KR20150122786A - 암 전이의 진단, 예후 및 치료를 위한 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암 환자에서 전이 발생의 확률을 결정하는 방법을 비롯하여, c-MAF의 발현 증가에 의해 그 발현이 조정되는 1 이상의 유전자의 발현도 결정을 기반으로, 암 환자, 구체적으로 유방암, 결장암, 폐암, 신장암 또는 갑상선암을 갖는 환자에 대한 맞춤형 요법을 디자인하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 c-MAF의 발현 조정의 유도를 기반으로 암 전이 경향을 동정하는 마커 유전자를 동정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 암, 구체적으로 유방암, 결장암, 폐암, 신장암 또는 갑상선암의 전이를 치료 및/또는 예방하는데서 PTHLH 및 PODXL 억제제 및 RERG 활성제의 용도에 관한 것이다.

Description

암 전이의 진단, 예후 및 치료를 위한 방법{METHOD FOR THE DIAGNOSIS, PROGNOSIS AND TREATMENT OF CANCER METASTASIS}
본 발명은 암, 구체적으로 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암을 앓고 있는 피험체가 전이로 발전될 가능성을 결정하기 위한 방법과, 그에 더하여 암, 구체적으로 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암을 앓고 있는 피험체를 위한 개별맞춤 요법을 생성하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 그 발현이 c-MAF 유전자 발현과 관련있는 유전자 세트의 발현도를 결정하는 것으로 이루어진다. 본 발명은 또한 전이성 암, 구체적으로 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암의 치료 및/또는 예방에서 PTHLH 및 PODXL 억제제 및 RERG 활성제의 용도를 포함한다.
유방암은 전세계에서 두번째로 가장 흔한 암 유형(10.4%; 폐암 다음으로)이고, 다섯번째로 가장 흔한 암에 의한 사망 원인(폐암, 위암, 간암 및 결장암 다음으로)이다. 여성의 가장 흔한 사망 원인이 유방암인가? 2005년에, 유방암에 의해 전세계적으로 502,000명이 사망하였다(암관련 사망의 7%; 전체 사망 중 거의 1%). 전세계적으로 사례의 수는 1970년대 이후로 유의하게 증가되었고, 이러한 현상은 서구 세계의 현대적 생활방식에 부분적으로 그 책임이 있다.
모든 세포는 그들의 표면 상에, 그들의 세포질내 및 핵에 수용체를 갖는다. 일부 화학적 메신저 예컨대 호르몬은 이들 수용체에 결합하고 그 결과 세포에 변화를 일으킨다. 3종의 주요 수용체, 에스트로겐 수용체(ER), 프로게스테론 수용체(PR) 및 HER2/neu는 유방암 세포에 영향을 미칠 수 있다. 이들 수용체 중 하나를 포함하는 세포를 명명하기 위한 목적으로, 수용체가 존재하는 경우는 양성 표시를 사용하고 부재하는 경우는 음성 표시를 사용한다: ER 양성(ER+), ER 음성(ER-), PR+(양성), PR 음성(PR-), HER2+(양성) 및 HER2 음성(HER2). 수용체 상태는 특이적 치료제 예컨대 타목시펜 또는 트라스투주맙 사용의 적합성을 결정하므로, 유방암의 모든 형태에 대한 중요한 평가가 되었다. 에스트로겐 수용체(ER)의 알파 이소폼은 유방암으로 진단된 사례 중 대략 65%에서 과발현된다. 이러한 유형의 유방암을 "ER-양성"(ER+)이라고 한다. 이러한 사례에서, 에스트로겐과 ER의 결합은 암성 유선 세포의 증식을 촉진한다. 암성 ER+ 세포는 확산을 위해서 이러한 자극에 고도로 의존적이며, 그로 인해 ER이 현재 치료 표적으로 사용되고 있다.
고형 종양을 갖는 암 환자의 대부분의 사망이 늦은 전이에 의한다는 사실은 종양을 전이시키는 분자 및 세포 기전을 이해하는데 중요하다. 최근 발표들은 상이한 전이성 세포 유형이 일정 장기에 대한 향성을 어떻게 나타내는지에 더하여, 많이 알려지지 않은 복합 기전에 의해 어떻게 전이가 야기되는지를 설명해 주었다. 이들 조직-특이적 전이성 세포는 그들을 특정 장기에 군락화시킬 수 있는 일련의 획득 기능을 갖는다.
특허 출원 EP 제1961825-A1호는 c-MAF를 포함하는, 대조군 샘플 내 상응하는 발현도와 비교하여 암성 조직 샘플 내 1 이상의 마커의 발현도를 결정하는 것으로 이루어진, 뼈, 폐, 간 및 뇌로 전이성 유방암의 출현을 예측하는 방법을 기술한다. 또한, 이 문헌은 유방암 환자의 생존을 결정하기 위해 동시에 몇몇 유전자의 정의가 필요하고 골전이가 없는 생존을 예측하기 위한 유전자 서명의 능력간 상관성이 통계적으로 유의하지 않았다.
[Bos, P.D., et al., Nature, 2009, 459:1005-1009]는 유방암에서 뇌로의 전이에 관여되는 유전자를 기술하고 있다.
특허 출원 US2005/0181375는 전이성 종양, 구체적으로 뇌로 전이된 종양에서 상향 또는 하향 조절되는 다수 유전자의 발현도의 검출을 기반으로 전이성 유방암을 검출하는 방법을 기술한다.
국제 특허 출원 WO2010/000907은 유방암 환자에서 말단 전이의 게놈 예측자로서 유용한 유전적 서명을 기술한다.
그러나, 특정 유방암, 예컨대 ER- 또는 ER+ 유방암을 앓는 환자가 전이가 발병될지 여부를 진단 및/또는 예측하여서, 상기 암을 앓는 피험체에게 적절한 요법을 사용할 수 있게 하는 유전자 마커가 당분야에서 요구된다. 신규한 예후 인자의 동정은 가장 적절한 치료법을 선택하는데 가이드로서 제공될 것이다.
본 발명의 저자는 c-MAF 유전자의 발현 변화 결과로서 유방 종양 샘플에서 그 발현이 증가하거나 또는 감소되는 유전자 그룹을 동정하였다. 기능 획득 실험 및 관련 임상 데이터를 통해서, 저자는 이들 유전자의 역할을 검증하였으며, 구체적으로 그 발현이 c-MAF의 발현과 반비례적으로 관련있는, REFR 유전자, 및 그 발현이 c-MAF 발현과 직접적으로 관련있는, PTHLH 및 PODXL 유전자, 예컨대 뼈로 전이된 ER+ 유방암의 예후 마커의 역할을 검증하였다.
그러한 이유로, 제1 측면에서, 본 발명은 피험체에서 전이성 암, 구체적으로 유방, 결장, 폐, 신장 및 갑상선의 암, 특히 유방암을 예측하기 위한 시험관내 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 상기 종양의 c-MAF 발현도 증가에 반응하여 그 발현이 조정되는 1 이상의 유전자의 암성 조직 샘플 내 발현도를 결정하는 단계로 이루어지고, 여기서 표준값과 비교하여 상기 언급된 1 이상의 유전자의 변화된 발현도는 전이성 암이 발생될 고 위험성을 의미한다.
본 발명의 제2 측면은 암, 구체적으로, 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암, 특히 유방암을 앓는 피험체를 위한 개별맞춤 요법을 생성하기 위한 시험관내 방법에 관한 것으로서, 상기 종양의 c-MAF 발현도 증가에 반응하여 그 발현이 조정되는 1 이상의 유전자의 암성 조직 샘플 내 발현도를 결정하는 단계로 이루어지고, 여기서 표준값과 비교하여 상기 언급된 1 이상의 유전자의 변화된 발현도는 대상 피험체가 전이의 예방에 맞춰진 요법을 수용하는데 감수성임을 의미한다.
본 발명의 제3 측면은 전이성 암, 구체적으로 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암, 특히 유방암의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조를 위한 유전자의 발현 또는 이 유전자의 발현 생성물의 활성을 억제하는 제제의 용도에 관한 것이고, 여기서 상기 유전자는 종양성 세포, 구체적으로 유방, 결장, 폐, 신장 및 갑상선의 암 세포, 특히 유방암 세포에서 그 발현이 이들 세포 내에서의 c-MAF 발현도 증가에 반응하여 증가하거나, 또는 이들 세포에서 c-MAF 발현도 감소에 반응하여 감소한다는 사실에 기인하여 특징지어진다.
본 발명의 제4 측면은 전이성 암, 구체적으로 유방, 결장, 폐, 신장 및 갑상선의 암, 특히 유방암의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조를 위한 유전자의 발현 또는 이러한 유전자의 발현 생성물의 활성을 자극하는 제제의 용도에 관한 것이고, 여기서 상기 유전자는 종양성 세포, 구체적으로 유방, 결장, 폐, 신장 및 갑상선의 암, 특히 유방암에서 그 발현이 이들 세포에서 c-MAF 발현도 증가에 반응하여 증가하거나, 또는 이들 세포에서 c-MAF 발현도 감소에 반응하여 감소한다는 사실에 기인하여 특징지어진다.
본 발명의 마지막 측면은 암, 구체적으로 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암, 특히 유방암을 앓는 피험체에서 마커 유전자를 동정하기 위한 시험관내 방법에 관한 것으로서,
(i) 원발성 암 종양 샘플, 구체적으로 유방암에서 후보 및 c-MAF 유전자의 발현도를 정의하는 단계, 및
(ii) c-MAF 유전자 발현의 조정에 반응하여, 암 세포, 특히 유방 세포의 개체군 내 상기 후보 유전자의 발현도 변화를 결정하는 단계
를 포함하고, 여기서 상기 유전자의 발현도는 원발성 암 종양 샘플, 구체적으로 유방암에서 c-MAF 발현과 비교하여 통계적으로 유의하고, c-MAF 유전자 발현의 조정에 반응하는 발현의 변화는 상기 유전자의 수준 변화에 비해 통계적으로 유의하고 상기 유전자는 전이가 발생할 피험체의 경향의 마커임을 의미한다.
도 1.(A) ER+ 유방암을 갖는 환자에서 골전이의 표현형과 증가(좌측) 또는 감소(우측)된 MBP 유전자와의 연관성("GSEA" 알고리즘). (B) 원발성 유방암 종양에서 유래된 뼈, 폐, 간 및 뇌로의 일련의 전이에서 골전이의 표현형과 증가(좌측) 또는 감소(우측)된 MBP 유전자와의 연관성("GSEA" 알고리즘). 증가된 유전자에 대해 동일한 근사치를 폐, 뇌 및 간으로의 전이에 대해서 처리하였다.
도 2.(A) 중간 전이성(부모) ER+, MCF7 유방암 세포 및 뼈로의 고도의 전이성인 이의 유도체(BoM2)를 이용한 이종이식 유형의 실험 마우스 모델의 전이성 병변에서, 증식 마커, Ki-67 발현도의 분석. (B) MAF 발현 및 RERG 유전자간 상관성의 정량적 RT-PCR을 이용한 검증. (C) MAF 존재 또는 미존재 BoM2 세포를 이용한 마우스의 골전이. Ki-67 신호 및 캐스파아제-3 활성은 면역조직화학을 통해 정량한다. (D) 증가된 RERG가 뼈에 고도로 전이성인 세포에서 유도된다. RERG 발현된 세포 유도체를 마우스의 좌심실에 주사하고 뼈의 군락화를 생물발광 영상법을 이용해 라이브 및 실시간으로 분석하여 뼈로 전이된 ER+ 유방암에 MAF의 존재하에서 RERG의 기여를 입증하였다.
도 3.( A) 상이한 MAF 수준을 특징으로 하는 상이한 세포 유형을 주사한 마우스에서 용골성 골전이 수의 X-선을 이용한 정량화.(B) 상이한 MAF 수준을 특징으로 하는 세포에 의해 야기된 병변 내 전이성 병변 주변에서, 파골세포 마커인, TRAP(타르트레이트-저항성 알칼리 포스파타아제) 세포 수의 정량. (C) MAF 발현 및 PTHLH 유전자 간 상관성의 정량적 RT-PCR을 이용한 검증. (D) 하나의 줄기 세포를 이용한 시험관내 파골세포의 분화에 대한 실험. 분화 과정은 상이한 개체군 유래의 배지, G-CSF 및 RANK 리간드의 존재 하에서 수행하였다. 부모 세포, 단형 및 장형 MAF 이소폼을 발현하는 부모 세포, 및 PTHLH 기능을 중성화하는 펩티드 존재 하의 후자 세포. (E) 마우스의 실험적 전이 모델에서 골전이 실험. C-MAF 발현이 있거나 또는 없는 세포를 주사하였고, 후자의 경우는, 마우스의 좌심실에 1일 2회(12 마이크로그램/마우스/일) 복강내 길항제 PTHLH 펩티드를 접종한 군이고, 따라서 뼈에 대한 병변의 출현 및 성장을 정량하였다. 좌측 그래프는 말단 신호의 강도를 도시한 것이다. 우측 그래프는 각 그룹에서 용골성 병변의 수를 명시한다. (F) 좌측에서, (E)에 기술된 그룹을 대표하는 뼈에서 X-선 영상(백색 영역은 뼈가 소실된, 용골성 병변을 나타냄) 및 TRAP+ 세포주(파골세포 마커)를 나타내는 패널. 흰색 삼각형은 파골세포를 나타낸다. 우측에는, 주변부에 의해 표준화된 TRAP 신호 영역을 나타내는 패널.
도 4.( A) 골수(BMSC)에서 유도된 세포층에 결합된 높거나(sh대조군) 또는 감소된(shMAF) c-MAF 유전자를 발현하는 세포수의 형광발광을 통한 정량화. (B) 세포외 폐 매트릭스 단백질 예컨대 피브로넥틴의 층에 결합하는 높거나(sh대조군) 또는 감소된(shMAF#1 또는 #2) c-MAF 유전자 수준을 발현하는 세포수의 형광발광을 통한 정량화, 이 경우는 골수 세포에 대한 반대 효과를 밝혀주었다. (C) RT-PCR을 통해 검증된 c-MAF 발현 변화에 따라 그 발현이 변화된 유전자 패널. 그 중에서, PODXL는 순간적이고 약한 세포간 결합 과정에 참여할 수 있는 셀렉틴 패밀리 유래의 단백질(당단백질)을 발현하는 유전자이다. (D) 골수 세포와 결합하는 c-MAF를 발현하는 암성 유방 세포에 관여하는 PODXL 유전자의 기능적 검증. 인테그린 매개 부착의 중화(RGES) 또는 차단(RGDS) 펩티드의 경쟁적 효과의 비교. 이 과정은 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)에서 재생되지 않으므로 특이적이다.
일반적인 표현 및 용어의 정의
본 발명에서 사용하는 "c- MAF 억제제"는 상기 유전자의 발현이 생성되는 것을 방해(c-MAF 유전자의 전사를 파괴하고/하거나 c-MAF 유전자 발현으로부터 mRNA의 번역을 차단함)하고 c-MAF 단백질 활성을 직접 억제하여, c-MAF 유전자의 발현을 부분적으로 또는 전체로 억제할 수 있는 임의의 분자를 의미한다. c-MAF 유전자 발현 억제제는 국제 특허 출원 WO2005/046731에 예시된 바와 같은 시험관내 세포 증식을 촉진하기 위한 c-MAF의 능력을 차단하는 추정 억제제의 능력을 기반으로 하거나, WO2008098351에 기술된 바와 같은, c-MAF를 발현하는 세포에서 c-MAF 반응 영역(MARE 또는 c-MAF 반응성 성분)을 함유하는 프로모터 또는 사이클린-D2 프로모터의 제어 하에서 리포터 유전자의 전사 능력을 차단하는 추정 억제제의 능력을 기반으로 하거나, 또는 US2009048117A에 기술된 바와 같이, NFATc2 및 c-MAF를 발현하는 세포에서 PMA/이노마이산을 이용한 자극에 반응하는 IL-4 프로모터의 제어하에서 유전자의 발현을 차단하는 추정 억제제의 능력을 기반으로 하는 방법을 이용해 동정할 수 있다.
본 발명의 문맥에서, "억제제 항체"는 특이적 방식으로 발현 생성물과 결합할 수 있고 그 단백질의 많은 기능 중 하나를 억제할 수 있는 항체를 의미한다.
용어 "소형 간섭 RNA"("siRNA")는 RNA 간섭을 유도하는 이중의 소형 RNA 억제제를 의미한다. 이들 분자는 길이가 다양(대체로 18-30 염기쌍)할 수 있고, 안티센스 사슬의 그들 표적 mRNA에 대한 다양한 정도의 상보성을 함유한다. 전부는 아니지만, 일부 siRNA는 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 5' 또는 3' 말단 상의 두드러진 미결합 염기를 특징으로 한다. 용어 "siRNA"는 2개 개별 사슬의 이중가닥을 포함한다. 본원에서 사용하는, siRNA 분자는 RNA 분자에 국한되지 않고 1 이상의 화학적으로 개질된 뉴클레오티드 예컨대 모르폴린을 갖는 핵산을 포함한다.
본원에서 사용하는 용어 "shRNA" 또는 "짧은 헤어핀 RNA"는 2개 사슬이 듀플렉스 구조를 형성하도록 한 가닥의 3' 말단 및 다른 가닥의 5' 말단 간 뉴클레오티드를 파괴하지 않고 가닥에 의해 결합되는 dsRNA를 의미한다.
용어 "증가된 유전자 발현"은 대조군 샘플 내 동일 유전자의 발현도에 상응하는, 표준 또는 대조 값에 비하여 유전자의 발현도가 높다는 사실을 의미한다. 본 발명에 따라서, 유전자의 발현도는 환자 샘플의 수준이 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%: 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150% 또는 그 이상만큼 증가된 경우 표준값에 비해 높은 것으로 간주한다.
본 발명에서 사용하는 "c- MAF"는 동종이량체 또는 이종이량체로 작용하는 류신 지퍼를 포함하는 전사 인자인, "v-maf 근막층 섬유육종 발암유전자 동족체"(새), MAF 또는 MGC71685)라고도 알려진 유전자를 의미한다. DNA 결합 부위에 따라서, 코딩된 단백질은 전사 활성제 또는 억제인자일 수 있다. c-MAF를 코딩하는 DNA 서열은 수탁 번호 NG_016440(2011년 12월 18일에 해당하는 NCBI 버전) 하에 NCBI 데이터베이스에 기술되었다. 상기 언급한 DNA 서열은 2종의 메신저 RNA의 전사가 후속되며, 그 각각은 c-MAF 단백질 이소폼, 이소폼 알파 또는 1(긴 c-MAF 이소폼에 해당) 및 이소폼 β 또는 2(짧은 c-MAF 이소폼에 해당) 중 하나가 된다. 상기 언급한 이소폼 각각에 대한 상보적 DNA 서열은 각각 수탁 번호 NM_005360.4 및 NM_001031804.2(2011년 12월 18일에 해당하는 NCBI 버전) 하에 NCBI 데이터베이스에 기술되어 있다.
용어 "암" 또는 "암종" 또는 "종양"은 인접한 조직을 침입하고 멀리 떨어진 장기로 확산될 수 있는 비정상 세포의 비제어적 증식을 특징으로 하는 병을 의미한다. 이 용어는 제한없이, 유방, 심장, 소장, 결장, 비장, 신장, 방광, 머리, 목, 난소, 전립선, 뇌, 췌장, 피부, 뼈, 골수, 혈액, 흉선, 자궁, 고환, 간담도계 및 간의 암; 또한, 종양, 예컨대 제한없이, 선종, 혈관육종, 성상세포종, 상피 암종, 배아세포종, 교모세포종, 신경교종, 혈관내피종, 혈관육종, 혈종, 간모세포종, 백혈병, 림프종, 수모세포종, 흑색종, 신경모세포종, 간담도 암, 골육종, 망막아종, 횡문근육종, 육종 및 기형종을 포함한다. 또한, 이 용어는 선단 흑자성 흑색종, 광선 각화증 선암종, 선양 낭포 암종, 선종, 선육종, 선편평세포 암종, 성상세포 종양, 바르톨린 분비선 암종, 기저 세포 암종, 기관지샘 암종, 모세관 암양종, 암종, 암육종, 담관암종, 낭선종, 내배엽동 종양, 자궁내막 과형성증, 자궁내막 기질 육종, 자궁내막양 선암종, 뇌실막 육종, 유잉 육종, 국소 결절성 과형성증, 배세포 종양, 교모세포종, 글루카곤종, 혈관모세포종, 혈관내피종, 혈관종, 간선종, 간선종증, 간세포암종, 간담도 암, 인슐린종, 상피내 종양형성, 편평 세포 상피내 종양형성, 침습성 편평-세포 암종, 거대 세포 암종, 평활근육종, 흑색종, 악성 흑색종, 악성 중피 종양, 수모세포종, 수질상피종, 점막표피양 암종, 신경모세포종, 신경상피 선암종, 결절성 흑색종, 골육종, 유두상 장액 선암종, 뇌하수체 종양, 형질세포종, 위육종, 폐모세포종, 신장 세포 암종, 망막아종, 횡문근육종, 육종, 장액 암종, 미소세포 암종, 연조직 암종, 소마토스타틴 분비성 종양, 편평 암종, 편평 세포 암종, 미분화 암종, 포도막 흑색종, 사마귀모양 암종, 비포마, 빌름 종양, 뇌내 암, 머리 및 목의 암, 직장암, 성상세포종, 교모세포종, 미소세포 암 및 비미소세포 암, 전이성 흑색종, 안드로겐 비의존성 전이성 전립선암, 안드로겐 의존성 전이성 전립선암 및 유방암을 포함한다. 이러한 구체적인 발명과 관련하여, 암은 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암, 특히 유방암을 의미한다.
