다. 본 발명의 핵산에 사용되는 다른 합성 백본은 메틸-포스포네이트 연결 또는 교대하는 메틸포스포네이트 및 포스포디에스테르 연결 (예를 들어, USPN 5,962,674; [Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692-8698] 참조), 및 벤질포스포네이트 연결 (예를 들어, USPN 5,532,226; [Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156] 참조)을 포함한다. 본 발명은 유전자, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, cDNA, mRNA, 올리고뉴클레오티드 프라이머, 프로브 및 증폭 산물을 포함하는 조절 (예를 들어, 억제성) 핵산의 용도를 제공한다.
본 발명의 핵산은 유전자 발현 패턴에 영향을 주는 기능을 하지만 단백질로 번역되지 않는 RNA 전사체를 발현시키기 위해 진핵 (예를 들어, 포유동물) 세포 내로 도입될 수 있다. 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 예시적인 조절 (예를 들어, 억제성) 핵산은 짧은 간섭 RNA (siRNA) 및 마이크로RNA (miRNA), 안티센스 RNA 및 리보자임 활성을 갖는 RNA를 포함하고, 이들은 천연 (내인성) 또는 도입된 (이종성) 세포 유전자, 예를 들어, 포유동물 유전자의 발현을 감소시키기거나 제거하는 기능을 수행할 수 있다.
전사될 때, 표적화된 메신저 RNA(들)의 전부 또는 일부(들)에 상보성인 조절 (예를 들어, 안티센스 또는 센스) RNA 또는 이중 가닥 RNA를 생산하는, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 유전자 및 핵산이 제조되거나 단리될 수 있다. 조절 (예를 들어, 안티센스 또는 센스) 또는 이중 가닥 RNA 또는 siRNA 또는 miRNA는 메신저 RNA의 폴리펩티드 생성물의 생성을 감소시킨다. 폴리펩티드 생성물은 포유동물 세포의 게놈에 의해 코딩되는 임의의 단백질일 수 있다.
또한, 전사될 때, 엘도리보뉴클레아제로서 작용하여 선택된 서열을 갖는 RNA 분자의 절단을 촉매할 수 있는 RNA 효소, 또는 리보자임을 생산하는, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 유전자 및 핵산이 제조되거나 단리될 수 있다.
선택된 메신저 RNA의 절단은 그의 코딩되는 폴리펩티드 생성물의 생산을 감소시킬 수 있다. 상기 조절 (예를 들어, 억제성) 핵산은 신규한 포유동물 세포주의 제조에 사용될 수 있고; 이들 포유동물 세포주는 안티센스 또는 간섭 RNA에 의해 영향을 받을 수 있는 본원에서 언급되는 폴리펩티드를 포함하고 이로 제한되지 않는 감소된 수준의 폴리펩티드를 발현할 수 있다.
임의의 특정 실시양태에서, 예를 들어 생물반응기, 임플란트, 세포 배양액에서 사용되거나, 재조합 단백질로서 발현되는 등의 조절 (예를 들어, 억제 또는 상향조절) 핵산의 최적 길이 및 농도는 통상적인 방법 및 스크리닝 시스템을 사용하여 결정될 수 있다. 최적 길이 및 농도의 설계를 위한 전략은 학술 및 특허 문헌에 잘 설명되어 있고, 당업자는 통상적인 방법 및 스크리닝 시스템을 사용하고 본 발명의 신규한 시약을 이용하여 조절 (예를 들어, 억제 또는 상향조절) 핵산, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드를 설계할 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드
본 발명은 유전자 메시지를 표적화하는 적어도 하나의 서열, 예를 들어 유즙분비 유전자 또는 유즙분비 유전자 메시지를 표적화하는 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 설계하기 위한 전략은 학술 및 특허 문헌에 잘 설명되어 있고, 당업자는 본 발명의 신규한 시약을 사용하여 단백질 코딩 (예를 들어, 유즙분비 단백질-코딩) 올리고뉴클레오티드를 설계할 수 있다. 예를 들어, 효과적인 안티센스 올리고뉴클레오티드를 스크리닝하기 위한 유전자 워킹 (walking)/RNA 맵핑 (mapping) 프로토콜은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 효능있는 안티센스 서열 선택을 위한 쉽고 신뢰가능한 방법을 제공하기 위해 표준 분자 기술을 기초로 한 RNA 맵핑 분석을 설명하고 있는 문헌 [Ho (2000) Methods Enzymol. 314:168-183] 참조). 또한, 문헌 [Smith (2000) Eur. J. Pharm. Sci. 11:191-198]을 참조한다.
한 실시양태에서, 천연 생성 핵산은 조절 (예를 들어, 억제 또는 상향조절) 핵산 올리고뉴클레오티드로서 사용된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 임의의 길이일 수 있고; 예를 들어, 다른 측면에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 약 5 내지 100, 약 10 내지 80, 약 15 내지 60, 약 18 내지 40이다. 최적 길이는 통상적인 스크리닝에 의해 결정될 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 임의의 농도로 존재할 수 있다. 최적 농도는 통상적인 스크리닝에 의해 결정될 수 있다. 이와 같은 잠재적인 문제를 처리할 수 있는 매우 다양한 합성, 비-천연 생성 뉴클레오티드 및 핵산 유사체가 알려져 있다. 예를 들어, 비-이온성 백본, 예를 들어 N-(2-아미노에틸) 글리신 단위를 포함하는 펩티드 핵산 (PNA)이 사용될 수 있다. 또한, WO 97/03211; WO 96/39154; 문헌 [Mata (1997) Toxicol Appl Pharmacol 144:189-197]; [Antisense Therapeutics, ed. Agrawal (Humana Press, Totowa, N.J., 1996)]에 기재된 바와 같이 포스포로티오에이트 연결을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드도 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 의해 제공되는 합성 DNA 백본 유사체를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 상기한 바와 같은 포스포로-디티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트, 알킬 포스포트리에스테르, 술파메이트, 3'-티오아세탈, 메틸렌(메틸이미노), 3'-N-카르바메이트, 및 모르폴리노 카르바메이트 핵산을 포함할 수 있다.
조합 화학 방법은 임의의 표적, 예를 들어 본 발명의 센스 및 안티센스 크실라나제, 만나나제 및/또는 글루카나제 서열에 대한 적절한 결합 친화도 및 특이성을 갖는 특이적인 올리고뉴클레오티드에 대해 신속하게 스크리닝될 수 있는 매우 많은 올리고뉴클레오티드를 생성하기 위해 사용될 수 있다 (예를 들어, [Gold (1995) J. of Biol. Chem. 270:13581-13584] 참조).
조절성 리보자임
본 발명은 예를 들어 유즙분비 단백질-코딩 메시지에 결합할 수 있는, 전사체 (메시지)를 절단할 수 있는 리보자임을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 리보자임은 예를 들어 mRNA를 표적화함으로써 단백질 활성, 예를 들어, 유즙분비 단백질 활성을 조절 (예를 들어, 억제)할 수 있다. 리보자임을 설계하고 표적화를 위해 유즙분비 단백질 특이적 안티센스 서열을 선택하기 위한 전략은 학술 및 특허 문헌에 잘 설명되어 있고, 당업자는 본 발명의 신규한 시약을 사용하여 상기 리보자임을 설계할 수 있다. 리보자임은 표적 RNA를 절단하는 RNA의 효소 활성 부분에 매우 근접하여 유지되는 리보자임의 표적 RNA 결합 부분을 통해 표적 RNA에 결합함으로써 작용한다. 따라서, 리보자임은 상보성 염기 페어링을 통해 표적 RNA를 인식하여 결합하고, 정확한 부위에 결합한 후에, 표적 RNA를 효소 활성에 의해 절단하고 불활성화시킨다. 상기 방식으로 표적 RNA를 절단하면, 절단이 코딩 서열 내에서 발생할 경우 코딩되는 단백질의 합성을 지시하는 표적 RNA의 능력이 파괴될 것이다. 리보자임이 그의 RNA 표적에 결합하여 이를 절단한 후, 리보자임은 그 RNA로부터 방출되어 새로운 표적에 반복적으로 결합하고 절단할 수 있다.
일부 상황에서, 리보자임의 효소 특성은 다른 기술, 예를 들어 안티센스 기술 (여기서, 핵산 분자는 그의 전사, 번역 또는 다른 분자와의 회합을 차단하기 위해 핵산 표적에 단순히 결합함)보다 유리할 수 있고, 이것은 치료 처리의 효과에 필요한 리보자임의 효과적인 농도가 안티센스 올리고뉴클레오티드의 그것보다 더 낮을 수 있기 때문이다. 상기 잠재적인 잇점은 효소 활성을 통해 작용하는 리보자임의 능력을 반영한다. 따라서, 하나의 리보자임 분자가 표적 RNA의 많은 분자를 절단할 수 있다. 또한, 리보자임은 일반적으로 고특이성 억제제이고, 억제 특이성은 결합의 염기 페어링 메카니즘뿐만 아니라, 그를 통해 분자가 결합하는 RNA의 발현을 그 분자가 억제하는 메카니즘에 의해 결정된다. 즉, 억제는 RNA 표적의 절단에 의해 야기되고, 특이성은 비-표적화된 RNA의 절단 속도에 대한 표적화된 RNA의 절단 속도의 비율로 규정된다. 상기 절단 메카니즘은 염기 페어링에 관련되는 것 이외의 추가의 요인에 의존적이다. 따라서, 리보자임의 작용 특이성은 동일한 RNA 부위에 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 그것보다 더 클 수 있다.
본 발명을 실시하기 위해 사용되는 리보자입은 효소 활성의 리보자임 RNA 분자일 수 있고, 해머헤드 (hammerhead) 모티프, 헤어핀 모티프, 델타 간염 바이러스 모티프, 그룹 I 인트론 모티프 및/또는 RNA 가이드 (guide) 서열과 함께 RNaseP-유사 RNA로 형성될 수 있다. 해머헤드 모티프의 예는 예를 들어 문헌 [Rossi (1992) Aids Research and Human Retroviruses 8:183]에; 헤어핀 모티프는 문헌 [Hampel (1989) Biochemistry 28:4929], 및 [Hampel (1990) Nuc. Acids Res. 18:299]에; 델타 간염 바이러스 모티프는 문헌 [Perrotta (1992) Biochemistry 31:16]에; RNaseP 모티프는 문헌 [Guerrier-Takada (1983) Cell 35:849]에; 그룹 I 인트론은 미국 특허 4,987,071 (Cech)에 기재되어 있다. 상기 특정 모티프의 언급은 그로 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
RNA 간섭 (RNAi)
한 측면에서, 본 발명은 단백질-코딩 서열, 예를 들어 유즙분비 단백질-코딩 서열을 표적화하기 위한 RNA 조절 (예를 들어, 억제, 안정화 또는 상향-조절) 분자, 예를 들어 "RNAi" 분자를 제공한다. RNAi 분자는 이중 가닥 RNA (dsRNA) 분자, 예를 들어, siRNA, miRNA 및/또는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 분자를 포함할 수 있다. RNAi 분자, 예를 들어, siRNA (작은 억제성 RNA)는 단백질 메시지 (예를 들어, 유즙분비 단백질 메시지)의 번역을 억제하기 위해 단백질-코딩 유전자 (예를 들어, 유즙분비 단백질-코딩 유전자), 및/또는 miRNA (마이크로RNA)의 발현을 억제할 수 있다. 한 측면에서, RNAi 분자, 예를 들어, siRNA 및/또는 miRNA의 길이는 약 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29개 또는 그 초과의 이중체 뉴클레오티드이다.
