KR20150119210A - Combination of an egfr t790m inhibitor and an egfr inhibitor for the treatment of non-small cell lung cancer - Google Patents

Combination of an egfr t790m inhibitor and an egfr inhibitor for the treatment of non-small cell lung cancer Download PDF

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KR20150119210A
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acceptable salt
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젤란나 아이리스 골드베르그
존 찰스 케이트
스티븐 폴 레트렌트
스코트 로렌스 웨인리치
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화이자 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 EGFR T790M 억제제를 적은 투여량의 panHER 억제제와 조합하여 투여함으로써 비소세포 폐암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 비가역성 EGFR T790M 억제제를 EGFR 억제제와 조합하여 투여함으로써 비소세포 폐암을 치료하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method of treating non-small cell lung cancer by administering an EGFR T790M inhibitor in combination with a small dose of a panHER inhibitor. The present invention also relates to a method of treating non-small cell lung cancer by administering an irreversible EGFR T790M inhibitor in combination with an EGFR inhibitor.

Description

비소세포 폐암의 치료를 위한 EGFR T790M 억제제와 EGFR 억제제의 조합{COMBINATION OF AN EGFR T790M INHIBITOR AND AN EGFR INHIBITOR FOR THE TREATMENT OF NON-SMALL CELL LUNG CANCER}FIELD OF THE INVENTION [0001] The present invention relates to a combination of an EGFR T790M inhibitor and an EGFR inhibitor for the treatment of non-small cell lung cancer.

본 발명은 EGFR T790M 억제제를 적은 투여량의 panHER 억제제와 조합하여 투여함으로써 비소세포 폐암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 비가역성 EGFR T790M 억제제를 EGFR 억제제와 조합하여 투여함으로서 비소세포 폐암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method of treating non-small cell lung cancer by administering an EGFR T790M inhibitor in combination with a small dose of a panHER inhibitor. The present invention also relates to a method of treating non-small cell lung cancer by administering an irreversible EGFR T790M inhibitor in combination with an EGFR inhibitor.

비소세포 폐암은 전 세계적으로 암 사망의 주요 원인이며 매년 약 140 만명의 새로운 환자가 진단된다. 비소세포 폐암의 가장 흔한 형태인 폐 선암에서, 표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 돌연변이를 가진 환자는 전체 인구의 10 내지 30%를 차지한다. 이는 EGFR 억제제, 예컨대 에를로티닙 또는 게피티닙이 가장 효과적일 수 있는 환자의 부분이다(Paez et al., Science 2004; Lynch et al., NEJM 2004; Pao et al., PNAS 2004). 이러한 억제제에 대한 우수한 반응과 관련된 가장 통상의 활성화 돌연변이는 엑손 19 내에서의 결실(예컨대 E746-A750) 및 활성화 루프에서의 점 돌연변이(엑손 21, 특히 L858R)이다. 현재까지 적은 정도로 확인된 추가 체세포 돌연변이는 점 돌연변이, 즉 G719S, G719C, G719A, L861 및 엑손 20에서의 작은 삽입을 포함한다(Shigematsu et al., JNCI 2005; Fukuoka et al., JCO 2003; Kris et al., JAMA 2003; Shepherd et al., NEJM 2004). Non-small cell lung cancer is a major cause of cancer death worldwide, with approximately 1.4 million new cases diagnosed each year. In lung cancer, the most common form of non-small cell lung cancer, patients with mutations in the epidermal growth factor receptor (EGFR) account for 10-30% of the population. This is part of the patient where EGFR inhibitors such as erlotinib or gefitinib may be most effective (Paez et al., Science 2004; Lynch et al., NEJM 2004; Pao et al., PNAS 2004). The most common active mutations associated with an excellent response to such inhibitors are deletion in exon 19 (e.g., E746-A750) and point mutation in the activation loop (exon 21, particularly L858R). Additional somatic mutations identified to date to date include small insertions in point mutations, G719S, G719C, G719A, L861 and exon 20 (Shigematsu et al., JNCI 2005; Fukuoka et al., JCO 2003; Kris et al., JAMA 2003; Shepherd et al., NEJM 2004).

이러한 제제는 EGFR 돌연변이체 하위개체에 대하여 효과적인 치료일 수 있지만, 초기에 반응하는 대다수의 환자는 내성이 발달된다. 약 50%의 환자에서 발견된 내성의 1차 기전은 게이트키퍼 트레오닌 잔기에서 발생하는 2차 돌연변이(T790M)에 기인한다(Kosaka et al., CCR 2006; Balak et al., CCR 2006; Engelman et al., Science 2007). While such agents may be effective treatments for EGFR mutant subpopulations, the majority of patients who respond early will develop resistance. The primary mechanism of tolerance found in approximately 50% of patients is due to a second mutation (T790M) occurring in the gatekeeper threonine residue (Kosaka et al., 2006; Balak et al., CCR 2006; Engelman et al ., Science 2007).

비소세포 폐암의 치료에 대한 개선된 요법은 크게 충족되지 않은 의료 요구를 포함하고, 치료 결과를 개선하기 위한 신규한 조합 양생법의 검증을 필요로 한다.
Improved therapy for the treatment of non-small cell lung cancer involves a medical requirement that is largely unmet, and requires verification of a novel combination curing regimen to improve treatment outcomes.

하기 각각의 실시양태는 조합된 실시양태와 모순되지 않는 본원에 기재된 임의의 다른 실시양태와 조합될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 각각의 실시양태는 그의 범주 내에서 본원에 기재된 화합물의 약학적으로 허용되는 염을 구상한다. 따라서, 어구 "또는 이의 약학적으로 허용되는 염"은 본원에 기재된 모든 화합물의 설명에 내포된다. Each of the following embodiments may be combined with any of the other embodiments described herein that are not inconsistent with the combination embodiment. In addition, each of the embodiments described herein encompasses within its scope a pharmaceutically acceptable salt of a compound described herein. Thus, the phrase "or a pharmaceutically acceptable salt thereof" is included in the description of all compounds described herein.

본원에 기재된 일부 실시양태는 비가역성 EGFR T790M 억제제의 효과량을 EGFR 억제제의 효과량과 조합하여 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하는 비소세포 폐암의 치료 방법에 관한 것이다.Some embodiments described herein relate to methods of treating non-small cell lung cancer, comprising administering an effective amount of an irreversible EGFR T790M inhibitor in combination with an effective amount of an EGFR inhibitor to a patient in need thereof.

본 발명의 방법의 추가 실시양태에서, 비가역성 EGFR T790M 억제제는 1-{(3R,4R)-3-[({5-클로로-2-[(1-메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}옥시)메틸]-4-메톡시피롤리딘-1-일}프로프-2-엔-1-온 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In a further embodiment of the method of the invention, the irreversible EGFR T790M inhibitor is 1 - {(3R, 4R) -3 - [({5-chloro- Amino] -7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-4-yl} oxy) methyl] -4-methoxypyrrolidin- 1 -yl} prop- It is an acceptable salt.

본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 비가역성 EGFR T790M 억제제는 N-메틸-N-[트랜스-3-({2-[(1-메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-5-(피리딘-2-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}옥시)사이클로부틸]프로프-2-엔아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In some embodiments of the methods of the invention, the irreversible EGFR T790M inhibitor is selected from the group consisting of N-methyl-N- [trans-3 - ({2- [ (Pyridin-2-yl) -7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-4- yl} oxy) cyclobutyl] prop- 2-enamide or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 비가역성 EGFR T790M 억제제는 N-[트랜스-3-({5-클로로-2-[(1,3-다이메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}아미노)사이클로부틸]-N-메틸프로프-2-엔아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In certain embodiments of the methods of the invention, the irreversible EGFR T790M inhibitor is N- [trans-3- ({5-chloro-2- [ -7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-4-yl} amino) cyclobutyl] -N-methylprop-2-enamide or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 추가 실시양태에서, 비가역성 EGFR T790M 억제제는 1-{(3R,4R)-3-[({5-클로로-2-[(3-메톡시-1-메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}옥시)메틸]-4-메톡시피롤리딘-1-일}프로프-2-엔-1-온 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In a further embodiment of the method of the invention, the irreversible EGFR T790M inhibitor is selected from the group consisting of: 1 - {(3R, 4R) -3 - [({5-chloro-2- [ Yl) amino] -7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-4- yl} oxy) methyl] -4- methoxypyrrolidin- -On or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 실시양태에서, EGFR 억제제는 게피티닙, 에를로티닙, 이코티닙, 반데타닙, 라파티닙, 네라티닙, 아파티닙, 페리티닙, 다코미티닙, 카네르티닙, 세툭시맙 및 파니투무맙으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In an embodiment of the method of the invention, the EGFR inhibitor is selected from the group consisting of gefitinib, erlotinib, icocidinib, vandetanib, lapatinib, neratib, apatinate, peritinib, dacomitinib, And panitumum, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 추가 실시양태에서, EGFR 억제제는 게피티닙, 에를로티닙, 이코티닙, 반데타닙, 라파티닙, 네라티닙, 아파티닙, 페리티닙, 다코미티닙 및 카네르티닙으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In a further embodiment of the method of the invention, the EGFR inhibitor is selected from the group consisting of gefitinib, erlotinib, icocidin, vandetanib, lapatinib, neratib, apatinate, peritinib, ≪ / RTI > or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, EGFR 억제제는 게피티닙, 에를로티닙, 아파티닙 및 다코미티닙으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In some embodiments of the methods of the invention, the EGFR inhibitor is selected from the group consisting of gefitinib, erlotinib, apatinate, and docomitinib, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, EGFR 억제제는 게피티닙 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In certain embodiments of the methods of the invention, the EGFR inhibitor is gefitinib or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, EGFR 억제제는 에를로티닙 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In some embodiments of the methods of the invention, the EGFR inhibitor is erlotinib or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 실시양태에서, EGFR 억제제는 아파티닙 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In an embodiment of the method of the present invention, the EGFR inhibitor is apatinate or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, EGFR 억제제는 다코미티닙 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In some embodiments of the methods of the invention, the EGFR inhibitor is < RTI ID = 0.0 > Dakomitinib < / RTI > or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 추가 실시양태에서, EGFR 억제제는 가역성 EGFR 억제제이다.In a further embodiment of the method of the invention, the EGFR inhibitor is a reversible EGFR inhibitor.

본 발명의 방법의 추가 실시양태에서, 가역성 EGFR 억제제는 게피티닙, 에를로티닙, 이코티닙, 반데타닙 및 라파티닙으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In a further embodiment of the method of the present invention, the reversible EGFR inhibitor is selected from the group consisting of gefitinib, erlotinib, icocidinib, vanadatumib and lapatinib, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 실시양태에서, 가역성 EGFR 억제제는 게피티닙 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In an embodiment of the method of the invention, the reversible EGFR inhibitor is gefitinib or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 추가 실시양태에서, 가역성 EGFR 억제제는 에를로티닙 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다. In a further embodiment of the method of the invention, the reversible EGFR inhibitor is erlotinib or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 추가 실시양태에서, EGFR 억제제는 비가역성 EGFR 억제제이다.In a further embodiment of the method of the invention, the EGFR inhibitor is an irreversible EGFR inhibitor.

본 발명의 방법의 실시양태에서, 비가역성 EGFR 억제제는 네라티닙, 아파티닙, 페리티닙, 다코미티닙 및 카네르티닙으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In an embodiment of the method of the invention, the irreversible EGFR inhibitor is selected from the group consisting of neratib, apatinate, ferritinib, dakomitinib and caneritib, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 추가 실시양태에서, 비가역성 EGFR 억제제는 아파티닙 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In a further embodiment of the method of the present invention, the irreversible EGFR inhibitor is apatinate or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 비가역성 EGFR 억제제는 다코미티닙 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In some embodiments of the methods of the invention, the irreversible EGFR inhibitor is Dakomitimin or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 일부 실시양태는 EGFR T790M 억제제의 효과량을 panHER 억제제와 조합하여 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하는 비소세포 폐암을 치료하는 방법에 관한 것이고, 이때 panHER 억제제는 비표준 임상 투여 양생법에 따라 투여된다.Some embodiments of the invention are directed to methods of treating non-small cell lung cancer comprising administering to a patient in need thereof an effective amount of an EGFR T790M inhibitor in combination with a panHER inhibitor, wherein the panHER inhibitor is administered in a non- Lt; / RTI >

본 발명의 방법의 추가 실시양태에서, 비표준 임상 투여 양생법은 비표준 임상 투여량 또는 비표준 투여 일정이다.In a further embodiment of the method of the invention, the non-standard clinical dosage regimen is a non-standard clinical dose or a non-standard dose schedule.

본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 비표준 임상 투여 양생법은 적은 투여량의 panHER 억제제이다.In some embodiments of the methods of the invention, the non-standard clinical dose regimen is a low dose panHER inhibitor.

본 발명의 방법의 실시양태에서, 비표준 임상 투여 양생법은 간헐적인 투여 양생법이다.In an embodiment of the method of the invention, the non-standard clinical administration regimen is an intermittent administration regimen.

본 발명의 방법의 추가 실시양태에서, EGFR T790M 억제제는 Go6976, PKC412, AP26113, HM61713, WZ4002, CO-1686 및 TAS-2913으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In a further embodiment of the method of the invention, the EGFR T790M inhibitor is selected from the group consisting of Go6976, PKC412, AP26113, HM61713, WZ4002, CO-1686 and TAS-2913 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 추가 실시양태에서, EGFR T790M 억제제는 1-{(3R,4R)-3-[({5-클로로-2-[(1-메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}옥시)메틸]-4-메톡시피롤리딘-1-일}프로프-2-엔-1-온 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In a further embodiment of the method of the invention, the EGFR T790M inhibitor is selected from the group consisting of: 1 - {(3R, 4R) -3 - [({5-chloro- Methyl] -4-methoxypyrrolidin-1-yl} prop-2-en-1-one or its pharmacological ≪ / RTI >

본 발명의 방법의 실시양태에서, EGFR T790M 억제제는 N-메틸-N-[트랜스-3-({2-[(1-메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-5-(피리딘-2-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}옥시)사이클로부틸]프로프-2-엔아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In an embodiment of the method of the present invention, the EGFR T790M inhibitor is selected from the group consisting of N-methyl-N- [trans-3 - ({2 - [(1-methyl-1H-pyrazol- Yl) -7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-4-yl} oxy) cyclobutyl] prop-2- enamide or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 추가 실시양태에서, EGFR T790M 억제제는 N-[트랜스-3-({5-클로로-2-[(1,3-다이메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}아미노)사이클로부틸]-N-메틸프로프-2-엔아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In a further embodiment of the method of the invention, the EGFR T790M inhibitor is N- [trans-3- ({5-chloro-2- [ 7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-4-yl} amino) cyclobutyl] -N-methylprop-2-enamide or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 추가 실시양태에서, EGFR T790M 억제제는 1-{(3R,4R)-3-[({5-클로로-2-[(3-메톡시-1-메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}옥시)메틸]-4-메톡시피롤리딘-1-일}프로프-2-엔-1-온 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In a further embodiment of the method of the invention, the EGFR T790M inhibitor is selected from the group consisting of: 1 - {(3R, 4R) -3 - [({5-chloro-2- [ Methoxypyrrolidin-1-yl} prop-2-en-1-yl) amino] -7H-pyrrolo [2,3- d] pyrimidin- Or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, panHER 억제제는 라파티닙, 네라티닙, 아파티닙, 페리티닙, 다코미티닙 및 카네르티닙으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In some embodiments of the methods of the present invention, the panHER inhibitor is selected from the group consisting of lapatinib, neratinib, apatinate, peritinib, dakomitinib and carnertinib, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, panHER 억제제는 라파티닙, 네라티닙, 아파티닙, 페리티닙, 다코미티닙 및 카네르티닙으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In certain embodiments of the methods of the present invention, the panHER inhibitor is selected from the group consisting of lapatinib, neratinib, apatinate, peritinib, dakomitinib and carnertinib, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 추가 실시양태에서, panHER 억제제는 아파티닙 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In a further embodiment of the method of the invention, the panHER inhibitor is apatinate or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 실시양태에서, panHER 억제제는 다코미티닙 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In an embodiment of the method of the present invention, the panHER inhibitor is dacomitimib or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 추가 실시양태에서, panHER 억제제는 비가역성 EGFR 억제제이다.In a further embodiment of the method of the invention, the panHER inhibitor is an irreversible EGFR inhibitor.

본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 비가역성 panHER 억제제는 네라티닙, 아파티닙, 페리티닙, 다코미티닙 및 카네르티닙으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In certain embodiments of the methods of the invention, the irreversible panHER inhibitor is selected from the group consisting of neratib, apatinate, peritinib, dakomitinib and caneritib, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 실시양태에서, 비가역성 panHER 억제제는 아파티닙 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In an embodiment of the method of the invention, the irreversible panHER inhibitor is apatinate or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 비가역성 panHER 억제제는 다코미티닙 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In some embodiments of the methods of the invention, the irreversible panHER inhibitor is DakoMitinib or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 특정 실시양태는 EGFR T790M 억제제를 EGFR 억제제와 조합하여 상승적인 양으로 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하는 비소세포 폐암을 치료하는 방법에 관한 것이다.Certain embodiments of the invention are directed to methods of treating non-small cell lung cancer, comprising administering to a patient in need thereof in a synergistic amount, an EGFR T790M inhibitor in combination with an EGFR inhibitor.

본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, EGFR T790M 억제제는 Go6976, PKC412, AP26113, HM61713, WZ4002, CO-1686 및 TAS-2913으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In some embodiments of the methods of the invention, the EGFR T790M inhibitor is selected from the group consisting of Go6976, PKC412, AP26113, HM61713, WZ4002, CO-1686 and TAS-2913 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 추가 실시양태에서, EGFR T790M 억제제는 1-{(3R,4R)-3-[({5-클로로-2-[(1-메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}옥시)메틸]-4-메톡시피롤리딘-1-일}프로프-2-엔-1-온 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In a further embodiment of the method of the invention, the EGFR T790M inhibitor is selected from the group consisting of: 1 - {(3R, 4R) -3 - [({5-chloro- Methyl] -4-methoxypyrrolidin-1-yl} prop-2-en-1-one or its pharmacological ≪ / RTI >

본 발명의 방법의 실시양태에서, EGFR T790M 억제제는 N-메틸-N-[트랜스-3-({2-[(1-메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-5-(피리딘-2-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}옥시)사이클로부틸]프로프-2-엔아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In an embodiment of the method of the present invention, the EGFR T790M inhibitor is selected from the group consisting of N-methyl-N- [trans-3 - ({2 - [(1-methyl-1H-pyrazol- Yl) -7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-4-yl} oxy) cyclobutyl] prop-2- enamide or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, EGFR T790M 억제제는 N-[트랜스-3-({5-클로로-2-[(1,3-다이메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}아미노)사이클로부틸]-N-메틸프로프-2-엔아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In certain embodiments of the methods of the invention, the EGFR T790M inhibitor is N- [trans-3- ({5-chloro-2- [ 7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-4-yl} amino) cyclobutyl] -N-methylprop-2-enamide or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, EGFR T790M 억제제는 1-{(3R,4R)-3-[({5-클로로-2-[(3-메톡시-1-메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}옥시)메틸]-4-메톡시피롤리딘-1-일}프로프-2-엔-1-온 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In some embodiments of the methods of the invention, the EGFR T790M inhibitor is selected from the group consisting of: 1 - {(3R, 4R) -3 - [({5-Chloro-2- (3-methoxy- Methoxypyrrolidin-1-yl} prop-2-en-1-yl) amino] -7H-pyrrolo [2,3- d] pyrimidin- Or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 추가 실시양태에서, EGFR 억제제는 게피티닙, 에를로티닙, 이코티닙, 반데타닙, 라파티닙, 네라티닙, 아파티닙, 페리티닙, 다코미티닙, 카네르티닙, 세툭시맙 및 파니투무맙으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In a further embodiment of the method of the invention the EGFR inhibitor is selected from the group consisting of gefitinib, erlotinib, icocidinib, vandetanib, lapatinib, neratib, apatinate, peritinib, dakomitinib, Gt; and < / RTI > pharmaceutically acceptable salts thereof.

본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, EGFR 억제제는 게피티닙, 에를로티닙, 이코티닙, 반데타닙, 라파티닙, 네라티닙, 아파티닙, 페리티닙, 다코미티닙 및 카네르티닙으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In some embodiments of the methods of the present invention, the EGFR inhibitor is selected from the group consisting of gefitinib, erlotinib, icocitin, vandetanib, lapatinib, neratib, apatinate, peritinib, ≪ / RTI > or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, EGFR 억제제는 게피티닙, 에를로티닙, 아파티닙 및 다코미티닙으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In certain embodiments of the methods of the invention, the EGFR inhibitor is selected from the group consisting of gefitinib, erlotinib, apatinate, and dacomitinib, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, EGFR 억제제는 게피티닙 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In some embodiments of the methods of the invention, the EGFR inhibitor is gefitinib or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 실시양태에서, EGFR 억제제는 에를로티닙 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In an embodiment of the method of the invention, the EGFR inhibitor is erlotinib or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, EGFR 억제제는 panHER 억제제이다.In some embodiments of the methods of the invention, the EGFR inhibitor is a panHER inhibitor.

본 발명의 방법의 추가 실시양태에서, panHER 억제제는 라파티닙, 네라티닙, 아파티닙, 페리티닙, 다코미티닙 및 카네르티닙으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In a further embodiment of the method of the invention, the panHER inhibitor is selected from the group consisting of lapatinib, neratinib, apatinate, peritinib, dakomitinib and carnertinib, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 실시양태에서, panHER 억제제는 라파티닙, 네라티닙, 아파티닙, 페리티닙, 다코미티닙 및 카네르티닙으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In an embodiment of the method of the present invention, the panHER inhibitor is selected from the group consisting of lapatinib, neratinib, apatinate, peritinib, dakomitinib and carnertinib, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, panHER 억제제는 아파티닙 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In some embodiments of the methods of the present invention, the panHER inhibitor is apatinate or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 추가 실시양태에서, panHER 억제제는 다코미티닙 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In a further embodiment of the method of the invention, the panHER inhibitor is dacomitinib or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 추가 실시양태에서, panHER 억제제는 비가역성 EGFR 억제제이다.In a further embodiment of the method of the invention, the panHER inhibitor is an irreversible EGFR inhibitor.

본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 비가역성 panHER 억제제는 네라티닙, 아파티닙, 페리티닙, 다코미티닙 및 카네르티닙으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In some embodiments of the methods of the invention, the irreversible panHER inhibitor is selected from the group consisting of neratib, apatinate, peritinib, dakomitinib, and caneritinib, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 실시양태에서, 비가역성 panHER 억제제는 아파티닙 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In an embodiment of the method of the invention, the irreversible panHER inhibitor is apatinate or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 비가역성 panHER 억제제는 다코미티닙 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In certain embodiments of the methods of the invention, the irreversible panHER inhibitor is DakoMitinib or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 일부 실시양태는 (a) EGFR T790M 억제제; 및 (b) EGFR 억제제의 상승적인 조합에 관한 것이고, 이때 성분 (a) 및 성분 (b)는 상승적이다.Some embodiments of the invention comprise (a) an EGFR T790M inhibitor; And (b) a synergistic combination of an EGFR inhibitor, wherein component (a) and component (b) are synergistic.

본 발명의 조합의 일부 실시양태에서, EGFR T790M 억제제는 Go6976, PKC412, AP26113, HM61713, WZ4002, CO-1686 및 TAS-2913으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In some embodiments of the combination of the present invention, the EGFR T790M inhibitor is selected from the group consisting of Go6976, PKC412, AP26113, HM61713, WZ4002, CO-1686 and TAS-2913 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 조합의 추가 실시양태에서, EGFR T790M 억제제는 1-{(3R,4R)-3-[({5-클로로-2-[(1-메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}옥시)메틸]-4-메톡시피롤리딘-1-일}프로프-2-엔-1-온 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In a further embodiment of the combination of the present invention, the EGFR T790M inhibitor is selected from the group consisting of 1 - {(3R, 4R) -3 - [({5-chloro- Methyl] -4-methoxypyrrolidin-1-yl} prop-2-en-1-one or its pharmacological ≪ / RTI >

본 발명의 조합의 실시양태에서, EGFR T790M 억제제는 N-메틸-N-[트랜스-3-({2-[(1-메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-5-(피리딘-2-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}옥시)사이클로부틸]프로프-2-엔아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In an embodiment of the combination of the present invention, the EGFR T790M inhibitor is selected from the group consisting of N-methyl-N- [trans-3 - ({2- [ Yl) -7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-4-yl} oxy) cyclobutyl] prop-2- enamide or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 조합의 추가 실시양태에서, EGFR T790M 억제제는 N-[트랜스-3-({5-클로로-2-[(1,3-다이메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}아미노)사이클로부틸]-N-메틸프로프-2-엔아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In a further embodiment of the combination of the present invention, the EGFR T790M inhibitor is N- [trans-3- ({5-chloro-2- [ 7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-4-yl} amino) cyclobutyl] -N-methylprop-2-enamide or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 조합의 일부 실시양태에서, EGFR T790M 억제제는 1-{(3R,4R)-3-[({5-클로로-2-[(3-메톡시-1-메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}옥시)메틸]-4-메톡시피롤리딘-1-일}프로프-2-엔-1-온 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In some embodiments of the combination of the present invention, the EGFR T790M inhibitor is selected from the group consisting of: 1 - {(3R, 4R) -3 - [({5-chloro- Methoxypyrrolidin-1-yl} prop-2-en-1-yl) amino] -7H-pyrrolo [2,3- d] pyrimidin- Or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 조합의 일부 실시양태에서, EGFR 억제제는 게피티닙, 에를로티닙, 이코티닙, 반데타닙, 라파티닙, 네라티닙, 아파티닙, 페리티닙, 다코미티닙, 카네르티닙, 세툭시맙 및 파니투무맙으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In some embodiments of the combination of the present invention, the EGFR inhibitor is selected from the group consisting of gefitinib, erlotinib, icocidinib, vandetanib, lapatinib, neratib, apatinate, peritinib, dakomitinib, Gt; and < / RTI > pharmaceutically acceptable salts thereof.

본 발명의 조합의 실시양태에서, EGFR 억제제는 게피티닙, 에를로티닙, 이코티닙, 반데타닙, 라파티닙, 네라티닙, 아파티닙, 페리티닙, 다코미티닙 및 카네르티닙으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In an embodiment of the combination of the present invention, the EGFR inhibitor is selected from the group consisting of gefitinib, erlotinib, icocitin, vandetanib, lapatinib, neratib, apatinate, peritinib, dakomitinib and caneritinib Or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 조합의 실시양태에서, EGFR 억제제는 게피티닙, 에를로티닙, 아파티닙 및 다코미티닙으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In an embodiment of the combination of the present invention, the EGFR inhibitor is selected from the group consisting of gefitinib, erlotinib, apatinate, and docomitinib, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 조합의 특정 실시양태에서, EGFR 억제제는 게피티닙 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In certain embodiments of the combination of the present invention, the EGFR inhibitor is gefitinib or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 조합의 추가 실시양태에서, EGFR 억제제는 에를로티닙 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In a further embodiment of the combination of the present invention, the EGFR inhibitor is erlotinib or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 조합의 일부 실시양태에서, EGFR 억제제는 panHER 억제제이다.In some embodiments of the combination of the present invention, the EGFR inhibitor is a panHER inhibitor.

본 발명의 조합의 추가 실시양태에서, panHER 억제제는 라파티닙, 네라티닙, 아파티닙, 페리티닙, 다코미티닙 및 카네르티닙으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In a further embodiment of the combination of the present invention, the panHER inhibitor is selected from the group consisting of lapatinib, neratinib, apatinate, ferritinib, dakomitinib and carnertinib, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 조합의 추가 실시양태에서, panHER 억제제는 라파티닙, 네라티닙, 아파티닙, 페리티닙, 다코미티닙 및 카네르티닙으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In a further embodiment of the combination of the present invention, the panHER inhibitor is selected from the group consisting of lapatinib, neratinib, apatinate, ferritinib, dakomitinib and carnertinib, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 조합의 실시양태에서, panHER 억제제는 아파티닙 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In an embodiment of the combination of the present invention, the panHER inhibitor is apatinate or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 조합의 일부 실시양태에서, panHER 억제제는 다코미티닙 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In some embodiments of the combination of the present invention, the panHER inhibitor is DakoMitinib or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 조합의 실시양태에서, panHER 억제제는 비가역성 EGFR 억제제이다.In an embodiment of the combination of the present invention, the panHER inhibitor is an irreversible EGFR inhibitor.

본 발명의 조합의 추가 실시양태에서, 비가역성 panHER 억제제는 네라티닙, 아파티닙, 페리티닙, 다코미티닙 및 카네르티닙으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In a further embodiment of the combination of the present invention, the irreversible panHER inhibitor is selected from the group consisting of neratinib, apatinate, peritinib, dakomitinib and carnertinib, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 조합의 일부 실시양태에서, 비가역성 panHER 억제제는 아파티닙 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.In some embodiments of the combination of the present invention, the irreversible panHER inhibitor is apatinate or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 조합의 실시양태에서, 비가역성 panHER 억제제는 다코미티닙 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.
In an embodiment of the combination of the present invention, the irreversible panHER inhibitor is dacomitinib or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

도 1은 총 EGFR 대립유전자에 대하여 캐스트PCR 정량화된 EGFR T790M 대립유전자를 나타내는 백분율과 함께 RPC9 클론 3 및 클론 6에서 C>T EGFR T790M 돌연변이가 확인된 생거(Sanger) 서열결정을 도시한다.
도 2는 다코미티닙(도 2A) 또는 에를로티닙(도 2B)의 다양한 농도로 처리된 PC9 및 RPC9 클론 3 및 6에 대한 세포 생존력 분석시 용량 반응 곡선을 도시한다.
도 3은 RPC9 클론 6 세포 생존력 분석시 용량 반응 곡선을 도시한다. 도 3A는 화합물 A(화합물 A) 및 다코미티닙(daco) 단독 및 조합의 용량 반응 곡선을 도시한다. 도 3B는 화합물 A 및 에를로티닙(erlo) 단독 및 조합의 용량 반응 곡선을 도시한다. 도 3C는 단일 제제로서 화합물 A의 선택된 농도, 및 다코미티닙 및 에를로티닙과 조합시 선택된 농도에서 억제(%)를 도시한다.
도 4는 RPC9 클론 6 세포 생존력 분석시 용량 반응 곡선을 도시한다. 도 4A는 화합물 B(화합물 B) 및 다코미티닙(daco) 단독 및 조합의 용량 반응 곡선을 도시한다. 도 4B는 화합물 B 및 에를로티닙(erlo) 단독 및 조합의 용량 반응 곡선을 도시한다. 도 4C는 단일 제제로서 화합물 B의 선택된 농도, 및 다코미티닙 및 에를로티닙과 조합시 선택된 농도에서 억제(%)를 도시한다.
도 5는 RPC9 클론 6 세포 생존력 분석시 용량 반응 곡선을 도시한다. 도 5A는 화합물 A(화합물 A) 단독 및 다코미티닙(daco)과 조합시 용량 반응 곡선을 도시한다. 도 5B는 화합물 A 단독 및 게피티닙(gefi)과 조합시 용량 반응 곡선을 도시한다. 도 5C는 화합물 A 단독 및 아파티닙(afat)과 조합시 용량 반응 곡선을 도시한다. 도 5D는 단일 제제로서 화합물 A의 선택된 농도, 및 다코미티닙, 게피티닙 및 아파티닙과 조합시 선택된 농도에서 억제(%)를 도시한다.
도 6은 RPC9 클론 6 세포 생존력 분석시 용량 반응 곡선을 도시한다. 도 6A는 화합물 B(화합물 B) 단독 및 다코미티닙(daco)과 조합시 용량 반응 곡선을 도시한다. 도 6B는 화합물 B 단독 및 게피티닙(gefi)과 조합시 용량 반응 곡선을 도시한다. 도 6C는 화합물 B 단독 및 아파티닙(afat)과 조합시 용량 반응 곡선을 도시한다. 도 4D는 단일 제제로서 화합물 B의 선택된 농도, 및 다코미티닙, 게피티닙 및 아파티닙과 조합시 선택된 농도에서 억제(%)를 도시한다.
도 7은 RPC9 클론 6 세포에서 EGFR, AKT 및 ERK의 인산화 수준의 웨스턴 면역블롯(Western Immunoblot)을 도시한다. GAPDH를 단백질 로딩 대조군으로서 포함하였다. 도 7A는 DMSO, 다코미티닙, 화합물 A, 또는 다코미티닙 + 화합물 A(화합물 A)을 조합하여 처리된 RPC9 클론 6 세포를 도시한다. 도 7B는 DMSO, 에를로티닙, 화합물 A, 또는 에를로티닙 + 화합물 A(화합물 A)을 조합하여 처리된 RPC9 클론 6 세포를 도시한다.
도 8은 DMSO, 다코미티닙, 화합물 A, 또는 다코미티닙(Daco) + 화합물 A(화합물 A)을 조합하여 처리된 RPC9 클론 6 세포의 웨스턴 면역 블롯의 밴드(도 7A)에서 밀도계측 결과를 도시한다. pEGFR Y1068(도 8A), pAKT S473(도 8B), 및 pERK T202/Y204(도 8C)의 억제를 DMSO 대조군과 비교하여 측정하였다.
도 9는 DMSO, 에를로티닙, 화합물 A, 또는 에를로티닙(Erlo) + 화합물 A(화합물 A)을 조합하여 처리된 RPC9 클론 6 세포의 웨스턴 면역블롯의 밴드(도 7B)에서 밀도계측 결과를 도시한다. pEGFR Y1068(도 9A), pAKT S473(도 9B), 및 pERK T202/Y204(도 9C)의 억제를 DMSO 대조군과 비교하여 측정하였다.
도 10은 RPC9 클론 6 세포에서 EGFR, AKT 및 ERK의 인산화 수준의 웨스턴 면역블롯을 도시한다. GAPDH를 단백질 로딩 대조군으로서 포함하였다. 도 10A는 DMSO, 다코미티닙, 화합물 B, 또는 다코미티닙 + 화합물 B(화합물 B)을 조합하여 처리된 RPC9 클론 6 세포를 도시한다. 도 10B는 DMSO, 에를로티닙, 화합물 B, 또는 에를로티닙 + 화합물 B(화합물 B)을 조합하여 처리된 RPC9 클론 6 세포를 도시한다.
도 11은 DMSO, 다코미티닙, 화합물 B, 또는 다코미티닙(Daco) + 화합물 B(화합물 B)을 조합하여 처리된 RPC9 클론 6 세포의 웨스턴 면역블롯 밴드(도 10A)에서 밀도계측 결과를 도시한다. pEGFR Y1068(도 11A), pAKT S473(도 11B), 및 pERK T202/Y204(도 11C)의 억제를 DMSO 대조군과 비교하여 측정하였다.
도 12는 DMSO, 에를로티닙, 화합물 B, 또는 에를로티닙(Erlo) + 화합물 B(화합물 B)을 조합하여 처리된 RPC9 클론 6 세포의 웨스턴 면역블롯의 밴드(도 10B)에서 밀도계측 결과를 도시한다. pEGFR Y1068(도 12A), pAKT S473(도 12B), 및 pERK T202/Y204(도 12C)의 억제를 DMSO 대조군과 비교하여 측정하였다.
도 13은 무작위화되고 비히클, 다코미티닙, 화합물 A, 또는 다코미티닙(Daco) + 화합물 A(화합물 A)로 매일 경구 처리된, RPC9 클론 6 종양을 가진 SCID 마우스의 이종이식 모델의 결과를 나타낸 그래프이다. 도 13A는 종양 부피를 주당 3회 측정하고 이의 평균 및 평균의 표준 오차를 나타낸 그래프이다. 도 13B는 각각의 군의 체중을 매일 기록하고 이의 변화(%)를 평균 및 평균의 표준 오차로 나타낸 그래프이다.
도 14는 무작위화되고 비히클, 다코미티닙, 화합물 B, 또는 다코미티닙(Daco) + 화합물 B(화합물 B)로 매일 경구 처리된, RPC9 클론 6 종양을 가진 SCID 마우스의 이종이식 모델의 결과를 나타낸 그래프이다. 도 14A는 종양 부피를 주당 3회 측정하고 이의 평균 및 평균의 표준 오차를 나타낸 그래프이다. 도 14B는 각각의 군의 체중을 매일 기록하고 이의 변화(%)를 평균 및 평균의 표준 오차로 나타낸 그래프이다.
도 15는 무작위화되고 비히클, 다코미티닙, 화합물 B, 또는 다코미티닙(Daco) + 화합물 B(화합물 B)로 매일 경구 처리된, RPC9 클론 6 종양을 가진 SCID 마우스의 이종이식 모델의 결과를 나타낸 그래프이다. 도 15A는 단일 제제 처리 군의 종양 부피를 나타낸 그래프이다. 도 15B는 조합 처리 군의 종양 부피를 나타낸 그래프이다.
도 16은 무작위화되고 비히클, 에를로티닙, 화합물 A, 또는 에를로티닙(Erlo) + 화합물 A(화합물 A)로 매일 경구 처리된, RPC9 클론 6 종양을 가진 SCID 마우스의 이종이식 모델의 결과를 나타낸 그래프이다. 도 16A는 종양 부피를 주당 3회 측정하고 이의 평균 및 평균의 표준 오차를 나타낸 그래프이다. 도 16B는 각각의 군의 체중을 매일 기록하고 이의 변화(%)를 평균 및 평균의 표준 오차로 나타낸 그래프이다.Brief Description of the Drawings Figure 1 shows the Sanger sequence determination in which the C > EGFR T790M mutation was identified in RPC9 clone 3 and clone 6 with a percentage representing the cast PCR quantified EGFR T790M allele for the total EGFR allele.
Figure 2 shows dose response curves for cell viability analysis for PC9 and RPC9 clones 3 and 6 treated with various concentrations of Dakomutinip (Figure 2A) or erlotinib (Figure 2B).
Figure 3 shows dose response curves for RPC9 clone 6 cell viability assay. Figure 3A shows the dose response curves of Compound A (Compound A) and DakoMitinib (daco) alone and in combination. Figure 3B shows the dose response curves of compounds A and E and rotinib (erlo) alone and in combination. Figure 3C shows the inhibition (%) at a selected concentration of Compound A as a single agent and at a concentration selected in combination with Dakomutinip and Errotinib.
Figure 4 shows the dose response curve for RPC9 clone 6 cell viability assay. Figure 4A shows dose response curves of Compound B (Compound B) and Dakomitimin (daco) alone and in combination. Figure 4B shows the dose response curves of compound B and erlotinib (erlo) alone and in combination. Figure 4C shows the inhibition (%) at a selected concentration of Compound B as a single agent and at a concentration selected in combination with Dakomutinip and Errotinib.
Figure 5 shows the dose response curve for RPC9 clone 6 cell viability assay. Figure 5A shows the dose response curve in combination with Compound A (Compound A) alone and DakoMitinib (daco). Figure 5B shows the dose response curve in combination with Compound A alone and with gefitinib (gefi). Figure 5C shows the dose response curve in combination with Compound A alone and afat. Figure 5D shows the inhibition (%) at a selected concentration of Compound A as a single agent and at selected concentrations in combination with Dakomutinip, Gefitinib, and Appatanib.
Figure 6 shows the dose response curve for RPC9 clone 6 cell viability assay. Figure 6A shows the dose response curve in combination with compound B (compound B) alone and with dakomitinib (daco). Figure 6B shows the dose response curve in combination with compound B alone and gepitibem (gefi). Figure 6C shows the dose response curve in combination with Compound B alone and afat. Figure 4D shows the inhibition (%) at a selected concentration of Compound B as a single agent and at a selected concentration in combination with Dakomutinip, Gefitinib, and Afazinib.
Figure 7 shows Western immunoblot of EGFR, AKT and ERK phosphorylation levels in RPC9 clone 6 cells. GAPDH was included as a protein loading control. FIG. 7A shows RPC9 clone 6 cells treated with a combination of DMSO, Dakomitimin, Compound A, or Dakommitib + Compound A (Compound A). Figure 7B shows RPC9 clone 6 cells treated with a combination of DMSO, erlotinib, Compound A, or erlotinib + Compound A (Compound A).
Figure 8 shows the results of density measurements in a band of Western immunoblot (Figure 7A) of RPC9 clone 6 cells treated with DMSO, Dakomutinip, Compound A, or combination of Dacomitinib (Daco) + Compound A Respectively. The inhibition of pEGFR Y1068 (FIG. 8A), pAKT S473 (FIG. 8B), and pERK T202 / Y204 (FIG. 8C) was measured as compared to the DMSO control.
Figure 9 shows the results of density measurements in a band of Western immunoblot (Figure 7B) of RPC9 clone 6 cells treated with DMSO, erlotinib, Compound A, or erlotinib (Erlo) + Compound A (Compound A) Respectively. The inhibition of pEGFR Y1068 (FIG. 9A), pAKT S473 (FIG. 9B), and pERK T202 / Y204 (FIG. 9C) was measured as compared to the DMSO control.
Figure 10 shows a Western immunoblot of EGFR, AKT and ERK phosphorylation levels in RPC9 clone 6 cells. GAPDH was included as a protein loading control. Figure 10A shows RPC9 clone 6 cells treated with a combination of DMSO, Dakomitimin, Compound B, or Dakomitinib + Compound B (Compound B). Figure 10B shows RPC9 clone 6 cells treated with a combination of DMSO, erlotinib, compound B, or erlotinib + compound B (compound B).
Figure 11 shows the density measurement results in the Western immunoblot band (Figure 10A) of RPC9 clone 6 cells treated with DMSO, Dakomutinib, Compound B, or combination of Dacomitinib (Daco) + Compound B (Compound B) do. The inhibition of pEGFR Y1068 (FIG. 11A), pAKT S473 (FIG. 11B), and pERK T202 / Y204 (FIG. 11C) was measured as compared to the DMSO control.
Figure 12 shows the results of density measurements in a band of Western immunoblot (Figure 10B) of RPC9 clone 6 cells treated with DMSO, erlotinib, compound B, or erlotinib (Erlo) + compound B (compound B) Respectively. The inhibition of pEGFR Y1068 (FIG. 12A), pAKT S473 (FIG. 12B), and pERK T202 / Y204 (FIG. 12C) was measured as compared to the DMSO control.
Figure 13 shows the results of a xenotransplantation model of SCID mice with RPC9 clone 6 tumors that were randomized and orally treated with vehicle, DakoMitinib, Compound A, or Dakomutinip (Daco) + Compound A (Compound A) Fig. Figure 13A is a graph showing the tumor volume measured three times per week and the mean and standard error of the mean. FIG. 13B is a graph showing the body weight of each group recorded daily and the change (%) thereof as the mean and the standard error of the average.
Figure 14 shows the results of a xenotransplantation model of SCID mice with RPC9 clone 6 tumors, which were randomized and treated daily with vehicle, Dakomutinip, Compound B, or Dakomutinip (Daco) + Compound B (Compound B) Fig. 14A is a graph showing the tumor volume measured three times per week and the mean and standard error of the mean. FIG. 14B is a graph showing the body weight of each group recorded daily and the change (%) thereof as the mean and the standard error of the average.
Figure 15 shows the results of a xenotransplantation model of SCID mice with RPC9 clone 6 tumors that were randomized and treated orally with vehicle, DakoMitinib, Compound B, or DakoMitinib (Daco) + Compound B (Compound B) Fig. 15A is a graph showing the tumor volume of a single agent treated group. 15B is a graph showing the tumor volume of the combined treatment group.
Figure 16 shows the results of a xenotransplantation model of SCID mice with RPC9 clone 6 tumors randomized and treated with vehicle, erlotinib, Compound A, or erlotinib (Erlo) + Compound A (Compound A) Fig. 16A is a graph showing the tumor volume measured three times per week and the mean and standard error of the mean. FIG. 16B is a graph showing the body weight of each group recorded daily and the change (%) thereof as the mean and the standard error of the average.