표현 "결장암"은 결장, 직장 및 맹장 세포의 임의의 악성 증식성 질병을 의미한다. 용어 결장암은 임의의 하기 병기를 포함한다:
- 제0 병기: 장의 최내층내 초기암
- 제1 병기: 장의 내층 내 암
- 제2 병기: 결장의 근육 벽을 통해 확산된 암
- 제3 병기: 림프절로 확산된 암
- 제4 병기: 다른 장기로 확산된 암
표현 "유방암", "유선암" 또는 "가슴암"은 유선 조직에서 비롯된 암 유형을 의미한다. 용어 "유방암"은 TNM 체계에 따른 임의 시기 하에서 분류된 암을 포함한다. 예후는 시기 분류 결과와 밀접하게 관련있고, 시기 분류는 또한 환자를 임상 시험 및 의료 행위 둘 모두의 치료에 지정하는데도 사용된다. 시기 분류와 관련된 정보는 다음과 같다:
. TX: 원발성 종양은 평가할 수 없다. T0: 원발성 종양의 증거가 없다. TIVE 원 위치, 암종, 비침습성 T1: 종양이 2.0 cm 또는 그 보다 작다. T2: 종양이 2 cm 보다 크지만 5 cm보다 크지 않다. T3: 종양이 5 cm 보다 크다. T4: 가슴 벽에서 성장한 임의 크기의 종양 또는 피부, 염증성 유방암.
. NX: 이웃한 림프절을 평가할 수 없다. N0: 암이 림프절로 확산되지 않았다. N1: 암이 1 내지 3 액와 림프절 또는 하나의 내유림프절로 확산되었다. N2: 암이 4 내지 9 액와 림프절 또는 복수의 내유림프절로 확산되었다. N3: 다음 중 하나에 적용된다:
. 암이 10 또는 그 이상의 액와 림프절로 확산되었거나, 또는 암이 쇄골 아래 림프절로 확산되었거나, 또는 암이 쇄골 위의 림프절로 확산되었거나, 또는 암이 액와 림프절에 영향을 미치고 내부 유선 림프절로 확산되었거나, 또는 암이 4 또는 그 이상의 액와 림프절에 영향을 미치고, 최소량의 암이 내유림프절 또는 감시 림프절 생검에서 발견된다.
. Max 먼거리 확장(전이)의 존재를 평가할 수 없다. M0: 먼거리 확장이 없다. M1: 먼 장기로의 확장이 발생하였으나, 쇄골상부 림프절은 포함하지 않는다.
표현 "폐암" 또는 "폐의 암" 또는 "폐암종"은 폐의 임의의 암을 의미하고 비소세포 폐암, 비미소세포 폐암(NSCLC) 및 소세포 폐암을 포함한다.
표현 "신장암" 또는 "신장의 암" 또는 "신장 암종"은 신장 세포의 임의의 악성 증식성 질병을 의미한다.
표현 "갑상선암" 또는 "갑상선 암종"은 갑상선샘의 임의의 증식성 질병을 의미하고, 제한없이, 유두상 갑상선 암종 및 여포성 갑상선 암종을 포함한다.
본원에서 사용하는 "통계적으로 유의한 상관성"은 2가지 사건(후보 유전자의 발현도 및 c-MAF 유전자의 발현도)이 그들 사건이 관련있고 변화가 무작위적이지 않을 높은 확률이 존재함을 의미하는 것이다.
표현 "암, 구체적으로 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암을 앓는 피험체, 바람직하게는 유방암을 앓는 피험체에서 암의 발병 가능성을 결정하다"는 상기 피험체에게 영향을 미치는 암이 향후에 전이성이 될지 여부를 결정하기 위한 증거를 이용하는 것을 의미한다. 본 발명의 문맥에서, 지수는 그 발현이 표준 값에 비하여 c-MAF 발현도 증가에 반응하여 변하는 1 이상의 유전자의 발현도의 변화이다. "유전자의 발현도의 변화"는 표준값에 비하여 유전자의 발현도의, 상향으로 또는 하향으로 변화를 의미한다. 따라서, 암, 구체적으로 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암, 특히 유방암을 앓는 피험체에서 전이 발생의 "높거나" 또는 "증가한" 또는 "향상된" 가능성은 그 발현이 표준값에 비해 c-MAF 발현도 증가에 반응하여 변화하는 1 이상의 유전자의 발현도 변화에 기인한다.
용어 "감소된 유전자 발현"은 대조군 샘플 내 동일 유전자의 발현도에 상응하는, 표준 또는 대조 값에 비해 유전자의 발현도가 떨어지거나 또는 감소된 경우를 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 표준값에 대한 유전자의 발현도는 환자 샘플 내 수준이 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%: 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150% 또는 그 이상만큼 떨어진 경우 감소된 것으로 간주한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "마커 유전자" 또는 "정보성 유전자"는 상이한 표현형을 갖는 개체군에서 차등적인 방식으로 그 자체가 발현하고, 그 차등 발현이, 다른 유전자와 개별적으로 또는 조합하여, 임의로 기대했던 것보다 더 큰 정도로 특이적 표현형과 관련있는 유전자를 의미한다.
포도칼릭신-유사로도 알려진, "PODXL 유전자"는 시알로무신 패밀리의 일부를 형성하는 단백질을 코딩하고, 신사구체 족세포의 중요한 성분인 유전자를 의미한다. 족세포는 기저 신사구체막의 외면을 덮는 지간 돌기를 갖는 고도로 분화된 상피 세포이다. 이 단백질이 코딩되게 하는 다른 생물학적 활성은 막-단백질 복합체로 세포내 세포골격 성분의 Na+/H+ 교환체의 조절 인자와의 결합 및 L-셀렉틴과 그들의 결합을 포함한다. 2종의 전사 PODXL 변이체의 설명은 수탁 번호 NM_001018111.2(변이체 1) 및 NM_005397.3(변이체 2) 하에서 NCBI 데이타베이스(2013년 3월 3일 버전)에 제출하였다. PODXL 유전자에 의해 코딩된 단백질의 수탁 번호 NP_001018121.1(이소폼 1) 및 NP_005388.2(이소폼 2) 하에 NCBI 데이타베이스(2013년 3월 3일 버전)에 제출하였다.
"PTHLH"(부갑상선 호르몬-유사 호르몬 유전자)는 인간 12 염색체에 위치하고, PTHrP(부갑상선 호르몬-관련 단백질)라고 알려진 부갑상선 호르몬 패밀리에 속하는 단백질을 코딩한다. 이 단백질은 연골내 뼈 발생뿐만 아니라 유선 및 치아 형성 동안 상피 및 간엽조직 간 상호작용을 조절한다. 이 호르몬에 대한 수용체는 PTHR1이라고 한다. PTHLH에 대한 DNA 서열은 수탁 번호 NG_023197(2011년 11월 6일 버전) 하에 NCBI 데이터베이스에 제출하였다. 4종 PTHLH 전사체 변이체의 설명은 수탁 번호 NM_198965.1(변이체 1), NM_002820.2(변이체 2), NM_198964.1(변이체 3) 및 NM_198966.1(변이체 4) 하에 NCBI 데이타베이스(2011년 11월 20일)에 제출하였다. 유사하게, PTHLH 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 서열은 수탁 번호 AAA60360.1(A형), AAA60358.1(B형) 및 AAA60359.1(C형) 하에 NCBI 데이타베이스(1995년 1월 10일 버전)에 제출되었다.
Ras-유사 에스트로겐-조절되는 성장 억제제라고도 알려진 "RERG 유전자"는 RAS GTPase 수퍼패밀리의 일부를 형성하고, 세포 증식 및 종양 형성에 대한 억제제로서 작용하는 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 2종의 전사 RERG 변이체의 설명은 수탁 번호 NM_032918.2(변이체 1) 및 NM_001190726.1(변이체 2) 하에 NCBI 데이타베이스(2011년 11월 28일 버전)에 제출되었다. RERG 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 서열은 수탁 번호 NP_116307(이소폼 1) 및 NP_001177655(이소폼 2) 하에 NCBI 데이타베이스(2011년 11월 28일)에 제출되었다.
"전이"는 암성 공급원이 그 초기 부위에서 다른 장기로의 확산을 의미한다. 이는 정상적으로는 혈액 또는 림프계를 통해 일어난다. 암성 세포가 확산되어 새로운 종양을 야기하는 경우, 이를 속발성 또는 전이성 종양이라고 한다. 속발성 종양을 형성하는 암 세포는 원래 종양의 세포와 유사하다. 예를 들면, 유방암이 폐로 확산(전이)되면, 속발성 종양은 악성 유방암 세포를 포함한다. 폐에서 이러한 질환을 전이성 유방암(폐암이 아님)이라고 한다. 이러한 특정 발명의 경우에서, 전이는 뼈로 확산(전이)된 유방암, 결장암, 폐암, 신장암 또는 갑상선암이다. 또한, 이러한 발명에 대한 추가적인 특정 측면에서, 전이는 뼈로 확산(전이)된 ER+ 유방암이다.
"용골성 골전이"는 종양 세포에 의한 파골세포 활성의 자극으로 발생한 전이 근처에 뼈 재흡수(뼈 밀도의 점진적인 손실)를 야기하는 전이 유형을 의미하고, 심각한 통증, 병적 골절, 저칼슘혈증, 척수의 압박 및 신경 압박에 의한 다른 증후군을 특징으로 한다.
용어 "마이크로 RNA" 또는 " miRNA"는 전형적으로 길이가 대략 21-23 뉴클레오티드이고 유전자 발현을 조절할 수 있는 짧은 단일 가닥 RNA 분자를 의미한다. miRNA는 합성(달리 말해, 재조합)되거나 또는 천연일 수 있다. 천연 miRNA는 DNA로부터 전사되고 1차 전사체("프리-miRNA")에서 짧은 스템-루프 구조("프리-miRNA")로 처리되어, 최종적으로 성숙한 miRNA가 되는 유전자에 의해 코딩된다. 성숙한 miRNA 분자는 1 이상의 mRNA에 부분적으로 상보적이고 RNA의 간섭과 유사한 과정 또는 mRNA의 번역을 억제하여 유전자 발현을 감소시킨다.
"종양 조직 샘플"은 원발성 종양, 구체적으로 유방암, 결장암, 폐암, 신장암 또는 갑상선암, 보다 구체적으로 ER+ 또는 ER-Her2- 유방암에서 얻은 조직 샘플이다. 상기 샘플은 통상적인 방법, 예를 들면 관련 의학 기술의 전문가에게 잘 알려진 방법을 이용하는, 생검을 통해 얻을 수 있다. 생검 샘플을 얻는 방법은 종양을 큰 조각으로 자르는 것, 또는 현미해부 또는 기술 분야에 공지된 다른 세포 분리 방법을 포함한다. 종양 세포는 부가적으로 작은 게이지 바늘을 사용한 흡인을 통한 세포학을 통해 얻을 수 있다. 샘플 보존 및 취급을 단순화하기 위해서, 샘플을 포르말린에 고정하고 파라핀에 함침시키거나 또는 먼저 동결시키고 이어서 급속 동결시킬 수 있는 고도의 저온성 매질 내 액침을 통해 조직-동결 매질 예컨대 OCT 화합물에 함침시킬 수 있다. 본 발명에 따라서, 샘플은 또한, 제한없이, 혈장 또는 혈청, 예컨대 종양 기원의 DNA 또는 엑소솜이 존재하는 혈장 또는 혈청을 포함하는, 종양 유래 조직, 종양 유래 RNA, 종양 유래 DNA 또는 종양 유래 단백질을 포함하는 임의의 체액을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 바와 같은, 표현 유전자 발현 생성물의 "우성 음성 돌연변이체"는 천연 발현 생성물의 활성을 간섭할 수 있는 상기 발현 생성물의 변이체를 의미한다.
본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "억제제 펩티드"는 발현 생성물에 결합할 수 있고 그 활성을 억제할 수 있는 펩티드를 의미한다.
용어 "전이 예측"은 본원에서 환자가 전이를 발생시킬 수 있는 확률을 의미하기 위해 사용한다. 본 발명의 예측 방법은 구체적으로 각 환자를 위한 치료에 대해 가장 적합한 선택을 결정하는데 임상적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 예측 방법은 환자가 치료 계획, 예컨대 화학요법에 대해 호의적으로 반응할지 여부를 예측하기 위한 가치있는 도구이다. 예측은 예후 인자를 포함할 수 있다. 당분야의 전문가가 이해하게 되는 바와 같이, 그러나 바람직하지는 않으나, 예측은 진단하거나 또는 평가할 수 있는 피험체의 100%에 대해 정확할 필요는 없다. 그러나, 이 용어는 피험체의 상당한 부분이 결정된 결과를 가지는 보다 큰 확률로 동정되는 것이 요구된다. 피험체가 통계적으로 유의하면, 이는 상이한 기지의 통계 평가 도구, 예를 들면 [Dowdy and Wearden, Statistics for Research by Wiley, John & Sons, New York, 1983]에 나타낸 바와 같은, 신뢰 구간의 결정, p-값의 결정, 분류의 교차 검증률 및 세부사항 등을 이용해 당분야의 숙련가가 결정할 수 있다. 추천된 신뢰 구간은 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%이다. P-값은 바람직하게는 0.01, 0.005, 또는 그 이하이다.
본원에서 사용하는 용어 "확률"은 충분하게 안정한 상태 하에서, 모든 가능한 결과가 알려진, 임의추출된 실험을 수행하여 결과(또는 결과 세트)가 얻어지는 빈도를 측정한다. 확률은 "높"거나 또는 "낮"을 수 있다. 당분야의 숙련가가 이해하는 바와 같이, 확률은 평가한 모든 피험체에 대해 100%일 필요는 없지만, 바람직하게는 이러한 방식이어야 한다. 상관성이 통계적으로 유의하거나 또는 그렇지 않은지 여부는 큰 복잡함없이, 상이한 기지의 통계적 평가 도구, 예를 들면 신뢰 구간의 결정, p-값 결정, 스튜던트 t-검정법, 만-위트니 검정법 등을 통해 당분야의 숙련가가 결정할 수 있다. 이러한 통계 도구에 대한 추가 정보는 [Dowdy and Wearden, Statistics for Research. John Wiley & Sons, New York 1983]에서 확인할 수 있다. 바람직한 신뢰 구간은 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%이다. P 값은 바람직하게는 0.05, 0.02, 0.01 또는 그 이하이다.
본 발명에서 사용하는 "유방 조직-특이적 프로모터"는 프로모터로 기능하고, 다른 조직에서 유의한 발현이 관찰되지 않는, 유방 조직에서 특이적으로 상기 프로모터에 작동적으로 회합된 핵산의 발현을 가능하게 하는 핵산의 서열을 의미한다.
본원에서 사용하는 용어 "피험체" 또는 "환자"는 포유동물로 분류된 모든 동물을 의미하고, 제한없이, 가축 및 농장 동물, 영장류 및 인간, 예를 들면, 인간, 인간외 영장률, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 또는 설치류를 포함한다. 바람직하게, 피험체는 임의 연령 또는 인종의 남성 또는 여성이다.
"원발성 종양"은 그것이 발견된 조직 또는 장기에서 기원하고 상기 위치에서 다른 위치로 전이되지 않은 종양을 의미한다.
"ER+ 종양"은 결정된 수준보다 높게 ER을 발현하는 종양을 의미한다. 10 fmol/mg 보다 높거나 또는 이와 동일한 ER 수준, 핵의 10% 이상의 면역조직화학 배지에 의한 양성 검출은 ER+로서 유방 종양을 고려하기 위한 일반적인 기준이다.
본원에서 사용되는 "ER- 종양"은 면역조직화학 기술을 이용해 종양 세포 핵의 5% 미만이 ER 발현을 보이는 종양을 의미한다(예를 들면, 문헌 [Elizabeth H et al., 2010, Journal of Clinical Oncology, 28: 2784-2795]에 기술된 방법을 이용함).
"Her2 - 종양"은 세포가 HER2 유전자의 증폭을 보이지 않는 종양을 의미한다. 종양 세포는 다클론 항-HER2 항체(예를 들면, HercepTest 키트(코드 K5204), Dako North America, Inc.,(코드 K5204)를 이용한 반정량적 면역조직화학 분석을 사용해 얻은 값이 0, 1+ 또는 2+일 경우 HER2에 대해 음성으로 간주한다. 대안적으로, 종양은 핵 당 HER2 유전자 카피수가 4보다 적거나 또는 FISH에 의해 결정된 염색체 17 카피수와 비교하여 HER2 유전자 카피수의 비율이 1.8보다 낮은 경우 Her2-로 간주한다. 종양이 Her2+ 또는 Her2-인지 여부를 결정하기 위한 표준 분석법은 예를 들면, [American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guidelines(Wolff AC, et al. J Clin Oncol., 2007, 25: 118-145; Wolff AC, et al., 2007, Archives of Pathology Laboratory Medicine 131:18-43)]에 기술되어 있다.
"PR- 종양"은 프로게스테론 수용체를 검출가능하게 발현하지 않는 종양을 의미한다. 본원에서, 양성 핵의 센트 당 10 보다 낮은 면역조직화학 관찰값 및/또는 10 fmol/mg보다 낮은 프로게스테론 수용체 수준은 PR-음성으로 간주한다.
"삼중 음성 종양"은 ER-, PR- 및 HER2-를 특징으로하는 유방암을 의미한다.
표현 "기준값"은 환자로부터 얻은 샘플에 의해 획득한 데이터/값에 대한 기준으로 사용되는 실험실 값을 의미한다. 기준값 또는 기준 수준은 절대값, 상대값, 상한치 및/또는 하한치를 갖는 값, 일련의 값, 평균값, 중앙값, 평균치, 또는 대조값 또는 기준값으로 표현되는 값일 수 있다. 기준값은 개별 샘플에서 획득한 값, 예를 들면 실험 환자 대상에서 얻은 샘플에서 획득하였지만, 이전 시점에 획득한 값을 기반으로 할 수 있다. 기준값은 높은 수의 샘플, 예컨대 분석하려는 샘플의 포함 또는 배제 샘플의 세트를 기반으로 하거나 또는 실험 환자 대상과 일치하는 생활 연령 그룹으로부터의 피험체 개체군에서 얻은 값을 기반으로 할 수 있다.
본원에서 사용되는 표현 "유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드"는 그 서열이 상기 유전자, 상기 유전자에 의해 코딩된 프리-mRNA 또는 상기 유전자의 mRNA의 영역과 부분적으로 또는 전체적으로 상보적이어서, 상기 유전자, 프리-mRNA 또는 mRNA와 특이적으로 혼성화되어 유전자 전사 또는 mRNA 번역을 차단하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
안티센스 핵산은 통상적인 염기 상보성을 통해서, 또는 예를 들면, 이중현수선 DNA에 결합하는 경우에는, 이중 나선의 깊은 홈에서의 특이적 상호작용을 통해서 약물의 가능한 표적에 결합할 수 있다. 일반적으로, 이러한 방법은 이러한 기술에서 사용되는 광범위한 기법을 의미하고 올리고뉴클레오티드 서열과의 특이적 결합을 기반으로 하는 임의의 방법을 포함한다.
본 발명의 안티센스 구축물은 예를 들면, 세포 내에서 전사될 때, 표적 유전자를 코딩하는 세포 mRNA의 적어도 하나의 단일 부분에 상보적인 RNA를 생성하는 발현 플라스미드로서 제공될 수 있다. 다르게, 안티센스 구축물은 생체외에서 생성된 올리고뉴클레오티드 프로브이고 세포에 도입되는 경우, 표적 핵산의 mRNA 및/또는 게놈 서열과 혼성화하는 유전자 발현을 억제한다. 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 바람직하게는 내생성 뉴클레아제, 예를 들면 엑소뉴클레아제 및/또는 엔도뉴클레아제에 내성이어서, 생체내에서 안정한 개질 올리고뉴클레오티드이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드로서 사용하기 위한 핵산 분자의 예는 포스포르아미다이트, 포스포티오네이트 및 메틸포스포네이트 DNA 유사체(예를 들면, 미국 특허 제5176996호; 제5264564호; 및 제5256775호를 참조함)를 포함한다. 또한, 안티센스 요법에 유용한 올리고머를 구축하기 위한 일반적인 접근법은 예를 들면, [Van der Krol et al., BioTechniques 6: 958-976, 1988] 및 [Stein et al., Cancer Res 48: 2659-2668, 1988]를 참조한다.
