KR20150124383A - Method for measuring multiple protein-protein interactions simultaneously between two yeast library - Google Patents

Method for measuring multiple protein-protein interactions simultaneously between two yeast library Download PDF

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Abstract

The present invention relates to a method for simultaneously analyzing protein-protein binding between libraries through a novel yeast two hybrid system. More particularly, the present invention relates to: a pAD-acc vector and a pDBD-donor vector including a barcode sequence specific to target protein; a yeast strain including a c-myc reporter expression cassette and a Cre reporter expression cassette at the same time; and a method for detecting protein interaction between libraries by introducing the same vectors into the same yeast strain. According to the method of the present invention, interaction between two proteins can be selected in a very simple manner. Therefore, library-to-library selection can be performed beyond an existing yeast two hybrid method. Consequently, the method of the present invention is effective for detecting interaction between proteins.

Description

라이브러리-라이브러리 간 단백질-단백질 결합 동시 분석 방법{Method for measuring multiple protein-protein interactions simultaneously between two yeast library}[0001] The present invention relates to a method for simultaneously analyzing protein-protein binding between a library and a library,

본 발명은 새로운 yeast two hybrid 시스템을 통한 라이브러리-라이브러리 간 단백질-단백질 결합 동시 분석 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 목적 단백질 특이적인 바코드 서열을 포함하는 pAD-acc 벡터 및 pDBD-donor 벡터, c-myc 리포터 발현 카세트 및 Cre 리포터 발현 카세트를 동시에 포함하는 효모 균주, 및 상기 벡터를 상기 효모 균주에 도입하여 라이브러리-라이브러리 간 단백질 상호작용을 검출하는 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a method for simultaneously analyzing protein-protein binding between a library and a library through a novel yeast two hybrid system. More particularly, the present invention relates to a pAD-acc vector and a pDBD-donor vector containing a target protein- a myc reporter expression cassette and a Cre reporter expression cassette, and a method for introducing said vector into said yeast strain to detect library-library protein interaction.

세포 내에서 하나 또는 두 개 이상의 단백질은 서로 상호작용(비공유결합, 물리적인 결합)을 통하여 생물학적인 기능을 나타낸다. 따라서 단백질 간의 상호작용에 대한 이해는 생물학적인 기능을 이해하는데 있어서 매우 중요한 의미를 갖는다. 생화학(biochemistry), 단백질체학(Proteomics), 분자 동력학(molecular dynamics), 신호 전달(signal transduction) 등의 다양한 학문에서 단백질 간의 상호작용을 밝히기 위한 노력이 현재까지 지속되고 있다. 최근 사용되고 있는 단백질 간의 상호작용을 알아보기 위한 방법들은 Co-immunoprecipitation(Co-IP), Fluorescence resonance energy transfer (FRET), Yeast two-hybrid 그리고 최근에 고안된 Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) 등이 잘 알려져 있다.One or more proteins in a cell exhibit biological functions through interaction (non-covalent, physical). Understanding the interactions between proteins is therefore of great importance in understanding biological functions. Efforts to identify protein interactions in diverse disciplines such as biochemistry, proteomics, molecular dynamics, and signal transduction have continued to date. Co-immunoprecipitation (Co-IP), fluorescence resonance energy transfer (FRET), yeast two-hybrid and recently designed Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) are well known.

그 중에서도 Yeast two-hybrid(Fields S, Song O, 1989)는 1989년에 송옥규 박사와 Stanley Fields에 의하여 고안된 방법으로서 일반적인 전사인자(Transcription factor)가 갖는 modular한 특징을 이용한 방법이다. 여기서 modular라는 것은 전사인자의 구조는 DNA 결합 도메인(DNA binding domanin, DBD)과 활성 도메인(Activation domain, AD)으로 구성이 되며 서로 독립적으로 분리되어 발현되어도 어떠한 상호작용에 의하여 두 도메인이 가까운 거리를 유지할 때 전사인자로서의 정상적인 기능이 가능하다는 원리를 이용한 방법이다. Among them, Yeast two-hybrid (Fields S, Song O, 1989) was designed by Dr. Song Ok-kyu and Stanley Fields in 1989 and uses a modular characteristic of a common transcription factor. Here, the modular structure consists of the DNA binding domain (DNA binding domain) (DBD) and the activation domain (AD), and the two domains are close to each other It is a method using the principle that normal function as a transcription factor is possible.

일반적으로 Yeast two-hybrid mothod에서는 Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae)의 GAL4 전사인자를 주로 사용하며 특정 단백질 간의 상호작용 또는 하나의 단백질에 대한 상호작용 파트너를 선별(screening)하는데 널리 사용되고 있다. 따라서 GAL4 전사인자의 각 각의 도메인에 연구하고자하는 단백질의 유전자를 재조합하여 동일한 효모 내에서 발현을 유도하여 상호작용 유무를 알 수 있는 방법이다. 일반적으로 DNA 결합 도메인에는 Bait(미끼)를 활성 도메인에는 Prey(먹이)를 결합하게 되는데 Bait에는 주로 연구하고자하는 한 종류의 단백질에 대한 유전자를 Prey에는 주로 cDNA library를 재조합하여 Bait 단백질에 대한 상호작용 파트너를 선별하는 방식으로 진행된다. DNA 결합 도메인과 Bait, 활성 부위와 Prey는 각 각 독립적인 벡터(Vector)의 형태로 효모에 형질전환(transformation)되고 도입 후 각 각의 벡터에 존재하는 ADH1 프로모터(ADH1 promoter)에 의하여 항시발현(Constitutive expression)된다. 발현된 DBD-Bait, AD-Prey 결합 단백질은 DNA 결합 도메인과 활성 도메인의 N-말단(N-terminus)에 존재하는 NLS(Nuclear Localization Signal)에 의하여 효모의 핵으로 이동하게 된다. 그 후 핵 내에서 Bait와 Prey가 서로 상호작용하지 않을 경우에는 DBD-Bait, AD-Prey가 복합체를 이루지 못하므로 정상적인 GAL4 전사인자의 기능을 할 수 없다. 그러나 Bait와 Prey가 서로 상호작용하는 경우에는 DBD-Bait-Prey-AD 복합체(DBD-Bait-Prey-AD complex)가 형성되어 GAL4 전사인자의 정상적인 기능을 수행할 수 있게 되어 효모의 유전체 내에 존재하는 리포터(Reporter)의 발현을 유도하게 된다. Generally, in yeast two-hybrid mothod, GAL4 transcription factor of Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is mainly used and is widely used for screening interactions among specific proteins or interaction partners for one protein. Therefore, it is a method of recombination of gene of protein to be studied in each angular domain of GAL4 transcription factor and induction of expression in the same yeast to determine whether or not there is an interaction. In general, Bait binds to the DNA binding domain and Prey (prey) to the active domain. In Bait, a gene for one kind of protein to be studied is prey, and a cDNA library is mainly recombined for Bait to interact with Bait protein It is conducted in a way that selects partners. DNA binding domain, Bait, active site and Prey were transformed into yeast in the form of independent vectors and expressed by the ADH1 promoter (ADH1 promoter) present in each vector after introduction Constitutive expression. The expressed DBD-Bait and AD-Prey binding proteins are transferred to the yeast nucleus by NLS (Nuclear Localization Signal) located at the N-terminus of the DNA binding domain and the active domain. If Bait and Prey do not interact with each other in the nucleus, DBD-Bait and AD-Prey do not form a complex, so they can not function as normal GAL4 transcription factors. However, when Bait and Prey interact with each other, DBD-Bait-Prey-AD complex (DBD-Bait-Prey-AD complex) is formed to perform the normal function of GAL4 transcription factor. Which leads to the expression of the reporter.

이러한 원리로 리포터 유전자의 발현을 통하여 Bait와 Prey의 상호작용을 확인하는 방법이다. 효모 유전체 내의 리포터는 GAL4 전사인자의 DNA 결합 도메인이 결합할 수 있는 GAL4 UAS (Upstream Activation Sequence)와 레포터 유전자로 구성되는데 대표적으로 LacZ, MEL1(Colormetric repoter), HIS3, ADE2, URA3(Authotrophic reporter) 등의 유전자가 사용된다. 따라서 결과 적으로 Bait와 Prey가 서로 상호작용하는 경우 DBD-Bait-Prey-AD 복합체가 리포터의 GAL4 UAS에 결합하여 리포터 유전자의 발현을 유도하게 된다.This principle is a method to confirm the interaction of Bait and Prey through the expression of the reporter gene. Reporters in the yeast genome are composed of GAL4 UAS (Upstream Activation Sequence) and reporter genes to which the DNA binding domain of the GAL4 transcription factor can bind. Typically, LacZ, MEL1 (Colormetric reporter), HIS3, ADE2, URA3 (Authotrophic reporter) Are used. As a result, when Bait and Prey interact with each other, the DBD-Bait-Prey-AD complex binds to the reporter GAL4 UAS and induces the expression of the reporter gene.

이러한 Yeast two-hybrid가 가지는 장점 중에는 in vivo 에서 수행이 가능하다는 점, 고등진핵생물(Higher eukaryote)인 효모를 이용하므로 박테리아(Bacteria)를 이용할 때 보다 유리하다는 점, 실험을 수행하는데 필요한 요소가 많지 않다는 점, 수천가지 단백질 간의 상호작용을 동시에 선별할 수 있다는 점 등이 있다. 반면 기존의 Yeast two-hybrid system(이하 Y2H)은 몇 가지 한계를 가지고 있었다. One of the advantages of this yeast two-hybrid is that it can be performed in vivo, it is more advantageous to use bacteria than yeast because it is a high eukaryote, And the ability to simultaneously screen thousands of protein interactions. On the other hand, the existing yeast two-hybrid system (Y2H) has some limitations.

첫 번째 한계는 대량 선별이 어렵다는 것이다. Y2H를 통하여 특정 단백질에 대한 상호작용 단백질을 찾기 위한 선별(screening)을 수행할 경우 높은 다양성(diversity)을 갖는 단백질 라이브러리가 사용된다. 예를 들어 특정 단백질 A에 대한 상호작용 단백질을 찾기 위한 선별에서 1.0 x 107의 다양성을 갖는 단백질 라이브러리를 사용할 경우 1개의 한천배지에서 천(1.0 x 103)개의 효모 colony를 선별할 수 있다고 하면 실험자는 선별을 위해서 만개의 한천배지를 사용하여야 한다. 이는 실험자에게 상당히 높은 노동력이 소모됨과 동시에 시간 그리고 비용적인 측면에서 상당히 비효율적이다. 따라서 이러한 문제로 인하여 대량 선별이 어렵다는 한계를 가지고 있다.The first limitation is that mass screening is difficult. A protein library with high diversity is used when performing screening to find an interacting protein for a specific protein through Y2H. For example, if a protein library with a diversity of 1.0 x 10 7 is used for screening for interacting proteins for a specific protein A, one (1 x 10 3 ) yeast colony can be selected from one agar medium The experimenter should use full agar medium for screening. This consumes a considerably high labor force for the experimenter, as well as considerable inefficiency in terms of time and cost. Therefore, it is difficult to select the mass because of these problems.

두 번째 한계는 선별을 통하여 얻은 데이터의 분석이다. 기존의 방법에서는 한천배지를 이용하여 positive candidate(단백질 간의 상호작용이 존재하는 효모)를 선별한 후에 plasmid를 얻어 sanger sequencing을 통하여 prey 유전자의 데이터를 분석하는 방식으로 진행되었다. 이러한 방식을 사용 할 경우 대량 선별을 통하여 얻은 positive candidate를 모두 분석하는 것은 많은 노동력을 필요로 하며 시간과 비용 또한 상당히 비효율 적이다. The second limitation is the analysis of data obtained through screening. In the conventional method, a positive candidate (a yeast with interactions between proteins) was selected using an agar medium, and a plasmid was obtained and analyzed by precher gene sequencing. Using this method, analyzing all the positive candidates obtained through mass screening requires a lot of labor and time and cost are also quite inefficient.

세 번째 한계는 기존의 reporter system의 민감도(sensitivity) 문제이다. 기존의 Y2H에 사용되는 reporter system(예를 들어 β-galactosidase, HIS3, ADE2 등)을 사용하였을 경우 약한 단백질 간의 상호작용을 선별할 수 없다는 단점을 가지고 있다. 그 외 자동화가 어렵다는 점, 단백질 자체가 스스로 활성화 되어 전사(transcription)를 활성화 할 경우 사용 할 수 없다는 점, 단백질 간의 상호작용에 보인자(Co-factor)가 필요한 경우 선별하기 어렵다는 점 등이 있다.The third limitation is the sensitivity of existing reporter systems. The use of reporter systems (eg, β-galactosidase, HIS3, ADE2, etc.) used in conventional Y2H has the disadvantage that it can not discriminate weak protein interactions. And other difficulties in automation, the fact that the protein itself can not be activated when it is activated by transcription, and it is difficult to select when a co-factor is required for protein interactions.

본 발명자들은 기존 Yeast two-hybrid 시스템의 단점을 보완하는 새로운 방법을 연구하던 중, bait 및 prey 두 단백질의 상호작용에 의해 효모 균주 세포벽에 c-myc 에피토프가 발현되는 1st 리포터 시스템 및 bait 및 prey 두 단백질의 상호작용에 의해 Cre recombinase가 발현이 되고 이에 의하여 바코드 서열 조합 및 형광 발현이 발생하는 2nd 리포터 시스템이 동시에 작동하는 dual repoter Yeast two-hybrid 시스템을 구축하여, 한천배지를 사용하지 않고 스크리닝이 가능하며 바코드 서열에 의해 데이터 분석이 단순화 및 대량화된 본 발명을 완성하였다.The present inventors investigated a new method to overcome the disadvantages of the existing yeast two-hybrid system. The inventors of the present invention found that the c-myc epitope was expressed in the yeast cell wall by the interaction of the bait and prey proteins, Cre recombinase is expressed by the interaction of proteins. Thus, a dual reporter yeast two-hybrid system in which the 2nd reporter system in which bar code sequence combination and fluorescence expression occurs simultaneously can be constructed and screened without using agar medium And the data analysis is simplified and mass-produced by the bar code sequence.

따라서 본 발명의 목적은 플라스미드 pGADT7의 LEU2 유전자 말단에 loxP 서열을 삽입하고, 멀티플 클로닝 사이트(MCS)를 두 개의 Sfi I 제한효소 자리로 대체하고, 그 뒤로 바코드 삽입 부위, lox2272 서열이 순차적으로 도입된 것을 특징으로 하는 pAD-acc 벡터를 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for producing a recombinant vector, which comprises loxP sequence insertion at the LEU2 gene end of the plasmid pGADT7, replacement of multiple cloning sites (MCS) with two Sfi I restriction sites, followed by insertion of a barcode insertion site, Lt; RTI ID = 0.0 > pAD-acc < / RTI >

본 발명의 다른 목적은 플라스미드 pGBKT7에 멀티플 클로닝 사이트(MCS)를 제거하고, 멀티플 클로닝 사이트(MCS)를 두 개의 Sfi I 제한효소 자리로 대체하고, 그 뒤로 lox2272 서열과 바코드 삽입 부위, 카나마이신 항생제 저항성 유전자와 프로모터, GFP 유전자 및 loxP 서열이 순차적으로 도입된 것을 특징으로 하는 pDBD-donor 벡터를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to eliminate the multiple cloning site (MCS) in the plasmid pGBKT7, to replace the multiple cloning site (MCS) with two SfiI restriction sites, followed by the lox2272 sequence and the barcode insertion site, the kanamycin antibiotic resistance gene And a promoter, a GFP gene, and a loxP sequence are sequentially introduced into the pDBD-donor vector.

본 발명의 다른 목적은 하기 (i) 및 (ii)의 발현 카세트를 동시에 포함하는, 이중(dual) 리포터 효모 균주를 제공하는 것이다; (i) 순차적으로 작동 가능하게 연결되며 GAL4 UAS(upstream activation sequence), GAL1 프로모터, MFα1 유전자, c-myc 에피토프 코딩 폴리뉴클레오티드 및 AgαI 유전자를 포함하는 c-myc 리포터 발현 카세트; 및 (ii) 순차적으로 작동 가능하게 연결되며 GAL4 UAS(upstream activation sequence), GAL1 프로모터 및 Cre 재조합효소(Cre recombinase) 발현 유전자를 포함하는 Cre 리포터 발현 카세트.Another object of the present invention is to provide a dual reporter yeast strain comprising simultaneously the expression cassettes of (i) and (ii) below; (i) a c-myc reporter expression cassette comprising a GAL4 upstream activation sequence, GAL1 promoter, MFα1 gene, c-myc epitope-encoding polynucleotide and AgαI gene operably linked in sequence; And (ii) a Cre reporter expression cassette comprising a GAL4 upstream activation sequence, GAL1 promoter and Cre recombinase expression gene operably linked in sequence.

본 발명의 다른 목적은 (a) 상기 pAD-acc 벡터 및 상기 pDBD-donor 벡터에 각각 상이한 바코드 서열을 도입하고, 서로 다른 목적 단백질을 발현하는 유전자를 재조합하여 제 1, 제 2 라이브러리를 구성하는 단계; (b) 상기 제1 및 제2라이브러리를 상기 이중 리포터 효모 균주에 도입하는 단계; (c) 상기 제1라이브러리 및 제2라이브러리가 도입된 효모 균주로부터, 상기 pAD-acc 벡터에 도입된 유전자로부터 발현된 단백질과 상기 pDBD-donor 벡터에 도입된 유전자로부터 발현된 단백질이 서로 상호작용하는 효모 균주를 선별하는 단계; 및 (d) 상기 선별된 효모균주의 바코드 서열을 식별하여 상기 상호작용하는 단백질을 선택하는 단계를 포함하는 단백질간의 상호작용을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is (a) constructing first and second libraries by introducing different barcode sequences into the pAD-acc vector and the pDBD-donor vector, respectively, and recombining the genes expressing different target proteins ; (b) introducing said first and second libraries into said double reporter yeast strain; (c) a protein expressed from the gene introduced into the pAD-acc vector and a protein expressed from the gene introduced into the pDB-donor vector interact with each other from the yeast strain into which the first library and the second library are introduced Selecting yeast strains; And (d) selecting the interacting protein by identifying the bar code sequence of the selected yeast strain.