수용체의 인간 표피 성장 인자 수용체/표피 성장 인자 수용체(HER/EGFR) 계열의 일원은 EGFR/HER-1, HER2/neu/erbB-2, HER3/erbB-3 및 HER4/erbB-4를 포함한다.Members of the human epidermal growth factor receptor / epidermal growth factor receptor (HER / EGFR) family of receptors include EGFR / HER-1, HER2 / neu / erbB-2, HER3 / erbB-3 and HER4 / erbB-4.

EGFR 억제제는 EGFR의 통상의 활성화 돌연변이(L858R 및 delE746-A750)를 효과적으로 억제한다. 통상의 활성화 돌연변이는 또한 단일 돌연변이체 또는 단일 돌연변이체 형태로서 지칭된다. EGFR 억제제의 예는 게피티닙, 에를로티닙, 이코티닙, 반데타닙, 라파티닙, 네라티닙, 아파티닙, 페리티닙, 다코미티닙 및 카네르티닙을 포함한다. EGFR의 단클론 항체 억제제, 예컨대 세툭시맙 및 파니투무맙은 또한 본원에 정의된 바와 같이 EGFR 억제제이다.EGFR inhibitors effectively inhibit the normal activation mutations of EGFR (L858R and delE746-A750). Conventional activated mutants are also referred to as single mutants or single mutant forms. Examples of EGFR inhibitors include gefitinib, erlotinib, icocidinib, bandetanib, lapatinib, neratinib, apatinate, peritinib, dakomitinib and carnertinib. Monoclonal antibody inhibitors of EGFR, such as cetuximab and panitumum, are also EGFR inhibitors as defined herein.

EGFR의 억제제는 가역성 또는 비가역성 억제제일 수 있다. EFGR 분자의 티로신 키나아제 도메인의 가역성 억제제는 수용체에 부착되고 주기적으로 수용체로부터 탈착된다. 게피티닙, 에를로티닙, 이코티닙, 반데타닙 및 라파티닙은 가역성 EGFR 억제제의 예이다. EFGR 분자의 티로신 키나아제 도메인의 비가역성 억제제는 EGFR에 비가역적으로 조합한다. 네라티닙, 아파티닙, 페리티닙, 다코미티닙 및 카네르티닙은 비가역성 EGFR 억제제의 예이다.The inhibitor of EGFR may be a reversible or irreversible inhibitor. Reversibility inhibitors of the tyrosine kinase domain of the EFGR molecule are attached to the receptor and are desorbed periodically from the receptor. Gefitinib, erlotinib, isotinib, vanDetanib and lapatinib are examples of reversible EGFR inhibitors. The irreversible inhibitors of the tyrosine kinase domain of the EFGR molecule are irreversibly associated with EGFR. Neratinib, apatinate, ferritinib, Dakomitinib and carnertinib are examples of irreversible EGFR inhibitors.

EGFR 억제제는 HER 계열의 하나 이상의 일원의 억제제이다. 게피티닙, 에를로티닙, 이코티닙 및 반데타닙은 선택적인 EGFR/HER-1 티로신 키나아제 억제제(TKI)이다. 세툭시맙 및 파니투무맙은 EGFR/HER-1에 특이적인 단클론 항체이다.EGFR inhibitors are inhibitors of one or more members of the HER family. Gefitinib, erlotinib, icocitinib, and bandetanib are selective EGFR / HER-1 tyrosine kinase inhibitors (TKI). Cetuximab and panituumatum are monoclonal antibodies specific for EGFR / HER-1.

pan-HER 억제제는 HER 계열의 다중 일원을 차단하는 제제이다. 라파티닙, 네라티닙, 아파티닙, 페리티닙, 다코미티닙 및 카네르티닙은 pan-HER 억제제의 예이다. 라파티닙, 네라티닙, 아파티닙 및 페리티닙은 HER 계열의 EGFR 및 GER2 일원을 억제한다. 다코미티닙 및 카네르티닙은 HER 계열의 EGFR, HER2 및 HER4를 억제한다.Pan-HER inhibitors are agents that block multiple members of the HER family. Lapatinib, neratinib, apatinate, peritinib, dakomitinib and carnertinib are examples of pan-HER inhibitors. Lapatinib, neratinib, apatinate, and peritinib inhibit the HER family of EGFR and GER2 members. Dakomutinib and caneritinib inhibit the HER family of EGFR, HER2 and HER4.

EGFR T790M 억제제는 통상의 활성화 돌연변이(L858R 및 delE746-A750) 및 게이트키퍼 돌연변이(T790M)를 효과적으로 억제한다. 본 발명의 EGFR T790M 억제제는 단일 돌연변이체(L858R 및 delE746-A750)에 비해 EGFR의 이중 돌연변이체 형태(L858R/T790M 및 delE746-A750/T790M)를 우선적으로 억제한다. EGFR T790M 억제제의 예는 Go6976, PKC412, AP26113, HM61713, WZ4002, CO-1686 및 TAS-2913을 포함한다.EGFR T790M inhibitors effectively inhibit normal activation mutations (L858R and delE746-A750) and gatekeeper mutations (T790M). The EGFR T790M inhibitor of the present invention preferentially inhibits the dual mutant forms of EGFR (L858R / T790M and delE746-A750 / T790M) compared to single mutants (L858R and delE746-A750). Examples of EGFR T790M inhibitors include Go6976, PKC412, AP26113, HM61713, WZ4002, CO-1686 and TAS-2913.

EGFR T790M의 억제제는 가역성 또는 비가역성 억제제일 수 있다. Go6976, PKC412 및 AP26113은 가역성 EGFR T790M 억제제의 예이다. HM61713, WZ4002, CO-1686 및 TAS-2913은 비가역성 EGFR T790M 억제제의 예이다.The inhibitor of EGFR T790M may be a reversible or irreversible inhibitor. Go6976, PKC412 and AP26113 are examples of reversible EGFR T790M inhibitors. HM61713, WZ4002, CO-1686 and TAS-2913 are examples of irreversible EGFR T790M inhibitors.

또한, 본 발명의 EGFR T790M 억제제는 1-{(3R,4R)-3-[({5-클로로-2-[(1-메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}옥시)메틸]-4-메톡시피롤리딘-1-일}프로프-2-엔-1-온(화합물 A), N-메틸-N-[트랜스-3-({2-[(1-메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-5-(피리딘-2-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}옥시)사이클로부틸]프로프-2-엔아미드(화합물 B), N-[트랜스-3-({5-클로로-2-[(1,3-다이메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}아미노)사이클로부틸]-N-메틸프로프-2-엔아미드(화합물 C), 및 1-{(3R,4R)-3-[({5-클로로-2-[(3-메톡시-1-메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}옥시)메틸]-4-메톡시피롤리딘-1-일}프로프-2-엔-1-온(화합물 D), 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 화합물 A, 화합물 B, 화합물 C 및 화합물 D는 비가역성 EGFR T790M 억제제의 예이다.In addition, the EGFR T790M inhibitor of the present invention is also useful as an inhibitor of EGFR T790M inhibition of 1 - {(3R, 4R) -3 - [({5-chloro- Methyl-4-methoxypyrrolidin-1-yl} prop-2-en-1-one (Compound A), N-methyl- Pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-2-yl) -lH-pyrrolo [2,3-d] ({5-chloro-2 - [(1, 3-dimethyl-lH-pyrrolo < / RTI > Yl) amino) cyclobutyl] -N-methylprop-2-enamide (Compound C), and Amino] -7H-pyrrolo [2, < RTI ID = 0.0 > 3-d] pyrimidin-4-yl} oxy] methyl] -4-methoxypyrrolidin-1-yl} prop-2-en- 1 -one (Compound D), or a pharmaceutically acceptable salt thereof . Compound A, Compound B, Compound C and Compound D are examples of irreversible EGFR T790M inhibitors.

하기 약어가 본원에 사용될 수 있다: Ac(아세틸); APCI(원자 압력 화학 이온화); Boc(t-부톡시카본일); Boc2O(다이-t-부틸 다이카보네이트); 브렛포스 팔라다사이클(BrettPhos Palladacycle)(클로로[2-(다이사이클로헥실포스피노)-3,6-다이메톡시-2',4',6'-트라이이소프로필-1,1'-바이페닐][2-(2-아미노에틸)페닐]팔라듐(II)); DCC(1,3-다이사이클로헥실카보다이이미드); DCM(다이클로로메탄); 데옥소-프루오르(Deoxo-Fluor: 등록상표)(비스(2-메톡시에틸)아미노설퓨르 트라이플루오리드); DIAD(다이이소프로필 아조다이카복실레이트); DIEA(다이이소프로필에틸아민); DIPEA(N,N-다이이소프로필에틸아민); DMAP(4-다이메틸아미노피리딘); DMEM(듀벨코 개질된 이글 배지); DMF(다이메틸포름아미드); DMSO(다이메틸설폭시드); DPPA(다이페닐 포스포라지데이트); EGTA([에틸렌비스(옥시에틸렌니트릴로)]테트라아세트산); eq(당량); Et(에틸); EtOH(에탄올); EtOAc(에틸 아세테이트); Et2O(다이에틸 에터); FBS(소 태아 혈청); HATU(2-(7-아자-1H-벤조트라이아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트); HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산); HMDS(비스(트라이메틸실릴)아민, 이는 헥사메틸다이실라잔 또는 헥사메틸다이실록산으로도 공지됨); HOAc(아세트산); HPLC(고성능 액체 크로마토그래피); iPr(이소프로필); iPrMgCl(이소프로필마그네슘 클로라이드); iPrOH(이소프로필 알코올); KHMDS(칼륨 비스(트라이메틸실릴)아미드); LAH(리튬 알루미늄 하이드리드); LCMS(액체 크로마토그래피-질량 분광법); LiHMDS(리튬 비스(트라이메틸실릴)아미드); Me(메틸); MeOH(메탄올); MeCN(아세토니트릴); MTBE(메틸 t-부틸 에터); N(정상); N/A(이용할 수 없음); NaHMDS(나트륨 비스(트라이메틸실릴)아미드); N/D(측정되지 않음); NIS(N-요오도숙신이미드); NMM(N-메틸모폴린); NMR(핵 자기 공명); Pd2(dba)3(트리스(다이벤질리덴아세톤)다이팔라듐(0)); PG(보호기); Ph(페닐); PhI(OAc)2(요오도벤젠 다이아세테이트); PMSF(페닐메틸설폰일 플루오라이드); psi(제곱 인치당 파운드); Rf(체류 인자); RPMI(로스웰 파크 메모리얼 연구소: Roswell Park Memorial Institute); rt(실온); sat.(포화된); SCX(강양이온 교환); SEM(2-(트라이메틸실릴)에톡시메틸); SEM-Cl(2-(트라이메틸실릴)에톡시메틸 클로라이드); SFC(초임계 유체 크로마토그래피); TBAF(테트라부틸암모늄 플루오라이드); TBDPS(t-부틸다이페닐실릴); TBS(t-부틸다이메틸실릴); t-BuXPhos 팔라다사이클(클로로[2-(다이-t-부틸포스피노)-2',4',6'-트라이이소프로필-1,1'-바이페닐][2-(2-아미노에틸)페닐)]팔라듐(II); TFA(트라이플루오로아세테이트); THF(테트라하이드로푸란); TLC(박층 크로마토그래피); 톨루엔(메틸벤젠); 토실(p-톨루엔설폰일); 및 Xantphos(4,5-비스(다이페닐포스피노)-9,9-다이메틸잔텐).The following abbreviations may be used herein: Ac (acetyl); APCI (atomic pressure chemical ionization); Boc (t-butoxycarbonyl); Boc 2 O (di-t-butyl dicarbonate); BrettPhos Palladacycle (chloro [2- (dicyclohexylphosphino) -3,6-dimethoxy-2 ', 4', 6'-triisopropyl-1,1'-biphenyl ] [2- (2-aminoethyl) phenyl] palladium (II)); DCC (1,3-dicyclohexylcarbodiimide); DCM (dichloromethane); Deoxo-Fluor (registered trademark) (bis (2-methoxyethyl) aminosulfur trifluoride); DIAD (diisopropyl azodicarboxylate); DIEA (diisopropylethylamine); DIPEA (N, N-diisopropylethylamine); DMAP (4-dimethylaminopyridine); DMEM (dubelco modified Eagle's medium); DMF (dimethylformamide); DMSO (dimethylsulfoxide); DPPA (diphenylphosphorazidate); EGTA ([ethylene bis (oxyethylene nitrilo)] tetraacetic acid); eq (equivalent); Et (ethyl); EtOH (ethanol); EtOAc (ethyl acetate); Et 2 O (diethyl ether); FBS (fetal bovine serum); HATU (2- (7-aza-1H-benzotriazol-l-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate); HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethanesulfonic acid); HMDS (bis (trimethylsilyl) amine, also known as hexamethyldisilazane or hexamethyldisiloxane); HOAc (acetic acid); HPLC (high performance liquid chromatography); iPr (isopropyl); iPrMgCl (isopropylmagnesium chloride); iPrOH (isopropyl alcohol); KHMDS (potassium bis (trimethylsilyl) amide); LAH (lithium aluminum hydride); LCMS (liquid chromatography-mass spectrometry); LiHMDS (lithium bis (trimethylsilyl) amide); Me (methyl); MeOH (methanol); MeCN (acetonitrile); MTBE (methyl t-butyl ether); N (normal); N / A (not available); NaHMDS (sodium bis (trimethylsilyl) amide); N / D (not measured); NIS (N-iodosuccinimide); NMM (N-methylmorpholine); NMR (nuclear magnetic resonance); Pd 2 (dba) 3 (tris (dibenzylideneacetone) dipalladium (0)); PG (protecting group); Ph (phenyl); PhI (OAc) 2 (iodobenzene diacetate); PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride); psi (pounds per square inch); Rf (retention factor); RPMI (Roswell Park Memorial Institute); rt (room temperature); sat (saturated); SCX (strong cation exchange); SEM (2- (trimethylsilyl) ethoxymethyl); SEM-Cl (2- (trimethylsilyl) ethoxymethyl chloride); SFC (Supercritical Fluid Chromatography); TBAF (tetrabutylammonium fluoride); TBDPS (t-butyldiphenylsilyl); TBS (t-butyldimethylsilyl); t-BuXPhos paladacycycle (chloro [2- (di-t-butylphosphino) -2 ', 4', 6'- triisopropyl-1,1'- biphenyl] [2- ) Phenyl)] palladium (II); TFA (trifluoroacetate); THF (tetrahydrofuran); TLC (thin layer chromatography); Toluene (methylbenzene); Tosyl (p-toluenesulfonyl); And Xantphos (4,5-bis (diphenylphosphino) -9,9-dimethylzanthene).

일부 실시양태는 본원에 기재된 화합물의 약학적으로 허용되는 염에 관한 것이다. 본원에 기재된 화합물의 약학적으로 허용되는 염은 이의 산 부가 염 및 염기 부가 염을 포함한다. Some embodiments relate to pharmaceutically acceptable salts of the compounds described herein. Pharmaceutically acceptable salts of the compounds described herein include the acid addition and base addition salts thereof.

또한, 일부 실시양태는 본원에 기재된 화합물의 약학적으로 허용되는 산 부가 염에 관한 것이다. 적합한 산 부가 염은 무독성 염을 형성하는 산으로부터 형성된다. 적합한 산 부가 염, 즉 약학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 염의 비제한적인 예는 아세테이트, 산 시트레이트, 아디페이트, 아스파테이트, 벤조에이트, 베실레이트, 바이카보네이트/카보네이트, 바이설페이트/설페이트, 바이타르트레이트, 보레이트, 캄실레이트, 시트레이트, 사이클라메이트, 에디실레이트, 에실레이트, 에탄설포네이트, 하이벤제이트, 하이드로클로라이드/클로라이드, 하이드로브로마이드/브로마이드, 하이드로요오다이드/요오다이드, 이세티오네이트, 락테이트, 말레이트, 말레에이트, 말론에이트, 메실레이트, 메탄설포네이트, 메틸설페이트, 나프틸레이트, 2-나프실레이트, 니코티네이트, 니트레이트, 오로테이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 팜오에티으, 포스페이트/수소 포스페이트/이수소 포스페이트, 피로글루타메이트, 사카레이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 탄네이트, 타르트레이트, p-톨루엔설포네이트, 토실레이트, 트라이플루오로아세테이트 및 지노포에이트 염을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.In addition, certain embodiments relate to pharmaceutically acceptable acid addition salts of the compounds described herein. Suitable acid addition salts are formed from acids which form non-toxic salts. Non-limiting examples of suitable acid addition salts, i.e., salts containing a pharmaceutically acceptable anion, include, but are not limited to, acetate, acid citrate, adipate, aspartate, benzoate, besylate, bicarbonate / carbonate, bisulfate / sulfate, But are not limited to, tartrate, borate, camylate, citrate, cyclamate, eddylate, esylate, ethanesulfonate, hybeneze, hydrochloride / chloride, hydrobromide / bromide, hydroiodide / iodide, But are not limited to, isethionate, lactate, maleate, maleate, malonate, mesylate, methanesulfonate, methylsulfate, naphthylate, 2-naphthylate, nicotinate, nitrate, orotate, oxalate, Tate, Palm Oat, Phosphate / Hydrogen Phosphate / Hydrogen Phosphate, Pyroglutamate, Saka Sites, stearate, succinate include, burnt carbonate, acetate and benzoate salts as fabric Gino tartrate, p- toluene sulfonate, tosylate, trifluoromethyl, but are not limited thereto.

추가 실시양태는 본원에 기재된 화합물의 염기 부가 염에 관한 것이다. 적합한 염기 부가 염은 무독성 염을 형성하는 염기로부터 형성된다. 적합한 염기 염의 비제한적인 예는 알루미늄, 아르기닌, 벤자틴, 칼슘, 콜린, 다이에틸아민, 다이올아민, 글리신, 리신, 마그네슘, 메글루민, 올아민, 칼륨, 나트륨, 트로메타민 및 아연 염을 포함한다.Additional embodiments relate to base addition salts of the compounds described herein. Suitable base addition salts are formed from bases which form non-toxic salts. Non-limiting examples of suitable base salts include, but are not limited to, aluminum, arginine, benzathine, calcium, choline, diethylamine, diolamine, glycine, lysine, magnesium, meglumine, oleamine, potassium, sodium, tromethamine and zinc salts .

천연에서 염기성인 본원에 기재된 화합물은 다양한 무기 산 및 유기 산을 사용하여 매우 다양한 염을 형성할 수 있다. 본원에 기재된 상기 염기성 화합물의 약학적으로 허용되는 산 부가 염을 제조하기 위해 사용될 수 있는 산은 무독성 산 부가 염, 예를 들면 약학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 염, 예컨대 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로요오다이드, 니트레이트, 설페이트, 바이설페이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 이소니코티네이트, 아세테이트, 락테이트, 살리실레이트, 시트레이트, 산 시트레이트, 타르트레이트, 판토테네이트, 바이타르트레이트, 아스코르베이트, 숙시네이트, 말레에이트, 겐티시네이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 사카레이트, 포름에이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄설포네이트, 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트 및 팜오에이트[즉, 1,1'-메틸렌-비스-(2-하이드록시-3-나프토에이트)] 염을 형성하는 것이다. 염기성 잔기, 예컨대 아미노 기를 포함하는 본원에 기재된 화합물은 상기한 산 이외에 다양한 아미노산을 사용하여 약학적으로 허용되는 염을 형성할 수 있다.The compounds described herein, which are natural in nature, can form a wide variety of salts using various inorganic and organic acids. Acids that may be used to prepare the pharmaceutically acceptable acid addition salts of the basic compounds described herein include non-toxic acid addition salts, such as those containing a pharmaceutically acceptable anion, such as hydrochloride, hydrobromide, But are not limited to, iodide, nitrate, sulfate, bisulfate, phosphate, acid phosphate, isonicotinate, acetate, lactate, salicylate, citrate, acid citrate, tartrate, pantothenate, But are not limited to, but are not limited to, but are not limited to, cobalt, succinate, maleate, gentisinate, fumarate, gluconate, glucuronate, Sulfonate and pamoate [i.e., 1,1'-methylene-bis- (2-hydroxy-3-naphthoyl ) To form a salt. Compounds described herein, including basic moieties such as amino groups, can form pharmaceutically acceptable salts with various amino acids in addition to the acids described above.

천연에서 산성인 본원에 기재된 화합물의 약학적으로 허용되는 염기 염을 제조하기 위한 약제로서 사용될 수 있는 화학 염기는 상기 화합물을 사용하여 무독성 염기 염을 형성하는 것이다. 상기 무독성 염기 염은, 상기 약학적으로 허용되는 양이온, 예컨대 알칼리 금속 양이온(예를 들면, 칼륨 및 나트륨) 및 알칼리 토금속 양이온(예를 들면, 칼슘 및 마그네슘), 암모늄으로부터 유도된 것 또는 수용성 아민 부가 염, 예커대 N-메틸글루카민-(메글루민), 및 저급 알칸올암모늄 및 약학적으로 허용되는 유기 아민의 다른 염기 염을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.Chemical bases which can be used as medicaments for preparing pharmaceutically acceptable base salts of the compounds described herein which are naturally acidic are those which form non-toxic base salts using such compounds. The non-toxic base salts may be those derived from the pharmaceutically acceptable cations such as alkali metal cations (e.g., potassium and sodium) and alkaline earth metal cations (e.g., calcium and magnesium), ammonium, But are not limited to, salts such as, for example, N-methylglucamine- (meglumine), and lower alkanolammonium and other base salts of pharmaceutically acceptable organic amines.

본원에 기재된 실시양태의 화합물은 모두 입체이성질체(예를 들면, 시스 및 트랜스 이성질체) 및 본원에 기재된 화합물의 모든 광학 이성질체(예를 들면, R 및 S 거울상이성질체), 뿐만 아니라 라세미체, 부분입체이성질체 및 상기 이성질체의 다른 혼합물을 포함한다. 모든 입체이성질체는 본 발명의 청구범위의 범주 내에 포괄되고, 당업자는 특정한 입체이성질체가 바람직할 수 있음을 인지할 것이다.The compounds of the embodiments described herein can all include all stereoisomers (e.g., cis and trans isomers) and all optical isomers (e. G., R and S enantiomers) of the compounds described herein, as well as racemates, Isomers and other mixtures of the isomers. All stereoisomers are encompassed within the scope of the claims of the present invention, and one of ordinary skill in the art will recognize that certain stereoisomers may be preferred.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 화합물은 엔올 및 이민 형태, 및 케토 및 엔아민 형태 및 기하이성질체 및 이의 혼합물을 비롯한 여러 호변이성질체 형태로 존재할 수 있다. 모든 상기 호변이성질체 형태는 본 실시양태의 범주 내에 포함된다. 호변이성질체는 호변이성질체 세트의 혼합물로서 용액 중에 존재한다. 고체 형태에서, 일반적으로 1개의 호변이성질체가 우선시된다. 비록 1개의 호변이성질체가 기재될 수 있을지라도, 본 실시양태는 본 화합물의 모든 호변이성질체를 포함한다.In some embodiments, the compounds described herein may exist in various tautomeric forms, including enol and imine forms, and keto and enamine forms and geometric isomers and mixtures thereof. All such tautomeric forms are included within the scope of this embodiment. Tautomers are present in solution as a mixture of tautomeric sets. In the solid form, generally one tautomer is preferred. Although one tautomer may be described, this embodiment includes all tautomers of the present compounds.

또한, 본 실시양태는 본원에 기재된 아트로프이성질체를 포함한다. 아트로프이성질체는 회전적으로 제한된 이성질체로 분리될 수 있는 화합물을 지칭한다.This embodiment also includes the art rope isomers described herein. Art rope isomers refer to compounds that can be separated into rotationally limited isomers.

산 및 염기의 헤미염은 또한 예를 들면 헤미설페이트 및 헤미칼슘 염을 형성할 수 있다.Hemic salts of acids and bases can also form, for example, hemisulphate and hemicalcium salts.

적합한 염기에 대한 검토를 위해, 문헌[Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use by Stahl and Wermuth(Wiley-VCH, 2002)]을 참조한다. 본원에 기재된 화합물의 약학적으로 허용되는 염을 제조하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.For a review of suitable bases, see Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use by Stahl and Wermuth (Wiley-VCH, 2002). Methods for preparing pharmaceutically acceptable salts of the compounds described herein are known to those skilled in the art.

용어 "용매화물"은 본원에 기재된 화합물 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 용매 분자, 예를 들면 에탄올을 포함하는 분자 착체를 설명하기 위해 본원에서 사용된다.The term "solvate" is used herein to describe a molecular complex comprising a compound described herein and one or more pharmaceutically acceptable solvent molecules, for example, ethanol.

또한, 본원에 기재된 화합물은 비용매화된 형태 및 용매화된 형태로 존재할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태는 본원에 기재된 화합물의 수화물 및 용매화물에 관한 것이다.In addition, the compounds described herein may exist in unsolvated and solvated forms. Accordingly, certain embodiments are directed to hydrates and solvates of the compounds described herein.

하나 이상의 비대칭 탄소 원자를 함유하는 본원에 기재된 화합물은 2개 이상의 입체이성질체로서 존재할 수 있다. 본원에 기재된 화합물이 알켄일 또는 알켄일렌 기를 함유하는 경우, 기하 시스/트랜스(또는 Z/E) 이성질체가 가능하다. 위치이성질체가 낮은 에너지 장벽을 통해 호환성이 있는 경우, 호변이성질체 이성질(호변이성질)이 발생할 수 있다. 이는 예를 들면, 이미노, 케토 또는 옥심 기를 함유하는 본원에 기재된 화합물의 양성자 호변이성질의 형태, 또는 소위 방향족 잔기를 함유하는 화합물 중 원자가 호변이성질을 취할 수 있다. 단일 화합물은 하나의 유형의 이성질체보다 많이 존재할 수 있다.The compounds described herein that contain one or more asymmetric carbon atoms can exist as two or more stereoisomers. Where the compounds described herein contain an alkenyl or alkenylene group, geometric cis / trans (or Z / E) isomers are possible. If the position isomer is compatible through a low energy barrier, tautomeric isomerism (tautomerism) may occur. This may take the form of, for example, the proton tautomeric nature of the compounds described herein containing imino, keto or oxime groups, or the valence tautomeric nature of the compounds containing so-called aromatic moieties. A single compound may exist more than one type of isomer.

하나의 유형의 이성질체보다 많이 존재하는 화합물, 이의 하나 이상의 혼합물을 비롯한 본원에 기재된 화합물의 모든 입체이성질체, 기하이성질체 및 호변이성질체 형태가 본 실시양태의 범주 내에 포함된다. 또한, 반대 이온이 광학적으로 활성인 산 부가 염 또는 염기 염, 예를 들면 d-락테이트 또는 l-리신, 또는 라세미체, 예를 들면 dl-타르트레이트 또는 dl-아르기닌이 포함된다.All stereoisomers, geometric isomers and tautomeric forms of the compounds described herein, including compounds that are more abundant than one type of isomer, including mixtures of one or more thereof, are included within the scope of this embodiment. Also included are acid addition salts or base salts in which the counterion is optically active, such as d-lactate or l-lysine, or racemates, such as dl-tartrate or dl-arginine.

시스/트랜스 이성질체는 당업자에게 널리 공지된 통상적인 기법, 예를 들면 크로마토그래피 및 분별 결정화에 의해 분리될 수 있다.The cis / trans isomers can be separated by conventional techniques well known to those skilled in the art, for example, by chromatography and fractional crystallization.

개별적인 거울상이성질체의 제조/단리를 위한 통상적인 기법은 예를 들변 키랄 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 적합한 광학적으로 순수한 전구체로부터의 키랄 합성 또는 라세미체(또는 염 또는 전구체의 라세미체)의 분해를 포함한다.Conventional techniques for the preparation / isolation of individual enantiomers include, but are not limited to, chiral synthesis from suitable optically pure precursors using racemic high pressure liquid chromatography (HPLC) or racemates (or racemates of salts or precursors) Lt; / RTI >

다르게는, 라세미체(또는 라세믹 전구체)는 적합한 광학적으로 활성인 화합물, 예를 들면, 알코올, 또는 본원에 기재된 화합물이 산성 또는 염기성 잔기를 함유하는 경우, 염기 또는 산, 예컨대 1-페닐에틸 아민 또는 타르타르산과 반응할 수 있다. 생성된 부분입체이성질체 혼합물은 크로마토그래피 및/또는 분별 결정화에 의해 분리될 수 있고, 부분입체이성질체 중 1 또는 2개는 당업자에게 널리 공지된 수단에 의해 상응하는 순수한 거울상이성질체로 전환된다.Alternatively, the racemate (or racemic precursor) may be reacted with a suitable optically active compound, such as an alcohol, or, if the compound described herein contains an acidic or basic moiety, a base or an acid such as 1-phenylethyl Amine or tartaric acid. The resulting diastereomeric mixture can be separated by chromatography and / or fractional crystallization and one or two of the diastereomers are converted to the corresponding pure enantiomers by means well known to those skilled in the art.

본원에 사용된 용어 "치료하는"은, 달리 나타내지 않는 한, 상기 용어를 적용하는 장애 또는 질환, 또는 상기 장애 또는 질환의 하나 이상의 증상을 역전시키거나 완화하거나 진행 억제하거나 예방하는 것을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "치료"는, 달리 나타내지 않는 한, 바로 위에 정의된 "치료하는"과 같이 치료하는 작용을 지칭한다. The term "treating" as used herein, unless otherwise indicated, means reversing, alleviating, inhibiting or preventing the disorder or disease to which the term applies, or one or more symptoms of the disorder or disorder. The term "treatment ", as used herein, unless otherwise indicated, refers to the action of treating, such as" treating "

본 발명에 따라 치료될 환자는 임의의 온혈 동물, 예컨대 인간, 원숭이 또는 다른 하위 영장류, 말, 개, 토끼, 기니아 피그 또는 마우스를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 예를 들면, 환자는 인간이다. 의학 분야의 숙련자는 비소세포 폐암으로 고통을 받고 있고 치료를 필요로 하는 개별적인 환자를 용이하게 확인할 수 있다. The subject to be treated in accordance with the present invention includes, but is not limited to, any warm-blooded animal such as a human, monkey or other sub-primate, horse, dog, rabbit, guinea pig or mouse. For example, the patient is a human. Those skilled in the medical arts can easily identify individual patients suffering from non-small cell lung cancer and needing treatment.

용어 "첨가제"는, 2개의 화합물 또는 표적된 제제와 조합한 결과가 개별적으로 각각의 제제를 합한 것임을 의미한다. 용어 "상승효과" 또는 "상승적인"은, 2개의 제제와 조합한 결과가 각각의 제제를 함께 합한 것보다 큼을 의미하기 위해 사용된다. "상승적인 양"은 상승적인 효과를 야기하는 2개의 제제와 조합한 양이다.The term "additive" means that the result of combining two compounds or a targeted agent is the sum of each agent individually. The term " synergistic "or" synergistic "is used to mean that the result of combining two agents is greater than the sum of the two agents together. The "synergistic amount" is the amount combined with the two agents causing synergistic effects.

1 또는 2개의 성분 사이의 상승적인 상호작용을 결정하여, 최적 효과 범위 및 각각의 성분 효과의 절대 투여량 범위를, 치료를 필요로 하는 환자에게 상이한 w/w 비 범위 및 투여량 이상의 성분을 투여함으로써 명확하게 측정할 수 있다. 인간의 경우, 환자에 대한 임상 연구를 수행하는 복잡성 및 비용은 상승효과에 대한 기본적인 모델로서 시험하는 이러한 양식의 사용을 비현실적으로 제시한다. 그러나, 시험관내 모델 또는 생체내 모델에서 상승효과의 관찰은 인간 및 다른 종에서의 효과를 예측할 수 있고, 본원에 기재된 바와 같은 시험관내 모델 또는 생체내 모델은 상승적인 효과를 측정하도록 존재하고, 또한 상기 연구의 결과를 사용하여 효과적인 투여량 및 혈장 농도 비 범위, 및 약동학/약역학 방법의 적용에 의해 인간 및 다른 종에서 요구되는 절대 투여량 및 혈장 농도를 예측할 수 있다.The synergistic interaction between one or two components may be determined to determine the optimum range of effect and the absolute dosage range of each component effect to the extent that the composition is administered to a patient in need of treatment with a different w / Can be clearly measured. In the case of humans, the complexity and cost of performing clinical studies on patients presents the use of this form unrealistically as a basic model for synergy. However, observation of synergistic effects in an in vitro model or an in vivo model can predict effects in humans and other species, and in vitro or in vivo models such as those described herein exist to measure synergistic effects, and The results of this study can be used to predict absolute doses and plasma concentrations required by humans and other species by the application of effective dose and plasma concentration ratio ranges and pharmacokinetic / pharmacodynamic methods.

실시양태에서, 본 발명의 방법은 EGFR T790M 억제제의 효과량을 panHER 억제제의 효과량과 조합하여 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하는 비소세포 폐암의 치료 방법에 관한 것이고, 이때 panHER 억제제는 상승적인 효과를 달성하기에 충분한 양으로 비표준 임상 투여 양생법에 따라 투여된다. 이 실시양태에서, 본 발명의 방법은 표적화된 치료제, 구체적으로 EGFR T790M 억제제 및 panHER 억제제의 상승적인 조합에 관한 것이다.In an embodiment, the method of the invention is directed to a method of treating non-small cell lung cancer comprising administering to a patient in need thereof an effective amount of an EGFR T790M inhibitor in combination with an effective amount of a panHER inhibitor, wherein the panHER inhibitor is elevated Lt; RTI ID = 0.0 > effective < / RTI > effect. In this embodiment, the methods of the invention relate to the synergistic combination of targeted therapies, specifically EGFR T790M inhibitors and panHER inhibitors.

일 실시양태에서, 본 발명의 방법은 EGFR T790M 억제제의 효과량을 적은 투여량의 panHER 억제제와 조합하여 상승적인 효과를 달성하기에 충분한 양으로 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하는 비소세포 폐암의 치료 방법에 관한 것이다. 이 실시양태에서, 본 발명의 방법은 표적화된 치료제, 구체적으로 EGFR T790M 억제제 및 panHER 억제제의 상승적인 조합에 관한 것이다.In one embodiment, the methods of the invention comprise administering an effective amount of an EGFR T790M inhibitor in combination with a low dose of a panHER inhibitor to a patient in need thereof in an amount sufficient to achieve a synergistic effect, . In this embodiment, the methods of the invention relate to the synergistic combination of targeted therapies, specifically EGFR T790M inhibitors and panHER inhibitors.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 비가역성 EGFR T790M 억제제의 효과량을 EGFR 억제제의 효과량과 조합하여 상승적인 효과를 달성하기에 충분한 양으로 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하는 비소세포 폐암의 치료 방법에 관한 것이다. 이 실시양태에서, 본 발명의 방법은 표적화된 치료제, 구체적으로 비가역성 EGFR T790M 억제제 및 EGFR 억제제의 상승적인 조합에 관한 것이다.In another embodiment, the methods of the invention comprise administering an effective amount of an irreversible EGFR T790M inhibitor in combination with an effective amount of an EGFR inhibitor to a patient in need thereof in an amount sufficient to achieve a synergistic effect, To a method of treating lung cancer. In this embodiment, the methods of the present invention are directed to a synergistic combination of a targeted therapeutic agent, specifically an irreversible EGFR T790M inhibitor and an EGFR inhibitor.

본원에 사용된 "효과"량은 본 발명의 조합시 종양 세포의 성장 또는 암 전이의 진행을 예방하거나 억제하기에 충분한 물질, 제제, 화합물 또는 조성물의 양을 지칭한다. 또한, 투여량 및 투여 양생법의 치료적 또는 약학적 효과는 특정한 종양을 경험하는 환자에게서 완화를 유도하거나 강화하거나 유지하거나 연장하는 능력으로서 특징될 수 있다. The "effect" amount as used herein refers to an amount of a substance, agent, compound or composition sufficient to prevent or inhibit the growth of tumor cells or progression of cancer metastasis in the combination of the present invention. In addition, the therapeutic or pharmacological effects of the dosage and administration regimen can be characterized as the ability to induce, enhance, maintain or prolong palliation in a patient experiencing a particular tumor.

본원에 사용된 "비표준 임상 투여 양생법"은, EGFR의 단일 돌연변이체 형태(L858R 및 delE746-A750)를 효과적으로 억제하지만, 임상적인 설정에 통상적으로 사용되는 양 또는 투여량과 상이한, 물질, 제제, 화합물 또는 조성물을 투여하는 양생법을 지칭한다. "비표준 임상 투여 양생법"은 "비표준 임상 투여량" 또는 "비표준 투여 일정"을 포함한다. As used herein, the term " non-standard clinical dosing regimen "refers to a substance, agent, compound, compound or composition that effectively inhibits the single mutant form of EGFR (L858R and delE746- A750) but differs from the amount or dose normally used in clinical settings Or < / RTI > "Non-standard clinical dosage regimen" includes "non-standard clinical dosage" or "non-standard dosage schedule. &Quot;

본원에 사용된 "적은 투여량"은, EGFR의 단일 돌연변이체 형태(L858R 및 delE746-A750)를 효과적으로 억제하지만, 임상적인 설정에 통상적으로 사용되는 양 또는 투여량보다 적은 양 또는 투여량의 물질, 제제, 화합물 또는 조성물의 양 또는 투여량을 지칭한다.As used herein, "low doses" effectively inhibit the single mutant forms of EGFR (L858R and delE746-A750), but do not adversely affect the amount or dose of a substance, Compound, or composition of the invention.