본 발명은 임의의 특정 작용 메카니즘으로 제한되지 않지만, RNAi는 세포 내로 들어가, 내인성 mRNA를 포함하여 유사한 또는 동일한 서열의 단일 가닥 RNA (ssRNA)의 분해를 야기할 수 있다. 세포가 이중 가닥 RNA (dsRNA)에 노출될 경우, 상동성 유전자로부터의 mRNA는 RNA 간섭 (RNAi)으로 불리는 과정에 의해 선택적으로 분해된다. RNAi 이면의 가능한 기본적인 메카니즘은 특이적 유전자 서열에 일치하는 이중 가닥 RNA (dsRNA)가 짧은 간섭 RNA로 불리는 짧은 조각 (이는 그의 서열에 일치하는 mRNA의 분해를 촉발한다)으로 끊어지는 것이다. 한 측면에서, 본 발명의 RNAi는 유전자-침묵 치료제로 사용된다 (예를 들어, [Shuey (2002) Drug Discov. Today 7:1040-1046] 참조). 한 측면에서, 본 발명은 RNAi 분자, 예를 들어, 본 발명의 siRNA 및/또는 miRNA를 사용하여 RNA를 선택적으로 분해하는 방법을 제공한다. 방법은 시험관 내에서, 생체 외에서 또는 생체 내에서 실시될 수 있다. 한 측면에서, 본 발명의 RNAi 분자는 세포, 장기 또는 동물에서 기능 상실 돌연변이를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
조절 핵산, 예를 들어, RNAi 분자, siRNA 및/또는 miRNA를 제조하고, 이를 RNA 발현의 조절을 위해, 예를 들어 RNA의 선택적인 분해를 위해 사용하는 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, USPN 6,506,559; 6,511,824; 6,515,109; 6,489,127을 참조한다.
트랜스제닉 (transgenic) 비-인간 동물
본 발명은 예를 들어 비-인간 동물에서 삼투조절을 연구하기 위해서 본 발명의 삼투-반응성 전사 조절 요소 (OR-TRE)를 포함하는 트랜스제닉 비-인간 동물을 제공한다. 트랜스제닉 비-인간 동물은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 설계하고 생성될 수 있다; 예를 들어, 형질전환된 세포 및 난자 및 트랜스제닉 마우스, 래트, 토끼, 양, 돼지, 닭, 염소, 물고기 및 소를 제조하고 사용하는 것을 설명하는 USPN 6,211,428; 6,187,992; 6,156,952; 6,118,044; 6,111,166; 6,107,541; 5,959,171; 5,922,854; 5,892,070; 5,880,327; 5,891,698; 5,639,940; 5,573,933; 5,387,742; 5,087,571을 참조한다. 또한, 예를 들어, 트랜스제닉 낙농 동물의 젖에서 재조합 단백질의 생산을 설명하는 문헌 [Pollock (1999) J. Immunol. Methods 231:147-157], 및 트랜스제닉 염소의 생산을 예시하는 문헌 [Baguisi (1999) Nat. Biotechnol. 17:456-461]을 참조한다.
세포 배양, 임플란트 및 생물반응기
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 임의의 임플란트, 인공 장기 또는 배양 시스템, 예를 들어 생물반응기, 임플란트, 인공 장기 또는 간단한 세포 배양 플레이트, 병, 접시, 튜브 또는 플라스크에서 세포의 건강 및 생활력을 유지하기 위해 사용될 수 있다. 조성물 및 방법은 예를 들어 세포가 생성물, 예를 들어, 재조합 단백질 또는 다당류 생성물, 또는 "생산자 세포주"의 경우에 바이러스 (예를 들어, 비리온 입자) 생성물 (예를 들어, USPN 5,837,484; 6,566,118 참조), 또는 유기 분자, 예를 들어 폴리케타이드를 생산하도록 설계될 때 배양 조건에서 세포의 건강 및 생활력을 유지하기 위해 사용되고, 이것은 본 발명의 조성물 (예를 들어, 본 발명의 삼투-반응성 전사 조절 요소 (OR-TRE)를 포함하는 본 발명의 발현 카세트, 벡터, 재조합 바이러스, 플라스미드, 파지, 파지미드, 인공 염색체 또는 클로닝 벡터, 또는 임의의 키메라 (chimeric) 핵산)의 혼입에 의해 세포가 보다 건강하고 보다 생활력이 좋고, 상기 요구되는 생성물이 보다 많이 제조되기 때문이다.
본원에서 제공되는 조성물 및 방법은 또한 배양 시스템, 예를 들어, 생물반응기, 임플란트 등에서 세포에 의한 분자, 예를 들어, 재조합 단백질의 생산을 상승시키기 위해 사용될 수 있다. 한 측면에서, 본원에서 제공되는 조성물 및 방법은 최적 미만의 삼투 조건 (특정 세포 또는 배양 시스템에 대한 최적 미만의 삼투 조건) 하에서, 예를 들어, 후기 또는 치밀한 세포 배양 조건에서 관찰되는 것과 같은 고오스몰랄농도 및/또는 저오스몰랄농도의 조건 하에서 적절하게 폴딩된 또는 바람직하게 폴딩된 (예를 들어, 야생형 폴딩) 및/또는 글리코실화된 단백질의 생산을 유지하거나 증가시키기 위해 사용된다. 따라서, 한 실시양태에서, 본원에서 제공되는 조성물 및 방법은 특히 후기 또는 치밀한 세포 배양 조건에서 관찰되는 것과 같은 삼투 스트레스가 가해진 조건에서 세포에서, 예를 들어 세포 배양 시스템에서 생산된 생성물 (예를 들어, 재조합 단백질)의 품질을 유지하거나 증가시키기 위해 사용된다.
본원에서 제공되는 조성물 및 방법은 당업계에 공지된 임의의 배양 시스템을 사용하여 실시될 수 있다 (예를 들어, USPN 5,705,364; 5,721,121; 5,976,833; 6,180,401; 6,410,270; 6,716,602; 7,294,484; 7,294,481; 및 미국 특허 출원 공개 20030096414; 20050272124 (유가식 세포 배양을 설명함); 20060160180; 20070254358; 20070231901 (마이크로유체 (microfluidic) 세포 배양 시스템을 설명함); 20070184529 (글리코실화를 위한 세포 배양 환경의 조작을 설명함); 20070161106 참조).
예를 들어, 한 실시양태에서, 예를 들어 세포 및 배양 배지가 초기에 배양 도관 (vessel)에 공급되고 추가의 배양 영양분이 배양 종결 전에 주기적으로 세포 및/또는 생성물을 수거하거나 수거하지 않으면서 배양 동안 배양액에 연속적으로 또는 불연속적인 증가량으로 공급되는 배치 (batch) 배양인 "유가식 세포 배양"이 사용된다. 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 유가식 배양 시스템은 예를 들어 세포 및 배지를 포함하는 전체 배양액을 주기적으로 제거하고 신선한 배지로 교체하는 "반연속적 유가식 배양"일 수 있다. 예를 들어, 세포 및 모든 배양 영양분을 포함하는, 세포 배양을 위한 모든 성분이 배양 과정의 출발시에 배양 도관에 공급되는 간단한 "배치 배양"도 본 발명을 실시하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 예를 들어 상등액을 제조 배양 성장 공정 동안 배양 도관으로부터 제거하지 않고; 세포가 예를 들어 여과, 봉입, 미세담체에 대한 고정 등에 의해 배양액에서 억제될 수 있고, 배양 배지를 연속적으로 또는 간헐적으로 도입하고 배양 도관으로부터 제거하는 관류 배양도 본 발명을 실시하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 세포 (본 발명의 삼투-반응성 전사 조절 요소 (OR-TRE)를 포함하는 본 발명의 발현 카세트, 벡터, 재조합 바이러스, 플라스미드, 파지, 파지미드, 인공 염색체 또는 클로닝 벡터, 또는 임의의 키메라 핵산을 포함하는 임의의 세포 포함)는 임의의 생물반응기, 세포 배양 플레이트, 튜브 또는 플라스크를 비롯한 임의의 세포 배양 시스템에 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 세포를 포함하는 생물반응기 시스템, 세포 배양 시스템, 플레이트, 튜브 및 플라스크를 제공한다.
예를 들어, 본 발명을 실시할 때, 세포 성장기 다음에 그와 구별되는 폴리펩티드 생산기가 이어질 수 있다. 한 실시양태에서, 생산기는 세포 성장기와 상이한 배양 도관에서 수행된다.
별법으로, 동일한 도관이 각각의 단계에 대해 사용될 수 있다. 예를 들어, 성장기의 배양 배지에는 생산을 위한 고-오스몰랄농도, 저-글루코스 함유 배지가 공급될 수 있다. 별법으로, 당업계에서 이용가능한 세포-유체 분리 장치 (예를 들어, 십자류 (cross-flow) 여과, 회전 스크린 또는 유동층 미세담체)를 사용한 배지-교환은 동일한 도관의 사용이 가능하도록 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 생산기는 성장기의 배양된 동물 세포를 적어도 약 1.0 x 106 세포/mL, 또는 적어도 약 3.0 x 106 세포/mL, 또는 약 1 내지 10 x 106 세포/mL의 세포 접종 밀도로 접종하는 것을 수반한다. 한 실시양태에서, 동물 세포는 예를 들어 성장기에 대해 예시된 바와 같은 배양 도관에서 약 400 내지 600 mOsm, 또는 약 400 내지 500 mOsm의 출발 오스몰랄농도로 배양된다.