상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 플라스미드 pGADT7의 LEU2 유전자 말단에 loxP 서열을 삽입하고, 멀티플 클로닝 사이트(MCS)를 두 개의 Sfi I 제한효소 자리로 대체하고, 그 뒤로 바코드 삽입 부위, lox2272 서열이 순차적으로 도입된 것을 특징으로 하는 pAD-acc 벡터를 제공한다.In order to accomplish the above object, the present invention provides a plasmid pGADT7, wherein the loxP sequence is inserted at the LEU2 gene end of the plasmid pGADT7, the multiple cloning site (MCS) is replaced with two SfiI restriction sites, and the barcode insertion site, lox2272 sequence Lt; RTI ID = 0.0 > pAD-acc < / RTI >

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 플라스미드 pGBKT7에 멀티 클로닝 사이트(MCS)를 제거하고, 멀티플 클로닝 사이트(MCS)를 두 개의 Sfi I 제한효소 자리로 대체하고, 그 뒤로 lox2272 서열과 바코드 삽입 부위, 카나마이신 항생제 저항성 유전자와 프로모터, GFP 유전자 및 loxP 서열이 순차적으로 도입된 것을 특징으로 하는 pDBD-donor 벡터를 제공한다.In order to accomplish another object of the present invention, the present invention provides a method for screening a plasmid pGBKT7 by removing a multicloning site (MCS) in a plasmid pGBKT7, replacing a multiple cloning site (MCS) with two SfiI restriction sites, followed by a lox2272 sequence and a barcode insertion Donor vector characterized in that a kanamycin antibiotic resistance gene and a promoter, a GFP gene and a loxP sequence are sequentially introduced.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 하기 (i) 및 (ii)의 발현 카세트를 동시에 포함하는, 이중(dual) 리포터 효모 균주를 제공한다; (i) 순차적으로 작동 가능하게 연결되며 GAL4 UAS(upstream activation sequence), GAL1 프로모터, MFα1 유전자, c-myc 에피토프 코딩 폴리뉴클레오티드 및 AgαI 유전자를 포함하는 c-myc 리포터 발현 카세트; 및 (ii) 순차적으로 작동 가능하게 연결되며 GAL4 UAS(upstream activation sequence), GAL1 프로모터 및 Cre 재조합효소(Cre recombinase) 발현 유전자를 포함하는 Cre 리포터 발현 카세트.To achieve another object of the present invention, there is provided a dual reporter yeast strain comprising simultaneously the expression cassettes of (i) and (ii) below; (i) a c-myc reporter expression cassette comprising a GAL4 upstream activation sequence, GAL1 promoter, MFα1 gene, c-myc epitope-encoding polynucleotide and AgαI gene operably linked in sequence; And (ii) a Cre reporter expression cassette comprising a GAL4 upstream activation sequence, GAL1 promoter and Cre recombinase expression gene operably linked in sequence.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 (a) 상기 pAD-acc 벡터 및 상기 pDBD-donor 벡터에 각각 상이한 바코드 서열을 도입하고, 서로 다른 목적 단백질을 발현하는 유전자를 재조합하여 제 1, 제 2 라이브러리를 구성하는 단계; (b) 상기 제1 및 제2라이브러리를 상기 이중 리포터 효모 균주에 도입하는 단계; (c) 상기 제1라이브러리 및 제2라이브러리가 도입된 효모 균주로부터, 상기 pAD-acc 벡터에 도입된 유전자로부터 발현된 단백질과 상기 pDBD-donor 벡터에 도입된 유전자로부터 발현된 단백질이 서로 상호작용하는 효모 균주를 선별하는 단계; 및 (d) 상기 선별된 효모균주의 바코드 서열을 식별하여 상기 상호작용하는 단백질을 선택하는 단계를 포함하는 단백질간의 상호작용을 검출하는 방법을 제공한다.In order to accomplish another object of the present invention, the present invention provides a method for producing a recombinant vector comprising (a) introducing different barcode sequences into the pAD-acc vector and the pDBD-donor vector, 2 building a library; (b) introducing said first and second libraries into said double reporter yeast strain; (c) a protein expressed from the gene introduced into the pAD-acc vector and a protein expressed from the gene introduced into the pDB-donor vector interact with each other from the yeast strain into which the first library and the second library are introduced Selecting yeast strains; And (d) selecting the interacting protein by identifying the bar code sequence of the selected yeast strain.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 플라스미드 pGADT7의 LEU2 유전자 말단에 loxP 서열을 삽입하고, 멀티플 클로닝 사이트(MCS)를 두 개의 Sfi I 제한효소 자리로 대체하고, 그 뒤로 바코드 삽입 부위, lox2272 서열이 순차적으로 도입된 것을 특징으로 하는 pAD-acc 벡터를 제공한다.The present invention is characterized in that the loxP sequence is inserted into the LEU2 gene end of the plasmid pGADT7, the multiple cloning site (MCS) is replaced with two SfiI restriction sites, and the barcode insertion site and the lox2272 sequence are sequentially introduced PAD-acc < / RTI >

본 발명의 pAD-acc 벡터는 pGADT7벡터를 기본으로 유전자 변형을 통하여 제조된 것으로 LEU2 유전자 말단에 loxP 서열을 삽입하고, 멀티플 클로닝 사이트(MCS)를 두 개의 Sfi I 제한효소 자리로 대체하고, 그 뒤로 바코드 삽입 부위, lox2272 서열이 순차적으로 도입된 것을 특징으로 한다.The pAD-acc vector of the present invention was prepared through gene modification based on the pGADT7 vector. The pAD-acc vector was constructed by inserting the loxP sequence at the end of the LEU2 gene, replacing the multiple cloning site (MCS) with two Sfi I restriction sites, A barcode insertion site, and a lox2272 sequence are sequentially introduced.

상기 pGADT7벡터는 목적 단백질을 GAL4 activation 도메인(AD)에 결합하여 발현될 수 있도록 디자인 된 yeast two hybrid 벡터로 [도 3]의 개열지도와 같은 구조를 가진다.The pGADT7 vector is a yeast two hybrid vector designed to bind the target protein to the GAL4 activation domain (AD), and has the same structure as the cleavage map of [Fig. 3].

상기 LEU2 유전자는 류신의 upstream 조절 인자로 일반적으로 효모의 스크리닝에 사용되며, pGADT7벡터에 기본적으로 포함된다.The LEU2 gene is an upstream regulator of leucine and is generally used for yeast screening and is basically contained in the pGADT7 vector.

loxP 서열 및 lox2272 서열은 Cre recombinase에 인식되고 switching 되는 서열이다. 본 발명의 벡터는 LEU2 유전자 하단에 loxP 서열을, 제거된 멀티플 클로닝 사이트에 lox2272 서열을 붙여 Cre recombinase에 의해 다른 서열(유전자)이 LEU2 하단에 결합하면 발현이 이루어지게 구성되어 있다. 이를 위하여 loxP 서열이 도입되는 LEU2 유전자 말단은 종결코돈을 제거하여 발현시 LEU2 말단에서 발현이 중단되지 않도록 구성되어 있다. 또한 lox2272 서열 뒤에 바코드 서열 삽입부위를 도입하여 바코드 서열 삽입부위에 삽입된 바코드 서열이 Cre recombinase에 의해 결합된 다른 서열과 함께 발현되도록 구성되어 있다. 도 5에서 본 발명의 Cre recombinase에 의하여 pDBD-donor 벡터로부터 일부 서열이 pAD-acc 벡터로 switch 된 후의 벡터의 개열지도를 도시하며, 이러한 벡터의 switch 과정 및 결과물을 도 14에서 도시한다. The loxP sequence and the lox2272 sequence are sequences recognized and switched to Cre recombinase. The vector of the present invention is constructed such that the loxP sequence is attached to the lower end of the LEU2 gene, the lox2272 sequence is attached to the removed multiple cloning site, and the other sequence (gene) is bound to the lower end of LEU2 by Cre recombinase. For this purpose, the end of the LEU2 gene in which the loxP sequence is introduced is constructed so as not to stop the expression at the end of LEU2 upon elimination of the stop codon. The barcode sequence insertion site is introduced after the lox2272 sequence so that the barcode sequence inserted at the barcode sequence insertion site is expressed together with other sequences joined by Cre recombinase. FIG. 5 shows a cleavage map of a vector after a partial sequence is switched from a pDBD-donor vector to a pAD-acc vector by the Cre recombinase of the present invention. The switch process and the result of such a vector are shown in FIG.

상기 바코드 서열 삽입부위는 본 벡터의 유전자 삽입부위에 도입되는 유전자를 표시하는 서열로 뉴클레오티드 수는 특별히 제한되지 아니하나, 1개 내지 20개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있으며, 바람직하게는 5개 내지 15개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 상기 바코드 서열 삽입부위는 임의의 제한효소 인식부위를 포함하여 원하는 바코드를 도입할 수 있게 하는 것이 바람직하며, 상기 제한효소는 공지의 제한효소로 그 종류가 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 BsiW I, XbaI 및 Sac II의 제한효소 일 수 있으며, 예를 들어 BsiW I 및 Sac II의 세트 또는 XbaI 및 Sac II 세트를 사용할 수 있다.The barcode sequence insertion site is a sequence representing a gene to be introduced into the gene insertion site of the present vector. The number of nucleotides is not particularly limited, but may be 1 to 20 nucleotides, preferably 5 to 15 nucleotides Nucleotides < / RTI > It is preferable that the barcode sequence insertion site includes an arbitrary restriction enzyme recognition site so that a desired barcode can be introduced. The restriction enzyme is a known restriction enzyme and its kind is not particularly limited. Preferably, the restriction enzyme is a BsiW I , XbaI and SacII, for example a set of BsiW I and Sac II or a set of XbaI and Sac II.

상기‘멀티플 클로닝 사이트(MCS)를 두 개의 Sfi I 제한효소 자리로 대체’는, 상기 기존 벡터의 MCS를 목적 단백질에 대한 유전자 삽입부위로 만드는 것을 의미한다. 상기 유전자 삽입부위는 라이브러리를 구성하는 목적 유전자가 삽입될 수 있는 부위로 임의의 제한효소 인식부위를 포함하여 원하는 유전자를 도입할 수 있게 하는 것이 바람직하며, 상기 제한효소는 공지의 제한효소로 그 종류가 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 두 개의 Sfi I 일 수 있다. 상기 유전자 삽입부위에 삽입되는 유전자는 pDBD-donor 벡터에 도입되는 유전자와 상호 interaction을 알고자 하는 목적 유전자로서 그 종류는 특별히 제한되지 아니한다.Replacing the 'multiple cloning site (MCS) with two Sfi I restriction enzyme sites' means making the MCS of the existing vector a gene insertion site for the target protein. It is preferable that the gene insertion site allows a desired gene to be introduced by incorporating an arbitrary restriction enzyme recognition site into a site into which a target gene constituting the library can be inserted, and the restriction enzyme is a known restriction enzyme, Is not particularly limited, but may preferably be two Sfi I. The gene to be inserted into the gene insertion site is a target gene to be mutually interacted with a gene introduced into the pDBD-donor vector, and its kind is not particularly limited.

본 발명의 pAD-acc 벡터는 바람직하게는 [도 1] 또는 [도 10]의 개열지도로 나타내어질 수 있다. 도 1과 도 10의 개열지도는 바코드 삽입부위에 포함되는 제한효소 인식 서열에서 차이가 있을 뿐 이외의 다른 구성은 모두 동일하다. 도 1의 개열지도로 표시되는 pAD-acc 벡터의 바코드 삽입부위에는 BsiW I 및 Sac II의 제한효소 인식 서열이 포함되어있으며 도 10의 개열지도로 표시되는 pAD-acc 벡터의 바코드 삽입부위에는 XbaI 및 Sac II의 제한효소 인식서열이 포함되어 있다. The pAD-acc vector of the present invention can be preferably represented by a cleavage map of [Figure 1] or [Figure 10]. The cleavage maps of FIGS. 1 and 10 are identical except for the restriction enzyme recognition sequence included in the barcode insertion site. The barcode insertion site of the pAD-acc vector represented by the cleaved map in Fig. 1 contains the restriction enzyme recognition sequence of BsiW I and Sac II, and the bar code insertion site of the pAD-acc vector represented by the cleaved map of Fig. Contains the restriction enzyme recognition sequence of Sac II.

또한 본 발명은 플라스미드 pGBKT7에 멀티플 클로닝 사이트(MCS)를 제거하고, 멀티플 클로닝 사이트(MCS)를 두 개의 Sfi I 제한효소 자리로 대체하고, 그 뒤로 lox2272 서열과 바코드 삽입 부위, 카나마이신 항생제 저항성 유전자와 프로모터, GFP 유전자 및 loxP 서열이 순차적으로 도입된 것을 특징으로 하는 pDBD-donor 벡터를 제공한다.The present invention also relates to a method for screening a plasmid pGBKT7 which comprises the steps of removing multiple cloning sites (MCS) in plasmid pGBKT7, replacing multiple cloning sites (MCS) with two SfiI restriction sites, followed by lox2272 sequence and barcode insertion site, kanamycin antibiotic resistance gene and promoter , A GFP gene and a loxP sequence are sequentially introduced into the pDBD-donor vector.

본 발명의 pDBD-donor 벡터는 pGBKT7 벡터를 기본으로 유전자 변형을 통하여 제조된 것으로 멀티플 클로닝 사이트(MCS)를 제거하고, 멀티플 클로닝 사이트(MCS)를 두 개의 Sfi I 제한효소 자리로 대체하고, 그 뒤로 lox2272 서열과 바코드 삽입 부위, 카나마이신 항생제 저항성 유전자와 프로모터, GFP 유전자 및 loxP 서열이 순차적으로 도입된 것을 특징으로 한다.The pDBD-donor vector of the present invention was prepared by gene-transformation based on the pGBKT7 vector. The multiple cloning site (MCS) was removed, the multiple cloning site (MCS) was replaced with two Sfi I restriction sites, a lox2272 sequence and a barcode insertion site, a kanamycin antibiotic resistance gene and a promoter, a GFP gene, and a loxP sequence are sequentially introduced.

상기 pGBKT7 벡터는 목적 단백질을 GAL4 DNA binding 도메인(DBD)에 결합하여 발현될 수 있도록 디자인 된 yeast two hybrid 벡터로 [도 4]의 개열지도와 같은 구조를 가진다.The pGBKT7 vector is a yeast two hybrid vector designed to bind a target protein to the GAL4 DNA binding domain (DBD), and has the same structure as the cleavage map of FIG.

loxP 서열 및 lox2272 서열은 Cre recombinase에 인식되고 switching 되는 서열이다. 본 발명의 pDBD-donor 벡터는 Cre recombinase에 의해 인식되고 재조합되는 loxP 서열 및 lox2272 서열을 포함하며, 상기 loxP 서열 및 lox2272 서열 사이에 GFP 유전자 및 바코드 서열 삽입부위가 도입되어 있다.The loxP sequence and the lox2272 sequence are sequences recognized and switched to Cre recombinase. The pDBD-donor vector of the present invention includes a loxP sequence and a lox2272 sequence recognized and recombined by Cre recombinase, and a GFP gene and a barcode sequence insertion site are introduced between the loxP sequence and the lox2272 sequence.

Cre recombinase에 의해 loxP 서열 및 lox2272 서열 사이 부분이 pAD-acc 벡터로 도입되면 상기 GFP(green fluorescent protein) 유전자는 LEU2 프로모터에 의해 발현이 되어 형광을 나타내며, 바코드 서열은 pAD-acc 벡터의 바코드 서열과 연결되어 식별될 수 있도록 구성되어 있다.When the part between the loxP sequence and the lox2272 sequence is introduced into the pAD-acc vector by Cre recombinase, the GFP (green fluorescent protein) gene is expressed by the LEU2 promoter to exhibit fluorescence, and the barcode sequence corresponds to the bar code sequence of the pAD- So that they can be connected and identified.

상기 바코드 서열 삽입부위는 본 벡터의 유전자 삽입부위에 도입되는 유전자를 표시하는 서열로 뉴클레오티드 수는 특별히 제한되지 아니하나, 1개 내지 20개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있으며, 바람직하게는 5개 내지 15개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 상기 바코드 서열 삽입부위는 임의의 제한효소 인식부위를 포함하여 원하는 바코드를 도입할 수 있게 하는 것이 바람직하며, 상기 제한효소는 공지의 제한효소로 그 종류가 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 Afl II 및 Age I 일 수 있다.The barcode sequence insertion site is a sequence representing a gene to be introduced into the gene insertion site of the present vector. The number of nucleotides is not particularly limited, but may be 1 to 20 nucleotides, preferably 5 to 15 nucleotides Nucleotides < / RTI > It is preferable that the barcode sequence insertion site includes an arbitrary restriction enzyme recognition site so that a desired barcode can be introduced. The restriction enzyme is a known restriction enzyme and its kind is not particularly limited. Preferably, the restriction enzyme is Afl II And Age I.

상기‘멀티플 클로닝 사이트(MCS)를 두 개의 Sfi I 제한효소 자리로 대체’는, 상기 기존 벡터의 MCS를 목적 단백질에 대한 유전자 삽입부위로 만드는 것을 의미한다. 상기 유전자 삽입부위는 라이브러리를 구성하는 목적 유전자가 삽입될 수 있는 부위로 임의의 제한효소 인식부위를 포함하여 원하는 유전자를 도입할 수 있게 하는 것이 바람직하며, 상기 제한효소는 공지의 제한효소로 그 종류가 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 두 개의 Sfi I 일 수 있다. 상기 유전자 삽입부위에 삽입되는 유전자는 pAD-acc 벡터에 도입되는 유전자와 상호 interaction을 알고자 하는 목적 유전자로 그 종류는 특별히 제한되지 아니한다.Replacing the 'multiple cloning site (MCS) with two Sfi I restriction enzyme sites' means making the MCS of the existing vector a gene insertion site for the target protein. It is preferable that the gene insertion site allows a desired gene to be introduced by incorporating an arbitrary restriction enzyme recognition site into a site into which a target gene constituting the library can be inserted, and the restriction enzyme is a known restriction enzyme, Is not particularly limited, but may preferably be two Sfi I. The gene to be inserted into the gene insertion site is a target gene to be mutually interacted with a gene to be introduced into the pAD-acc vector, and the kind thereof is not particularly limited.

본 발명의 pDBD-donor 벡터는 바람직하게는 [도 2]의 개열지도로 나타내어질 수 있다. 도 2의 개열지도로 표시되는 pDBD-donor 벡터의 바코드 삽입부위에는 Afl II 및 Age I의 제한효소 인식서열이 포함되어있다. The pDBD-donor vector of the present invention can be preferably represented by a cleavage map of [Fig. 2]. The barcode insertion site of the pDBD-donor vector represented by the cleaved map in Fig. 2 contains restriction enzyme recognition sequences of Afl II and Age I.