당업자는 공지된 방법에 따라, 연령, 체중, 일반적인 건강, 투여된 화합물, 투여 경로, 치료를 필요로 하는 비소세포 폐암의 특성 및 발달, 다른 약제의 존재와 같은 인자를 고려하여, 본 발명의 조합에 사용된 바와 같이 환자에게 투여하기 위한 각각의 화합물의 적절한 양 또는 투여를 결정할 수 있을 것이다. Those skilled in the art will appreciate that combinations of the present invention may be used in accordance with known methods in consideration of factors such as age, weight, general health, the compound administered, the route of administration, the characteristics and development of non-small cell lung cancer requiring treatment, The appropriate amount or administration of each compound to be administered to a patient as used herein.

본 발명의 방법의 실시는 다양한 투여 양생법을 통해 수행될 수 있다. 본 발명의 조합 화합물은 간헐적으로, 동시적으로 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 투여 양생법의 반복은 필요에 따라 암 세포의 목적 감소 또는 축소를 달성하기 위해 수행될 수 있다. 일 실시양태에서, 본 발명의 조합 화합물은 간헐적인 투여 양생법으로 투여될 수 있다.The practice of the methods of the present invention may be carried out through various administration and curing methods. The combination compounds of the present invention may be administered intermittently, concurrently or sequentially. Repetition of the administration regimen may be carried out to achieve the desired reduction or reduction of the cancer cells as desired. In one embodiment, the combination compounds of the present invention may be administered by an intermittent administration regimen.

본 발명의 조합 화합물의 투여는 화합물을 작용 부위에 전달할 수 있는 임의의 방법에 의해 영향받을 수 있다. 이러한 방법은 경구 경로, 십이지장내 경로, 비경구 주사(정맥내, 피하, 근육내, 혈관내 또는 투입 포함), 국소 및 직장 투여를 포함한다.Administration of the combination compounds of the present invention may be effected by any method capable of delivering the compound to the site of action. Such methods include oral routes, intraduodenal routes, parenteral injections (including intravenous, subcutaneous, intramuscular, intravascular or infusion), topical and rectal administration.

본 발명의 방법 또는 조합 화합물은 투여 전에 제형화될 수 있다. 제형은 바람직하게는 특정한 투여 방식으로 채택될 것이다. 이러한 화합물은 당해 분야에 공지된 약학적으로 허용되는 담체로 제형화될 수 있고 당해 분야에 공지된 광범위한 투여 형태로 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물을 제조하는데 있어서, 활성 성분은 통상적으로 약학적으로 허용되는 담체와 혼합되거나, 담체로 희석되거나, 담체 내에 동봉될 것이다. 이러한 담체는 고체 희석제 또는 충전제, 부형제, 멸균수 배지 및 다양한 무독성 유기 용매를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 투여 단위 형태 또는 약학 조성물은 정제, 캡슐, 예컨대 젤라틴 캡슐, 알약, 분말, 과립, 수성 및 비수성 경구 용액 및 현탁액, 로젠지, 트로키, 하드 캔디, 스프레이, 크림, 고약(salve), 좌제, 젤리, 젤, 페이스트, 로션, 연고, 주사용수, 엘릭시르, 시럽 및 개별적인 투여량으로 세분하기 위해 채택된 용기에 포장된 비경구 용액을 포함한다.The methods or combination compounds of the invention may be formulated prior to administration. The formulations will preferably be employed in a particular mode of administration. Such compounds may be formulated into pharmaceutically acceptable carriers well known in the art and may be administered in a wide variety of dosage forms known in the art. In preparing the pharmaceutical compositions of the present invention, the active ingredient will usually be mixed with a pharmaceutically acceptable carrier, diluted with the carrier, or enclosed within the carrier. Such carriers include, but are not limited to, solid diluents or fillers, excipients, sterile water media and various non-toxic organic solvents. Dosage unit forms or pharmaceutical compositions may be in the form of tablets, capsules such as gelatin capsules, pills, powders, granules, aqueous and non-aqueous oral solutions and suspensions, lozenges, troches, hard candies, sprays, creams, Gels, gels, pastes, lotions, ointments, injectable solutions, elixirs, syrups and parenteral solutions packaged in containers adapted for subdivision into individual doses.

비경구 제형은 약학적으로 허용되는 수성 또는 비수성 용액, 분산제, 현탁제, 유화제, 및 이의 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올(프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 식물성유, 및 주사용 유기 에스터, 예컨대 에틸 올레에이트를 포함한다. 유동성을 코팅제, 예컨대 레시틴, 계면활성제의 사용에 의해 유지하거나, 적합한 입자 크기를 유지할 수 있다. 예시적인 비경구 투여 형태는 멸균 수용액, 예를 들면 수성 프로필렌 글리콜 또는 텍스트로스 용액 중 본 발명의 화합물의 용액 또는 현탁액을 포함한다. 이러한 투여 형태는 필요에 따라 적절하게 완충될 수 있다.Parenteral formulations include pharmaceutically acceptable aqueous or nonaqueous solutions, dispersing agents, suspending agents, emulsifying agents, and sterile powders for the manufacture thereof. Examples of carriers include water, ethanol, polyols (propylene glycol, polyethylene glycol), vegetable oils, and injectable organic esters such as ethyl oleate. Fluidity can be maintained by the use of coating agents such as lecithin, a surfactant, or to maintain a suitable particle size. Exemplary parenteral dosage forms include solutions or suspensions of the compounds of the invention in a sterile aqueous solution, for example, aqueous propylene glycol or a textol solution. Such dosage forms may be suitably buffered as needed.

추가적으로, 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 라우릴 설페이트 및 활석은 종종 정제화 목적에 유용하다. 또한 유사한 유형의 고체 조성물은 충전된 연질 및 경질 젤라틴 캡슐에 이용될 수 있다. 따라서, 바람직한 물질은 락토스 또는 유당 및 고분자랑 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 수성 현탁액 또는 엘릭시르가 경구 투여에 바람직한 경우, 이의 활성 화합물은 다양한 감미료 또는 착향료, 착색 물질 또는 염료, 및 필요에 따라 유화제 또는 현탁제와 함께 희석제, 예컨대 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 글리세린, 또는 이들의 조합물과 혼합될 수 있다. Additionally, lubricants such as magnesium stearate, sodium lauryl sulfate and talc are often useful for tabletting purposes. Solid compositions of a similar type may also be used in filled soft and hard gelatin capsules. Thus, preferred materials include lactose or lactose and high molecular weight polyethylene glycols. When aqueous suspensions or elixirs are desired for oral administration, the active compounds thereof may be formulated with various sweetening or flavoring agents, coloring matter or dyes, and, if desired, emulsifying or suspending agents with diluents such as water, ethanol, propylene glycol, glycerin, May be mixed with the combination.

특정한 양의 활성 화합물을 사용하여 다양한 약학 조성물을 제조하는 방법은 당업자에게 공지되어 있거나, 당업자에게 이해될 것이다. 예를 들면, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easter, Pa., 15th Edition (1975)]을 참조한다.Methods for preparing various pharmaceutical compositions using a particular amount of active compound are known to those skilled in the art or will be understood by those skilled in the art. See, for example, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easter, Pa., 15th Edition (1975).

또한, 본 발명은 본 발명의 조합 치료제 및 상기 치료제의 투여에 대하여 서면으로 된 설명서를 포함하는 키트에 관한 것이다. 일 실시양태에서, 서면으로 된 설명서는 치료제의 투여 방식, 예를 들면, 본 발명의 치료제의 동시적 또는 연속적 투여에 대하여 상세하게 한정한다. The invention also relates to a combination treatment of the invention and a kit comprising written instructions for the administration of said treatment. In one embodiment, written instructions specifically define the mode of administration of the therapeutic agent, for example simultaneous or sequential administration of the therapeutic agent of the present invention.

하기 제공된 실시예 및 제조예는 본원에 기재된 화합물 및 상기 화합물의 제조 방법을 추가로 서술하고 예시한다. 본원에 기재된 실시양태의 범주는 어떠한 방식으로도 하기 실시예　및 제조예를 제한하지 않는다. 하기 실시예에서, 단일 키랄 중심을 갖는 분자는, 달리 나타내지 않는 한 라세믹 혼합물로서 존재한다. 2개 이상의 키랄 중심을 갖는 이러한 분자는, 달리 나타내지 않는 한 부분입체이성질체의 라세믹 혼합물로서 존재한다. 단일 거울상이성질체/부분입체이성질체는 당업자에게 공지된 방법으로 수득될 수 있다.The examples and preparations provided below further describe and illustrate the compounds described herein and the preparation of such compounds. The scope of the embodiments described herein is not intended to limit the following examples and preparations in any way. In the following examples, molecules with a single chiral center are present as a racemic mixture, unless otherwise indicated. Such a molecule having two or more chiral centers is present as a racemic mixture of diastereomers unless otherwise indicated. Single enantiomers / diastereomers can be obtained by methods known to those skilled in the art.

제시된 실시예에서, 염 형태는 때때로 크로마토그래피 정제에 기초된 HPLC 동안 이동상 첨가제의 결과로서 단리된다. 이러한 경우에, 염, 예컨대 포름에이트, 트라이플루오로아세테이트 및 아세테이트는 추가 가공없이 단리되고 시험된다. 당업자는 표준 방법론(예컨대 이온 교환 컬럼을 사용하거나, 가벼운 수성 기제를 사용하여 단순 염기성 추출을 수행함)에 의해 자유 염기 형태를 달성할 수 있음이 인지될 것이다. In the example shown, the salt form is sometimes isolated as a result of the mobile phase additive during HPLC based on chromatographic purification. In this case, salts such as formate, trifluoroacetate and acetate are isolated and tested without further processing. Those skilled in the art will recognize that free base form can be achieved by standard methodology (e.g., using an ion exchange column or performing a simple basic extraction using a light aqueous base).

일반적으로, 본원에 기재된 화합물은 화학 분야에 공지된 공정, 특히 본원에 함유된 설명에 비추어 제조될 수 있다. 본원에 기재된 화합물의 특정한 제조 공정은 실시양태의 추가 특징으로서 제공되고 하기 제공된 반응식 및 실험 부분에 예시된다. In general, the compounds described herein may be prepared in view of processes known in the chemical art, particularly in light of the description contained herein. Certain processes for preparing the compounds described herein are provided as additional features of the embodiments and are illustrated in the reaction and experimental sections provided below.

실시예Example

실시예 1: 1-{(3R,4R)-3-[5-클로로-2-(1-메틸-1H-피라졸-4-일아미노)-7H-피롤로[Example 1: 1 - {(3R, 4R) -3- [5-Chloro-2- (l- 2,3-d]피리미딘2,3-d] pyrimidine -4--4- 일옥시메틸1-oxymethyl ]-4-]-4- 메톡시Methoxy -- 피롤리딘Pyrrolidine -1-일}-1 day} 프로페논Propenone 트라이플루오로아세테이트Trifluoroacetate (또한 "1-{(3R,4R)-3-[({5-(Also referred to as "1 - {(3R, 4R) -3 - [({5- 클로로Chloro -2-[(1--2 - [(1- 메틸methyl -1H--1H- 피라졸Pyrazole -4-일)아미노]-7H-Yl) amino] -7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘Pyrrolo [2,3-d] pyrimidine -4-일}-4-yl} 옥시Oxy )) 메틸methyl ]-4-]-4- 메톡시피롤리딘Methoxypyrrolidine -1-일}-1 day} 프로프Professional -2-엔-1-온 2-en-1-one 트라이플루오로아세테이트Trifluoroacetate " 및 "1-((3R,4R)-3-(((5-"And" 1 - ((3R, 4R) -3 - (((5- 클로로Chloro -2-((1--2 - ((1- 메틸methyl -1H-피라졸-4-일)아미노)-7H--LH-pyrazol-4-yl) amino) -7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘Pyrrolo [2,3-d] pyrimidine -4-일)Yl) 옥시Oxy )) 메틸methyl )-4-)-4- 메톡시피롤리딘Methoxypyrrolidine -1-일)-1 day) 프로프Professional -2-엔-1-온 2-en-1-one 트라이플루오로아세테이트Trifluoroacetate "로 공지됨)("화합물 A"의 "(Known as" Compound A " 트라TRA 이플루오로아세테이트 염)의 제조≪ / RTI > trifluoroacetate salt)

Figure pct00001
Figure pct00001

단계 1: (3S,4R)-1-벤질-4-메톡시-피롤리딘-3-카복실산 메틸 에스터의 제조Step 1: Preparation of (3S, 4R) -l-benzyl-4-methoxy-pyrrolidine-3-carboxylic acid methyl ester

Figure pct00002
Figure pct00002

0℃에서 2-Me-THF(600 mL) 및 TFA(6.7 mL) 중 (E)-3-메톡시-아크릴산 메틸 에스터(50 g, 430.6 mmol)의 용액에 N-(메톡시메틸)-N-(트라이메틸실릴메틸)-벤질아민(204 g, 2 eq)을 적가하였다. 첨가 후, 반응 생성물을 실온으로 가온하고 2 시간 동안 교반하였다. 반응 생성물을 분별 깔때기로 옮기고, 포화 NaHCO3, 포화 NaCl로 세척한 후, Na2SO4로 건조하고 용매를 제거하여 황색 오일로서 조질 라세믹 생성물을 수득하고, 이를 SiO2(10% 내지 35% EtOAc/헵탄)로 정제하여 황색 오일로서 라세믹 트랜스 생성물(82.7 g)을 수득하였다. 키랄-SFC(키랄팩(Chiralpak) AD-H 4.6 x 250 mm 컬럼 4% MeOH w/0.1% 다이에틸아민, 140 바, 3.0 mL/분)로 거울상이성질체를 분리하여 목적 단일 이성질체 생성물(34 g, 31.7% 수율)을 수득하고, 이를 공지된 표준물과 비교하여 확인하였다. 비회전(specific rotation) [α]D 27 = +23.8° (C=1.3, MeOH). 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.55-2.63(m, 2 H) 2.69(dd, J=9.95, 6.42 Hz, 1 H) 2.82-2.88(m, 1 H) 2.90-2.96(m, 1 H) 3.23(s, 3 H) 3.51-3.63(m, 2 H) 3.66(s, 3 H) 4.07-4.12(m, 1 H) 7.22-7.39(m, 5 H). (C14H19NO3)에 대한 m/z (APCI+): 250.0(M+H)+.To a solution of (E) -3-methoxy-acrylic acid methyl ester (50 g, 430.6 mmol) in 2-Me-THF (600 mL) and TFA (6.7 mL) at 0 C was added N- (methoxymethyl) -N - (trimethylsilylmethyl) -benzylamine (204 g, 2 eq) was added dropwise. After the addition, the reaction product was warmed to room temperature and stirred for 2 hours. The reaction product was transferred to a separatory funnel, washed with saturated NaHCO 3 , saturated NaCl, then dried over Na 2 SO 4 and solvent removed to give the crude racemic product as a yellow oil which was purified by SiO 2 (10% to 35% EtOAc / heptane) to give racemic trans product (82.7 g) as a yellow oil. The enantiomers were separated by chiral-SFC (Chiralpak AD-H 4.6 x 250 mm column 4% MeOH w / 0.1% diethylamine, 140 bar, 3.0 mL / min) to yield the desired single isomer product (34 g, 31.7% yield), which was confirmed by comparison with known standards. A non-rotating (specific rotation) [α] D 27 = + 23.8 ° (C = 1.3, MeOH). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6)? Ppm 2.55-2.63 (m, 2 H) 2.69 (dd, J = 9.95, 6.42 Hz, 1 H) 2.82-2.88 , 1H) 3.23 (s, 3H) 3.51-3.63 (m, 2H) 3.66 (s, 3H) 4.07-4.12 (m, 1H) 7.22-7.39 (m, 5H). (C 14 H 19 NO 3) m / z (APCI +) for: 250.0 (M + H) + .

단계 2: (3S,4R)-4-Step 2: (3S, 4R) -4- 메톡시Methoxy -- 피롤리딘Pyrrolidine -1,3--1,3- 다이카복실산Dicarboxylic acid 1-t-부틸 에스터 3- 1-t-Butyl Ester 3- 메틸methyl 에스터의 제조 Manufacture of Esters

Figure pct00003
Figure pct00003

에탄올(500 mL) 중 (3S,4R)-1-벤질-4-메톡시-피롤리딘-3-카복실산 메틸 에스터(35 g, 140.4 mmol)의 용액을 질소로 퍼징한 후 Pd(OH)2(2 g, 0.1 eq)를 첨가하고, 혼합물을 약 15 psi에서 (질소 풍선을 통해) 질소 가스의 대기하에 밤새 교반하였다. 이어서, 반응 생성물을 셀라이트를 통해 여과하고, 다이-t-부틸다이카보네이트(30.9 g, 1 eq)를 생성된 여액에 교반하면서 천천히 첨가하였다. 1 시간 후, 반응 생성물을 농축하고, 생성물이 완전히 용리될 때까지 조질 물질을 10% EtOAc/헵탄(2 용량), 이어서 1:1 EtOAc/헵탄으로 용리하는 짧은 실리카 컬럼을 통해 정제하였다. 생성물 분획을 합하고 농축하여 투명한 오일로서 표제 화합물(35.81 g, 98% 수율)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.39(s, 9 H) 3.17(br. s., 1 H) 3.23-3.28(m, 4 H) 3.35-3.53(m, 3 H) 3.65(s, 3 H) 4.06(d, J=4.78 Hz, 1 H). 생성물 - Boc(C7H13NO3)에 대한 m/z (APCI+): 160.1(M+H)+. 비회전: [a]D = -12.5°(C=0.87, MeOH).In ethanol (500 mL) (3S, 4R ) -1- benzyl-4-methoxy-pyrrolidine-3-carboxylic acid methyl ester [Pd (OH) was purged with nitrogen and a solution of (35 g, 140.4 mmol) 2 (2 g, 0.1 eq) and the mixture was stirred at about 15 psi (via nitrogen balloon) in an atmosphere of nitrogen gas overnight. The reaction product was then filtered through celite and di-t-butyl dicarbonate (30.9 g, 1 eq) was slowly added to the resulting filtrate with stirring. After 1 h, the reaction product was concentrated and the crude material was purified via a short silica column eluting with 10% EtOAc / heptane (2 volumes) then 1: 1 EtOAc / heptane until the product was completely eluted. The product fractions were combined and concentrated to give the title compound (35.81 g, 98% yield) as a clear oil. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6)? Ppm 1.39 (s, 9 H) 3.17 (br s, 1H) 3.23-3.28 (m, 4 H) 3.35-3.53 s, 3 H) 4.06 (d, J = 4.78 Hz, 1H). - product Boc (C 7 H 13 NO 3 ) m / z (APCI +) for: 160.1 (M + H) + . Rotation: [a] D = -12.5 (C = 0.87, MeOH).

단계 3: (3R,4R)-3-Step 3: (3R, 4R) -3- 하이드록시메틸Hydroxymethyl -4--4- 메톡시Methoxy -- 피롤리딘Pyrrolidine -1--One- 카복실산Carboxylic acid t-부틸 에스터의 제조 Preparation of t-butyl ester

Figure pct00004
Figure pct00004

리튬 보로하이드리드(12.7 g, 4 eq)를 THF(600 mL) 중 (3S,4R)-4-메톡시-피롤리딘-1,3-다이카복실산 1-t-부틸 에스터 3-메틸 에스터(35.81 g, 138.1 mmol)의 용액에 나눠서 첨가한 후, 반응 생성물을 60℃로 4 시간 동안 가열하였다. 반응 생성물을 0℃에서 물로 급랭하고 EtOAc로 추출하였다. 유기 층을 포화 NaCl로 세척하고 Na2SO4로 건조하였다. 용매를 제거하고, 잔사를 SiO2(3:1 EtOAc/헵탄)의 플러그를 통해 정제하여 투명 오일로서 표제 화합물(29.35 g, 92% 수율)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.46(s, 9 H) 2.37-2.47(m, 1 H) 3.19(dd, J=11.08, 5.29 Hz, 1 H) 3.33(d, J=4.03 Hz, 4 H) 3.50-3.66(m, 4H) 3.77-3.83(m, 1 H). 생성물 - Boc(C6H13NO2)에 대한 m/z (APCI+): 132.2(M+H)+. 비회전: [a]D= +9.3°(C=0.86, MeOH).Lithium borohydride (12.7 g, 4 eq) was added to a solution of (3S, 4R) -4-methoxy-pyrrolidine-l, 3- dicarboxylic acid 1-tert- butyl ester 3-methyl ester 35.81 g, 138.1 mmol) in dichloromethane (5 mL) and the reaction product was heated to 60 < 0 > C for 4 h. The reaction product was quenched with water at 0 < 0 > C and extracted with EtOAc. The organic layer was washed with saturated NaCl and dried over Na 2 SO 4. The solvent was removed and the residue was purified by SiO 2 (3: 1 EtOAc / heptane) to give the title compound (29.35 g, 92% yield) as a clear oil and purified through a plug of. 1 H NMR (400 MHz, chloroform -d) δ ppm 1.46 (s, 9 H) 2.37-2.47 (m, 1 H) 3.19 (dd, J = 11.08, 5.29 Hz, 1 H) 3.33 (d, J = 4.03 Hz, 4 H) 3.50 - 3.66 (m, 4 H) 3.77 - 3.83 (m, 1 H). - product Boc (C 6 H 13 NO 2 ) m / z (APCI +) for: 132.2 (M + H) + . Non-rotating: [?] D = + 9.3 (C = 0.86, MeOH).

단계 4: (3R,4R)-3-[5-클로로-2-(1-메틸-1H-피라졸-4-일아미노)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일옥시메틸]-4-메톡시-피롤리딘-1-카복실산 t-부틸 에스터의 제조Step 4: (3R, 4R) -3- [5-Chloro-2- (l -methyl-lH- pyrazol- 4- ylamino) -7H- pyrrolo [2,3- d] pyrimidin- 1-oxymethyl] -4-methoxy-pyrrolidine-l-carboxylic acid tert-butyl ester

Figure pct00005
Figure pct00005

방법 A: 마이크로파 가열을 사용함Method A: using microwave heating

바이크로파 바이알 중에서 1,4-다이옥산(15 mL) 중 2,4,5-트라이클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘(904 mg, 4.1 mmol) 및 (3R,4R)-3-하이드록시메틸-4-메톡시-피롤리딘-1-카복실산 t-부틸 에스터(940 mg, 4.1 mmol)의 용액에 칼륨 t-부톡사이드(톨루엔 중 25% w/w, 1.6 mL, 3.5 mmol)를 첨가하였다. 생성된 용액을 상온에서 15 분 동안 교반하였다. LCMS는 (3R,4R)-3-(2,5-다이클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일옥시메틸)-4-메톡시-피롤리딘-1-카복실산 t-부틸 에스터의 양적 형성을 나타낸다. 이 생성된 반응 용액에 1-메틸-1H-피라졸-4-일아민(474 mg, 4.9 mmol) 및 t-BuXPhos 팔라다사이클(110 mg, 0.04 mol eq)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 교반하고 45 분 동안 정상 흡수 수준에서 마이크로파를 사용하여 100℃로 가열하였다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 여액을 증발시켜 담색 잔사를 수득하였다. 조질 물질을 헵탄 중 0% 내지 100% EtOAc의 구배로 용리하는 플래시 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물(1.78 g, 76% 수율)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 11.50(br. s., 1 H) 9.06(s, 1 H) 7.85(s, 1 H) 7.52(s, 1 H) 7.05(d, J=2.27 Hz, 1 H) 4.30-4.53(m, 2 H) 3.86-3.96(m, 1 H) 3.80(s, 3 H) 3.55-3.68(m, 1 H) 3.43-3.53(m, 1 H) 3.24-3.31(m, 3 H) 2.71(br. s., 1 H) 1.39(br. s., 9 H). 생성물 - Boc에 대한 m/z (APCI+); Cl 동위원소 패턴을 갖는 C16H20ClN7O2: 378.1(M+H)+.Pyrrolo [2,3-d] pyrimidine (904 mg, 4.1 mmol) and (3R, 4R) -tetrahydro-2H- To a solution of 3-hydroxymethyl-4-methoxy-pyrrolidine-l-carboxylic acid tert-butyl ester (940 mg, 4.1 mmol) in potassium t-butoxide (25% w / w in toluene, 1.6 mL, 3.5 mmol). The resulting solution was stirred at ambient temperature for 15 minutes. LCMS was carried out using (3R, 4R) -3- (2,5-dichloro-7H-pyrrolo [2,3- d] pyrimidin- 4- yloxymethyl) -4- methoxy-pyrrolidin- Carboxylic acid tert-butyl ester. 1-Methyl-1H-pyrazol-4-ylamine (474 mg, 4.9 mmol) and t-BuXPhos palladacycle (110 mg, 0.04 mol eq) were added to the resulting reaction solution. The reaction mixture was stirred and heated to 100 < 0 > C using microwave at normal absorption level for 45 minutes. The reaction mixture was filtered through celite and the filtrate was evaporated to give a pale residue. The crude material was purified by flash chromatography eluting with a gradient of 0% to 100% EtOAc in heptane to give the title compound (1.78 g, 76% yield). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6)? Ppm 11.50 (br s, 1H) 9.06 (s, 1H) 7.85 2.27 Hz, 1H) 4.30-4.53 (m, 2H) 3.86-3.96 (m, 1H) 3.80 (s, 3H) 3.55-3.68 -3.31 (m, 3 H) 2.71 (br s, 1 H) 1.39 (br s, 9 H). Product - m / z (APCI +) for Boc; C 16 H 20 ClN 7 O 2 : 378.1 (M + H) < + > having a Cl isotope pattern.

방법 B: 열역학적 가열을 사용함Method B: using thermodynamic heating

환저 플라스크 중에서 1,4-다이옥산(100 mL) 중 2,4,5-트라이클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘(9.28 g, 41.7 mmol) 및 (3R,4R)-3-하이드록시메틸-4-메톡시-피롤리딘-1-카복실산 t-부틸 에스터(9.65 g, 41.7 mmol)의 용액에 칼륨 t-부톡사이드(톨루엔 중 25% w/w, 80 mL, 167 mmol)를 첨가하였다. 생성된 반응 용액을 상온에서 30 분 동안 교반하였다. LCMS는 (3R,4R)-3-(2,5-다이클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일옥시메틸)-4-메톡시-피롤리딘-1-카복실산 t-부틸 에스터의 양적 형성을 나타낸다. 생성된 반응 용액에 1-메틸-1H-피라졸-4-일아민(4.86 g, 50.1 mmol) 및 t-BuXPhos 팔라다사이클(1.1 g, 1.67 mmol, 0.04 mol eq)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 교반하고, 오일 욕에서 90℃로 1 시간 동안 가열하였다. 이어서, 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 여액을 증발시켜 휘발성 물질을 제거하여 담샘 검을 수득한 후 이를 에틸 아세테이트(300 mL)에 용해하고 실리카 셀 플러그를 통해 여과하였다. 여액을 증발시키고, 잔사를 헵탄 중 0% 내지 100% EtOAc의 구배로 용리하는 플래시 크로마토그래피를 통해 정제하여 표제 화합물(12.4 g, 62% 수율)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 11.51(br. s., 1 H) 9.07(s, 1 H) 7.86(s, 1 H) 7.52(s, 1 H) 7.06(d, J=2.20 Hz, 1 H) 4.31-4.54(m, 2 H) 3.92(br. s., 1 H) 3.80(s, 3 H) 3.55-3.68(m, 1 H) 3.44-3.55(m, 1 H) 3.30(d, J=18.34 Hz, 3 H) 2.72(br. s., 1 H) 1.39(br. s., 9 H). Cl 동위원소 패턴을 갖는 C21H28ClN7O4에 대한 m/z (APCI+): 378.2(M+H)+.2,4,5-trichloro-7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidine (9.28 g, 41.7 mmol) and (3R, 4R) -3 (25% w / w in toluene, 80 mL, 167 mmol) was added to a solution of 4-methoxy-pyrrolidine-1-carboxylic acid tert- butyl ester (9.65 g, 41.7 mmol) ). The resulting reaction solution was stirred at room temperature for 30 minutes. LCMS was carried out using (3R, 4R) -3- (2,5-dichloro-7H-pyrrolo [2,3- d] pyrimidin- 4- yloxymethyl) -4- methoxy-pyrrolidin- Carboxylic acid tert-butyl ester. 1-Methyl-1H-pyrazol-4-ylamine (4.86 g, 50.1 mmol) and t-BuXPhos palladacycle (1.1 g, 1.67 mmol, 0.04 mol eq) were added to the resulting reaction solution. The reaction mixture was stirred and heated in an oil bath to 90 < 0 > C for 1 hour. The reaction mixture was then filtered through celite and the filtrate was evaporated to remove volatiles to give pseudohalam gum which was dissolved in ethyl acetate (300 mL) and filtered through a silica cell plug. The filtrate was evaporated and the residue was purified by flash chromatography eluting with a gradient of 0% to 100% EtOAc in heptane to give the title compound (12.4 g, 62% yield). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6)? Ppm 11.51 (br s, 1H) 9.07 (s, 1H) 7.86 2.20 Hz, 1H) 4.31-4.54 (m, 2H) 3.92 (br s, 1H) 3.80 (s, 3H) 3.55-3.68 (m, 1H) 3.44-3.55 3.30 (d, J = 18.34 Hz, 3 H) 2.72 (br s, 1H) 1.39 (br s, 9H). M / z for Cl C 21 H 28 ClN 7 O 4 having a isotope pattern (APCI +): + 378.2 ( M + H).

단계 5: [5-Step 5: [5- 클로로Chloro -4-((3R,4R)-4--4 - ((3R, 4R) -4- 메톡시Methoxy -- 피롤리딘Pyrrolidine -3--3- 일메톡시Ylmethoxy )-7H-) -7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘Pyrrolo [2,3-d] pyrimidine -2-일]-(1-Yl] - (1- 메틸methyl -1H--1H- 피라졸Pyrazole -4-일)-아민 -4-yl) -amine 트라이플루오로아세테이트Trifluoroacetate 의 제조Manufacturing

Figure pct00006
Figure pct00006

0℃에서 DCM(60 mL) 중 (3R,4R)-3-[5-클로로-2-(1-메틸-1H-피라졸-4-일아미노)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일옥시메틸]-4-메톡시-피롤리딘-1-카복실산 t-부틸 에스터(12.40 g, 26 mmol)의 용액에 TFA(10.1 mL, 208 mmol)를 첨가하고, 생성된 용액을 상온에서 2.5 시간 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 제거하고, 잔사에 에틸 에터(150 mL)를 첨가하였다. 생성된 현탁액을 2 시간 동안 교반한 후 여과하여 연분홍색 고체를 수득하였다. 이를 에틸 에터(30 mL)로 세척하고, 건조하여 TEA 염으로서 표제 화합물(15.69 g, 정량)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 11.56(br. s., 1 H) 9.09(s, 3 H) 7.85(s, 1 H) 7.54(s, 1 H) 7.09(d, J=2.32 Hz, 1 H) 4.48(d, J=6.48 Hz, 2 H) 4.11(br. s., 1 H) 3.81(s, 3 H) 3.46-3.60(m, 1 H) 3.35-3.45(m, 2 H) 3.32(s, 3 H) 3.15(dq, J=12.01, 6.02 Hz, 1 H) 2.88(m, J=6.42, 6.42 Hz, 1 H). Cl 동위원소 패턴을 갖는 모 분자 C16H20ClN7O2에 대한 m/z (APCI+): 378.2(M+H)+.To a solution of (3R, 4R) -3- [5-chloro-2- (l -methyl-lH-pyrazol-4-ylamino) -7H- pyrrolo [2,3- d ] Pyrimidin-4-yloxymethyl] -4-methoxy-pyrrolidine- 1-carboxylic acid tert-butyl ester (12.40 g, 26 mmol) in THF (10.1 mL, Was stirred at room temperature for 2.5 hours. The volatiles were removed and ethyl ether (150 mL) was added to the residue. The resulting suspension was stirred for 2 hours and then filtered to give a pale pink solid. This was washed with ethyl ether (30 mL) and dried to give the title compound (15.69 g, quant.) As the TEA salt. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6)? Ppm 11.56 (s, 1 H) 9.09 (s, 3 H) 7.85 3.81 (s, 3 H) 3.46 - 3.60 (m, 1 H) 3.35 - 3.45 (m, 1 H) 2 H) 3.32 (s, 3 H) 3.15 (dq, J = 12.01, 6.02 Hz, 1H) 2.88 (m, J = 6.42, 6.42 Hz, 1H). Cl isotope parent molecule having a pattern C 16 H 20 ClN 7 m / z for O 2 (APCI +): 378.2 (M + H) +.

단계 6: 1-{(3R,4R)-3-[5-Step 6: l - {(3R, 4R) -3- [5- 클로로Chloro -2-(1--2- (1- 메틸methyl -1H--1H- 피라졸Pyrazole -4--4- 일아미노Amino )-7H-) -7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘Pyrrolo [2,3-d] pyrimidine -4--4- 일옥시메틸1-oxymethyl ]-4-]-4- 메톡시Methoxy -- 피롤리딘Pyrrolidine -1-일}-1 day} 프로페논Propenone 트라이플루오로아세테이트의Of trifluoroacetate 제조 Produce

Figure pct00007
Figure pct00007

[5-클로로-4-((3R,4R)-4-메톡시-피롤리딘-3-일메톡시)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일]-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)-아민(15.0 g(2 TFA 염)), 24.7 mmol), 에틸 아세테이트(200 mL) 및 포화 수성 NaHCO3(100 mL)의 혼합물을 0℃에서 10 분 동안 교반하였다. 아크릴로일 클로라이드(2.3 mL, 29 mmol, 1.1 mol eq)를 적가하고, 생성된 혼합물을 상온에서 30 분 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트(150 mL)를 첨가하고, 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 에틸 아세테이트(150 mL)로 추출하고, 합한 유기 층을 Na2SO4로 건조하고 증발시켜 고체를 수득하고, 이를 SFC(120 바에서 CO2 중 35% EtOH로 용리하는 ZymorSPHER HAP 5 μ 21.2 x 150 mm 컬럼, 유동 64 mL/분)로 정제하여 회백색 고체로서 표제 화합물(8.3 g, 78% 수율)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 11.51(s, 1 H) 9.07(s, 1 H) 7.86(s, 1 H) 7.52(s, 1 H) 7.05(s, 1 H) 6.59(ddd, J=16.75, 10.27, 1.34 Hz, 1 H) 6.14(dd, J=16.75, 2.32 Hz, 1 H) 5.68(dt, J=10.27, 2.32 Hz, 1 H) 4.44(d, J=6.24 Hz, 2 H) 3.82-4.09(m, 2 H) 3.80(s, 3 H) 3.57-3.76(m, 2 H) 3.47-3.54(m, 1 H) 3.31(d, J=4.65 Hz, 3 H) 2.67-2.92(m, 1 H). Cl 동위원소 패턴을 갖는 모 분자 C19H22ClN7O3에 대한 m/z (APCI+): 431.9(M+H)+.Pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-2-yl] - (1-methyl-pyrrolidin-2-ylmethoxy) (15.0 g, 2 TFA salt), 24.7 mmol), ethyl acetate (200 mL) and saturated aqueous NaHCO 3 (100 mL) was added dropwise to a solution of 10 Lt; / RTI > Acryloyl chloride (2.3 mL, 29 mmol, 1.1 mol eq) was added dropwise and the resulting mixture was stirred at ambient temperature for 30 min. Ethyl acetate (150 mL) was added and the organic layer was separated. The aqueous layer was extracted with ethyl acetate (150 mL) and the combined and dried and evaporated to give the organic layer with Na 2 SO 4 to give a solid which, ZymorSPHER HAP which eluted in SFC (120 bar with 35% EtOH in CO 2 5 μ 21.2 x 150 mm column, flow 64 mL / min) to afford the title compound (8.3 g, 78% yield) as an off-white solid. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6)? Ppm 11.51 (s, 1H) 9.07 (s, 1H) 7.86 ddd, J = 16.75, 10.27, 1.34 Hz, 1H) 6.14 (dd, J = 16.75, 2.32 Hz, 1H) 5.68 (dt, J = 10.27, 2.32 Hz, 1H) (M, 1H), 3.31 (d, J = 4.65 Hz, 3H), 3.82-3.56 2.67-2.92 (m, 1H). Cl isotope parent molecule having a pattern C 19 H 22 ClN 7 m / z for O 3 (APCI +): + 431.9 (M + H).

대체 how 실시예Example 1: 1-{(3R,4R)-3-[({5- 1: 1 - {(3R, 4R) -3 - [({5- 클로로Chloro -2-[(1--2 - [(1- 메틸methyl -1H--1H- 피라졸Pyrazole -4-일)아미노]-7H-Yl) amino] -7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘Pyrrolo [2,3-d] pyrimidine -4-일}-4-yl} 옥시Oxy )) 메틸methyl ]-4-]-4- 메톡시피롤리딘Methoxypyrrolidine -1-일}-1 day} 프로프Professional -2-엔-1-온("1-((3R,4R)-3-(((5-(1 - ((3R, 4R) -3 - (((5- 클로로Chloro -2-((1--2 - ((1- 메틸methyl -1H--1H- 피라졸Pyrazole -4-일)아미노)-7H-Yl) amino) -7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘Pyrrolo [2,3-d] pyrimidine -4-일)Yl) 옥시Oxy )) 메틸methyl )-4-)-4- 메톡시피롤리딘Methoxypyrrolidine -1-일)-1 day) 프로프Professional -2-엔-1-온"으로도 공지됨)(화합물 A)의 제조2-en-1-one ") (Compound A)

Figure pct00008
Figure pct00008

단계 1: Step 1: 메틸methyl (3,4-트랜스)-1-벤질-4-(3,4-trans) -1-benzyl-4- 메톡시피롤리딘Methoxypyrrolidine -3--3- 카복실레이트의Carboxylate 제조 Produce

Figure pct00009
Figure pct00009

자기로 교반하면서 질소 대기하에, 메틸 트랜스-3-메톡시아크릴레이트(500 mL, 540 g, 4.65 mol) 및 벤질 메톡시메틸트라이메틸실릴아민(595 mL, 552.1 g, 2.3 mol)을 혼합하였다. 이 혼합물에 약 95℃로 30 초 동안 발열하여 생성된 TFA(2.7 mL, 4.14 g, 36.3 mmol)를 첨가하였다. 이어서, 생성된 혼합물을 1 시간 동안 환류 가열하였다(주: 초기 환류 온도는 약 104℃이었고 1 시간 후 이를 약 90℃로 떨어뜨렸다). 벤질 메톡시메틸트라이메틸실릴아민 화합물(325 mL)을 사용하여 이러한 규모의 3개의 배치(batch) 및 또 다른 배치를 수행하였다. 이러한 배치 중 2개를 합하고 2 N HCl(5 L)에 부었다. 혼합물을 EtOAc(3 L 및 2 L)로 추출하였다. 얼음으로 냉각하면서, 50% NaOH(수성)를 첨가하여 수성 층의 pH가 9가 되게 하였다. 수성 층을 EtOAc(2.5 L, 1.5 L 및 1 L)로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수(3 L)로 세척하고, Na2SO4로 건조하였다. 나머지 배치에 대하여 동일한 후처리를 수행하였다. 모든 유기 층을 여과하고, 여액을 진공에서 농축하여 표제 화합물(라세믹-트랜스, 1640 g)을 수득하였다. 벌브-대-벌브 증류(0.1 mbar, 100℃ 내지 145℃)로 배치를 정제한 후, 황색 오일로서 표제 화합물(69% 전체 수율)을 단리하였다.Methyl trans-3-methoxyacrylate (500 mL, 540 g, 4.65 mol) and benzylmethoxymethyl trimethylsilylamine (595 mL, 552.1 g, 2.3 mol) were mixed under nitrogen atmosphere while stirring under magnetic stirring. To this mixture was added TFA (2.7 mL, 4.14 g, 36.3 mmol) generated by heating at about 95 ° C for 30 seconds. The resulting mixture was then heated to reflux for 1 hour (note: the initial reflux temperature was about 104 ° C and after 1 hour it was dropped to about 90 ° C). Three batches of this scale and another batch were carried out using benzylmethoxymethyl trimethylsilylamine compound (325 mL). Two of these batches were combined and poured into 2 N HCl (5 L). The mixture was extracted with EtOAc (3 L and 2 L). While cooling with ice, 50% NaOH (aq) was added to bring the pH of the aqueous layer to 9. The aqueous layer was extracted with EtOAc (2.5 L, 1.5 L and 1 L). The combined organic layers were washed with brine (3 L) and dried over Na 2 SO 4 . The same post-treatment was performed for the remaining batches. All organic layers were filtered and the filtrate was concentrated in vacuo to give the title compound (racemic-trans, 1640 g). After purification of the batch as a bulb-to-bulb distillation (0.1 mbar, 100-145 ° C), the title compound (69% overall yield) was isolated as a yellow oil.