한 실시양태에서, 명시된 오스몰랄농도를 갖는 배양 배지를 달성하기 위해, PS-04™, DIESEL™ 또는 SUPER CELL™ 배양 배지, 또는 유사한 배지를 사용할 수 있고, 배양 배지의 오스몰랄농도는 기초 농도의 글루코스 및 염 (예를 들어 NaCl)의 첨가를 통해 증가될 수 있다. 상기 종류의 배양 배지는 추가의 세포 영양분을 제공하고 높은 출발 오스몰랄농도를 달성하기 위해 과량의 아미노산을 함유한다. 그러나, 통상적으로 숙련된 당업자에게 쉽게 명백할 바와 같이, 배양 배지 내의 다른 구성분의 농도(들)은 요구되는 오스몰랄농도에 도달하도록 조정될 수 있다.
한 실시양태에서, 오스몰랄농도는 배양 내내 실질적으로 바람직한 범위로 유지된다. 세포 배양 배지에 대한 글루코스 공급을 제어하는 것은 바람직한 최적치를 실질적으로 초과한 오스몰랄농도의 과도한 증가를 방지하는 것을 돕는다.
한 실시양태에서, 생산기는 약 0.01 및 1 g/L, 바람직하게는 0.02-0.5 g/L, 보다 바람직하게는 0.05-0.2 g/L의 범위 내에 있도록 배양기간 내내 제어된 글루코스의 농도의 존재 하에 수행된다. 배양 배지의 글루코스 농도를 모니터링하고 명시된 범위에서 제어하기 위해, FIA 또는 다른 자동화 온-라인 (on-line) 제어 시스템이 유용하다.
한 실시양태에서, 글루타민 농도는 또한 배양 기간 내내 0.2 내지 2 mM, 보다 바람직하게는 0.5 내지 1 mM의 범위 내에 있도록 제어된다. 글루타민 농도의 제어는 예를 들어 상기 논의된 것과 유사한 FIA 시스템을 이용하여 달성할 수 있다.
한 실시양태에서, 배양 조건, 예를 들어 온도, pH, dO2 등은 단백질 생산을 위해 선택된 숙주 세포에서 이전에 사용된 것이고, 당업자에게 자명할 것이다. 예를 들어, pH는 6.5 내지 7.5 범위로 조정될 수 있고, 생산을 위한 온도는 30℃ 내지 38℃일 수 있다.
한 실시양태에서, 생산 주기는 재조합 단백질에 대해 약 10 내지 15일 또는 그 초과의 정상적인 시간에서 약 9일 이하, 또는 7일 이하로 감소될 수 있다. 특정 실시양태에서 (예를 들어, 관심있는 폴리펩티드가 DNase인), 생산기는 최대 폴리펩티드 역가가 얻어지기 전에 종결된다. 생성되는 DNase 조성물이 보다 긴 실행에서 생산된 DNase에 비해 감소된 탈아미드화 %를 갖기 때문에, 이것은 유리하다. 폴리펩티드 생산기 후에, 관심있는 폴리펩티드는 당업계에 잘 확립된 기술을 이용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
생물반응기, 임플란트 및 인공 장기
본 발명은 또한 본 발명의 세포를 포함하는 임플란트 및 인공 장기, 생물반응기 시스템, 세포 배양 시스템, 플레이트, 접시, 관, 병 및 플라스크를 제공한다. 본 발명을 실시하기 위해 임의의 임플란트, 인공 장기, 생물반응기 시스템, 세포 배양 시스템, 세포 배양 플레이트, 접시 (예를 들어, 페트리 접시), 세포 배양관 및/또는 세포 배양 플라스크 (예를 들어, 회전병)이 사용될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 생물반응기, 또는 본 발명의 방법을 실시하기 위해 사용된 생물반응기는 예를 들어, 본 발명을 실시하기 위해 사용될 수 있는 단지 몇 개의 예시적인 생물반응기 및 세포 배양 시스템을 설명하기 위해 미국 특허 출원 공개 20080112995에 기재된 이식가능한 생물반응기 장치; 또는 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 20080057571; 20080044890; 20080044850; 20080038816; 20080032396; 20080032389; 20080032380; 20080014629; 20080014215; 및/또는 20080003669에, 및/또는 미국 특허 (USPN) 7,378,023; 7,371,567 (생체인공 장기를 위한 생물반응기를 설명함); 7,351,584 (포유동물 간세포를 위한 생물반응기를 설명함); 7,348,175 (마이크로프로세서 제어된 및 설비된 생물반응기를 설명함); 7,300,584 (생물반응기에서 현탁액의 생물학적 처리를 위한 장치를 설명함); 7,290,669 (상향류 (upflow) 생물반응기를 설명함); 7,264,962 (3단 효소 반응기를 설명함); 7,229,808 (생존가능한 고정된 생물학적 물질을 사용하는 생물반응기를 설명함); 7,198,941 (다공성 도관 생물반응기 장치를 설명함); 7,198,940 (살아있는 세포의 자동화 배양 및 처리를 위한 생물반응기 장치 및 세포 배양 시스템을 설명함); 7,156,985 (개선된 온도 제어가 있는 생물반응기 시스템을 설명함)에 기재된 생물반응기 장치일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 세포를 포함하는 임플란트, 예를 들어, 의료 임플란트 (예를 들어, 인슐린 또는 시토킨 또는 호르몬을 분비하는 세포), 또는 스텐트 (stent), 정형외과, 눈 또는 치과 임플란트를 제공한다. 예를 들어, 임플란트 및 인공 장기 (예를 들어, 인공 또는 임플란트 피부, 간, 췌장 또는 치아), 생물반응기 시스템, 세포 배양 시스템, 플레이트, 접시, 튜브 및 플라스크는 줄기 세포, 다능 세포, 미분화된 세포, 맥락총 세포, 쉬반 (Schwann) 세포, 망막 세포, 신경 세포, 뼈 세포, 간 세포, 간 실질 세포, 내피 세포, 지방 세포, 섬유모세포 세포, 쿠퍼 (Kupffer) 세포, 신장 세포, 혈관 세포, 피부 세포, 치주 세포, 치아모세포, 상아질모세포, 시멘트질모세포, 에나멜질모세포, 치원성 외배엽중간엽 조직, 골모세포, 파골세포, 섬유모세포, 및 치아형성 또는 뼈 형성 및/또는 줄기 세포에 관련된 다른 세포 및 조직, 및 다른 인간 또는 동물 장기 세포를 포함할 수 있거나, 세포는 배아 또는 성체 줄기 세포, 또는 그의 조합물이다.
본 발명의 세포를 포함하는 임의의 생물반응기, 임플란트, 스텐트, 인공 장기 또는 유사한 장치가 본 발명의 조성물 또는 방법을 실행하기 위해 또는 이용하기 위해 사용될 수 있다; 예를 들어, USPN 7,388,042; 7,381,418; 7,379,765; 7,361,332; 7,351,423; 6,886,568; 5,965,125; 5,270,192; 및 미국 특허 출원 공개 20040127987; 20080119909 (귀 임플란트를 설명함); 20080118549 (눈 임플란트를 설명함); 20080020015 (생물활성 상처 드레싱을 설명함); 20070254005 (심장 판막 생체-인공삽입물, 혈관 이식편, 반월판 임플란트를 설명함); 20070059335; 20060128015 (간 임플란트를 설명함)에 기재된 임플란트.
삼투-반응성 전사 인핸서 및 그의 결합 단백질
본 발명은 전사 조절 서열에 작동가능하게 연결된, 예를 들어, 프로모터, 예를 들어 최소 프로모터, 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터 등에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 TonEBP-반응성 또는 NFATc-반응성 전사 인핸서 서열을 포함하는 적어도 하나의 삼투-반응성 전사 조절 요소 (OR-TRE)를 제공한다. TonEBP-반응성 및 NFATc 반응성 전사 인핸서 서열, 및 그들에 결합하는 TonEBP 및 NFATc 단백질은 당업계에 잘 공지되어 있다.
예를 들어, TonEBP-반응성 전사 인핸서 서열은 5'-(T/A/C)GGAA(A/T)NN(T/A/C)N(T/A/C)-3' (서열 1)을 포함하고; TonEBP-반응성 전사 인핸서 서열은 예를 들어 문헌 ([Daoudal (1997) J. Biol. Chem. 272(5):2615-2619]; [Ferraris (1999) Am. J. Physiol. 276(3 Pt 1)]) 및 아래 기재된 다른 문헌에 기재되어 있다. 본 발명을 실시하기 위해 사용될 수 있는 예시적인 활성 TonEBP 결합 부위는 표 1에 기재된 것을 포함한다:
<표 1>
Figure pat00011
Figure pat00012
삼투-보호 표현형의 상승
한 측면에서, 본 발명의 조성물 및/또는 방법은 또한 삼투-반응성 전사 인핸서에 결합하는 단백질을 발현하고, 예를 들어, 본 발명의 조성물 (구축물)는 본 발명의 구축물에서 사용되는 삼투-반응성 전사 인핸서에 결합하는 적어도 하나의 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 상기 또 다른 실시양태는 본 발명의 구축물 및/또는 방법이 유도성 핵산 및/또는 폴리펩티드 발현 시스템으로서 사용되는 본 발명의 측면에서 특히 유용하고; 여기서, 본 발명의 구축물 자체는 구성적으로 또는 유도가능하게 (예를 들어, 삼투-반응성으로), 본 발명의 구축물 내에 존재하는 삼투-반응성 전사 인핸서 서열의 전사 활성화를 "상승시키기" 위해 삼투-반응성 전사 인핸서에 결합하는 추가의 또는 새로운 단백질을 공급할 (제조할) 수 있다.
다른 실시양태에서, 삼투반응성 전사 인핸서 서열의 전사 활성화를 "상승시키기 위해" 삼투반응성 전사 인핸서에 결합하는 추가의 또는 새로운 단백질은 본 발명의 삼투-반응성 전사 조절 요소 (OR-TRE)과 다른 별개의 구축물 상에 존재한다.
예를 들어, 본 발명의 예시적인 방법은 새로운 또는 추가의 삼투-반응성 전사 인핸서-결합 서열을 생성하기 위한 본 발명의 구축물을 포함하는 OR TRE 및 또 다른 발현 구축물 (예를 들어, 발현 벡터) 모두의 용도를 포함한다.