안티센스 올리고뉴클레오티드와 관련하여, 번역 개시 부위, 예를 들면 표적 유전자의 -10 내지 +10 사이에서 유래된 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 영역이 바람직하다. 안티센스 접근법은 표적 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA에 상보적인 올리고뉴클레오티드 디자인(DNA 또는 RNA)을 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 mRNA 전사체에 결합하고 번역을 방지하게 된다.
mRNA의 5' 말단, 예를 들면 5' 미번역 서열에 상보적이고 AUG 출발 코돈을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 번역을 억제하는데 가장 효과적인 방식으로 기능한다. 그러나, 최근에 알려진 바에 의하면, mRNA의 3' 미번역 서열에 상보적인 서열이 또한 mRNA의 번역을 억제하는데 효과적이라고 한다(Wagner, Nature 372: 333, 1994). 따라서, 상보적인 올리고뉴클레오티드는 그 mRNA의 번역을 억제하기 위한 안티센스 접근법에서 유전자의 비코딩 5' 또는 3' 미번역 영역 상에서 사용될 수 있다. mRNA의 5' 미번역 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드는 AUG 출발 코돈의 상보성을 포함해야 한다. mRNA의 코딩 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드는 덜 효과적인 번역 억제제이지만 또한 본 발명에 따라 청구한다. mRNA의 5', 3' 또는 코딩 영역과 혼성화되도록 디자인하면, 안티센스 핵산은 길이가 적어도 6 뉴클레오티드여야 하고 바람직하게는 길이가 대략 100 뉴클레오티드 미만이고, 보다 바람직하게는 길이가 대략 50, 25, 17 또는 10 뉴클레오티드 미만이다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 단일 사슬 또는 이중 사슬 DNA 또는 RNA 또는 이의 화학적 혼합물 또는 유도체 또는 개질형일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들면 분자의 안정성, 그 혼성화 능력등을 개선시키기 위해서, 염기성 기, 당 기 또는 포스페이트 골격이 개질될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 다른 결합 기, 예컨대 펩티드(예를 들면, 숙주 세포 수용체로 안내하기 위함) 또는 세포막(예를 들면, [Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6553-6556, 1989]; [Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 648-652, 1987]; PCT 공개 출원 제 WO88/09810호 참조) 또는 혈액-뇌 장벽(예를 들면, PCT 공개 출원 제 WO89/10134호 참조)을 통한 수송을 촉진하기 위한 제제, 인터컬레이팅제(예를 들면, [Zon, Pharm. Res. 5: 539-549, 1988] 참조) 등을 포함할 수 있다. 이러한 목적을 위해서, 올리고뉴클레오티드는 다른 분자, 예를 들면, 펩티드, 수송체 제제, 혼성화에 의해 촉발되는 커팅제 등에 접합될 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 1 이상의 개질된 염기의 기를 포함할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 또한, 제한없이, 아라비노스, 2-플루오로아라비노스, 자일룰로스, 및 헥소스를 포함하는 군에서 선택된 1 이상의 개질 당의 기를 포함할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 또한 중성 펩티드와 유사한 골격을 함유할 수 있다. 상기 분자는 펩티드 핵산(PNA) 올리고머라고 하고, 예를 들면, [Perry-O'Keefe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 14670, 1996], 및 [Eglom et al., Nature 365: 566, 1993]에 기술되어 있다.
다른 합성 형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 1 이상의 개질된 포스페이트 골격을 포함한다. 추가적인 합성 형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 알파-아노머 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
표적 mRNA 서열의 코딩 영역에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드가 사용되지만, 미번역 전사 영역에 상보적인 것도 사용될 수 있다.
일부 경우에서, 내생성 mRNA의 번역을 억제할 수 있는 세포내 안티센스 농도에 도달하는 것이 어려울 수 있다. 따라서, 바람직한 접근법은 안티센스 올리고뉴클레오티드가 강력한 pol III 또는 pol II 프로모터 제어하에 위치하는 재조합 DNA 구축물을 이용하는 것이다.
다르게, 표적 유전자 발현은 체내 표적 세포에서 유전자 전사를 방지하는 삼중 나선 구조를 형성하도록 유전자 조절 영역(즉, 프로모터 및/또는 포텐시에이터)에 상보적인 데옥시리보뉴클레오티드 서열을 유도하여 감소시킬 수 있다(예를 들면, [Helene, Anti Cancer Drug Des. 6(6): 569-84, 1991] 참조함). 일부 합성 형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 안티센스 모르폴리노스이다.
표현 "RNA 간섭" 또는 RNAi는 진핵생물 세포에서 일어날 수 있는 유전자 발현의 서열 특이적인 전사후 억제 과정이다. 일반적으로, 이러한 과정은 상기 서열에 상동성인 이중 가닥 RNA(dsRNA)에 의해 유도되는 mRNA의 특정 서열의 분해를 포함한다. 이러한 dsRNA는 일정 유형의 RNase II(다이서)를 통해 RNA를 siRNA로 전환시켜 유전자 발현 침묵을 일으킬 수 있다.
본원에서 사용하는 용어 "핵산"은 2 이상의 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사 분자를 비롯하여, 천연 핵산과 구조적으로 유사하지만, 핵산 골격(예를 들면, 천연 핵산의 포스페이트), 핵산 당(예를 들면, 천연 DNA의 경우 데옥시리보스, 및 천연 RNA에서 리보스) 및 핵산 염기(예를 들면, 천연 핵산에서 아데노신, 시토신, 구아닌, 티미딘 또는 퓨린) 중 1 이상이 천연 핵산과 다른(예를 들면, 화학 개질에 의함) 분자를 갖는 중합체를 의미한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "안티센스 서열"은 표적 DNA(안티센스) 또는 mRNA(센스) 서열에 결합할 수 있는 모노카테너리 핵산 서열(RNA 또는 DNA)을 포함하는 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 소정 단백질을 코딩하는 cDNA 서열을 기반으로 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 생성하는 능력은 예를 들면, [Stein and Cohen, Cancer Res. 48:2659,(1988)] 및 [van der Krol et al., BioTechniques 6:958,(1988)]에 기술되어 있다.
본원에서 사용하는 용어 "리보자임" 또는 "RNA 효소" 또는 "촉매성 RNA"는 화학 반응을 촉매하는 RNA 분자를 의미한다. 많은 천연 리보자임이 1 이상의 그들 자신의 포스포디에스테르 결합의 가수분해 또는 다른 RNA 내 결합의 가수분해를 촉매하지만, 또한 리보솜의 아미노트랜스퍼라아제 활성, DNA 리가아제의 결찰 활성 및 통상적인 단백질 효소에 의해 수행되는 다수의 다른 화학 반응을 촉매하는 것으로 확인되었다.
용어 "치료"는 질환의 경감 또는 제거를 제공하거나, 상기 질환과 연관된 1 이상의 증상을 감소 또는 제거하거나 또는 환자가 종양 크기의 감소, 전이 발생 또는 크기의 감소, 종양 성장의 감소 또는 저지, 경감의 유도, 재발 전 지속기간 증가, 종양과 연관된 통증 감소, 종양 세포 분열 억제, 종양 세포의 근절, 종양 세포의 아폽토시스 유도, 종양 재발 감소 및/또는 환자 생존 증가로서 광범위하게 정의되는, 임상적 혜택을 얻도록 하는 약물의 투여를 의미한다.
암, 특히 유방암이 발병한 피험체에서 전이를 예측하기 위한 시험관내 방법
본 발명의 저자는 그 발현이 c-MAR의 발현과 양성적으로 또는 음성적으로 상관있는 유전자 그룹을 동정하였다. 구체적으로, 저자는 (i) 원발성 종양에서 그들 발현이 MAF 발현과 유의하게 상관있고 (ii) MCF7 세포에서 그들 발현이 발현에 대해 c-MAF 발현으로 변화되거나(장형 또는 단형 이소폼) 또는 MAF를 발현하는 MCF7으로부터 유래하는 뼈로 고도로 전이된 세포에서 c-MAF 침묵에 의한 변화때문에 특징되는 일련의 유전자를 동정하였다. 이러한 상태를 만족하는 유전자는 c-MAF에 의해 매개되는 골전이 프로프램의 구성원으로 간주한다. 이들 유전자는 표 1(c-MAF 프로그램에 의해 증가된 유전자) 및 2(c-MAF 프로그램에 의해 억제된 유전자)에 나타내었다. 기능 획득 실험 및 임상 상관성 데이터를 이용하여, 발명자들은 ER+ 유방암의 골전이 과정의 일반적인 표적 유전자로서 그리고 c-MAF에 의해 매개되는 골전이 프로그램의 일부로서 PTHLH, PODXL 및 RERG의 역할을 기능적으로 검증하였다.
따라서, 제1 이슈로서, 본 발명은 기준값과 비교한 1 이상의 유전자의 변경된 발현도가 전이 발생의 고위험성을 의미하는 c-MAF 발현도 증가에 반응하여 그 발현이 변경되는 1 이상의 유전자의 발현도를 피험체의 종양 조직 샘플에서 결정하는 것을 포함하는 피험체에서 암, 특히 유방암, 결장암, 폐암, 신장암 또는 갑상선암, 보다 구체적으로 유방암의 전이를 예측하기 위한 시험관내 방법(이하, 본 발명의 제1 방법)에 관한 것이다.
본 발명의 제1 방법은 제1 단계로서, 암, 구체적으로 유방암, 결장암, 폐암, 신장암 또는 갑상선암, 보다 구체적으로 유방암에 의해 영향받은 피험체의 종양 조직 샘플에서 c-MAF 발현도 증가에 반응하여 그 발현이 조정되는 1 이상의 유전자의 발현도를 정량하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 사용하는 표현 ""c-MAF 발현도 증가에 반응하여 그 발현이 조정된 유전자"는 c-MAF 발현도 변화에 반응하여 그 발현이 유의하게 변화되는 유전자를 의미한다. c-MAF 발현도 증가에 반응하여 그 발현이 변경된 유전자는 원발성 종양 샘플에서 그 발현이 c-MAF 발현과 유의하게 상관있는 유전자 및/또는 c-MAF 발현도 변화에 반응하여 유방암 세포에서 그 발현이 변화된 유전자를 포함한다.
바람직한 형태로 수행시, c-MAF 발현도 증가에 반응하여 그 발현이 변경되는 유전자는 높은 c-MAF 발현을 보이는 원발성 종양 샘플에서 그 발현이 증가된 유전자 및/또는 c-MAF 발현도 증가에 반응하여 암 세포, 바람직하게 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선 세포, 보다 더 바람직하게 유방 세포에서 그 발현이 증가된 유전자 및/또는 c-MAF 발현 침묵에 반응하여 암 세포, 바람직하게 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선 세포, 보다 더 바람직하게 유방 세포에서 그 발현이 감소된 유전자를 포함한다.
바람직한 형태로 수행시, c-MAF 발현도 증가에 반응하여 그 발현이 조정된 유전자는 높은 c-MAF 발현을 보이는 원발성 종양 샘플에서 그 발현이 감소된 유전자 및/또는 c-MAF 발현도 증가에 반응하여 암 세포, 바람직하게 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선 세포, 보다 더 바람직하게는 유방 세포에서 그 발현이 감소된 유전자 및/또는 c-MAF 발현 침묵에 반응하여, 암 세포, 바람직하게 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선 세포, 보다 더 바람직하게 유방 세포에서 그 발현이 증가된 유전자를 포함한다.
본 발명에서 "증가된" 또는 "상승된" 발현도는 기준값 수준보다 높은 수준을 의미하는 발현도로서 이해한다. 구체적으로, 피험체 유래의 샘플은 피험체의 샘플에서 발현도가 기준값과 비교하여 적어도 1.1배, 1.5배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배 또는 그 이상일 경우 증가된 발현도를 나타내는 것으로 간주할 수 있다.
또한, 본 발명에서, "감소된" 또는 "저하된" 발현도는 기준값보다 낮은 수준을 의미하는 발현도이다. 구체적으로, 기준 샘플에서 발현도가 피험체의 샘플과 비교하여 적어도 1.1배, 1.5배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배 또는 그 이상인 경우 감소된 발현도를 나타내는 것으로 간주할 수 있다.
바람직한 형태로 수행시, 본 발명의 제1 방법은 암, 특히 유방암이 발병된 피험체의 종양 조직에서 표 1에 나타낸 유전자 군에서 선택된 1 이상의 유전자 및/또는 표 2에 나타낸 유전자 군에서 선택된 1 이상의 유전자의 발현도를 정량하는 것을 포함한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
표 1은 (i) 그들 발현도가 원발성 종양 샘플에서의 c-MAF 발현도와 직접적으로 상관있고 (ii) 그들 발현도가 c-MAF 발현이 유방암 세포주에서 유도시 증가하고 c-MAF가 침묵시 감소하는 것을 특징으로 하는 76개 유전자 군에 해당된다.
본 발명의 제1 방법에 따라서, 기준값과 비교하여 표 1에 나타낸 유전자 중 1 이상의 발현도 증가는 피험체가 전이가 발생할 높은 확률을 나타냄을 의미한다.
본 발명의 제1 방법에 의해 바람직하게 수행시, PTHLH 유전자의 발현도를 정량하여서, PTHLH 유전자의 발현도가 기준값에 비해 증가하면, 피험체는 전이가 발생할 높은 확률을 나타낸다. 본 발명의 제1 방법의 다른 바람직한 수행시, PODXL 유전자의 발현도를 정량하여서, PODXL 유전자의 발현도가 기준값과 비교하여 증가하면, 피험체는 전이가 발생할 높은 확률을 나타낸다.
표 2는 (i) 그들의 발현도가 원발성 종양 샘플에서의 c-MAF 발현도와 역으로 상관있고 (ii) 그들의 발현도가 c-MAF 발현이 유방암 세포주에서 유도되는 경우에 감소하거나 c-MAF가 유방암 세포주에서 침묵하면 증가하는 것을 특징으로 하는 33개 유전자의 군에 해당된다.
본 발명의 제1 방법에 따라서, 기준값과 비교하여 표 2에 나타낸 유전자 중 1 이상의 발현도 감소는 피험체가 전이가 발생할 높은 확률을 나타냄을 의미한다.
본 발명의 제1 방법에 의해 바람직하게 수행시, RERG 유전자의 발현도를 정량하여서, RERG 유전자의 발현도가 기준값에 비해 감소하면, 피험체는 전이가 발생할 높은 확률을 나타낸다.
주제의 전문가가 이해하는 바와 같이, 유전자 발현도의 정량화는 상기 유전자의 메신저 RNA 수준 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 수준을 측정하여 결정할 수 있다.
이러한 목적을 위해서, 생물학적 샘플은 조직 또는 세포의 구조를 물리적으로 또는 기계적으로 해체하여, 핵산이 준비되도록 수용액 또는 유기용액에 세포내 성분을 방출하기 위해 처리될 수 있다. 핵산은 주제의 전문가에게 공지되고 시판되는 과정을 통해 추출한다(Sambroock, J., et al., "Molecular cloning: a Laboratory Manual", 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol. 1-3.)
따라서, 그 발현이 c-MAF 발현도 증가에 반응하여 조정되는 유전자의 발현도의 정량화는 상기 유전자의 전사로 얻은 RNA(메신저 RNA 또는 mRNA) 또는, 대안적으로 상기 유전자의 상보성 DNA(cDNA)로부터 수행할 수 있다. 따라서, 본 발명의 구체적인 수행시, 그 발현이 c-MAF 발현도 증가에 반응하여 조정되는 유전자의 유전자 발현도의 정량화는 상기 유전자의 메신저 RNA, 또는 상기 mRNA의 단편, 상기 유전자에 상보적인 DNA, 또는 상기 cDNA의 단편, 또는 그들의 혼합물의 정량화를 포함한다.
실제로 임의의 통상적인 방법은 c-MAF 발현도 증가에 반응하여 그 발현이 조정되는 유전자에 의해 코딩되는 mRNA 또는 그의 상응하는 cDNA를 검출 및 정량하기 위해 본 발명에서 사용될 수 있다. 예를 들면, 제한없이, 상기 유전자에 의해 코딩되는 mRNA는 통상의 방법, 예를 들면 mRNA를 증폭시키고 상기 mRNA 증폭 생성물을 정량하는 것을 포함하는 방법, 예컨대 전기영동 및 염색, 또는 대안적으로, 적절한 프로브를 사용하는 써던 블랏, c-MAF에 의해 조정되는 목적 유전자의 mRNA 또는 그에 상응하는 cDNA의 특이적 프로브를 사용하는 노던 블랏, S1 뉴클레이제를 이용한 맵핑, RT-LCR, 혼성화, 마이크로어레이, 등, 바람직하게는 적절한 마커를 이용한 실시간 정량 PCR을 통해 정량할 수 있다. 유사하게, 유전자 c-MAF에 의해 코딩되는 상기 mRNA에 상응하는 cDNA의 수준은 또한 통상의 기술을 이용해 또한 정량할 수 있고, 이 경우에서, 본 발명의 방법은 상응하는 mRNA의 역 전사(RT)에 의해 상응하는 cDNA를 합성한 후 증폭하고 상기 cDNA 증폭 생성물을 정량하는 단계를 포함한다. 발현도를 정량하는 통상적인 방법은, 예를 들면, [Sambrook et al., 2001.(상기 인용된 것)]에서 확인할 수 있다.
특정 실시양태에서, c-MAF 발현도 증가에 반응하여 그 발현이 조정되는 유전자의 발현도의 정량은 정량적 중합효소 연쇄 반응(PCR) 또는 DNA 또는 RNA 어레이를 이용해 수행할 수 있다. 또한, c-MAF 발현도 증가에 반응하여 그 발현이 조정되는 유전자의 발현도의 정량은 또한 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현도, 또는 이 단백질의 기능적 균등 변이체의 발현도를 정량하여 수행할 수 있다. c-MAF 발현도 증가에 반응하여 그 발현이 조정되는 유전자의 발현도의 정량은 단백질의 임의의 이소폼의 발현도를 정량하여 수행할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, c-MAF 발현도 증가에 반응하여 그 발현도가 조정되는 유전자에 의해 코딩되는 단백질 수준의 정량은 단백질의 정량을 포함한다.
단백질의 발현도는 상기 단백질을 피험체 샘플에서 검출하고 정량할 수 있는 임의의 통상적인 방법을 이용해 정량할 수 있다. 예를 들면, 제한없이, 상기 단백질의 수준은, 예를 들면, 단백질(또는 항원 결정부를 포함하는 이의 단편)에 결합할 수 있는 항체를 이용하고, 이어서 형성된 복합체를 정량하여, 정량할 수 있다. 이러한 어세이에서 사용되는 항체는 표지되거나 또는 그렇지 않을 수 있다. 사용할 수 있는 마커의 예시적인 예에는 동위원소, 효소, 형광단, 화학발광 시약, 효소 기질 또는 보조인자, 효소 억제제, 입자, 염료 등이 포함된다. 미표지된 항체(1차 항체) 및 표시된 항체(2차 항체)를 이용하는, 본 발명에서 사용할 수 있는 광범위한 기지의 어세이가 존재한다. 이들 기술에는 웨스턴 블랏 또는 웨스턴 전달, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), RIA(radioimmunoassay), 경쟁적 EIA(competitive enzyme immunoassay), DAS-ELISA(double antibody sandwich ELISA), 면역세포화학 및 면역조직화학 기술, 특이적 항체를 포함하는 바이오칩 또는 단백질 마이크로어레이의 사용을 기반으로 하는 기술 또는 딥스틱과 같은 포맷의 콜로이드 침전을 기반으로 하는 어세이 등이 포함된다. 상기 단백질을 검출 및 정량하는 다른 방식은 친화성 크로마토그래피 기술, 리간드 결합 어세이 등을 포함한다. 면역학적 방법을 사용하는 경우, 그 양을 검출하기 위해 고친화성으로 단백질에 결합하는 것으로 알려진 임의의 항체 또는 시약을 사용할 수 있다. 그러나, 항체의 사용이 바람직하다; 예를 들면 다클론 혈청, 하이브리도마 상등액 또는 단일클론 항체, 항체 단편, Fv, Fab, Fab' 및 F(ab')2, scFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 인간화 항체 등이 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 시중에 나와있는 PTHrP 또는 RERG 단백질에 대한 시판 항체가 존재한다. PTHrP 단백질에 대해 특이적인 항체는 제한없이, Abcam(ab115488)의 인간 PTHrP를 인식하는 마우스 단일클론 항체 3H1-5G8, Abbiotech(카탈로그 번호 251478)의 래트, 마우스 및 인간 PTHrP를 인식하는 토끼 다클론 항체 P12272, BioVision(카탈로그 번호 5652-100)의 인간 PTHrP를 인식하는 토끼 다클론 항체 또는 Novus Biologicals(카탈로그 번호 NBP1-26542)의 인간 PTHrP를 인식하는 마우스 단일클론 항체를 포함한다. RERG 단백질에 대한 특이적 항체는, 제한없이, Santa Cruz(sc-109008 및 sc-109009)의 인간 RERG를 인식하는 염소 다클론 항체, ProteinTech(10687-1-AP)의 인간, 래트 및 마우스 RERG를 인식하는 토끼 다클론 항체, Abcam(ab115806)의 래트 RERG를 인식하는 토끼 다클론 항체 및 Novus Biologicals(H00085004-B01)의 인간 RERG를 인식하는 마우스 다클론 항체를 포함한다.