단계 2: Step 2: 메틸methyl (3,4-트랜스)-4-(3,4-trans) -4- 메톡시피롤리딘Methoxypyrrolidine -3--3- 카복실레이트의Carboxylate 제조 Produce

Figure pct00010
Figure pct00010

메틸(3,4-트랜스)-1-벤질-4-메톡시피롤리딘-3-카복실레이트(463.3 g, 1858 mmol)를 iPrOH(2 L)에 용해하였다. 이 용액에 20% Pd(OH)2/C(50 g, 37% 수분, 알드리치(Aldrich))를 첨가하고, 혼합물을 격렬하게 교반하였다. 11.8 바 H2의 압력을 적용하고, 1H-NMR이 완전 전환을 나타낼 때까지 수회 재충전을 수행하였다. 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 셀라이트를 iPrOH로 헹궜다. 여액을 진공에서 농축하여 담황색 액체로서 표제 화합물(266 g, 90% 수율)을 수득하였다. 다음 단계에서 사용하였다.Methyl (3,4-trans) -1-benzyl-4-methoxypyrrolidine-3-carboxylate (463.3 g, 1858 mmol) was dissolved in iPrOH (2 L). To this solution was added 20% Pd (OH) 2 / C (50 g, 37% moisture, Aldrich) and the mixture was stirred vigorously. The pressure of 11.8 bar H 2 was applied and multiple recharges were performed until 1 H-NMR showed complete conversion. The mixture is filtered through celite and the celite is rinsed with iPrOH. The filtrate was concentrated in vacuo to give the title compound (266 g, 90% yield) as a pale yellow liquid. Used in the next step.

단계 3: (3R,4S)-3-Step 3: (3R, 4S) -3- 메톡시Methoxy -4-(-4-( 메톡시카본일Methoxycarbonyl )) 피롤리디늄Pyrrolidinium (2R,3R)-2,3-비스((2R, 3R) -2,3-bis ( 벤질옥시Benzyloxy )-3-) -3- 카복시프로판오에이트의Carboxypropanoate 제조 Produce

Figure pct00011
Figure pct00011

에탄올(5 L) 중 O,O-다이벤조일-L-타르타르산(1 kg, 2.79 mol)의 가온 용액에 에탄올(1 L) 중 메틸(3,4-트랜스)-4-메톡시피롤리딘-3-카복실레이트(480 g, 2.84 mol)의 용액을 첨가하였다. 투명 용액을 시딩하고, 밤새 결정화하였다. 생성된 고체를 단리하고 에탄올로 세척하였다. 이 농축된 물질을 에탄올로부터 5회 재결정화하여(5 L 2회, 4 L, 3.5 L 및 3 L) 98%의 과잉 거울상이성질체를 갖는 염(216 g, 15% 수율)을 수득하였다(하기 조건을 사용하여 Rt = 12.18 분).To a warm solution of O, O-dibenzoyl-L-tartaric acid (1 kg, 2.79 mol) in ethanol (5 L) was added methyl (3,4- trans) -4-methoxypyrrolidin- -Carboxylate (480 g, 2.84 mol) in tetrahydrofuran was added. The clear solution was seeded and crystallized overnight. The resulting solid was isolated and washed with ethanol. This concentrated material was recrystallized five times from ethanol (5 L 2, 4 L, 3.5 L and 3 L) to give a salt (216 g, 15% yield) with 98% excess enantiomer Using Rt = 12.18 min).

키랄 순도 측정:Chiral purity measurement:

샘플 제조: 염(5 mg)을 DCM(1.5 mL) 및 2 N NaOH(0.2 mL)와 혼합하였다. DCM 층을 건조하고 기체 크로마토그래피로 분석하였다.Sample preparation: The salt (5 mg) was mixed with DCM (1.5 mL) and 2 N NaOH (0.2 mL). The DCM layer was dried and analyzed by gas chromatography.

컬럼: 아질런트 사이클로실(Agilent Cyclosil) B; 30 m x 250 cm x 0.25 cm Column: Agilent Cyclosil B; 30 m x 250 cm x 0.25 cm

온도: 90℃(0 분) 내지 5℃/분 내지 180℃(4 분). 총 실행 시간: 22 분.Temperature: 90 占 폚 (0 minutes) to 5 占 폚 / min to 180 占 폚 (4 minutes). Total run time: 22 minutes.

주입 온도: 250℃Injection temperature: 250 ℃

검출기: 250℃; FIDDetector: 250 DEG C; FID

주입 용량: 1.0 ㎕Injection volume: 1.0 μl

분할 비: 25:1Split ratio: 25: 1

컬럼 유동: 2.2 mL/분(H2)Column flow: 2.2 mL / min (H2)

단계 4: 1-t-부틸 3-Step 4: 1-tert-Butyl 3- 메틸methyl (3S,4R)-4-(3S, 4R) -4- 메톡시피롤리딘Methoxypyrrolidine -1,3--1,3- 다이카복실레이트의Dicarboxylate 제조 Produce

Figure pct00012
Figure pct00012

DCM 중 (3R,4S)-3-메톡시-4-(메톡시카본일)피롤리디늄(2R,3R)-2,3-비스(벤질옥시)-3-카복시프로판오에이트(216 g, 420 mmol) 및 포화 NaHCO3의 혼합물을 기계적으로 교반하고, Boc2O(119 g, 546 mmol)를 나눠서 첨가하였다. 혼합물을 밤새 실온에서 교반하고, 층을 분리하였다. 수성 상을 DCM으로 추출하고, 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 건조하고 농축하였다. 33% Boc2O와 혼합된 조질 표제 생성물(138 g, 85% 수율)을 수득하였다. 다음 단계에서 직접 사용하였다.To a solution of (3R, 4S) -3-methoxy-4- (methoxycarbonyl) pyrrolidinium (2R, 3R) -2,3-bis (benzyloxy) -3- carboxypropanoate 420 mmol) and saturated NaHCO 3 the mixture was stirred in a mechanically and was added by dividing the Boc 2 O (119 g, 546 mmol). The mixture was stirred overnight at room temperature and the layers were separated. The aqueous phase was extracted with DCM and the combined organic layers were washed with brine, dried and concentrated. The crude title product (138 g, 85% yield) mixed with 33% Boc 2 O was obtained. It was used directly in the next step.

단계 5: t-부틸(3R,4R)-3-(Step 5: Preparation of t-butyl (3R, 4R) -3- ( 하이드록시메틸Hydroxymethyl )-4-)-4- 메톡시피롤리딘Methoxypyrrolidine -1--One- 카복실레이트의Carboxylate 제조 Produce

Figure pct00013
Figure pct00013

1-t-부틸 3-메틸(3S,4R)-4-메톡시피롤리딘-1,3-다이카복실레이트(138 g, Boc2O 함유, 약 2:1, 약 0.35 mol)를 THF(2 L)에 용해하였다. 용액을 기계적으로 교반하고, -78℃로 냉각하였다. 리튬 알루미늄 하이드리드(THF 중 2.4 M, 200 mL, 0.5 mol)의 용액을 30 분간에 걸쳐서 적가하면서, -70℃ 미만의 온도로 유지하였다. 이어서, 온도를 -30℃로 올렸다. 나트륨 칼륨 타르트레이트 테트라하이드레이트(수성, 100 mL)의 포화 용액을 천천히 첨가하여 반응 생성물을 급랭하였다. 고체 물질을 Na2SO4의 베드로 여과 제거하였다. 여액을 진공에서 농축하여 거의 무색 시럽으로서 표제 화합물(66 g, 0.28 mol, 약 80% 수율)을 수득하였다. 1H-NMR(300 MHz, CDCl3): ppm 3.80(q, J= 5.1 Hz, 1H), 3.62(d, J=6.2 Hz, 2H), 3.56(m, 1H), 3.52(d, J=7.4 Hz, 1H), 3.40-3.30(m, 1H), 3.36(s, 3H), 2.42(m, 1H), 1.46(s, 9H). C11H21NO4에 대한 m/z (GCMS): 231.2(M)+. C11H21NO4에 대한 m/z (APCI+): 132.0(M+H)+. 비회전: [a]D = +11.6°(c 0.77, MeOH). 키랄 순도 측정 방법: 키랄팩 AD-H 21.2 x 250 mm 5 μ 컬럼을 35℃에서 2% MeOH:88% CO2의 이동상으로 용출하고, 120 바로 보유하였다. 유속: 62 mL/분. 체류 시간: 3.36 분.(138 g, containing Boc 2 O, about 2: 1, about 0.35 mol) was dissolved in THF (2, 1, L). The solution was mechanically stirred and cooled to -78 < 0 > C. A solution of lithium aluminum hydride (2.4 M in THF, 200 mL, 0.5 mol) was added dropwise over 30 minutes while maintaining the temperature below -70 < 0 > C. The temperature was then raised to -30 占 폚. A saturated solution of sodium potassium tartrate tetrahydrate (aq., 100 mL) was slowly added to quench the reaction product. The solid material was filtered off with Na 2 SO 4 bed. The filtrate was concentrated in vacuo to give the title compound (66 g, 0.28 mol, ca. 80% yield) as almost colorless syrup. 1 H-NMR (300 MHz, CDCl 3): ppm 3.80 (q, J = 5.1 Hz, 1H), 3.62 (d, J = 6.2 Hz, 2H), 3.56 (m, 1H), 3.52 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 3.40-3.30 (m, 1H), 3.36 (s, 3H), 2.42 (m, 1H), 1.46 (s, 9H). M / z (GCMS) for C 11 H 21 NO 4 : 231.2 (M) < + & gt ; . C 11 H 21 NO 4 m / z (APCI +) for: 132.0 (M + H) + . Non-rotating: [a] D = + 11.6 [deg.] (C 0.77, MeOH). Chiral Purity Measurement Method: Chiralpak AD-H 21.2 x 250 mm 5 μ column was eluted with mobile phase of 2% MeOH: 88% CO 2 at 35 ° C and immediately held at 120 ° C. Flow rate: 62 mL / min. Retention time: 3.36 minutes.

단계 6: t-부틸(3R,4R)-3-[({5-Step 6: t-Butyl (3R, 4R) -3 - [({5- 클로로Chloro -2-[(1--2 - [(1- 메틸methyl -1H--1H- 피라졸Pyrazole -4-일)아미노]-7H-피Yl) amino] -7H-pyrrolo [2,3-c] 롤로[2,3-d]피리미2,3-d] pyrimidine 딘-4-일}4-yl} 옥시Oxy )) 메틸methyl ]-4-]-4- 메톡시피롤리딘Methoxypyrrolidine -1--One- 카복실레이트의Carboxylate 제조  Produce

Figure pct00014
Figure pct00014

환저 플라스크 중에서 1,4-다이옥산(100 mL) 중 2,4,5-트라이클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘(9.28 g, 41.7 mmol) 및 t-부틸(3R,4R)-3-(하이드록시메틸)-4-메톡시피롤리딘-1-카복실레이트 9.65 g, 41.7 mmol)의 용액에 칼륨 t-부톡사이드(톨루엔 중 25% w/w, 80 mL, 167 mmol)를 첨가하였다. 생성된 반응 용액을 상온에서 30 분 동안 교반하였다. LCMS는 중간체 t-부틸(3R,4R)-3-{[(2,5-다이클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)옥시]메틸}-4-메톡시피롤리딘-1-카복실레이트의 양적 형성을 나타낸다. 상기 반응 용액에 1-메틸-1H-피라졸-4-일아민(4.86 g, 50.1 mmol) 및 t-BuXPhos 팔라다사이클(1.1 g, 1.67 mmol, 0.04 mol eq)을 첨가하고, 반응 혼합물을 교반하고 오일 욕에서 1 시간 동안 90℃로 가열하였다. LCMS는 반응이 완료됨을 나타낸다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 셀라이트를 에틸 아세테이트(200 mL)로 세척하였다. 합한 여액을 증발시켜 휘발성 물질을 제거하여 담색 잔사를 수득하였다. 이 잔사를 에틸 아세테이트(300 mL)에 용해하고, 실리카 겔 플러그를 통해 여과하였다. 여액을 증발시키고, 잔사를 헵탄 중 0 내지 100% EtOAc의 구배로 용리하는 플래시 크로마토그래피를 통해 여과하여 표제 화합물(12.4 g, 62% 수율)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 11.51(br. s., 1 H) 9.07(s, 1 H) 7.86(s, 1 H) 7.52(s, 1 H) 7.06(d, J=2.20 Hz, 1 H) 4.31-4.54(m, 2 H) 3.92(br. s., 1 H) 3.80(s, 3 H) 3.55-3.68(m, 1 H) 3.44-3.55(m, 1 H) 3.30(d, J=18.34 Hz, 3 H) 2.72(br. s., 1 H) 1.39(br. s., 9 H). Cl 동위원소 패턴을 갖는 C21H28ClN7O4에 대한 m/z (APCI+): 378.2(M+H)+. 광학 회전: [a]d= -8.3°(c=0.24, MeOH).Pyrrole [2,3-d] pyrimidine (9.28 g, 41.7 mmol) and t-butyl (3R, 4R Butoxide (25% w / w in toluene, 80 mL, 167 mmol) was added to a solution of 3-amino-3- (hydroxymethyl) -4- methoxypyrrolidine- 1-carboxylate (9.65 g, 41.7 mmol) Was added. The resulting reaction solution was stirred at room temperature for 30 minutes. LCMS was carried out in the same manner as in Example 1 except that the intermediate t-butyl (3R, 4R) -3 - {[(2,5-dichloro-7H- pyrrolo [2,3- d] pyrimidin- 1-carboxylate. ≪ / RTI > To the reaction solution was added 1-methyl-1H-pyrazol-4-ylamine (4.86 g, 50.1 mmol) and t-BuXPhos palladacycle (1.1 g, 1.67 mmol, 0.04 mol eq) And heated to 90 < 0 > C for 1 hour in an oil bath. LCMS indicates that the reaction is complete. The reaction mixture was filtered through celite and the celite was washed with ethyl acetate (200 mL). The combined filtrate was evaporated to remove volatiles and a pale residue was obtained. The residue was dissolved in ethyl acetate (300 mL) and filtered through a silica gel plug. The filtrate was evaporated and the residue was filtered through flash chromatography eluting with a gradient of 0-100% EtOAc in heptane to give the title compound (12.4 g, 62% yield). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6)? Ppm 11.51 (br s, 1H) 9.07 (s, 1H) 7.86 2.20 Hz, 1H) 4.31-4.54 (m, 2H) 3.92 (br s, 1H) 3.80 (s, 3H) 3.55-3.68 (m, 1H) 3.44-3.55 3.30 (d, J = 18.34 Hz, 3 H) 2.72 (br s, 1H) 1.39 (br s, 9H). M / z for Cl C 21 H 28 ClN 7 O 4 having a isotope pattern (APCI +): + 378.2 ( M + H). Optical Rotation: [a] d = -8.3 [deg.] (C = 0.24, MeOH).

단계 7: (3R,4R)-3-[({5-Step 7: (3R, 4R) -3 - [({5- 클로로Chloro -2-[(1--2 - [(1- 메틸methyl -1H--1H- 피라졸Pyrazole -4-일)아미노]-7H-Yl) amino] -7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘Pyrrolo [2,3-d] pyrimidine -4-일}-4-yl} 옥시Oxy )) 메틸methyl ]-4-]-4- 메톡시피롤리디늄Methoxypyrrolidinium 트라이플루오로아세테이트Trifluoroacetate 의 제조Manufacturing

Figure pct00015
Figure pct00015

수욕에서 DCM (60 mL) 중 t-부틸(3R,4R)-3-[({5-클로로-2-[(1-메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}옥시)메틸]-4-메톡시피롤리딘-1-카복실레이트(12.40 g, 26 mmol)의 용액에 TFA(10.1 mL, 208 mmol)를 첨가하고, 생성된 용액을 상온에서 2.5 시간 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 제거하여 잔사를 수득하고, 이에 에틸 에터(150 mL)를 첨가하였다. 생성된 현탁액을 2 시간 동안 교반하고, 연분홍색 고체를 여과로 수집하고, 에틸 에터(30 mL)로 세척하고 건조하여 표제 생성물(15.69 g, 100% 수율)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 11.56(br. s., 1 H) 9.09(s, 3 H) 7.85(s, 1 H) 7.54(s, 1 H) 7.09(d, J=2.32 Hz, 1 H) 4.48(d, J=6.48 Hz, 2 H) 4.11(br. s., 1 H) 3.81(s, 3 H) 3.46-3.60(m, 1 H) 3.35-3.45(m, 2 H) 3.32(s, 3 H) 3.15(dq, J=12.01, 6.02 Hz, 1 H) 2.88(m, J=6.42, 6.42 Hz, 1 H). Cl 동위원소 패턴을 갖는 모 분자 C16H20ClN7O2에 대한 m/z (APCI+): 378.2(M+H)+. 광학 회전: [a]d= -4.1°(c=0.24, MeOH).In a water bath, a solution of t-butyl (3R, 4R) -3 - [({5-chloro-2- [ TFA (10.1 mL, 208 mmol) was added to a solution of [2,3-d] pyrimidin-4-yl} oxy] methyl] -4- methoxypyrrolidine- , And the resulting solution was stirred at room temperature for 2.5 hours. The volatiles were removed to give a residue, to which was added ethyl ether (150 mL). The resulting suspension was stirred for 2 hours and the pink solid was collected by filtration, washed with ethyl ether (30 mL) and dried to give the title product (15.69 g, 100% yield). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6)? Ppm 11.56 (s, 1 H) 9.09 (s, 3 H) 7.85 3.81 (s, 3 H) 3.46 - 3.60 (m, 1 H) 3.35 - 3.45 (m, 1 H) 2 H) 3.32 (s, 3 H) 3.15 (dq, J = 12.01, 6.02 Hz, 1H) 2.88 (m, J = 6.42, 6.42 Hz, 1H). Cl isotope parent molecule having a pattern C 16 H 20 ClN 7 m / z for O 2 (APCI +): 378.2 (M + H) +. Optical Rotation: [a] d = -4.1 [deg.] (C = 0.24, MeOH).

단계 8: 1-{(3R,4R)-3-[5-Step 8: l - {(3R, 4R) -3- [5- 클로로Chloro -2-(1--2- (1- 메틸methyl -1H--1H- 피라졸Pyrazole -4--4- 일아미노Amino )-7H-) -7H- 피롤Pyrrole 로[in[ 2,3-d]피리미딘2,3-d] pyrimidine -4--4- 일옥시메틸1-oxymethyl ]-4-]-4- 메톡시Methoxy -- 피롤리딘Pyrrolidine -1-일}-1 day} 프로프Professional -2-엔-1-온의 제조2-en-1-one

Figure pct00016
Figure pct00016

(3R,4R)-3-[({5-클로로-2-[(1-메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}옥시)메틸]-4-메톡시피롤리디늄 트라이플루오로아세테이트(15.0 g 24.7 mmol), 에틸 아세테이트(200 mL) 및 포화 수성 NaHCO3(100 mL)의 혼합물을 0℃에서 10 분 동안 교반하였다. 아크릴로일 클로라이드(2.3 mL, 29 mmol, 1.1 mol eq)를 적가하고, 생성된 혼합물을 상온에서 30 분 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트(150 mL)를 첨가하고, 유기 층을 분리하고, 수성 층을 에틸 아세테이트(150 mL)로 추출하고, 합한 유기 층을 Na2SO4로 건조하고, 증발시켜 고체를 수득하고, 이를 에틸 아세테이트 중 0 내지 50% 에탄올의 구배로 용리하는 플래시 크로마토그래피를 통해 정제하여 백색 고체를 수득하였다. 이어서, 이 고체를 열총을 사용하여 살짝 가열하여 에탄올(1 g의 조질에 대하여 10 mL 에탄올)로부터 재결정화하고, 결정 시드로 시딩하였다. 냉각시 백색 결정을 여과로 수집하고, 에탄올(1 g의 조질에 대하여 3 mL의 에탄올)로 세척하여 백색 고체로서 표제 화합물(7.47 g, 70%)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 11.50(br. s., 1 H) 9.06(s, 1 H) 7.85(s, 1 H) 7.51(s, 1 H) 7.04(d, J=2.32 Hz, 1 H) 6.58(ddd, J=16.78, 10.30, 1.16 Hz, 1 H) 6.13(dd, J=16.81, 2.38 Hz, 1 H) 5.67(dt, J=10.33, 2.23 Hz, 1 H) 4.43(d, J=6.24 Hz, 2 H) 3.95-4.05(m, 1 H) 3.68-3.85(m, 4 H) 3.56-3.66(m, 2 H) 3.44-3.53(m, 1 H) 3.30(d, J=4.65 Hz, 3 H) 2.68-2.90(m, 1 H). Cl 동위원소 패턴을 갖는 모 분자 C19H22ClN7O3에 대한 m/z (APCI+): 432.1(M+H)+. 키랄 순도 측정: 140 바, 3 mL/분에서 Whelk-O1(R,R) 4.6 x 250 mm 컬럼 30% EtOH. Rt = 약 8.8 분, 피크 1, >99% ee. 광학 회전: [a]D22 = -3.1°(c 0.14, EtOH). 원소 분석: 이론치: C, 52.84; H, 5.13; Cl, 8.21; N, 22.70. 실측치: C, 52.45; H, 5.38; Cl, 7.91; N, 22.02.(3R, 4R) -3 - [({5-chloro-2 - [(1 -methyl-1 H- pyrazol- (15.0 g, 24.7 mmol), ethyl acetate (200 mL) and saturated aqueous NaHCO 3 (100 mL) was stirred at 0 <0> C for 10 min Respectively. Acryloyl chloride (2.3 mL, 29 mmol, 1.1 mol eq) was added dropwise and the resulting mixture was stirred at ambient temperature for 30 min. Ethyl acetate (150 mL), the organic layer was separated, to the aqueous layer extracted with ethyl acetate (150 mL) and the combined organic layers were dried with Na 2 SO 4, and evaporated to give a solid, which was ethyl Purification via flash chromatography eluting with a gradient of 0-50% ethanol in acetate afforded a white solid. The solid was then slightly heated using a hot gun to recrystallize from ethanol (10 mL ethanol for 1 g of crude) and seeded with the crystalline seed. Upon cooling, the white crystals were collected by filtration and washed with ethanol (3 mL of ethanol for 1 g of crude) to give the title compound (7.47 g, 70%) as a white solid. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6)? Ppm 11.50 (br s, 1 H) 9.06 (s, 1H) 7.85 (Dd, J = 10.33, 2.23 Hz, 1H), 6.13 (dd, J = 16.81, 2.38 Hz, 1H) 3.43-3.56 (m, 1H) 3.30 (m, 2H), 3.43-3.56 (m, d, J = 4.65 Hz, 3 H) 2.68 - 2.90 (m, 1 H). Cl isotope parent molecule having a pattern C 19 H 22 ClN 7 O 3 m / z (APCI +) for: 432.1 (M + H) + . Determination of chiral purity: Whelk-O1 (R, R) 4.6 x 250 mm column, 30% EtOH at 140 bar, 3 mL / min. Rt = about 8.8 min, peak 1, &gt; 99% ee. Optical rotation: [a] D22 = -3.1 (c 0.14, EtOH). Elemental analysis: Calculated: C, 52.84; H, 5.13; Cl, 8.21; N, 22.70. Found: C, 52.45; H, 5.38; Cl, 7.91; N, 22.02.

실시예Example 2: N- 2: N- 메틸methyl -N-[트랜스-3-({2-[(1--N- [trans-3 - ({2 - [(1- 메틸methyl -1H--1H- 피라졸Pyrazole -4-일)아미노]-5-(피리딘-2-일)-7H-Yl) amino] -5- (pyridin-2-yl) -7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘Pyrrolo [2,3-d] pyrimidine -4-일}-4-yl} 옥시Oxy )) 사이클로부틸Cyclobutyl ]] 프로프Professional -2--2- 엔아미드Enamide (화합물 B)의 제조(Compound B)

Figure pct00017
Figure pct00017

단계 1: 2,4-Step 1: 2,4- 다이클로로Dichloro -5--5- 요오도Iodo -7H--7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘의Pyrrolo [2,3-d] pyrimidine 제조 Produce

Figure pct00018
Figure pct00018

DMF(266 mL, 1.0 M) 중 2,4-다이클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘,(50.0 g, 266 mmol, 1.00 eq)의 용액에 내부 온도를 50℃ 미만으로 유지하는 속도로 N-요오도숙신이미드(62.8 g, 279 mmol, 1.05 eq)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 격렬하게 교반하고 상온 욕에서 1.5 시간 동안 냉각하였다. 반응 혼합물을 빙수(1.5 L)로 희석하고, 생성된 침전물을 여과로 단리하였다. 침전물을 빙수(2 x 500 mL)로 세척하고, 진공에서 45℃로 36 시간 동안 건조하여 회백색 고체로서 표제 화합물(81.5 g, 98% 수율)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 13.09(br. s., 1 H), 7.95(s, 1 H). C6H2Cl2IN3에 대한 m/z (APCI+): 313.9(M+H)+. To a solution of 2,4-dichloro-7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidine, (50.0 g, 266 mmol, 1.00 eq) in DMF (266 mL, 1.0 M) N-iodosuccinimide (62.8 g, 279 mmol, 1.05 eq) was added at the rate of maintaining. The reaction mixture was vigorously stirred and cooled in a room temperature bath for 1.5 hours. The reaction mixture was diluted with ice water (1.5 L) and the resulting precipitate was isolated by filtration. The precipitate was washed with ice water (2 x 500 mL) and dried in vacuo at 45 캜 for 36 h to give the title compound (81.5 g, 98% yield) as an off-white solid. 1 H NMR (400 MHz, DMSO -d6) δ ppm 13.09 (br. S., 1 H), 7.95 (s, 1 H). M / z (APCI +) for C 6 H 2 Cl 2 IN 3 : 313.9 (M + H) <+> .

단계 2: 2,4-Step 2: 2,4- 다이클로로Dichloro -5--5- 요오도Iodo -7-{[2-(-7 - {[2- ( 트라이메틸실릴Trimethylsilyl )) 에톡시Ethoxy ]] 메틸methyl }-7H-피롤로[} -7H-pyrrolo [ 2,3-d]피리미딘의2,3-d] pyrimidine 제조 Produce

Figure pct00019
Figure pct00019

THF(600 mL) 중 2,4-다이클로로-5-요오도-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘(81.4 g, 259 mmol, 1.00 eq) 및 다이이소프로필에틸아민(105 mL, 596 mmol, 2.30 eq)의 냉 용액(0℃)에 2-(트라이메틸실릴)에톡시메틸 클로라이드(59.5 mL, 337 mmol, 1.30 eq)를 적가 방식으로 5 분간에 걸쳐서 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 3 시간 동안 교반하도록 하였다. 그때 반응 혼합물을 여과하고, 여액을 진공에서 농축하였다. 생성된 농축된 오일을 EtOAc(400 mL)로 희석하고, 연속적으로 포화 수성 NH4Cl(2 x 200 mL) 및 염수(2 x 200 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고 진공에서 농축하였다. 생성된 물질을 최소량의 DCM(50 mL)에 용해하고 헵탄(200 mL)으로 희석하였다. 이 용액을 150 mL의 총량으로 농축하고, 표제 화합물의 마쇄를 촉진하였다. 이 혼합물을 여과하여 표제 화합물(84.1 g)을 수득하고, 여액을 농축하고 헵탄 중 0 내지 15% EtOAc의 구배로 용리하는 플래시 크로마토그래피를 통해 추가 정제하여 표제 화합물의 추가 부분(26.5 g)을 수득하였다. 이러한 2개의 부분을 합하여 회백색 고체로서 목적 생성물(110.6 g)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ ppm 7.50(s, 1 H), 5.57(s, 2 H), 3.61(t, J=8.0 Hz, 2 H), 0.95(t, J=8.0 Hz, 2 H), 0.01(s, 9 H). C12H16Cl2IN3OSi에 대한 m/z (APCI+): 444.0(M+H)+.To a solution of 2,4-dichloro-5-iodo-7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidine (81.4 g, 259 mmol, 1.00 eq) and diisopropylethylamine 2- (trimethylsilyl) ethoxymethyl chloride (59.5 mL, 337 mmol, 1.30 eq) was added dropwise over 5 minutes to a cold solution (0 ° C) The reaction mixture was allowed to stir at 0 &lt; 0 &gt; C for 3 hours. The reaction mixture was then filtered and the filtrate was concentrated in vacuo. The resulting concentrated oil was diluted with EtOAc (400 mL), washed successively with saturated aqueous NH 4 Cl (2 x 200 mL) and brine (2 x 200 mL), dried over Na 2 SO 4 and concentrated in vacuo Respectively. The resulting material was dissolved in a minimal amount of DCM (50 mL) and diluted with heptane (200 mL). The solution was concentrated to a total volume of 150 mL to facilitate the grinding of the title compound. The mixture was filtered to give the title compound (84.1 g) and the filtrate was concentrated and further purified by flash chromatography eluting with a gradient of 0-15% EtOAc in heptane to give an additional portion of the title compound (26.5 g) Respectively. The two portions were combined to give the desired product (110.6 g) as an off-white solid. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ ppm 7.50 (s, 1 H), 5.57 (s, 2 H), 3.61 (t, J = 8.0 Hz, 2 H), 0.95 (t, J = 8.0 Hz, 2 H), 0.01 (s, 9 H). M / z (APCI +) for C 12 H 16 Cl 2 IN 3 OSi: 444.0 (M + H) <+> .

단계 3: 2,4-Step 3: 2,4- 다이클로로Dichloro -5-(피리딘-2-일)-7-{[2-(-5- (pyridin-2-yl) -7 - {[2- ( 트라이메틸실릴Trimethylsilyl )) 에톡시Ethoxy ]] 메틸methyl }-7H-} -7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘의Pyrrolo [2,3-d] pyrimidine 제조 Produce

Figure pct00020
Figure pct00020

THF(350 mL) 중 2,4-다이클로로-5-요오도-7-{[2-(트라이메틸실릴)에톡시]메틸}-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘(30.0 g, 68.0 mmol, 1.00 eq)의 냉 용액(-78℃)에 i-PrMgCl(47.3 mL, 94.6 mmol, 1.40 eq, 1.00 M THF)의 용액을 적가 방식으로 4 분간에 걸쳐서 첨가하였다. 반응 혼합물을 -78℃에서 2 시간 동안 교반한 후 THF(100 mL) 중 ZnBr2(24.7 g, 110 mmol, 1.62 eq, 130℃에서 건조됨)의 신선하게 제조된 용액으로 적가 방식으로 15 분간에 걸쳐서 처리하였다. 혼합물을 -78℃에서 추가 1 시간 동안 교반한 후 상온에서 가온하고 추가 0.5 시간 동안 교반하였다. 이 시간에 반응 혼합물을 Pd(PPh3)4(3.94 g, 3.38 mmol, 0.05 eq) 및 2-요오도피리딘(10.8 mL, 101 mol, 1.50 eq)으로 처리하고, 65℃로 10 시간 동안 가열하였다. 상온으로 냉각시, 반응 혼합물을 약 200 mL의 용량으로 농축하고, 물(600 mL), 포화 수성 나트륨 칼륨 타르트레이트(100 mL) 및 EtOAc(400 mL)로 희석하였다. 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(4 x 300 mL)로 추출하였다. 합한 유기물을 염수(300 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 진공에서 농축하였다. 생성된 오일을 헵탄 중 0 내지 30% EtOAc의 구배로 용리하는 플래시 크로마토그래피를 통해 정제하여 오일로서 표제 화합물(23.5 g, 87% 수율)을 수득하였고 방치시 연황갈색 고체로 전환되었다. 1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.76-8.63(m, 1 H), 7.83-7.77(m, 1 H), 7.74(s, 1 H), 7.67(d, J=7.8 Hz, 1 H), 7.35-7.29(m, 1 H), 5.68(s, 2 H), 3.61(dd, J=7.6, 8.9 Hz, 2 H), 1.03-0.92(m, 2 H), -0.01(s, 9 H). C17H20Cl2N4OSi에 대한 m/z (APCI+): 395.1(M+H)+.To a solution of 2,4-dichloro-5-iodo-7 - {[2- (trimethylsilyl) ethoxy] methyl} -7H-pyrrolo [2,3- d] pyrimidine (30.0 PrMgCl (47.3 mL, 94.6 mmol, 1.40 eq, 1.00 M THF) was added dropwise over 4 minutes to a cold solution (-78 deg. The reaction mixture was stirred at -78 ° C for 2 hours and then added dropwise to the freshly prepared solution of ZnBr 2 (24.7 g, 110 mmol, 1.62 eq, dried at 130 ° C.) in THF (100 mL) Lt; / RTI &gt; The mixture was stirred at -78 &lt; 0 &gt; C for an additional 1 h, then warmed to room temperature and stirred for an additional 0.5 h. The reaction mixture at this time was heated Pd (PPh 3) 4 (3.94 g, 3.38 mmol, 0.05 eq) and 2-iodo-pyridine (10.8 mL, 101 mol, 1.50 eq) and the treatment for 10 hours in 65 ℃ . Upon cooling to room temperature, the reaction mixture was concentrated to a volume of about 200 mL and diluted with water (600 mL), saturated aqueous sodium potassium tartrate (100 mL) and EtOAc (400 mL). The layers were separated and the aqueous layer was extracted with EtOAc (4 x 300 mL). The combined organics were washed with brine (300 mL), dried over Na 2 SO 4 and concentrated in vacuo. The resulting oil was purified by flash chromatography, eluting with a gradient of 0-30% EtOAc in heptane to give the title compound (23.5 g, 87% yield) as an oil and upon standing allowed to convert to a light tan solid. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 )? Ppm 8.76-8.63 (m, 1H), 7.83-7.77 (m, 1H), 7.74 H), 7.35-7.29 (m, 1H), 5.68 (s, 2H), 3.61 (dd, J = 7.6, 8.9 Hz, 2H), 1.03-0.92 , 9 H). C 17 H 20 Cl 2 N 4 m / z (APCI +) for OSi: 395.1 (M + H) +.

단계 4: t-부틸(트랜스-3-{[t-부틸(Step 4: Preparation of t-butyl (trans-3 - {[t-butyl 다이메틸Dimethyl )실릴]) Silyl] 옥시Oxy }} 사이클로부틸Cyclobutyl )-) - 카바메이트의Carbamate 제조 Produce

Figure pct00021
Figure pct00021

THF(1.0 L) 중 t-부틸(시스-3-하이드록시사이클로부틸)카바메이트(62.0 g, 330 mmol, 1.00 eq) 및 4-니트로벤조산(60.8 g, 360 mmol, 1.10 eq)의 냉용액(0℃)에 PPh3(130 g, 490 mol, 1.48 eq) 및 다이에틸 아조다이카복실레이트(86.3 g, 490 mmol, 1.48 eq)로 연속적으로 처리하였다. 추가 반응 혼합물을 4 일 동안 환류한 후, 상온으로 냉각하고, 진공에서 농축하였다. 잔사를 i-PrOH로부터 결정화하여 백색 고체(63 g)를 수득하였다. MeOH(1.0 L) 및 H2O(200 mL) 중 상기 수득된 4-니트로 벤조에이트 에스터(63 g)의 용액에 K2CO3(51.6 g, 370 mmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 2 시간 동안 환류하고, 상온을 냉각하고, 여과하였다. 여액을 진공에서 농축하고, EtOAc와 수성 10% Na2CO3 사이에 분배하였다. 생성된 유기 층을 염수로 세척하고 농축하여 백색 고체(31.0 g)를 수득하였다. 피리딘(1.0 L) 중 상기 수득된 알코올(75.0 g, 400 mmol, 1.00 eq)의 용액에 TBSCl(91.0 g, 600 mmol, 1.50 eq)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 2 시간 동안 교반한 후 진공에서 농축하였다. 생성된 잔사를 석유 에터 중 0 내지 10% EtOAc의 구배로 용리하는 플래시 크로마토그래피로 정제하여 백색 고체로서 표제 화합물(111 g, 92% 수율)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 7.13(d, 1 H) 4.38-4.47(m, 1 H) 3.90(br. s., 1 H) 2.00-2.16(m, 4 H) 1.36(s, 9 H) 0.81-0.89(m, 9 H) -0.01-0.01(m, 6 H). C10H23NOSi에 대한 m/z (APCI+): 202.1(M-Boc+H)+.A cold solution of t-butyl (cis-3-hydroxycyclobutyl) carbamate (62.0 g, 330 mmol, 1.00 eq) and 4-nitrobenzoic acid (60.8 g, 360 mmol, 1.10 eq) in THF (1.0 L) Was treated successively with PPh 3 (130 g, 490 mol, 1.48 eq) and diethyl azodicarboxylate (86.3 g, 490 mmol, 1.48 eq) at 0 ° C. The additional reaction mixture was refluxed for 4 days, then cooled to room temperature and concentrated in vacuo. The residue was crystallized from i-PrOH to give a white solid (63 g). To a solution of the obtained 4-nitrobenzoate ester (63 g) in MeOH (1.0 L) and H 2 O (200 mL) was added K 2 CO 3 (51.6 g, 370 mmol). The resulting mixture was refluxed for 2 hours, cooled to ambient temperature and filtered. The filtrate was concentrated in vacuo and was partitioned between EtOAc and aqueous 10% Na 2 CO 3. The resulting organic layer was washed with brine and concentrated to give a white solid (31.0 g). TBSCl (91.0 g, 600 mmol, 1.50 eq) was added to a solution of the alcohol (75.0 g, 400 mmol, 1.00 eq) obtained above in pyridine (1.0 L). The reaction mixture was stirred at ambient temperature for 2 hours and then concentrated in vacuo. The resulting residue was purified by flash chromatography eluting with a gradient of 0-10% EtOAc in petroleum ether to give the title compound (111 g, 92% yield) as a white solid. 1 H NMR (400 MHz, DMSO- d 6)? Ppm 7.13 (d, 1H) 4.38-4.47 (m, 1H) 3.90 (br s, 1H) 2.00-2.16 s, 9 H) 0.81-0.89 (m, 9 H) - 0.01 - 0.01 (m, 6 H). C 10 m / z for H 23 NOSi (APCI +): 202.1 (M-Boc + H) +.

단계 5: t-부틸(트랜스-3-{[t-부틸(Step 5: t-Butyl (trans-3 - {[t-butyl ( 다이메틸Dimethyl )실릴]) Silyl] 옥시Oxy }} 사이클로부틸Cyclobutyl )-) - 메틸카바메이트의Methylcarbamate 제조 Produce

Figure pct00022
Figure pct00022

THF(1.0 L) 중 t-부틸(트랜스-3-{[t-부틸(다이메틸)실릴]옥시}사이클로부틸)카바메이트(111 g, 370 mmol, 1.00 eq)의 용액에 NaH(오일 중 60% 현탁액, 22.2 g, 550 mmol, 1.50 eq)를 나눠서 첨가하였다. 첨가 후, 반응 혼합물을 추가 0.5 시간 동안 교반하고, 0℃로 냉각하고, 메틸 요오다이드(38.2 mL, 615 mmol, 1.66 eq)로 적가 방식으로 처리하였다. 상온에서 추가 5 시간 후, 반응 혼합물을 진공에서 농축하고, 생성된 잔사를 석유 에터 중 10% EtOAc로 용리하는 플래시 크로마토그래피로 정제하여 오일로서 표제 화합물(97.5 g, 84% 수율)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 4.64(br. s., 1 H) 4.29-4.37(m, 1 H) 2.73(s, 3 H) 2.31-2.43(m, 2 H) 1.97-2.08(m, 2 H) 1.37(s, 9 H) 0.86(s, 9 H) -0.01-0.05(m, 6 H). C11H25NOSi에 대한 m/z (APCI+): 216.2(M-Boc+H)+.To a solution of t-butyl (trans-3 - {[t-butyl (dimethyl) silyl] oxy} cyclobutyl) carbamate (111 g, 370 mmol, 1.00 eq) in THF (1.0 L) % Suspension, 22.2 g, 550 mmol, 1.50 eq) was added in portions. After the addition, the reaction mixture was stirred for an additional 0.5 h, cooled to 0 &lt; 0 &gt; C and treated dropwise with methyl iodide (38.2 mL, 615 mmol, 1.66 eq). After an additional 5 h at ambient temperature, the reaction mixture was concentrated in vacuo and the resulting residue was purified by flash chromatography eluting with 10% EtOAc in petroleum ether to give the title compound (97.5 g, 84% yield) as an oil. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6)? Ppm 4.64 (br s, 1H) 4.29-4.37 (m, 1H) 2.73 2.08 (m, 2 H) 1.37 (s, 9 H) 0.86 (s, 9 H) - 0.01 - 0.05 (m, 6 H). C 11 H 25 m / z ( APCI +) for NOSi: 216.2 (M-Boc + H) +.