예를 들어, 본 발명의 구축물은 다음 서열을 갖는 긴장성-반응성 인핸서-결합 단백질, 또는 "TonE-결합 단백질," 또는 "TonEBP"를 코딩할 수 있다:
Figure pat00013
NFATc 긴장성-반응성 전사 활성화 서열은 또한 본 발명의 구축물에서 사용될 수 있고; NFATc 신호전달 경로는 예를 들어 문헌 [Li (2007) Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 292(5): C1606-16]에 기재되어 있다. 예를 들어 문헌 [Miyakawa (1999) "Tonicity-responsive enhancer binding protein, are1-like protein that stimulates transcription in response to hypertonicity" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(5):2538-2542]에 기재된 긴장성-반응성 인핸서 결합 단백질에 반응성인 서열 (또한 예를 들어, 문헌 [Lopez-Rodriguez (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(13):7214-7219] 참조)이 또한 본 발명을 실시하기 위해 사용될 수 있다. 상기 단백질은 포유동물 세포에서 삼투 스트레스에 의해 유도된 유전자 발현을 조절한다. 상기 단백질 패밀리의 단량체 구성원과는 달리, 상기 단백질은 동종이량체로서 종재하고, DNA 요소와 안정한 이량체를 형성한다. 상이한 이소형을 코딩하는 다수 전사체 변이체가 상기 유전자에 대해 발견되었다. 본 발명을 실시하기 위해 사용될 수 있는 하나의 이소형은 다음과 같다:
Figure pat00014
(예를 들어, 문헌 [Nagase (1998) DNA Res. 5(6):355-364]; [Lopez-Rodriguez (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(13):7214-7219]; [Miyakawa (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(5):2538-2542] 참조).
상기 설명된 바와 같이, 본 발명은 세포 (생물반응기, 세포 배양액, 임플란트 등의 내의 세포 포함) 내에 삽입되고 발현될 때 그 세포에 삼투-보호 표현형을 제공하는 핵산 구축물을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 또한 NFATc 폴리펩티드, AP-1 폴리펩티드, TonEBP 폴리펩티드, 칼시뉴린 폴리펩티드, 또는 그의 조합물을 코딩함으로써 향상된 능력을 갖는 삼투-보호 구축물을 제공한다. 예를 들어, NFATc 폴리펩티드를 긴장성 반응성 인핸서에 결합하여, 세포 내에서 삼투-보호 단백질의 보다 많은 (보다 큰, 보다 높은) 발현을 일으키므로, 본 발명의 구축물이 또한 NFATc 폴리펩티드를 발현할 때 증대된 삼투-보호 능력이 얻어진다. 예를 들어, AP-1 폴리펩티드는 NFATc 폴리펩티드가 긴장성 반응성 인핸서에 결합하는데 필요한 보조인자일 수 있으므로, 본 발명의 구축물이 또한 AP-1 폴리펩티드를 발현할 때 증대된 삼투-보호 능력이 얻어진다. 예를 들어, TonEBP 단백질이 본 발명의 TonEBP-반응성 전사 인핸서 서열에 결합하므로, 본 발명의 구축물이 또한 TonEBP 폴리펩티드를 발현할 때 증대된 삼투-보호 능력이 얻어진다. NFATc, AP-1, TonEBP 및/또는 칼시뉴린 폴리펩티드 코딩 핵산은 또한 본 발명의 삼투반응성 전사 조절 요소 (OR-TRE)에 의해, 또는 다른 인핸서 또는 프로모터에 의해 조절될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 ORE-TRE 삼투-반응성 핵산 분자와 동일한 구축물 상에서 발현되기보다는, NFATc, AP-1, TonEBP 및/또는 칼시뉴린 폴리펩티드는 에피좀성, 일시 발현 구축물, 또는 게놈에 통합된 발현 구축물일 수 있는 별개의 구축물, 예를 들어, 별개의 벡터 상에서 발현된다.
키트 및 라이브러리
본 발명은 본 발명의 세포, 표적 서열, 형질감염제, 형질도입제, 지시서 (본 발명의 방법에 대한), 또는 그의 임의의 조합을 포함하는, 본 발명의 조성물 및 방법을 포함하는 키트를 제공한다. 따라서, 키트, 세포, 벡터 등이 본원에서 제공된다.
본 발명은 다음 실시예를 참조로 하여 추가로 설명되지만; 본 발명이 그러한 실시예에 제한되지 않음을 이해해야 한다.
실시예
실시예 1: 삼투-감수성 하이브리드 (hybrid) 전사 조절 요소의 설계
본 발명은 삼투-반응성 전사 조절 요소 (ORTRE)를 제공한다.
본 실시예는 본 발명의 예시적인 삼투-반응성 합성 하이브리드 전사 조절 요소, 및 증가하는 오스몰랄농도에서 그의 발현 특징을 설계하기 위해 TonE 결합 부위의 사용을 설명한다. 이들 결과는 본 발명의 삼투-반응성 전사 조절 요소가 삼투-의존 방식으로 전사활성화될 수 있음을 입증한다.
방법:
삼투-반응성 프로모터 POR1의 제작
삼투-반응성 프로모터 POR1을 올리고 OLM155
Figure pat00015
및 어닐링 서열 OLM165
Figure pat00016
(여기서, TonE 및 AP1 결합 부위를 굵은 글씨체로 표기하고, 이들 결합 부위 및 그들 사이의 서열을 삼투 반응 요소 (OR)로서 취하고, 어닐링 서열은 이탤릭체로 표시한다; SpeI 및 NheI 클로닝 부위를 각각 삼투 반응 요소 (OR)의 5' 및 3'에 도입하고, 클로닝 부위를 밑줄친다))을 사용하여 인간 CMV 프로모터의 PCR 증폭에 의해 클로닝하였다. PCR 생성물을 클로닝하여, pLM216을 생성하였다. 그의 직접 3' 인트론을 갖는 하이브리드 프로모터를 (SpeI/ClaI)를 사용하여 pLM216으로부터 절제하고, STIgMA-FC 스토크리스 (Stalkless) 발현 플라스미드 (SpeI ClaI) 내로 클로닝하여, pOsmo1 (POR1-인트론-STIgMA-Fc-pA; POR1, OR-Pfragment CMV)을 생성하였다.
세포 배양, 형질감염
차이니즈 햄스터 난소 세포 CHO-K1 DUX-B11 (dhfr-)을 무혈청 저단백질 (재조합 인간 인슐린) 배지 내에서 현탁액으로 성장시켰다. 최적화된 LIPOFECTAMINE™ (인비트로겐 (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스바드)) 형질감염 프로토콜을 세포의 고효율 일시 형질감염을 위해 사용하였다. 일시적으로 형질감염된 세포를 형질감염 6시간 후에 수거하고, 6 웰 플레이트에서 혈청 함유 배지 내에 증가하는 오스몰랄농도에서 접종하였다. 배지의 오스몰랄농도는 각각의 웰 내에서 증가하는 염 농도를 갖는 고정 부피의 인산염 완충 염수를 첨가함으로써 조정하였다. 일시적으로 형질감염된 세포는 48시간 후에 ELISA에 의해 Fc 융합 유전자 발현에 대해 일상적으로 분석하였다.
결과
생물약제 생산 및 스트레스 반응성 유전자-조작을 위한 포유동물 유전자 조절 시스템의 설계를 위한 삼투-반응성 요소의 가능성을 분석하기 위해, TonE 부위 및 AP-1 부위 (활성화 단백질-1)를 함유하는 마우스 알도스 리덕타제 프로모터의 삼투-반응성 요소 (서열 -1053 내지 -1007) (예를 들어, [Daoudal et al 1997, 상기 문헌] 참조)를 인간 시토메갈로바이러스 극초기 프로모터의 일부의 5'에 융합시켜, 삼투반응성 프로모터 1 POR1을 제작하였다.
본 발명자들은 예시적인 POR1 프로모터가 Fc 융합 단백질 pOsmo1 (POR1-인트론-STIgMA-Fc-pA; POR1, OR Pfragment CMV)의 발현을 유도하는 플라스미드를 제작하였다. 구성적 프로모터 (인간 시토메갈로바이러스 프로모터)- 또는 POR1-유도된 Fc 융합 발현 플라스미드를 CHOK1 DUX-B11 (dhfr-) 세포 내로 형질감염시킨 후에, 형질감염된 세포를 증가하는 오스몰랄농도의 배지 내에 접종하고 48시간 (h) 동안 성장시켰다. 이어서, 세포 상등액을 도 2에 개략적으로 예시된 바와 같이 Fc 융합체 발현에 대해 분석하였고, 여기서 오스몰랄농도는 mOsm으로서 표현하고, 구성적 프로모터 및 본 발명의 POR1-전사 조절 요소 모두로부터 단백질 농도는 mg/L로 표현한다.
구성적 프로모터-유도된 발현 플라스미드의 발현 수준은 300에서 400 mOsm으로 안정하게 유지된 후, 오스몰랄농도가 추가로 증가함에 따라 감소되었다. 이는 아마도 높은 오스몰랄농도에서 잘 설명된 세포 거동을 반영한다: 증가하는 오스몰랄농도에 따라 감소하는 세포 성장 속도 및 감소하는 세포 생활력.
따라서, 리포터 (reporter) 유전자의 구성적 발현이 재조합 단백질 발현에 대한 높은 오스몰랄농도의 효과를 해명한다.
인간 시토메갈로바이러스 프로모터 및 삼투-반응성 프로모터 1은 300 mOsm에서 동등한 재조합 단백질 발현 수준을 유도하였다. 오스몰랄농도가 400 mOsm까지 증가함에 따라, POR1-유도된 발현 수준은 증가한 후, 증가하는 오스몰랄농도에 따라 감소하였다. 그러나, POR1-유도된 발현 수준은 그들의 구성적 프로모터-유도된 상대물보다 훨씬 더 느린 속도로 감소하였다.
결론
구성적-유도된 및 예시적인 POR1-유도된 Fc 융합체 발현 수준을 비교하면, 세포 생리학은 높은 오스몰랄농도에서 영향을 받고, 따라서 전체 단백질 생산이 감소하지만, 본 발명의 예시적인 POR1은 고삼투성 배지 내에서 CMV 프로모터보다 더 높은 단백질 발현 수준을 유도하는 것을 나타낸다. 이들 결과는 본 발명의 삼투-반응성 전사 조절 요소가 CHO-K1 DUX-B11 (dhfr-) 세포 내로 형질감염될 때 삼투-의존 방식으로 전사-활성화될 수 있음을 입증한다. 따라서, 이들 결과는 상기 POR1-유도된 도입유전자 발현에 의해 예시되는 바와 같이 본 발명의 전사 조절 요소가 실시간 오스몰랄농도 센서 (sensor)에서 사용될 수 있음을 입증한다.
실시예 2: 한 세트의 삼투-반응성 전사 조절 요소의 설계
본 실시예는 본 발명의 한 세트의 삼투-반응성 전사 조절 요소의 설계 및 시험을 설명한다. 본 발명자들은 증가하는 오스몰랄농도에서 재조합 단백질 발현 창에 대한 본 발명의 구축물 내의 삼투-반응성 요소의 수를 증가시키는 영향을 시험하였다. 도 3은 본 발명의 3개의 예시적인 합성 삼투-반응성 전사 조절 요소가 제작된 방식을 개략적으로 설명한다.