구체적으로, 본 발명에서, 단백질 수준은 웨스턴 블랏, ELISA 또는 단백질 어레이를 통해 정량된다.
제2 단계에서, 본 발명의 제1 방법은 기준 범위에 대해 제1 단계에서 분석한 유전자에 대해 획득된 발현도의 비교를 포함한다.
암, 바람직하게 유방암, 결장암, 폐암, 신장암 또는 갑상선암, 특히 유방암에 의해 영향받은 피험체의 종양 조직 샘플에서 c-MAF 발현도 증가에 반응하여 그 발현이 조정되는 1 이상의 유전자의 발현도를 측정하고, 기준 범위와 비교한 후, 이(이들) 유전자(들)의 발현도가 기준 범위에 비해 증가하면, 피험체가 전이가 발생될 높은 확률을 갖는다고 결론내릴 수 있다.
본 발명의 제1 방법을 특별히 시행하는 경우, 암, 특히 유방암, 결장암, 폐암, 신장암 또는 갑상선암, 특히 유방암에 의해 영향받은 피험체의 종양 조직 샘플에서 표 1에 포함된 1 이상의 유전자의 발현도가 기준 범위에 비해 증가하고/하거나, 암, 특히 유방암, 결장암, 폐암, 신장암 또는 갑상선암, 특히 유방암에 의해 영향받은 피험체의 종양 조직 샘플에서 표 2에 포함된 1 이상의 유전자의 발현도가 기준 범위에 비해 감소하면, 피험체는 전이가 발형될 높은 확률을 갖는다.
그 발현이 c-MAF 발현도 증가에 반응하여 조정되는 유전자 발현도의 결정은 기준 범위와의 상관성을 보여줄 필요가 있다. 분석 중인 종양의 유형에 따라서, 기준 범위의 정확한 성질은 다양할 수 있다. 따라서, 전이가 발생될 확률이 결정되면, 기준 범위는 전이를 겪지 않은, 암, 특히 유방암, 폐암, 신장암 또는 갑상선암, 특히 유방암을 갖는 피험체의 종양 조직 샘플로부터 유래되거나 또는 전이가 발생되지 않은, 암, 특히 유방암, 폐암, 신장암 또는 갑상선암, 특히 유방암을 갖는 피험체의 생검 샘플에서 채취된 종양 조직에서 측정한 발현도의 중앙값에 상응한다.
기준 샘플은 전형적으로 피험체 개체군 유래 샘플의 균등량을 배합하여 얻는다. 전형적인 기준 샘플은 대체로, 전이의 부재가 충분히 규정된 피험체 및 임상적으로 충분히 입증된 피험체에서 일반적으로 얻는다. 이러한 샘플에서, 생체마커의 정상(기준) 농도는, 예를 들면 기준 개체군에 대한 평균 농도를 제공하여, 결정할 수 있다. 마커의 기준 농도를 결정시, 몇몇 사항을 고려한다. 그 중에서 고려사항은 연령, 체중, 성별, 환자의 일반적인 신체 상태 등이 있다. 예를 들면, 적어도 2, 적어도 10 내지 바람직하게는 100 이상 내지 1000 이상의 피험체 군으로부터의 등량을 기준군으로 취하고, 바람직하게 이전 고려사항, 예를 들면 다양한 연령 카테고리에 따라 분류한다. 기준 수준으로부터 얻은 샘플 컬렉션은 바람직하게 실험 중인 환자와 동일한 유형의 암을 갖는 피험체로 구성된다.
중앙값이 확립되면, 환자 종양 조직 내 이 마커의 수준을 중앙값과 비교할 수 있고, 이러한 방식에서 "증가된" 발현도로 지정할 수 있다. 피험체간 가변성(예를 들면, 연령, 인종 등과 관련된 측면)에 기인하여, 유전자 발현의 절대 기준 범위를 확립하는 것은 매우 어렵다(실제로 불가능하지 않으면). 따라서, 특히 본 발명에서, 그 발현이 c-MAF 발현도 증가에 반응하여 조정되는 유전자 발현의 "증가"되거나 또는 "감소"된 발현에 대한 기준 범위는 임의의 상기 언급한 방법에 의해 충분히 질환이 입증된 1 또는 몇몇 단리된 샘플에서, 그 발현이 c-MAF에 의해 조정된 유전자 발현도를 분석하는 것을 포함하는 통상적인 수단을 통해 백분율을 계산하여 결정된다. "감소"된 수준은 이어서 바람직하게는, 예를 들면, 정상 개체군의 60% 이하, 정상 개체군의 70% 이하, 정상 개체군의 80% 이하, 정상 개체군의 90% 이하, 정상 개체군의 95% 이하를 포함하는, 발현도가 정상 개체군의 50% 이하인 샘플에 대해 지정된다. "증가"된 발현도는 바람직하게는, 예를 들면 정상 개체군의 60% 이상, 정상 개체군의 70% 이상, 정상 개체군의 80% 이상, 정상 개체군의 90% 이상, 정상 개체군의 95% 이상인 발현도를 포함하는, 발현도가 정상 개체군의 50% 이상인 샘플에 대해 지정된다.
구체적으로 본 발명에서, 암은 유방암, 결장암, 폐암, 신장암 및 갑상선암에 의해 형성된 군에서 선택된다. 본 발명에서 바람직한 암은 유방암이다. 보다 바람직하게는 임의 유형의 ER+ 또는 삼중 음성 유방암이다.
본 발명의 제1 방법을 실시할 경우, 암, 특히 유방암, 결장암, 폐암, 신장암 또는 갑상선암, 특히 유방암에 의해 영향받는 피험체에서 바람직한 전이는 골전이이다. 본 발명의 제1 방법을 실시할 때, 암, 특히 유방암, 결장암, 폐암, 신장암 또는 갑상선암, 특히 유방암에 의해 영향받는 피험체에서 특히 바람직한 전이는 용골성 골전이이다.
암, 특히 유방암에 의해 영향받은 피험체에 대한 개별화 요법에 대한 디자인 방법
당분야에서 공지된 바와 같이, 암, 예컨대 유방암, 결장암, 폐암, 신장암 또는 갑상선암을 앓는 피험체에 대해 투여되는 치료는 전이가 발생할 고확률과 연관된 것에 따라서 다양할 수 있다. 전이를 가질 확률이 높은 경우, 선택 치료는 화학요법과 같은 전신 치료를 포함한다.
따라서, 본 발명에서 설명하는 것에 따라, 그 발현이 c-MAF 발현도 증가에 반응하여 조정되는 1 이상의 유전자의 발현도의 변경이 전이 발생 확률과 관련있음을 고려하면, c-MAF에 의해 조정되는 이들 유전자 수준의 결정은 암을 갖는 피험체에 대해 최적인 요법을 결정하는데 도움이 된다.
따라서, 본 발명의 다른 측면은 기준 범위에 비해 1 이상의 유전자의 변경된 발현도는 피험체가 전이를 예방하는 목적의 요법을 받는데 감수성임을 의미하는, c-MAF 발현도 증가에 반응하여 그 발현이 조정되는 1 이상의 유전자의 피험체 종양 조직 샘플 내 발현도를 결정하는 것을 포함하는, 암, 특히 유방암, 결장암, 폐암, 신장암 또는 갑상선암, 보다 특히 유방암에 의해 영향받은 피험체에 대한 맞춤형 요법을 디자인하기 위한 시험관내 방법(이하, 본 발명의 제1 방법)에 관한 것이다.
본 발명의 제2 방법은, 제1 단계에서, c-MAF 발현도 증가에 반응하여 그 발현이 조정되는 1 이상의 유전자의 발현도를 암, 특히 유방암, 결장암, 폐암, 신장암 또는 갑상선암, 보다 특히 유방암에 의해 영향받은 피험체의 종양 조직 샘플에서 정량하는 것을 포함한다.
본 발명의 제1 방법을 특히 실시하는 경우, c-MAF 발현도 증가에 반응하여 그 발현이 조정되는 유전자 또는 유전자들은 표 1에 포함된 유전자 및/또는 피험체의 종양 조직 샘플에서 표 2에 포함된 1 이상의 유전자로 형성된 군에서 선택되고, 여기서 표 1의 1 이상의 유전자의 발현도가 기준 범위에 비해 증가하고/하거나 표 2의 1 이상의 유전자의 발현도가 기준 범위에 비해 감소하면, 피험체는 전이를 예방하기 위한 요법을 받는데 감수성이다.
본 발명의 제2 방법을 실행하면, PTHLH 유전자의 바람직한 발현도를 정량하여서, PTHLH 유전자 발현도가 기준 범위에 비해 증가하면, 피험체는 전이 예방을 목적으로 하는 요법을 받는데 감수성이다.
본 발명의 제2 방법을 실시하는 경우, PODXL 유전자의 바람직한 발현도를 정량하여서, PODXL 유전자 발현도가 기준 범위에 비해 증가하면, 피험체는 전이 예방을 목적으로 하는 요법을 받는데 감수성이다.
본 발명의 제2 방법을 실시하는 경우, RERG 유전자의 바람직한 발현도를 정량하여서, RERG 유전자 발현도가 기준 범위에 비해 감소하면, 피험체는 전이 예방을 목적으로 하는 요법을 받는데 감수성이다.
본 발명의 제2 방법을 실시하는 경우, 암은 유방암, 결장암, 폐암, 신장암 또는 갑상선암으로 형성된 군에서 선택되고, 바람직하게는 유방암이다. 본 발명의 제2 방법을 보다 상세하기 실시하는 경우, 유방암은 임의 유형의 ER+ 또는 ER-HER2-(ER-HER2-PR+ 또는 ER-HER2-PR-) 유방암일 수 있다.
본 발명의 제2 방법을 구체적으로 실시하는 경우, 전이는 골전이이다. 본 발명의 제2 방법을 보다 더 상세하게 실시하는 경우, 골전이는 용골성 전이이다.
본 발명의 제2 방법의 경우에서, 샘플은 피험체의 원발성 종양 조직 샘플이다.
제2 단계에서, 피험체의 종양 샘플에서 c-MAF 발현도 증가에 반응하여 그 발현이 조정되는 1 이상의 유전자의 발현은 기준 범위에 대해 비교된다. 기준 범위는 c-MAF 발현도 증가에 반응하여 그 발현이 조정되는 유전자의 대조군 샘플에서의 발현도로부터 획득된다. 분석 중인 종양 유형에 따라서, 대조군 샘플의 정확한 성질은 다양할 수 있다. 따라서, 바람직한 대조군 샘플은 전이를 겪지 않은 유방암, 결장암, 폐암, 신장암 또는 갑상선암을 갖는 피험체의 종양 조직 샘플이다. 보다 더 바람직하게 대조군 샘플은 전이가 발생되지 않은 ER+ 유방암을 갖는 피험체의 종양 조직 샘플이다. 대안적으로, 기준 범위는 전이가 발생하지 않은, 암, 특히 유방암, 결장암, 폐암, 신장암 또는 갑상선암, 특히 더 ER+ 유방암을 갖는 피험체의 생검에서 채취한 종양 조직 샘플에서 측정된 c-MAF 발현도의 중앙값에 상응한다.
본 발명의 제2 방법의 제2 단계에서, 암, 특히 유방암, 결장암, 폐암, 신장암 또는 갑상선암, 특히 더 유방암에 의해 영향받는 피험체의 종양 조직 샘플에서 얻은, c-MAF 발현도 증가에 반응하여 그 발현이 조정되는 1 이상의 유전자에 대한 발현도는 기준 범위와 비교하여서, 이들 유전자 중 1 이상의 발현도가 기준 범위에 비해 변경되면, 전이 예방(피험체가 아직 전이가 발생되지 않은 경우) 및/또는 치료(피험체가 이미 전이가 발생한 경우)을 목적으로 하는 요법을 받는데 감수성이라고 결론내릴 수 있다.
암이 전이를 야기하는 경우, 제한없이, 화학요법, 호르몬 치료, 면역요법, 또는 이들 조합을 포함하는 전신 치료를 포함한다. 부가적으로, 방사선요법 및/또는 수술을 사용할 수 있다. 치료의 선택은 일반적으로 원발성 암의 유형, 크기, 전이 위치, 연령, 환자의 일반적 건강 상태 및 이전에 사용된 치료 유형에 따라 좌우된다.
암, 예컨대 유방암을 갖는 피험체에서 전이를 예방 및/또는 치료하는 것을 목적으로 하는 치료는 화학요법, 호르몬 요법 및 면역요법을 포함한다.
- 화학요법은 암세포를 사멸하는 약물의 사용이다. 암페타민은 전형적으로 경구 또는 정맥내로 처리된다. 때때로, 화학요법은 방사선 치료와 함께 사용된다. 유방암에 대한 적합한 화학요법 치료는 제한없이, 안트라사이클린(독소루비신, 에피루비신, PEG화, 리포솜-캡슐화된 독소루비신), 탁산(파클리탁셀, 도세탁셀, 나노입자, 알부민-결합 파클리탁셀), 5-플루오로우라실, 빈카 알칼로이드(비노렐빈, 빈블라스틴), 젬시타빈, 플라티넘 염(시스플라틴, 및 카르보플라틴), 시클로포스파미드, 에토포시드 및 상기 중 1 이상의 계획적 병용 예컨대 시클로포스파미드-안트라시클린 +/- 5-플루오로우라실(예를 들면, 독소루비신-시클로포스파미드(AC), 에피루비신-시클로포스파미드(EC), 시클로포스파미드-에피루비신-5-플루오로우라실(CEF), 시클로포스파미드-독소루비신-5-플루오로우라실(CAF), 5-플루오로우라실-에피루비신-시클로포스파미드(FEC)), 시클로포스파미드-메토트렉세이트-5-플루오로우라실(CMF), 안트라시클린-탁산(예를 들면, 독소루비신-파클리탁셀 또는 독소루비신-도세탁셀), 도세탁셀-카페시타빈, 젬시타빈-파클리탁셀, 탁산-플래티넘 염(예를 들면, 파클리탁셀-카르보플라틴 또는 도세탁셀-카르보플라틴)을 포함한다.
- 호르몬 요법은 일부 호르몬이 일부 암의 성장을 촉진한다는 사실을 기반으로 한다. 예를 들면, 난소에서 생성되는 여성의 에스트로겐은 때때로 유방암의 성장을 촉진한다. 이들 호르몬의 생성을 중지시키는 다양한 방식이 존재한다. 한 방식은 그들을 생성하는 장기, 즉 여성의 경우 난소, 남성의 경우 고환을 외과적으로 제거하는 것이다. 보다 빈번하게 약물은 이들 장기가 호르몬 생성을 예방하거나 또는 호르몬이 암세포에 대해 작용하는 것을 예방하도록 사용될 수 있다.
- 면역요법은 면역계 자체가 환자의 암과 싸우는 것을 돕는 치료이다. 전이를 갖는 환자를 치료하는데 사용되는 몇몇 유형의 면역요법이 존재한다. 이들은 제한없이, 사이토카인, 단일클론 항체 및 항종양 백신을 포함한다.
발현이 c- MAF 발현과 양성적으로 상관있는 유전자의 억제를 기반으로 하는 치료 방법
본 발명의 저자는 유방 종양의 이종이식에 의해 야기되는 골전이성 군락화 모델에서 PHTLH의 억제가 전이 내 용골성 병변의 수를 감소시킨다고 언급하였다. 이는 유방 종양에서 c-MAF 발현 증가에 발현하여 그 발현이 증가되는(또는 그 발현이 유방 종양에서 c-MAF 발현 감소에 반응하여 감소되는) 유전자가 ER+ 유방암으로부터의 골전이 과정에서 일상적인 표적 유전자이고, 이의 억제가 유방암 전이의 출현을 중지시키는데 유용할 수 있음을 시사한다.
한편, 본 발명의 저자는 정제된 마우스 골수 세포를 기반으로 하는 실험 모델에서 골수 세포에 대한 부착 어세이로 전이성 유전자 PODXL의 발현의 상관성을 기능적으로 입증하였다(실시예 5). PODXL 발현은 PODXL 유전자의 내생성 수준의 증가에 대한 원인인 c-MAF의 높은 발현도를 보이는 고도의 전이성 골세포, MCF7에서 생체내 감소되었따. 따라서, 이 유전자는 c-MAF에 의해 매개되는 골전이 프로그램의 일부로서 그리고 ER+ 유방암의 골전이성 과정에서 일상적인 표적 유전자 및 예후 마커로서 가치가 있다.
따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 전이성 암, 특히 유방암, 결장암, 폐암, 신장암 또는 갑상선암, 보다 특히 유방암을 치료 및/또는 예방하기 위한 약물의 제조를 위한 유전자의 발현 또는 유전자 생성물 활성을 억제하는 제제의 용도에 관한 것이고, 여기서 유전자는 종양 세포, 특히 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선, 보다 특히 유방에서 발견되는 종양 세포에서 그 발현이 이들 세포에서의 c-MAF 발현도 증가에 반응하여 증가하거나 또는 이들 세포에서 c-MAF 발현도 감소에 반응하여 감소하는 것을 특징으로 한다.
다른 측면에서, 본 발명은 전이성 암, 특히 유방암, 결장암, 폐암, 신장암 또는 갑상선암, 더욱 특히 유방암을 치료 및/또는 예방하는데 사용하기 위한 유전자의 발현 또는 유전자 생성물 활성을 억제하는 제제에 관한 것이고, 여기서 유전자는 종양 세포, 특히 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선, 더욱 특히 유방에서 발견되는 것에서의 그 발현이 이들 세포에서의 c-MAF 발현도 증가에 반응하여 증가하거나 또는 이들 세포에서 c-MAF 발현도 감소에 반응하여 감소하는 것을 특징으로 한다.
다른 측면에서, 본 발명은 종양 세포, 특히 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선, 더욱 특히 유방에서 발견되는 것에서 그 발현이 이들 세포에서 c-MAF 발현도 증가에 반응하여 증가하거나, 또는 이들 세포에서 c-MAF 발현도 감소에 반응하여 감소하는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 또는 유전자 생성물 활성을 억제하는 제제를 투여하는 것을 포함하는, 피험체에서 전이성 암, 특히 유방암, 결장암, 폐암, 신장암 또는 갑상선암, 더욱 특히 유방암을 치료 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
표현 "유전자 발현을 억제하는 제제"는 유전자 전사의 감소, mRNA 탈안정화 및/또는 mRNA 번역 감소를 일으킬 수 있는 임의의 분자를 의미한다.
발현 억제제는 일정 유전자의 전사를 억제(RT-PCR, 노던 블랏 및 혼성화, 런온 어세이 등)하거나, mRNA를 탈안정화시키거나, 또는 mRNA의 번역을 억제(망상 적혈구 용해물 또는 맥아 용해물에서 시험관내 번역 어세이 등)하는 화합물의 능력을 결정하기 위해 표준 방법을 통해 동정할 수 있다. 본 발명에서, 화합물은 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 100%로 유전자 mRNA 양을 감소시키고/시키거나, 유전자의 전사를 감소시키고/시키거나 유전자의 번역을 감소(이 발현 생성물의 완전한 불활성화)시킬 수 있는 경우 유전자 발현의 억제제로 고려한다.
본 발명에서 사용하기 위한 유전자 발현의 억제제의 예에는, 제한없이 유전자-특이적 안티센스 올리고뉴클레오티드, 유전자-특이적 간섭 RNA(siRNA) 및 유전자-특이적 촉매성 RNA 또는 리보자임을 포함한다.
본 발명에서 사용하기 위한 유전자 발현에 대한 바람직한 억제제는 유전자-특이적 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
유전자 발현을 억제하는데 바람직한 제제는 유전자-특이적 간섭 RNA이다. 소형 간섭 RNA 또는 siRNA는 RNA 간섭을 통해 표적 유전자 발현을 억제할 수 있는 제제이다. siRNA는 화학적으로 합성하거나, 시험관내 전사를 통해서 얻거나, 또는 표적 세포에서 생체내 합성할 수 있다. 전형적으로, siRNA는 15 내지 40 뉴클레오티드 길이의 이중 가닥 RNA로 구성되고 1 내지 6 뉴클레오티드의 3' 및/또는 5' 돌출 영역을 포함한다. 돌출 영역의 길이는 siRNA 분자의 총 길이와는 독립적이다. siRNA는 표적 메신저의 전사후 침묵 또는 분해를 통해 작용한다.
본 발명의 siRNA는 PTHLH를 코딩하는 유전자, PODXL을 코딩하는 유전자, 또는 단백질을 코딩하는 게놈 서열의 mRNA와 실질적으로 상동성이다. "실질적으로 상동성"은, siRNA가 간섭 RNA에 의해 표적 mRNA의 분해를 일으킬 수 있는 방식으로, 표적 mRNA에 충분히 상보적이거나 또는 그와 유사한 서열을 갖는 것을 이해한다. 이러한 간섭을 일으키는데 적합한 siRNA는 RNA에 의해 형성된 siRNA를 비롯하여, 예컨대 다음과 같은 상이한 화학 개질을 포함하는 siRNA를 포함한다:
- 뉴클레오티드 간 연결이 자연적으로 나타나는 것, 예컨대 포스포로티오에이트 연결과 상이한 siRNA.