단계 6: t-부틸(트랜스-3-Step 6: t-Butyl (trans-3- 하이드록시사이클로부틸Hydroxycyclobutyl )메틸카바메이트의 제조) Preparation of methyl carbamate

Figure pct00023
Figure pct00023

THF(1.0 L) 중 t-부틸(트랜스-3-{[t-부틸(다이메틸)실릴]옥시}사이클로부틸)-메틸카바메이트(195 g, 600 mmol, 1.00 eq)의 용액에 TBAF(930 mL, 930 mmol, 1.55 eq, THF 중 1 M)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 3 시간 동안 교반한 후 진공에서 농축하였다. 생성된 잔사를 EtOAc(1.0 L)와 포화 수성 NH4Cl(500 mL) 사이에 분배하였다. 생성된 유기 층을 진공에서 농축하고, 생성된 잔사를 석유 에터 중 10% EtOAc로 용리하는 플래시 크로마토그래피로 정제하여 백색 고체로서 표제 화합물(88 g, 76% 수율)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ ppm 4.78(s, 1 H), 4.41-4.38(m, 1 H), 2.82(s, 3 H), 2.41-2.38(m, 2 H), 2.23-2.20(m, 2 H), 1.47(s, 9 H). C10H18NO3에 대한 m/z (ESI+): 146.1(M-tBu+H)+.To a solution of t-butyl (trans-3 - {[t-butyl (dimethyl) silyl] oxy} cyclobutyl) -methylcarbamate (195 g, 600 mmol, 1.00 eq) in THF (1.0 L) mL, 930 mmol, 1.55 eq, 1 M in THF). The reaction mixture was stirred at room temperature for 3 hours and then concentrated in vacuo. The resulting residue was partitioned between EtOAc (1.0 L) and saturated aqueous NH 4 Cl (500 mL). The resulting organic layer was concentrated in vacuo and the resulting residue was purified by flash chromatography eluting with 10% EtOAc in petroleum ether to give the title compound (88 g, 76% yield) as a white solid. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 )? Ppm 4.78 (s, 1H), 4.41-4.38 (m, 1H), 2.82 2.20 (m, 2 H), 1.47 (s, 9 H). C 10 H 18 NO 3 m / z (ESI +) for: 146.1 (M- t Bu + H ) +.

단계 7: t-부틸 메틸{트랜스-3-[(2-[(1-Step 7: t-Butylmethyl {trans-3 - [(2 - [(1- 메틸methyl -1H--1H- 피라졸Pyrazole -4-일)아미노]-5-(피리딘-2-일)-7-{[2-(Yl) amino] -5- (pyridin-2-yl) -7 - {[2- 트라이메틸실릴Trimethylsilyl )) 에톡시Ethoxy ]] 메틸methyl }-7H-} -7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘Pyrrolo [2,3-d] pyrimidine -4-일)옥Yl) ox 시city ]] 사이클로부틸Cyclobutyl }} 카바메이트의Carbamate 제조 Produce

Figure pct00024
Figure pct00024

THF(100 mL) 중 t-부틸(트랜스-3-하이드록시사이클로부틸)메틸카바메이트(12.9 g, 64.0 mmol, 1.15 eq)의 냉 용액에 칼륨 비스(트라이메틸실릴)아미드(12.4 g, 62.3 mmol, 1.12 eq)를 3분량으로 첨가하였다. 첨가 후, 알콕사이드 용액을 상온으로 0.5 시간에 걸쳐서 가온하였다. 분리 플라스크를 2,4-다이클로로-5-(피리딘-2-일)-7-{[2-(트라이메틸실릴)에톡시]메틸}-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘(22.0 g, 55.6 mmol, 1.00 eq) 및 THF(300 mL)로 충전하고 0℃로 냉각하였다. 이 용액을 캐눌라를 통해 5분간에 걸쳐서 알콕사이드 용액으로 처리한 후 추가 0.5 시간 동안 0℃에서 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 염수(100 mL), 물(200 mL) 및 EtOAc(600 mL)로 희석하였다. 층을 분리하고, 수층을 EtOAc(4 x 200 mL)로 추출하였다. 이어서, 합한 유기 층을 염수(200 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 진공에서 농축하였다. 생성된 점성 오일(31.0 g)을 다음 단계에서 추가 정제 없이 사용하였다. 1,4-다이옥산(300 mL) 중 상기 수득된 오일(31.0 g)의 용액에 1-메틸-1H-피라졸-4-아민(7.57 g, 77.9 mmol, 1.40 eq), Pd2dba3(2.68 g, 2.78 mmol, 0.05 eq), 4,5-비스(다이페닐포스피노)-9,9-다이메틸잔텐(3.25 g, 5.56 mmol, 0.10 eq) 및 Cs2CO3(45.8 g, 139 mmol, 2.5 eq)을 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 질소 가스의 스트림으로 20 분 동안 살포하고, 격렬하게 교반하면서 105℃에서 10 시간 동안 가열하였다. 상온으로 냉각시, 반응 혼합물을 EtOAc(500 mL)로 희석하고, 셀라이트를 통해 여과하고, 진공에서 농축하였다. 생성된 잔사를 헵탄 중 0 내지 80% EtOAc의 구배로 용리하는 플래시 크로마토그래피로 정제하여 주황색 포말로서 표제 화합물(25.6 g, 74% 수율)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 9.17(s, 1 H), 8.56(d, J=4.3 Hz, 1 H), 8.14(d, J=7.9 Hz, 1 H), 7.93(br. s., 1 H), 7.87-7.79(m, 1 H), 7.69(s, 1 H), 7.55(s, 1 H), 7.23(dd, J=5.0, 7.2 Hz, 1 H), 5.57(br. s., 2 H), 5.47(br. s., 1 H), 4.84-4.66(m, 1 H), 3.82(s, 3 H), 3.63-3.53(m, 2 H), 2.84(s, 3 H), 2.75-2.62(m, 2 H), 2.47-2.34(m, 2 H), 1.38(s, 9 H), 0.86(t, J=8.0 Hz, 2 H), -0.11(s, 9 H). C31H44N8O4Si에 대한 m/z (APCI+): 621.3(M +H)+.To a cold solution of t-butyl (trans-3-hydroxycyclobutyl) methylcarbamate (12.9 g, 64.0 mmol, 1.15 eq) in THF (100 mL) was added potassium bis (trimethylsilyl) amide (12.4 g, 62.3 mmol , 1.12 eq) was added in three portions. After the addition, the alkoxide solution was warmed to room temperature over 0.5 hours. The separation flask was charged with 2,4-dichloro-5- (pyridin-2-yl) -7- {[2- (trimethylsilyl) ethoxy] methyl} -7H- pyrrolo [2,3- d] pyrimidine (22.0 g, 55.6 mmol, 1.00 eq) and THF (300 mL) and cooled to 0 &lt; 0 &gt; C. The solution was treated with an alkoxide solution over a cannula for 5 minutes and then stirred at 0 ° C for an additional 0.5 hour. The reaction mixture was then diluted with brine (100 mL), water (200 mL) and EtOAc (600 mL). The layers were separated and the aqueous layer was extracted with EtOAc (4 x 200 mL). The combined organic layers were then washed with brine (200 mL), dried over Na 2 SO 4 and concentrated in vacuo. The resulting viscous oil (31.0 g) was used in the next step without further purification. Methyl-lH-pyrazol-4-amine (7.57 g, 77.9 mmol, 1.40 eq), Pd 2 dba 3 (2.68 g) was added to a solution of the oil (31.0 g) obtained above in 1,4- (3.25 g, 5.56 mmol, 0.10 eq) and Cs 2 CO 3 (45.8 g, 139 mmol, 0.05 eq) 2.5 eq). The reaction mixture was then sparged with a stream of nitrogen gas for 20 minutes and heated at 105 DEG C for 10 hours with vigorous stirring. Upon cooling to room temperature, the reaction mixture was diluted with EtOAc (500 mL), filtered through celite, and concentrated in vacuo. The resulting residue was purified by flash chromatography eluting with a gradient of 0 to 80% EtOAc in heptane to give the title compound (25.6 g, 74% yield) as an orange foam. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6)? Ppm 9.17 (s, 1H), 8.56 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 8.14 (d, J = 7.9 Hz, 1H) (s, 1 H), 7.87-7.79 (m, 1H), 7.69 (s, 1H), 7.55 3H), 3.63-3.53 (m, 2H), 2.84 (m, 2H), 5.47 (br s, 1H), 4.84-4.66 (s, 3H), 2.75-2.62 (m, 2H), 2.47-2.34 (m, 2H), 1.38 (s, 9 H). C 31 H 44 N 8 O 4 Si m / z (APCI +) for: 621.3 (M + H) + .

단계 8: 3-Step 8: 3- 클로로Chloro -N--N- 메틸methyl -N-{트랜스-3-[(2-[(1--N- {trans-3 - [(2 - [(1- 메틸methyl -1H--1H- 피라졸Pyrazole -4-일)아미노]-5-(피리딘-2-일)-7-{[2-(Yl) amino] -5- (pyridin-2-yl) -7 - {[2- 트라이메틸실릴Trimethylsilyl )) 에톡시Ethoxy ]] 메틸methyl }-7H-} -7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘Pyrrolo [2,3-d] pyrimidine -4-일)Yl) 옥시Oxy ]] 사이클로부틸Cyclobutyl }} 프로판아미드의Propanamide 제조 Produce

Figure pct00025
Figure pct00025

MeCN(600 mL) 중 t-부틸 메틸{트랜스-3-[(2-[(1-메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-5-(피리딘-2-일)-7-{[2-(트라이메틸실릴)에톡시]메틸}-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)옥시]사이클로부틸}카바메이트(25.0 g, 40.3 mmol, 1.00 eq)의 냉 용액(0℃)에 TFA(70.0 mL, 914 mmol, 22.7 eq)를 적가 방식으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 교반한 후 상온으로 밤새 가온하였다. 이어서, 반응 혼합물을 0℃로 냉각하고, 수성 NaOH를 사용하여 pH를 8로 조정하고, 상을 분리하였다. 수성 상을 EtOAc(3 x 300 mL)로 추출하고, 합한 유기 상을 염수(2 x 200 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 진공에서 농축하였다. 생성된 잔사를 DCM 중 2 내지 7% MeOH의 구배로 용리하는 플래시 크로마토그래피를 통해 부분적으로 정제하여 황색 검으로서 4-{[트랜스-3-(메틸아미노)사이클로부틸]옥시}-N-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)-5-피리딘-2-일-7-{[2-(트라이메틸실릴)에톡시]메틸}-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-아민을 수득하고, 이를 다음 단계에서 직접 사용하였다. DCM(500 mL) 중 4-{[트랜스-3-(메틸아미노)사이클로부틸]옥시}-N-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)-5-피리딘-2-일-7-{[2-(트라이메틸실릴)에톡시]메틸}-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-아민 및 DIPEA(16.0 mL, 91.9 mmol, 1.61 eq)의 용액에 3-클로로프로피온일 클로라이드(8.25 mL, 86.4 mmol, 1.51 eq)를 적가 방식으로 첨가한 후 상온에서 1 시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 H2O(2 x 100 mL) 및 염수(100 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 진공에서 농축하였다. 생성된 검을 MTBE(250 mL)로 마쇄하고, 고체를 여과하고 진공에서 농축하여 황색 고체로서 표제 화합물(24.0 g, 68.9% 수율)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 9.10-9.25(m, 1 H) 8.51-8.61(m, 1 H) 8.10-8.25(m, 1 H) 7.92-8.05(m, 1 H) 7.82-7.91(m, 1 H) 7.67-7.76(m, 1 H) 7.47-7.60(m, 1 H) 7.17-7.30(m, 1 H) 5.55-5.64(m, 2 H) 5.40-5.54(m, 1 H) 4.63-5.31(m, 1 H) 3.83(s, 3 H) 3.74-3.81(m, 2 H) 3.53-3.66(m, 2 H) 2.92-3.08(m, 3 H) 2.81-2.89(m, 2 H) 2.58-2.79(m, 2 H) 2.29-2.46(m, 2 H) 0.75-0.93(m, 2 H) -0.10(s, 9 H). C29H39ClN8O3Si에 대한 m/z (APCI+): 611.2(M +H)+.To a solution of t-butylmethyl {trans-3 - [(2 - [(1 -methyl-1 H-pyrazol- 4- yl) amino] -5- (pyridin- (25.0 g, 40.3 mmol, 1.00 eq) was added to a solution of [2- (trimethylsilyl) ethoxy] methyl} -7H-pyrrolo [2,3- d] pyrimidin-4- yl) oxy] cyclobutyl} carbamate TFA (70.0 mL, 914 mmol, 22.7 eq) was added dropwise to the cold solution (0 C). The reaction mixture was stirred at 0 &lt; 0 &gt; C and then warmed to room temperature overnight. The reaction mixture was then cooled to 0 C, the pH was adjusted to 8 using aqueous NaOH and the phases were separated. The aqueous phase was extracted with EtOAc (3 x 300 mL) and the combined organic phases were washed with brine (2 x 200 mL), dried over Na 2 SO 4 and concentrated in vacuo. The resulting residue was partially purified by flash chromatography eluting with a gradient of 2-7% MeOH in DCM to give 4 - {[trans-3- (methylamino) cyclobutyl] oxy} -N- Yl} -7- {[2- (trimethylsilyl) ethoxy] methyl} -7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidin- Amine, which was used directly in the next step. To a solution of 4 - {[trans-3- (methylamino) cyclobutyl] oxy} -N- (1 -methyl-lH- pyrazol- Amine and DIPEA (16.0 mL, 91.9 mmol, 1.61 eq) in anhydrous tetrahydrofuran (2 mL) was added 3- Chloropropionyl chloride (8.25 mL, 86.4 mmol, 1.51 eq) was added dropwise and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. The reaction mixture was then washed with H 2 O (2 x 100 mL) and brine (100 mL), dried over Na 2 SO 4 and concentrated in vacuo. The resulting sword was triturated with MTBE (250 mL) and the solid was filtered and concentrated in vacuo to give the title compound (24.0 g, 68.9% yield) as a yellow solid. 1 H NMR (400 MHz, DMSO -d6) δ ppm 9.10-9.25 (m, 1 H) 8.51-8.61 (m, 1 H) 8.10-8.25 (m, 1 H) 7.92-8.05 (m, 1 H) 7.82 -7.91 (m, 1H) 7.67-7.76 (m, 1H) 7.47-7.60 (m, 1H) 7.17-7.30 (m, 1H) 5.55-5.64 1 H) 4.63 - 5.31 (m, 1 H) 3.83 (s, 3 H) 3.74 - 3.81 (m, 2 H) 3.53 - 3.66 (m, m, 2 H) 2.58 - 2.79 (m, 2 H) 2.29 - 2.46 (m, 2 H) 0.75 - 0.93 (m, 2 H) - 0.10 (s, 9 H). M / z (APCI +) for C 29 H 39 ClN 8 O 3 Si: 611.2 (M + H) <+> .

단계 9: N-Step 9: N- 메틸methyl -N-[트랜스-3-({2-[(1--N- [trans-3 - ({2 - [(1- 메틸methyl -1H--1H- 피라졸Pyrazole -4-일)아미노]-5-(피리딘-2-일)-7H-Yl) amino] -5- (pyridin-2-yl) -7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘Pyrrolo [2,3-d] pyrimidine -4-일}-4-yl} 옥시Oxy )) 사이클로부틸Cyclobutyl ]] 프로프Professional -2--2- 엔아미드의Enamidic 제조 Produce

Figure pct00026
Figure pct00026

DCM/iPrOH(9:1, 250 mL) 중 3-클로로-N-메틸-N-{트랜스-3-[(2-[(1-메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-5-(피리딘-2-일)-7-{[2-(트라이메틸실릴)에톡시]메틸}-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)옥시]사이클로부틸}프로판아미드(24.0 g, 39.2 mmol, 1.00 eq)의 용액에 HCl 용액(250 mL, 1,4-다이옥산 중 4 M)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 밤새 교반하고, 진공에서 농축하여 3-클로로-N-[트랜스-3-({7-(하이드록시메틸)-2-[(1-메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-5-피리딘-2-일-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}옥시)사이클로부틸]-N-메틸프로판아미드를 수득하고, 이를 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. 이전 단계로부터의 중간체를 1,4-다이옥산(80 mL) 및 농축된 수성 NH4OH(50 mL)에 용해하였다. 반응 혼합물을 상온에서 3 시간 동안 교반한 후 진공에서 농축하였다. 잔사를 MTBE(100 mL)로 마쇄하고, 고체를 여과하고 진공에서 농축하여 황색 고체로서 3-클로로-N-메틸-N-[트랜스-3-({2-[(1-메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-5-피리딘-2-일-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}옥시)사이클로부틸]프로판아미드를 수득하고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. EtOH(400 mL) 중 3-클로로-N-메틸-N-[트랜스-3-({2-[(1-메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-5-피리딘-2-일-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}옥시)사이클로부틸]프로판아미드의 용액에 K2CO3(21.4 g, 155 mmol, 3.95 eq)을 첨가하고, 반응 혼합물을 상온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하여 무기 염을 제거하고, 진공에서 농축하고, EtOAc(100 mL)에 용해하였다. MTBE(200 mL)를 첨가하여 조질 생성물을 침전시키고, 이를 여과로 수집하였다. 여액을 농축하고, DCM 중 2 내지 7% MeOH의 구배로 용리하는 플래시 크로마토그래피로 정제하여 조질 생성물의 추가 부분을 수득하였다. 합한 조질 물질을 H2O(0.225% HCOOH) 중 5% MeCN 내지 H2O(0.225% HCOOH) 중 25% MeCN의 구배로 용리하는 YMC-액투스 트라이액트(Actus Triact) C18(150 mm x 30 mm x 5 μM) 컬럼을 사용하여 역상 크로마토그래피를 통해 정제하여 황색 고체로서 표제 화합물의 포름에이트 염(7.14 g, 3 단계에 걸쳐서 37%)을 수득하였다.To a solution of 3-chloro-N-methyl-N- {trans-3 - [(2 - [(1-methyl-lH- pyrazol- Pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-4-yl) oxy] cyclobutyl} propane Amide (24.0 g, 39.2 mmol, 1.00 eq) was added HCl solution (250 mL, 4 M in 1,4-dioxane). The reaction mixture was stirred at room temperature overnight and concentrated in vacuo to give 3-chloro-N- [trans-3- ({7- (hydroxymethyl) -2 - [(1 -methyl-1 H- ) Amino] -5-pyridin-2-yl-7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-4-yl} oxy) cyclobutyl] -N-methylpropanamide, Respectively. Intermediate from the previous step was dissolved in 1,4-dioxane (80 mL) and concentrated aqueous NH 4 OH (50 mL). The reaction mixture was stirred at room temperature for 3 hours and then concentrated in vacuo. The residue was triturated with MTBE (100 mL) and the solid was filtered and concentrated in vacuo to give 3-chloro-N-methyl-N- [trans-3- ({2- [ Pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-4-yl} oxy) cyclobutyl] propanamide, which was obtained without further purification Used in the next step. To a solution of 3-chloro-N-methyl-N- [trans-3 - ({2 - [(1 -methyl-1 H- pyrazol- -7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-4-yl} oxy) cyclobutyl] propanamide K 2 CO 3 (21.4 g, 155 mmol, 3.95 eq) was added and the reaction mixture was stirred overnight at room temperature. The reaction mixture was filtered to remove inorganic salts, concentrated in vacuo and dissolved in EtOAc (100 mL). MTBE (200 mL) was added to precipitate the crude product which was collected by filtration. The filtrate was concentrated and purified by flash chromatography eluting with a gradient of 2-7% MeOH in DCM to give an additional portion of the crude product. The combined crude material H 2 O (0.225% HCOOH) in 5% MeCN to H 2 O (0.225% HCOOH) YMC- eluting with a gradient of 25% MeCN solution of the tooth acts tri (Actus Triact) C18 (150 mm x 30 mm x 5 [mu] M) column to give the Formate salt of the title compound (7.14 g, 37% over 3 steps) as a yellow solid.

H2O(200 mL) 중 표제 화합물의 포름에이트 염(5.14 g)의 용액에 포화 수성 NaHCO3(100 mL) 및 EtOAc(200 mL)를 연속적으로 첨가하였다. 층을 분리하고, 수층을 EtOAc(8 x 100 mL)로 추출하였다. 합한 유기물을 Na2SO4로 건조하고, 진공에서 농축하여 무정형 고체로서 표제 화합물을 수득하였다. 이 무정형 고체의 사용되는 양(약 3 g)를 최소량의 EtOH/EtOAc(약 1:1, 약 120 mL)에 용해하고, 약 10 mL의 용량으로 진공에서 농축하고, EtOAc(40 mL)로 희석하였다. 이 용액을 결정질 생성물(약 5 mg)로 시딩하고, 상온에서 밤새 교반하였다. 결정화 플라스크를 1 시간 동안 0℃로 냉각하여 추가 결정화를 촉진하였다. 생성물을 여과로 수집하고, 진공에서 농축하여 EtOAc(0.038 eq) 및 EtOH(0.03 eq)을 함유하는 백색 결정질 물질로서 표제 화합물(2.63 g)을 수득하였다. 융점 = 204.9℃. 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6, 30℃) δ ppm 11.65(s, 1 H), 8.93(s, 1 H), 8.54(d, J=3.9 Hz, 1 H), 8.14(d, J=8.1 Hz, 1 H), 7.86(s, 1 H), 7.82(t, J=7.3 Hz, 1 H), 7.53(s, 1 H), 7.52(s, 1 H), 7.20(ddd, J=1.0, 4.9, 7.4 Hz, 1 H), 6.71(br. s., 1 H), 6.08(br. s., 1 H), 5.66(br. s., 1 H), 5.53(br. s., 1 H), 5.31-4.79(m, 1 H), 3.82(s, 3 H), 3.15-2.93(m, 3 H), 2.76(br. s., 2 H), 2.46(br. s., 2 H). 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6, 80℃) δ ppm 11.41(br. s., 1 H), 8.59(s, 1 H), 8.55-8.52(m, 1 H), 8.13(d, J=8.1 Hz, 1 H), 7.84(s, 1 H), 7.80(dt, J=1.9, 7.7 Hz, 1 H), 7.55(s, 1 H), 7.50(s, 1 H), 7.18(ddd, J=1.0, 4.8, 7.4 Hz, 1 H), 6.66(dd, J=10.6, 16.8 Hz, 1 H), 6.05(dd, J=2.3, 16.8 Hz, 1 H), 5.63(dd, J=2.3, 10.5 Hz, 1 H), 5.59-5.53(m, 1 H), 5.00(t, J=8.0 Hz, 1 H), 3.82(s, 3 H), 3.04(s, 3 H), 2.82-2.71(m, 2 H), 2.55-2.45(m, 2 H). C23H24N8O2에 대한 m/z (APCI+): 445.2(M +H)+. 원소 분석: 측정치 C, 61.96; H, 5.50; N, 24.93. C23H24N8O2 + 0.038 EtOAc + 0.030 당량 EtOH는 C, 62.06; H, 5.49; N, 24.95를 필요로 한다.Saturated aqueous NaHCO 3 (100 mL) and EtOAc (200 mL) were successively added to a solution of the formate salt of the title compound in H 2 O (200 mL) (5.14 g). The layers were separated and the aqueous layer was extracted with EtOAc (8 x 100 mL). The combined organics were dried with Na 2 SO 4 and concentrated in vacuo to give the title compound as an amorphous solid. The used amount of this amorphous solid (about 3 g) was dissolved in a minimum amount of EtOH / EtOAc (about 1: 1, ca. 120 mL), concentrated in vacuo to a volume of about 10 mL and diluted with EtOAc (40 mL) Respectively. This solution was seeded with the crystalline product (about 5 mg) and stirred overnight at room temperature. The crystallization flask was cooled to 0 &lt; 0 &gt; C for 1 hour to promote further crystallization. The product was collected by filtration and concentrated in vacuo to give the title compound (2.63 g) as a white crystalline material containing EtOAc (0.038 eq) and EtOH (0.03 eq). Melting point = 204.9 占 폚. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6, 30 C)? Ppm 11.65 (s, 1H), 8.93 (s, 1H), 8.54 (d, J = 3.9 Hz, 1H) = 8.1 Hz, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.82 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.53 (s, 1H) = 1.0, 4.9, 7.4 Hz, 1H), 6.71 (br s, 1H), 6.08 (br s, 1H), 5.66 (br s, 1H), 5.53 (M, 3 H), 2.76 (br s, 2 H), 2.46 (s, 3 H), 3.15-2.93 ., 2 H). 1 H), 8.55 (s, 1H), 8.55-8.52 (m, 1H), 8.13 (d, J) = 8.1 Hz, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.80 (dt, J = 1.9,7.7 Hz, 1H), 7.55 (s, 1H), 7.50 J = 1.0, 4.8, 7.4 Hz, 1H), 6.66 (dd, J = 10.6,16.8 Hz, 1H), 6.05 (dd, J = 2.3, 16.8 Hz, 1H) 2.3, 10.5 Hz, 1H), 5.59-5.53 (m, 1H), 5.00 (t, J = 8.0 Hz, 1H) 2.71 (m, 2 H), 2.55 - 2.45 (m, 2 H). C 23 H 24 N 8 m / z (APCI +) for O 2: 445.2 (M + H ) +. Elemental analysis: Measured C, 61.96; H, 5.50; N, 24.93. C 23 H 24 N 8 O 2 + 0.038 EtOAc + 0.030 eq EtOH is C, 62.06; H, 5.49; N, 24.95.

실시예Example 3: N-[트랜스-3-({5- 3: N- [trans-3 - ({5- 클로로Chloro -2-[(1,3--2 - [(1,3- 다이메틸Dimethyl -1H--1H- 피라졸Pyrazole -4-일)아미노]-7H-Yl) amino] -7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘Pyrrolo [2,3-d] pyrimidine -4-일}아미노)-4-yl} amino) 사이클로부틸Cyclobutyl ]-N-] -N- 메틸프로프Methyl propyl -2--2- 엔아미드Enamide (화합물 C)(Compound C)

Figure pct00027
Figure pct00027

단계 1: t-부틸 메틸{Step 1: t-Butylmethyl { 시스Cis -3-[1--3- [1- 메틸methyl -1-(-One-( 트라이메틸실릴Trimethylsilyl )) 에톡시Ethoxy ]] 사이클로부틸Cyclobutyl }} 카바메이트의Carbamate 제조 Produce

Figure pct00028
Figure pct00028

피리딘(150 mL) 중 t-부틸(시스-3-하이드록시사이클로부틸)카바메이트(10.5 g, 56 mmol, 1.00 eq)의 용액에 TBSCl(12.7 g, 84 mmol, 1.50 eq)을 첨가하였다. 첨가 후, 혼합물을 상온에서 3 시간 동안 교반하였다. TLC(석유 에터/EtOAc = 3/1)는 출발 물질이 완전히 소비됨을 나타낸다. 반응 혼합물을 농축하고, 잔사를 EtOAc(3 x 100 mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 농축하여 오일로서 조질 t-부틸 {시스-3-[1-메틸-1-(트라이메틸실릴)에톡시]사이클로부틸}카바메이트를 수득하고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계를 위해 사용하였다. 조질 t-부틸 {시스-3-[1-메틸-1-(트라이메틸실릴)에톡시]사이클로부틸}카바메이트를 THF(300 mL)에 희석하고, NaH(60%, 3.36 g, 84 mmol, 1.50 eq)로 나눠서 처리하고 실온에서 30 분 동안 교반하였다. 혼합물을 0℃로 냉각하고, 메틸 요오다이드(23.9 g, 168 mmol, 3.0 eq)로 적가 방식으로 첨가하였다. 첨가 후, 반응 혼합물을 상온에서 5 시간 동안 교반하였다. TLC(석유 에터/EtOAc = 10/1)는 출발 물질이 완전히 소비되었음을 나타낸다. 반응 혼합물을 농축하고 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에터/EtOAc = 10/1)를 통해 정제하여 오일로서 표제 화합물(18 g, 100%)을 수득하였다. To a solution of t-butyl (cis-3-hydroxycyclobutyl) carbamate (10.5 g, 56 mmol, 1.00 eq) in pyridine (150 mL) was added TBSCl (12.7 g, 84 mmol, 1.50 eq). After the addition, the mixture was stirred at ambient temperature for 3 hours. TLC (petroleum ether / EtOAc = 3/1) indicates complete consumption of the starting material. The reaction mixture was concentrated and the residue was extracted with EtOAc (3 x 100 mL). The combined organic layers were concentrated to give crude t-butyl {cis-3- [1-methyl-1- (trimethylsilyl) ethoxy] cyclobutyl} carbamate which was used for the next step without further purification Respectively. (Trimethylsilyl) ethoxy] cyclobutyl} carbamate was diluted in THF (300 mL) and NaH (60%, 3.36 g, 84 mmol, 1.50 eq) and stirred at room temperature for 30 minutes. The mixture was cooled to 0 &lt; 0 &gt; C and added dropwise to methyl iodide (23.9 g, 168 mmol, 3.0 eq). After the addition, the reaction mixture was stirred at room temperature for 5 hours. TLC (petroleum ether / EtOAc = 10/1) indicates complete consumption of the starting material. The reaction mixture was concentrated and purified via silica gel chromatography (petroleum ether / EtOAc = 10/1) to give the title compound (18 g, 100%) as an oil.

단계 2: t-부틸(Step 2: t-Butyl ( 시스Cis -3--3- 하이드록시사이클로부틸Hydroxycyclobutyl )메틸카바메이트의 제조) Preparation of methyl carbamate

Figure pct00029
Figure pct00029

THF(200 mL) 중 t-부틸 메틸{시스-3-[1-메틸-1-(트라이메틸실릴)에톡시]사이클로부틸}카바메이트(18 g, 56 mmol, 1.0 eq)의 용액에 TBAF(22.0 g, 84 mmol, 1.50 eq)를 나눠서 첨가하였다. 첨가 후, 혼합물을 상온에서 3 시간 동안 교반하였다. TLC(석유 에터:EtOAc = 2:1)는 출발 물질이 완전히 소비되었음을 나타낸다. 반응 혼합물을 농축하고, 잔사를 컬럼 크로마토그래피(석유 에터:EtOAc = 2:1)로 정제하여 백색 고체로서 표제 화합물(8.9 g, 79% 수율)을 수득하였다. To a solution of t-butylmethyl {cis-3- [1 -methyl-1- (trimethylsilyl) ethoxy] cyclobutyl} carbamate (18 g, 56 mmol, 1.0 eq) in THF (200 mL) 22.0 g, 84 mmol, 1.50 eq) was added in portions. After the addition, the mixture was stirred at ambient temperature for 3 hours. TLC (petroleum ether: EtOAc = 2: 1) indicates complete consumption of the starting material. The reaction mixture was concentrated and the residue was purified by column chromatography (petroleum ether: EtOAc = 2: 1) to give the title compound as a white solid (8.9 g, 79% yield).

단계 3: t-부틸(트랜스-3-Step 3: t-Butyl (trans-3- 아미노사이클로부틸Aminocyclobutyl )메틸카바메이트의 제조) Preparation of methyl carbamate

Figure pct00030
Figure pct00030

DCM(300 mL) 중 t-부틸(시스-3-하이드록시사이클로부틸)메틸카바메이트(18.0 g, 0.089 mol, 1.0 eq) 및 트라이에틸아민(37 mL, 0.267 mol, 3.0 eq)의 격렬하게 교반된 냉 용액(0℃)에 MsCl(14.1 g, 0.123 mol, 1.38 eq)을 적가 방식으로 30 분간에 걸쳐서 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 상온으로 가온하고 1 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물(100 mL) 및 DCM(200 mL)으로 희석하였다. 유기 상을 분리하고, 물(2 x 100 mL), 포화 수성 NH4Cl(3 x 100 mL) 및 염수(100 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조하고, 여과하여 황색 고체로서 조질 시스-3-[(t-부톡시카본일)(메틸)아미노]사이클로부틸 메탄설포네이트를 수득하고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. 상기 수득된 조질 시스-3-[(t-부톡시카본일)(메틸)아미노]사이클로부틸 메탄설포네이트를 DMF(250 mL)에 용해하고, NaN3(28.77 g, 0.44 mol, 5 eq)으로 처리하였다. 이어서, 생성된 혼합물을 70℃로 가열하고 밤새 교반하였다. 냉각 후, 물(1500 mL) 및 EtOAc(300 mL)를 반응 혼합물에 첨가하였다. 상을 분리하고 수층을 EtOAc(3 x 300 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 포화 수성 NaHCO3(2 x 100 mL), 물(2 x 200 mL) 및 염수(100 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조하고, 증발시켜 조질 t-부틸(트랜스-3-아지도사이클로부틸)메틸카바메이트를 수득하고, 이를 다음 단계에서 직접 사용하였다. 수소 대기하에 MeOH(100 mL) 중 상기 조질 t-부틸(트랜스-3-아지도사이클로부틸)메틸카바메이트 및 Pd/C(2.5 g)의 혼합물에 MeOH(200 mL) 중 포화 NH3을 주사기를 통해 첨가하였다. 생성된 혼합물을 상온에서 36 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 여액을 감압하에 농축하였다. 이 조질 물질을 EtOAc/석유 에터(1/10 내지 1/1)를 사용하여 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 황색 액체로서 표제 화합물(13.6 g, 3 단계에 걸쳐서 76.4% 수율)을 수득하였다. To a stirred solution of t-butyl (cis-3-hydroxycyclobutyl) methyl carbamate (18.0 g, 0.089 mol, 1.0 eq) and triethylamine (37 mL, 0.267 mol, 3.0 eq) in DCM (300 mL) MsCl (14.1 g, 0.123 mol, 1.38 eq) was added dropwise over 30 minutes to the cooled solution (0 占 폚). The reaction mixture was then warmed to ambient temperature and stirred for 1 hour. The reaction mixture was diluted with water (100 mL) and DCM (200 mL). The organic phase was separated and washed with water (2 x 100 mL), saturated aqueous NH 4 Cl (3 x 100 mL) and brine (100 mL), dried over anhydrous Na 2 SO 4 , filtered and triturated as a yellow solid Cis-3 - [(t-butoxycarbonyl) (methyl) amino] cyclobutyl methanesulfonate, which was used in the next step without further purification. The obtained crude cis-3 - [(t-butoxycarbonyl) (methyl) amino] cyclobutylmethane sulfonate was dissolved in DMF (250 mL) and NaN 3 (28.77 g, 0.44 mol, 5 eq) Respectively. The resulting mixture was then heated to 70 &lt; 0 &gt; C and stirred overnight. After cooling, water (1500 mL) and EtOAc (300 mL) were added to the reaction mixture. The phases were separated and the aqueous layer was extracted with EtOAc (3 x 300 mL). The combined organic phases were washed with saturated aqueous NaHCO 3 (2 x 100 mL), water (2 x 200 mL) and brine (100 mL), dried over anhydrous Na 2 SO 4 and evaporated to give crude t- 3-azidocyclobutyl) methylcarbamate, which was used directly in the next step. To a mixture of the crude t-butyl (trans-3-azidocyclobutyl) methylcarbamate and Pd / C (2.5 g) in MeOH (100 mL) under hydrogen atmosphere was added saturated NH 3 in MeOH (200 mL) Lt; / RTI &gt; The resulting mixture was stirred at ambient temperature for 36 hours. The reaction mixture was filtered and the filtrate was concentrated under reduced pressure. The crude material was purified by column chromatography using EtOAc / petroleum ether (1/10 to 1/1) to give the title compound (13.6 g, 76.4% yield over 3 steps) as a yellow liquid.

단계 4: 2,4,5-Step 4: 2,4,5- 트라이클로로Trichloro -7-{[2-(-7 - {[2- ( 트라이메틸실릴Trimethylsilyl )) 에톡시Ethoxy ]] 메틸methyl }-7H-} -7H- 피롤Pyrrole 로[in[ 2,3-d]피리미딘의2,3-d] pyrimidine 제조 Produce

Figure pct00031
Figure pct00031

실시예 2의 단계 1에서 제조된 바와 같이, DMF(1800 mL) 중 2,4-다이클로로-7-{[2-(트라이메틸실릴)에톡시]메틸}-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘(100.0 g, 316 mmol, 1.0 eq)에 N-클로로숙신이미드(44.5 g, 332 mmol, 1.05 eq)를 상온에서 첨가하였다. 이어서, 생성된 혼합물을 80℃에서 3 시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 상온으로 냉각하고 빙수(3 L)에 부었다. 형성된 백색 침전물을 수집하고 진공에서 농축하여 회색 고체로서 표제 화합물(99.7 g, 90% 수율)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ ppm = 7.35(s, 1H), 5.58(s, 2H), 3.60-3.49(m, 2H), 1.00-0.89(m, 2H), -0.02(s, 9H). C12H16Cl3N3OSi에 대한 m/z (APCI+): 352.0(M+H)+. Methyl] -7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-2-ylmethyl ester as prepared in step 2 of Example 2, N-chlorosuccinimide (44.5 g, 332 mmol, 1.05 eq) was added at room temperature to 100.0 g (316 mmol, 1.0 eq. The resulting mixture was then stirred at 80 &lt; 0 &gt; C for 3 hours. The reaction mixture was then cooled to ambient temperature and poured into ice water (3 L). The resulting white precipitate was collected and concentrated in vacuo to give the title compound (99.7 g, 90% yield) as a gray solid. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ ppm = 7.35 (s, 1H), 5.58 (s, 2H), 3.60-3.49 (m, 2H), 1.00-0.89 (m, 2H), -0.02 (s, 9H). C 12 H 16 Cl 3 N 3 m / z (APCI +) for OSi: 352.0 (M + H) +.

단계 5: 1,3-Step 5: 1,3- 다이메틸Dimethyl -1H--1H- 피라졸Pyrazole -4--4- 아민의Amine 제조 Produce

Figure pct00032
Figure pct00032

MeOH(15 mL) 중 1,3-다이메틸-1H-피라졸-4-아민 하이드로클로라이드(800 mg)의 용액을, pH가 약 8이 될 때까지 하이드록사이드 수지[바이오 래드(Bio Rad) AG 1-X2 수지, 카탈로그 번호 143-1255]로 처리하였다. 혼합물을 15 분 동안 교반하였다. 수지를 여과 제거하고, MeOH로 여러 번 나눠서 세척하였다. 여액을 감압하에 농축하여 표제 화합물(615.3 mg, 94% 수율)을 수득하였다. 이 물질을 추가 정제없이 사용하였다. 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ ppm = 6.89(s, 1H) 3.57(s, 3H) 3.54(br. s., 2H) 1.96(s, 3H). C5H9N3에 대한 m/z (APCI+): 112.1(M+H)+.A solution of 1,3-dimethyl-1H-pyrazole-4-amine hydrochloride (800 mg) in MeOH (15 mL) was added to a solution of hydroxyl resin (Bio Rad) AG 1-X2 resin, Catalog No. 143-1255]. The mixture was stirred for 15 minutes. The resin was filtered off and washed several times with MeOH. The filtrate was concentrated under reduced pressure to give the title compound (615.3 mg, 94% yield). This material was used without further purification. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6)? Ppm = 6.89 (s, 1H) 3.57 (s, 3H) 3.54 (br.s. C 5 H 9 N 3 m / z (APCI +) for: 112.1 (M + H) + .