한편, 본 발명은 하기 (i) 및 (ii)의 발현 카세트를 동시에 포함하는 이중(dual) 리포터 효모 균주를 제공한다;On the other hand, the present invention provides dual reporter yeast strains simultaneously containing the expression cassettes of (i) and (ii) below;

(i) 순차적으로 작동 가능하게 연결되며 GAL4 UAS(upstream activation sequence), GAL1 프로모터, MFα1 유전자, c-myc 에피토프 코딩 폴리뉴클레오티드 및 AgαI 유전자를 포함하는 c-myc 리포터 발현 카세트; 및 (i) a c-myc reporter expression cassette comprising a GAL4 upstream activation sequence, GAL1 promoter, MFα1 gene, c-myc epitope-encoding polynucleotide and AgαI gene operably linked in sequence; And

(ii) 순차적으로 작동 가능하게 연결되며 GAL4 UAS(upstream activation sequence), GAL1 프로모터 및 Cre 재조합효소(Cre recombinase) 발현 유전자를 포함하는 Cre 리포터 발현 카세트.(ii) a Cre reporter expression cassette comprising a GAL4 upstream activation sequence, GAL1 promoter and Cre recombinase expression gene operably linked in sequence.

본 발명의 효모 균주는, 상기 (i)의 발현 카세트에 의한 c-myc 리포터 시스템(도 11의 A에 도시) 및 (ii)의 발현 카세트에 의한 Cre 리포터 시스템(도 11의 B에 도시)의 이중 리포터 시스템을 가지는 것이 그 특징이다. The yeast strain of the present invention is characterized in that the expression system of the Cre reporter system (shown in Fig. 11B) by the expression cassette of the above (i) with the c-myc reporter system (shown in Fig. 11A) It is characterized by having a dual reporter system.

본 발명의 효모 균주는 효모 이중 보합계(yeast two hybrid)에 사용될 수 있는 균주는 어떤 것이든 가능하며, 바람직하게는 사카로마이세스 속 균주일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주 일 수 있다.The yeast strain of the present invention may be any strain that can be used for the yeast two hybrid, preferably a strain of the genus Saccharomyces, more preferably a strain of Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae strain.

본 발명에서 용어‘발현 카세트’는 ‘발현 구조체’와 호환성 있게 사용되며, 목적하는 구조 유전자를 발현할 수 있는 핵산 구조체를 의미하는 것으로, 세포에 따라 적절한 프로모터 및 이와 작동가능 하게 연결된 구조 유전자 등을 포함한다. In the present invention, the term 'expression cassette' refers to a nucleic acid construct which is used interchangeably with an 'expression construct' and is capable of expressing a desired structural gene. The expression cassette may include a suitable promoter and a structural gene operably linked thereto, .

상기 (i)의 c-myc 리포터 발현 카세트는 본 명세서에서 1st repoter 또는 1st repoter system 등으로 지칭 될 수 있으며, 순차적으로 작동 가능하게 연결되어있는 GAL4 UAS(upstream activation sequence), GAL1 프로모터, MFα1 유전자, c-myc 에피토프 코딩 폴리뉴클레오티드 및 AgαI 유전자가 포함된 것이 그 특징이다. The c-myc reporter expression cassette of (i) may be referred to herein as a first reporter or a first reporter system, and may include a GAL4 upstream activation sequence, a GAL1 promoter, an MF alpha 1 gene, c-myc epitope-encoding polynucleotide and Ag? I gene.

상기 GAL4 UAS는 GAL4 전사인자인 DNA 결합 도메인(DBD)이 결합 할 수 있는 서열을 말한다. 본 발명의 pAD-acc 벡터 및 pDBD-donor 벡터가 효모 균주 내로 도입되어 발현되면 양 벡터에 삽입되어 있는 상호작용 여부를 확인하고자 하는 단백질이 각각 DBD 및 AD에 결합된 상태로 제조가 되고, (이들은 통상 각각 DBD-Bait 및 AD-Prey로 불린다) 이들이 상호작용하면 GAL4 전사인자가 작동하여 하위 report 서열의 전사가 일어나게 된다. The GAL4 UAS refers to a sequence to which a DNA binding domain (DBD), which is a GAL4 transcription factor, can bind. When the pAD-acc vector and the pDBD-donor vector of the present invention are introduced into yeast strains and expressed, the proteins to be mutually inserted in the both vectors are prepared in the state of binding to DBD and AD, Usually referred to as DBD-Bait and AD-Prey, respectively). When they interact, GAL4 transcription factor activates and transcription of the lower report sequence occurs.

MFα1 유전자는, 효모에서 외래 유전자에 의한 단백질(본 발명에서 c-myc 에피토프)의 분비를 위한 분비 신호 인자이다.The MF? 1 gene is a secretory signaling factor for the secretion of a protein (c-myc epitope in the present invention) by a foreign gene in yeast.

c-myc 에피토프(epitope, 항원결정기) 코딩 폴리뉴클레오티드는 Myc 단백질 중 특정 에피토프만을 발현하도록 구성되었다. 상기 c-myc 에피토프는, 상기 c-myc 에피토프의 반복체(즉, 첫번째 c-myc 에피토프에 연결되어 수회 반복하여 발현된 것)를 의미하는 것 수 있다. 상기 반복 횟수는 특별히 제한되지 아니하나, 1회 내지 20회 일 수 있으며, 바람직하게는 1회 내지 10회 일 수 있다.The c-myc epitope (antigenic determinant) coding polynucleotide was constructed to express only a specific epitope of the Myc protein. The c-myc epitope may be a repetitive form of the c-myc epitope (i.e., a c-myc epitope linked to the first c-myc epitope and repeatedly expressed). The number of repeating times is not particularly limited, but may be 1 to 20 times, preferably 1 to 10 times.

Agα1 유전자는 효모 균주의 세포 표면 당단백질인 α-agglutinin을 발현하는 유전자이다. 상기 유전자는 c-myc 유전자(특히, c-myc 에피토프 코딩 폴리뉴클레오티드)와 결합되어 있으며, yeast two hybrid 실험시 bait와 prey가 상호작용하는 경우 함께 발현되는 Myc 단백질(c-myc 에피토프)을 세포 표면에 발현시킨다.Agα1 gene is a gene that expresses α-agglutinin, a cell surface glycoprotein of yeast strain. The gene is associated with the c-myc gene (in particular, c-myc epitope-encoding polynucleotide). When the bait and prey interact with each other in the yeast two hybrid experiment, the Myc protein (c-myc epitope) Lt; / RTI >

상기 (i) c-myc 리포터 발현 카세트의 c-myc 에피토프 코딩 폴리뉴클레오티드 및 AgαI 유전자는 링커로 연결되는 것 일 수 있으며, 상기 링커는 이에 제한되지 않으나 글리신(Glycine) 또는/ 및 세린(Serine)으로 이루어지는 펩타이드 링커일 수 있다. The c-myc epitope-encoding polynucleotide of the (i) c-myc reporter expression cassette and the Ag? I gene may be linked by a linker, and the linker may include, but is not limited to, Glycine and / or Serine Lt; / RTI > linker.

본 발명의 균주에 도입된 bait와 prey가 상호작용하여 GAL4 전사인자를 작동시키면 하위 Myc단백질(특히, c-myc 에피토프)이 세포 표면에 발현이 되고, 이를 detection하는 방법으로 bait와 prey의 상호작용 여부를 확인할 수 있다. 상기 Myc 단백질의 세포 표면 발현을 detection하는 방법은 공지의 단백질 detection 방법에 의할 수 있으며, 바람직하게는 Myc 단백질(특히, c-myc 에피토프)에 특이적으로 결합하는 항체 및 식별가능한 표지를 포함하며 상기 항체에 특이적으로 결합하는 항체에 의한 detection 방법일 수 있다. When the bait and prey introduced into the strain of the present invention interact to activate the GAL4 transcription factor, the sub Myc protein (particularly c-myc epitope) is expressed on the cell surface and the interaction between bait and prey Can be confirmed. The method of detecting the expression of the Myc protein on the cell surface can be performed by a known protein detection method and preferably includes an antibody specifically binding to a Myc protein (in particular, a c-myc epitope) and an identifiable label And a detection method by an antibody that specifically binds to the antibody.

상기 항체를 사용하는 경우, 항체의 결합 특이성을 이용하는 공지의 세포 검출 또는 세포 선별 방법을 사용하는 것일 수 있으며, 이에 제한되지 않으나 Magnetic-activated cell sorting (MACS) 방법에 의한 것 일 수 있다. When the antibody is used, known cell detection or cell sorting methods using the binding specificity of the antibody may be used, but may be by a magnetic-activated cell sorting (MACS) method.

상기 식별가능한 표지는 바람직하게는 형광물질 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 시아닌 계열의 형광물질 일 수 있다. 상기 형광물질의 발현을 detection하는 방법은 공지의 형광 분석 방법이면 특별히 제한되지 아니하며, 바람직하게는 형광 분석 및 형광 발현 세포의 분류가 가능한 FACS(Fluorescence-activated cell sorting) 방법에 의할 수 있다.The identifiable label may preferably be a fluorescent substance, and more preferably a fluorescent substance of the cyanine series. The method of detecting the expression of the fluorescent substance is not particularly limited as long as it is a known fluorescence analysis method. Preferably, the fluorescence-activated cell sorting (FACS) method capable of fluorescence analysis and classification of fluorescently expressed cells can be used.

상기 (ii)의 Cre 리포터 발현 카세트는 본 명세서에서 2nd repoter 또는 2nd repoter system 등으로 지칭 될 수 있으며, 순차적으로 작동 가능하게 연결되며 GAL4 UAS(upstream activation sequence), GAL1 프로모터 및 Cre 재조합효소(Cre recombinase) 발현 유전자를 포함하는 것이 특징이다. CRE 유전자를 yeast two hybird의 report 유전자로 사용하는 것은 본 발명에서 최초로 공개되는 것이다.The Cre reporter expression cassette of (ii) above may be referred to herein as a second reporter or a second reporter system, etc., and is operably linked in sequence and comprises a GAL4 upstream activation sequence, a GAL1 promoter and a Cre recombinase ) Expression gene. The use of the CRE gene as a report gene of yeast two hybird is disclosed for the first time in the present invention.

본 발명의 CRE 유전자는 Cre recombinasse를 발현하는 유전자이다. CRE 유전자의 발현에 의해 생성된 Cre recombinase는 yeast two hybird 과정에서 본 발명의 효모 균주에 도입된 pAD-acc 벡터 및 pDBD-donor 벡터의 loxP 및 lox2272서열을 인식하고 이들을 재조합한다. 상기 두 벡터의 Cre recombinase에 의한 재조합에 의해 GFP 단백질의 발현 및 바코드 서열의 조합이 일어나게 되며, 상기 GFP 단백질의 발현을 detection하여 bait와 prey간 상호작용이 일어난 균주를 selection 할 수 있으며, 상기 조합된 pAD-acc 벡터 및 pDBD-donor 벡터에 포함된 바코드 서열을 식별하여 상호작용이 일어난 단백질이 어떤 것인지 확인이 가능하다. 상기 식별은 바코드의 폴리뉴클레오티드 서열을 식별하는 것을 말하며, 공지의 시퀀싱 방법에 의하여 식별할 수 있다.The CRE gene of the present invention is a gene expressing Cre recombinase. Cre recombinase produced by expression of the CRE gene recognizes the loxP and lox2272 sequences of the pAD-acc vector and the pDBD-donor vector introduced into the yeast strain of the present invention in the yeast two hybird process and recombines them. The recombination of the two vectors with Cre recombinase leads to the expression of GFP protein and the combination of barcode sequences. The expression of the GFP protein can be detected to select a strain having an interaction between bait and prey, The pAD-acc vector and the pDBD-donor vector can be used to identify the interacting protein by identifying the barcode sequence. The identification refers to identifying the polynucleotide sequence of the barcode and can be identified by a known sequencing method.

상기 GFP 단백질의 발현을 detection하는 방법은 공지의 형광 분석 방법이면 특별히 제한되지 아니하며, 바람직하게는 형광 분석 및 형광 발현 세포의 분류가 가능한 FACS(Fluorescence-activated cell sorting) 방법에 의할 수 있다.The method of detecting the expression of the GFP protein is not particularly limited as long as it is a known fluorescence analysis method. Preferably, the fluorescence-activated cell sorting (FACS) method capable of fluorescence analysis and classification of fluorescently expressed cells can be used.

또한 상기 바코드 서열의 조합은 PCR을 통하여 해당 단백질의 상호작용의 유무를 검출 할 수 있을 뿐만아니라, NGS를 통한 바코드 리딩(bacord reading)을 통하여 라이브러리-라이브러리간 대량의 단백질 동시 분석 시에 단백질간 상호작용의 세기 차이 또한 검출 가능하다. In addition, the combination of the above-mentioned barcode sequences can detect the presence or absence of the interaction of the protein through PCR, and can also be used for the simultaneous analysis of proteins in a large amount of library-library through bar code reading (bacord reading) The intensity difference of action is also detectable.

한편 본 발명은 The present invention, however,

(a) 제1항의 pAD-acc 벡터 및 제2항의 pDBD-donor 벡터에 각각 상이한 바코드 서열을 도입하고, 서로 다른 목적 단백질을 발현하는 유전자를 재조합하여 제 1, 제 2 라이브러리를 구성하는 단계;(a) constructing first and second libraries by introducing different barcode sequences into the pAD-acc vector of claim 1 and the pDBD-donor vector of claim 2, respectively, and recombining the genes expressing different target proteins;

(b) 상기 제1 및 제2라이브러리를 상기 이중 리포터 효모 균주에 도입하는 단계;(b) introducing said first and second libraries into said double reporter yeast strain;

(c) 상기 제1라이브러리 및 제2라이브러리가 도입된 효모 균주로부터, 상기 pAD-acc 벡터에 도입된 유전자로부터 발현된 단백질과 상기 pDBD-donor 벡터에 도입된 유전자로부터 발현된 단백질이 서로 상호작용하는 효모균주를 선별하는 단계; 및(c) a protein expressed from the gene introduced into the pAD-acc vector and a protein expressed from the gene introduced into the pDB-donor vector interact with each other from the yeast strain into which the first library and the second library are introduced Selecting yeast strains; And

(d) 상기 선별된 효모균주의 바코드 서열을 식별하여 상기 상호작용하는 단백질을 선택하는 단계를 포함하는 단백질간의 상호작용을 검출하는 방법을 제공한다.(d) identifying the barcode sequence of the selected yeast strain to select the interacting protein.

이하 본 발명의 방법에 관하여 단계별로 설명한다.Hereinafter, the method of the present invention will be described step by step.

(a) 단계에서는 본 발명의 pAD-acc 벡터 및 pDBD-donor벡터에 각각 상이한 바코드 서열을 도입하고, 서로 다른 목적 단백질을 발현하는 유전자를 재조합하여 제1 및 제2라이브러리를 구성한다.In step (a), the first and second libraries are constructed by introducing different barcode sequences into the pAD-acc vector and the pDBD-donor vector of the present invention, respectively, and recombining the genes expressing different target proteins.

본 발명의 pAD-acc 벡터, pDBD-donor벡터 및 바코드 서열은 전술한 바와 같다. 도 14의 A 및 B에서 상기 벡터들에 대한 모식도가 제공된다. The pAD-acc vector, pDBD-donor vector and barcode sequence of the present invention are as described above. A schematic diagram of the vectors is provided in Figures 14A and 14B.

바코드는 재조합되는 유전자를 식별하기 위하여 도입되는 서열로 각 재조합 되는 유전자마다 상이한 바코드 서열이 도입되는 것이 바람직하다. 바코드 서열은 본 발명 벡터의 바코드 서열 삽입부위에 삽입된다.The barcode is a sequence introduced to identify a gene to be recombined, and it is preferable that a different barcode sequence is introduced for each recombinant gene. The barcode sequence is inserted at the barcode sequence insertion site of the vector of the present invention.

상기 유전자는 상호작용 여부를 확인하고자 하는 단백질을 코딩하는 DNA(유전자)를 말하며, pAD-acc 벡터 및 pDBD-donor벡터의 유전자 삽입부위에 삽입된다. The gene refers to a DNA (gene) encoding a protein to be tested for interaction, and is inserted at the gene insertion site of the pAD-acc vector and the pDBD-donor vector.

본 발명의 벡터에 바코드 서열 및 유전자를 재조합하는 방법은 공지의 유전자 조작 방법에 의할 수 있다.The method of recombining the bar code sequence and the gene into the vector of the present invention can be carried out by a known gene manipulation method.

본 발명의 제1라이브러리는 유전자 및 바코드 서열이 도입된 pAD-acc 벡터군을 말하며, 제2라이브러리는 유전자 및 바코드 서열이 도입된 pDBD-donor 벡터군을 말한다.The first library of the present invention refers to the pAD-acc vector group into which the gene and the barcode sequence are introduced, and the second library refers to the pDBD-donor vector group into which the gene and the barcode sequence are introduced.

상기 (b) 단계에서는 상기 제1 및 제2라이브러리를 본 발명의 이중 리포터 효모 균주에 도입한다. 본 발명 방법의 상기 효모 균주는 본 발명의 GAL4 UAS(upstream activation sequence), GAL1 및 CRE 유전자가 포함된 효모 균주를 말하며, 이에 관하여는 전술한 바와 같다.In the step (b), the first and second libraries are introduced into the double reporter yeast strain of the present invention. The yeast strain of the present invention is a yeast strain containing the GAL4 UAS (upstream activation sequence), GAL1, and CRE genes of the present invention, as described above.

본 발명의 라이브러리를 효모 균주에 도입하는 방법은 공지의 효모 형질전환 방법에 의할 수 있다.The method of introducing the library of the present invention into yeast strains can be performed by a known yeast transformation method.

상기 (c) 단계에서는 pAD-acc 벡터에 도입된 유전자로부터 발현된 단백질(AD-Prey)과 pDBD-donor 벡터에 도입된 유전자로부터 발현된 단백질(DBD-Bait)이 상호작용 하는 효모균주를 선별한다.In step (c), a yeast strain in which a protein (AD-Prey) expressed from a gene introduced into a pAD-acc vector interacts with a protein expressed from a gene introduced into a pDBD-donor vector (DBD-Bait) is selected .

상기 본 발명의 효모균주는 전술한 (i) 및 (ii)의 이중(dual) 리포터 시스템을 가지므로, 상기 AD-Prey와 DBD-Bait이 상호작용하는 경우, (i)의 리포터 시스템에 의하여 c-myc에피토프가 효모 세포벽 표면에 발현하고, (ii)의 리포터 시스템에 의해 GFP의 발현, 바코드 서열 조합, 두 개 이상의 항생제에 대한 내성을 가지는 등 다양한 표현형이 발현된다. 상기 표현형들을 이용하여 AD-Prey와 DBD-Bait가 상호작용하는 효모균주를 선별할 수 있다. 도 14의 C에서 상기 AD-Prey와 DBD-Bait이 상호작용하는 경우, (ii)의 리포터 시스템에의해 재조합된 벡터의 모식도를 도시하며, 구체적으로 도 5에서 그 개열지도를 도시한다. Since the yeast strain of the present invention has a dual reporter system of (i) and (ii) described above, when the AD-Prey interacts with the DBD-Bait, the reporter system of (i) myc epitope is expressed on the surface of the yeast cell wall, and various phenotypes are expressed by the reporter system of (ii), such as expression of GFP, barcode sequence combination, resistance to two or more antibiotics. Using these phenotypes, yeast strains that interact with AD-Prey and DBD-Bait can be selected. FIG. 14C shows a schematic diagram of a vector reconstructed by the reporter system of (ii) when the AD-Prey interacts with DBD-Bait, and specifically shows a cleavage map thereof in FIG.