방법:
삼투-반응성 프로모터의 제작
POR1을 pOsmo1로부터 절제하고 (SpeI/ClaI), pOsmo1 내로 클로닝하여 (NheI/ClaI), 2개의 삼투 반응 요소를 함유하는 삼투-반응성 하이브리드 프로모터 pLM217 (POR2-인트론)을 생성하였다. 마찬가지로, POR3은 pLM217로부터 POR2-인트론의 절제 (SpeI/ClaI) 및 pOsmo1 내로 삽입 (NheI/ClaI)에 의해 제작하여, pOsmo2 (POR3-인트론-STIgMA-Fc-pA; POR3, OR-OR-OR-Pfragment CMV)을 생성하였다. POR2-인트론을 pLM217로부터 절제하고 (SpeI/ClaI), pLM217 (NheI/ClaI) 내로 클로닝하여, pLM218:POR4-인트론 (POR4, OR-OR-OR-OR-Pfragment CMV)를 생성하였다. POR4-인트론을 pLM218로부터 절제하고 (SpeI/ClaI), pOsmo2 내로 라이게이팅시켜 (NheI/ClaI), pOsmo3 (POR7-인트론-STIgMA-Fc-pA; POR7, OR-OR-OR-OR-OR-OR-OR-Pfragment CMV)를 생성하였다.
세포 배양, 형질감염
차이니즈 햄스터 난소 세포 CHO-K1 DUX-B11 (dhfr-)을 무혈청 저단백질 (재조합 인간 인슐린) 배지 내에서 현탁액으로 성장시켰다. 최적화된 LIPOFECTAMINE™ (인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드) 형질감염 프로토콜을 세포의 고효율 일시 형질감염을 위해 사용하였다. 일시적으로 형질감염된 세포를 형질감염 6시간 후에 수거하고, 6 웰 플레이트에서 혈청 함유 배지 내에 증가하는 오스몰랄농도에서 접종하였다. 배지의 오스몰랄농도는 각각의 웰 내에서 증가하는 염 농도를 갖는 고정 부피의 인산염 완충 염수를 첨가함으로써 조정하였다. 일시적으로 형질감염된 세포는 48시간 후에 ELISA에 의해 Fc 융합 유전자 발현에 대해 일상적으로 분석하였다.
결과
인간 시토메갈로바이러스 프로모터 단편의 5'의 삼투-반응성 요소의 수를 증가시키는 효과를 평가하기 위해, 도 3에 예시된 바와 같이, 나란히 클로닝된 3 또는 7개의 삼투-반응성 요소를 보유하는 2개의 추가의 삼투-반응성 프로모터를 제작하였다: POR3 및 POR7. CHO-K1 DUX-B11 (dhfr-) 세포를 인간 시토메갈로바이러스 구성적 프로모터 또는 삼투 반응성 프로모터 3, POR3 또는 삼투-반응성 프로모터 7, POR7에 의해 유도된 Fc 융합체 발현 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염 6시간 후에, 세포를 수거하고, 증가하는 오스몰랄농도의 배지 내에 접종하였다. 리포터 유전자의 구성적 발현은 300 mOsm 내지 400 mOsm의 오스몰랄농도에 의해 유의하게 영향을 받지 않았고, 이어서, 도 4에 예시된 바와 같이 오스몰랄농도가 증가함에 따라 Fc 융합체 발현 수준은 감소하였고, 여기서 상기 도 4는 도 3에 예시된 본 발명의 예시적인 삼투-반응성 전사 조절 요소 (OR-TRE)의 생체내 삼투-보호 효능을 개략적으로 예시한다 (또한 도 5의 표준화된 데이타 참조).
POR3-유도된 Fc 융합체 발현 수준은 도 4에 예시된 바와 같이, 등장성 배지 내에서 그들의 상대물의 구성적 발현 수준의 절반이었다. 배지 오스몰랄농도가 300 mOsm에서 500 mOsm로 증가함에 따라, POR3 유도된 발현은 등장성 발현 수준의 1.5배의 피크로 증가한 후, 오스몰랄농도가 500 mOsm에서 700 mOsm까지 증가함에 따라 감소하였다.
POR7-유도된 Fc 융합체 발현 수준은 도 4에 예시된 바와 같이, 등장성 배지 내에서 그들의 구성적 발현 상대물보다 15배 더 낮았다. 오스몰랄농도가 300 mOsm에서 550 mOsm로 증가함에 따라, POR7-유도된 Fc 융합체 발현 수준은 등장성 발현 수준의 4배의 최대치로 증가한 후, 오스몰랄농도에 따라 감소하였다. 데이타를 도 5에 표준화하였다.
결론
보다 많은 (보다 높은 수의) 삼투-반응성 요소가 본 발명의 삼투-반응성 전사 조절 요소 (OR-TRE) (소위 "하이브리드 삼투-반응성 프로모터") 내로 코딩되면 (삽입되면), 등장성 배지 내의 도입유전자 발현 수준은 더 낮지만, 그들의 유도 인자 (그의 최대 발현 수준 대 등장성 발현 수준의 비)는 더 높다. 따라서, 본 발명자들은 다양한 도입유전자 발현 창 및 유도 인자를 생성시키는 한 세트의 삼투-반응성 프로모터를 제작하였고; 본 발명은 구축물 내로 조작된 하나 또는 다수의 삼투 반응 요소; 예를 들어, 하나 또는 다수의 긴장성 인핸서-결합 단백질 (TonEBP)-반응성 전사 인핸서 서열 (TonEBP-결합 모티프)을 갖는, 및 또 다른 실시양태로서 또한 임의로 하나 또는 다수의 AP-1 단백질 결합 부위 (AP-1 결합 모티프)를 갖는 다양한 삼투-반응성 전사 조절 요소 (OR-TRE)를 제공한다.
표준화된 발현 수준
데이타 분석
등장성 발현에서 고장성 발현까지 구성적 발현 수준의 상대적인 감소는 억제된 세포 성장 및 생활력으로 인한 단백질 생산의 삼투-관련 감소를 표시한다. 따라서, POR3- 및 POR7-유도된 발현 수준을 그들의 구성적 발현 수준을 사용하여 표준화하였다; 도 4 참조.
결론
본 실시예는 본 발명의 구축물 내에 코딩된 삼투-반응성 요소 (본 발명의 삼투-반응성 전사 조절 요소 (OR-TRE), 또는 "삼투-반응성 프로모터")의 수를 증가시키면 삼투-반응성 요소의 수 의존 방식으로 등장성 발현 수준을 저하시킴을 입증하는 데이타를 제시한다. 본 실시예는 또한 본 발명의 예시적인 구축물에 의한 이들 프로모터의 실제 전사활성화 수준이 350 mOsm에서 700 mOsm까지 선형 방식으로 오스몰랄농도에 따라 증가함을 입증하는 데이타를 제시한다.
실시예 3: 삼투-감수성 전사 및 전사후 유전자 조정
본 실시예는 조합된 삼투-감수성 전사 및 전사후 유전자 조정을 갖는 본 발명의 예시적인 구축물; 예를 들어, 삼투 스트레스가 가해진 (예를 들어, 고 염) 조건 하에 각각 메시지 및 폴리펩티드의 전사 및 전사후 발현 수준 모두를 양성으로 조절할 수 있는 본 발명의 예시적인 구축물을 설명한다.
또 다른 실시양태에서는 삼투-조절을 전사 대조군 및/또는 전사후 (예를 들어, 번역) 수준 대조군과 조합한다: (1) (전사 수준에서) 내인성 포유동물 삼투-반응성 프로모터 및/또는 본 발명의 합성 진핵 삼투-반응성 프로모터; 및 (2) (전사후 수준에서) 하나 이상의 전사 또는 번역 조절 서열 또는 모티프의 포함에 의해. 이들 대조군은 본 발명의 구축물 내로 포함될 (조작될) 수 있어서, 그 구축물로부터 생성된 임의의 메시지 (전사체)가 삼투-감수성 5' 및/또는 3' 비번역 영역; 및 한 실시양태에서 추가의 전사 및/또는 전사후 (예를 들어, 번역) 수준 대조군을 갖게 된다.
예를 들어, 전사 및/또는 전사후 (예를 들어, 번역) 수준 제어 서열 또는 모티프의 존재는 보다 안정한 및/또는 보다 오래 지속하는, 예를 들어, 고오스몰랄농도 (예를 들어, 고삼투성 환경)의 조건에서 보다 안정한 및/또는 오래 지속하는 mRNA (메시지)를 생성하고; 따라서, 고오스몰랄농도의 조건에서, 예를 들어, 높은 오스몰랄농도에서 증가된 재조합 단백질 발현을 일으킨다. 상기 실시양태는 등장성 배지에서 기초 발현에서 고오스몰랄농도의 조건에서, 예를 들어, 고삼투성 배지에서 최대 유전자-유도로 조절 인자를 상승시킨다.
실시예 4:
구성적 프로모터에 의해 유도된 재조합 단백질 생산의 수율은 오스몰랄농도가 증가함에 따라 꾸준하게 감소한다. 본 발명자들은 구성적 프로모터 내에 삼투-반응성 요소(들)의 도입이 구성적 프로모터를 전사활성화하고, 재조합 단백질 생산에 대한 고장성의 음성 효과를 맞균형잡을 수 있는 것으로 추론하였다. 상기 가설을 시험하기 위해, 인간 CMV 프로모터의 인핸서 및 Pfragment CMV 사이에 1, 3 또는 7개의 삼투 반응 요소를 도입하였다.
방법:
삼투-반응성 프로모터의 제작
인간 CMV 프로모터의 인핸서를 올리고 OLM401, 즉
Figure pat00017
및 OLM400, 즉
Figure pat00018
(제한 부위는 굵은 글씨체, 어닐링 서열은 이탤릭체로 표기함)를 사용하여 PCR 증폭시켰다. PCR 생성물을 HindIII 및 NheI로 소화시키고, POR1-인트론을 중개 (intermediary) 플라스미드로부터 절제하고 (SpeI/EcoRI), 두 DNA 단편을 다른 중개 플라스미드 내에 클로닝하여 (HindIII/EcoRI), PconstOR1-인트론: EhCMVOR1Pfragment CMV-인트론을 생성하였다. 동일한 전략을 사용하여, PconstOR3-인트론: EhCMV0R3Pfragment CMV-인트론 및 PconstOR7-인트론: EhCMVOR7Pfragment CMV-인트론을 생성하였다.