단계 6: t-부틸 {트랜스-3-[(2,5-Step 6: t-Butyl {trans-3 - [(2,5- 다이클로로Dichloro -7-{[2-(-7 - {[2- ( 트라이메틸실릴Trimethylsilyl )) 에톡시Ethoxy ]메틸}-7H-] Methyl} -7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘Pyrrolo [2,3-d] pyrimidine -4-일)아미노]Yl) amino] 사이클로부틸Cyclobutyl }} 메틸카바메이트의Methylcarbamate 제조 Produce

Figure pct00033
Figure pct00033

MeCN(21.0 mL, 0.2 M) 중 t-부틸(트랜스-3-아미노사이클로부틸)메틸카바메이트 (1020 mg, 5.1 mmol, 1.2 eq), 2,4,5-트라이클로로-7-{[2-(트라이메틸실릴)에톡시]메틸}-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘(1500 mg, 4.253 mmol, 1.0 eq) 및 DIPEA(2.12 mL, 12.8 mmol, 3.0 eq)의 혼합물을 80℃에서 5.5 시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 물로 희석하고, EtOAc로 추출하였다. 유기 층을 Na2SO4로 건조하고 농축하였다. 잔사를 플래시 크로마토그래피(헵탄 중 10 내지 30% EtOAc)로 정제하여 투명한 검으로서 표제 화합물(2.22 g, 100% 수율)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ ppm = 7.54(s, 1H) 7.05(d, J=5.99 Hz, 1H) 5.40(s, 2H) 4.74(br. s., 1H) 4.41-4.54(m, 1H) 3.45-3.54(m, 2H) 2.83(s, 3H) 2.52-2.63(m, 2H) 2.28-2.42(m, 2H) 1.40(s, 9H) 0.78-0.89(m, 2H) -0.08(s, 9H). C22H35Cl2N5O3Si에 대한 m/z (APCI+): 516.2(M+H)+.(Trans-3-aminocyclobutyl) methylcarbamate (1020 mg, 5.1 mmol, 1.2 eq), 2,4,5-trichloro-7 - {[2- (1500 mg, 4.253 mmol, 1.0 eq) and DIPEA (2.12 mL, 12.8 mmol, 3.0 eq) was added to a solution of 80 Lt; 0 &gt; C for 5.5 hours. The reaction mixture was diluted with water and extracted with EtOAc. The organic layer was dried over Na 2 SO 4 and concentrated. The residue was purified by flash chromatography (10-30% EtOAc in heptane) to give the title compound as a clear gum (2.22 g, 100% yield). 1 H NMR (400 MHz, DMSO -d6) δ ppm = 7.54 (s, 1H) 7.05 (d, J = 5.99 Hz, 1H) 5.40 (s, 2H) 4.74 (. Br. S, 1H) 4.41-4.54 ( (m, 2H), 3.78-3.54 (m, 2H) 2.83 (s, 3H) 2.52-2.63 (s, 9 H). C 22 H 35 Cl 2 N 5 O 3 Si m / z (APCI +) for: 516.2 (M + H) + .

단계 7: t-부틸 {트랜스-3-[(5-Step 7: t-Butyl {trans-3 - [(5- 클로로Chloro -2-[(1,3--2 - [(1,3- 다이메틸Dimethyl -1H--1H- 피라졸Pyrazole -4-일)아미노]-7-{[2-(Yl) amino] -7 - {[2- ( 트라이메틸실릴Trimethylsilyl )) 에톡시Ethoxy ]] 메틸methyl }-7H-} -7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘Pyrrolo [2,3-d] pyrimidine -4-일)아미노]Yl) amino] 사이클로부틸Cyclobutyl }} 메틸카바메이트의Methylcarbamate 제조 Produce

Figure pct00034
Figure pct00034

1,3-다이메틸-1H-피라졸-4-아민(567 mg, 5.10 mmol, 1.2 eq) 및 t-부틸 {트랜스-3-[(2,5-다이클로로-7-{[2-(트라이메틸실릴)에톡시]메틸}-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)아미노]사이클로부틸}메틸카바메이트(2197 mg, 4.253 mmol, 1.00 eq)를 함유하는 플라스크를 Pd2(dba)3(393 mg, 0.425 mmol, 0.1 eq), Xantphos(259 mg, 0.425 mmol, 0.1 eq) 및 Cs2CO3(4160 mg, 12.8 mmol, 3.0 eq)으로 충전하였다. 1,4-다이옥산(42 mL, 0.1 M)을 첨가하고, 혼합물을 105℃로 18 시간 동안 가열하였다. 반응 생성물을 실온으로 냉각하고, 셀라이트의 패드를 통해 여과하였다. 여액을 농축하고, 잔사를 플래시 크로마토그래피(헵탄 중 40 내지 60% EtOAc)로 정제하여 포말로서 표제 화합물(1950 mg, 78% 수율)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ ppm = 8.03(s, 1H) 7.87(s, 1H) 7.10(s, 1H) 6.33(d, J=6.24 Hz, 1H) 5.35(s, 2H) 4.67(br. s., 1H) 4.55(br. s., 1H) 3.68-3.75(m, 3H) 3.45-3.53(m, 2H) 2.85(s, 3H) 2.52-2.60(m, 2H) 2.29-2.38(m, 2H) 2.12(s, 3H) 1.40(s, 9H) 0.78-0.88(m, 2H) -0.10(s, 9H). C27H43ClN8O3Si에 대한 m/z (APCI+): 591.3(M+H)+.(567 mg, 5.10 mmol, 1.2 eq) and t-butyl {trans-3 - [(2,5-dichloro- 4-yl) amino] cyclobutyl} methylcarbamate (2197 mg, 4.253 mmol, 1.00 eq) in anhydrous tetrahydrofuran Was charged with Pd 2 (dba) 3 (393 mg, 0.425 mmol, 0.1 eq), Xantphos (259 mg, 0.425 mmol, 0.1 eq) and Cs 2 CO 3 (4160 mg, 12.8 mmol, 3.0 eq). 1,4-Dioxane (42 mL, 0.1 M) was added and the mixture was heated to 105 [deg.] C for 18 hours. The reaction product was cooled to room temperature and filtered through a pad of celite. The filtrate was concentrated and the residue was purified by flash chromatography (40-60% EtOAc in heptane) to give the title compound (1950 mg, 78% yield) as a foam. 1 H NMR (400 MHz, DMSO -d6) δ ppm = 8.03 (s, 1H) 7.87 (s, 1H) 7.10 (s, 1H) 6.33 (d, J = 6.24 Hz, 1H) 5.35 (s, 2H) 4.67 2H), 2.85 (s, 3H), 2.52-2.60 (m, 2H), 2.29-2.38 (m, (m, 2 H) 2.12 (s, 3 H) 1.40 (s, 9 H) 0.78 - 0.88 (m, 2 H) - 0.10 (s, 9 H). M / z (APCI +) for C 27 H 43 ClN 8 O 3 Si: 591.3 (M + H) <+> .

단계 8: N-[트랜스-3-({5-Step 8: N- [trans-3 - ({5- 클로로Chloro -2-[(1,3--2 - [(1,3- 다이메틸Dimethyl -1H--1H- 피라졸Pyrazole -4-일)아미노]-7H-피Yl) amino] -7H-pyrrolo [2,3-c] 롤로[2,3-d]피리미2,3-d] pyrimidine 딘-4-일}아미노)4-yl} amino) 사이클로부틸Cyclobutyl ]-N-] -N- 메틸프로프Methyl propyl -2--2- 엔아미드의Enamidic 제조 Produce

Figure pct00035
Figure pct00035

DCM(42 mL) 중 t-부틸 {트랜스-3-[(5-클로로-2-[(1,3-다이메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-7-{[2-(트라이메틸실릴)에톡시]메틸}-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)아미노]사이클로부틸}메틸카바메이트(1950 mg, 3.30 mmol, 1.0 eq)의 냉 용액(0℃)에 TFA(31 mL)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 만들고, 추가 16 시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 톨루엔(30 mL)으로 희석하고 농축하여 건조하였다. 생성된 조질 잔사를 1,4-다이옥산(20 mL) 및 농축 수성 NH4OH(20 mL)에 용해하고 상온에서 3 시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 증발시켜 건조하였다. 생성된 조질 고체를 EtOAc(140 mL)와 포화 수성 Na2CO3(140 mL) 사이에 분배하고, 1 시간 동안 격렬하게 교반하면서 아크릴로일 클로라이드(0.420 mL, 5.19 mmol, 1.58 eq)로 처리하였다. 이 시간에 층을 분리하고, 수층을 EtOAc(50 mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4로 건조하고, 톨루엔(30 mL)으로 희석하고, 증발시켜 건조하였다. 생성된 고체를 4%/분, 140 바, 55 mL/분에서 20 내지 40% EtOH을 사용하는 ZymorSpher HAP 150 x 21.2 mm 컬럼을 사용하여 정제하여 회색 분말로서 표제 화합물(950 mg, 69% 수율)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6, 26℃) δ ppm = 11.16(br. s., 1H), 7.80(br. s., 1H), 7.77(s, 1H), 6.88(d, J=2.4 Hz, 1H), 6.74(dd, J=10.5, 16.7 Hz, 1H), 6.32(br. s., 1H), 6.07(d, J=15.9 Hz, 1H), 5.66(d, J=10.4 Hz, 1H), 5.30-4.75(m, 1H), 4.59(br. s., 1H), 3.71(s, 3H), 3.15-2.88(m, 3H), 2.62(br. s., 2H), 2.40(br. s., 2H), 2.08(s, 3H). 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6, 80℃) δ ppm = 10.93(br. s., 1H), 7.73(s, 1H), 7.41(br. s., 1H), 6.82(d, J=2.2 Hz, 1H), 6.68(dd, J=10.5, 16.9 Hz, 1H), 6.16(d, J=5.9 Hz, 1H), 6.05(dd, J=2.4, 16.8 Hz, 1H), 5.63(dd, J=2.4, 10.5 Hz, 1H), 4.94(t, J=8.0 Hz, 1H), 4.60(dd, J=4.0, 8.7 Hz, 1H), 3.72(s, 3H), 3.04(s, 3H), 2.72-2.57(m, 2H), 2.41(ddd, J=4.5, 8.9, 13.6 Hz, 2H), 2.10(s, 3H). C19H23ClN8O3에 대한 m/z (APCI+): 415.1(M+H)+.To a solution of t-butyl {trans-3 - [(5-chloro-2 - [(l, 3- dimethyl-lH- pyrazol- Amino] cyclobutyl} methylcarbamate (1950 mg, 3.30 mmol, 1.0 eq) in anhydrous tetrahydrofuran (2 mL) 0 &lt; 0 &gt; C) was added TFA (31 mL). The reaction mixture was allowed to come to room temperature and stirred for an additional 16 hours. The reaction mixture was then diluted with toluene (30 mL) and concentrated to dryness. The resulting crude residue was dissolved in 1,4-dioxane (20 mL) and concentrated aqueous NH 4 OH (20 mL) and stirred at room temperature for 3 hours. The reaction mixture was then evaporated to dryness. The resulting crude solid was treated with EtOAc (140 mL) and saturated aqueous Na 2 CO 3 (140 mL) distribution, and vigorously chloride (0.420 mL, 5.19 mmol, 1.58 eq) acryloyl with stirring for 1 hour between . At this time the layers were separated and the aqueous layer was extracted with EtOAc (50 mL). The combined organic layers were dried over Na 2 SO 4 , diluted with toluene (30 mL), and evaporated to dryness. The resulting solid was purified using a ZymorSpher HAP 150 x 21.2 mm column using 20-40% EtOH at 4% / min, 140 bar and 55 mL / min to give the title compound (950 mg, 69% yield) as a gray powder. &Lt; / RTI &gt; 1 H NMR (400 MHz, DMSO -d6, 26 ℃) δ ppm = 11.16 (br. S., 1H), 7.80 (br. S., 1H), 7.77 (s, 1H), 6.88 (d, J = J = 10.4 Hz, 1H), 6.74 (dd, J = 10.5, 16.7 Hz, 1H), 6.32 2H), 2.40 (s, 3H), 2.45 (s, 3H) (br.s, 2H), 2.08 (s, 3H). 1 H NMR (400 MHz, DMSO -d6, 80 ℃) δ ppm = 10.93 (br. S., 1H), 7.73 (s, 1H), 7.41 (br. S., 1H), 6.82 (d, J = J = 5.9 Hz, 1H), 6.05 (dd, J = 2.4, 16.8 Hz, 1H), 5.63 (dd, J = 2.4, 10.5 Hz, 1H), 4.94 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 4.60 (dd, J = 4.0,8.7 Hz, 1H) 2.72-2.57 (m, 2H), 2.41 (ddd, J = 4.5, 8.9, 13.6 Hz, 2H), 2.10 (s, 3H). C 19 H 23 ClN 8 O 3 m / z (APCI +) for: 415.1 (M + H) + .

실시예Example 4: 1-{(3R,4R)-3-[({5- 4: 1 - {(3R, 4R) -3 - [({5- 클로로Chloro -2-[(3--2 - [(3- 메톡시Methoxy -1--One- 메틸methyl -1H--1H- 피라졸Pyrazole -4-일)아미노]-7H-Yl) amino] -7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘Pyrrolo [2,3-d] pyrimidine -4-일}-4-yl} 옥시Oxy )) 메틸methyl ]-4-]-4- 메톡시피롤리딘Methoxypyrrolidine -1-일}-1 day} 프로프Professional -2-엔-1-온(화합물 D)의 제조2-en-1-one (Compound D)

Figure pct00036
Figure pct00036

1-메틸-1H-피라졸-4-아민을 3-메톡시-1-메틸-1H-피라졸-4-아민 및 다른 비임계 치환기로 치환하여 실시예 1과 유사한 방식으로 제조하였다.The title compound was prepared in analogy to example 1, substituting l-methyl-lH-pyrazol-4-amine with 3-methoxy-l-methyl-lH-pyrazol-4-amine and other non-critical substituents.

주요 중간체에 대한 실험 과정Experimental process for key intermediates

제조예Manufacturing example 1: t-부틸-3-( 1: t-Butyl-3- ( 하이드록시메틸Hydroxymethyl )-4-()-4-( 메톡시메틸Methoxymethyl )) 피롤리딘Pyrrolidine -1--One- 카복실레이트의Carboxylate 제조 Produce

Figure pct00037
Figure pct00037

단계 1: 에틸(2E)-4-{[t-부틸(Step 1: Ethyl (2E) -4 - {[t-butyl ( 다이메틸Dimethyl )실릴]) Silyl] 옥시Oxy }} 부트Boot -2--2- 엔오에이트의Enoate 제조 Produce

Figure pct00038
Figure pct00038

DIEA(2.75 mL, 16.6 mmol) 및 LiCl(5.54 g, 129 mmol)를 CH3CN(40 mL) 중 t-부틸다이메틸실릴옥시 아세트알데하이드(3.22 g, 18.5 mmol) 및 다이에틸메틸포스포노아세테이트(4.66 g, 22.2 mmol)의 용액에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물(50 mL)로 급랭하고, EtOAc(50 mL)로 추출하였다. 유기 층을 MgSO4로 건조하고 농축하였다. 잔사를 25% EtOAc/헵탄로 용리하는 플래시 크로마토그래피로 정제하여 무색 오일로서 표제 화합물(3.27 g, 72% 수율)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 6.91(dt, J=15.42, 3.49 Hz, 1 H) 6.01(dt, J=15.61, 2.27 Hz, 1 H) 4.25(dd, J=3.27, 2.27 Hz, 2 H) 4.12(q, J=7.22 Hz, 2 H) 1.21(t, J=7.18 Hz, 3 H) 0.84(s, 9 H) 0.00(s, 6 H).DIEA (2.75 mL, 16.6 mmol) and LiCl (5.54 g, 129 mmol) to CH 3 CN (40 mL) of t- butyl-dimethyl-silyloxy acetaldehyde (3.22 g, 18.5 mmol) and methyl diethyl phosphono acetate ( 4.66 g, 22.2 mmol) and the mixture was stirred at room temperature for 24 hours. The mixture was quenched with water (50 mL) and extracted with EtOAc (50 mL). The organic layer was dried with MgSO 4, and concentrated. The residue was purified by flash chromatography eluting with 25% EtOAc / heptane to give the title compound (3.27 g, 72% yield) as a colorless oil. 1 H NMR (400 MHz, chloroform -d) δ ppm 6.91 (dt, J = 15.42, 3.49 Hz, 1 H) 6.01 (dt, J = 15.61, 2.27 Hz, 1 H) 4.25 (dd, J = 3.27, 2.27 Hz, 2 H) 4.12 (q, J = 7.22 Hz, 2 H) 1.21 (t, J = 7.18 Hz, 3 H) 0.84 (s, 9 H) 0.00 (s, 6 H).

단계 2: 트랜스-에틸-1-벤질-4-({[t-부틸(Step 2: trans-Ethyl-1-benzyl-4 - ({[t-butyl ( 다이메틸Dimethyl )실릴]) Silyl] 옥시Oxy }} 메틸methyl ) ) 피롤리딘Pyrrolidine -3-카-3-car 복실레이트Decylate 의 제조Manufacturing

Figure pct00039
Figure pct00039

CH2Cl2(30 mL) 중 에틸(2E)-4-{[t-부틸(다이메틸)실릴]옥시}부트-2-엔오에이트(3.27 g, 13.4 mmol) 및 N-벤질-1-메톡시-N-((트라이메틸실릴)메틸)메탄아민(4.14 g, 17.5 mmol)의 용액에 TFA(0.280 mL, 3.64 mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 반응 생성물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 물(50 mL)로 급랭하고, EtOAc(2 x 50 mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 MgSO4로 건조하고 농축하였다. 잔사를 20% EtOAc/헵탄으로 용리하는 플래시 크로마토그래피로 정제하여 담황색 오일로서 표제 화합물(2.61 g, 53% 수율)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 7.08-7.41(m, 5H), 4.10(q, J = 7.13 Hz, 2H), 3.42-3.73(m, 4H), 2.37-2.90(m, 6H), 1.22(t, J = 7.05 Hz, 3H), 0.84(s, 9H), 0.00(d, J = 1.26 Hz, 6H).CH 2 Cl 2 (30 mL) of ethyl (2E) -4 - {[t- butyl (dimethyl) silyl] oxy} -2-boot enoh benzoate (3.27 g, 13.4 mmol) and N- benzyl-1-methoxy Was added TFA (0.280 mL, 3.64 mmol) at 0 &lt; 0 &gt; C to a solution of 4-methoxy- N - ((trimethylsilyl) methyl) methanamine (4.14 g, 17.5 mmol). The reaction product was stirred overnight at room temperature. The mixture was quenched with water (50 mL) and extracted with EtOAc (2 x 50 mL). The combined organic layers were dried over MgSO 4 and concentrated. The residue was purified by flash chromatography eluting with 20% EtOAc / heptane to give the title compound (2.61 g, 53% yield) as a pale yellow oil. 1 H NMR (400 MHz, chloroform-d)? Ppm 7.08-7.41 (m, 5H), 4.10 (q, J = 7.13 Hz, 2H), 3.42-3.73 ), 1.22 (t, J = 7.05 Hz, 3H), 0.84 (s, 9H), 0.00 (d, J = 1.26 Hz, 6H).

단계 3: 트랜스-1-t-부틸 3-에틸-4-({[t-부틸(Step 3: trans-1-tert-Butyl 3-ethyl-4 - ({[t-butyl 다이메틸Dimethyl )실릴]) Silyl] 옥시Oxy }} 메틸methyl ) ) 피롤리딘Pyrrolidine -1,3--1,3- 다이카복실레이트의Dicarboxylate 제조 Produce

Figure pct00040
Figure pct00040

EtOH(40 mL) 중 트랜스-에틸-1-벤질-4-({[t-부틸(다이메틸)실릴]옥시}메틸) 피롤리딘-3-카복실레이트(트랜스 혼합물)(3.25 g, 8.61 mmol)의 용액에 Pd(OH)2(300 mg) 및 Boc2O(1.90 g, 8.61 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 H2(50 psi, 50℃)하에 밤새 교반하였다. 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 여액을 농축하였다. 잔사를 5% 내지 10% EtOAc/헵탄으로 용리하는 플래시 크로마토그래피로 정제하여 무색 오일로서 표제 화합물(3.08 g, 92% 수율)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 4.13-4.25(m, 2 H) 3.65(m, 5 H) 3.14-3.29(m, 1 H) 2.84-3.00(m, 1 H) 2.47-2.70(m, 1 H) 1.46(s, 9 H) 1.27(td, J=7.11, 2.64 Hz, 3 H) 0.85-0.92(m, 9 H) 0.05(s, 6 H).Pyrrolidine-3-carboxylate (trans mixture) (3.25 g, 8.61 mmol) in EtOH (40 mL) was added dropwise to a solution of trans-ethyl-1-benzyl-4- ({[t- butyl (dimethyl) ) Pd (OH) 2 (300 mg) and Boc 2 O (1.90 g, 8.61 mmol) to a solution of was added. The mixture was stirred under H 2 (50 psi, 50 ° C) overnight. The mixture was filtered through celite and the filtrate was concentrated. The residue was purified by flash chromatography eluting with 5% to 10% EtOAc / heptane to give the title compound (3.08 g, 92% yield) as a colorless oil. 1 H NMR (400 MHz, chloroform-d) ppm 4.13-4.25 (m, 2 H) 3.65 (m, 5 H) 3.14-3.29 (m, 1 H) 1.46 (s, 9 H) 1.27 (td, J = 7.11, 2.64 Hz, 3 H) 0.85 - 0.92 (m, 9 H) 0.05 (s, 6 H).

단계 4: 트랜스-t-부틸-3-({[t-부틸(Step 4: Preparation of trans-t-butyl-3 - ({[t-butyl ( 다이메틸Dimethyl )실릴]) Silyl] 옥시Oxy }} 메틸methyl )-4-()-4-( 하이드록Hydlock 시메틸)Methyl) 피롤리딘Pyrrolidine -1--One- 카복실레이트의Carboxylate 제조 Produce

Figure pct00041
Figure pct00041

LiBH4(911 mg, 39.7 mmol)를 THF(25 mL) 중 트랜스-1-t-부틸 3-에틸-4-({[t-부틸(다이메틸)실릴]옥시}메틸)피롤리딘-1,3-다이카복실레이트(3.08 g, 7.95 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 3 시간 동안 환류 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각한 후, 물(15 mL)로 급랭하고 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물(60 mL)로 희석하고 에틸 아세테이트(2 x 80 mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 진공에서 농축하여 무색 오일을 수득하였다. 조질 생성물을 30% EtOAc/헵탄으로 용리하는 플래시 크로마토그래피로 정제하여 무색 오일로서 표제 화합물(2.34 g, 86% 수율)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 3.73(m, 1H), 3.61(m, 2H), 3.52(m, 2H), 3.45(m, 1H), 2.90-3.09(m, 2H), 2.04-2.32(m, 2H), 1.46(s, 9H), 0.92(s, 9H), 0.10(d, J = 1.01 Hz, 6H).LiBH 4 (911 mg, 39.7 mmol) was added to a solution of trans-l-butyl 3-ethyl-4 - ({[t- butyl (dimethyl) silyl] oxy} methyl) pyrrolidin- , 3-dicarboxylate (3.08 g, 7.95 mmol). The mixture was heated to reflux for 3 hours. The reaction mixture was cooled to room temperature, quenched with water (15 mL) and stirred at room temperature for 1 hour. The mixture was diluted with water (60 mL) and extracted with ethyl acetate (2 x 80 mL). The combined organic layers were washed with brine, dried over Na 2 SO 4 and concentrated in vacuo to give a colorless oil. The crude product was purified by flash chromatography eluting with 30% EtOAc / heptane to give the title compound (2.34 g, 86% yield) as a colorless oil. 1 H NMR (400 MHz, chloroform -d) δ ppm 3.73 (m, 1H), 3.61 (m, 2H), 3.52 (m, 2H), 3.45 (m, 1H), 2.90-3.09 (m, 2H), (M, 2H), 1.46 (s, 9H), 0.92 (s, 9H), 0.10 (d, J = 1.01 Hz, 6H).

단계 5: 트랜스-t-부틸-3-({[t-부틸(Step 5: Preparation of trans-t-butyl-3 - ({[t-butyl ( 다이메틸Dimethyl )실릴]) Silyl] 옥시Oxy }} 메틸methyl )-4-()-4-( 메톡시메틸Methoxymethyl )) 피롤리딘Pyrrolidine -1--One- 카복실레이트의Carboxylate 제조 Produce

Figure pct00042
Figure pct00042

테트라부틸암모늄 요오다이드(0.110 g, 0.28 mmol), 50% 수성 NaOH(20 mL) 및 다이메틸 설페이트(0.325 mL, 3.41 mmol)를 CH2Cl2(20 mL) 중 트랜스-t-부틸-3-({[t-부틸(다이메틸)실릴]옥시}메틸)-4-(하이드록시메틸)피롤리딘-1-카복실레이트(0.982 g, 2.84 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 생성물을 실온에서 밤새 교반하였다. TLC는 일부 출발 물질이 남아 있음을 보여주고, 추가 다이메틸 설페이트(0.150 mL)를 반응 혼합물에 첨가하고 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 수성 NH3OH(30 mL)를 반응 혼합물에 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물(20 mL)로 희석하고 CH2Cl2(2 x 30 mL)로 추출하였다. 유기 층을 MgSO4로 건조하고 농축하였다. 잔사를 10% EtOAc/헵탄으로 용리하는 플래시 크로마토그래피로 정제하여 무색 오일로서 표제 화합물(451 mg, 44% 수율)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 3.60-3.70(m, 1H), 3.55(br. s., 2H), 3.37-3.48(m, 1H), 3.34(m, 4H), 3.05-3.23(m, 2H), 2.22-2.40(m, 1H), 2.07-2.21(m, 1H), 1.43-1.49(m, 9H), 0.89(s, 9H), 0.05(s, 6H).Tetrabutylammonium iodide trans -3 -t- butyl-of (0.110 g, 0.28 mmol), 50% aqueous NaOH (20 mL) and dimethyl sulfate (0.325 mL, 3.41 mmol) to CH 2 Cl 2 (20 mL) pyrrolidine-1-carboxylate (0.982 g, 2.84 mmol) in dichloromethane (5 ml) was added to a solution of 2 - ({[tert- butyl (dimethyl) silyl] oxy} methyl) -4- The reaction product was stirred overnight at room temperature. TLC showed some starting material remaining and additional dimethyl sulfate (0.150 mL) was added to the reaction mixture and stirred at room temperature for 3 hours. An aqueous NH 3 OH (30 mL) was added to the reaction mixture, which was stirred at room temperature for 1 hour. The mixture was diluted with water (20 mL) and extracted with CH 2 Cl 2 (2 x 30 mL). The organic layer was dried with MgSO 4, and concentrated. The residue was purified by flash chromatography eluting with 10% EtOAc / heptane to give the title compound (451 mg, 44% yield) as a colorless oil. 1 H NMR (400 MHz, chloroform -d) δ ppm 3.60-3.70 (m, 1H), 3.55 (br. S., 2H), 3.37-3.48 (m, 1H), 3.34 (m, 4H), 3.05- (S, 9H), 0.89 (s, 9H), 0.05 (s, 6H), 3.23 (m, 2H), 2.22-2.40 (m, 1H), 2.07-2.21 (m,

단계 6: 트랜스-t-부틸-3-(Step 6: Preparation of trans-t-butyl-3- ( 하이드록시메틸Hydroxymethyl )-4-()-4-( 메톡시메틸Methoxymethyl )) 피롤리딘Pyrrolidine -1--One- 카복Carbop 실레이트의 제조Manufacture of silicate

Figure pct00043
Figure pct00043

TBAF(THF 중 1.0 M, 2.45 mL, 2.45 mmol)를 THF(5 mL) 중 트랜스-t-부틸-3-({[t-부틸(다이메틸)실릴]옥시}메틸)-4-(메톡시메틸)피롤리딘-1-카복실레이트(290 mg, 0.81 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물로 급랭하고, EtOAc로 추출하였다. 유기 층을 MgSO4로 건조하고 농축하였다. 조질 생성물을 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.TBAF (1.0 M in THF, 2.45 mL, 2.45 mmol) was added to a solution of trans-t-butyl-3- ({[t- butyl (dimethyl) silyl] oxy} Methyl) pyrrolidine-1-carboxylate (290 mg, 0.81 mmol) in DMF (5 mL). The mixture was stirred at room temperature for 1 hour. The mixture was quenched with water and extracted with EtOAc. The organic layer was dried with MgSO 4, and concentrated. The crude product was used in the next step without further purification.

제조예Manufacturing example 2: t-부틸(트랜스-3- 2: t-Butyl (trans-3- 아미노사이클로부틸Aminocyclobutyl )메틸카바메이트의 제조) Preparation of methyl carbamate

Figure pct00044
Figure pct00044

단계 1: 3-Step 1: 3- 메틸리덴사이클로부탄카복실산의Of methylidene cyclobutanecarboxylic acid 제조 Produce

Figure pct00045
Figure pct00045

에탄올(500 mL) 및 물(500 mL) 중 3-메틸리덴사이클로부탄카보니트릴(110 g, 1.18 mol)의 용액에 칼륨 하이드록사이드(264 g, 4.7 mol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 밤새 환류하였다. 에탄올을 감압하에 제거한 후, 용액을 10℃ 미만으로 냉각하고 농축 HCl을 사용하여 pH 1로 산성화하였다. 혼합물을 EtOAc(2 x 500 mL)로 농축하고, 합한 유기 추출물을 무수 나트륨 설페이트로 건조하고 진공하에 농축하여 황색 오일로서 표제 화합물(132 g, 100% 수율)을 수득하였다.To a solution of 3-methylidene cyclobutanecarbonitrile (110 g, 1.18 mol) in ethanol (500 mL) and water (500 mL) was added potassium hydroxide (264 g, 4.7 mol) Lt; / RTI &gt; After removing the ethanol under reduced pressure, the solution was cooled to below 10 &lt; 0 &gt; C and acidified to pH 1 using concentrated HCl. The mixture was concentrated to EtOAc (2 x 500 mL) and the combined organic extracts were dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated in vacuo to give the title compound (132 g, 100% yield) as a yellow oil.

단계 2: t-Step 2: Preparation of t- 부틸(3-메틸리덴사이클로부틸)카바메이트의Butyl (3-methylidene cyclobutyl) carbamate 제조 Produce

Figure pct00046
Figure pct00046

t-부틸 알코올(1 L) 중 3-메틸리덴사이클로부탄카복실산(132 g, 1.17 mol) 및 Et3N(178 g, 1.76 mol)의 용액에 DPPA(574 g, 1.41 mol)를 적가하고, 생성된 혼합물을 밤새 환류하였다. 이어서, 혼합물을 물(100 mL)로 급랭하였다. t-부틸 알코올을 제거한 후, 잔사를 포화 NH4Cl(500 mL)로 처리하고, 남아있는 고체 침전물을 수집하고, 포화 NH4Cl 및 포화 NaHCO3으로 세척하여 백색 고체로서 표제 화합물(165 g, 77% 수율)을 수득하였다.It was added dropwise DPPA (574 g, 1.41 mol) to a solution of t- butyl alcohol, 3-methyl cyclobutane carboxylic acid fluoride of (1 L) (132 g, 1.17 mol) and Et 3 N (178 g, 1.76 mol) and the resulting The resulting mixture was refluxed overnight. The mixture was then quenched with water (100 mL). After removal of the t-butyl alcohol, the residue was treated with saturated NH 4 Cl (500 mL) and the remaining solid precipitate was collected and washed with saturated NH 4 Cl and saturated NaHCO 3 to give the title compound as a white solid (165 g, 77% yield).

단계 3: t-Step 3: Preparation of t- 부틸(3-옥소사이클로부틸)카바메이트의Butyl (3-oxocyclobutyl) carbamate 제조 Produce

Figure pct00047
Figure pct00047

CH2Cl2(1000 mL) 및 MeOH(1000 mL) 중 t-부틸(3-메틸리덴사이클로부틸)카바메이트(165 g, 0.91 mol)의 용액에 -78℃에서 용액이 청색으로 변할 때까지 O3을 발포하였다. TLC(석유 에터:EtOAc = 10:1)는 출발 물질이 완전히 소비되었음을 나타낸다. 이어서, 질소 가스를 반응 생성물을 통해 발포하여 과잉 O3을 제거한 후, 혼합물을 Me2S(200 mL)로 급랭하고 1 시간 동안 교반하였다. 용액을 농축하여 잔사를 수득하고, 이를 포화 NaHCO3 및 물로 세척하여 백색 고체로서 표제 화합물(118 g, 70% 수율)을 수득하였다.To a solution of t-butyl (3-methylidenecyclobutyl) carbamate (165 g, 0.91 mol) in CH 2 Cl 2 (1000 mL) and MeOH (1000 mL) at -78 ° C was added O 3 . TLC (petroleum ether: EtOAc = 10: 1) indicates complete consumption of starting material. Then nitrogen gas was bubbled through the reaction product to remove excess O 3 , then the mixture was quenched with Me 2 S (200 mL) and stirred for 1 hour. The solution was concentrated to give a residue which was washed with saturated NaHCO 3 and water to give the title compound (118 g, 70% yield) as a white solid.

단계 4: t-부틸(Step 4: t-Butyl ( 시스Cis -3--3- 하이드록시사이클로부틸Hydroxycyclobutyl )카바메이트의 제조) Preparation of carbamate

Figure pct00048
Figure pct00048

-72℃에서 THF(2000 mL) 중 t-부틸(3-옥소사이클로부틸)카바메이트(100 g, 54 mmol)의 용액에 THF 중 리튬 트라이 s-부틸하이드리도보레이트(648 mL, 1 M)의 용액을 1.5 시간에 걸쳐서 적가하였다. 생성된 용액을 실온으로 가온하고, 추가 1 시간 동안 교반하였다. TLC(석유 에터:EtOAc = 2:1)는 출발 물질이 완전히 소비되었음을 나타낸다. 반응 생성물을 수성 NH4Cl로 급랭하였다. 물(1000 mL) 및 EtOAc(2000 mL)를 혼합물에 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, MgSO4로 건조하고, 농축하여 조질 물질을 수득하고, 이를 석유 에터:EtOAc(10:1 내지 1:2)로 용리하는 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 백색 고체로서 표제 화합물(62 g, 61% 수율)을 수득하였다.To a solution of t-butyl (3-oxocyclobutyl) carbamate (100 g, 54 mmol) in THF (2000 mL) at -72 ° C was added a solution of lithium tri- s- butyl hydridoborate (648 mL, 1 M) in THF The solution was added dropwise over 1.5 hours. The resulting solution was allowed to warm to room temperature and stirred for an additional hour. TLC (petroleum ether: EtOAc = 2: 1) indicates complete consumption of the starting material. The reaction product was quenched with aqueous NH 4 Cl. Water (1000 mL) and EtOAc (2000 mL) were added to the mixture. The organic layer was separated, dried over MgSO 4, and concentrated to give the crude material, this petroleum ether: EtOAc (10: 1 to 1: 2) to give the title compound (62 as a white solid purified by column chromatography eluting with a g, 61% yield).

단계 5: t-부틸 {Step 5: t-Butyl { 시스Cis -3-[1--3- [1- 메틸methyl -1-(-One-( 트라이메틸실릴Trimethylsilyl )) 에톡시Ethoxy ]] 사이클로부틸Cyclobutyl }} 카바메이트의Carbamate 제조 Produce

Figure pct00049
Figure pct00049

피리딘(1 L) 중 t-부틸(시스-3-하이드록시사이클로부틸)카바메이트(62 g, 0.33 mol)의 용액에 TBSCl(159 g, 1.056 mol)을 첨가하였다. 첨가 후, 혼합물을 상온에서 밤새 교반하였다. TLC(석유 에터:EtOAc = 2:1)는 출발 물질이 완전히 소비되었음을 나타낸다. 이어서, 반응 생성물을 농축하고 EtOAc(1 L)로 희석하고, 유기 층을 분리하고, 물(3 x 300 mL) 및 염수(200 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고 농축하여 조질 표제 화합물(108 g)을 수득하고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에서 직접 사용하였다.To a solution of t-butyl (cis-3-hydroxycyclobutyl) carbamate (62 g, 0.33 mol) in pyridine (1 L) was added TBSCl (159 g, 1.056 mol). After the addition, the mixture was stirred at room temperature overnight. TLC (petroleum ether: EtOAc = 2: 1) indicates complete consumption of the starting material. The reaction product was then concentrated and diluted with EtOAc (1 L), the organic layer was separated, washed with water (3 x 300 mL) and brine (200 mL), dried over MgSO 4 , The title compound (108 g) was obtained which was used directly in the next step without further purification.

단계 6: t-부틸 메틸{Step 6: t-Butylmethyl { 시스Cis -3-[1--3- [1- 메틸methyl -1-(-One-( 트라이메틸실릴Trimethylsilyl )) 에톡시Ethoxy ]] 사이클로부Cyclobutane 틸}Yl} 카바메이트의Carbamate 제조 Produce

Figure pct00050
Figure pct00050

THF(1 L) 중 조질 t-부틸 {시스-3-[1-메틸-1-(트라이메틸실릴)에톡시]사이클로부틸}카바메이트(108 g)의 용액에 NaH(오일 중 60%, 39.6 g, 0.99 mol)를 나눠서 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 30 분 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 0℃로 냉각하고, 요오도메탄(140.58 g, 0.99 mol)을 적가하였다. 적가 후, 혼합물을 0℃ 내지 실온으로 밤새 교반하였다. 혼합물을 포화 NH4Cl로 급랭하고, 물(200 mL)을 첨가하고, EtOAc로 추출하였다. 유기 층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조한 후, 증발시켜 조질 생성물을 수득하고, 이를 실리카 겔 크로마토그래피를 통해 정제하여 오일로서 표제 화합물(68.9 g, 87% 수율)을 수득하였다.To a solution of crude t-butyl {cis-3- [l-methyl-1- (trimethylsilyl) ethoxy] cyclobutyl} carbamate (108 g) in THF (1 L) was added NaH g, 0.99 mol) was added in portions, and the resulting mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. The mixture was then cooled to 0 C and iodomethane (140.58 g, 0.99 mol) was added dropwise. After the dropwise addition, the mixture was stirred overnight at 0 [deg.] C to room temperature. The mixture was quenched with saturated NH 4 Cl, water (200 mL) was added and extracted with EtOAc. The organic layer was washed with brine, dried over Na 2 SO 4 and evaporated to give the crude product which was purified via silica gel chromatography to give the title compound (68.9 g, 87% yield) as an oil.

단계 7: t-부틸(Step 7: t-Butyl ( 시스Cis -3--3- 하이드록시사이클로부틸Hydroxycyclobutyl )메틸카바메이트의 제조) Preparation of methyl carbamate

Figure pct00051
Figure pct00051

피리딘(800 mL) 중 t-부틸 메틸{시스-3-[1-메틸-1-(트라이메틸실릴)에톡시]사이클로부틸}카바메이트(68.9 g, 0.217 mol)의 용액에 TBAF(62 g, 0.24 mol)를 나눠서 첨가하였다. 첨가 후, 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 증발시켜 건조하고, 잔사를 에틸 아세테이트(1000 mL)에 용해하고, 농축 NH4Cl(3 x 200 mL)로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 농축하여 조질 생성물을 수득하고, 이를 EtOAc/석유 에터(1/20 내지 1/5)를 사용하는 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 백색 고체로서 표제 화합물(26.3 g, 60% 수율)을 수득하였다.To a solution of t-butyl methyl {cis-3- [l-methyl-1- (trimethylsilyl) ethoxy] cyclobutyl} carbamate (68.9 g, 0.217 mol) in pyridine (800 mL) 0.24 mol) was added in portions. After the addition, the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. The mixture was evaporated to dryness, and the residue was dissolved in ethyl acetate (1000 mL) and washed with concentrated NH 4 Cl (3 x 200 mL). The organic layer was dried with Na 2 SO 4, filtered and concentrated to give the crude product, which was purified by column chromatography using EtOAc / petroleum ether (1/20 to 1/5) to yield the title compound as a white solid ( 26.3 g, 60% yield).