상기 효모균주 선별은 상기 표현형을 이용하는 한 그 방법이 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어, Myc 단백질(특히, c-myc 에피토프)에 특이적으로 결합하는 1차 항체를 Myc 단백질에 결합시킨 후 상기 1차 항체에 특이적으로 결합하며 형광물질(특히 시아닌 계열)로 표지된 2차 항체를 결합시키고 형광현미경 또는 FACS 등을 이용하여 선별하는 방법, Myc 단백질에 특이적으로 결합하는 1차 항체를 단백질에 결합시킨 후 상기 1차 항체에 특이적으로 결합하는 항체로 코팅된 자성 비드를 사용하여 MACS를 수행하여 선별하는 방법, 2종 이상의 항생제를 처리하여 선별하는 방법, GFP에 대하여 형광현미경 관찰 또는 FACS 등을 수행하여 선별하는 방법 등을 사용할 수 있다. 특히, 본 발명에서 MACS 또는 FACS를 사용하는 방법은 기존의 한천배지를 이용한 yeast two hybrid 스크리닝에 비하여 월등히 적은 시간과 노동력으로도 많은 양의 균주를 처리할 수 있어 매우 유용하다.For example, the primary antibody that specifically binds to the Myc protein (particularly, the c-myc epitope) is bound to the Myc protein and the 1 < st > A secondary antibody that specifically binds to a secondary antibody and binds to a secondary antibody labeled with a fluorescent substance (in particular, a cyanine family) and is screened using a fluorescence microscope or FACS; a method in which a primary antibody that specifically binds to Myc protein is added to a protein A method of screening by performing MACS using magnetic beads coated with an antibody that specifically binds to the primary antibody, a method of selecting and treating two or more kinds of antibiotics, a fluorescence microscope observation of GFP or a FACS And then performing a screening process. In particular, the method using MACS or FACS in the present invention is very useful because it can treat a large amount of strains with much less time and labor than the conventional yeast two hybrid screening using agar medium.

상기 (d) 단계에서는 상기 선별된 효모균주의 바코드 서열을 식별하여 어떤 유전자의 단백질들이 서로 상호작용을 하였는지 확인하여 선택한다.In step (d), the bar code sequence of the selected yeast strain is identified, and the proteins of the genes are identified and selected.

상기 (d) 단계의 바코드 서열은 pAD-acc 벡터 및 pDBD-donor 벡터에 Prey 및 Bait를 코딩하는 유전자와 함께 포함된 각 바코드 서열의 조합이다. 본 발명의 효모균주는 Prey 및 Bait가 상호작용하는 경우 Cre recombinase가 생성되어 pAD-acc 벡터 및 pDBD-donor 벡터에 포함된 바코드 서열을 결합시킨다. 라이브러리 구성시 각 벡터에 도입되는 유전자가 어떤 바코드 서열과 매칭되었는지 조사되므로, 상기 선별된 효모 균주의 바코드 서열의 식별을 통하여 어떤 단백질이 서로 상호작용하여 해당 효모균주에서 형광물질이 발생한 것인지 손쉽게 확인 할 수 있다. 상기 바코드 서열을 식별하는 방법은 공지의 폴리뉴클레오티드 서열의 식별 방법인 시퀀싱, NSG 등에 의할 수 있다. The bar code sequence of step (d) is a combination of the respective bar code sequences included in the pAD-acc vector and the pDBD-donor vector together with the gene encoding Prey and Bait. The yeast strain of the present invention produces Cre recombinase when Prey and Bait interact with each other to bind the bar code sequence contained in the pAD-acc vector and the pDBD-donor vector. In the library construction, it is examined how the genes introduced into each vector are matched with the bar code sequence. Therefore, it is possible to easily identify whether the proteins interact with each other through identification of the bar code sequence of the selected yeast strains, . The bar code sequence may be identified by sequencing, NSG or the like, which is a known polynucleotide sequence discrimination method.

따라서 본 발명의 단백질간의 상호작용을 검출하는 방법은 Prey 및 Bait가 상호작용하는 경우, 해당 효모세포를 신속하게 높은 정확도로 분리할 수 있으며, 기 도입된 바코드 서열의 분석을 통하여 상호작용하는 단백질이 어떤 것인지 손쉽게 확인이 가능하다.Therefore, in the method of detecting the interactions between proteins of the present invention, when Prey and Bait interact, the yeast cells can be rapidly and highly precisely separated, and the interaction of the interacting protein It is easy to check which one it is.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 CRE 유전자를 리포터 유전자로 사용하는 효모균주, Myc 유전자를 리포터 유전자로 사용하는 효모균주, 상기 CRE 유전자에서 발현된 Cre recombinase에 의하여 GFP를 발현하며, 각각 바코드 서열을 가지는 두 벡터 및 상기 효모균주 및 벡터를 이용한 단백질간의 상호작용을 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 두 단백질의 상호작용을 매우 간소한 방법으로 선별할 수 있어 기존의 yeast two hybrid 방법을 넘어서 라이브러리 대 라이브러리 선별을 진행 할 수 있어 단백질 상호작용 검출에 효과적이다.As described above, the present invention expresses GFP by yeast strain using CRE gene as a reporter gene, yeast strain using Myc gene as a reporter gene, Cre recombinase expressed in the CRE gene, And a method for detecting the interaction between two vectors and proteins using the yeast strain and the vector. The method of the present invention is capable of screening the interaction of two proteins in a very simple manner and is effective in detecting protein interactions because the library-to-library screening can proceed beyond the conventional yeast two hybrid method.

도 1은 본 발명의 pAD-acc 벡터의 개열지도이다.
도 2는 본 발명의 pDBD-donor 벡터의 개열지도이다.
도 3은 본 발명의 pAD-acc 벡터 제작을 위한 기본 벡터인 pGAADT7 AD 벡터의 개열지도이다.
도 4는 본 발명의 pDBD-donor 벡터 제작을 위한 기본 벡터인 pGBKT7 벡터의 개열지도이다.
도 5는 본 발명의 Cre recombinase에 의하여 pDBD-donor 벡터로부터 일부 서열이 pAD-acc 벡터로 switch 된 후 벡터의 개열지도이다.
도 6 및 도 7은 본 발명 효모 균주에 p53과 SV40 large T 항원을 도입한 본 발명 벡터를 형질전환 후 효모의 리포터 유전자가 정상작동 하는지를 확인한 형광현미경 사진이다(p53 (WT): 야생형 Murine p53; p53 (D278G, 34 %) : p53 단백질의 278번째 아미노산 D(aspartic acid)를 G(Glycin)으로 바꾼 돌연변이, SV40 L.T와 결합력이 34%로 감소; p53 (V144G, 4.9%) : p53 단백질의 144번째 아미노산 V(Valine)를 G(Glycin)으로 바꾼 돌연변이, SV40 L.T와 결합력이 4.9%로 감소; p53 (E255K, 1.5%) : p53 단백질의 255번째 아미노산 E(Glutamic acid)를 K(Lysine)으로 바꾼 돌연변이, SV40 L.T와 결합력이 1.5%로 감소; Lamin A : p53 단백질과 전혀 상호작용하지 않는 단백질 (Negative control)).
도 8은 본 발명 효모 균주에 p53과 SV40 large T 항원을 도입한 본 발명 벡터를 형질전환 후 단백질 상호작용이 일어난 효모세포를 FACS로 검출 분리한 결과그래프이다.
도 9는 본 발명 효모 균주에 p53과 SV40 large T 항원을 도입한 본 발명 벡터를 형질전환 후 단백질 상호작용이 일어난 효모세포를 FACS로 검출 분리한 결과그래프이다(X 축 : GFP 발현강도, Y 축 : Cy5 발현강도).
도 10은 본 발명에서 또다른 형태의 pAD-acc 벡터의 개열지도이다.
도 11은 본 발명의 효모 세포에 포함된 두 개의 리포터 시스템을 나타낸다(A: c-myc 리포터 시스템, B: Cre 리포터 시스템)
도 12는 c-myc 리포터 시스템에 의해, 목적하는 두 단백질이 상호작용하는 경우 효모 세포벽에 c-myc 에피토프가 발현되는 것을 나타내는 모식도이다.
도 13은 c-myc 리포터 시스템을 위한 c-myc 리포터 발현 시스템의 여러 가지 구현형태를 도시한다(A: c-myc 10개 반복, B: c-myc 5개 반복, C: c-myc 1개 )
도 14는 cre 리포터 시스템에 의하여, pDBD-donor 벡터(A) 및 pAD-acc 벡터(B)가 재조합(C)되는 것을 보여주는 모식도이다.
도 15는 c-myc 리포터 시스템에서, c-myc 에피토프 반복 갯수에 따른 신호강도를 나타낸다.
도 16은 본 발명의 dual repoter Y2H 시스템을 적용한 효모에서, 단백질 상호작용에 따른 MACS 선별 및 이의 결과를 GFP로 확인한 것이다.
도 17은 본 발명의 dual repoter Y2H 시스템을 적용한 효모에서, MACS를 1회 및 2회 반복 수행하여 단백질 상호작용에 따른 MACS 선별 결과를 형광신호로 확인한 결과이다.
도 18은 본 발명에서 바코드 조합을 검출하기 위해 사용된 primer A,B,C의 결합위치를 나타낸다.
도 19는 PCR 방법으로 본 발명의 dual repoter Y2H 시스템을 적용한 효모에서, 단백질 상호작용 여부에 따른 바코드 조합여부를 검출한 결과이다.
도 20은 본 발명의 dual repoter Y2H 시스템을 적용한 효모에 2종의 항생제 처리후 생성된 콜로니에 대하여, PCR 방법으로 단백질 상호작용에 따른 바코드 조합여부를 검출한 결과이다.
도 21는 NGS 분석 방법을 이용하여, 단백질 상호작용 강도에 따른 바코드 리드(bacord read) 수치를 나타낸다.

도 22는 NGS 분석 방법을 이용하여, 라이브러리-라이브러리 간 단백질 단백질 상호작용 강도에 따른 바코드 리드(bacord read) 수치를 나타낸다.
도 23은 상기 도 22와 관련하여 NGS결과 bacord read 수가 높은 순서로 상위 41개를 정렬한 결과이다.
도 24는 단백질 상호작용 세기에 따라 MACS 수행시 세포 선별능이 달라지는 것을 나타내는 것을 보여주는 데이터로서, 단백질 상호작용 세기가 강할 수록 MACS에 의해 세포 선별이 잘되며, 이를 형광강도로 확인한 결과이다. Figure 1 is a cleavage map of the pAD-acc vector of the present invention.
Figure 2 is a cleavage map of the pDBD-donor vector of the present invention.
Fig. 3 is a cleavage map of the pGAADT7 AD vector, which is a basic vector for producing the pAD-acc vector of the present invention.
FIG. 4 is a cleavage map of the pGBKT7 vector, which is a basic vector for producing the pDBD-donor vector of the present invention.
FIG. 5 shows a cleavage map of a vector after some sequences are switched from a pDBD-donor vector to a pAD-acc vector by the Cre recombinase of the present invention.
FIGS. 6 and 7 are fluorescence micrographs showing that the reporter gene of the yeast is functioning after transfection of the vector of the present invention in which p53 and SV40 large T antigen are introduced into the yeast strain of the present invention (p53 (WT): wild type Murine p53; p53 (D278G, 34%): a mutation that changed the 278th amino acid D (aspartic acid) of p53 protein to G (Glycine), decreased binding capacity to SV40 LT by 34%; p53 (V144G, 4.9% (E255K, 1.5%): The 255th amino acid E (Glutamic acid) of the p53 protein is converted to K (Lysine) by the mutation of the amino acid V (Valine) A mutated mutation, reduced binding to SV40 LT by 1.5%; Lamin A: a protein that does not interact with the p53 protein at all (Negative control).
FIG. 8 is a graph showing the result of detection and isolation of yeast cells having undergone protein interaction after transformation according to the present invention vector in which p53 and SV40 large T antigen were introduced into the yeast strain of the present invention, by FACS.
FIG. 9 is a graph showing the result of detection and isolation of yeast cells in which protein interactions have occurred after transfection according to the present invention vector in which p53 and SV40 large T antigen are introduced into yeast strain of the present invention (X axis: GFP expression intensity, Y axis : Cy5 expression intensity).
10 is a cleavage map of another type of pAD-acc vector in the present invention.
Figure 11 shows two reporter systems included in the yeast cells of the present invention (A: c-myc reporter system, B: Cre reporter system)
12 is a schematic diagram showing that a c-myc epitope is expressed on the yeast cell wall when two desired proteins interact with each other by a c-myc reporter system.
Figure 13 shows several implementations of a c-myc reporter expression system for a c-myc reporter system (A: 10 repeats of c-myc, 5 repeats of c-myc, )
14 is a schematic diagram showing that the pDBD-donor vector (A) and the pAD-acc vector (B) are recombined (C) by the cre reporter system.
Figure 15 shows the signal intensity according to the number of c-myc epitope repeats in the c-myc reporter system.
FIG. 16 shows the results of screening of MACS according to protein interaction and the result of GFP using yeast using the dual reporter Y2H system of the present invention.
FIG. 17 is a graph showing the result of MACS screening by fluorescence signal according to protein interaction by performing MACS once and twice in yeast using the dual reporter Y2H system of the present invention.
18 shows binding positions of the primers A, B and C used for detecting the bar code combination in the present invention.
FIG. 19 is a result of detecting whether or not bar codes are combined according to the protein interaction in yeast to which the dual reporter Y2H system of the present invention is applied by the PCR method.
FIG. 20 is a graph showing the results of detection of the combination of bar codes according to protein interaction by the PCR method on the colonies produced after the treatment with the two antibiotics in the yeast to which the dual reporter Y2H system of the present invention was applied.
FIG. 21 shows the bar code read value according to the protein interaction intensity, using the NGS analysis method.

Figure 22 shows the bar code read value according to protein-protein interaction intensity between library-library using NGS analysis method.
FIG. 23 is a result of aligning the upper 41 pieces in order of NGS result bacord read count with respect to FIG.
FIG. 24 shows data showing that the cell sorting ability is changed by MACS according to the protein interaction intensity. As the protein interaction intensity is stronger, cell sorting by MACS is performed well, and the result is confirmed by fluorescence intensity.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.

<실시예 1>&Lt; Example 1 >

이중 리포터 시스템을 가지는 Mega-throughput Y2H 효모 균주 개발Developed Mega-throughput Y2H yeast strain with dual reporter system

<1-1> c-myc 에피토프를 발현하는 1st repoter 발현 카세트<1-1> 1st reporter expression cassette expressing c-myc epitope

GAL4 UAS(upstream activation sequence)의 downstream에 서열번호 13의 ‘Gal1 promoter MFα1- myc10 repeats- Glycine/Serine linker- AgαI(C-term)’의 발현 구조체(발현 카세트)가 연결된 형태의, c-myc 리포터 시스템을 제작하였다. (Expression cassette) of the 'Gal1 promoter MFα1-myc10 repeats-Glycine / Serine linker-AgαI (C-term)' of SEQ ID NO: 13 downstream of GAL4 UAS (upstream activation sequence) c-myc reporter system.

이때, 상기 발현 구조체 중 myc repeat의 개수를 0개, 1개, 5개, 10개(myc10 repeats)로 하는 발현 구조체(도 13 참조)를 제작 및 효모에 도입하여 발현시키고, 상기 효모에 1차 항체인 mouse α-myc 항체(c-Myc Antibody (9E10) (Santa cruz사의 sc-40))와 2차 항체인 goat α-mouse IgG-Cy5(Molecular probe사의 A10524) 항체를 처리하여, 형광현미경으로 관찰하였다. At this time, an expression construct (see FIG. 13) in which the number of myc repeats in the expression construct was 0, 1, 5, 10 (myc10 repeats) was produced and introduced into yeast, The mouse α-myc antibody (c-Myc Antibody (9E10) (Santa Cruz sc-40)) and goat α-mouse IgG-Cy5 antibody (A10524 of Molecular probe) were treated with a fluorescent microscope Respectively.

그 결과, 도 15에서 보는 바와 같이 c-myc 10 repeat에서 형광 발현이 강한 것을 확인하였고, 이를 이후의 실험에서도 확인하였다. As a result, as shown in Fig. 15, it was confirmed that the fluorescence expression was strong in c-myc 10 repeat, which was confirmed in the subsequent experiments.

<1-2> Cre recombinase를 발현하는 2nd repoter 발현 카세트<1-2> 2nd reporter expression cassette expressing Cre recombinase

GAL4 UAS(upstream activation sequence)의 downstream에 서열번호 14의 ‘GAL1 promoter- CRE recombinase’가 연결된 형태의, Cre 리포터 시스템을 제작하였다. A Cre reporter system with the 'GAL1 promoter-CRE recombinase' of SEQ ID NO: 14 linked downstream of the GAL4 UAS (upstream activation sequence) was constructed.

<1-3> c-myc 리포터 발현 카세트 및 Cre 리포터 발현 카세트를 동시에 포함하는 효모 균주 제작<1-3> Production of yeast strains simultaneously containing c-myc reporter expression cassette and Cre reporter expression cassette

상기 실시에 1-1 및 1-2의 발현 구조체가 영구적으로 발현되는 효모균주를 제작하였다. 서열번호 13의 ‘Gal1 promoter MFα1- myc10 repeats- Glycine/Serine linker- AgαI(C-term)’의 발현 구조체는 15번 크로모좀(chromosome)에서 GAL4 UAS(upstream activation sequence)의 downstream에 위치하며, 서열번호 14의 ‘GAL1 promoter- CRE recombinase’ 발현 구조체는 5번 크로모좀(chromosome)에서 GAL4 UAS(upstream activation sequence)의 downstream에 위치한다. Yeast strains in which the expression constructs 1-1 and 1-2 were permanently expressed were prepared. The expression construct of the 'Gal1 promoter MFα1- myc10 repeats-Glycine / Serine linker-AgαI (C-term)' of SEQ ID NO: 13 is located downstream of the GAL4 UAS (upstream activation sequence) in chromosome 15, The 'GAL1 promoter-CRE recombinase' expression construct of SEQ ID NO: 14 is located downstream of the GAL4 UAS (upstream activation sequence) in chromosome 5.

구체적으로, c-myc 리포터 및 Cre 리포터 동시발현 효모 균주인 ‘SK10-CRE’를 제작하였으며, 상기 효모 균주는 하기 표 1의 유전자형을 가진다.Specifically, ' SK10-CRE', a c-myc reporter and a Cre reporter simultaneous expression yeast strain, was produced. The yeast strain has the genotype shown in Table 1 below.