- 기능적 반응제, 예컨대 형광단과 RNA 사슬의 접합체.
- 상이한 기능적 2'-위치 히드록실 기를 이용한 개질에 의한 RNA 사슬의 말단, 특히 3' 말단의 개질.
- 2' 위치에 개질 당 예컨대 O-알킬화 잔기 예컨대 2'-O-메틸 리보스 p2'-O-플루오로리보스를 갖는 뉴클레오티드.
- 개질된 염기 예컨대 할로겐화 염기(예를 들면, 5-브로모우라실 및 5-요오도우라실), 알킬화 염기(예를 들면, 7-메틸구아노신)을 갖는 뉴클레오티드.
siRNA는 상기 언급한 특징을 갖는 이중 가닥 RNA의 형태로서 사용될 수 있다. 다르게, 목적 세포에서의 발현에 적합한 프로모터 제어 하에 siRNA의 센스 및 안티센스 사슬을 포함하는 벡터를 이용하는 것이 가능하다.
siRNA 발현에 적합한 벡터는 전사 시에, 루프를 형성하는 분리된 영역에 의해 분리된 하나의 단일 DNA 사슬에 직렬로 배열된 siRNA의 2개 사슬을 코딩하는 DNA의 2 영역의 것이고 단일 프로모터가 shRNA가 생성되는 DNA 분자의 전사를 유도한다.
다르게, siRNA를 형성하는 사슬 각각이 상이한 전사 유닛의 전사로부터 형성되는 벡터를 이용하는 것이 가능하다. 이어서 이들 벡터는 수렴 및 분기 전사 벡터로 나뉜다. 분기 전사 벡터에서, siRNA를 형성하는 DNA 사슬 각각을 코딩하는 전사 유닛은 각 DNA 사슬의 전사가 동일하거나 또는 상이할 수 있는, 각 DNA 사슬의 전사가 그 자체의 프로모터에 의존적인 방식으로 벡터에 직렬로 위치된다(Wang, J. et al., 2003, Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 100:5103-5106; Lee, N.S., et al., 2002, Nat.Biotechnol., 20:500-505). 수렴 전사 벡터에서, siRNA를 생성하는 DNA 영역은 2개의 도치된 프로모터가 측접된 DNA 영역의 센스 및 안티센스 사슬을 형성하는 것으로 확인된다. 센스 및 안티센스 RNA 사슬의 전사 후, 사슬은 기능성 siRNA를 형성하도록 하이브리드를 형성하게 된다. 벡터는 2개 U6 프로모터(Tran, N. et al., 2003, BMC Biotechnol., 3:21), 마우스 U6 프로모터 및 인간 H1 프로모터(Zheng, L., et al., 2004, Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 135-140; WO2005026322) 및 인간 U6 프로모터 및 마우스 H1 프로모터(Kaykas, A. & Moon, R., 2004, BMC Cell Biol., 5:16)를 이용하는 도치된 프로모터 시스템으로서 기술되었다.
수렴 및 분기 벡터로부터 siRNA 발현에 사용하기 적합한 프로모터는 siRNA를 발현하는데 바람직한 세포와 상용성인 프로모터 쌍 또는 임의의 프로모터를 포함한다. 따라서, 본 발명의 개발에 적합한 프로모터는 제한할 필요없이, 항상성 프로모터 예컨대 진핵생물 바이러스의 게놈 유래의 것 예컨대 폴리오마바이러스, 아데노바이러스, SV40, CMV, 조류 육종 바이러스, B형 간염 바이러스, 메탈로티오넨 프로모터 유전자, 헤르페스 심플렉스 바이러스 키나아제 프로모터, 레트로바이러스의 LTR 영역, 면역글로불린 프로모터, 액틴 프로모터, EF-1 알파 프로모터를 비롯하여 단백질의 발현이 분자 또는 외부 신호의 부가에 의존적인 유도성 프로모터, 예컨대 테트라사이클린 시스템, NF-kB 및 UV 광 시스템, Cre-lox 시스템, 열충격 프로모터, WO/2006/135436에 기술된 RNA 중합효소 II 조절 프로모터 및 조직-특이적 프로모터(예를 들면, WO2006012221에 기술된 PSA 프로모터)를 포함한다. 항상 작용하는 RNA 중합효소 III 프로모터가 본 발명에 바람직한 프로모터이다. RNA 중합효소 III 프로모터는 제한된 유전자 수 예컨대 5S RNA, tRNA, 7SL RNA 및 U6 snRNA로 나타낸다. 다른 RNA 중합효소 III 프로모터와 달리, III형 프로모터는 임의의 유전자내 서열을 필요로하지 않지만 위치 -34 내지 -24에 TATA 박스, -66 내지 -47에 근위 서열 성분 (PSE) 및 일부 경우에, -265 내지 -149에 원위 서열 성분(DSE)을 포함하는 5' 방향 서열은 필요하다. RNA 중합효소 III 제III형은 인간 또는 쥣과동물 H1 및 U6 유전자의 바람직한 프로모터이다. 보다 더 바람직하게는 2 인간 또는 쥣과동물 U6 프로모터, 마우스 U6 프로모터 및 인간 H1 프로모터 또는 인간 U6 프로모터 및 마우스 H1 프로모터이다. 본 발명에서, 유방 종양, 바람직하게는 ER+ 유방 종양에서 목적 유전자를 특이적으로 발현하는데 특히 적합하고, 따라서 바람직한 프로모터는 알파 ER 또는 사이클린 D1 프로모터이다.
siRNA는 루프 또는 헤어핀 영역에 의해 연결된 siRNA를 형성하는 역평행 사슬을 특징으로 하는, 소위 shRNA(짧은 헤어핀 RNA)로부터 세포내에서 생성될 수 있다. siRNA는 플라스미드 또는 바이러스, 특히 레트로바이러스에 의해 코딩될 수 있고, 프로모터의 제어 하에 존재한다. shRNA를 발현하는데 적합한 프로모터는 siRNA 발현에 대해 이전 단락에서 언급한 것이다.
siRNA 및 shRNA 발현에 적합한 벡터는 원핵생물 발현 벡터 예컨대 pUC18, pUC19, pBluescript 및 유도체, mp18, mp19, pBR322, pMB9, CoIEl, pCRl, RP4, 파지 및 셔틀 벡터 예컨대 pSA3 및 pAT28, 효모 발현 벡터 예컨대 2-미크론 플라스미드, 통합 플라스미드, YEp 벡터, 동원체 플라스미드 및 유사 벡터, 곤충 세포 내 발현 벡터 예컨대 pAC 시리즈 및 pVL 시리즈 벡터, 식물 세포 내 발현 벡터 예컨대 pIBI 시리즈, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, pORE 및 유사 벡터 및 바이러스 벡터 기반의 거대 진핵생물 세포 발현 벡터(아데노바이러스, 아데노바이러스 연합 바이러스를 비롯하여, 레트로바이러스 및 구체적으로 렌티바이러스)를 비롯하여 비바이러스 벡터 예컨대 pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl, pZeoSV2, pCI, pSVL 및 pKSV-10, pBPV-1, pML2d 및 pTDTl을 포함한다. 렌티바이러스 벡터가 개발에 바람직한 벡터이다.
본 발명의 siRNA 및 shRNA는 당분야의 숙련가에게 공지된 일련의 기술을 이용해 얻을 수 있다. siRNA를 디자인하기 위한 베이스로서 사용되는 뉴클레오티드 서열 영역은 제한되지 않으며 코딩 서열 영역(출발 코돈과 종결 코돈 사이)을 포함하거나, 또는 다르게, 바람직하게 25 내지 50 뉴클레오티드 길이 및 출발 코돈에 대해 센스 3' 위치 내 임의 위치인 5' 또는 3' 미번역 영역의 서열을 포함할 수 있다. siRNA를 디자인하는 방법은 N이 유전자 서열, 특히 PTHLH 또는 PODXL의 임의의 뉴클레오티드일 수 있는, AA(N19)TT 모티프를 동정하고, 높은 GC-함량을 갖는 것의 선택을 포함한다. 이러한 모티프가 발견되지 않으면, NA(N21)를 동정하는 것도 가능하며, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있다.
유전자-특이적 DNA 효소는 유전자 발현을 억제하는 바람직한 제제이다. DNA 효소는 안티센스 기술 및 리보자임의 물리적 특징 중 일부를 도입한다. DNA 효소는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 유사하게, 특정 핵산의 표적 서열을 인식하게 디자인되지만, 리보자임처럼, 촉매성이고 표적 핵산을 특이적으로 절단한다.
유전자 발현을 억제하는데 바람직한 제제는 그 억제된 활성이 바람직한 PTHLH 또는 PODXL을 코딩하는 mRNA의 번역을 억제하도록 표적 mRNA의 전사체를 촉매적으로 절단하게 디자인된 리보자임이다. 리보자임은 RNA의 특이적 절단을 촉매할 수 있는 RNA 효소 분자이다(개략적으로, 다음의 문헌을 참조함: Rossi, Current Biology 4: 469-471, 1994). 리보자임 작용 기전은 상보성 표적 RNA와 특이적 분자 서열 혼성화 후, 내부핵산분해 절단 사건을 포함한다. 리보자임 분자의 조성은 바람직하게 표적 mRNA에 대한 1 이상의 상보성 서열, 및 mRNa 절단을 담당하는 잘알려진 서열 또는 기능적 균등 서열(예를 들면, 미국 특허 제5093246호 참조)을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 리보자임은 망치 머리 리보자임, 엔도리보뉴클레아제 RNA(이하, "체크(Cech) 리보자임")을 포함한다(Zaug et al., Science 224:574-578, 1984).
리보자임은 개질 올리고뉴클레오티드(예를 들면, 안정성, 유도성 등의 개선을 위함)를 포함할 수 있고 표적 유전자를 생체내 발현하는 세포에 분포되어야 한다. 바람직한 분포 방법은 형질감염된 세포가 내생성 표적 메신저를 파괴하고 번역을 억제하기에 충분한 양의 리보자임을 생성하는 방식으로, 강력한 pol III 또는 pol II 항상성 프로모터의 제어하에 리보자임을 "코딩"하는 DNA 구성체의 이용을 포함한다. 다른 안티센스 분자와 달리, 리보자임은 촉매성이므로, 이들은 유효한 소량의 세포내 농도를 필요로 한다.
유전자 생성물의 활성을 억제하는 화합물의 경우, 이들 화합물은 이 생성물의 활성을 결정할 수 있는 특별한 어세이를 이용해 동정될 수 있다. 바람직하게, 유전자 생성물의 활성을 억제하는 화합물은 높은 전이성 군락화 능력을 갖는 유방암 전이의 동물 모델에서 용골성 병변의 형성을 감소시키고/시키거나 시험관내 전이성 병변에서 파골세포를 분화시키는 억제제 능력의 결정을 기반으로 특징지어진 본 발명의 실시예 3에 기술된 어세이를 이용해 동정될 수 있다. 본 발명에서, 화합물은 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100% 만큼(유전자 생성물의 완전한 불활성화) 이러한 생성물의 활성을 감소시킬 수 있는 경우 유전자 생성물 활성의 억제제로 간주한다.
본 발명에서 사용하기 위한 유전자 생성물 활성을 억제하는 제제의 예에는 제한없이, 유전자 생성물에 대한 특이적 억제 항체, 유전자 생성물의 음성 우성 변이체 및 유전자 생성물의 억제성 펩티드가 포함된다.
유전자 생성물 활성을 억제하는 다른 바람직한 제제는 이 생성물에 특이적인 억제 항체이다. 이러한 항체는 당분야의 숙련가에게 공지된 임의 방법을 이용해 제조할 수 있고, 이중 일부는 앞서 언급하였다. 따라서, 다클론 항체는 억제가 바람직한 단백질로 동물을 면역화시켜 제조된다. 단일클론 항체는 Kohler, Milstein 등(Nature, 1975, 256: 495)이 기술한 방법을 이용해 제조된다. 본 발명에서 적합한 항체는 결합 항원의 가변 영역, 불변 영역, Fab, F(ab')2 및 Fab'단편, Fv, scFv, 나노바디, 디아바디 및 이중특이적 항체를 포함하는 온전한 항체를 포함한다. 특히 PTHLH 또는 PODXL에 대한, 단백질-결합능으로 항체를 동정한 후, 이 단백질의 활성을 억제할 수 있는 것은 억제제를 동정하기 위한 어세이를 통해 선택한다.
유전자 생성물 활성을 억제하는 다른 바람직한 제제는 생성물의 억제성 펩티드이다.
유전자 생성물 활성을 억제하기 위한 다른 바람직한 제제는 이러한 유전자 생성물의 "음성 우성 돌연변이체"이다. 본 발명은 유전자 생성물의 음성 우성 돌연변이체를 비롯하여 그 돌연변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 사용을 고려한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 전사를 조절하는데 사용할 수 있는 프로모터는 기본적으로 전사를 유도할 수 있음을 의미하는 항상성 프로모터 또는 전사 활성이 외부 신호를 필요로하는 유도성 프로모터일 수 있다. 전사 조절을 위해 적합한 항상성 프로모터는 특히, CMV 프로모터, SV40 프로모터, DHFR 프로모터, 마우스 유선 종양 virus(MMTV) 프로모터, 연장 인자 1a(EF1a) 프로모터, 알부민 프로모터, ApoA1 프로모터, 케라틴 프로모터, CD3 프로모터, 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 프로모터, 신경필라멘트 프로모터, 뉴론-특이적 에놀라아제 프로모터, L7 프로모터, CD2 프로모터, 미오신 경쇄 프로모터, HOX 프로모터, 티미딘 키나아제 프로모터, RNA 중합효소 II 프로모터, MyoD 프로모터, 포스포글리세로키나아제(PGK), 저밀도 지단백질 프로모터, 액틴 프로모터를 포함한다. 트랜스활성제 발현을 조절하는 바람직한 프로모터는 PGK 프로모터이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 전사를 조절하는데 바람직한 프로모터는 파지 T7 RNA 중합효소이다.
바람직하게, 본 발명에서 사용할 수 있는 유도성 프로모터는 유도제 부재시에는 기본 발현이 없거나 또는 유의하지 않으며 3' 위치에 존재하는 유전자의 활성화를 촉진할 수 있는, 유도제에 반응하는 것이다. 유도제 유형을 기반으로, 유도성 프로모터는 Tet 온/오프 프로모터(Gossen, M. & H. Bujard(1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89:5547-5551; Gossen, M. et al., 1995, Science 268:1766-1769; Rossi, F.M.V. y H.M. Blau, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:451-456); Pip 온/오프 프로모터(US6287813); 항프로게스틴-의존성 프로모터(US2004132086), 엑디손-의존성 프로모터(Christopherson et al., 1992, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89:6314-6318; No et al., 1996, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 93:3346-3351, Suhr et al., 1998, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 95:7999-8004 및 WO9738117), 메탈로티오넨-의존성 프로모터(WO8604920) 및 라파마이신-의존성 프로모터(Rivera et al., 1996, Nat.Med. 2:1028-32)로 분류된다.
c-MAF의 우성-음성 변이체들[원문대로, 변이체]을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 적합한 벡터는 원핵생물 내 발현 벡터의 벡터 유도체 예컨대 pUC18, pUC19, Bluescript 및 이의 유도체, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColEl, pCRa, RP4, 파지 및 "셔틀" 벡터 예컨대 pSA3 및 pAT28, 효모 내 발현 벡터 예컨대 2 미크론 플라스미드 벡터, 통합 플라스미드, YEp 벡터, 동심체 및 유사 플라스미드, 곤충 세포 발현 벡터 예컨대 pAC 및 pVL 시리즈 벡터, 식물 발현 벡터 예컨대 pIBI, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, pORE 시리즈 벡터 및 유사물, 및 바이러스 벡터 기반의 고등 진핵생물 세포내 발현 벡터(아데노바이러스 또는 이의 연합 바이러스, 예컨대 레트로바이러스, 및 렌티바이러스)를 비롯하여 비바이러스 벡터 예컨대 pSilencer 4.1-CMV(Ambion), pcDNA3, pcDNA3.1/hyg pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTracer-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1, pZeoSV2, pCI, pSVL 및 pKSV-10, pBPV-1, pML2d 및 pTDT1을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 종양, 특히 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 종양, 보다 구체적으로, 유방의 종양에서 c-MAF 발현도 증가에 반응하여 그 발현이 증가되거나, 또는 종양, 특히 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암, 보다 구체적으로 유방의 암에서 c-MAF 발현도 감소에 반응하여 그 발현이 감소된 유전자, 표 1에 기술된 유전자를 선택한다.
보다 더 바람직한 실시양태에서, 유방 종양에서 c-MAF 발현도 증가에 반응하여 그 발현이 증가된 유전자는 PHTLH 유전자이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 유방 종양에서 c-MAF 발현도 증가에 반응하여 그 발현이 증가된 유전자는 PODXL 유전자이다.
따라서, PHTHL 발현 또는 이 유전자의 발현 생성물 활성을 억제하는 제제는 제한없이, PHTHL 유전자에 특이적인 siRNA, PHTHL 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, PHTHL 유전자에 특이적인 리보자인, PHTHL 단백질에 특이적인 항체 억제제, 상기 발현 생성물의 우성-음성 PHTHL 변이체 및 PHTHL 억제성 펩티드를 포함한다.
PODXL 발현 또는 이 유전자의 발현 생성물 활성의 억제제는 제한없이, PODXL 유전자에 특이적인 siRNA, PODXL 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, PODXL 유전자에 특이적인 리보자임, PODXL 단백질에 특이적인 억제 항체, PODLX 발현 생성물의 우성-음성 변이체 및 PODXL 억제성 펩티드를 포함한다.
PTHLH-특이적 siRNA는 제한없이, 시판되는 siRNA 예컨대 Abgent의 PTHLH에 대해 사전디자인된 siRNA(카탈로그 번호 RI14318) Qiagen의 마우스 PTHLH에 대한 siRNA(GS19227), Cambridge Bioscience의 인간 PTHLH에 대한 siRNA 듀플렉스(카탈로그 번호 SR303874)를 포함한다.
PODXL-특이적 siRNA는 제한없이, 시판되는 siRNA 예컨대 Santa Cruz Biotechnology의 sc-44765 siRNA, 인간 PODXL에 대한 Ori 유전자의 siRNA 듀플렉스(SR303611), 또는 Cambridge Bioscience의 인간 PODXL에 대한 siRNA 듀플렉스(카탈로그 # SR303611)를 포함한다.
본 발명에서 사용하는데 효과적인 PTHLH 억제 항체는 제한없이, 인간 PTHLH를 인식하는 Abcam의 3H1-5G8 마우스 단일클론 항체(ab115488), 래트, 마우스 및 인간 PTHLH를 인식하는 Abbiotech의 P12272 토끼 다클론 항체(카탈로그 번호 251478), 인간 PTHLH를 인식하는 BioVision의 토끼 다클론 항체(카탈로그 번호 5652-100), 또는 인간 PTHLH를 인식하는 Novus Biologicals의 마우스 단일클론 항체(카탈로그 번호 NBP1-26542)를 포함한다.
본 발명에서 사용하기에 효과적인 PODXL 억제 항체는 제한없이, 인간 PODXL의 N-말단 영역을 인식하는 ab62594 토끼 다클론 항체, 또는 Santa Cruz Biotechnology에 의한 인간 PODXL을 인식하는 sc-23903 마우스 단일클론 항체를 포함한다.
PTHLH 억제성 펩티드는 제한없이, 다음을 포함한다:
- PTHLH 절두형 변이체 예컨대 서열 LLHDKGKSIQDLRRRFFLHHLIAEIHTA(서열번호 8)을 갖는 hPTHrP(7-34), PTHrP(3-34), PTHrP(8-34), PTHrP(9-34), PTHrP(10-34)를 비롯하여 아미드화 변이체 및 PTHLH 위치 10, 11 및 12에 상응하는 아미노산의 각각 Asn(Asn10 변이체), Leu(Leu11 변이체) 및 D-Trp(D-Trp12 변이체) 치환에 의한 변이체, 및 구체적으로 [Nutt et al., 1990, Endocrinology 127:491-493 , Doppelt et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7557-7560 및 US6362163 및 US5527772]에 기술된 펩티드 [Nle8'18, Tyr34]bPTH(7-34)NH2, [Tyr34] bPTH(7-34)NH2, hPTHrP(7-34), [Leu11, D-Trp12]hPTHrP(7-34)2, [Asn10Leu11]hPTHrP(7-34)-NH2 및 [Asn10, Leu11, D-Trp 12] hPTHrP(7-34)-NH2.
- [Hoare et al, Peptides 23: 989-998, 2002]에 기술된 바와 같은 TIP 펩티드(1-39)(결절 누두 펩티드 1-39)같은 TIP(결절 누두 펩티드) 절두형 유도체, 및 이의 유도체 .