단계 8: Step 8: 시스Cis -3-[(t--3 - [(t- 부톡시카본일Butoxycarbonyl )() ( 메틸methyl )아미노]) Amino] 사이클로부틸Cyclobutyl 메탄설포네이트의Methanesulfonate 제조 Produce

Figure pct00052
Figure pct00052

트라이에틸아민(4.14 mL, 29.79 mmol)을 CH2Cl2(30 mL) 중 t-부틸(시스-3-하이드록시사이클로부틸)메틸카바메이트(2.0 g, 9.93 mmol)의 용액 내에 첨가하고, 생성된 혼합물을 격렬하게 교반하면서 -30℃로 냉각하였다. 메실 클로라이드(1.36 g, 11.91 mmol)를 10 분간에 걸쳐서 적가하였다. 이어서, 혼합물을 실온으로 가온하고, TLC 분석(MeOH/CH2Cl2 = 1/15)이 반응의 완료를 나타낼 때까지 1 시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 물(2 x 10 mL), 수성 NH4Cl(10 mL) 및 염수(10 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조하고, 농축하여 황색 고체로서 표제 화합물(2.5 g, 91% 수율)을 수득하고, 이를 다음 단계를 위해 직접 사용하였다.Triethylamine (4.14 mL, 29.79 mmol) was added to a solution of t-butyl (cis-3-hydroxycyclobutyl) methylcarbamate (2.0 g, 9.93 mmol) in CH 2 Cl 2 (30 mL) The resulting mixture was cooled to -30 &lt; 0 &gt; C with vigorous stirring. Mesyl chloride (1.36 g, 11.91 mmol) was added dropwise over 10 min. The mixture was then allowed to warm to room temperature and stirred for 1 h until TLC analysis (MeOH / CH 2 Cl 2 = 1/15) indicated completion of the reaction. The reaction mixture was then washed with water (2 x 10 mL), aqueous NH 4 Cl (10 mL) and brine (10 mL), dried over anhydrous Na 2 SO 4 and concentrated to afford the title compound as a yellow solid , 91% yield) which was used directly for the next step.

단계 9: t-부틸(트랜스-3-Step 9: t-Butyl (trans-3- 아지도사이클로부틸Acylcyclobutyl )메틸카바메이트의 제조) Preparation of methyl carbamate

Figure pct00053
Figure pct00053

시스-3-[(t-부톡시카본일)(메틸)아미노]사이클로부틸 메탄설포네이트(2.5 g, 8.94 mmol)를 DMF(25 mL)에 용해하고, NaN3(2.84 g, 43.69 mmol)을 첨가하였다. 이어서, 생성된 혼합물을 70℃로 가열하고 밤새 교반하였다. 냉각 후, 물(150 mL)을 첨가하고, 혼합물을 EtOAc(3 x 50 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 물(3 x 20 mL) 및 염수(20 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조한 후 진공에서 농축하여 황색 액체로서 표제 화합물(1.8 g, 89% 수율)을 수득하고, 이를 추가 정제 없이 사용하였다.(2.5 g, 8.94 mmol) was dissolved in DMF (25 mL), and NaN 3 (2.84 g, 43.69 mmol) was added to a solution of cis-3 - [(t-butoxycarbonyl) (methyl) amino] cyclobutylmethanesulfonate . The resulting mixture was then heated to 70 &lt; 0 &gt; C and stirred overnight. After cooling, water (150 mL) was added and the mixture was extracted with EtOAc (3 x 50 mL). Wash the combined organic phases with water (3 x 20 mL) and brine (20 mL) and concentrated in vacuo after drying over anhydrous Na 2 SO 4 to give the title compound (1.8 g, 89% yield) as a yellow liquid, This was used without further purification.

단계 10: t-부틸(트랜스-3-Step 10: t-Butyl (trans-3- 아미노사이클로부틸Aminocyclobutyl )메틸카바메이트의 제조) Preparation of methyl carbamate

Figure pct00054
Figure pct00054

수소 대기(수소 풍선)하에 MeOH(5 mL) 중 t-부틸(트랜스-3-아지도사이클로부틸)메틸카바메이트(1.8 g, 7.95 mmol) 및 Pd/C(200 mg)의 혼합물에 NH3(g)/MeOH(포화됨, 50 mL)를 주사기를 통해 첨가하였다. 생성된 혼합물을, TLC 분석(EtOAc:석유 에터 = 1:2)이 반응이 완료되었음을 나타낼 때까지 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. Pd/C를 여과 제거하고, 생성된 용액을 농축하고 진공에서 건조하여 조질 표제 화합물(1.6 g)을 수득하고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계를 위해 사용하였다.To a mixture of t- butyl hydrogen atmosphere from under (hydrogen balloon), MeOH (5 mL) (trans-3-O map cyclobutyl) methyl-carbamate (1.8 g, 7.95 mmol) and Pd / C (200 mg), NH 3 ( g) / MeOH (sat., 50 mL) was added via syringe. The resulting mixture was stirred at room temperature for 3 hours until TLC analysis (EtOAc: petroleum ether = 1: 2) indicated that the reaction was complete. The Pd / C was filtered off and the resulting solution was concentrated and dried in vacuo to give the crude title compound (1.6 g) which was used for the next step without further purification.

Figure pct00055
Figure pct00055

Figure pct00056
Figure pct00056

Figure pct00057
Figure pct00057

생물학적 Biological 실시예Example

실시예Example 5:  5: pEGFRpEGFR Y1068Y1068 ELISAELISA 분석 analysis

상이한 EGFR 돌연변이 상태를 갖는 세포에서 EGFR T790M 억제제의 효과를 프로파일하기 위해, 야생형 EGFR 및 EGFR 이중 돌연변이체(L858R+T790M, EGFR delE746-A750+T790M)를 갖는 세포에서 Tyr1068에서 EGFR의 인산화의 억제를 측정하였다. Y1068에서 EGFR의 인산화를 패쓰스캔(PathScan: 등록상표) 포스포-EGF 수용체(Try1068) 샌드위치 ELISA 키트[# 7240, 셀 시그날링 테크놀로지(Cell Signaling Technology), 미국 매사추세츠주 덴버 소재]로 측정하였다. 패쓰스캔(등록상표) 포스포-EGF 수용체(Tyr1068) 샌드위치 ELISA 키트는 포스포-EGF 수용체(Tyr1068) 단백질의 내인성 수준을 검출하는 고체 상 샌드위치 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA)이다. 하기 세포주를 이 분석에서 평가하였다: A549(EGFR 야생형, 내인성), NCI-H1975(EGFR L858R+T790M, 내인성), NIH3T3/EGFR_야생형, NIH3T3/EGFR L858R+T790M 및 PC9-DRH(EGFR delE746-A750 +T790M). NIH/3T3 모, A549, 및 NCI-H1975 세포를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection: ATCC, 미국 버지니아주 매너새스 소재)으로부터 구입하였다. 모든 세포를 ATCC 권고에 따라 배양하였다. A549 세포를 10% FBS[시그마(Sigma), 미국 미주리주 세인트루이스 소재], 및 1% 페니실린/스트렙토마이신[인비트로겐(Invitrogen)]이 보충된 RPMI 배지(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)에서 배양하였다. NCI-H1975 세포를 10% FBS(시그마), 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(인비트로겐)이 보충된 RPMI(인비트로겐)에서 배양하였다. NIH/3T3 세포를 10% 갓 태어난 송아지 혈청(인비트로겐)이 보충된 DMEM(인비트로겐)에서 배양하고, NIH3T3/EGFR 돌연변이체 세포를 5 μg/mL 퓨로마이신(인비트로겐)을 갖는 완전 배지에서 배양하였다. PC9-DRH 세포를 실시예 6에 기재된 바와 같이 생성하고 배양하였다. 다양한 EGFR 구축물을 갖는 플라스미드(pLPCX)를 젠스크립트(GenScript, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)를 제조하고, 이러한 구축물을 발현하는 NIH3T3 세포의 안정된 풀을 화이자(Pfizer, 미국 캘리포니아주 라호이아 소재)에서 제조하였다. 세포를 투명한 조직 배양물이 처리된 마이크로역가 플레이트[#3595, 코닝 인코포레이티드(Corning Inc), 미국 뉴욕주 코닝 소재]의 바닥에 완전 배양 배지(50 μL/웰) 중에 플레이팅하고, 밤새 37℃, 5% CO2에서 부착하도록 하였다. 세포를 하기 농도로 시딩하였다: A549: 40,000/웰, NCI-H1975: 40,000/웰, NIH3T3: 20,000/웰, PC9-DRH: 50,000/웰. 다음날, 화합물 희석 플레이트를 96-웰 투명 V-바닥 0.5 mL 폴리프로필렌 차단 플레이트(#3956, 코닝 인코포레이티드) 중에 제조하였다. 모든 세포주를 각각의 화합물에 대하여 평가하지 않았다. 평가된 각각의 화합물을 DMSO 스톡 용액(10 mM)으로 제조하였다. 화합물을 11-점 연속 희석 곡선(1:3 희석)으로 각각의 플레이트에 대하여 2회 시험하였다. 화합물 처리물(50 μL)을 화합물 희석 플레이트로부터 세포 플레이트에 첨가하였다. 가장 높은 화합물 농도는 0.3% 최종 DMSO(#D-5879, 시그마) 농도와 함께 1 또는 10 μM(최종)이었다. 이어서, 플레이트를 2 시간 동안 37℃, 5% CO2에서 항온처리하였다. NIH3T3/야생형 분석을 위해, 세포를 24 시간 동안 혈청 결칩시킨 후 화합물 처리하고, 세포를 기재된 바와 같이 무혈청 배지로 처리한 후 10 분 동안 EGF[100 ng/mL, 칼바이오켐/이엠디 케미칼스(Calbiochem/EMD Chemicals), 미국 뉴저지주 깁스타운 소재]로 자극하였다. A549/야생형 분석을 위해, 세포를 화합물 처리 전에 24 시간 동안 완전 혈청(10%) 배지에 플레이팅하고, 세포를 기재된 바와 같은 완전 혈청으로 처리한 후, 10 분 동안 EGF(40 ng/mL/기아 배지, 인비트로겐)로 자극하였다. 항온처리가 끝나기 직전에, 순수한 물 중 빙냉 용해 완충액[1x 세포 용해 완충액(#9803, 셀 시그날링 테크놀로지), 1 mM 나트륨 오르토바나데이트(Na3VO4, #96508, 시그마), 1 mM 페닐메탄설폰일 플루오라이드(PMSF, 52332, 칼바이오켐/이엠디 케미칼스), 완전 미니 EDTA-무함유 프로테아제 억제제 칵테일 정제(1 정제/10 mL, #11836170001, 로슈(Roche), 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재), 및 PhosSTOP 포스파타아제 억제제 칵테일 정제(1 정제/10 mL, #04906837001, 로슈]를 제조하였다. 2 시간 끝에, 배지를 털어 버리고, 세포를 PBS 중 빙냉 1 mM Na3VO4(100 ㎕/웰, 인비트로겐)로 1회 세척하였다. 이어서, 세척액을 털어 버리고, 빙냉 용해 완충액을 세포에 첨가하였다(50 ㎕/웰). 플레이트를 20 내지 30 분 동안 4℃에서 교반하여 세포를 완전히 용해시켰다. 샘플 희석액(50 ㎕/웰)을 ELISA 플레이트에 첨가하고, 용해물(50 ㎕)을 ELISA 플레이트의 각각의 웰의 샘플 희석액으로 희석하였다. 플레이트를 밀봉하고, 교반하면서 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 다음날, 웰을 1x 세척 완충액으로 4회 세척하고, 최종 세척 후 플레이트를 린트 프리(lint-free) 종이로 테이핑한 후 첨가 검출 항체(녹색, 100 ㎕/웰)를 각각의 웰에 첨가하고, 1 시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 항온처리 후, 웰을 기재된 바와 같이 세척하였다. HRP-연결된 2차 항체(적색, 100 ㎕/웰)를 각각의 웰에 첨가하고, 30 분 동안 37℃에서 항온처리하였다. 항온처리 후, 웰을 기재된 바와 같이 세척하였다. TMB 기질(100 ㎕/웰)을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 10 분 동안 37℃에서 또는 30 분 동안 최대 실온에서 항온처리하였다. 정지액(100 ㎕/웰)을 항온처리의 끝에 각각의 웰이 첨가하고, 플레이트를 몇 초 동안 부드럽게 교반하였다. 정지액을 첨가한 후 30 분 이내에 450 nm에서 흡광도용 퍼킨엘머 엔비젼 엑사이트 멀티라벨(PerkinElmer EnVision Excite Multilabel) 판독기 또는 흡광도용 몰레큘라 디바이스 스펙트라맥스(molcular Devices SpectraMax384) 판독기로 흡광도를 판독하였다. 마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel)의 4-매개변수 맞춤을 사용하여 데이터를 분석하였다. The inhibition of phosphorylation of EGFR in Tyr1068 was measured in cells with wild type EGFR and EGFR double mutants (L858R + T790M, EGFR delE746-A750 + T790M) to profile the effect of EGFR T790M inhibitor in cells with different EGFR mutation status Respectively. Phosphorylation of EGFR at Y1068 was measured with a PathScan® phospho-EGF receptor (Try 1068) sandwich ELISA kit (# 7240, Cell Signaling Technology, Denver, Mass.). The Pathscan (R) phospho-EGF receptor (Tyr1068) sandwich ELISA kit is a solid phase sandwich enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA) that detects the endogenous levels of the phospho-EGF receptor (Tyr1068) protein. The following cell lines were evaluated in this assay: A549 (EGFR wild type, endogenous), NCI-H1975 (EGFR L858R + T790M, endogenous), NIH3T3 / EGFR_ wild type, NIH3T3 / EGFR L858R + T790M and PC9- + T790M). NIH / 3T3 model, A549, and NCI-H1975 cells were purchased from the American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Va.). All cells were cultured according to ATCC recommendations. A549 cells were cultured in RPMI medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) supplemented with 10% FBS (Sigma, St. Louis, Mo.) and 1% penicillin / streptomycin [Invitrogen] Lt; / RTI &gt; NCI-H1975 cells were cultured in RPMI (Invitrogen) supplemented with 10% FBS (Sigma), and 1% penicillin / streptomycin (Invitrogen). NIH / 3T3 cells were cultured in DMEM (Invitrogen) supplemented with 10% newborn calf serum (Invitrogen) and NIH3T3 / EGFR mutant cells were cultured in complete medium with 5 μg / mL puromycin (Invitrogen) Respectively. PC9-DRH cells were generated and cultured as described in Example 6. A plasmid (pLPCX) with various EGFR constructs was prepared with GenScript (GenScript, Piscataway, NJ) and the stable pool of NIH3T3 cells expressing the construct was digested with Pfizer (Raho, Lt; / RTI &gt; Cells were plated in complete culture medium (50 [mu] L / well) at the bottom of clear tissue culture treated microtiter plate [# 3595, Corning Inc, Corning, NY, USA] And allowed to adhere at 37 ° C and 5% CO 2 . Cells were seeded at the following concentrations: A549: 40,000 / well, NCI-H1975: 40,000 / well, NIH3T3: 20,000 / well, PC9-DRH: 50,000 / well. The following day, compound dilution plates were prepared in 96-well clear V-bottom 0.5 mL polypropylene barrier plates (# 3956, Corning Incorporated). All cell lines were not evaluated for each compound. Each compound evaluated was prepared as a DMSO stock solution (10 mM). Compounds were tested twice for each plate with a 11-point serial dilution curve (1: 3 dilution). Compound treatment (50 [mu] L) was added to the cell plate from the compound dilution plate. The highest compound concentration was 1 or 10 μM (final) with 0.3% final DMSO (# D-5879, Sigma) concentration. It was then incubated at 37 ℃ the plates for 2 hours, 5% CO 2. For NIH3T3 / wild-type analysis, the cells were serum-chipped for 24 hours, treated with compounds, treated with serum-free medium as described and incubated with EGF [100 ng / mL, Calbiochem / (Calbiochem / EMD Chemicals, Gipston, NJ). For A549 / wild-type analysis, the cells were plated in complete serum (10%) medium for 24 hours before compound treatment and the cells were treated with complete serum as described and incubated with EGF (40 ng / Medium, Invitrogen). Immediately before the end of the incubation, the cells were lysed in ice-cold lysis buffer (1x cell lysis buffer (# 9803, Cell Signaling Technologies), 1 mM sodium orthovanadate (Na 3 VO 4 , # 96508, Sigma), 1 mM phenylmethane (1 tablet / 10 mL, # 11836170001, Roche, Indianapolis, IN) was added to the solution, ) And PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail tablets (1 tablet / 10 mL, # 04906837001, Roche) were prepared. After 2 hours, the medium was shaken and the cells were lysed with ice-cold 1 mM Na 3 VO 4 The plate was then shaken off and the ice-cold lysis buffer was added to the cells (50 [mu] l / well). The plates were stirred for 20-30 minutes at 4 [deg.] C to completely dissolve the cells The sample dilution (50 [mu] l / well) (50 [mu] l) was diluted with a sample dilution of each well of an ELISA plate .. The plate was sealed and incubated overnight at 4 [deg.] C with agitation. The next day, the wells were washed four times with 1x Wash Buffer After washing and final washing, the plates were taped with lint-free paper and an addition detecting antibody (green, 100 쨉 l / well) was added to each well and incubated for 1 hour at 37 ° C. At constant temperature HRP-linked secondary antibody (red, 100 [mu] l / well) was added to each well and incubated for 30 minutes at 37 [deg.] C After incubation, TMB substrate (100 [mu] L / well) was added to each well and the plate was incubated for 10 min at 37 [deg.] C or 30 min at the maximum room temperature. At the end of the treatment, each well was added, Sites and stirred gently for a few seconds, followed by the addition of stop solution Perkin for in the 450 nm absorbance within 30 minutes Elmer Envy immersion exo site Multiprotocol Label (PerkinElmer EnVision Excite Multilabel) reader or a Molecular Devices Spectra Max for absorbance (molcular Devices SpectraMax 384 ) reader. The data was analyzed using a four-parameter fit of Microsoft Excel.

시험된 화합물에 대한 pEGFR Y1068 ELISA 분석의 결과를 하기 표 2에 제시하였다. T790M_L858R에 대하여 표 2에 제시된 pEGFR ELISA IC50 데이터는 달리 나타내지 않는 한 3T3 세포주에 대한 것이다.The results of pEGFR Y1068 ELISA analysis on the compounds tested are presented in Table 2 below. The pEGFR ELISA IC 50 data shown in Table 2 for T790M-L858R is for the 3T3 cell line unless otherwise indicated.

실시예 번호Example No. pEGFRY1068
ELISA3T3T790M_
L858R
IC50(nM)pEGFRY1068
ELISA3T3T790M_
L858R
IC 50 (nM) pEGFRY1068 PC9-DRH IC50(nM)pEGFRY1068 PC9-DRH IC 50 (nM) pEGFRY1068
ELISAA549
IC50(nM)pEGFRY1068
ELISAA549
IC 50 (nM) 1One 77 N/DN / D >4,287> 4,287 대체 1Substitute 1 1515 22 6(H1975)6 (H1975) N/DN / D 16501650 33 2727 1414 42864286 44 1212 66 >10,000> 10,000

실시예Example 6:  6: RPC9RPC9 및  And PC9PC9 -- DRHDRH 세포의 생성 및 특성화 Cell production and characterization

단계 1: Step 1: PC9PC9 세포로부터  From the cell RPC9RPC9 세포의 생성 Cell formation

모 PC9 세포에서, EGFR delE746-A750 돌연변이체 대립유전자를 증폭시켰고, 야생형 EGFR 대립유전자를 검출할 수 없었다. 모 PC9 세포를 RPC9 세포의 생성에 이용하였다. PC9 세포를 10% 열 비활성화된 FBS가 보충된 RPMI 1640 배지 중에서 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. EGFR 억제제 내성 세포주를 생성하기 위해, PC9 세포를 먼저 0.5 nM 다코미티닙으로 처리하였다. 세포가 90%의 점유율까지 자라면, 세포를 분열시키고 약물 농도를 2배까지 증가시켰다. 상기 처리로부터 6 주 후, PC9 세포는 2 nM 다코미티닙에서 자랄 수 있다. 단일 세포 클론을 생성하고 추가 특성화를 위해 10개를 선택하였다. 이러한 내성 세포를 2 μM 에를로티닙을 함유하는 성장 배지에서 유지하고, 내성 PC9에 대하여 RPC9로 명명하였다.In the parent PC9 cells, the EGFR delE746-A750 mutant allele was amplified and the wild-type EGFR allele could not be detected. PC9 cells were used for the production of RPC9 cells. From the RPMI 1640 medium supplemented with the disable PC9 cells were cultured in 10% FBS heat 37 ℃ and 5% CO 2. To generate EGFR inhibitor resistant cell lines, PC9 cells were first treated with 0.5 nM dacomitinib. If the cells grew to a 90% share, the cells were disrupted and the drug concentration doubled. After 6 weeks from the treatment, PC9 cells may grow in 2 nM DakoMitinib. Single cell clones were generated and 10 were selected for further characterization. These resistant cells were maintained in growth medium containing 2 μM rotinib and termed RPC9 for resistant PC9.

단계 2: 캐스트Step 2: Cast PCRPCR (( CastPCRCastPCR ) 분석) analysis

게놈 DNA를, 제조자의 권고에 따라 퀴아겐(Qiagen) DNA 미니 키트를 사용하여 RPC9 세포의 클론으로부터 추출하고, 제조자(ABI)의 프로토콜에 따라 캐스트PCR(프라이머 세트: Hs00000106_wt 및 Hs00000105)에 이용하였다. ABI 돌연변이 검출기 소프트웨어를 통해 데이터를 분석하였다.Genomic DNA was extracted from a clone of RPC9 cells using a Qiagen DNA minikit according to the manufacturer's recommendations and used in cast PCR (primer sets: Hs00000106_wt and Hs00000105) according to the manufacturer's (ABI) protocol. Data were analyzed using ABI mutation detector software.

단계 3: 세포 생존력 Step 3: Cell viability ICIC 5050 측정 Measure

웰당 3000개의 RPC9 세포를 96-웰 플레이트[코닝(Corning)]의 성장 배지(90 ㎕)에 중복 웰로 시딩하였다. 24 시간 후, 세포를 성장 배지(10 ㎕)의 3배 희석의 11 점 역가로 다코미티닙 또는 에를로티닙으로 처리하였다. 가장 높은 최종 농도는 10 μM이었다. 72 시간 처리한 후, 세포를 제조자의 설명서에 따라 CTG 분석[프로메가(Promega)]을 통해 분석하였다.3000 RPC9 cells per well were seeded into duplicate wells in 96-well plates (Corning) growth medium (90 [mu] l). After 24 hours, the cells were treated with 3-fold dilution of the 11-point reverse transcomponent or erlotinib of the growth medium (10 [mu] l). The highest final concentration was 10 μM. After 72 hours of treatment, cells were analyzed by CTG analysis (Promega) according to the manufacturer's instructions.

단계 4: Step 4: EGFREGFR T790MT790M 돌연변이를 갖는  Mutated RPC9RPC9 세포의 특성화 Characterization of cells

단계 1에서 생성된 10 클론에서, 생거 서열결정은 임상적으로 관련된 T790M 돌연변이에 상응하는 EGFR 엑손 20의 C>T 돌연변이를 동정하였다. 각각의 RPC9 클론 3 및 클론 6의 서열을 도 1에 제시하였다. 캐스트PCR을 통한 추가 확인은 EGFR T790M 돌연변이를 갖는 EGFR 대립 유전자가 RPC9 클론 3 및 6에 각각 10.2% 및 11.9% 존재함을 나타낸다(도 1). PC9 세포는 다코미티닙에 매우 민감하다(도 2A). 다코미티닙의 가장 낮은 농도(0.17 nM)에서 조차도 PC9 세포 생존력을 96% 억제하였다(도 2A). IC50은 용량 반응 곡선에 따라 계산될 수 없다. RPC9 클론 3 및 6은 73 nM 및 64 nM의 IC50에 더욱 내성이다(도 2A). RPC9 클론 3 및 6을 에를로티닙으로 처리한 경우, RPC9 클론 3 및 6은 세포 생존력 분석시 PC9 세포와 비교하여 IC50에서 200배 이상 증가함을 보여준다(도 2B). In the 10 clones generated in step 1, the senger sequence determination identified the C > T mutation of EGFR exon 20, which corresponds to a clinically relevant T790M mutation. The sequence of each RPC9 clone 3 and clone 6 is shown in Fig. Additional confirmation via cast PCR shows that the EGFR allele with the EGFR T790M mutation is present in RPC9 clones 3 and 6 at 10.2% and 11.9%, respectively (FIG. 1). PC9 cells are highly sensitive to Dakomutinib (Figure 2A). Even at the lowest concentration (0.17 nM) of Dakomutinib, PC9 cell viability was inhibited 96% (Fig. 2A). The IC 50 can not be calculated according to the dose response curve. RPC9 clones 3 and 6 are more resistant to an IC 50 of 73 nM and 64 nM (Fig. 2A). When RPC9 clones 3 and 6 were treated with erlotinib, RPC9 clones 3 and 6 increased more than 200-fold in IC 50 compared to PC9 cells in cell viability assays (FIG. 2B).

따라서, EGFR T790M 돌연변이를 갖고 EGFR 억제제, 예컨대 다코미티닙 및 에를로티닙에 내성인 RPC9 세포를 생성하였다. RPC9 세포는 단일 돌연변이체(EGFR delE746-A750) 및 이중 돌연변이체(EGFR delE746-A750 및 T790M) EGFR 대립유전자 둘다의 혼합물을 함유하므로, EGFR T790M 대립유전자는 RPC9 세포의 전체 EGFR 대립유전자 중 약 10%를 구성한다. Thus, RPC9 cells with EGFR T790M mutations and EGFR inhibitors such as dacomitinib and erlotinib resistant were generated. Since RPC9 cells contain a mixture of both the single mutant (EGFR delE746-A750) and the double mutants (EGFR delE746-A750 and T790M) EGFR allele, the EGFR T790M allele contains about 10% of the entire EGFR allele of RPC9 cells .

단계 5: Step 5: PC9PC9 -- DRHDRH 세포의 생성 및 특성화 Cell production and characterization

RPC9 세포 이외에, PC9-DRH 세포(DRH = 다코미티닙 내성 고 T790M)를 또한 생성하였다. 2 nM 다코미티닙에 내성인 RPC9 세포 풀을 단계 1에 기재된 바와 같이 8 주에 2 nM 내지 2 μM의 다코미티닙의 농도를 증가시켜 추가로 도전하였다. PC9-DRH 세포를 단계 1에 기재된 바와 같이 2 μM 다코미티닙을 함유하는 성장 배지에서 유지하였다. PC9-DRH 세포를 단계 2, 3 및 4에 기재된 바와 같이 분석하였다. PC9-DRH 세포는 이중 돌연변이체 EGFR delE746-A750 및 T790M과 같이 이의 EGFR 대립유전자의 70%를 함유한다. RPC9 세포와 유사하게, PC9-DRH 세포는 다코미티닙(IC50 = 1,651 nM), 에를로티닙(IC50 >10,000 nM), 및 게피티닙(IC50 >10,000 nM)에 내성이다. pEGFR Y1068 ELISA 분석에서 실시예 5에 기재된 바와 같이 사용된 경우, 2 μM 다코미티닙을 성장 배지로부터 제거하고, 세포를 36 시간 동안 자라도록 한 후 ELISA 분석에 사용하였다.In addition to RPC9 cells, PC9-DRH cells (DRH = dacomitinib resistant high T790M) were also generated. 2 nM Dakomutinib resistant RPC9 cell pool was further challenged by increasing the concentration of dacomitinib in the range of 2 nM to 2 [mu] M at 8 weeks as described in step 1. [ PC9-DRH cells were maintained in growth medium containing 2 [mu] M dacomitinib as described in step 1. [ PC9-DRH cells were analyzed as described in steps 2, 3 and 4. PC9-DRH cells contain 70% of their EGFR allele, such as the dual mutants EGFR delE746-A750 and T790M. Similar to RPC9 cells, PC9-DRH cells are resistant to Dakomutinip (IC 50 = 1,651 nM), erlotinib (IC 50 > 10,000 nM), and gepitriptib (IC 50 > 10,000 nM). When used as described in Example 5 in the pEGFR Y1068 ELISA assay, 2 [mu] M dacomitinib was removed from the growth medium and the cells were allowed to grow for 36 hours before being used for ELISA analysis.

실시예Example 7:  7: EGFREGFR T790MT790M 억제제를 단독으로, 또는  The inhibitor may be used alone, or 다코미티닙Dakomitinib 또는  or 에를로티닙Erlotinib 과 함께 이용하는 Used with RPC9RPC9 세포 생존력  Cell viability

실시예 6에 기재된 바와 같이 웰당 3000개의 RPC9 세포를 96-웰 플레이트(코닝)의 웰 중 성장 배지(90 ㎕)에 중복하여 시딩하였다. 24 시간 후, 세포를 성장 배지(10 ㎕) 중 4 nM 다코미티닙 또는 300 nM 에를로티닙을 함유하거나 함유하지 않는 3배 희석의 11 점 역가로 EGFR T790M 억제제, 화합물 A, 화합물 B, 화합물 C 또는 화합물 D 중 하나로 처리하였다. 화합물 A, 화합물 B, 화합물 C 또는 화합물 D의 가장 높은 최종 농도는 10 μM이었다. 72 시간 처리 후, 세포를 제조자의 설명서에 따라 CTG 분석(프로메가)을 통해 분석하였다.3000 RPC9 cells per well were seeded in duplicate in a 96-well plate (Corning) well growth medium (90 [mu] l) as described in Example 6. [ After 24 hours, the cells were incubated with 4 nM dacomitinib or 300 nM EGFR T790M inhibitor, Compound A, Compound B, and Compound C (with 3-fold dilution, with or without rotinib) in growth medium 0.0 &gt; D &lt; / RTI &gt; The highest final concentration of Compound A, Compound B, Compound C or Compound D was 10 [mu] M. After 72 hours of treatment, the cells were analyzed by CTG analysis (Promega) according to the manufacturer &apos; s instructions.

정지 상태에서 표준 임상적 투여 양생법으로부터 다코미티닙 및 에를로티닙 자유 혈장 농도는 각각 4 nM 및 300 nM이었다. 이러한 농도에서, 다코미티닙 및 에를로티닙은 모 PC9 세포 생존력을 완전히 억제하였다(도 2A 및 2B). 동일한 농도에서 어떤 약물도 RPC9 세포 생존력을 유의하게 억제하지 않았다(도 2A 및 2B). From the standard clinical dosing regimen at rest, the concentrations of doxymaticip and erlotinib free plasma were 4 nM and 300 nM, respectively. At this concentration, Dakomitinib and erlotinib completely inhibited parent PC9 cell viability (Figures 2A and 2B). No drug at the same concentration significantly inhibited RPC9 cell viability (FIGS. 2A and 2B).

RPC9 클론 6 세포에서 생존력의 억제는 화합물 A, 및 다코미티닙 또는 에를로티닙의 조합에 의해 강화되었다(도 3A 및 3B). 화합물 A의 생존력 IC50은 4 nM 다코미티닙과 조합된 경우 17 nM이었고, 300 nM 에를로티닙과 조합된 경우 15 nM이었다(표 3). 조합된 화합물 A에 대한 생존력 IC50은 화합물 A를 단독으로 처리한 것과 비교하여 11배 이상 감소하였다. 유사하게, RPC9 클론 6 세포를 화합물 B로 처리한 경우, 다코미티닙 및 에를로티닙은 또한 화합물 B에 대한 ROC9 클론을 민감하게 하였다(도 4A 및 4B). 화합물 B의 IC50은 다코미티닙과 조합하여 4 nM이고, 에를로티닙과 조합하여 5 nM이었다(표 3). 생존력 IC50은 화합물 B를 단독으로 처리한 것과 비교하여 9.5배 및 7.6배까지 감소하였다. 중요하게, 화합물 A에 대한 계획된 인간 노출은 세포 생존력이 약 40% 억제된 화합물 A 단독 농도에서 190 nM이다. 다코미티닙 또는 에를로티닙과 조합된 경우, 동일한 농도의 화합물 A는 최대 억제(83%)를 달성하였다(도 3A 및 3B). 화합물 B와 유사하게, 계획된 인간 노출은 64% 억제된 화합물 B 단독 농도에서 90 nM이다. 또한, 조합은 84%까지 억제를 강화하였다(도 4A 및 4B). 따라서, 다코미티닙 또는 에를로티닙과 조합하여 화합물 A 및 화합물 B의 생존력 효과를 강화한다. 화합물 A 및 화합물 B 이외에, 화합물 C 및 화합물 D는 다코미티닙 및 에를로티닙의 임상적으로 관련된 농도로 상승한다(표 3). Inhibition of viability in RPC9 clone 6 cells was enhanced by the combination of compound A, and DakoMitinib or erlotinib (Figs. 3A and 3B). The viability IC 50 of Compound A was 17 nM when combined with 4 nM dacomitinib and 15 nM when combined with 300 nM and rotinib (Table 3). The viability IC 50 for the combined compound A was reduced by 11 times or more as compared with that of the compound A alone. Similarly, when RPC9 clone 6 cells were treated with compound B, both multicomib and erlotinib sensitized ROC9 clones to compound B (FIGS. 4A and 4B). The IC 50 of Compound B was 4 nM in combination with Dakomutinib and 5 nM in combination with erlotinib (Table 3). Survival IC 50 was reduced to 9.5-fold and 7.6-fold as compared to a single treatment with the compound B. Significantly, the planned human exposure to Compound A is 190 nM at a single concentration of Compound A with about 40% inhibition of cell viability. When combined with Dakomutinib or erlotinib, the same concentration of Compound A achieved maximal inhibition (83%) (FIGS. 3A and 3B). Similar to Compound B, the planned human exposure is 90 nM at a concentration of Compound B alone inhibited by 64%. In addition, the combination enhanced the inhibition to 84% (Figs. 4A and 4B). Thus, the viability effects of Compound A and Compound B are enhanced in combination with Dakomitimin or Errotinib. In addition to Compound A and Compound B, Compound C and Compound D are elevated to the clinically relevant concentrations of dacomitinib and erlotinib (Table 3).

RPC9 클론 6에서 EGFR T790M 억제제 단독, 또는 다코미티닙 또는 에를로티닙과의 조합의 생존력 IC50 In RPC9 clone 6, the viability IC 50 of the EGFR T790M inhibitor alone, or combination with Dakomutinib or erlotinib IC50(nM)IC 50 (nM) 화합물compound 단일 제제Single agent 다코미티닙과 조합Combination with Dakomiti Nip 에를로티닙과 조합Combined with erlotinib 다코미티닙Dakomitinib 6767 에를로티닙Erlotinib 64336433 화합물 A Compound A 199199 1717 1515 화합물 B Compound B 3838 44 55 화합물 C Compound C 234234 1919 1616 화합물 D Compound D 441441 3030 2121

결론적으로, 임상적으로 관련된 농도에서 사용된 EGFR의 단일 돌연변이체를 특이적으로 표적하는 화합물, 예컨대 다코미티닙 및 에를로티닙은, EGFR의 이중 돌연변이체 및 단일 돌연변이체 형태를 둘다 갖는 임상적으로 관련된 모델에서 EGFR의 이중 돌연변이체 형태를 우선적으로 억제하는 화합물, 예컨대 화합물 A, 화합물 B, 화합물 C 및 화합물 D를 강화하였다.In conclusion, compounds that specifically target a single mutant of EGFR used at clinically relevant concentrations, such as Dakomitinib and erlotinib, have been shown clinically as having both a double mutant form of EGFR and a single mutant form Compounds that preferentially inhibit the dual mutant form of EGFR, such as Compound A, Compound B, Compound C and Compound D, have been enhanced in a related model.

실시예Example 8:  8: EGFREGFR T790MT790M 억제제를 단독으로, 또는  The inhibitor may be used alone, or 다코미티닙Dakomitinib , , 게피티닙Gefitinib 또는 아파티닙과 함께 사용하는  Or for use with a RPC9RPC9 클론 6 세포 생존력  Clone 6 cell viability

실시예 7의 방법을 사용하여, 세포를 4 nM 다코미티닙, 20 nM 게피티닙 또는 20 nM 아파티닙을 사용하거나 사용하지 않고, EGFR T790M 억제제, 화합물 A 또는 화합물 B 중 하나로 처리하였다. Using the method of Example 7, the cells were treated with either the EGFR T790M inhibitor, Compound A or Compound B, with or without 4 nM DakoMitinib, 20 nM GepittiNib, or 20 nM Afaritinib.

정상 상태에서 표준 임상적 투여 양생법으로부터 다코미티닙의 자유 혈장 농도는 4 nM이다. 정상 상태에서 표준 임상적 투여 양생법으로부터 게피티닙 및 아파티닙의 자유 혈장 농도는 20 nM이다. The free plasma concentration of Dakomutinip from standard clinical dosing regimen at steady state is 4 nM. The free plasma concentration of gefitinib and apatinate is 20 nM from the standard clinical dosing regimen at steady state.

RPC9 클론 6 세포에서 생존력의 억제는 화합물 A를 다코미티닙, 게피티닙 또는 아파티닙과 조합하여 강화하였다(도 5A, 5B 및 5C). 유사하게, RPC9 클론 6 세포를 화합물 B로 처리한 경우, 다코미티닙, 게피티닙 또는 아파티닙은 또한 화합물 B에 대한 RPC9 클론 6을 민감하게 만든다(도 6A, 6B 및 6C). 따라서, 화합물 A 및 화합물 B는 각각 다코미티닙, 게피티닙 및 아파티닙의 임상적으로 관련된 농도까지 상승한다(도 5 및 6). 실시예 7에서의 설명과 유사하게, 화합물 A의 생존력 IC50은 게피티닙 및 아파티닙과 조합된 경우 각각 19배 및 14배 감소하였다. 화합물 B의 IC50은 게피티닙 및 아파티닙과 조합된 경우 각각 10배 및 8배 감소하였다.Inhibition of viability in RPC9 clone 6 cells enhanced compound A in combination with either doxometinib, gepitib, or apatinate (Figs. 5A, 5B and 5C). Similarly, when RPC9 clone 6 cells are treated with compound B, doxamidip, gefitinib or apatipin also sensitizes RPC9 clone 6 to compound B (FIGS. 6A, 6B and 6C). Thus, Compound A and Compound B rise to clinically relevant concentrations of Dakomutinip, Gefitinib and Apatinate, respectively (Figures 5 and 6). Similar to the description in Example 7, the viability IC 50 of Compound A was reduced 19-fold and 14-fold, respectively, when combined with gefitinib and apatinate. The IC 50 of Compound B was reduced 10-fold and 8-fold, respectively, when combined with gefitinib and apatinate.

결론적으로, 임상적으로 관련된 농도에서 사용된, EGFR의 단일 돌연변이체 형태를 특이적으로 표적하는 화합물, 예컨대 다코미티닙, 게피티닙 또는 아파티닙은 EGFR의 이중 돌연변이체 및 단일 돌연변이체 형태를 둘다 갖는 임상적으로 관련된 모델에서 EGFR의 이중 돌연변이체 형태를 우선적으로 억제하는 화합물, 예컨대 화합물 A 및 화합물 B를 강화하였다.In conclusion, compounds that specifically target single mutant forms of EGFR, such as dacomitinib, gefitinib, or apatinate, used at clinically relevant concentrations, are in a dual mutant form and a single mutant form of EGFR Compounds that both preferentially inhibit the dual mutant form of EGFR, such as Compound A and Compound B, in a clinically relevant model with both.

실시예Example 9: 대립유전자 혼합물 모델에서  9: Allele mixture model EGFREGFR T790MT790M 억제제와  Inhibitors and 다코미티닙Dakomitinib 또는  or 에를로티닙의Erlotinib 조합 Combination

방법Way

세포 배양: RPC9 클론 6 세포를 실시예 6에 기재된 바와 같이 제조하고 서브클로닝하였다. 세포를 10% FBS를 갖는 RPMI에서 배양하고, 선택압 하에 유지하였다(2 nM 다코미티닙). 실험을 위해, 선택압을 제거하고, 세포를 10 cm 접시 위에 플레이팅하고 밤새 항온처리하여(37℃, 5% CO2) 처리를 위한 70 내지 80% 점유율을 달성하였다. Cell culture: RPC9 clone 6 cells were prepared and subcloned as described in Example 6. Cells were cultured in RPMI with 10% FBS and maintained under selective pressure (2 nM Dakomitinib). For the experiments, the selective pressure was removed and the cells were plated on a 10 cm dish and incubated overnight (37 ° C, 5% CO 2 ) to achieve a 70-80% share for treatment.