균주명Strain name 유전자형 (Genotype)Genotype SK10-CRESK10-CRE MATa, gal4Δ, gal80Δ, trp1-901, ura3-52, leu2-3, leu2-112,
[HIS3::GAL1-Agα1-myc10, URA3::GAL1-CRE]MATa, GAL4A, Gal80A, TRP1-901, URa3-52, Leu2-3, Leu2-112,
[HIS3 :: GAL1-Agα1-myc10, URA3 :: GAL1-CRE]

상기 효모의 제작방법은 하기와 같다. 먼저 하기 표 2의 유전자형을 가지는JC-993 (ATCC 204097) 효모 균주에 pRS_pGAL1-MFαI-myc10-GS-Agα1(350a.a)를 도입하여 GAL1-Agα1-myc10 repoter 시스템을 가지는 효모인 SK10을 제작하였다. 상기 pRS_pGAL1-MFαI-myc10-GS-Agα1(350a.a)는 효모 게놈상의 his3 유전자에 상동성이 있는 부분이 있어 이를 이용하여 재조합을 유도하여 리포터를 도입하였다. 구체적으로, 5ug pRS_pGAL1-MFαI-myc10-GS-Agα1(350a.a)를 제한효소 Msc I(His3 유전자의 중간을 자름)를 처리하여 완전히 반응한 후 에탄올 침전을 사용하여 DNA를 모두 가라 앉힌 후 형질전환에 사용 하였다. 형질전환체의 선별은 SD / -Ura, -His + 25mM 3-AT media 선택배지에서 진행하였으며 선별된 후보군 중 게놈상에 리포터가 삽입된 효모를 PCR과 GAL4를 지속적으로 발현하는 벡터를 형질전환하여 리포터의 정상적인 작동을 확인 하였다. The production method of the yeast is as follows. First, pRS_pGAL1-MFαI-myc10-GS-Agα1 (350a.a) was introduced into a JC-993 (ATCC 204097) yeast strain having the genotype shown in Table 2 below to prepare SK10 as a yeast having a GAL1-Agα1-myc10 reporter system . The above pRS_pGAL1-MFαI-myc10-GS-Agα1 (350a.a) had a portion homologous to the his3 gene on the yeast genome, and the reporter was introduced by inducing recombination thereof. Specifically, 5 ug pRS_pGAL1-MFαI-myc10-GS-Agα1 (350a.a) was treated with restriction enzyme Msc I (truncated His3 gene in the middle), completely reacted, ethanol precipitation was used to completely quench the DNA, Was used for conversion. Transformants were screened in SD / -Ura, -His + 25mM 3 -AT media selective medium, and yeast transformed with the reporter gene in the genome of the selected candidate group was transformed with PCR and a vector expressing GAL4 continuously I confirmed the normal operation of the reporter.

이렇게 제작된 SK10 효모의 유전자형은 하기 표 2와 같으며, 상기 SK10 효모에서 효모 게놈상의 URA3::GAL1-LacZ 부분의 LacZ 를 CRE 유전자로 바꾸어주어, 본 발명의 이중리포터를 가지는 SK10-Cre 효모 균주를 제작하였다. Cas9-gRNA를 이용하여 게놈상의 LacZ 부위에 dsDNA 절단부위를 만들고 여기에 CRE 유전자의 5‘말단에 Gal1 프로모터의 끝부분의 300 bp와 3’ 말단에 LacZ 유전자의 끝부분 500 bp를 갖는 Donor DNA를 PCR을 통하여 제작하여 형질전환시에 함께 넣어 상동성 재조합을 유도하였다. 구체적으로, 먼저 200 ng p414-TEF1p-Cas9-CYC1t(Cas9 발현벡터)을 SK10 효모 균주에 형질전환하고 SD/-Ura,-His,-Trp 한천배지에서 선별하여, SK10 + Cas9 형질전환체를 얻었다. PCR을 통하여 Cre Donor DNA를 증폭하여 준비하고, 6 ug의 DNA를 에탄올 침전을 통하여 침전후 충분히 말린 후 사용하였다. 그리고 상기 효모 균주 SK10 + Cas9 형질전환체(on the SD/ -Ura, -His, -Trp)에 상기 Donor DNA와 200 ng과 Guide RNA expression vector를 함께 형질 전환 하였다. 형질전환체는 SD/ -Ura, -His, -Trp, -Leu 한천배지를 통하여 선별 하였고 리포터 유전자의 도입은 형질전환체의 게놈에 존재하는 CRE 유전자를 PCR을 통하여 확인하였다.The genotype of SK10 yeast thus constructed is shown in Table 2 below. In the SK10 yeast, LacZ of the URA3 :: GAL1-LacZ moiety on the yeast genome was replaced with CRE gene, and SK10-Cre yeast strain having the double reporter of the present invention Respectively. Using Cas9-gRNA, a dsDNA cleavage site was created in the LacZ site on the genome. Donor DNA, which had 300 bp of the end of the Gal1 promoter and 500 bp of the end of the LacZ gene at the 3 'end at the 5' PCR, and inserted into the transformant to induce homologous recombination. Specifically, 200 ng of p414-TEF1p-Cas9-CYC1t (Cas9 expression vector) was transformed into SK10 yeast strain and selected in SD / -Ura, -His, -Trp agar medium to obtain SK10 + Cas9 transformant . The Cre donor DNA was amplified and prepared by PCR, and 6 ug of DNA was precipitated through ethanol precipitation and dried sufficiently before use. Then, 200 ng of Donor DNA and a guide RNA expression vector were transformed into the yeast strain SK10 + Cas9 transformant (on the SD / -Ura, -His, -Trp). Transformants were screened through SD / -Ura, -His, -Trp, -Leu agar medium and the introduction of reporter gene was confirmed by PCR using the CRE gene present in the genome of the transformant.

균주명Strain name 유전자형 (Genotype)Genotype JC-993
(ATCC 204097) JC-993
(ATCC 204097) MATa gal4 gal80 trp1-901 ura3-52 leu2-3 leu2-112 his3
[URA3::pGAL1-LacZ]MATa gal4 gal80 trp1-901 ura3-52 leu2-3 leu2-112 his3
[URA3 :: pGAL1-LacZ] SK10SK10 MATa, gal4Δ, gal80Δ, trp1-901, ura3-52, leu2-3, leu2-112,
[HIS3::GAL1-Agα1-myc10, URA3::GAL1-LacZ]MATa, GAL4A, Gal80A, TRP1-901, URa3-52, Leu2-3, Leu2-112,
[HIS3 :: GAL1-Agα1-myc10, URA3 :: GAL1-LacZ]

<실시예 2>&Lt; Example 2 >

Mega-throughput Y2H vector 구축Mega-throughput Y2H vector construction

본 발명의 Mega-through put Y2H system에 사용되는 vector를 제작하였다. 본 발명의 vector는 pAD-acc 및 pDBD-donor의 두 종류가 한 쌍으로 이루어져 있으며, 상기 두 벡터 모두 barcode sequence와 CRE recombinase에 의해 switching 되는 서열을 포함하고 있다. pDBD-donor 벡터에는 형광을 방출하는 단백질의 유전자(GFP)가 포함되어 있는 것이 특징으로서, Cre recombinase에 의해 switching되면 pDBD-donor 벡터에 포함되어있던 식별용 barcode 및 GFP 유전자가 pAD-acc 벡터로 이동되어,각각 검출 및 발현이 가능한 상태로 만들어진다.A vector used in the Mega-through put Y2H system of the present invention was prepared. The vector of the present invention consists of two pairs of pAD-acc and pDBD-donor, both of which contain sequences that are switched by the barcode sequence and CRE recombinase. The pDBD-donor vector contains a fluorescent protein gene (GFP). When it is switched by Cre recombinase, the identification barcode and GFP gene contained in the pDBD-donor vector are shifted to the pAD-acc vector So that they can be detected and expressed, respectively.

<2-1> pAD-acc vector의 구축<2-1> Construction of pAD-acc vector

기존의 Y2H vector인 pGADT7 vector(Clontech, 도 2 참조)를 바탕으로 하여 본 발명의 목적에 맞게 변형하였다. 먼저 MCS 부분을 모두 제거하고 두 개의 Sfi I 제한효소 인식자리를 포함하는 유전자 삽입 부위를 도입하였다. 그 다음 NGS 분석을 통하여 삽입된 유전자가 무엇인지 파악하기 위하여 바코드 삽입부위 (제한효소 BsiW I 및 Sac II[도 1의 개열지도 참조], 또는 제한효소 XbaI 및 Sac II[도 10의 개열지도 참조])와 CRE recombinase에 의하여 재조합을 유도할 수 있는 lox2272 염기서열 (약 40 bp)을 두 번째 Sfi I 인식부위 바로 뒤에 삽입하였다. loxP 염기서열은 Leu2 유전자의 종결코돈을 제거하고 삽입하였다.Based on the existing Y2H vector pGADT7 vector (Clontech, see FIG. 2), it was modified for the purpose of the present invention. First, the MCS portion was removed and a gene insertion site containing two Sfi I restriction enzyme recognition sites was introduced. Then, NGS analysis was carried out to identify the inserted gene. The barcode insertion site (restriction enzymes BsiW I and Sac II [refer to the cleavage map in FIG. 1], or restriction enzymes XbaI and Sac II [see the open map in FIG. 10] ) And the recombinant lox2272 base sequence (about 40 bp) which was able to induce recombination by CRE recombinase was inserted just after the second Sfi I recognition site. The loxP nucleotide sequence was inserted into the Leu2 gene to eliminate the stop codon.

<2-2> pDBD-donor vector의 구축<2-2> Construction of pDBD-donor vector

기존의 Y2H vector인 pGBKT7 vector(Clontech, 도 3참조)를 바탕으로 하여 본 발명의 목적에 맞게 변형하였다. 먼저 MCS 부분을 모두 제거하고 두 개의 Sfi I 제한효소 인식자리를 포함하는 유전자 삽입부위를 도입하였다. 그 다음 CRE recombinase에 의하여 재조합을 유도할 수 있는 lox2272 염기서열과 함께 NGS 분석을 통하여 삽입된 유전자가 무엇인지 파악하기 위한 바코드 삽입 부위(제한효소 Afl II/ Age I)를 두 번째 Sfi I 인식부위 뒤에 삽입하였다. 그 뒤로 항생제 카나마이신(Kanamycin) 저항성 유전자와 프로모터 그리고 GFP 유전자와 loxP 염기서열을 차례로 삽입 하였다.Based on the existing Y2H vector pGBKT7 vector (Clontech, see FIG. 3), it was modified for the purpose of the present invention. First, the MCS portion was removed and a gene insertion site containing two Sfi I restriction enzyme recognition sites was introduced. Then, a barcode insertion site (restriction enzyme Afl II / Age I) for identifying the inserted gene by NGS analysis together with the lox2272 base sequence capable of inducing recombination by CRE recombinase was inserted into the second Sfi I recognition site Respectively. Followed by the insertion of the antibiotic kanamycin resistance gene and promoter, and the GFP gene and loxP nucleotide sequence.

<2-3> Barcode 및 벡터 준비<2-3> Barcode and vector preparation

상기 구축한 vector에 삽입하기 위한 barcode를 준비하였다. barcode 주형 oligo와 이를 PCR을 통하여 증폭하기 위한 프라이머를 제작한다. Phusion High-fidelity DNA polymerase(NEB사의 M0530)를 사용하여 PCR을 통해 Barcode를 합성하였다.A barcode for inserting into the constructed vector was prepared. barcode template oligo and a primer to amplify it by PCR. Barcode was synthesized by PCR using Phusion High-fidelity DNA polymerase (NEB M0530).

Barcode 제작에 사용된 주형 올리고 및 프라이머 서열The template oligo and primer sequences used in the barcode construction 서열번호SEQ ID NO: 이름name 서열order 1One Barcode 주형 oligo ADBarcode Template oligo AD 5'-CGT ACG CTT GGG NNN NNN NNN NTT TCC ACC GCG G-3'5'-CGT ACG CTT GGG NNN NNN NNN NTT TCC ACC GCG G-3 ' 22 AD-5 (BsiW I)AD-5 (BsiW I) 5'-TGC ACA GCG TAC GCT TGG G-3'5'-TGC ACA GCG TAC GCT TGG G-3 ' 33 AD-3 (Sac II) AD-3 (Sac II) 5'-GGC CAT GCC GCG GTG GAA A-3'5'-GGC CAT GCC GCG GTG GAAA-3 ' 44 Barcode 주형 oligo DBD Barcode Template oligo DBD 5'-ACC GGT CTT GGG NNN NNN NNN NTT TCC ACT TAA G-3'5'-ACC GGT CTT GGG NNN NNN NNN NTT TCC ACT TAA G-3 ' 55 DBD-5 (Afl II)DBD-5 (Afl II) 5'-TGC ACA GAC CGG TCT TGG G-3'5'-TGC ACA GAC CGG TCT TGG G-3 ' 66 DBD-3 (Age I)DBD-3 (Age I) 5'-GGC CAT GCT TAA GTG GAA A-3'5'-GGC CAT GCT TAA GTG GAAA-3 '

PCR을 통하여 얻은 산물에 각 각 제한효소를 처리하였다. AD 용 바코드는 pAD-acc에 맞도록 제한효소 BsiW I (NEB사) 및 Sac II (NEB사)를 처리하며, DBD용 바코드는 pDBD-donor에 맞도록 제한효소 Afl II (NEB사) 및 Age I (NEB사)를 처리하였다.The products obtained by PCR were treated with restriction enzymes. The bar codes for AD are treated with restriction enzymes BsiW I (NEB) and Sac II (NEB) to match pAD-acc, and the bar codes for DBD are treated with restriction enzymes Afl II (NEB) and Age I (NEB Corp.).

제한효소 처리 후 Shrimp alkaline phosphatase(USB사의 78390)를 처리하여 양 말단의 인산기를 모두 제거하였다. 완전히 제한된 절편(약 30 bp)을 10% polyacrylamide gel(1X TBE)을 통하여 순수하게 정제하였다.After the restriction enzyme treatment, Shrimp alkaline phosphatase (78390, manufactured by USB Corporation) was treated to remove all phosphate groups at both ends. A fully defined section (approximately 30 bp) was purified pure through 10% polyacrylamide gel (1X TBE).

실시예 2-1 및 2-2를 통하여 구축한 vector에 각 각 제한효소를 처리하였다. pAD-acc vector는 제한효소 BsiW I (NEB사) 및 Sac II (NEB사)를 처리하며, pDBD-donor vector는 제한효소 Afl II (NEB사) 및 Age I (NEB사)를 처리하였다.The vectors constructed in Examples 2-1 and 2-2 were treated with restriction enzymes. pAD-acc vector was treated with restriction enzymes BsiW I (NEB) and Sac II (NEB), and pDBD-donor vector was treated with restriction enzymes Afl II (NEB) and Age I (NEB).

효소 처리 후 완전히 제한된 절편을 Expin Gel SV(Geneall사의 102-150)를 사용하여 정제하였다.After the enzyme treatment, a completely restricted section was purified using Expin Gel SV (Geneall's 102-150).

<2-4> Barcode 삽입 라이브러리 구축<2-4> Building Barcode Insertion Library

상기 과정을 통하여 얻은 vector와 barcode를 분자 수의 비율을 1:10이 되도록 섞은 후 T4 DNA ligase(NEB사의 M0202)를 처리하여 재조합을 유도한다. (4℃에서 12시간) 반응을 마친 후 박테리아(Top10F')에 형질전환을 하여 총 1.0 x 107개의 박테리아 클론을 얻을 수 있는 양을 준비한다.The vector and barcode obtained by the above procedure are mixed so that the ratio of the number of molecules is 1:10, and then T4 DNA ligase (NE20 M0202) is treated to induce recombination. (12 hours at 4 ° C) and then transformed into bacteria (Top10F ') to prepare an amount to obtain a total of 1.0 × 10 7 bacterial clones.

준비된 클론을 미리 준비한 0.3% seaPrep agarose(Lonza사의 50302) LB 배지에 접종하여 37℃에서 36시간 동안 배양 후 Plasmid Maxi kit(Qiagen사의 12165)를 사용하여 barcode가 삽입 된 라이브러리를 얻는다.The prepared clone was inoculated on a 0.3% seaPrep agarose (Lonza 50302) LB medium and incubated at 37 ° C for 36 hours. A plasmid maxi kit (Qiagen 12165) was used to obtain a library having a barcode inserted therein.

<2-5> PCR을 통한 재조합 유전자 준비<2-5> Preparation of recombinant gene by PCR

재조합에 사용된 유전자는 총 27종으로서 Amino-acyl tRNA 합성에 관여하는 유전자를 대상으로 하였다. 유전자의 목록은 [표 5]에 표시하였다. 각 각의 유전자는 선행 연구에 의하여 cDNA 형태로 재조합이 되어 있는 상태의 것을 주형으로 하여 New England biolab사의 Phusion High-fidelity DNA polymerase(Cat.No M0530)를 사용하여 PCR을 통하여 증폭하였다.A total of 27 genes were used for recombination, including genes involved in the synthesis of Amino-acyl tRNA. The list of genes is shown in [Table 5]. Each gene was amplified by PCR using the Phusion High-fidelity DNA polymerase (Cat. No M0530) from New England biolab with the recombinant cDNA as a template.

사용된 프라이머는 하기 표4와 같다. pAD-acc vector에 삽입될 유전자는 서열번호 7 및 9번의 프라이머를 이용하여 증폭하고, pDBD-donor vector에 삽입될 유전자는 서열번호 7 및 8번의 프라이머를 이용하여 증폭하였다.The primers used are shown in Table 4 below. The gene to be inserted into the pAD-acc vector was amplified using the primers of SEQ ID NOS: 7 and 9, and the gene to be inserted into the pDBD-donor vector was amplified using the primers of SEQ ID NOS: 7 and 8.