PconstOR1을 중개 플라스미드로부터 절제하고 (SpeI/ClaI), pOsmoI 내로 클로닝하여 (SpeI/ClaI), pconstOsmo1 (PconstOR1-인트론-STIgMA-Fc-pA; PconstOR1: EhCMV-POR1)을 생성하였다. 동일한 전략을 사용하여, pconstOsmo3 (PconstOR3-인트론-STIgMA-Fc-pA; PconstOR3: EhCMV-POR3) 및 pconstOsmo7 (PconstOR7-인트론-STIgMA-Fc-pA; PconstOR7: EhCMV-POR7)을 제작하였다.
세포 배양, 형질감염
차이니즈 햄스터 난소 세포 CHO-K1 DUX-B11 (dhfr-)을 무혈청 저단백질 (재조합 인간 인슐린) 배지 내에서 현탁액으로 성장시켰다. 최적화된 리포펙타민 형질감염 프로토콜을 세포의 고효율 일시 형질감염을 위해 사용하였다. 일시적으로 형질감염된 세포를 이식 6시간 후에 수거하고, 6 웰 플레이트에서 혈청 함유 배지 내에 증가하는 오스몰랄농도에서 접종하였다. 배지의 오스몰랄농도는 각각의 웰에서 증가하는 염 농도를 갖는 고정 부피의 인산염 완충 염수를 첨가함으로써 조정하였다. 일시적으로 형질감염된 세포를 ELISA에 의해 수행된 Fc 융합체 유전자 발현 분석으로 통상적으로 분석하였다.
결과
인간 시토메갈로바이러스 프로모터의 인핸서의 3' 및 인간 시토메갈로바이러스 프로모터 단편의 5'의 삼투-반응성 요소의 증가하는 수의 도입의 영향을 평가하기 위해, 나란히 클로닝된 1, 3 또는 7개의 삼투-반응성 요소를 보유하는 3개의 프로모터를 제작하였다: PconstOR1, PconstOR3, PconstOR7. CHO-K1 DUX-B11 (dhfr-) 세포를 인간 시토메갈로바이러스 구성적 프로모터 또는 이들 조작된 프로모터 중 하나에 의해 유도된 Fc 융합체 발현 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염 6시간 후에, 세포를 수거하고, 증가하는 오스몰랄농도의 배지 내에 접종하였다.
리포터 유전자의 구성적 발현은 오스몰랄농도가 증가함에 따라 꾸준하게 감소하였다 (도 6).
놀랍게도, 인핸서 및 CMV 프로모터의 단편 사이에 하나의 삼투-반응성 요소를 도입하면, 등장성 배지 내에서 재조합 단백질 발현의 배가를 일으켰다. 300 mOsm/Kg 내지 450 mOsm/Kg 사이에서, PconstOR1에 의해 유도된 관심있는 재조합 단백질의 발현 수준은 상기 높은 수준으로 유지된 후, 오스몰랄농도가 500 mOsm/Kg에서 700 mOsm/Kg까지 증가함에 따라 감소하였다.
구성적 인간 CMV 프로모터 내에 3개의 삼투-반응성 요소를 도입하면, 300 mOsm/Kg에서 야생형 CMV 프로모터에 비해 재조합 단백질 발현의 근소한 증가를 일으켰다. 이와 반대로, 7개의 삼투-반응성 요소를 도입하면, 등장성 배지 내에서 재조합 단백질 발현의 근소한 감소를 일으켰다. 3 또는 7개의 삼투-반응성 요소를 함유하도록 변형된 CMV 프로모터에 의해 유도된 Fc 융합체 발현 수준은 300 mOsm/Kg에서 400 mOsm/Kg까지 증가된 후 700 mOsm/Kg까지 꾸준하게 감소하였다.
결론
인간 CMV 프로모터 내에 하나의 삼투-반응성 요소를 도입하면, 300 mOsm/Kg에서 재조합 단백질 발현 수준을 배가시켰다. 이것은 예기치 않은 결과였다.
삼투-반응성 요소의 존재는 재조합 단백질 발현에 대한 증가된 오스몰랄농도의 효과를 상쇄할 수 있고, 3 또는 7개의 삼투-반응성 요소가 도입될 때, 증가하는 오스몰랄농도에 따라 재조합 발현 수준은 상향-조절되어 400 mOsm/Kg에서 최대치에 도달한 후 꾸준하게 감소하였다.
본 발명의 많은 실시양태를 설명하였다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 취지 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 다양한 변형이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 다른 실시양태는 다음 특허청구범위의 범위 내에 있다.
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Met Pro Ser Asp Phe Ile Ser Leu Leu Ser Ala Asp Leu Asp Leu Glu 1 5 10 15 Ser Pro Lys Ser Leu Tyr Ser Arg Asp Ser Leu Lys Leu His Pro Ser 20 25 30 Gln Asn Phe His Arg Ala Gly Leu Leu Glu Glu Ser Val Tyr Asp Leu 35 40 45 Leu Pro Lys Glu Leu Gln Leu Pro Pro Ser Arg Glu Thr Ser Val Ala 50 55 60 Ser Met Ser Gln Thr Ser Gly Gly Glu Ala Gly Ser Pro Pro Pro Ala 65 70 75 80 Val Val Ala Ala Asp Ala Ser Ser Ala Pro Ser Ser Ser Ser Met Gly 85 90 95 Gly Ala Cys Ser Ser Phe Thr Thr Ser Ser Ser Pro Thr Ile Tyr Ser 100 105 110 Thr Ser Val Thr Asp Ser Lys Ala Met Gln Val Glu Ser Cys Ser Ser 115 120 125 Ala Val Gly Val Ser Asn Arg Gly Val Ser Glu Lys Gln Leu Thr Ser 130 135 140 Asn Thr Val Gln Gln His Pro Ser Thr Pro Lys Arg His Thr Val Leu 145 150 155 160 Tyr Ile Ser Pro Pro Pro Glu Asp Leu Leu Asp Asn Ser Arg Met Ser 165 170 175 Cys Gln Asp Glu Gly Cys Gly Leu Glu Ser Glu Gln Ser Cys Ser Met 180 185 190 Trp Met Glu Asp Ser Pro Ser Asn Phe Ser Asn Met Ser Thr Ser Ser 195 200 205 Tyr Asn Asp Asn Thr Glu Val Pro Arg Lys Ser Arg Lys Arg Asn Pro 210 215 220 Lys Gln Arg Pro Gly Val Lys Arg Arg Asp Cys Glu Glu Ser Asn Met 225 230 235 240 Asp Ile Phe Asp Ala Asp Ser Ala Lys Ala Pro His Tyr Val Leu Ser 245 250 255 Gln Leu Thr Thr Asp Asn Lys Gly Asn Ser Lys Ala Gly Asn Gly Thr 260 265 270 Leu Glu Asn Gln Lys Gly Thr Gly Val Lys Lys Ser Pro Met Leu Cys 275 280 285 Gly Gln Tyr Pro Val Lys Ser Glu Gly Lys Glu Leu Lys Ile Val Val 290 295 300 Gln Pro Glu Thr Gln His Arg Ala Arg Tyr Leu Thr Glu Gly Ser Arg 305 310 315 320 Gly Ser Val Lys Asp Arg Thr Gln Gln Gly Phe Pro Thr Val Lys Leu 325 330 335 Glu Gly His Asn Glu Pro Val Val Leu Gln Val Phe Val Gly Asn Asp 340 345 350 Ser Gly Arg Val Lys Pro His Gly Phe Tyr Gln Ala Cys Arg Val Thr 355 360 365 Gly Arg Asn Thr Thr Pro Cys Lys Glu Val Asp Ile Glu Gly Thr Thr 370 375 380 Val Ile Glu Val Gly Leu Asp Pro Ser Asn Asn Met Thr Leu Ala Val 385 390 395 400 Asp Cys Val Gly Ile Leu Lys Leu Arg Asn Ala Asp Val Glu Ala Arg 405 410 415 Ile Gly Ile Ala Gly Ser Lys Lys Lys Ser Thr Arg Ala Arg Leu Val 420 425 430 Phe Arg Val Asn Ile Met Arg Lys Asp Gly Ser Thr Leu Thr Leu Gln 435 440 445 Thr Pro Ser Ser Pro Ile Leu Cys Thr Gln Pro Ala Gly Val Pro Glu 450 455 460 Ile Leu Lys Lys Ser Leu His Ser Cys Ser Val Lys Gly Glu Glu Glu 465 470 475 480 Val Phe Leu Ile Gly Lys Asn Phe Leu Lys Gly Thr Lys Val Ile Phe 485 490 495 Gln Glu Asn Val Ser Asp Glu Asn Ser Trp Lys Ser Glu Ala Glu Ile 500 505 510 Asp Met Glu Leu Phe His Gln Asn His Leu Ile Val Lys Val Pro Pro 515 520 525 Tyr His Asp Gln His Ile Thr Leu Pro Val Ser Val Gly Ile Tyr Val 530 535 540 Val Thr Asn Ala Gly Arg Ser His Asp Val Gln Pro Phe Thr Tyr Thr 545 550 555 560 Pro Asp Pro Ala Ala Gly Ala Leu Asn Val Asn Val Lys Lys Glu Ile 565 570 575 Ser Ser Pro Ala Arg Pro Cys Ser Phe Glu Glu Ala Met Lys Ala Met 580 585 590 Lys Thr Thr Gly Cys Asn Leu Asp Lys Val Asn Ile Ile Pro Asn Ala 595 600 605 Leu Met Thr Pro Leu Ile Pro Ser Ser Met Ile Lys Ser Glu Asp Val 610 615 620 Thr Pro Met Glu Val Thr Ala Glu Lys Arg Ser Ser Thr Ile Phe Lys 625 630 635 640 Thr Thr Lys Ser Val Gly Ser Thr Gln Gln Thr Leu Glu Asn Ile Ser 645 650 655 Asn Ile Ala Gly Asn Gly Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ser His Leu 660 665 670 Pro Ser Glu Asn Glu Lys Gln Gln Gln Ile Gln Pro Lys Ala Tyr Asn 675 680 685 Pro Glu Thr Leu Thr Thr Ile Gln Thr Gln Asp Ile Ser Gln Pro Gly 690 695 700 Thr Phe Pro Ala Val Ser Ala Ser Ser Gln Leu Pro Asn Ser Asp Ala 705 710 715 720 Leu Leu Gln Gln Ala Thr Gln Phe Gln Thr Arg Glu Thr Gln Ser Arg 725 730 735 Glu Ile Leu Gln Ser Asp Gly Thr Val Val Asn Leu Ser Gln Leu Thr 740 745 750 Glu Ala Ser Gln Gln Gln Gln Gln Ser Pro Leu Gln Glu Gln Ala Gln 755 760 765 Thr Leu Gln Gln Gln Ile Ser Ser Asn Ile Phe Pro Ser Pro Asn Ser 770 775 780 Val Ser Gln Leu Gln Asn Thr Ile Gln Gln