- 펩티드 NCT00051779(Chugai Pharmaceuticals)
- US2007203071AA 표 1 내지 5에 기술된 펩티드
- 구조가 WO04103273A2 화학식 1로 도시된 펩티드
- [Olstad et al., Peptides 1995, 16:1031-1037] 및 [Roubini et al., Biochemistry, 1992, 31: 4026-4033]에 기술된 펩티드
- [Nutt et al., Endocrinology, 1990, 127:491-3]에 기술된 펩티드 [Asn10Leu11]-PTHrP(7-34)-NH2 및 [Asn10, leu11, D-Trp12]-PTHrP-(7-34)-NH2
- 임의의 전술한 펩티드의 Fc 접합체, 예컨대 WO04060386에 기술된 펩티드
- 이들 펩티드의 기능적으로 균등한 변이체.
본 발명에서 사용되는 용어 "기능적으로 균등한 변이체"는 1 이상의 아미노산의 개질, 삽입 및/또는 결실에 의해 본 발명의 펩티드의 서열에서 유래된 펩티드이고, 단 상기 펩티드의 기능은 개질, 삽입 및/또는 결실이 없는 본 발명의 상응하는 펩티드의 기능에 대해 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 80%가 유지된다. 본 발명에서 사용하기 적합한 변이체는 상기 언급한 펩티드 서열에 대해 서열 동일성이 적어도 25%, 적어도 40%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%로 나타나는 변이체를 포함한다. 2개 아미노산 서열 간 동일한 정도는 통상의 방법, 예를 들면, 종래 공지된 서열의 표준 배열 알고리즘, 예컨대 예를 들면, BLAST(Altschul SF et al. Basic Local Alignment Search Tool. J Mol Biol . 1990 Oct 5; 215(3):403-10)를 통해 결정된다.
다른 PTHLH 억제제는 제한없이, WO2011003935에 기술된 바와 같이, PTHLH N-말단 영역에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 제1 용도의 특정 형태에서, 암은 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암, 바람직하게는 유방암이다.
본 발명의 제2 용도의 보다 구체적인 형태에서, 유방암은 ER+ 유형 또는 삼중 음성 유형이다.
본 발명의 용도의 특정 형태에서, 암 전이, 구체적으로 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암, 바람직하게 유방암은 골전이이다. 보다 더 구체적인 형태에서, 골전이는 용골성 전이이다.
발현이 c- MAF 발현과 역으로 상관있는 유전자 활성화를 기반으로 하는 치료 방법
본 발명의 저자는 RERG 유전자 발현도가 c-MAF 발현도와 역으로 상관있고 유방 종양 RERG 발현의 증가가 전이성 세포의 수를 감소시킬 수 있음을 보여주었다. 따라서, 이는 그 발현이 c-MAF에 의해 하향 조절되는 유전자의 발현의 조정이 유방암 전이의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있음을 의미한다. 이 경우, 저자는 RERG 활성화제의 사용이 전이성 세포의 수를 감소시킬 수 있음을 보여주었다.
따라서, 일 측면에서, 본 발명은 암전이, 구체적으로 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암, 보다 구체적으로 유방암의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조를 위한 유전자의 발현 또는 상기 유전자의 발현 생성물의 활성을 자극하는 제제의 용도에 관한 것이고, 여기서 상기 유전자는 종양 세포, 구체적으로 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암의 세포, 보다 구체적으로 유방암의 세포에서 그 발현이 상기 세포에서 c-MAF의 발현도 증가에 반응하여 감소하거나 또는 그 발현이 상기 세포에서 c-MAF의 발현도 감소에 반응하여 증가하는 것을 특징으로 한다.
다른 측면에서, 본 발명은 암전이, 구체적으로 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암, 보다 구체적으로 유방암의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 사용하기 위한 유전자의 발현 또는 이 유전자의 발현 생성물의 활성을 자극하는 제제에 관한 것이고, 여기서 상기 유전자는 종양 세포, 구체적으로, 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암의 세포, 보다 구체적으로 유방암의 세포에서 그 발현이 상기 세포에서 c-MAF의 발현도 증가에 반응하여 감소하거나, 또는 이들 세포에서 c-MAF의 발현도 감소에 반응하여 그 발현이 증가하는 것을 특징으로 한다.
다른 측면에서, 본 발명은 유전자의 발현 또는 상기 유전자의 발현 생성물의 활성을 자극하는 제제를 피험체에 투여하는 것을 포함하는, 피험체에서 암전이, 구체적으로 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암, 보다 구체적으로 유방암의 치료 및/또는 예방을 위한 방법에 관한 것이고, 여기서 상기 유전자는 종양 세포, 구체적으로 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암의 세포, 보다 구체적으로 유방암의 세포에서 그 발현이 상기 세포에서 c-MAF의 발현도 증가에 반응하여 감소하거나, 또는 상기 세포에서 c-MAF 발현도 감소에 반응하여 그 발현이 증가하는 것을 특징으로 한다.
바람직한 실시양태에서, 상기 유전자의 발현을 자극하는 제제는 상기 유전자의 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이거나 또는 상기 유전자의 발현 생성물의 활성을 자극하는 제제는 상기 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드이다.
다른 측면에서, 이 유전자의 발현을 자극하는 폴리뉴클레오티드는 유전자 구성체의 일부가 될 수 있다. 바람직하게, 유전자 구성체는 프로모터, 전사 종결인자, 미번역된 5' 및 3' 영역, 폴리아데닐화 신호 등을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하는데 적합한 영역과 함께 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
이론적으로, 프로모터가 폴리뉴클레오티드를 발현하는데 바람직한 세포와 상용성인한, 임의의 벡터를 본 발명에서 클로닝 벡터로 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시양태에 적합한 프로모터는 제한없이, 항상성 프로모터 예컨대 진핵생물 바이러스 게놈의 유도체 예컨대 폴리오마바이러스, 아데노바이러스, SV40, CMV, 조류 육종 바이러스, B형 간염 바이러스, 메탈로티오네인 유전자 프로모터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나아제 유전자 프로모터, 레트로바이러스의 LTR 영역, 면역글로불린 유전자 프로모터, 액틴 유전자 프로모터, EF-1알파 유전자 프로모터를 비롯하여, 단백질의 발현이 분자 또는 외생성 신호의 부가에 의존적인 유도성 프로모터, 예컨대 테트라사이클린 시스템, NFκB/UV 광 시스템, Cre/Lox 시스템 및 열충격 유전자 프로모터, WO/2006/135436에 기술된 바와 같은 조절성 RNA 중합성 II 프로모터를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 유방 조직-특이적 프로모터에 작동적으로 커플링된다. 본 발명에서 사용하는데 적합한 유방 조직의 특이적 프로모터의 예는 예시적으로 다음을 포함한다:
- 스트로머리신 3 프로모터(Basset et al, Nature 348.: 699,1990)
- 뮤신-유사 당단백질(DF3, MUCI)의 프로모터((Abe et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 282,1993)
- c-erbB-3, c-erbB-2 또는 c-erbB-4 프로모터
- 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV)의 프로모터
- 유장 산성 단백질의 프로모터
- 인간 알파-락트알부민 프로모터
- 양 β-락토글로불린 프로모터.
바람직한 실시양태에서, 유전자의 발현을 자극하는 제제는 벡터의 일부이다. 따라서, 본 발명은 원핵생물 발현 벡터에서 유도된 벡터 예컨대 pUC18, pUC19, Bluescript 및 그들의 유도체, mp18, mp19, pBR322, pMB9, CoIEl, pCRl, RP4, 파지 및 "셔틀" 벡터 예컨대 pSA3 및 pAT28, 효모 내 발현 벡터 예컨대 2-미크론 플라스미드 유형 벡터, 통합 플라스미드, YEP 벡터, 동심체 플라스미드, 곤충 세포 발현 벡터 예컨대 pAC 및 pVL 시리즈 벡터, 식물 발현 벡터 예컨대 pIBI, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, pORE 시리즈 벡터, 바이러스 벡터 또는 비바이러스 벡터를 기반으로 하는 고등 진핵생물 세포에서의 발현 벡터 예컨대 pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFL/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV pUB6/V5-His, pVAXl, pZeoSV2, pCI, pSVL 및 pKSV-10, pBPV-1, pML2d 및 pTDTl의 사용을 고려한다.
바람직한 실시양태에서, 유전자의 발현을 자극하는 제제는 바이러스 벡터의 형태로 전달된다. 본 발명에서 사용하는데 적합한 바이러스 벡터는 제한없이, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 유래 벡터, 아데노-연합 바이러스(AAV) 및 헤르페스 바이러스를 포함한다.
본 발명은 배양된 포유동물 세포로 발현 구성체를 전달하기 위한 몇몇 비바이러스 방법을 포함한다. 이들에는 인산칼슘 침전법, DEAE-덱스트란, 전기천공, 직접 미세주입법, DNA-적재 리포솜 및 리포펙타민-DNA 복합체, 세포 초음파, 미세주입 속도를 이용한 유전자 포격 및 수용체 매개 형질감염이 포함된다. 이들 기술 중 일부는 생체내 또는 생체외에서 올바르게 사용하도록 적합화될 수 있다.
본 발명의 추가 실시양태에서, 유전자의 발현을 자극하는 제제는 리포솜 내에 포획될 수 있다. 리포솜은 인지질 이중층 막 및 내부 수용성 매질을 특징으로 하는 소포 구조물이다.
본 발명은 유전자의 발현 또는 상기 유전자의 발현 생성물의 활성을 촉진하는 제제의 국소, 지역, 또는 전신 투여를 고려한다. 제제의 투여는 제제가 종양, 종양 혈관구조, 종양-회합 림프관 또는 종양과 연합된 관에 직접 투여되는 국지적인 방식으로 수행될 수 있다. 투여는 복강내, 흉막내, 방광내, 또는 척추강내일 수 있다. 유전자 요법은 종양-연합된 구성원의 혈관구조에 지역적 투여를 포함할 수 있다.
유전자의 발현 생성물 활성을 자극하는 제제로 폴리펩티드가 사용되는 경우, 본 발명은 세포 내부로 단백질의 전위를 촉진할 수 있는 펩티드로 개질된 폴리펩티드의 변이체의 사용을 고려하며, 예컨대 HIV-1 TAT 단백질에서 유도된 Tat 펩티드, 디. 멜라노가스터(D.melanogaster) 안테나페디아 단백질의 호메오도메인의 제3 나선, 헤르페스 심플렉스 바이러스의 VP22 단백질 및 아르기닌 올리고머가 있다(Lindgren, A. et al., 2000, Trends Pharmacol. Sci, 21:99-103, Schwarze, S.R. et al. , 2000, Trends Pharmacol . Sci., 21:45-48, Lundberg, M et al., 2003, Mol . Therapy 8:143-150 및 Snyder, E.L. & Dowdy, S.F., 2004, Pharm . Res. 21:389-393).
보다 바람직한 실시양태에서, 종양, 구체적으로 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암, 구체적으로 유방암에서 c-MAF의 발현도 증가에 반응하여 그 발현이 감소되는 유전자, 또는 종양, 구체적으로 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암, 구체적으로 유방암에서 c-MAF의 발현도 감소에 반응하여 그 발현이 증가되는 유전자는 표 2에 기술한 유전자에서 선택된다.
보다 더 바람직한 실시양태에서, 종양, 구체적으로 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암, 구체적으로 유방암에서 c-MAF의 발현도 증가에 반응하여 그 발현이 감소되는 유전자는 RERG 유전자이다.
본 발명의 제2 용도의 구체적은 실시양태에서, RERG 활성화제는 다음으로 이루어진 군에서 선택된다:
(i) RERG 또는 RERG의 기능적으로 균등한 변이체를 코딩하는 핵산, 및
(ii) RERG 단백질 또는 RERG의 기능적으로 균등한 변이체.
바람직한 실시양태에서, RERG를 코딩하는 핵산은 수탁 번호 NM_032918.2(변이체 1) 및 NM_001190726.1(변이체 2)로 NCBI 데이터베이스(2011년 11월 28일 버전)에 수집된, 2 전사 변이체에 해당된다.
용어 "RERG 단백질의 기능적으로 균등한 변이체"는 폴리펩티드가 그 서열이 1 이상의 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실을 통해 RERG 단백질로부터 유도되고, RERG 단백질과 실질적으로 동일한 기능을 유지하며, 이는 세포 증식 및 종양 형성의 억제제로서 작용함을 의미하는 폴리펩티드를 의미하는 것으로 이해한다. RERG 단백질 변이체는 세포 증식을 억제하는 RERG의 능력을 기반으로 하는 방법 예컨대 본 발명의 실시예 4에 기술된 방법을 이용해 동정할 수 있다.
본 발명에 따라서, 변이체는 바람직하게는 임의의 RERG 유전자 변이체의 뉴클레오티드 서열 또는 임의의 RERG 단백질 이소폼의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94% 내지 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이다. 상기 정의된 바와 같은 유전자 또는 RERG 단백질의 특이적 서열 및 변이체간 동일성 정도는 컴퓨터 알고리즘, 및 당분야의 숙련가에게 공지된 방법을 이용해 결정된다. 2개 핵산 서열 간 동일성은 바람직하게는 BLASTN 알고리즘을 이용해 결정되고, 2개 아미노산 서열 간 동일성은 바람직하게는 BLASTP를 이용해 결정된다[BLAST Manual, Altschul, S., et al., Algorism., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., y col., J. Mol. Biol. 215: 403-410(1990)].
바람직한 실시양태에서, 암은 유방, 결장, 폐, 신장, 또는 갑상선의 암, 보다 구체적으로는 유방암이다. 바람직한 실시양태에서, 유방암은 ER+ 암 및 ER-Her2- 암으로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 전이는 골전이이다. 보다 더 바람직한 실시양태에서, 골전이는 용골성 전이이다.
약학 조성물 및 투여 방법
종양, 특히 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암, 보다 구체적으로 유방암에서 c-MAF의 발현도 증가에 반응하여 그 발현이 증가되거나, 또는 종양, 특히 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암, 보다 구체적으로 유방암에서 c-MAF 발현도의 감소에 반응하여 그 발현이 감소하는 유전자의 발현을 억제하는 제제, 종양, 구체적으로 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암, 보다 구체적으로 유방암에서 c-MAF 발현도 증가에 반응하여 그 발현이 증가하거나, 또는 종양, 특히 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암, 보다 구체적으로 유방암에서 c-MAF 발현도 감소에 반응하여 그 발현이 감소하는 유전자의 발현 생성물의 활성을 억제하는 제제, 종양, 특히 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암, 보다 구체적으로 유방암에서 c-MAF 발현도 증가에 반응하여 그 발현이 감소하거나, 또는 종양, 특히 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암, 보다 구체적으로 유방암에서 c-MAF 발현도 감소에 반응하여 그 발현이 증가하는 유전자의 발현을 자극하는 제제, 및/또는 종양, 특히 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암, 보다 구체적으로 유방암에서 c-MAF 발현도 증가에 반응하여 그 발현이 감소되거나, 또는 c-MAF 발현도 감소에 반응하여 그 발현이 증가하는 유전자의 발현 생성물의 활성을 자극하는 제제는 전형적으로 약학적으로 허용되는 담체와 조합하여 투여된다.
용어 "담체"는 활성 성분과 투여되는 희석제 또는 부형제를 의미한다. 이러한 약학 담체는 멸균 액체, 예컨대 물 및 페트롤륨, 동물성, 식물성 또는 합성 기원, 예컨대 땅콩유, 대두유, 미네랄유, 참깨유 등을 포함하는 오일일 수 있다. 이들은 바람직하게는 물 담체 또는 염수 수용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액, 특히 주사용 용액으로서 사용된다. 적합한 약학 담체는 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" by EW Martin, 1995]에 기술되어 있다. 바람직하게, 본 발명의 담체는 주정부의 규제 기관에 의해 승인되었거나 또는 미국 약전 또는 동물, 보다 구체적으로 인간에서 사용하기 위해 일반적으로 인식되는 다른 약전에 언급된다.
본 발명의 약학 조성물의 투여의 바람직한 약학 형태를 제조하는데 필요한 비히클 및 보조 성분은 다른 요인 중에서도, 선택된 투여의 약학 형태에 따라 좌우된다. 상기 약학 조성물의 투여의 약학 형태는 당분야의 숙련가에게 공지된 통상의 방법에 따라 제작된다. 활설 성분의 투여를 위한 상이한 방법, 사용되는 부형제 및 그들을 생성하는 과정에 대한 리뷰는 ["Tratado de Farmacia Galenica", C. Fauli i Trillo, Luzan 5, S.A. de Ediciones, 1993]에서 확인할 수 있다. 약학 조성물의 예에는 임의의 고형 조성물(정제, 알약, 캡슐, 과립 등) 또는 경구, 국소 또는 비경구 투여용 액상(용액, 현탁액 또는 에멀션)이 포함된다. 또한, 약학 조성물은 안정화제, 현탁액, 보존제, 계면활성제 및 필요에 따라 유사물 등을 포함할 수 있다.
의약 용도를 위해서, 본 발명의 억제제/활성제는 부가적인 활성제와 병용하거나 또는 단독으로, 프로드러그, 염, 용매화물 또는 클라트레이트의 형태일 수 있고 약학적 관점에서 허용되는 부형제와 함께 제제화될 수 있다. 본 발명에서 사용하기 바람직한 부형제는 당, 전분, 셀룰로스, 검 및 단백질을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 약학 조성물은 약학적 고형 용량형(예를 들면, 정제, 캡슐, 드라제, 과립, 좌제, 멸균 결정 또는 액체형을 제공하도록 재구성할 수 있는 무정형 고체 등), 액상(예를 들면, 용액, 현탁액, 에멀션, 엘릭시르, 로션, 연고 등) 또는 반고체(겔, 연구, 크림 등)으로 제제화될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 제한없이, 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 척추강내, 심실내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장, 국소, 설하 또는 직장을 포함하는, 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. 활성 성분 투여의 상이한 형태, 사용되는 부형제 및 그들의 제조 공정에 대한 리뷰는 [Tratado de Farmacia Galenica, C. Fauli i Trillo, Luzan 5, S.A. de Ediciones, 1993 in Remington's Pharmaceutical Sciences(AR Gennaro, Ed), 20th edition, Williams & Wilkins PA, USA(2000)]에서 확인할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체의 예는 종래에 공지이고 포스페이트 완충 염수 용액, 물, 에멀션 예컨대 오일/물 에멀션, 다양한 유형의 습윤제, 멸균 용액 등을 포함한다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 종래 공지된 통상의 방법을 통해 제제화될 수 있다.
핵산이 투여되는 경우(siRNA, siRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 shRNA 우성-음성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드)에서, 본 발명은 상기 핵산의 투여를 위해 특히 제조된 약학 조성물을 고려한다. 약학 조성물은 나형의 상기 핵산, 즉 형질감염에 사용된 시약과 관련된 독성이 제거된 장점을 수반하는, 유기체의 뉴클레아제에 의한 분해로부터 핵산을 보호하는 화합물이 부재하는 핵산을 포함할 수 있다. 나 화합물에 대한 적합한 투여 경로는 혈관내, 종양내, 두개내, 복강내, 비장내, 근육내, 망막하, 피하, 점막, 국소 및 경구 경로를 포함한다(Templeton, 2002, DNA Cell Biol, 21:857-867). 다르게, 핵산은 콜레스테롤에 접합되거나 또는 세포막을 통한 전위를 촉진할 수 있는 화합물 예컨대 HIV-1 TAT 단백질에서 유도된 Tat 펩티드 Tat, 디. 멜라노가스터 안테나페디아 단백질의 호메오도메인의 제3 나선, 헤르페스 심플렉스 바이러스 VP22 단백질, 아르기닌 올리고머 및 예컨대 WO07069090에 기술된 펩티드에 접합된, 리포솜의 일부분을 형성하여 투여될 수 있다(Lindgren, A. et al., 2000, Trends Pharmacol. Sci, 21:99-103, Schwarze, S.R. et al., 2000, Trends Pharmacol. Sci., 21:45-48, Lundberg, M et al., 2003, Mol Therapy 8:143-150 및 Snyder, E.L. & Dowdy, S.F., 2004, Pharm. Res. 21:389-393). 대안적으로, 폴리뉴클레오티드는 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터, 바람직하게는 아데토바이러스, 아데노 연합 바이러스 또는 레트로바이러스, 예컨대 쥣과동물 백혈병 바이러스(MLV) 또는 렌티바이러스(HIV, FIV, EIAV)를 기반으로 하는 벡터의 일부분을 형성하여 투여될 수 있다.
억제제/활성제 또는 이들을 함유하는 약학 화합물은 체중 킬로그램 당 10 mg 미만, 바람직하게는 체중 kg 당 5, 2, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005 또는 0.00001 mg 미만의 용량으로 투여될 수 있다. 단위 용량은 주사, 흡입 또는 국소 투여를 통해 투여될 수 있다.