라이브러리 제작에 사용된 프라이머 서열The primer sequences used in library construction 서열번호SEQ ID NO: 이름name 서열order 77 aaRS(F)sfi IaaRS (F) sfi I 5'-GCG ATC AGG CCC AGC AGG CCG GCG CCG AGA CCG CGG TC-3'5'-GCG ATC AGG CCC AGC AGG CCG GCG CCG AGA CCG CGG TC-3 ' 88 DBD-aaRS(R)sfi IDBD-aaRS (R) sfi I 5'-ACA GCT TGG CCA GCA GGG CCC TGC AGG TCG ACC TCG AG-3'5'-ACA GCT TGG CCA GCA GGG CCC TGC AGG TCG ACC TCG AG-3 ' 99 AD-aaRS(R)sfi IAD-aaRS (R) sfi I 5'-ACA GCT TGG CCC AGC AGG CCC TGC AGG TCG ACC TCG AG-3'5'-ACA GCT TGG CCC AGC AGG CCC TGC AGG TCG ACC TCG AG-3 '

<2-6> 유전자 재조합<2-6> Genetic recombination

상기 얻은 PCR 산물 총 54종 (AD-aaRS 27종, DBD-aaRS 27종)과 pAD-acc와 pDBD-donor를 제한효소 Sfi I(NEB사의 R0123)을 사용하여 절단한다. 절단을 마친 후 Expin Gel SV(Geneall사의 102-150)를 사용하여 원하는 산물만을 정제하였다. 이후 제한효소를 처리한 aaRS 유전자와 vector의 분자 수의 비율을 3:1로 하여 섞어 주었고 T4 DNA ligase(NEB사의 M0202)를 처리하여 재조합을 유도하였다. 재조합 반응은 4℃에서 1시간 동안 진행하였고 반응을 마친 후 박테리아(Top10F')에 형질전환 하였고 LB 한천배지 내에서 특정 항생제에 대한 저항성을 통하여 재조합 클론을 선별하였으며 Sequencing을 통하여 정상적인 재조합과 동시에 각 각의 vector에 도입된 barcode의 염기서열을 확인하여 연관 관계를 정립 하였다.([표 5] 참고) A total of 54 PCR products (27 kinds of AD-aaRS, 27 kinds of DBD-aaRS), pAD-acc and pDBD-donor were digested with restriction enzyme Sfi I (R0123 of NEB). After cleavage, only the desired product was purified using Expin Gel SV (Geneall's 102-150). Then, the ratio of the number of molecules of the aaRS gene treated with the restriction enzyme to that of the vector was adjusted to 3: 1, and the recombination was induced by treatment with T4 DNA ligase (NEB M0202). The recombinant reaction was carried out at 4 ° C for 1 hour. After the reaction, the cells were transformed into bacteria (Top10F '). Recombinant clones were screened for resistance to specific antibiotics in LB agar medium. (See Table 5). In addition,

Figure pat00001
Figure pat00001

<실시예 3>&Lt; Example 3 >

dual repoter Mega-throughput Y2H system 구축 및 시스템 작동 확인Dual repoter Mega-throughput Y2H system construction and system operation confirmation

스크리닝 시스템 작동 시험을 하기 위하여 이미 단백질간 상호작용 하는 것으로 알려진 p53 단백질 및 SV40 large T 항원을 각각 본 발명의 벡터에 도입하고 상기 각 단백질이 도입된 벡터를 본 발명의 효모 균주의 리포터 유전자인 CRE유전자 및 c-myc 유전자를 모두 리포터 유전자로 가지는 효모 균주에 도입하여 형광 발색을 관찰하였다.In order to perform the screening system operation test, p53 protein and SV40 large T antigen, which are already known to interact with each other, are introduced into the vector of the present invention and the vector into which the respective proteins are introduced is used as a reporter gene of the yeast strain of the present invention And c-myc gene were introduced into a yeast strain having a reporter gene to observe fluorescence.

<3-1> 라이브러리 구성<3-1> Library Configuration

우선 표 6에 기재된 바와 같이, Sv40과의 결합력이 제한된 p53 돌연변이를 제조하고, 이를 벡터에 도입하여 시험용 라이브러리를 구축하였다. 라이브러리 구축을 위하여 유전자를 벡터에 도입하는 방법은 실시예 2와 동일하게 실시하였다.First, as shown in Table 6, a p53 mutant with limited binding capacity to Sv40 was prepared and introduced into a vector to construct a test library. The method for introducing the gene into the vector for constructing the library was carried out in the same manner as in Example 2. [

시험용 라이브러리 구성Configuring the test library 실험군Experimental group 대조군Control group 1One pDBD-donor-p53 (WT) + pAD-acc-Sv40 TpDBD-donor-p53 (WT) + pAD-acc-Sv40 T 66 pDBD-donor-p53 (WT)pDBD-donor-p53 (WT) 22 pDBD-donor-p53 (D278G, 34 %) + pAD-acc-Sv40 TpDBD-donor-p53 (D278G, 34%) + pAD-acc-Sv40 T 77 pDBD-donor-p53 (D278G, 34 %)pDBD-donor-p53 (D278G, 34%) 33 pDBD-donor-p53 (V144G, 4.9%) + pAD-acc-Sv40 TpDBD-donor-p53 (V144G, 4.9%) + pAD-acc-Sv40 T 88 pDBD-donor-p53 (V144G, 4.9 %)pDBD-donor-p53 (V144G, 4.9%) 44 pDBD-donor-p53 (E255K, 1.5%) + pAD-acc-Sv40 TpDBD-donor-p53 (E255K, 1.5%) + pAD-acc-Sv40 T 99 pDBD-donor-p53 (E255K, 1.5 %)pDBD-donor-p53 (E255K, 1.5%) 55 pDBD-donor-Lamin A + pAD-acc-Sv40 TpDBD-donor-Lamin A + pAD-acc-Sv40 T 1010 pDBD-donor-Lamin ApDBD-donor-Lamin A 1111 pAD-acc-Sv 40 TpAD-acc-Sv 40 T

Figure pat00002
Figure pat00002

상기 표의 기재에 관한 설명은 다음과 같다.The description of the above table is as follows.

p53 (W.T): 야생형 Murine p53p53 (W.T): wild type Murine p53

p53 (D278G, 34 %) : p53 단백질의 278번째 아미노산 D(aspartic acid)를 G(Glycin)으로 바꾼 돌연변이, SV40 L.T와 결합력이 34%로 감소p53 (D278G, 34%): a mutation that changed the 278th amino acid D (aspartic acid) of p53 protein to G (Glycin)

p53 (V144G, 4.9%) : p53 단백질의 144번째 아미노산 V(Valine)를 G(Glycin)으로 바꾼 돌연변이, SV40 L.T와 결합력이 4.9%로 감소p53 (V144G, 4.9%): a mutation that changed the 144th amino acid V (Valine) of p53 protein to G (Glycine), decreased binding strength to SV40 L.T by 4.9%

p53 (E255K, 1.5%) : p53 단백질의 255번째 아미노산 E(Glutamic acid)를 K(Lysine)으로 바꾼 돌연변이, SV40 L.T와 결합력이 1.5%로 감소p53 (E255K, 1.5%): a mutation that changed the 255th amino acid E (Glutamic acid) of p53 protein to K (Lysine) and decreased the binding force to 1.5% with SV40 L.T

Lamin A : p53 단백질과 전혀 상호작용하지 않는 단백질 (Negative control)Lamin A: Protein that does not interact with p53 protein at all (Negative control)

<3-2> 효모 균주의 형질전환 및 GFP를 통한 CRE 리포터의 작동 여부 확인<3-2> Transformation of yeast strains and confirmation of CRE reporter function through GFP

효모의 형질전환에는 Yeastmaker™ Yeast Transformation System 2 (Clontech 사의 630439)을 사용하여 진행하였다. 형질전환에 사용된 재조합 DNA는 총 25총의 plasmid를 동일한 분자 수가 되도록 섞은 후 사용하였다. 상기 실시예1에서 제조한 효모에 형질전환시킨 후 형질전환체 선별을 위하여 SD/ -U,H,L,T 한천 배지에서 배양하였다. 배양 후 O.D 600 값을 측정하여 yeast 세포 수를 계산하였다(O.D 600 값이 1.0인 경우 yeast 세포는 1.0 x 107cell/ml 이다). 50 ml conical tube에 fresh한 YPD 배지 10 ml을 넣고 여기에 각 각의 형질전환체 배양액에서 1.0 x 107개의 효모를 넣었다. 이를 30℃에서 4시간 동안 배양하여 효모의 교배를 유도하였다. 교배를 마친 후 원심분리하여 여분의 YPD 배지를 완전히 제거 한 후 SD/ -U,H,L,T 액체배지 10 ml을 넣고 30℃에서 3일동안 배양하여, 형질전환체를 선별하였다. 3일간 배양 후 배양이 진행된 한천배지를 형광현미경으로 관찰하였다.Yeast transformation was carried out using Yeastmaker Yeast Transformation System 2 (Clontech 630439). The recombinant DNA used in the transformation was used after mixing 25 total plasmids so as to have the same number of molecules. The yeasts prepared in Example 1 were transformed and cultured in SD / -U, H, L, and T agar plates for selection of transformants. After the incubation, the OD 600 value was measured to calculate the number of yeast cells (when the OD 600 value was 1.0, the yeast cells were 1.0 x 10 7 cells / ml). 10 ml of fresh YPD medium was placed in a 50 ml conical tube, and 1.0 × 10 7 yeast cells were added to each transformant culture. This was cultivated at 30 DEG C for 4 hours to induce crossing of the yeast. After the hybridization, the excess YPD medium was completely removed by centrifugation and 10 ml of SD / -U, H, L, T liquid medium was added and cultured at 30 ° C for 3 days to select transformants. After culturing for 3 days, the cultured agar medium was observed under a fluorescence microscope.

실험 결과, [도 6]에서 보는 바와 같이, 상호작용이 일어난 세포에서 성공적으로 형광이 나타나는 것을 확인하였다. 또한 단백질 간의 결합력이 강할수록 리포터 유전자의 발현 수준이 증가하여 결론적으로 형광의 강도가 강해지는 것을 확인하였다.As a result of the experiment, as shown in FIG. 6, it was confirmed that fluorescence appeared successfully in the cells in which the interaction occurred. In addition, the stronger the binding force between the proteins, the higher the expression level of the reporter gene, and consequently, the stronger the fluorescence intensity was confirmed.

<3-3> 항생제 처리에 의한 CRE 리포터의 작동 여부 확인<3-3> Confirmation of CRE reporter function by antibiotic treatment

전술한 바와 같이 형질전환된 세포에서, 단백질 간의 상호작용이 일어나는 경우 CRE recombinase에 의하여 Ampicillin과 kanamycin 모두에 저항성을 갖는 plasmid가 재조합된다. 이를 확인하기 위하여, 구체적으로 상기 실시예3-2와 같은 방법으로 형질전환된 효모에 엠피실린 단독 처리, 또는 엠피시린 및 카나마이신을 병용처리하여 생성된 콜로니를 측정하였다. In the transfected cells as described above, when protein interactions occur, plasmids resistant to both Ampicillin and kanamycin are recombined by CRE recombinase. In order to confirm this, specifically produced colonies were obtained by treating ampicillin alone or in combination with ampicillin and kanamycin in transformed yeasts in the same manner as in Example 3-2.

Figure pat00003
Figure pat00003

그 결과 상기 표8에서 보는 바와 같이, 단백질 간의 상호작용이 강할수록 CRE에 의한 recombination 비율이 높아지기 때문에 두 종의 항생제에 저항성을 갖는 plasmid가 증가하게 되고, 더 많은 콜로니가 형성 되는 것을 확인 하였다. As a result, as shown in Table 8, stronger interactions between proteins resulted in an increase in the recombination rate by CRE, so that plasmids resistant to both antibiotics were increased and more colonies were formed.

<3-4> 효모 균주의 Myc 리포터 작동 여부 확인<3-4> Confirmation of Myc reporter operation of yeast strain

상기 배양한 형질전환체 효모에서 c-myc 리포터 유전자가 정상 작동하는지 여부를 확인하기 위하여 상기 배양한 형질전환체 효모에 1차로 발현된 Myc과 결합하는 mouse α- c-myc 항체와 상기 c-myc 항체에 결합하는 2차 항체로 Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG 항체(Molecular probe)를 처리한 후 형광현미경으로 관찰하였다.In order to confirm whether the c-myc reporter gene functions normally in the cultured transformant yeast, mouse α-c-myc antibody that binds to Myc firstly expressed in the transformant yeast cultured and the c-myc Antibody-conjugated secondary antibody was treated with Alexa Fluor 568 Goat anti-Mouse IgG antibody (Molecular probe) and observed with fluorescence microscope.

실험결과 [도 7]에서 보는 바와 같이, 효모 균주의 Myc가 단백질간 상호작용에 의해 정상 작동 하여 붉은색 형광이 나타나는 것을 확인하였다. 또한 Cre recombinase 정상 발현에 의하여 GFP 형광 발현도 함께 관찰되었다. As a result of the experiment, as shown in Fig. 7, it was confirmed that Myc of the yeast strain works normally by protein interactions and red fluorescence appears. GFP fluorescence was also observed by normal expression of Cre recombinase.

<3-5> 형광표지 효모세포의 선별 process 작동 여부 확인<3-5> Confirmation of selection process of fluorescently labeled yeast cells

효모 균주에 도입된 pAD-acc 벡터 및 pDBD-donor 벡터에 도입된 알려진 p53 단백질과 SV40 large T 항원의 상호작용에 의해 형광이 발현된 효모균주를 한천배지 작업 없이 검출하고 분리할 수 있는지 확인하기 위하여 실시예 3-2에서 형질전환 한 효모균주 실험군을 액상배지에서 배양 후 세포를 분리하여 버퍼에 풀어 FACS 분석을 하였다.To confirm that the yeast strain expressing fluorescence by the interaction of the SV40 large T antigen with the known p53 protein introduced into the pAD-acc vector and the pDBD-donor vector introduced into the yeast strain can be detected and isolated without agar medium operation The yeast strains transformed in Example 3-2 were cultured in a liquid medium, and then the cells were separated, and analyzed by FACS analysis.

구체적으로, 실시예 3-2에서 형질전환시킨 효모균주 실험군들에서 배양을 마친 배양액을 원심분리하여 배지를 완전히 제거하고 효모만을 얻었다. 여기에 5 ml WB 버퍼(1X PBS, 5% BSA, 5mM EDTA)를 이용하여 2 번 효모를 세척하고 1 ml WB buffer에 1차 항체인 mouse α-myc 항체(c-Myc Antibody (9E10) (Santa cruz사의 sc-40))를 1:500으로 희석하여 세척한 효모에 넣고 잘 섞어 주었다. 얼음에 시료가 담긴 튜브를 보관하여 차가운 상태를 유지하면서 30분간 1차 항체가 결합하도록 반응시켰다. 30분 후 5 ml WB 버퍼를 이용하여 효모를 세척한 후 1 ml buffer에 형광염료가 표지된 2차 항체인 goat α-mouse IgG-Cy5(Molecular probe사의 A10524) 항체를 1:500으로 희석하여 1차 항체를 부착한 효모에 넣고 잘 섞어 주었다. 이 또한 얼음에 보관하여 차가운 상태를 유지하면서 30분간 반응시켰다. 염색을 마친 후 5 ml WB buffer로 한번 5 ml 1X PBS로 두 번 세척한 후 3 ml 1X PBS로 효모 세포를 완전히 풀어 준 후 14 ml FACS tube(BD falcon사의 352017)에 옮겼다. Specifically, in the main experimental groups transformed in Example 3-2, the cultured medium was centrifuged to completely remove the culture medium and only yeast cells were obtained. The yeast cells were washed with 5 ml of WB buffer (1X PBS, 5% BSA, 5 mM EDTA), and 1 ml of mouse α-myc antibody (c-Myc Antibody (9E10) (Santa sc-40, manufactured by cruz) was diluted 1: 500 and added to the washed yeast. The tubes containing the samples were kept in ice and allowed to react for 30 minutes while the cold was maintained. After 30 minutes, the yeast was washed with 5 ml of WB buffer. Then, 1 ml of goat α-mouse IgG-Cy5 (Molecular probe A10524) antibody, a fluorescent dye-labeled secondary antibody, was diluted 1: 500 It was added to the yeast with the secondary antibody and mixed well. This was also stored in ice and allowed to react for 30 minutes while keeping it in a cold state. After completion of the staining, the cells were washed twice with 5 ml of 1X PBS in 5 ml of WB buffer, and the yeast cells were completely disrupted with 3 ml of 1X PBS, and then transferred to a 14 ml FACS tube (352017 from BD falcon).

준비 된 시료를 FACS Moflo XDP(Backman Coulter)를 이용하여 분석하고 단백질 간의 상호작용에 의하여 유도된 레포터 유전자의 발현을 통하여 나타나는 형광(GFP, Cy5)을 가지는 효모 군을 따로 분리하였다. 선별되는 세포는 최소 1.0 x 107 이상이 되도록 하였다.The prepared samples were analyzed by FACS Moflo XDP (Backman Coulter) and the yeast group having fluorescence (GFP, Cy5) expressed through the expression of the reporter gene induced by protein interactions was separately isolated. Selected cells were at least 1.0 x 10 7 cells.

그 결과 [도 8] 및 [도 9]에서 보는 바와 같이, 상호작용이 일어나는 1번, 2번 실험군의 경우 리포트 유전자의 정상 발현에 의해 세포들이 분리되는 반면, 형질전환된 단백질이 상호작용하지 않는 3번 내지 5번 실험군의 경우 대조군(6번 내지 11번)과 동일한 분포를 나타내는 것을 확인하였다. As a result, as shown in FIG. 8 and FIG. 9, in the case of the first and second experimental groups in which the interaction occurs, cells are separated by normal expression of the report gene, while the transformed proteins do not interact And in the case of the experiment groups 3 to 5, the same distribution as the control group (6 to 11) was observed.

<3-6> 선별된 효모의 barcord reading 가능 여부 확인<3-6> Confirmation of barcord reading of selected yeast

단백질 상호작용이 일어난 효모에서 실제 바코드가 리딩(reading) 가능한 상태로 조합되었는지 확인하기 위하여, 상기 실시예3-5에서와 같이 GFP를 발현하는 콜로니의 효모 세포에서 핵산을 추출하고 하기 프라이머들을 사용하여 PCR을 수행하였다. GFP 를 발현하지 않았던 콜로니의 효모는 대조군으로 사용되었다. In order to confirm whether the actual barcodes were combined in a readable state in the yeast in which the protein interaction occurred, the nucleic acid was extracted from the yeast cells of the colon expressing GFP as in Example 3-5, and the following primers were used PCR was performed. Colony yeasts that did not express GFP were used as controls.

프라이머 서열Primer sequence 서열번호SEQ ID NO: 명칭designation sequencesequence 1010 primer Aprimer GGCCgTCGAcTaaTtGAGTGACGTACGCTTGGGGGCCgTCGAcTaaTtGAGTGACGTACGCTTGGG 1111 primer Bprimer B ggccATGCCGCGGTGGAAAggccATGCCGCGGTGGAAA 1212 primer Cprimer C GCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTATCTTAAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTATCTTAAG

도 19는 lox P 인근에서 재조합 된 Barcode를 PCR을 통하여 증폭한 결과를 나타낸다. 단백질 상호작용이 일어나 GFP가 발현되는 효모(lane 1)에서는 Cre recombinase에 의해 재조합이 일어나 115bp의 Barcode PCR 산물이 형성된 것을 확인하였으나, GFP 를 발현하지 않았던 콜로니의 효모(lane 2)에서는 Barcode PCR 산물이 검출되지 않았다. lane 3 및 lane 4는 plasmid가 있다는 것을 확인하기 위한 control로서 사용되었다(48 bp).19 shows the result of amplifying the recombined barcode near lox P by PCR. In the lane 1 gene expressing GFP, recombination was induced by Cre recombinase and a 115-bp Barcode PCR product was formed. In the lane 2 of the colonies that did not express GFP, Barcode PCR product Was not detected. lane 3 and lane 4 were used as controls to confirm that plasmids were present (48 bp).