Leu Gln Ala Gly Ser Phe 785 790 795 800 Thr Gly Ser Thr Ala Ser Gly Ser Ser Gly Ser Val Asp Leu Val Gln 805 810 815 Gln Val Leu Glu Ala Gln Gln Gln Leu Ser Ser Val Leu Phe Ser Ala 820 825 830 Pro Asp Gly Asn Glu Asn Val Gln Glu Gln Leu Ser Ala Asp Ile Phe 835 840 845 Gln Gln Val Ser Gln Ile Gln Ser Gly Val Ser Pro Gly Met Phe Ser 850 855 860 Ser Thr Glu Pro Thr Val His Thr Arg Pro Asp Asn Leu Leu Pro Gly 865 870 875 880 Arg Ala Glu Ser Val His Pro Gln Ser Glu Asn Thr Leu Ser Asn Gln 885 890 895 Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Val Met Glu Ser Ser Ala Ala 900 905 910 Met Val Met Glu Met Gln Gln Ser Ile Cys Gln Ala Ala Ala Gln Ile 915 920 925 Gln Ser Glu Leu Phe Pro Ser Thr Ala Ser Ala Asn Gly Asn Leu Gln 930 935 940 Gln Ser Pro Val Tyr Gln Gln Thr Ser His Met Met Ser Ala Leu Ser 945 950 955 960 Thr Asn Glu Asp Met Gln Met Gln Cys Glu Leu Phe Ser Ser Pro Pro 965 970 975 Ala Val Ser Gly Asn Glu Thr Ser Thr Thr Thr Thr Gln Gln Val Ala 980 985 990 Thr Pro Gly Thr Thr Met Phe Gln Thr Ser Ser Ser Gly Asp Gly Glu 995 1000 1005 Glu Thr Gly Thr Gln Ala Lys Gln Ile Gln Asn Ser Val Phe Gln 1010 1015 1020 Thr Met Val Gln Met Gln His Ser Gly Asp Asn Gln Pro Gln Val 1025 1030 1035 Asn Leu Phe Ser Ser Thr Lys Ser Met Met Ser Val Gln Asn Ser 1040 1045 1050 Gly Thr Gln Gln Gln Gly Asn Gly Leu Phe Gln Gln Gly Asn Glu 1055 1060 1065 Met Met Ser Leu Gln Ser Gly Asn Phe Leu Gln Gln Ser Ser His 1070 1075 1080 Ser Gln Ala Gln Leu Phe His Pro Gln Asn Pro Ile Ala Asp Ala 1085 1090 1095 Gln Asn Leu Ser Gln Glu Thr Gln Gly Ser Leu Phe His Ser Pro 1100 1105 1110 Asn Pro Ile Val His Ser Gln Thr Ser Thr Thr Ser Ser Glu Gln 1115 1120 1125 Met Gln Pro Pro Met Phe His Ser Gln Ser Thr Ile Ala Val Leu 1130 1135 1140 Gln Gly Ser Ser Val Pro Gln Asp Gln Gln Ser Thr Asn Ile Phe 1145 1150 1155 Leu Ser Gln Ser Pro Met Asn Asn Leu Gln Thr Asn Thr Val Ala 1160 1165 1170 Gln Glu Ala Phe Phe Ala Ala Pro Asn Ser Ile Ser Pro Leu Gln 1175 1180 1185 Ser Thr Ser Asn Ser Glu Gln Gln Ala Ala Phe Gln Gln Gln Ala 1190 1195 1200 Pro Ile Ser His Ile Gln Thr Pro Met Leu Ser Gln Glu Gln Ala 1205 1210 1215 Gln Pro Pro Gln Gln Gly Leu Phe Gln Pro Gln Val Ala Leu Gly 1220 1225 1230 Ser Leu Pro Pro Asn Pro Met Pro Gln Ser Gln Gln Gly Thr Met 1235 1240 1245 Phe Gln Ser Gln His Ser Ile Val Ala Met Gln Ser Asn Ser Pro 1250 1255 1260 Ser Gln Glu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln 1265 1270 1275 Gln Gln Gln Gln Gln Ser Ile Leu Phe Ser Asn Gln Asn Thr Met 1280 1285 1290 Ala Thr Met Ala Ser Pro Lys Gln Pro Pro Pro Asn Met Ile Phe 1295 1300 1305 Asn Pro Asn Gln Asn Pro Met Ala Asn Gln Glu Gln Gln Asn Gln 1310 1315 1320 Ser Ile Phe His Gln Gln Ser Asn Met Ala Pro Met Asn Gln Glu 1325 1330 1335 Gln Gln Pro Met Gln Phe Gln Ser Gln Ser Thr Val Ser Ser Leu 1340 1345 1350 Gln Asn Pro Gly Pro Thr Gln Ser Glu Ser Ser Gln Thr Pro Leu 1355 1360 1365 Phe His Ser Ser Pro Gln Ile Gln Leu Val Gln Gly Ser Pro Ser 1370 1375 1380 Ser Gln Glu Gln Gln Val Thr Leu Phe Leu Ser Pro Ala Ser Met 1385 1390 1395 Ser Ala Leu Gln Thr Ser Ile Asn Gln Gln Asp Met Gln Gln Ser 1400 1405 1410 Pro Leu Tyr Ser Pro Gln Asn Asn Met Pro Gly Ile Gln Gly Ala 1415 1420 1425 Thr Ser Ser Pro Gln Pro Gln Ala Thr Leu Phe His Asn Thr Ala 1430 1435 1440 Gly Gly Thr Met Asn Gln Leu Gln Asn Ser Pro Gly Ser Ser Gln 1445 1450 1455 Gln Thr Ser Gly Met Phe Leu Phe Gly Ile Gln Asn Asn Cys Ser 1460 1465 1470 Gln Leu Leu Thr Ser Gly Pro Ala Thr Leu Pro Asp Gln Leu Met 1475 1480 1485 Ala Ile Ser Gln Pro Gly Gln Pro Gln Asn Glu Gly Gln Pro Pro 1490 1495 1500 Val Thr Thr Leu Leu Ser Gln Gln Met Pro Glu Asn Ser Pro Leu 1505 1510 1515 Ala Ser Ser Ile Asn Thr Asn Gln Asn Ile Glu Lys Ile Asp Leu 1520 1525 1530 Leu Val Ser Leu Gln Asn Gln Gly Asn Asn Leu Thr Gly Ser Phe 1535 1540 1545 <210> 38 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 38 caagcttgac tagtcaatca attacggggt cattagttca t 41 <210> 39 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 39 agctagcaca ccgtacacgc ctaccg 26

Claims (54)

  1. 전사 조절인자에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 TonEBP-반응성 전사 인핸서 또는 NFATc-반응성 전사 인핸서 및 상기 TonEBP-반응성 전사 인핸서 또는 NFATc-반응성 전사 인핸서에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 활성화인자 단백질-1 (AP-1)-반응성 전사 인핸서를 포함하는 적어도 하나의 삼투-반응성 전사 조절 요소 (OR-TRE)를 포함하는 단리된 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 전사 조절인자가 프로모터, 인핸서 또는 그의 조합물을 포함하는 것인 핵산 분자.
  3. 제2항에 있어서, 프로모터의 5'에 위치하는 제1 TonEBP-반응성 전사 인핸서 또는 NFATc-반응성 전사 인핸서, 및 상기 프로모터의 3'에 위치하는 제2 TonEBP-반응성 전사 인핸서 또는 NFATc-반응성 전사 인핸서를 포함하는 핵산 분자.
  4. 제1항에 있어서, 상기 OR-TRE의 5'에 위치하는 제1 활성화인자 단백질-1 (AP-1)-반응성 전사 인핸서 및 상기 OR-TRE의 3'에 위치하는 제2 활성화인자 단백질-1 (AP-1)-반응성 전사 인핸서를 포함하는 핵산 분자.
  5. 제1항에 있어서, 활성화인자 단백질-1 (AP-1)-반응성 전사 인핸서가 상기 전사 조절인자의 5'에 위치하고, 상기 전사 조절인자가 프로모터인 핵산 분자.
  6. 제1항에 있어서, 활성화인자 단백질-1 (AP-1)-반응성 전사 인핸서가 상기 전사 조절인자의 3'에 위치하고, 상기 전사 조절인자가 프로모터인 핵산 분자.
  7. 제1항에 있어서, 상기 전사 조절인자의 5'에 위치하는 제1 활성화인자 단백질-1 (AP-1)-반응성 전사 인핸서 및 상기 전사 조절인자의 3'에 위치하는 제2 활성화인자 단백질-1 (AP-1)-반응성 전사 인핸서를 포함하고, 여기서 상기 제1 전사 조절인자 및 상기 제2 전사 조절인자가 프로모터인 핵산 분자.
  8. 제1항에 있어서,
    (a) 적어도 하나의 TonEBP-반응성 전사 인핸서가 서열 1의 핵산 서열을 포함하거나;
    (b) 적어도 하나의 NFATc-반응성 전사 인핸서가 서열 2 또는 서열 4의 핵산 서열을 포함하거나;
    (c) 적어도 하나의 활성화인자 단백질-1 (AP-1)-반응성 전사 인핸서가 서열 3의 핵산 서열을 포함하고,
    여기서 N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있는 것인 핵산 분자.
  9. 제1항에 있어서, 상기 OR-TRE가 서열 7, 서열 8, 또는 서열 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
  10. 제1항에 있어서, 핵산 분자가 전사 조절인자에 작동가능하게 연결된 추가의 핵산 분자를 추가로 포함하고, 여기서 상기 전사 조절인자가 진핵 세포 내에서 전사 활성인 프로모터인 핵산 분자.
  11. 제10항에 있어서, 추가의 핵산 분자가 (a) 관심있는 단백질을 코딩하는 단백질-코딩 핵산 분자; 또는 (b) 조절 핵산 분자를 포함하는 것인 핵산 분자.
  12. 제11항에 있어서, 상기 조절 핵산 분자가 억제성 분자, 안정화 분자, 상향-조절 핵산 분자이거나, 안티센스 분자를 생산하는 것인 핵산 분자.
  13. 제11항에 있어서, 추가의 핵산 분자가 삼투-보호 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 것인 핵산 분자.
  14. 제11항에 있어서, 추가의 핵산 분자가 세포 내에서 발현된 단백질에 유익한 특성을 부여하는 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 것인 핵산 분자.