용량은 치료하려는 병태의 중증도 및 반응에 의존적이고 병태가 차도가 있는 것으로 관찰될 때까지 수일 또는 수개월간으로 다양할 수 있다. 최적 용량은 환자 전신에서 제제 농도의 주기적 측정을 수행하여 결정할 수 있다. 최적 용량은 동물 모델에서 시험관내 또는 생체내 예비 실험을 통해 얻은 EC50 값을 이용해 결정할 수 있다. 단위 용량은 1일 1회 또는 1일 적어도 1회, 바람직하게, 2, 4, 8 또는 30일 동안 1일 적어도 1회 투여될 수 있다. 대안적으로, 초기 용량을 투여하고 이어서 대체로 초기 농도 보다 낮은 용량의, 1 또는 몇몇 유지 용량을 투여하는 것이 가능하다. 유지 계획은 1일 0.01 ㎍ 내지 1.4 mg/kg-체중 범위, 예를 들면 1일 체중 kg 당 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001, 0.00001 mg의 용량으로 환자를 치료하는 것을 포함할 수 있다. 유지 용량은 바람직하게 최대로, 5, 10 또는 30일 마다 1회 투여된다. 치료는 환자가 겪는 고통의 유형, 이의 중증도, 및 환자의 상태/병태에 따라 다양한 기간 동안 지속되어야 한다. 치료 이후, 환자의 발전은 질환이 투여된 치료에 반응하지 않는 경우, 용량을 증가시켜야 하는지 여부, 또는 병의 호전이 관찰되는 경우, 또는 원치않는 부작용이 관찰되는 경우, 용량을 감소시켜야 하는지 여부를 결정하기 위해 모니터링해야 한다.
전이 경향을 의미하는 마커 유전자( 블루프린트 )를 동정하기 위한 방법
본 발명의 저자는 유방암을 앓는 환자의 전이가 발생할 경향/감수성과 관련된 유전자를 동정하는 것이 가능한 방법을 개발하였다. 이 방법론은 유방 종양에서 그 발현이 c-MAF의 발현과 상관있고 유방암 세포주에서 그 발현이 c-MAF 발현도 변화에 반응하여 변화하는 유전자의 동정을 기반으로 한다.
이러한 방식으로, 다른 측면에서, 본 발명은 암, 구체적으로 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암, 구체적으로 유방암을 앓는 환자에서 전이에 대한 경향의 유전적 마커를 동정하기 위한 시험관내 방법(이하, 본 발명의 유전자 동정 방법)에 관한 것이고,
(i) 원발성 유방암 종양 샘플에서 후보 유전자 및 c-MAF 유전자의 발현도를 결정하는 단계, 및
(ii) c-MAF 유전자 발현의 조정에 반응하여 유방암 세포의 개체군에서 상기 후보 유전자의 발현도 변화를 결정하는 단계
를 포함하며, 여기서 상기 유전자의 발현도는 원발성 암 종양 샘플, 구체적으로 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암, 보다 구체적으로 유방암에서 c-MAF 발현과의 유의한 통계적 상관성을 보여주며, c-MAF 유전자 발현의 변화 결과로서 발현도 변화는 상기 유전자의 수준 변화와 통계적 상관성을 보여주며, 이는 상기 유전자가 환자에서 전이에 대한 경향/성향의 마커임을 의미한다.
제1 시기에서, 본 발명의 유전자의 동정을 위한 방법은 후보 유전자의 발현도를 결정하는 것을 포함하고, c-MAF 유전자는 원발성 암 종양 샘플, 구체적으로 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암, 보다 구체적으로 유방암이다.
원발성 조직 샘플에서 상기 후보 유전자 및 c-MAF 유전자의 발현도의 결정은 암, 구체적으로 유방암을 갖는 환자에서 전이의 발생을 예측하기 위해서, 시험관내 방법의 내용에서 기술한 바와 같이 본질적으로 수행한다. 바람직한 방법에서, 상기 유전자 및 c-MAF 유전자의 발현도는 상기 유전자의 상보성 DNA(cDNA)를 기반으로, 상기 유전자의 전사를 통한 RNA(RNA 메신저 또는 mRNA)를 이용하거나 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현도 정량을 통해서 수행할 수 있다.
제2 단계에서, 본 발명의 유전자의 동정을 위한 방법은 c-MAF 유전자 발현의 조정에 반응하여, 암 세포, 구체적으로 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암, 보다 구체적으로 유방암의 개체군에서 상기 후보 유전자의 발현도 변화를 결정하는 것을 포함한다.
후보 유전자의 발현도 변화의 결정은 종양 세포 내 발현도를 c-MAF 발현도에 변화가 시작되는 특별한 2 시점에 결정하는 것이 요구된다. 상기 제1 시점과 상기 제2 시점 사이에서 c-MAF 발현도에 대한 상기 변화는 c-MAF의 발현도 증가 또는 c-MAF의 발현도 감소를 나타낼 수 있다.
바람직한 방법에서, 단계 (ii) 동안 수행된 c-MAF 수준의 조정은 c-MAF 수준의 증가를 나타낸다. 이를 달성하기 위해서, 이 단계는 c-MAF 또는 세포로 도입된 c-MAF의 일부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 세포를 필요로 한다. 세포로 목적 유전자를 도입하기 위한 적절한 방법 및 세포로 목적 유전자의 발현을 위한 적절한 배열은 그 발현이 본 발명에서 동일한 형태로 사용된 c-MAF의 발현과 역상관성이 입증된 유전자의 활성화를 기반으로 하는 치료 방법의 내용에서 기술하였다.
표적/소정 세포 개체군에서 c-MAF의 발현도 증가를 유도하기 위한 목적으로, c-MAF를 코딩하고, 종양, 예컨대 유방, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암, 바람직하게는 유방암에서 세포 발현을 촉진하는 프로모터에 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오티드의 도입을 통해 세포를 개질시키는 것이 가능하다. 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드 이외에도, 숙주 원핵생물 유기체에서 그 증식을 보장하기 위한 부가 서열(예를 들면, 적용 기원)과 선별 마커를 포함하는 벡터의 일부분을 형성하여 정상적으로 생성된다. 예시를 위해, 유방암 종양 세포에서 목적 유전자의 발현에 적합한 다음의 프로모터를 사용할 수 있다:
- 스트로멜라이신 3의 프로모터(Basset et al., Nature 348: 699,1990)
- 뮤신과 유사한 당단백질(DF3, MUCI)의 프로모터((Abe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 282,1993)
- c-erbB-3, c-erbB-2 또는 c-erbB-4의 프로모터
- 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV)의 프로모터
- 유장 산성 단백질의 프로모터
- 인간 알파-락트알부민의 프로모터
- 소 β-락토글로불린의 프로모터
c-MAF를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 과학 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 형질감염 방법을 이용해 실험 목적의 세포에 도입한다([Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc, 2003]의 섹션 9.1 내지 9.5 참조). 구체적으로, 세포는 인산칼슘과 DNA 공침전법, DEAE-덱스트란, 폴리브레온, 전기천공, 미세주입, 리보폼 매개 융합, 리포펙션, 레트로바이러스에 의한 감염 및 유전자총 형질감염을 이용해 형질감염될 수 있다.
다르게, 세포는 이로 c-MAF 단백질 도입을 통해 개질될 수 있다. 이를 위해, 본 발명은 세포 내부로 단백질의 전위를 촉진할 수 있는 펩티드(세포하 수준), 예컨대 펩티드, HIV-1 Tat 단백질에서 유도된 Tat, 드로소필라 멜라노가스터의 안테나페디아 단백질의 제3 나선, 헤르페스 심플렉스 바이러스의 VP22 및 아르기닌의 올리고머에 의해 개질된 c-MAF의 변이체의 용도를 제공한다(Lindgren, A. et al., 2000, Trends Pharmacol. Sci, 21:99-103, Schwarze, S.R. et al., 2000, Trends Pharmacol. Sci., 21:45-48, Lundberg, M et al., 2003, Mol . Therapy 8:143-150 y Snyder, E.L. 및 Dowdy, S.F., 2004, Pharm . Res. 21:389-393).
보다 특별한 모델에서, c-MAF에서의 발현 증가는 암 세포, 구체적으로 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암을 비롯하여 유방암, 보다 구체적으로 유방암에서 c-MAF의 단형 이소폼의 발현 동안 일어난다. 다른 보다 더 구체적인 모델에서, c-MAF의 발현에 대한 증가는 암 세포, 구체적으로 유방암을 비롯하여, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암, 보다 구체적으로 유방암에서 c-MAF의 장형 이소폼의 발현 동안 일어난다. 보다 더 구체적인 모델에서, c-MAF의 발현에 대한 증가는 암세포, 구체적으로 유방암을 비롯하여, 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암, 보다 구체적으로 유방암에서 c-MAF의 장형 및 단형의 공발현 동안 일어난다.
제2 단계 동안 일어나는 c-MAF 수준의 조정이 c-MAF 수준에 대한 감소를 포함하는 경우, 이 단계는 c-MAF를 침묵시킬 수 있는 제제의 세포의 도입을 요한다. 배제를 의미하지 않으며 예시를 위해, c-MAF 수준에서의 갑소를 달성하는데 적합한 제제의 예는 상기 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, 상기 유전자에 특이적인 RNA 간섭(RNAi) 과정, 상기 유전자에 대한 촉매성 RNA 또는 특이적 리보핵산 효소, c-MAF 억제제 및 억제 항체를 포함한다.
c-MAF에 대한 RNA 간섭(RNAi) 과정은 하나의 사슬이 ACGGCUCGAGCAGCGACAA(서열번호 1)인, WO2005046731에 기술된 RNAi를 포함한다. c-MAF에 특이적인 RNAi의 다른 서열은 제한없이, CUUACCAGUGUGUUCACAA(서열번호 2), UGGAAGACUACUACUGGAUG(서열번호 3), AUUUGCAGUCAUGGAGAACC(서열번호 4), CAAGGAGAAAUACGAGAAGU(서열번호 5), ACAAGGAGAAAUACGAGAAG(서열번호 6) 및 ACCUGGAAGACUACUACUGG(서열번호 7)을 포함한다.
본 발명에서 사용할 수 있는 c-MAF의 우성 음성은 AP-1 패밀리의 다른 구성원, 예컨대 fos 및 Jun과 동종이량체를 비롯하여 이종이량체를 형성할 수 없음을 고려하면 c-MAF와 이량체를 형성할 수 있지만 전사를 활성화시키는 능력은 결여된 돌연변이체를 포함한다. 이와 같이, c-MAF의 음성 우성은 세포에 존재하고 트랜스활성화의 도메인을 포함하는 아미노 말단의 2/3이 결여된 임의의 소형 maf 단백질(예를 들면, mafK, mafF, mafg 및 pi8)일 수 있다(Fujiwara et. al.(1993) Oncogene 8, 2371-2380; Igarashi et al.(1995) J. Biol.Chem. 270, 7615-7624; Andrews et al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11488-11492; Kataoka et al.(1995) Mol. Cell. Biol. 15, 2180-2190)(Kataoka et al.(1996) Oncogene 12, 53-62).
다르게, c-MAF에 대한 우성 음성 단백질은 다른 단백질과의 이량체화 능력은 유지하지만 전사를 활성화시키는 능력은 결여된 c-MAF의 변이체를 포함한다. 이들 편이체는 예를 들면, 단백질의 N-말단에 위치한, c-MAF의 트랜스활성화를 위한 도메인이 결여된 것이다. 이와 같이, c-MAF 우성 음성 변이체는 예를 들면, 적어도 아미노산 1 내지 122, 적어도 아미노산 1-187 또는 적어도 아미노산 1 내지 257 아미노산(US6274338에 기술된 인간 c-MAF의 번호화를 고려함)이 제거된 변이체를 포함한다.
본 발명의 방법의 구체적인 모델에서, 단계 (i)에서 사용하는 종양 샘플은 유방암 종양, 또는 결장, 폐, 신장, 또는 갑상선, 보다 구체적으로, 유방암 종양에서 얻는다. 본 발명의 보다 구체적인 모델에서, 단계 (i)에서 사용되는, 종양 샘플, 구체적으로 유방암 종양은 ER 종양 및 삼중 음성 종양에서 얻는다. 바람직한 모델에서, 단계 (ii)에서 사용되는, 암 세포, 구체적으로 유방암 종양 유래 세포는 삼중 음성 종양에서 얻은 ER +이다. 보다 더 구 체적인 모델에서, 전이는 골전이이다.
본 발명에서 사용하기 적합한 다른 c-MAF 화합물 억제제는 다음을 포함한다:
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
c-MAF의 다른 억제제는 이하 표(표 4)에 도시된 바와 같이, 특허 출원 WO2005063252에 기술되어 있다.
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
보다 더 구체적(특이적)인 다른 모델에서, c-MAF의 발현도에서 감소는 유방암 종양 세포, 또는 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암, 보다 구체적으로 유방암 유래 암 세포에서 c-MAF의 단형 이소폼의 침묵을 통해 일어난다. 다른 모델에서, c-MAF의 수준의 감소는 유방암 종양 세포, 또는 결장, 폐, 신장 또는 갑상선, 보다 구체적으로는 유방암 유래의 암세포에서 c-MAF의 장형 이소폼의 침묵을 통해 일어난다. 보다 더 구체적인 다른 모델에서, c-MAF 수준의 감소는 유방암 종양 세포, 또는 결장, 폐, 신장 또는 갑상선, 보다 구체적으로 유방암 유래의 암 세포에서 c-MAF의 장형 및 단형의 침묵을 통해 일어난다. 암세포, 구체적으로 유방암 세포, 또는 결장, 폐, 신장 또는 갑상선, 보다 구체적으로 유방의 암의 세포 개체군은 이러한 유형의 암을 앓는 환자에서 채취된 생검 샘플에서 얻거나, 또는 제한없이, MCF-7, T47D 및 MDA-MB-231, MDA-MB-435, MDA-MB-468, BT20, SkBr3, HCC-1937, BT-474 및 ZR75.1를 포함하는 유방암 세포 계통일 수 있다. 바람직한 모델에서, 단계 (ii)는 MCF7 유방암 세포주 유래의 세포를 이용해 수행한다. 결장암 세포주는 제한없이, HCA-7, KM12C, KM12SM, KM12l4a, SW480, SW620를 포함한다. 폐암 세포주는 제한없이, NCI-H1781, NCI-H1373, LC319, A549, PC14, SK-MES-1, NCI-H2170, NCI-H1703, NCI-H520, LU61, LX1, SBC-3, SBC-5, DMS273 및 DMS114를 포함한다. 폐암 세포주는 제한없이, 786-0, 769-P, A-498, SW-156, SW-839, A-704, ACHN, CaKi-1 및 CaKi-2를 포함한다. 폐암 세포주는 제한없이, BCPAP, KTC-1, K1, TCP1, FTC133, ML1, 8505C, SW1736, Cal-62, T235, T238, Uhth-104, Uhth-104, HTh74, KAT18, TTA1, FRO81-2, HTh7, C643, BHT101 및 KTC-2를 포함한다.
이하 (i) 원발성 암 종양 샘플, 예컨대 유방암 종양 유래, 또는 결장, 폐, 신장 또는 갑상선의 암 종양 세포, 보다 구체적으로 유방암에서 후보 유전자 및 c-MAF의 발현도, 및 (ii) c-MAF 유전자의 발현의 조정에 반응하여, 암 세포, 예컨대 유방 폐, 신장 또는 갑상선, 보다 구체적으로 유방암 개체군 내에서 상기 후보 유전자의 발현도의 변화가 결정되면, 전이에 대한 경향(성향)의 동정을 위한 마커 유전자의 동정에 대한 시험관내 방법은
(i) 원발성 암 종양 샘플에서 상기 유전자 및 c-MAF 유전자의 발현도의 비교, 및
(ii) c-MAF 유전자의 발현의 조정에 반응한 발현도와 상기 유전자 수준 변화의 비교(원문대로 - 원문에는 기간이 없음)
를 포함한다.
바람직한 모델에서, 단계 (i)에서 정의/결정된 상기 유전자의 발현이 원발성 종양 샘플에서 c-MAF의 수준과 직접적으로 상관있고 c-MAF 유전자의 발현의 조정에 반응하여 발현 수준 변화가 상기 조정과 직접 상관있으면, 이는 상기 유전자의 상승된 수준이 전이에 대한 경향을 의미한다는 의미이다.
다른 바람직한 모델에서, 단계 (i)에서 결정된 상기 유전자의 발현이 원발성 종양 샘플에서의 c-MAF의 수준과 역으로 상관있고 c-MAF 유전자의 발현의 조정에 반응하여 발현도의 변화가 상기 조정과 음성적으로 상관있으면, 이는 상기 유전자의 감소된 수준이 전이에 대한 경향을 의미함을 의미한다.
원발성 종양 샘플에서 후보 유전자의 발현과 c-MAF의 발현 간 상관성은 기준값에 대한 양쪽 유전자의 발현도 비교를 통해 생성되고, 여기서 양쪽 유전자가 동일 샘플에서 기준값에 대해 그들 발현의 변동을 나타내면, 양쪽 유전자 발현간에 상관성이 있는 것으로 간주한다. 상관성은 직접적(기준값에 비해 후보 유전자의 발현 증가는 상기 유전자의 기준값에 대한 c-MAF의 발현 증가와 상관있거나 또는 기준값에 비해 후보 유전자의 발현 감소는 상기 유전자에 대한 기준값에 대한 c-MAF 유전자의 발현 감소와 관련됨)이거나 또는 정반대(기준값에 대한 후보 유전자의 발현 증가는 상기 유전자의 기준값에 대한 c-MAF 발현의 감소 증가(원문대로 - 여기 오류인듯함)와 상관있거나 또는 기준값에 대한 후보 유전자의 발현 감소는 상기 유전자의 기준값에 대한 c-MAF 유전자의 발현 증가와 관련있음)일 수 있다.
c-MAF 유전자의 조정에 반영하여 후보 유전자의 발현도 변화간 상관성은 c-MAF 유전자의 발현 조정을 유도하기 전 상기 유전자의 발현도 및 c-MAf 유전자 발현의 조정이 일어난 후 동일 샘플에서 상기 유전자의 발현도를 결정하여 알게되고, c-MAF 발현의 변화에 부수적인 방식으로 후보 유전자 발현의 변동이 일어나면 상관성이 있는 것으로 간주한다. 상관성은 직접적(후보 유전자 발현이 증가된 c-MAF 발현에 수반되어 증가하거나, 또는 감소된 유전자 발현이 감소된 c-MAF 발현에 수반하여 감소됨) 또는 정반대(후보 유전자 발현이 감소된 c-MAF 발현에 수반하여 증가되거나 또는 후보 유전자 발현이 그 유전자의 기준값에 비해 증가된 c-MAF 발현에 수반하여, 기준값에 비해 감소됨)일 수 있다.
c-MAF의 발현에 변화가 일어나기 전에 그 수준에 대해 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%: 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150% 또는 그 이상의 상기 유전자의 발현도 증가가 일어나는 경우 c-MAF의 발현 변동에 대해 수반되는 방식으로 유보 유전자의 발현에 증가가 존재하는 것으로 간주한다.
c-MAF의 발현에 변화가 일어나기 전에 그 수준에 대해 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%: 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150% 또는 그 이상의 상기 유전자의 발현도에 감소가 일어나는 경우 c-MAF의 발현도의 변동에 대해 수반되는 방식으로 후보 유전자의 발현에 감소가 존재하는 것으로 간주한다.
바람직한 모델에서, 전이는 골전이이다.
본 발명은 이하 실시예를 통해 다음에서 기술하며, 이는 단지 예시를 위한 목적으로 간주되어야 하고 본 발명의 범주를 한정하지 않는다.
실시예
I. 재료 및 방법
실험 연구 모델
유방암 ER+ 및 ER-PR-Her2-의 전이 연구를 위한 새로운 실험 모델을 개발하였다. 이러한 목적을 위해서, GFP/루시퍼라아제의 발현을 가능하게 하는 벡터로 안정한 형태로 형질감염시킨, MCF7이라고 알려진 유방암 ER+의 인간 세포주를 사용하였다. 다양한 장기에서 전이 능력을 갖는 세포를 선별할 수 있도록 (꼬리) 미정맥내 또는 심실내를 통한 주사에 의해 면역 결핍 마우스(Balb-c/누드)에 이 세포주를 접종하였다. 래트는 실험 과정 전반에서 이들 호르몬의 존재를 보장하기 위해 에스트로겐의 피하 이식물을 가졌다.
전이성 개체군의 선별
상이한 조직의 전이성 개체군을 전이성 병변 유래 세포의 동정 및 단리를 통해 선별하였다. 이를 위해, 상이한 시기에 목적 장기에서 종양 세포의 확립 및 성장을 검출하고 존재하는 종양성 세포의 수를 정량하는 것이 가능한 기법이 도입된, 생물발광 영상법을 사용하였다. 이러한 기술의 도입을 위해서, 세포는 루시퍼라아제 및 GFP의 유전자를 발현하기 위해 형질도입시켰고 이것으로 이들을 비침습성 방법을 이용해 실시간 생체내 모니터링/관찰이 가능하다. 발광 영상(루시퍼라아제 활성)의 포획은 그의 민감도 및 속도 덕분에 바람직한 방법론인 Xenogen IVIS 유형 및 Livingimage 소프트웨어 장비를 이용해, 전신 마취 하에 동물에서 수행하였다. 전이성 세포를 단리하기 위해서, 종양 병변을 절개하고 나서, 레이저 유도된 형광(GFP)(녹색 형광 단백질)으로의 스윕핑을 이용하는 혈구계산 기술을 이용해, 전이성 세포를 숙주 유기체의 다른 세포로부터 단리하였다. 이들 세포를 단리하면, 특이적 조직을 통한 그 향성을 농축/공급하기 위해 과정을 반복하였다. 이러한 과정을 이용해서, 뼈 및 뇌의 전이를 포함해, 조직 특이성을 갖는 특이적 전이성 개체군을 단리하였다.