이를 좀 더 알아보기 위하여 상기 실시예3-3의 방법으로 선별된 세포로부터 핵산을 추출하고 전술한 방법과 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 결과 도 20에서 보는 바와 같이, 단백질 상호작용이 일어나 mpicillin과 kanamycin 모두에 저항성을 갖는 효모들에서는 정상적으로 Barcode PCR 산물이 검출되는 것을 확인하였다. To further elucidate this, nucleic acids were extracted from selected cells by the method of Example 3-3, and PCR was performed in the same manner as described above. As a result, as shown in Fig. 20, it was confirmed that Barcode PCR products were detected normally in yeast resistant to both mpicillin and kanamycin due to protein interaction.

이로서 본 발명의 효모균주 및 벡터를 이용한 단백질간의 상호작용을 검출하는 system이 정상 작동 하는 것을 확인하였다.Thus, it was confirmed that the system for detecting the interactions between proteins using the yeast strains and the vectors of the present invention works normally.

<실시예 4><Example 4>

dual repoter Mega-throughput Y2H system 을 이용한, 단백질 상호작용 조사Protein interaction investigation using dual reporter Mega-throughput Y2H system

<4-1> MACS를 이용한, 단백질 상호작용 효모의 선별<4-1> Screening of protein-interacting yeasts using MACS

총 27 종의 ARS 유전자를 AD와 DBD에 재조합 후에 실험을 진행하였고 negative control 로서 Lamin A와 SV40 T를 사용하여, 전술한바와 같이 벡터를 제조하고 본 발명의 효모에 형질전환하여, 하기 표 10과 같은 실험군으로 실험을 진행하였다. c-myc epitope에 결합하는 항체를 (mouse Anti-c-myc IgG) 효모에 처리한 후, 여기에 다시 Anti-mouse IgG 항체가 코팅된 Bead를 처리하고 MACS를 수행하였다. 또한 상기 MACS 로 선별된 세포들을 형광현미경으로 관찰하였다. A total of 27 ARS genes were recombined into AD and DBD, and the experiment was conducted. Lamin A and SV40 T were used as negative controls, and vectors were prepared as described above and transformed into the yeast of the present invention. Experiments were conducted in the same experimental group. c-myc epitope (mouse anti-c-myc IgG) yeast was treated with anti-mouse IgG antibody-coated beads and MACS was performed. Cells selected by MACS were observed by fluorescence microscopy.

Figure pat00004
Figure pat00004

도 16에서 보는 바와 같이, MACS를 통하여 c-myc 리포터가 발현된 세포들을 선별하였으며, 이들 세포에서 GFP 형광발현이 일어나는 것을 확인하였다. 따라서 한천배지 작업 없이도, MACS 등의 작업을 통해 단백질 상호작용이 일어나고 있는 효모들을 선별할 수 있었다.As shown in FIG. 16, cells expressing c-myc reporter were selected through MACS, and GFP fluorescence expression was observed in these cells. Therefore, it was possible to select yeasts that are undergoing protein interaction through MACS and other processes without agar medium.

또한, 단백질 상호작용 세기와 관련하여 MACS 방법이 얼마나 효율적으로 효모 세포들을 선별할 수 있는지 확인하기 위하여, 하기 표 11과 같이 벡터를 제조하고 본 발명의 효모에 형질전환하여, 전술한 방법과 동일하게 MACS 수행하였다. In order to confirm how efficiently the MACS method can select yeast cells in relation to the protein interaction intensity, a vector is prepared as shown in Table 11 below and transformed into the yeast of the present invention, MACS was performed.

pHAB210 : pDBD-donor-p53pHAB210: pDBD-donor-p53 VSVS pHAB215 : pAD-acc-SV40 TpHAB215: pAD-acc-SV40 T pHAB211 : pDBD-donor-p53-E255K (1.5 %)pHAB211: pDBD-donor-p53-E255K (1.5%) pHAB212 : pDBD-donor-p53-V144G (4.9%)pHAB212: pDBD-donor-p53-V144G (4.9%) pHAB213 : pDBD-donor-p53-D278G (34 %)pHAB213: pDBD-donor-p53-D278G (34%) pHAB214 : pDBD-donor-Lamin ApHAB214: pDBD-donor-Lamin A

Figure pat00005
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그 결과 상기 표12 및 도 24에서 보는 바와 같이, 단백질 간의 상호작용 세기가 강할수록 MACS 에의해서 선별되는 세포의 양이 다른 것을 알 수 있다. 따라서 MACS를 수행함으로서 단백질 상호작용이 강한 것들이 더 잘 선별되며, 이는 본 발명의 Y2H system 정확도 향상에 기여하는 것으로 생각되었다. As a result, as shown in Table 12 and FIG. 24, it can be seen that as the intensity of interaction between proteins is strong, the amount of cells selected by MACS is different. Therefore, by carrying out MACS, those with strong protein interactions are better selected, which is believed to contribute to the improvement of the Y2H system accuracy of the present invention.

<4-2> 단백질 상호작용 효모의 선별에 있어서, 형광 이용 방법과 MACS 이용 방법의 효율 비교<4-2> Comparison of efficiency of fluorescence use and MACS utilization in screening protein-interacting yeast

실제로 단백질 상호작용이 일어난 효모 세포(즉, positive cell)를 선별하는 방법으로서, 형광을 이용하는 방법과 상기 MACS를 이용하는 방법 중 어느 방법이 더욱 정확한 선별을 가능하게 하는 지 알아보았다. 그리하여 상기 실시예4-1과 같이 효모를 형질전환하고 36시간 후에 cy5 및 GFP의 형광을 조사하고, MACS 를 1회 및 2회 시행하여 선별한 세포들에서 cy5 및 GFP의 발현을 조사하였다.As a method of selecting yeast cells (that is, positive cells) in which protein interaction actually took place, it has been examined whether any of the methods using fluorescence and the MACS enables more accurate selection. Thus, the yeast was transformed as in Example 4-1, and cy5 and GFP fluorescence were examined after 36 hours, and MACS was performed once and twice to examine the expression of cy5 and GFP in the selected cells.

도 17에서 보는 바와 같이, 각 벡터들을 효모에 도입한지 36시간에는 형광발현을 통하여 단백질 상호작용 여부를 알기 어려웠으나(도 17의 A), MACS는 실제로 단백질 상호작용이 일어난 positive cell들을 분리 가능하였으며 이는 MACS 시행 횟수가 증가할수록 positive cell 선별력이 증가되는 것이 확인되었다(도 17의 B). MACS를 이용하면, 높은 정확도로 positive cell들을 선별 가능함을 확인하였다.  As shown in FIG. 17, it was difficult to determine the protein interaction through fluorescence expression at 36 hours after each vector was introduced into the yeast (FIG. 17A), but MACS was able to isolate positive cells in which protein interaction actually occurred It was confirmed that as the number of MACS trials increased, positive cell sorting power was increased (FIG. 17B). Using MACS, we confirmed that positive cells can be selected with high accuracy.

<4-3> 상호작용하는 단백질들의 규명을 위한 바코드 리딩(reading)<4-3> Barcode reading for identification of interacting proteins

본 발명의 dual repoter Mega-throughput Y2H system에서 어떤 단백질들이 상호작용을 하고 있는지 규명하기 위하여, 이들의 바코드 서열을 분석하였다. 구체적으로, 표 6의 라이브러리를 구축하고, 이들을 본 발명의 효모에 도입한 후 재조합 된 barcode를 NGS사용하여 분석하였다. To identify which proteins interact with the dual reporter Mega-throughput Y2H system of the present invention, their bar code sequences were analyzed. Specifically, the libraries of Table 6 were constructed, and after they were introduced into the yeast of the present invention, the recombinant barcode was analyzed using NGS.

그 결과 도 21에서 보는 바와 같이, LaminA, SV40 T의 p53과의 친화도에 따라서 바코드 리드(barcode reads) 수가 현격이 차이가 나는 것을 확인하였다. 즉, 단백질의 친화도(상호작용 세기)가 감소될수록 바코드 리드수가 감소되었다. As a result, as shown in FIG. 21, it was confirmed that the number of barcode reads differs depending on the affinity of LaminA and SV40 T for p53. That is, as the affinity (interaction intensity) of the protein decreases, the number of barcode leads decreases.

<4-4> 라이브러리-라이브러리 단백질 상호작용 분석<4-4> Analysis of library-library protein interaction

본 발명의 dual repoter Mega-throughput Y2H system이 라이브러리-라이브러리 간의 각 단백질 상호작용에 대한 정보를 제공할 수 있는지 확인하기 위하여, ARS 라이브러리를 대상으로 본 발명의 Y2H system을 작동시키고 NRS로 바코드를 리딩(reading)한 결과를 확인하였다. 실험은 AD-acc 벡터는 AIMP2가 발현되도록 고정하고 DBD-doner 벡터에 ARS 라이브러리를 적용하는 방법(도 22의 A), DBD-doner 벡터는 AIMP2가 발현되도록 고정하고 D-acc 벡터에 ARS 라이브러리를 적용하는 방법(도 22의 B)의 두 가지로 확인하였다. In order to confirm whether the dual reporter Mega-throughput Y2H system of the present invention can provide information about each protein interaction between the library and the library, the Y2H system of the present invention was operated on the ARS library and the bar code was read reading). In the experiment, the AD-acc vector was fixed to express AIMP2 and the ARS library was applied to DBD-donor vector (FIG. 22A). DBD-doner vector was fixed to express AIMP2 and ARS library was added to D-acc vector (FIG. 22B).

그 결과 도 22 및 도 23에서 보는 바와 같이, 라이브러리를 이용한 대량의 단백질 동시 분석 실험에서 바코드 read 정도를 비교함에 따라 단백질간 상호작용 세기의 분석이 가능하였다. As a result, as shown in FIG. 22 and FIG. 23, it was possible to analyze the intensities of protein interactions by comparing the readings of bar codes in a large amount of protein simultaneous analysis using a library.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 새로운 yeast two hybrid 시스템을 통한 라이브러리-라이브러리 간 단백질-단백질 결합 동시 분석 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 목적 단백질 특이적인 바코드 서열을 포함하는 pAD-acc 벡터 및 pDBD-donor 벡터, c-myc 리포터 발현 카세트 및 Cre 리포터 발현 카세트를 동시에 포함하는 효모 균주, 및 상기 벡터를 상기 효모 균주에 도입하여 라이브러리-라이브러리 간 단백질 상호작용을 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 두 단백질의 상호작용을 매우 간소한 방법으로 선별할 수 있어 기존의 yeast two hybrid 방법을 넘어서 라이브러리 대 라이브러리 선별을 진행 할 수 있어 산업상 이용가능성이 높다.As described above, the present invention relates to a method for simultaneously analyzing protein-protein binding between a library and a library through a novel yeast two hybrid system. More particularly, the present invention relates to a method for simultaneous analysis of protein-protein binding between a pAD-acc vector containing a target protein- donor vector, a c-myc reporter expression cassette and a Cre reporter expression cassette, and introducing said vector into said yeast strain to detect library-library protein interaction. The method of the present invention enables selection of the interaction of two proteins in a very simple manner, and thus it is possible to carry out library-to-library screening beyond the conventional yeast two hybrid method, which is highly likely to be used industrially.