  15. 제14항에 있어서, 추가의 핵산 분자가 항-세포자멸성 단백질; 세포에 산화 스트레스에 대한 저항성을 부여하는 단백질; 단백질 폴딩의 용이화에 관련되는 샤페론 (chaperone) 단백질; 단백질의 세포외 분비에 관련되는 단백질; 해당 (glycolytic) 효소; 세포 주기 조절 단백질; 글리코실화 효소, 또는 그의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 것인 핵산 분자.
  16. 제12항에 있어서, 억제성 분자가 안티센스 서열, 리보자임, 짧은 간섭 RNA (siRNA), 또는 마이크로RNA (miRNA)를 포함하는 것인 핵산 분자.
  17. 제10항에 있어서, 추가의 핵산 분자가 NFATc 또는 TonEBP 폴리펩티드를 코딩하는 것인 핵산 분자.
  18. 제13항에 있어서, 삼투-보호 단백질 또는 펩티드가 프롤린 또는 글리신-베타인, 타우린 수송체, 글리신 베타인-γ-아미노부티르산 수송체, 나트륨-미오 (myo)-이노시톨 공동수송체, 열 쇼크 단백질, 아쿠아포린, 알도스 리덕타제, 또는 신경병증 표적 에스테라제 (NTE)인 핵산 분자.
  19. 제15항에 있어서, 항-세포자멸성 단백질이 Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, BHRF1, X-IAP, IAP1, IAP2, IEX-1L, Bfl-1 또는 Bcl-w인 핵산 분자.
  20. 제15항에 있어서, 세포에 산화 스트레스에 대한 저항성을 부여하는 단백질이 수퍼옥시드 디스뮤타제, 카탈라제, 글루타티온 퍼옥시다제, 퍼옥시레독신, 술피레독신, 티오레독신, 티오레독신 리덕타제, 티오레독신 퍼옥시다제, 티올트랜스퍼라제, 글루타레독신 또는 글루타티온 리덕타제인 핵산 분자.
  21. 제15항에 있어서, 단백질 폴딩의 용이화에 관련되는 샤페론 단백질이 결합 면역글로불린 단백질 (BiP), 칼넥신, 칼레티쿨린, ERp57 또는 단백질 디술피드 이소머라제 (PDI)인 핵산 분자.
  22. 제15항에 있어서, 해당 효소가 피루베이트 카르복실라제 또는 피루베이트 키나제인 핵산 분자.
  23. 제15항에 있어서, 세포 주기 조절 단백질이 시클린 또는 시클린-의존성 키나제, 또는 시클린 또는 시클린-의존성 키나제의 억제제인 핵산 분자.
  24. 제1항에 있어서, 상기 OR-TRE가 적어도 하나의 표적화 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 것인 단리된 핵산 분자.
  25. 제24항에 있어서, 표적화 핵산 분자가 유즙분비 (lactogenic) 유전자, 유즙분비 메시지, 또는 유즙분비 단백질의 발현을 감소시키기 위해 상기 유즙분비 유전자, 유즙분비 메시지, 또는 유즙분비 단백질을 표적화하기 위한 핵산 분자를 포함하는 것인 핵산 분자.
  26. 제25항에 있어서, 유즙분비 유전자가 락테이트 데히드로게나제인 핵산 분자.
  27. 제25항에 있어서, 유즙분비 유전자 또는 유즙분비 메시지를 표적화하기 위한 핵산 분자를 포함하는 핵산이 짧은 간섭 RNA (siRNA), 마이크로RNA (miRNA), 안티센스 RNA 및/또는 리보자임 활성을 갖는 RNA를 포함하는 것인 핵산 분자.
  28. 제1항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  29. 제28항의 벡터를 포함하는 세포.
  30. 제1항에 있어서, 핵산 분자가 (i) 전사 조절인자에 작동가능하게 연결된, 세포 내에서 발현된 단백질에 유익한 특성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 추가의 핵산 분자, 및 (ii) 세포 내에서 발현시킬 관심있는 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함하고, 여기서, 상기 전사 조절인자는 진핵 세포 내에서 전사 활성인 프로모터이고, (i)의 핵산 분자의 발현이 (ii)의 핵산 분자에 의해 코딩된 폴리펩티드에 상기 유익한 특성을 부여하는 것인 핵산 분자.
  31. 제30항에 있어서, (i)의 추가의 핵산 분자가 항-세포자멸성 단백질; 세포에 산화 스트레스에 대한 저항성을 부여하는 단백질; 단백질 폴딩의 용이화에 관련되는 샤페론 단백질; 단백질의 세포외 분비에 관련되는 단백질; 해당 효소; 세포 주기 조절 단백질; 글리코실화 효소, 또는 그의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 코딩하는 것인 핵산 분자.
  32. (a) (i) 추가의 핵산 분자가 삼투-보호 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 것인 제11항의 핵산 분자, 및/또는 조절 핵산 분자가 억제성 분자, 안정화 분자, 상향-조절 핵산 분자이거나, 안티센스 분자를 생산하는 것인 제11항의 핵산 분자, 및 (ii) 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2의 관심있는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하고;
    (b) 삼투-보호 단백질 또는 펩티드, 또는 삼투-보호 조절 핵산 및 상기 관심있는 단백질이 발현되어, 고오스몰랄농도 (hyperosmolality)의 조건 하에 세포를 보호하고 상기 제2의 관심있는 단백질을 발현시키도록 세포를 배양하는 것
    을 포함하는, 고오스몰랄농도의 조건 하에 세포를 보호하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 삼투-보호 단백질 또는 펩티드가 프롤린 또는 글리신-베타인, 타우린 수송체, 글리신 베타인-γ-아미노부티르산 수송체, 나트륨-미오-이노시톨 공동수송체, 열 쇼크 단백질, 아쿠아포린, 알도스 리덕타제, 또는 신경병증 표적 에스테라제 (NTE)인 방법.
  34. (a) (i) 제14항의 핵산 분자, 및 (ii) 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2의 관심있는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하고;
    (b) 상기 세포가 고오스몰랄농도의 조건 하에 성장될 때 (i)의 핵산 분자의 발현이 (ii)의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드에 상기 유익한 특성을 부여하도록 세포를 배양하는 것
    을 포함하는, 고오스몰랄농도의 조건 하에 세포 내에서 관심있는 단백질을 발현시키는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 세포에서 발현된 단백질에 유익한 특성을 부여하는 단백질 또는 펩티드가 항-세포자멸성 단백질; 세포에 산화 스트레스에 대한 저항성을 부여하는 단백질; 단백질 폴딩의 용이화에 관련되는 샤페론 단백질; 단백질의 세포외 분비에 관련되는 단백질; 해당 효소; 세포 주기 조절 단백질; 글리코실화 효소; 또는 그의 임의의 조합물인 방법.
  36. 제32항 또는 제34항에 있어서, 단계 (b)에서, 상기 세포가 정상 배양 조건 하에 초기에 배양된 세포이고, 이어서 상기 오스몰랄농도가 상기 제2의 관심있는 단백질의 발현을 증가시키기에 충분한 양으로 증가되는 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 오스몰랄농도가 상기 오스몰랄농도를 증가시키는 화합물로 상기 배양액을 스파이킹함으로써 증가되는 것인 방법.
  38. 제36항에 있어서, 상기 제2의 관심있는 단백질이 상기 세포에 독성인 방법.
  39. 제36항에 있어서, 상기 제2의 관심있는 단백질이 불안정한 것인 방법.
  40. 제36항에 있어서, 상기 제2의 관심있는 단백질이 정상적인 배양 조건 하에 발현하기 어려운 것인 방법.
  41. 제32항 또는 제34항에 있어서, 단계 (b)에서, 상기 세포가 정상 배양 조건 하에 초기에 배양된 세포이고, 배양액이 고삼투성으로 되어 상기 제2의 관심있는 단백질의 발현을 증가시키는 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 제2의 관심있는 단백질이 상기 세포에 독성인 방법.
  43. 제41항에 있어서, 상기 제2의 관심있는 단백질이 불안정한 것인 방법.
  44. 제41항에 있어서, 상기 제2의 관심있는 단백질이 정상적인 배양 조건 하에 발현하기 어려운 것인 방법.
  45. 세포에 제11항의 핵산 분자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것을 포함하고, 여기서 추가의 핵산 분자가 삼투-보호 단백질 또는 펩티드, 또는 삼투-보호 조절 핵산을 코딩하는 것인, 삼투 스트레스 또는 삼투 쇼크에 대한 세포의 적응성 또는 저항성을 추가하거나 향상시키는 방법.
  46. (a) 제11항의 핵산 분자 및 (b) 제2 OR-TRE에 작동가능하게 연결된 제2의 관심있는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 것을 포함하고, 여기서 상기 (a)의 핵산 분자가 TonEBP를 코딩하고; 증가된 오스몰랄농도의 조건 하에 상기 (a)의 핵산 분자가 발현되어 TonEBP 단백질을 발현시키고, 상기 TonEBP 단백질이 TonEBP 및 상기 제2의 관심있는 단백질의 발현을 양성적으로 조절하는 것인, 고오스몰랄농도의 조건 하에 세포 내에서 관심있는 단백질을 발현시키는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 제2의 관심있는 단백질이 삼투-보호 단백질인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 삼투-보호 단백질이 프롤린 또는 글리신-베타인, 타우린 수송체, 글리신 베타인-γ-아미노부티르산 수송체, 나트륨-미오-이노시톨 공동수송체, 열 쇼크 단백질, 아쿠아포린, 알도스 리덕타제, 또는 신경병증 표적 에스테라제 (NTE)인 방법.
  49. 제46항에 있어서, 상기 제2의 관심있는 단백질이 상기 세포에 의해 발현된 폴리펩티드에 유익한 특성을 부여하는 단백질인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 유익한 특성을 부여하는 상기 단백질이 항-세포자멸성 단백질; 세포에 산화 스트레스에 대한 저항성을 부여하는 단백질; 단백질 폴딩의 용이화에 관련되는 샤페론 단백질; 단백질의 세포외 분비에 관련되는 단백질; 해당 효소; 세포 주기 조절 단백질; 글리코실화 효소; 또는 그의 임의의 조합인 방법.
  51. 제49항에 있어서, 프로모터에 작동가능하게 연결된 제3의 관심있는 단백질을 코딩하는 제3의 핵산을 추가로 포함하고, 여기서 유익한 특성을 부여하는 상기 단백질이 상기 제3의 관심있는 단백질에 대해 작용하는 것인 방법.
  52. 제11항에 있어서, 추가의 핵산 분자가 TonEBP를 코딩하는 것인 핵산 분자.
  53. 제11항에 있어서, 제2 OR-TRE에 작동가능하게 연결된 제2의 관심있는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 핵산 분자.
  54. 제1항의 핵산 분자를 포함하는 키트.
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