전이성 개체군을 동정 및 단리하면, 고성능 전사 분석을 수행하였다. 대체로, 이러한 전략은 불충분한 예후의 암성 세포에서 전이성 과정의 매개인자로 작용하는, 일부를 포함하여 그 전사가 강화된 유전자의 동정을 가능하게 한다. 특이적 조직 및 장기에서 전이성 세포를 통한 군락화에서 그 발현이 변경된 것으로 확인된 유전자의 영향은 편견없는 생체내 선별 과정을 통해 검증하였다. 뼈에서 군락화하는 높은 능력을 갖는 세포의 선별 개체군은 BoM2라고 하였다.
그 발현이 c- MAF의 발현과 상관있는 유전자군의 동정
349 원발성 유방 종앙의 게놈 와이드 전사 프로파일의 비교를 통해서, c-MAF 발현과, 양성(직접) 방식으로 충분히 그 발현이 상관있는 유전자를 동정하거나, 또는 다르게, 음성(정반대) 방식인 것을 동정하였다. 이러한 방식으로 얻은 유전자의 검증은 정의된 세포 모델에서 c-MAF 발현에 대한 그 발현 분석을 통해 수행하였다. MCF7 ER+ 유방암 세포주는 그들이 충분히 c-MAF 유전자의 장형 이소폼 또는 단형 이소폼을 발현하고 mRNA 발현에 대한 프로파일을 Affymetrix U133A2Plus를 이용해 결정하기 위해 개질시켰다. 일반적인 기술을 이용해서, c-MAF가 고갈된, MCF-7 골전이 세포의 유도체를 얻었다. 유전자 발현 프로파일은 이전의 세포 개체군에서 결정하였고, c-MAF 발현 함수에 따라 유의하게 변화된 유전자를 선별하였다. 이러한 결과는 그 발현이 원발성 유방암 종양에서 c-MAF의 발현도와 유의하게 상관있고, 사용된 세포 상태 중 1 이상에서 c-MAF의 기능에 따라 다양한, 99개 유전자(이들 중 76개는 표 1에 기재된 바와 같이 과발현된 것이고, 33개는 표 2의 억제된 것들임)를 포함하는, 뼈에서 c-MAF의 전이성 프로그램을 얻는 것을 가능하게 하였다. 뼈에서 c-MAF의 전이성 프로그램은 사이토카인, 세포 부착 분자, 막에 앵커링된 프로테아제, 신호전달 매개인자 전사인자를 포함한다.
ER+ 유방암 세포에서 발현도 변화가 관찰된 유전자군을 검증하였다. 이를 위해, 후보 유전자의 발현도는 유방암을 앓는 환자에서 유래된 560 원발성 유방암 종양 및 46 전이성 세포를 포함하는, 원발성 유방암 종양 및 전이성 코호트를 이용해 얻은 유전자 발현의 프로파일과 비교하였다.
생물정보학 및 전산 생물학
전이에서 풍부한 유전자군을 획득하고 그들의 임상적 상관성을 검증하기 위해서, R 통계 패키지 및 바이오컨덕터를 사용하였다. 데이터 처리를 위한 특이적 함수 및 구조를 이입하고 웹사이트 www.bioconductor.org 상에 공공 접근을 위해 공개하였다.
실시예 1
관련 유전자의 선택
c-MAF 발현도 변화에 반응하여 단일 ER+ 유방암 세포에서 유래된 세포에서 차별적 방식으로 발현되는 유전자를 선별하기 위한 목적으로 분석을 수행하였다(표 1, 도 1B). c-MAF에 의해 매개되는 골전이 프로그램으로 확정된 유전자 및 기능은 다음의 기준에 따라 선택하였다:
i) 원발성 종양에서 그 발현이 c-MAF의 발현과 유의하게 상관있는 유전자.
ii) C-MAF가 MCF7 세포에서 과발현(장형 또는 단형 이소폼)되는 경우, 또는 c-MAF를 발현하는 MCF7에서 유도된 고도의 전이성 뼈 세포에서 c-MAF의 발현이 감소된 경우, 그 발현이 c-MAF의 발현으로 변화되는 유전자, 및
iii) 원발성 종양에서 MAF의 발현과 상관있고, ii)에서 언급한 세포 조건 중 하나에서 c-MAF에 의해 매개된 골전이성 프로그램의 구성원으로 간주되는 유전자.
이들 기준을 기반으로, 그 발현도가 c-MAF의 발현도와 상관있는 유전자를 동정하고, 발현도에서 그 변동이 ER+ 원발성 유방암 종양에서 c-MAF의 발현도와 어떻게 관련있는지를 결정하였다(표 1).
실시예 2:
골전이 발생을 위해 강화된 유전자의 치료 값 및 예후값
여기서 개발된 전이성 세포 개체군의 선택을 위한 실험 체계를 통해 골전이에서 강화된 유전자는 유방암을 앓는 환자 유래의 560 원발성 유방암 종양 및 58 전이의 발현 프로파일 및 임상 기록을 포함하는 2종의 상이한 데이터베이스를 비교하여 평가하였다. 이들 종양은 모든 하위유형의 유방암 및 전이 위치를 대표한다. 데이터베이스와 관련 임상 기록은 공공이 이용가능하다(GSE 2603, 2034, 12276 및 14020).
골전이에서 얻은 유전자의 ER+ 원발성 종양에서 유전자 발현은 뼈에서의 재발과 유의한 상관성을 보여주었고 또한 뼈로의 전이와 상관(도 1A)있었지만 다른 조직으로의 전이와는 상관없었다(도 1B).
실시예 3
c- MAF에 의해 매개된 골전이에 대한 프로그램의 구성원의 생체내 기능적 검증: PTHLH 유전자
이전 분석동안 양성이고 c-MAF의 발현과 직접 상관있는, 전이성 PTHLH 유전자(표 1 및 도 3)는 마우스에서 유방암 전이의 이종이식 실험 모델에서 뼈의 전이성 군락화 실험으로 기능적으로 검증하였다. 전이 과정에 지정되는 후보 유전자를 검증하기 위한 표준 근사치/접근법은 c-MAF를 발현하는 저전이성 세포에서 PTHLH 기능 손실의 샘플이었다. c-MAF 유전자의 발현은 유전자, c-MAF의 낮은 발현도를 나타내는, MCF7, 생체내, 뼈에서 중간 전이성인 세포에서 유도되었다. C-MAF의 과발현은 PTHLH 유전자의 내생성 수준 증가의 원인이었다(도 3). 이 내용에서, 사이토카인 PTHLH의 활성은 길항제 펩티드를 이용해 차단되었다(도 3).
유전자의 형질도입을 위한 과정에서, 렌티바이러스 시스템을 이용해 감염시키고 종양 세포에서 후보 유전자의 발현을 도입하였다. C-MAF 유전자 및 그의 이펙터 PTHLH의 전이를 촉친하는 기능은 마우스에 심실내 접종한 전이성 세포의 생물발광성 영상화를 도입하는 모니터링 기술을 이용해 결정하였다. 모든 경우에서, 빈 렌티바이러스 벡터로 감염된 상응하는 대조군 세포를 비교 목적으로 면역결핍된 래트의 평행한 코호트에 주사하였다(도 3). 용골성 병변의 형성을 위한 능력은 생체내 전이성 병변에서 파골세포의 분화 및 그 과정에서 PTHLH의 일반적 기능으로 평가하였다(도 3).
기능 획득 실험을 비롯하여 임상적 상관성과 관련된 데이터는 c-MAF 유전자에 의해 매개된 골전이의 프로그램의 일부분으로서 그리고 ER+ 유방암 사례의 골전이 과정에서 효과적으로 인과관계있는 표적 유전자 및 예후 마커로서 PTHLH의 역할을 기능적으로 검증하는 것을 가능하게 하였다.
실시예 4
c- MAF 유전자에 의해 매개된 골전이 프로그램의 구성원의 생체내 기능적 검증; RERG 유전자
전이 억제 유전자 RERG는 증식에 연루된다. 이전에 수행된 분석은 RERG 유전자의 발현이 c-MAF의 발현과 역으로 상관있음을 보여주었다(표 2 및 도 2). RERG 유전자는 래트에서 유방암 전이의 이종이식 실험 모델의 뼈에서 전이성 군락화 실험으로 기능적으로 검증하였다.
전이에서 RERG 유전자의 연루는 고도의 전이성 세포에서 기능 획득 실험을 통해 검증하였다. 생체내 선별된 뼈의 고도의 전이성 세포, BoM2에서 RERG의 발현이 유도되었고, 여기서 c-MAF 유전자의 높은 발현도가 나타났고, 이는 RERG의 내생성 수준의 억제를 책임진다(도 2).
유전자 형질도입 과정에서, 렌티바이러스 시스템은 종양 세포에서 후보 유전자의 발현을 감염시키고 도입하기 위해 사용하였다. RERG 억제의 전이를 촉진하는 기능은 마우스에서 심실내 접종된 전이성 세포를 모니터링하기 위한 생물발광 영상법을 이용해 결정하였다. 모든 경우에서, 빈 렌티바이러스 벡터로 감염된 상응하는 대조군 세포를 비교 목적을 위해 면역결핍 래트의 평행한 코호트에 주사하였다(도 2). c-MAF의 손실은 높은 RTRG 발현 및 전이성 세포의 증식 감소와 연관된다(도 2). 높은 수준의 c-MAF를 발현하는, 뼈에 대한 고도의 전이성 세포(BoM2)에서 RERG의 과발현은 뼈에 군락화하는 이들 세포의 능력 감소를 야기한다(도 2). 이러한 감소는 마커 Ki-67에 의해 측정된 증식률의 감소를 수반하였다(도 2).
임상적 상관성과 관련된 데이터를 비롯하여 c-MAF 과발현에서의 기능 획득 실험은 ER+ 유방암 사례에서 골전이 과정과 효과적으로 인과관계인 표적 유전자 및 예후 마커로서 그리고 c-MAF 유전자에 의한 골전이 프로그램의 일부로서 RERG의 역할을 기능적으로 검증하는 것을 가능하게 한다.
실시예 5
c- MAF에 의해 매개되는 뼈 전이 프로그램의 구성원의 생체내 기능적 검증: PODXL 유전자
이전 분석에서 양성이고 c-MAF 발현과 직접 상관있는 PODXL 전이성 유전자(표 1 및 도 4)는 마우스에서 정제한 골수 세포를 기반으로 하는 실험 모델에서 골수로부터 유래된 세포에 대한 부착 실험으로 기능적으로 검증하였다. 이러한 부착 과정은 혈관구조로부터 얻은, 폐의 세포외 매트릭스 유래 단백질 또는 내피 세포를 이용해 반복하면, PODXL 존재 하에 보다 큰 부착이나 c-MAf의 높은 수준이 관찰되기 보다는 상당히 반대인 것을 고려하면 뼈 세포에 대해 특이적이다(도 4). 전이 과정을 지정하는 후보 유전자를 검증하기 위한 표준 추정치는 뼈 또는 내피 세포에서, 고도의 전이성 세포의 기능 손실 실험이다. PODXL 유전자의 발현은, PODXL 유전자의 내생성 수준의 증가를 책임지는 c-MAF 유전자의 높은 발현도를 나타내는, MCF7, 생체내 뼈에서 고도의 전이성 세포에서 감소하였다.
간섭 RNA의 형질도입 과정에서, 종양 세포에서 RNAi의 발현을 감염 및 도입시키기 위한 렌티바이러스 시스템을 사용하였다. PODXL 유전자의 전이를 촉진하는 기능은 골수에서 유래된 세포 또는 내피 세포 층 상에 전이성 세포를 도포하는 형광 영상 기술(기법)을 이용해 결정하였다. 모든 경우에서, 빈 렌티바이러스 벡터로 감염된 상응하는 대조군 세포는 비교 목적을 위해 사용하였다(도 4). 2개의 펩티드를 이용해 인테그린의 활성과 이 과정이 연관되었는지 여부를 평가하였으며, 첫번째 펩티드는 인테그린에 결합하지 않는 반면, 제2 펩티드는 이들과 경쟁하고 세포 부착을 방지하였다. 결론적으로, 이러한 과정에서 PODXL의 일반적 기능은 인테그린을 통한 상호작용을 통해 잠재적으로 검증되었다(도 4).
상관성 데이터를 비룟하여 기능 손실과 관련된 실험은 ER+ 유방암에서 뼈로의 전이 과정에서 일반적인 표적 유전자 및 예후 마커로서 그리고 c-MAF 유전자에 의해 매개되는 뼈로의 전이 프로그램의 일부로서 PODXL의 역할의 기능적 검증을 허용한다.
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Claims (33)

  1. 피험체에서 유방암의 전이를 예측하기 위한 시험관내 방법으로서, 상기 피험체로부터 채취한 종양 조직 샘플에서, 상기 종양 내 c-MAF의 발현도 증가에 반응하여 발현이 조정되는 1 이상의 유전자의 발현도를 결정하는 단계를 포함하고, 기준값에 대한 상기 1 이상의 유전자의 변경된 발현도는 전이가 발생될 고위험성을 나타내는 방법.
  2. 제1항에 있어서, c-MAF의 발현도 증가에 반응하여 발현이 조정되는 상기 1 이상의 유전자는 표 1에 표시된 유전자 및 표 2에 표시된 유전자로 형성된 군에서 선택되고 상기 1 이상의 유전자의 발현도의 조정은 표 1에 표시된 1 이상의 유전자 발현의 증가 및/또는 표 2에 표시된 1 이상의 유전자 발현의 감소인 방법.
  3. 제2항에 있어서, c-MAF의 발현도 증가에 반응하여 발현이 조정되는 상기 유전자는 PTHLH, PODXL 및 RERG의 군에서 선택되는 것인 방법.
  4. 유방암이 발병한 피험체에 대해 맞춤형 요법을 디자인하기 위한 시험관내 방법으로서, 상기 피험체로부터 채취한 종양 조직 샘플에서의 c-MAF의 발현도 증가에 반응하여 발현이 조정되는 1 이상의 유전자의 발현도의 결정을 포함하고, 기준값에 대한 상기 1 이상의 유전자의 변경된 발현도는 상기 피험체가 전이의 예방을 위한 치료를 받는데 적합함을 나타내는 방법.
  5. 제4항에 있어서, c-MAF의 발현도 증가에 반응하여 발현이 조정되는 상기 1 이상의 유전자는 표 1에 포함된 1 이상의 유전자 및/또는 표 2에 표시된 1 이상의 유전자에 의해 형성된 군에서 선택되고, 표 1의 1 이상의 유전자의 발현도의 조정은 발현의 증가를 나타내고/내거나 표 2의 1 이상의 유전자의 발현도의 조정은 발현의 감소를 나타내는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, c-MAF의 발현도 증가에 반응하여 발현이 조정되는 상기 유전자는 PTHLH, PODXL 및 RERG의 군에서 선택되는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 유방암은 ER+ 암 및 삼중-음성 암으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 전이는 골전이인 방법.
  9. 제9항에 있어서, 골전이는 용골성 전이인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, c-MAF의 발현도 증가에 반응하여 발현이 조정되는 상기 1 이상의 유전자의 발현도의 결정은 상기 유전자의 mRNA의 발현도의 결정 동안 수행/발생되는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, c-MAF의 발현도 증가에 반응하여 발현이 조정되는 상기 1 이상의 유전자의 발현도의 결정은 상기 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 발현도의 결정 동안 수행되는 것인 방법.
  12. 유방암의 전이의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조를 위한 유전자의 발현 또는 상기 유전자의 발현 생성물의 활성을 억제하는 제제의 용도로서, 상기 유전자는 유방암 종양 세포에서의 발현이 상기 세포에서 c-MAF의 발현도 증가에 반응하여 증가되거나 또는 상기 세포에서 c-MAF의 발현도 감소에 반응하여 감소되는 것으로 인해 특성화되는 용도.
  13. 제12항에 있어서, 유전자의 발현을 억제하는 제제는 상기 유전자에 특이적인 RNAip, 상기 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, 상기 유전자에 특이적인 리보자임에서 선택되거나, 또는 상기 유전자의 발현 생성물의 활성을 억제하는 제제는 상기 발현 생성물에 특이적인 억제 항체, 상기 발현 생성물의 우성-음성 변이체 및 상기 발현 생성물 유래의 억제 펩티드로 형성된 군에서 선택되는 것인 용도.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 유방 종양에서 c-MAF의 발현도 증가에 반응하여 발현이 증가되거나 또는 유방 종양에서 c-MAF의 발현도 감소에 반응하여 발현이 감소되는 유전자는 표 1에 기술된 유전자에서 선택되는 것인 용도.
  15. 제14항에 있어서, 유방 종양에서 c-MAF의 발현도 증가에 반응하여 발현이 증가되는 유전자는 PHTLH 유전자 또는 PODXL 유전자인 용도.
  16. 유방암의 전이의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조를 위한 유전자의 발현 또는 상기 유전자의 발현 생성물의 활성을 자극하는 제제의 용도로서, 상기 유전자는 유방암 종양 세포에서의 발현이 상기 세포에서 c-MAF의 발현도 증가에 반응하여 감소되거나 또는 발현이 상기 세포에서 c-MAF의 발현도 감소에 반응하여 발현이 증가되는 것으로 인해 특성화되는 것인 용도.
  17. 제16항에 있어서, 상기 유전자의 발현을 자극하는 제제는 상기 유전자의 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이거나 또는 상기 유전자의 생성물의 활성을 자극하는 제제는 상기 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드인 용도.
  18. 제17항에 있어서, 유방 종양에서 c-MAF 발현도 증가에 반응하여 발현이 감소되거나 또는 유방 종양에서 c-MAF 발현도 감소에 반응하여 발현이 증가되는 유전자는 표 2에 기술된 유전자에서 선택되는 것인 용도.
  19. 제18항에 있어서, 유방 종양에서 c-MAF 발현도 증가에 반응하여 발현이 감소되는 유전자는 RERG 유전자인 용도.
  20. 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 유방암은 ER+ 암 및 삼중 음성 암으로 형성된 군에서 선택되는 것인 용도.
  21. 제12항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 전이는 골전이인 용도.
  22. 제21항에 있어서, 골전이는 용골성 전이인 용도.
  23. 유방암을 앓는 피험체에서 전이 경향에 대한 유전자 마커를 동정하기 위한 시험관내 방법으로서,
    (i) 유방암 원발성 종양 샘플에서 후보 유전자 및 c-MAF의 발현도를 결정하는 단계, 및
    (ii) c-MAF 유전자의 발현에 대한 조정에 반응하는 유방암 세포 개체군 내 상기 유전자의 발현도의 변화를 결정하는 단계
    를 포함하고,
    여기서 상기 유전자의 발현도가 유방암 원발성 종양 샘플에서 c-MAF의 발현과 통계적으로 유의하게 상관되고 c-MAF 유전자 발현의 조정에 반응하는 발현도의 변화가 상기 유전자의 수준 변화와 통계적으로 유의하게 상관되는 경우, 이는 상기 유전자가 피험체에서 전이 경향에 대한 마커임을 나타내는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 단계 (i)에서 결정된 소정 유전자의 발현이 원발성 종양 샘플에서 c-MAF의 수준과 직접적으로 상관되고, c-MAF 유전자 발현의 조정에 반응하는 발현도의 변화가 상기 조정과 직접적으로 상관되는 경우, 이는 높은 수준의 상기 유전자가 전이 경향을 나타냄을 가리키는 것인 방법.
  25. 제23항에 있어서, 단계 (i)에서 결정된 소정 유전자의 발현이 원발성 종양 샘플에서 c-MAF의 수준과 역으로 상관되고, c-MAF 유전자 발현의 조정에 반응하는 발현도의 변화가 상기 조정과 역으로 상관되는 경우, 이는 상기 유전자의 감소된 수준이 전이 경향을 나타냄을 가리키는 것인 방법.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, c-MAF 발현의 조정은 발현의 증가인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 발현의 증가는 c-MAF 단형 이소폼 및/또는 장형 이소폼의 세포 개체군에서의 발현에 의해 수행되는 것인 방법.
  28. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, c-MAF 발현도의 조정은 발현의 감소인 방법.
  29. 제28항에 있어서, c-MAF 단형 이소폼 및/또는 c-MAF 장형 이소폼 발현은 감소되는 것인 방법.
  30. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 유방암 세포 및/또는 원발성 종양은 ER+ 또는 삼중 음성인 방법.
  31. 제23항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 전이는 골전이인 방법.
  32. 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 유방암 세포는 확립된 세포주 유래인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 확립된 세포주는 MCF7 세포주인 방법.
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