<110> Medicinal Bioconvergence Research Center <120> Method for measuring multiple protein-protein interactions simultaneously between two yeast library <130> NP15-0039 <150> 1020140049726 <151> 2014-04-25 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcode template oligo AD <400> 1 cgtacgcttg ggnnnnnnnn nntttccacc gcgg 34 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AD-5 (BsiW I) <400> 2 tgcacagcgt acgcttggg 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AD-3 (Sac II) <400> 3 ggccatgccg cggtggaaa 19 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcode template oligo DBD <400> 4 accggtcttg ggnnnnnnnn nntttccact taag 34 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DBD-5 (Afl II) <400> 5 tgcacagacc ggtcttggg 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DBD-3 (Age I) <400> 6 ggccatgctt aagtggaaa 19 <210> 7 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aaRS(F)sfi I <400> 7 gcgatcaggc ccagcaggcc ggcgccgaga ccgcggtc 38 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DBD-aaRS(R)sfi I <400> 8 acagcttggc cagcagggcc ctgcaggtcg acctcgag 38 <210> 9 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AD-aaRS(R)sfi I <400> 9 acagcttggc ccagcaggcc ctgcaggtcg acctcgag 38 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer A <400> 10 ggccgtcgac taattgagtg acgtacgctt ggg 33 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer B <400> 11 ggccatgccg cggtggaaa 19 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer C <400> 12 gccccaaggg gttatgctag ttatcttaag 30 <210> 13 <211> 3043 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gal1 promoter- MFalpha1- myc10 repeats- Glycine/Serine linker- AgalphaI(C-term) <400> 13 cattacccgc ggacggatta gaagccgccg agcgggtgac agccctccga aggaagactc 60 tcctccgtgc gtcctcgtct tcaccggtcg cgttcctgaa acgcagatgt gcctcgcgcc 120 gcactgctcc gaacaataaa gattctacaa tactagcttt tatggttatg aagaggaaaa 180 attggcagta acctggcccc acaaaccttc aaatgaacga atcaaattaa caaccatagg 240 atgataatgc gattagtttt ttagccttat ttctggggta attaatcagc gaagcgatga 300 tttttgatct attaacagat atataaatgc aaaaactgca taaccacttt aactaatact 360 ttcaacattt tcggtttgta ttacttctta ttcaaatgta ataaaagtat caacaaaaaa 420 ttgttaatat acctctatac tttaacgtca aggagaaaaa accccggatc ggactactag 480 cagctgtaat acgactcact atagggaata ttaagctaat tctacttcat acattttcaa 540 ttaagagatc tatgagattt ccttcaattt ttactgctgt tttattcgca gcatcctccg 600 cattagctgc tccagtcaac actacaacag aagatgaaac ggcacaaatt ccggctgaag 660 ctgtcatcgg ttactcagat ttagaagggg atttcgatgt tgctgttttg ccattttcca 720 acagcacaaa taacgggtta ttgtttataa atactactat tgccagcatt gctgctaaag 780 aagaaggggt atctctcgag aaaagagagg ctgaagctac gcgtaacaca cagtatgttt 840 ttgatatcaa aatgtcccat cgatttaaag ctatggagca aaagctcatt tctgaagagg 900 acttgaatga aatggagcaa aagctcattt ctgaagagga cttgaatgaa atggagcaaa 960 agctcatttc tgaagaggac ttgaatgaaa tggagcaaaa gctcatttct gaagaggact 1020 tgaatgaaat ggagcaaaag ctcatttctg aagaggactt gaatgaaatg gagagcttgg 1080 gcgacctcac ctcgatcaaa atgtcccatc gatttaaagc tatggagcaa aagctcattt 1140 ctgaagagga cttgaatgaa atggagcaaa agctcatttc tgaagaggac ttgaatgaaa 1200 tggagcaaaa gctcatttct gaagaggact tgaatgaaat ggagcaaaag ctcatttctg 1260 aagaggactt gaatgaaatg gagcaaaagc tcatttctga agaggacttg aatgaaatgg 1320 agagcttggg cgacctcacc gccgctaatg gcaagcttct gcaggctagt ggtggtggtg 1380 gttctggtgg tggtggttct ggtggtggtg gttctgctag catgactctc gagcttgata 1440 ccatagcaaa tactacgtac gctacgcaat tctcgactac tagggaattt attgtttatc 1500 agggtcggaa cctcggtaca gctagcgcca aaagctcttt tatctcaacc actactactg 1560 atttaacaag tataaacact agtgcgtatt ccactggatc catttccaca gtagaaacag 1620 gcaatcgaac tacatcagaa gtgatcagcc atgtggtgac taccagcaca aaactgtctc 1680 caactgctac taccagcctg acaattgcac aaaccagtat ctattctact gactcaaata 1740 tcacagtagg aacagatatt cacaccacat cagaagtgat tagtgatgtg gaaaccatta 1800 gcagagaaac agcttcgacc gttgtagccg ctccaacctc aacaactgga tggacaggcg 1860 ctatgaatac ttacatctcg caatttacat cctcttcttt cgcaacaatc aacagcacac 1920 caataatctc ttcatcagca gtatttgaaa cctcagatgc ttcaattgtc aatgtgcaca 1980 ctgaaaatat cacgaatact gctgctgttc catctgaaga gcccactttt gtaaatgcca 2040 cgagaaactc cttaaattcc ttctgcagca gcaaacagcc atccagtccc tcatcttata 2100 cgtcttcccc actcgtatcg tccctctccg taagcaaaac attactaagc accagtttta 2160 cgccttctgt gccaacatct aatacatata tcaaaacgaa aaatacgggt tactttgagc 2220 acacggcttt gacaacatct tcagttggcc ttaattcttt tagtgaaaca gcagtctcat 2280 ctcagggaac gaaaattgac acctttttag tgtcatcctt gatcgcatat ccttcttctg 2340 catcaggaag ccaattgtcc ggtatccaac agaatttcac atcaacttct ctcatgattt 2400 caacctatga aggtaaagcg tctatatttt tctcagctga gctcggttcg atcatttttc 2460 tgcttttgtc gtacctgcta ttctaaaacg ggtactgtac agttagtaca ttgagtcgaa 2520 atatacgaaa ttattgttca taattttcat cctggctctt tttttcttca accatagtta 2580 aatggacagt tcatatctta actctaataa tacttttcta gttcttatcc ttttccgtct 2640 caccgcagat tttatcatag tattaaattt atattttgtt cgtaaaaaga aaaatttgtg 2700 agcgttaccg ctcgtttcat tacccgaagg ctgtttcagt agaccactga ttaagtaagt 2760 agatgaaaaa atttcatcac catgaaagag ttcgatgaga gctacttttt caaatgctta 2820 acagctaacc gccattcaat aatgttacgc tctcttcatt ctgcggctac gttatctaac 2880 aagaggtttt actctctcat atctcattca aatagaaaga acataatcaa aaagcttcta 2940 cgtcaccctt ctttcgatcc aattcgtcat catttgcctg aagatataac caccattgac 3000 ccatactctc tatcgcagaa tgttatcgaa accgcggagt cag 3043 <210> 14 <211> 2014 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAL1 promoter- CRE recombinase <400> 14 acggattaga agccgccgag cgggtgacag ccctccgaag gaagactctc ctccgtgcgt 60 cctcgtcttc accggtcgcg ttcctgaaac gcagatgtgc ctcgcgccgc actgctccga 120 acaataaaga ttctacaata ctagctttta tggttatgaa gaggaaaaat tggcagtaac 180 ctggccccac aaaccttcaa atgaacgaat caaattaaca accataggat gataatgcga 240 ttagtttttt agccttattt ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat 300 taacagatat ataaatgcaa aaactgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc 360 ggtttgtatt acttcttatt caaatgtaat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac 420 ctctatactt taacgtcaag gagaaaaaac tataatgact aaatctcatt cagaagaagt 480 gattgtacct gagttcaatt ctagcgcaaa ggaattacca agaccattgg ccgaaaagtg 540 cggaattcaa atgtctaatt tgttgactgt tcatcaaaat ttgccagctt tgccagttga 600 tgcaacgtct gatgaggtaa gaaagaattt gatggatatg tttagagata gacaagcatt 660 ctctgaacat acttggaaaa tgttgttgtc tgtttgtaga tcttgggctg cttggtgtaa 720 attaaataat agaaaatggt ttccagctga accagaagat gttagagatt atttgttgta 780 tttgcaagct agaggtttgg ctgttaaaac tatacaacaa catttgggtc aattaaatat 840 gttgcatagg agatctggtt tgcctagacc atctgattct aatgctgtat ctttggttat 900 gagaaggatt agaaaagaaa atgttgatgc aggtgaaaga gctaaacaag cattggcgtt 960 tgaaagaact gattttgatc aagttagatc tttgatggaa aattctgata gatgtcaaga 1020 tataagaaac ttggctttct tgggaattgc ttataataca ttgttgagaa ttgctgaaat 1080 tgctagaatt agagttaaag acatttctag aactgatggt ggtagaatgt tgattcatat 1140 tggtagaact aaaacattgg tttcaactgc tggcgttgag aaagcattgt ctttgggtgt 1200 tactaaattg gttgaaagat ggatttctgt atctggtgtg gctgatgacc caaataatta 1260 tttattttgt agagttagaa agaatggtgt tgcggctcca tctgctacat ctcagctctc 1320 tacccgtgcc ttggaaggaa tttttgaagc aactcataga ttgatttatg gtgctaaaga 1380 tgattctggt caaagatatt tagcatggtc tggtcattct gctagagttg gtgccgctag 1440 agatatggct agagctgggg tatctattcc tgaaattatg caagctggtg gttggactaa 1500 tgttaacatc gtcatgaact atattagaaa tttggattct gaaactggtg caatggttag 1560 actcttggaa gatggtgatc ccgggtagat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac 1620 ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca 1680 ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga atggcgcttt gcctggtttc 1740 cggcaccaga agcggtgccg gaaagctggc tggagtgcga tcttcctgag gccgatactg 1800 tcgtcgtccc ctcaaactgg cagatgcacg gttacgatgc gcccatctac accaacgtga 1860 cctatcccat tacggtcaat ccgccgtttg ttcccacgga gaatccgacg ggttgttact 1920 cgctcacatt taatgttgat gaaagctggc tacaggaagg ccagacgcga attatttttg 1980 atggcgttaa ctcggcgttt catctgtggt gcaa 2014 <110> Medicinal Bioconvergence Research Center <120> Method for measuring multiple protein-protein interactions          simultaneously between two yeast libraries <130> NP15-0039 <150> 1020140049726 <151> 2014-04-25 <160> 14 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcode template oligo AD <400> 1 cgtacgcttg ggnnnnnnnn nntttccacc gcgg 34 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > AD-5 (BsiW I) <400> 2 tgcacagcgt acgcttggg 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > AD-3 (Sac II) <400> 3 ggccatgccg cggtggaaa 19 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcode template oligo DBD <400> 4 accggtcttg ggnnnnnnnn nntttccact taag 34 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > DBD-5 (Afl II) <400> 5 tgcacagacc ggtcttggg 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > DBD-3 (Age I) <400> 6 ggccatgctt aagtggaaa 19 <210> 7 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aaRS (F) sfi I <400> 7 gcgatcaggc ccagcaggcc ggcgccgaga ccgcggtc 38 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > DBD-aaRS (R) sfi I <400> 8 acagcttggc cagcagggcc ctgcaggtcg acctcgag 38 <210> 9 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AD-aaRS (R) sfi I <400> 9 acagcttggc ccagcaggcc ctgcaggtcg acctcgag 38 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ggccgtcgac taattgagtg acgtacgctt ggg 33 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer B <400> 11 ggccatgccg cggtggaaa 19 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer C <400> 12 gccccaaggg gttatgctag ttatcttaag 30 <210> 13 <211> 3043 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gal1 promoter- MFalpha1- myc10 repeats- Glycine / Serine linker-          Agalpha I (C-term) <400> 13 cattacccgc ggacggatta gaagccgccg agcgggtgac agccctccga aggaagactc 60 tcctccgtgc gtcctcgtct tcaccggtcg cgttcctgaa acgcagatgt gcctcgcgcc 120 gcactgctcc gaacaataaa gattctacaa tactagcttt tatggttatg aagaggaaaa 180 attggcagta acctggcccc acaaaccttc aaatgaacga atcaaattaa caaccatagg 240 atgataatgc gattagtttt ttagccttat ttctggggta attaatcagc gaagcgatga 300 tttttgatct attaacagat atataaatgc aaaaactgca taaccacttt aactaatact 360 ttcaacattt tcggtttgta ttacttctta ttcaaatgta ataaaagtat caacaaaaaa 420 ttgttaatat acctctatac tttaacgtca aggagaaaaa accccggatc ggactactag 480 cagctgtaat acgactcact atagggaata ttaagctaat tctacttcat acattttcaa 540 ttaagagatc tatgagattt ccttcaattt ttactgctgt tttattcgca gcatcctccg 600 cattagctgc tccagtcaac actacaacag aagatgaaac ggcacaaatt ccggctgaag 660 ctgtcatcgg ttactcagat ttagaagggg atttcgatgt tgctgttttg ccattttcca 720 acagcacaaa taacgggtta ttgtttataa atactactat tgccagcatt gctgctaaag 780 aagaaggggt atctctcgag aaaagagagg ctgaagctac gcgtaacaca cagtatgttt 840 ttgatatcaa aatgtcccat cgatttaaag ctatggagca aaagctcatt tctgaagagg 900 acttgaatga aatggagcaa aagctcattt ctgaagagga cttgaatgaa atggagcaaa 960 agctcatttc tgaagaggac ttgaatgaaa tggagcaaaa gctcatttct gaagaggact 1020 tgaatgaaat ggagcaaaag ctcatttctg aagaggactt gaatgaaatg gagagcttgg 1080 gcgacctcac ctcgatcaaa atgtcccatc gatttaaagc tatggagcaa aagctcattt 1140 ctgaagagga cttgaatgaa atggagcaaa agctcatttc tgaagaggac ttgaatgaaa 1200 tggagcaaaa gctcatttct gaagaggact tgaatgaaat ggagcaaaag ctcatttctg 1260 aagaggactt gaatgaaatg gagcaaaagc tcatttctga agaggacttg aatgaaatgg 1320 agagcttggg cgacctcacc gccgctaatg gcaagcttct gcaggctagt ggtggtggtg 1380 gttctggtgg tggtggttct ggtggtggtg gttctgctag catgactctc gagcttgata 1440 ccatagcaaa tactacgtac gctacgcaat tctcgactac tagggaattt attgtttatc 1500 agggtcggaa cctcggtaca gctagcgcca aaagctcttt tatctcaacc actactactg 1560 atttaacaag tataaacact agtgcgtatt ccactggatc catttccaca gtagaaacag 1620 gcaatcgaac tacatcagaa gtgatcagcc atgtggtgac taccagcaca aaactgtctc 1680 caactgctac taccagcctg acaattgcac aaaccagtat ctattctact gactcaaata 1740 tcacagtagg aacagatatt cacaccacat cagaagtgat tagtgatgtg gaaaccatta 1800 gcagagaaac agcttcgacc gttgtagccg ctccaacctc aacaactgga tggacaggcg 1860 ctatgaatac ttacatctcg caatttacat cctcttcttt cgcaacaatc aacagcacac 1920 caataatctc ttcatcagca gtatttgaaa cctcagatgc ttcaattgtc aatgtgcaca 1980 ctgaaaatat cacgaatact gctgctgttc catctgaaga gcccactttt gtaaatgcca 2040 cgagaaactc cttaaattcc ttctgcagca gcaaacagcc atccagtccc tcatcttata 2100 cgtcttcccc actcgtatcg tccctctccg taagcaaaac attactaagc accagtttta 2160 cgccttctgt gccaacatct aatacatata tcaaaacgaa aaatacgggt tactttgagc 2220 acacggcttt gacaacatct tcagttggcc ttaattcttt tagtgaaaca gcagtctcat 2280 ctcagggaac gaaaattgac acctttttag tgtcatcctt gatcgcatat ccttcttctg 2340 catcaggaag ccaattgtcc ggtatccaac agaatttcac atcaacttct ctcatgattt 2400 caacctatga aggtaaagcg tctatatttt tctcagctga gctcggttcg atcatttttc 2460 tgcttttgtc gtacctgcta ttctaaaacg ggtactgtac agttagtaca ttgagtcgaa 2520 atatacgaaa ttattgttca taattttcat cctggctctt tttttcttca accatagtta 2580 aatggacagt tcatatctta actctaataa tacttttcta gttcttatcc ttttccgtct 2640 caccgcagat tttatcatag tattaaattt atattttgtt cgtaaaaaga aaaatttgtg 2700 agcgttaccg ctcgtttcat tacccgaagg ctgtttcagt agaccactga ttaagtaagt 2760 agatgaaaaa atttcatcac catgaaagag ttcgatgaga gctacttttt caaatgctta 2820 acagctaacc gccattcaat aatgttacgc tctcttcatt ctgcggctac gttatctaac 2880 aagaggtttt actctctcat atctcattca aatagaaaga acataatcaa aaagcttcta 2940 cgtcaccctt ctttcgatcc aattcgtcat catttgcctg aagatataac caccattgac 3000 ccatactctc tatcgcagaa tgttatcgaa accgcggagt cag 3043 <210> 14 <211> 2014 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAL1 promoter-CRE recombinase <400> 14 acggattaga agccgccgag cgggtgacag ccctccgaag gaagactctc ctccgtgcgt 60 cctcgtcttc accggtcgcg ttcctgaaac gcagatgtgc ctcgcgccgc actgctccga 120 acaataaaga ttctacaata ctagctttta tggttatgaa gaggaaaaat tggcagtaac 180 ctggccccac aaaccttcaa atgaacgaat caaattaaca accataggat gataatgcga 240 ttagtttttt agccttattt ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat 300 taacagatat ataaatgcaa aaactgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc 360 ggtttgtatt acttcttatt caaatgtaat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac 420 ctctatactt taacgtcaag gagaaaaaac tataatgact aaatctcatt cagaagaagt 480 gattgtacct gagttcaatt ctagcgcaaa ggaattacca agaccattgg ccgaaaagtg 540 cggaattcaa atgtctaatt tgttgactgt tcatcaaaat ttgccagctt tgccagttga 600 tgcaacgtct gatgaggtaa gaaagaattt gatggatatg tttagagata gacaagcatt 660 ctctgaacat acttggaaaa tgttgttgtc tgtttgtaga tcttgggctg cttggtgtaa 720 attaaataat agaaaatggt ttccagctga accagaagat gttagagatt atttgttgta 780 tttgcaagct agaggtttgg ctgttaaaac tatacaacaa catttgggtc aattaaatat 840 gttgcatagg agatctggtt tgcctagacc atctgattct aatgctgtat ctttggttat 900 gagaaggatt agaaaagaaa atgttgatgc aggtgaaaga gctaaacaag cattggcgtt 960 tgaaagaact gattttgatc aagttagatc tttgatggaa aattctgata gatgtcaaga 1020 tatagaaac ttggctttct tgggaattgc ttataataca ttgttgagaa ttgctgaaat 1080 tgctagaatt agagttaaag acatttctag aactgatggt ggtagaatgt tgattcatat 1140 tggtagaact aaaacattgg tttcaactgc tggcgttgag aaagcattgt ctttgggtgt 1200 tactaaattg gttgaaagat ggatttctgt atctggtgtg gctgatgacc caaataatta 1260 tttattttgt agagttagaa agaatggtgt tgcggctcca tctgctacat ctcagctctc 1320 tacccgtgcc ttggaaggaa tttttgaagc aactcataga ttgatttatg gtgctaaaga 1380 tgattctggt caaagatatt tagcatggtc tggtcattct gctagagttg gtgccgctag 1440 agatatggct agagctgggg tatctattcc tgaaattatg caagctggtg gttggactaa 1500 tgttaacatc gtcatgaact atattagaaa tttggattct gaaactggtg caatggttag 1560 actcttggaa gatggtgatc ccgggtagat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac 1620 ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca 1680 ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga atggcgcttt gcctggtttc 1740 cggcaccaga agcggtgccg gaaagctggc tggagtgcga tcttcctgag gccgatactg 1800 tcgtcgtccc ctcaaactgg cagatgcacg gttacgatgc gcccatctac accaacgtga 1860 cctatcccat tacggtcaat ccgccgtttg ttcccacgga gaatccgacg ggttgttact 1920 cgctcacatt taatgttgat gaaagctggc tacaggaagg ccagacgcga attatttttg 1980 atggcgttaa ctcggcgttt catctgtggt gcaa 2014

Claims (8)

플라스미드 pGADT7의 LEU2 유전자 말단에 loxP 서열을 삽입하고, 멀티플 클로닝 사이트(MCS)를 두 개의 Sfi I 제한효소 자리로 대체하고, 그 뒤로 바코드 삽입 부위, lox2272 서열이 순차적으로 도입된 것을 특징으로 하는 pAD-acc 벡터.
Characterized in that the loxP sequence is inserted at the LEU2 gene end of the plasmid pGADT7, the multiple cloning site (MCS) is replaced with two Sfi I restriction enzyme sites, followed by the barcode insertion site and the lox2272 sequence, acc vector.
플라스미드 pGBKT7에 멀티 클로닝 사이트(MCS)를 제거하고, 멀티플 클로닝 사이트(MCS)를 두 개의 Sfi I 제한효소 자리로 대체하고, 그 뒤로 lox2272 서열과 바코드 삽입 부위, 카나마이신 항생제 저항성 유전자와 프로모터, GFP 유전자 및 loxP 서열이 순차적으로 도입된 것을 특징으로 하는 pDBD-donor 벡터.
The multiple cloning site (MCS) was removed from the plasmid pGBKT7, the multiple cloning site (MCS) was replaced with two Sfi I restriction sites, followed by the lox2272 sequence and the barcode insertion site, the kanamycin antibiotic resistance gene and promoter, the GFP gene pDBD-donor vector characterized in that the loxP sequence is introduced sequentially.
제1항에 있어서, 상기 pAD-acc 벡터는 도 1 또는 도 10의 개열지도로 나타내어지는 것을 특징으로 하는 벡터.
2. The vector according to claim 1, wherein the pAD-acc vector is represented by a cleaved map of Fig. 1 or Fig.
제2항에 있어서, 상기 pDBD-donor 벡터는 도 2의 개열지도로 나타내어지는 것을 특징으로 하는 벡터.
3. The vector according to claim 2, wherein the pDBD-donor vector is represented by a cleavage map of Fig.
하기 (i) 및 (ii)의 발현 카세트를 동시에 포함하는 이중(dual) 리포터 효모 균주;
(i) 순차적으로 작동 가능하게 연결되며 GAL4 UAS(upstream activation sequence), GAL1 프로모터, MFα1 유전자, c-myc 에피토프 코딩 폴리뉴클레오티드 및 AgαI 유전자를 포함하는 c-myc 리포터 발현 카세트; 및
(ii) 순차적으로 작동 가능하게 연결되며 GAL4 UAS(upstream activation sequence), GAL1 프로모터 및 Cre 재조합효소(Cre recombinase) 발현 유전자를 포함하는 Cre 리포터 발현 카세트.
A dual reporter yeast strain containing simultaneously the expression cassettes of (i) and (ii) below;
(i) a c-myc reporter expression cassette comprising a GAL4 upstream activation sequence, GAL1 promoter, MFα1 gene, c-myc epitope coding polynucleotide and AgαI gene, operably linked in sequence; And
(ii) a Cre reporter expression cassette comprising a GAL4 upstream activation sequence, GAL1 promoter and Cre recombinase expression gene operably linked in sequence.
제5항에 있어서, 상기 (i) c-myc 리포터 발현 카세트의 c-myc 에피토프는 1 내지 20개 반복 되는 것을 특징으로 하는, 효모 균주.
6. The yeast strain according to claim 5, wherein (i) the c-myc epitope of the c-myc reporter expression cassette is repeated 1 to 20 times.
제5항에 있어서, 상기 (i) c-myc 리포터 발현 카세트의 c-myc 에피토프 코딩 폴리뉴클레오티드 및 AgαI 유전자는 링커로 연결되는 것을 특징으로 하는, 효모 균주.
6. The yeast strain of claim 5, wherein (i) the c-myc epitope-encoding polynucleotide of the c-myc reporter expression cassette and the Ag? I gene are linked by a linker.
(a) 제1항의 pAD-acc 벡터 및 제2항의 pDBD-donor 벡터에 각각 상이한 바코드 서열을 도입하고, 서로 다른 목적 단백질을 발현하는 유전자를 재조합하여 제 1, 제 2 라이브러리를 구성하는 단계;
(b) 상기 제1 및 제2라이브러리를 제5항의 효모 균주에 도입하는 단계;
(c) 상기 제1라이브러리 및 제2라이브러리가 도입된 효모 균주로부터, 제1항의 pAD-acc 벡터에 도입된 유전자로부터 발현된 단백질과 제2항의 pDBD-donor 벡터에 도입된 유전자로부터 발현된 단백질이 서로 상호작용하는 효모균주를 선별하는 단계; 및
(d) 상기 선별된 효모균주의 바코드 서열을 식별하여 상기 상호작용하는 단백질을 선택하는 단계를 포함하는 단백질간의 상호작용을 검출하는 방법.(a) constructing first and second libraries by introducing different barcode sequences into the pAD-acc vector of claim 1 and the pDBD-donor vector of claim 2, respectively, and recombining the genes expressing different target proteins;
(b) introducing the first and second libraries into the yeast strain of claim 5;
(c) a protein expressed from the gene introduced into the pAD-acc vector of claim 1 and a protein expressed from the gene introduced into the pDBD-donor vector of claim 2 from the yeast strain into which the first library and the second library are introduced Selecting yeast strains that interact with each other; And
(d) identifying the interacting protein by identifying the bar code sequence of the selected yeast strain.
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