처리: 다코미티닙, 에를로티닙, 화합물 A 및 화합물 B를 100% DMSO에 용해하였다. 다코미티닙(4 nM) 및 에를로티닙(300 nM)을 표준 임상적 투여 양생법으로부터의 자유 혈장 노출에서 사용하였다. 화합물 A 및 화합물 B를 각각 표적 조절 IC50 값 미만에서 출발하고 각각의 화합물에 대한 예상된 임상적 자유 혈장 노출까지의 범위에서 사용하였다. 세포를 다코미티닙 또는 에를로티닙 및/또는 화합물 A 또는 화합물 B의 역가로, 또는 대조군(DMSO)으로 처리하였다. 6 시간 동안 처리를 적용하고, 항온처리 기간의 끝에서, 세포 펠렛을 수집하고 분석을 위한 준비가 될 때까지 냉동시켰다.Treatment: Dacomitinib, erlotinib, Compound A and Compound B were dissolved in 100% DMSO. Dakomutinib (4 nM) and erlotinib (300 nM) were used for free plasma exposure from standard clinical dosing regimens. Compound A and Compound B were each used starting at a value below the target modulation IC 50 value and up to the expected clinical free plasma exposure for each compound. Cells were treated with Dakomutinib or erlotinib and / or the reverse side of Compound A or Compound B, or a control (DMSO). Treatment was applied for 6 hours and at the end of the incubation period, cell pellets were collected and frozen until ready for analysis.

면역블로팅: 세포 펠렛을 1 mM Na3VO4, 1 mM PMSF, 1 mM NaF, 1 mM β-글리세로포스페이트, 프로테아제 억제제 칵테일(로슈(Roche), 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재) 및 포스파타아제 억제제 칵테일(로슈)이 보충된 용해 완충액(150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 50 mM HEPES, 10% 글리세롤, 1 mM EGTA, 1% 트리톤(Triton: 등록상표) X-100, 0.5% NP-40)으로 처리하였다. 세포 용해물의 단백질 농도를 제조자의 설명서에 대하여 BCA 단백질 분석[피어스/써모 피셔 사이언티픽(Pierce/Thermo Fisher Scientific), 미국 일리노이주 락포드 소재]을 사용하여 측정하였다. 단백질(10 μg)을 SDS-PAGE로 분해하고, 니트로셀룰로스 막[바이오-라드 크리테리온(Bio-Rad Criterion: 상표) 시스템, 미국 캘리포니아주 에르쿨레스 소재] 위로 옮겼다. 블롯을 1차 항체로 침지하여 관심 단백질을 검출하였다. EGFR, pEGFR Y1068, AKT, pAKT S473, ERK 및 pERK T202/204 항체를 셀 시그날링 테크놀로지 인코포레이티드(Cell Signaling Technology, Inc., 미국 매사추세츠주 댄버스 소재)로부터 구입하였다. GAPDH 항체는 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology, 미국 캘리포니아주 산타 크루즈 소재)로부터 구입하였다. 2차 항체로 항온처리한 후, 화학발광(피어스/써모 피셔 사이언티픽)으로 막을 시각화하고, 플루오르켐 큐 이미징(FluorChem Q Imaging) 시스템[프로틴심플(ProteinSimple), 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재]으로 밀도측정을 수행하였다.Immunoblotting: Cell pellet was resuspended in 1 mM Na 3 VO 4 , 1 mM PMSF, 1 mM NaF, 1 mM β-glycerophosphate, protease inhibitor cocktail (Roche, Indianapolis, IN) and phosphatase (150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl 2 , 50 mM HEPES, 10% glycerol, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 0.5% NP-40) supplemented with inhibitor cocktail (Roche) ). The protein concentration of the cell lysate was measured using the BCA protein assay (Pierce / Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) for the manufacturer's instructions. Protein (10 μg) was digested by SDS-PAGE and transferred onto a nitrocellulose membrane (Bio-Rad Criterion ™ system, Erkulles, CA, USA). The blot was immersed in primary antibody to detect the protein of interest. EGFR, pEGFR Y1068, AKT, pAKT S473, ERK and pERK T202 / 204 antibodies were purchased from Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, Mass., USA. GAPDH antibodies were purchased from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). After incubation with a secondary antibody, the membrane was visualized by chemiluminescence (Pierce / Thermofix Scientific) and the density was measured with a FluorChem Q Imaging system (ProteinSimple, Santa Clara, CA) Measurements were performed.

결과result

다코미티닙 및 화합물 A 둘다로 처리된 세포는 2가지 가장 낮은 용량(다코미티닙으로 77% 억제, 10 nM 화합물 A로 24% 억제 대 다코미티닙 + 10 nM 화합물 A로 91% 억제; 30 nM 화합물 A로 21% 억제 대 다코미티닙 + 30 nM 화합물 A로 99% 억제)에서 조합 요법 대 단일 제제 요법의 더 큰 효과와 일치하는 pEGFR 신호화 감소를 나타낸다(도 7A, 8A). 이러한 조합은 가장 낮은 용량(다코미티닙으로 34% 억제, 10 nM 화합물 A로 27% 억제 대 다코미티닙 + 10 nM 화합물 A로 100% 억제)에서 pERK 신호화의 첨가제 억제 및 다음의 가장 높은 투여량(다코미티닙으로 34% 억제, 30 nM 화합물 A로 64% 억제 대 다코미티닙 + 30 nM 화합물 A로 99% 억제)에서 부가 효과보다 더 크게 나타났다(도 7A, 8C). 많은 용량의 단일 제제 요법은 pEGFR 및 pERK 신호화의 더 큰 억제를 야기하고; 분석시 관찰된 최대 억제에 의해 가성성 계산을 제한하였다. 반대로, pAKT의 억제는 최저 농도(다코미티닙으로 37% 억제, 10 nM 화합물 A로 22% 억제 대 다코미티닙 + 10 nM 화합물 A로 66% 억제)에서 부가되는 것으로 보이지만, 더 높은 용량에서조차도 60 내지 65% 이하의 억제를 달성한다(도 7A, 8B). Cells treated with both Dakomutinib and Compound A had two lowest doses (77% inhibition with Dakomutinib, 24% inhibition with 10 nM Compound A versus 91% inhibition with Dakomutinib + 10 nM Compound A; 30 nM (Fig. 7A, 8A), which is consistent with the greater effect of combination therapy versus monotherapy regimen, with 21% inhibition with compound A versus 99% inhibition with Dakommitib + 30 nM Compound A. This combination inhibited the addition of pERK signaling at the lowest dose (34% inhibition with Dakomutinip, 27% inhibition versus 10% inhibition with 10 nM Compound A + 10 nM Compound A) and the next highest dose (34% inhibition with Dakomutinib, 64% inhibition with 30 nM Compound A versus 99% inhibition with 30 mM Compound A) (Figs. 7A and 8C). Large doses of single agent regimens cause greater inhibition of pEGFR and pERK signaling; Pseudomorphic calculations were limited by the maximum inhibition observed in the analysis. In contrast, inhibition of pAKT appears to be added at the lowest concentration (37% inhibition with Dakomitinib, 22% inhibition vs. 10 mM compound A versus 66% inhibition with Dakomutinip + 10 nM Compound A), but even at higher doses, 60 To 65% or less (Figs. 7A and 8B).

에를로티닙 및 화합물 A 둘다로 처리된 세포는 pEGFR 신호화에서 화합물 A의 3가지 최저 농도(에를로티닙으로 61% 억제, 10 nM 화합물 A로 41% 억제 대 에를로티닙 + 10 nM 화합물 A로 86% 억제; 30 nM 화합물 A로 27% 억제 대 에를로티닙 + 30 nM 화합물 A로 91% 억제; 100 nM 화합물 A로 16% 억제 대 에를로티닙 + 100 nM 화합물 A로 95% 억제)에서 단일 약제 요법의 첨가제 효과보다 더 큰 감소를 나타낸다(도 7B, 9A). 이러한 처리는 pERK 신호화의 첨가제 억제보다 2가지 최저 용량(에를로티닙으로 31% 억제, 10 nM 화합물 A로 38% 억제 대 에를로티닙 + 10 nM 화합물 A로 100%; 30 nM 화합물 A로 54% 억제 대 에를로티닙 + 30 nM 화합물 A로 100%)에서 더 크게 나타났다(도 7B, 9C). 고용량의 단일 제제 요법은 pEGFR 및 pERK 신호화의 더 큰 억제를 야기하고; 가성성 계산은 분석에서 관찰된 최대 억제에 의해 제한되었다. 반대로, pAKT의 억제는 화합물 A(에를로티닙으로 18% 억제, 10 nM 화합물 A로 3% 억제 대 에를로티닙 + 10 nM 화합물 A로 48%; 도 7B, 9B)의 최저 농도에서의 첨가제 및 2번째 최고 용량(에를로티닙으로 18% 억제, 30 nM 화합물 A로 31% 억제 대 에를로티닙 + 30 nM 화합물로 49%; 도 7B, 9B)에서의 첨가제보다 더 큰 것으로 나타났지만, 심지어 고용량에서 50% 이하의 억제를 달성하였다. Cells treated with both erlotinib and Compound A showed the lowest three concentrations of compound A (61% inhibition with erlotinib, 41% inhibition with 10 nM Compound A vs. erlotinib + 10 nM Compound A in pEGFR signaling 86% inhibition; 27% inhibition with 30 nM Compound A; 91% inhibition with erlotinib + 30 nM Compound A; 95% inhibition with 100 nM Compound A vs. 16% inhibition with erlotinib + 100 nM Compound A) (Fig. 7B, 9A). &Lt; / RTI &gt; This treatment resulted in two lowest doses (31% inhibition with erlotinib, 38% inhibition with 10 nM Compound A plus 100% with 10 nM Compound A, 30 nM Compound A) than additive inhibition of pERK signaling Lt; / RTI &gt;% inhibition of erythropoietin + 100 nM with 30 nM compound A) (Fig. 7B, 9C). High dose single agent regimens cause greater inhibition of pEGFR and pERK signaling; Pseudocity calculations were limited by the maximum inhibition observed in the analysis. Conversely, inhibition of pAKT was observed at the lowest concentration of Compound A (18% inhibition with erlotinib, 48% with 10 nM Compound A to 3% inhibition versus erythropinib + 10 nM Compound A; Figures 7B and 9B) (18% inhibition with erlotinib, 31% inhibition with 30 nM compound A vs. 49% with erlotinib + 30 nM compound; Fig. 7B, 9B), but even with a higher dose Lt; RTI ID = 0.0 &gt; 50% &lt; / RTI &gt;

다코미티닙 및 화합물 B로 처리된 세포는 2개의 최저 용량(다코미티닙으로 54% 억제, 3 nM 화합물 B로 46% 억제 대 다코미티닙 + 3 nM 화합물 B로 81%; 10 nM 화합물 B로 17% 억제 대 다코미티닙 + 10 nM 화합물 B로 90%)에서 단일 제제 요법의 첨가제 효과 및 2번째 최고 용량(다코미티닙으로 54% 억제, 30 nM 화합물 B로 33% 억제 대 다코미티닙 + 30 nM 화합물 B로 90%)에서의 첨가제보다 더 큰 pEGFR 신호화에서 감소를 나타낸다(도 10A, 11A). 이러한 동일한 세포는 최저 용량(다코미티닙으로 57% 억제, 3 nM 화합물 B로 55% 억제 대 다코미티닙 + 3 nM 화합물 B로 100%; 도 10A, 11C)에서 pERK 신호화의 첨가제 억제를 나타낸다. 고용량의 단일 제제 요법은 pEGFR 및 pERK 신호화의 더 큰 억제를 야기하고; 분석시 관찰된 최대 억제에 의해 가성성 계산을 제어하였다. 반대로, pAKT의 억제는 심지어 고용량에서 72% 이하의 억제를 달성하였고, 첨가제 결과보다 일부 또는 더 크게 달성하지 않았다(도 10A, 11B). Cells treated with Dakomitinib and Compound B were treated with two lowest doses (54% inhibition with Dakomutinib, 46% inhibition with 3 nM Compound B vs. Dakomitinib + 3 nM Compound B 81%; 10 nM Compound B 17% inhibition vs. 10% inhibition of the additive effect of the single agent regimen and 10% inhibition of the second highest dose (54% inhibition with DakoMitinib, 33% inhibition vs. 30% inhibition with 30 nM Compound B, DakoMitinib + (90% with 30 nM compound B) (Fig. 10A, 11A). &Lt; tb &gt; &lt; TABLE &gt; These same cells exhibit additive inhibition of pERK signaling at the lowest dose (57% inhibition with DakoMitinib, 55% inhibition versus 100% with 3 nM Compound B + 100 nM with 3 nM Compound B) . High dose single agent regimens cause greater inhibition of pEGFR and pERK signaling; Pseudomorphic calculations were controlled by the maximum inhibition observed during the analysis. In contrast, inhibition of pAKT achieved inhibition of 72% or less even at high doses and did not achieve some or even greater than additive results (FIGS. 10A, 11B).

에를로티닙 및 화합물 B로 처리된 세포는 화합물 B의 모든 농도(에를로티닙으로 12% 억제, 3 nM 화합물 B로 2% 억제 대 에를로티닙 + 3 nM 화합물 B로 74%; 10 nM 화합물 B로 8% 억제 대 에를로티닙 + 10 nM 화합물 B로 66% 억제; 30 nM 화합물 B로 22% 억제 대 에를로티닙 + 30 nM 화합물 B로 82%; 100 nM 화합물 B로 60% 억제 대 에를로티닙 + 100 nM 화합물 B로 84%)에서 단일 제제 요법의 첨가제 효과보다 더 큰 pEGFR 신호화에서 감소를 나타낸다(도 10B, 12A). 이러한 처리는 화합물 B의 최저 투여량(에를로티닙으로 41% 억제, 3 nM 화합물 B로 39% 억제 대 에를로티닙 + 3 nM 화합물 B로 99%)에서 pERK 신호화의 첨가제 억제보다 더 크게 보여졌다(도 10B, 12C). 고용량의 단일 제제 요법은 pEGFR 및 pERK 신호화의 더 큰 억제를 야기하고; 분석에서 관찰된 최대 억제에 의해 가성성 계산을 제한하였다. 반대로, pAKT의 억제는 화합물 B의 최저 농도(에를로티닙으로 29% 억제, 3 nM 화합물 B로 15% 억제 대 에를로티닙 + 3 nM 화합물 B로 54%)에서 첨가제보다 더 큰 것으로 보여졌지만, 심지어 고용량에서 62% 이하의 억제를 달성하였다(도 10B, 12B). Cells treated with erlotinib and compound B were treated with all concentrations of compound B (12% inhibition with erlotinib, 2% inhibition with 3 nM compound B vs. erythrotibium plus 3 nM compound B; 10 nM compound B With 80% inhibition vs. 60% inhibition with 100 nM of compound B, with 80% inhibition with rotinib + 10 nM of compound B; 22% inhibition with 30 nM of compound B vs. 82% (84% with nip + 100 nM compound B) (Fig. 10B, 12A). This treatment appears to be greater than the inhibitor of pERK signaling at the lowest dose of compound B (41% inhibition with erlotinib, 99% with 3 nM compound B vs. 39% inhibition vs. erlotinib + 3 nM compound B) (Figs. 10B and 12C). High dose single agent regimens cause greater inhibition of pEGFR and pERK signaling; Pessimistic calculations were limited by the maximum inhibition observed in the analysis. In contrast, inhibition of pAKT was shown to be greater than the additive at the lowest concentration of compound B (29% inhibition with erlotinib, 15% inhibition vs. 3 nM compound B vs. erlotinib + 3 nM compound B) And achieved inhibition of 62% or less even at high doses (FIG. 10B, 12B).

실시예Example 10:  10: RPC9RPC9 클론 6( Clone 6 ( 다코미티닙Dakomitinib 및  And 에를로티닙Erlotinib 내성) 이종이식 모델에서 EGFR  Tolerance) In the xenograft model, EGFR T790MT790M 억제제와  Inhibitors and 다코미티닙Dakomitinib 또는  or 에를로티닙의Erlotinib 조합 Combination

배경:background:

RPC9 클론 6 세포를 실시예 6에 기재된 바와 같이 모 PC9 세포로부터 생성하였다. 모 PC9 세포는 EGFR delE746-A750을 함유하고, 다코미티닙 및 에를로티닙의 처리에 민감하다. RPC9 클론 6 세포주는 다코미티닙(daco)으로의 용량-증가 처리에 의해 생성된 선택된 내성 클론 중 하나이었다. RPC9 클론 6 세포는 약 10%의 EGFR delE746-A750 및 T790M, 및 90%의 EGFR delE746-A750 대립유전자를 함유한다. 따라서, 생체내 분석에서, RPC9 클론 6은 EGFR delE746-A750 및 T790M 대립유전자로 인해 다코미티닙/에를로티닙 단일 제제 처리에 내성일 뿐만 아니라 EGFR delE746-A750 대립유전자로 인해 화합물 A(화합물 A) 및 화합물 B(화합물 B) 단일 제제 처리에 내성이었다. 화합물 A 또는 화합물 B와 임상적으로 관련된 농도의 다코미티닙 또는 에를로티닙의 조합은 EGFR 신호 경로의 상승적인 억제를 통해 세포 생존력에 대한 상승적인 효과를 생성하였다. 따라서, 생체내 동물 연구를 수행하여 화합물 A 또는 화합물 B와 다코미티닙 또는 에를로티닙의 조합이 RPC9 클론 6 이종이식 모델에서 상승적인 항종양 효과를 생성할 수 있는지 여부를 평가하였다.RPC9 clone 6 cells were generated from parental PC9 cells as described in Example 6. The parental PC9 cells contain EGFR delE746-A750 and are sensitive to the treatment of both multicomib and erlotinib. The RPC9 clone 6 cell line was one of the selected resistant clones generated by dose-increasing treatment with DakoMitinib (daco). RPC9 clone 6 cells contain about 10% EGFR delE746-A750 and T790M, and 90% EGFR delE746-A750 allele. Thus, in an in vivo assay, RPC9 clone 6 is resistant to treatment with DakoMitinib / Errotinib monoglycerides due to the EGFR delE746-A750 and T790M alleles, as well as to Compound A (Compound A) due to the EGFR delE746-A750 allele, And Compound B (Compound B) were resistant to single agent treatment. The combination of clinically relevant concentrations of either docomitimib or erlotinib with compound A or compound B produced a synergistic effect on cell viability through synergistic inhibition of the EGFR signaling pathway. Thus, in vivo animal studies were conducted to assess whether the combination of compound A or compound B and either multicomunib or erlotinib could produce a synergistic antitumor effect in the RPC9 clone 6 xenograft model.

방법:Way:

4주령 내지 6주령의 SCID 베이지 암컷 마우스를 찰스 리버 랩(Charles River lab)으로부터 수득하고, 화이자 라 호이아(Pfizer La Jolla) 동물 시설에서 가압된 환기 우리에서 유지하였다. 모든 연구는 화이자 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Pfizer Institutional Animal Care and Use Committees)에 의해 승인되었다. 재구성된 기저 막[마트리겔(Matrigel), 비디 바이오사이언시스(BD Biosciences)]으로 1:1(v/v) 현탁된 5 x 106 RPC9 클론 6 세포를 피하로 주사하여 종양을 수립하였다. 종양 성장 억제(TGI) 연구를 위해, 약 300 mm3의 수립된 종양을 가진 마우스를 선택하고 무작위화한 후, 제시된 용량 및 양생법을 사용하여 단일 제제로서 EGFR T790M 억제제, 또는 다코미티닙 또는 에를로티닙과 함께 처리하였다. 버니어 캘리퍼를 사용하여 종양 치수를 측정하고, 수학식: π/6 x 큰 직경 x(작은 직경)2를 사용하여 종양 부피를 계산하였다. 종양 성장 억제(%)(TGI%)를 100 x (1-T/-C)로 계산하였다. 종양 퇴행(%)를 100 x(1-T/출발 종양 크기)로 계산하였다.SCID beige female mice between 4 and 6 weeks of age were obtained from the Charles River lab and maintained in pressurized ventilator in a Pfizer La Jolla animal facility. All studies were approved by the Pfizer Institutional Animal Care and Use Committees. Tumors were established by subcutaneous injection of 5 x 10 6 RPC9 clone 6 cells suspended in a 1: 1 (v / v) suspension with reconstituted basement membrane (Matrigel, BD Biosciences). For tumor growth inhibition (TGI) studies, mice with established tumors of about 300 mm &lt; 3 &gt; were selected and randomized and then used as EGFR T790M inhibitor, or Dakomitinib or erloty Lt; / RTI &gt; Tumor dimensions were measured using a vernier caliper and the tumor volume was calculated using the formula: [pi] / 6 x large diameter x (small diameter) 2 . Tumor growth inhibition (%) (TGI%) was calculated as 100 x (1-T / -C). Tumor regression (%) was calculated as 100 x (1-T / starting tumor size).

화합물 A를 0.5% 메토셀/20 mM 트리스 완충액(pH 7.4) 중 스프레이 건조된 분산 현탁액으로 제형화하였다. 화합물 B를 동일반응계에서 0.5% 메토셀을 함유하는 락테이트 염 용액으로 제형화하였다. 다코미티닙을 0.1 M 락트산 용액(pH 4.5)으로 제형화하였다. 에를로티닙을 40% 캅티솔(Captisol: 등록상표)로 제형화하였다. 모든 약물을 제형화하고 10 mL/kg의 농도로 투여하였다. 종양을 가진 마우스에 제시된 처리로 경구로 매일 투여하고, 체중 및 건강 관찰은 매일 기록하였다.Compound A was formulated into a spray-dried dispersion suspension in 0.5% Methocel / 20 mM Tris buffer (pH 7.4). Compound B was formulated in the same reaction system as a lactate salt solution containing 0.5% methocel. Dakommitib was formulated into a 0.1 M lactic acid solution (pH 4.5). The erlotinib was formulated with 40% Captisol (R). All drugs were formulated and administered at a concentration of 10 mL / kg. Mice with tumors were orally administered daily with the treatments presented, and body weight and health observations were recorded daily.

결과:result:

연구 I: 화합물 A 및 다코미티닙의 조합Study I: Combination of Compound A and Dakomitinib

이 연구에서, RPC9 클론 6 종양을 가진 마우스를 무작위화하고 화합물 A 또는 다코미티닙의 단일 제제로, 또는 화합물 A와 다코미티닙을 함께 처리하였다. 5 mg/kg에서 다코미티닙은 마우스 혈장에서 4 nM의 평균 미조합 약물 농도를 제공하였고, 이는 45 mg/kg/일의 임상 투여량으로부터의 평균 임상 노출에 부합한다. 체중 변화(%)를 도 13B에 제시하였고, 이 연구의 모든 투여량 군은 10% 미만의 체중 손실을 잘 견디는 것으로 나타났다. 화합물 A를 도 13A에 제시된 바와 같이 500 mg/kg, 200 mg/kg, 및 단일 제제로서 50 mg/kg 또는 5 mg/kg으로 다코미티닙과 함께 투여하였다. 39일에, 비히클 군의 종양 크기가 평균 1200 mm3에 달하는 경우, 도 13A 및 표 4에 도시된 바와 같이 다코미티닙의 단일 제제 처리는 종양 성장 정체를 발생시키고 화합물 A의 단일 제제 처리는 용량-의존성 종양 성장 억제를 발생시켰다. 화합물 A와 다코미티닙의 모든 투여량 범위의 조합은 표 4에 도시된 바와 같이 완전 종양 퇴행을 발생시켰다. In this study, mice with RPC9 clone 6 tumors were randomized and treated with Compound A or a single formulation of DakoMitinib, or Compound A and Dakomitinib together. At 5 mg / kg, Dakomitinib provided an average unconjugated drug concentration of 4 nM in mouse plasma, which corresponds to an average clinical exposure from a clinical dose of 45 mg / kg / day. The weight change (%) is shown in FIG. 13B, and all doses of this study showed less than 10% weight loss tolerance. Compound A was administered with 500 mg / kg, 200 mg / kg as shown in Figure 13A, and 50 mg / kg or 5 mg / kg as a single formulation with dacomitinib. At day 39, when the tumor size of the vehicle group reached an average of 1200 mm &lt; 3 &gt;, the single formulation treatment of dacomitinib as shown in Figure 13A and Table 4 resulted in tumor growth stagnation, - dependent tumor growth inhibition. The combination of all dose ranges of compound A and dacomitinib resulted in complete tumor regression as shown in Table 4.

종양 퇴행시 조합 효과를 추가로 평가하기 위해, 화합물 A의 단일 처리 군 및 조합 치료 군의 마우스는 연구일로부터 61일까지 200 mg/kg 및 50 mg/kg을 계속 받았다. 종양 성장 억제 및 종양 퇴행을 계산하고 표 4에 제시하였다. 결과는, (1) 화합물 A와 다코미티닙의 조합은 모든 투여량 범위에서 완전 종양 퇴행을 발생시키고, (2) 화합물 A의 단일 제제 처리 군에서의 종양은 200 mg/kg 및 50 mg/kg 모두에서 EGFR delE746-A750 대립유전자에 의해 구동될 수 있는 시험관 내 내성에서 유사한 용량-의존 방식으로 진행되고, (3) 다코미티닙의 단일 처리 군에서의 종양은 또한 이 RPC9 클론 6 이종이식 모델에서 EGFR delE746-A750 및 T790M 대립유전자에 의해 구동될 수 있는 시험관내 내성에서 유사하게 진행됨을 나타낸다.To further assess the combined effects of tumor regression, the monotherapy group of Compound A and the mice in the combination treatment group received 200 mg / kg and 50 mg / kg for up to 61 days from study day. Tumor growth inhibition and tumor regression were calculated and presented in Table 4. The results showed that (1) the combination of compound A and dacomitinib resulted in complete tumor regression in all dosage ranges; (2) tumors in the single agent treated group of Compound A had 200 mg / kg and 50 mg / kg (3) Tumors in the single treatment group of Dakomutinib also progressed in this RPC9 clone 6 xenograft model in a similar dose-dependent manner in vitro tolerance that could be driven by the EGFR delE746-A750 allele in both Lt; RTI ID = 0.0 &gt; EGFR &lt; / RTI &gt; delE746-A750 and T790M alleles.

또한, 처리 기간을 단일 제제 처리 및 조합 처리에 의한 시험관내 내성을 평가하기 위해 연장하였다. 다코미티닙의 단일 처리 군은 계속 진행하고, 종양 크기가 1200 mm3을 초과할 때 74 일에 종료하였다. 마찬가지로, 200 mg/kg의 화합물 A의 단일 처리 군을 계속 진행하고, 종양 크기가 1400 mm3을 초과할 때 95 일에 종료하였다. 따라서, 다코미티닙 또는 화합물 A의 단일 처리 군에서의 종양은 계속 진행되고, 생체내 내성이 시험관내 특성과 유사함을 입증하였다. 다코미티닙 및 50 mg/kg의 화합물 A의 조합 군은 100% TGI를 달성할 수 있을 뿐만 아니라, 다코미티닙 및 200 mg/kg의 화합물 A의 조합은 도 13A 및 표 4에 제시된 바와 같이 120 일의 연구 종료까지 종양 퇴행을 유지하였다.In addition, the treatment period was extended to evaluate tolerance in vitro by single formulation treatment and combination treatment. The single treatment group of Dakomutinib continued and terminated at 74 days when tumor size exceeded 1200 mm &lt; 3 & gt ;. Similarly, a single treatment group of 200 mg / kg of Compound A continued and terminated at 95 days when tumor size exceeded 1400 mm &lt; 3 & gt ;. Thus, tumors in the single treatment group of Dakomitimib or Compound A continued to prove that the in vivo resistance was similar to that in vitro. In addition to being able to achieve 100% TGI, the combination of Dakomutinib and 50 mg / kg Compound A could achieve 100% TGI, while the combination of Dakomitimib and 200 mg / kg Compound A resulted in 120 Tumor regression was maintained until the end of the study.

연구 I에서 종양 성장 억제 및 퇴행In Study I, tumor growth inhibition and regression 연구 일Study Days 제 39 일Day 39 제 61 일Day 61 제 120 일Day 120 TGITGI 퇴행Regression TGITGI 퇴행Regression TGITGI 퇴행Regression daco_5 mg/kgdAcO5 mg / kg 96%96% 45%45% NAb NA b 화합물 A_500 mg/kgCompound A_500 mg / kg 7%7% NA*NA * 화합물 A_200 mg/kgCompound A - 200 mg / kg 91%91% 65%65% NAc NA c 화합물 A_50 mg/kgCompound A 50 mg / kg 68%68% NAa NA a 화합물 A_500 mg/kg + daco_5 mg/kgCompound A_500 mg / kg + daco_5 mg / kg 100%100% NA*NA * 화합물 A_200 mg/kg + daco_5 mg/kgCompound A - 200 mg / kg + daco - 5 mg / kg 100%100% 100%100% 100%100% 화합물 A_50 mg/kg +
daco_5 mg/kgCompound A 50 mg / kg +
dAcO5 mg / kg 100%100% 100%100% 80%80% *: 이 연구 군은 조합 아암에 대하여 종양이 전혀 검출되지 않았으므로 39일에 종료되었고 동물은 안전성 종점에 대해 사용되었다.
a: 이 연구 군은 53일에 종료되었고, 평균 종양 부피는 1200 mm3을 초과하였다.
b: 이 연구 군은 74일에 종료되었고, 평균 종양 부피는 1200 mm3을 초과하였다.
c: 이 연구 군은 95일에 종료되었고, 평균 종양 부피는 1400 mm3을 초과하였다.*: This study group ended at 39 days because no tumors were detected for the combined arms and the animals were used for safety endpoints.
a : The study group ended at 53 days and the mean tumor volume exceeded 1200 mm 3 .
b : This study group ended at 74 days and the mean tumor volume exceeded 1200 mm 3 .
c : This study group ended at 95 days and the mean tumor volume exceeded 1400 mm 3 .

연구 II: 화합물 B 및 다코미티닙의 조합Study II: Combination of Compound B and Dakomitinib

이 연구에서, RPC9 클론 6 종양을 가진 마우스를 무작위화하여 화합물 B 또는 다코미티닙의 단일 제제로, 또는 화합물 B와 다코미티닙의 조합으로 처리하였다. 다코미티닙을 5 mg/kg 및 1.5 mg/kg 투여하였다. 화합물 B를 도 14A에 제시된 바와 같이 50 mg/kg, 15 mg/kg 및 5 mg/kg 투여하였다. 체중 변화(%)를 도 14B에 플롯팅하고, 이 연구의 모든 투여 군은 10% 미만의 체중 손실을 잘 견뎠다. 제 36 일에, 비히클 군의 종양 크기가 평균 1000 mm3에 도달할 때, 다코미티닙의 단일 제제 처리는 도 15A에 도시된 바와 같이 용량-의존성 종양 성장 억제를 발생시켰다. 5 mg/kg 및 15 mg/kg의 화합물 B의 단일 제제 처리는 극심한 낮은 투여로 인해 유의하게 효과적이지 않은 반면, 50 mg/kg의 화합물 B의 단일 제제 처리는 도 15A에 제시된 바와 같이 47% TGI를 제공하였다. 화합물 B 및 다코미티닙의 조합은 도 15B에 도시된 바와 같이 용량-의존성 종양 퇴행을 발생시켰다. 종양 성장 억제 및 퇴행을 계산하고 하기 표 5에 제시하였다.In this study, mice with RPC9 clone 6 tumors were randomized to treat with Compound B or a single formulation of DakoMitinib, or a combination of Compound B and DakoMitinib. Dacomitinib was administered at 5 mg / kg and 1.5 mg / kg. Compound B was administered at 50 mg / kg, 15 mg / kg and 5 mg / kg as shown in Fig. 14A. The weight change (%) was plotted in FIG. 14B, and all of the study groups tolerated less than 10% weight loss. On day 36, when the tumor size of the vehicle group reached an average of 1000 mm &lt; 3 & gt ;, a single formulation treatment of Dakomitinib resulted in dose-dependent tumor growth inhibition as shown in Fig. 15A. A single formulation treatment of Compound B at 5 mg / kg and 15 mg / kg was not significantly effective due to extremely low doses, whereas a single formulation treatment of Compound B at 50 mg / kg resulted in 47% TGI Lt; / RTI &gt; The combination of compound B and dacomitinib resulted in dose-dependent tumor regression as shown in Figure 15B. Tumor growth inhibition and degeneration were calculated and presented in Table 5 below.

연구 II에서 종양 성장 억제 및 퇴행 In Study II, tumor growth inhibition and regression 연구 일Study Days 제 36 일The 36th day TGI TGI 퇴행Regression 다코미티닙 5 mg/kgDakommitib 5 mg / kg 97%97% 다코미티닙 1.5 mg/kgDakommitib 1.5 mg / kg 80%80% 화합물 B_50 mg/kgCompound B_50 mg / kg 47%47% 화합물 B_15 mg/kgCompound B 15 mg / kg 2%2% 화합물 B_5 mg/kgCompound B_5 mg / kg 18%18% 화합물 B_50 mg/kg + 다코미티닙 5 mg/kgCompound B_50 mg / kg + Dakomitimin 5 mg / kg 92%92% 화합물 B_15 mg/kg + 다코미티닙 5 mg/kgCompound B 15 mg / kg + Dakomitimin 5 mg / kg 72%72% 화합물 B_5 mg/kg + 다코미티닙 5 mg/kgCompound B_5 mg / kg + Dakomitimin 5 mg / kg 52%52% 화합물 B_50 mg/kg + 다코미티닙 1.5 mg/kgCompound B_50 mg / kg + Dakomitimin 1.5 mg / kg 31%31%

연구 III: 화합물 A 및 에를로티닙의 조합Study III: Combination of Compound A and erlotinib

이 연구에서, RPC9 클론 6 종양을 가진 마우스를 무작위화하고 화합물 A 또는 에를로티닙의 단일 제제로, 또는 화합물 A와 에를로티닙의 조합으로 처리하였다. 25 mg/kg의 에를로티닙은 마우스 혈장에서 300 nM의 평균 미조합된 약물 농도를 제공하였고, 이는 평균 임상 노출에 부합한다. 체중 변화(%)를 도 16B에 제시하고, 이 연구에서 모든 투여량 군은 10% 미만의 체중 손실을 잘 견뎠다. 화합물 A를 도 16A에 제시된 바와 같이 단일 제제로서 400 mg/kg, 200 mg/kg, 및 50 mg/kg으로, 또는 에를로티닙과 함께 25 mg/kg을 투여하였다. 45 일에, 비히클 군의 종양 크기가 1500 mm3을 초과하여 도달하는 경우, 도 16A 및 표 6에 예시된 바와 같이 에를로티닙의 단일 제제 처리는 51% 종양 성장 억제를 발생시켰고, 화합물 A의 단일 제제 처리는 용량-의존성 종양 성장 억제를 발생시켰다. 화합물 A와 에를로티닙의 모든 투여량 범위의 조합은 표 6에 예시된 바와 같이 종양 퇴행을 발생시켰다. In this study, mice with RPC9 clone 6 tumors were randomized and treated with a single formulation of Compound A or Erotinib, or a combination of Compound A and Erotinib. 25 mg / kg of erlotinib provided an average uncombined drug concentration of 300 nM in mouse plasma, which is consistent with the average clinical exposure. Weight change (%) is presented in Figure 16B, and all dose groups in this study tolerated less than 10% weight loss. Compound A was administered at 400 mg / kg, 200 mg / kg, and 50 mg / kg, or 25 mg / kg, with erlotinib as a single agent as shown in Figure 16A. At day 45, when the tumor size of the vehicle group reached over 1500 mm 3 , a single formulation treatment of erlotinib as illustrated in Figure 16A and Table 6 resulted in 51% tumor growth inhibition, Single agent treatment resulted in dose-dependent tumor growth inhibition. The combination of all dose ranges of Compound A and erlotinib resulted in tumor regression as illustrated in Table 6.

종양 퇴행에 대한 조합 효과를 추가로 평가하기 위해, 200 mg/kg 및 50 mg/kg으로 화합물 A의 단일 군 및 조합 처리 군의 마우스에 73일까지 계속 투여하였다. 종양 성장 억제 및 종양 퇴행을 계산하고 표 6에 예시하였다. 다코미티닙과 조합하는 연구 I의 결과와 유사하게, 이 연구로부터의 결과는 또한 화합물 A와 에를로티닙의 조합이 모든 투여량 범위에서 종양 퇴행을 발생시키고, 화합물 A 또는 에를로티닙의 단일 제제 처리 군에서의 종양은 진행을 계속하여, del 또는 del/T790M 대립유전자에 의해 구동된 생체내 내성을 시사하였다. To further assess the combined effect on tumor regression, mice were continuously administered to mice in the single and combined treatment groups of Compound A at 200 mg / kg and 50 mg / kg for up to 73 days. Tumor growth inhibition and tumor regression were calculated and illustrated in Table 6. Similar to the results of Study I in combination with Dakomutinib, the results from this study also showed that the combination of Compound A and erlotinib resulted in tumor regression in all dose ranges, and that Compound A or erlotinib single agent Tumors in the treatment group continued to progress, suggesting in vivo resistance driven by the del or del / T790M allele.

따라서, 결론적으로, 화합물 A와 다코미티닙 또는 에를로티닙의 조합은 내성 RPC9 클론 6 이종이식 모델에서 종양 퇴행을 유도하는 상승적인 항종양 활성을 달성하였다.Thus, in conclusion, the combination of compound A and either dakomitinib or erlotinib achieved synergistic antitumor activity leading to tumor regression in the resistant RPC9 clone 6 xenograft model.

연구 III에서 종양 성장 억제 및 퇴행In Study III, tumor growth inhibition and regression 연구 일Study Days 제 45 일The 45th day 제 73 일Day 73 TGITGI 퇴행Regression TGITGI 퇴행Regression 에를로티닙 25 mg/kgErlotinib 25 mg / kg 51%51% NAa NA a 화합물 A 400 mg/kgCompound A 400 mg / kg 39%39% NA*NA * 화합물 A 200 mg/kgCompound A 200 mg / kg 94%94% 76%76% 화합물 A 50 mg/kgCompound A 50 mg / kg 63%63% NAb NA b 화합물 A 400 mg/kg + 에를로티닙 25 mg/kgCompound A 400 mg / kg + erlotinib 25 mg / kg 92%92% NA*NA * 화합물 A 200 mg/kg + 에를로티닙 25 mg/kgCompound A 200 mg / kg + erlotinib 25 mg / kg 80%80% 75%75% 화합물 A 50 mg/kg + 에를로티닙 25 mg/kgCompound A 50 mg / kg + erlotinib 25 mg / kg 44%44% 35%35% *: 이 연구 군은 조합 아암에 대하여 종양이 전혀 검출되지 않았으므로 45일에 종료되었고 동물은 안전성 종점에 대해 사용되었다.
a: 이 연구 군은 52일에 종료되었고, 평균 종양 부피는 1500 mm3을 초과하였다.
b: 이 연구 군은 55일에 종료되었고, 평균 종양 부피는 1500 mm3을 초과하였다.*: The study group was terminated at 45 days because no tumor was detected for the combined arm, and the animals were used for safety endpoints.
a : The study group ended at 52 days and the mean tumor volume exceeded 1500 mm 3 .
b : This study group ended at 55 days and the mean tumor volume exceeded 1500 mm 3 .

결론:conclusion:

EGFR delE746-A750 및 EGFR delE746-A750/T790M 대립유전자 둘다를 갖는 RPC9 클론 6 이종이식 모델은 단일 제제 치료로서 화합물 A, 화합물 B, 다코미티닙 또는 에를로티닙으로 처리된 경우 종양 진행을 나타냈다. 상기 모델은 조합 요법으로서 고용량의 화합물 A, 및 다코미티닙 또는 에를로티닙의 임상적으로 관련된 투여량으로 처리된 경우 완전 퇴행을 보여주고, 또한 화합물 B 및 다코미티닙의 적은 용량으로 처리된 경우 용량-의존성 종양 퇴행을 보여주었다. 따라서, 현재 전임상적 동물 연구는, EGFR T790M 선택적인 억제제와 다코미티닙 또는 에를로티닙의 조합 요법이 선천적 및 후천적 FR 돌연변이 둘다를 갖는 NSCLC 환자에서 EGFR T790M 임상적 후보를 개발하는데 기전 기초의 강력하고 임상적으로 변환가능한 전략임을 성공적으로 입증하였다.The RPC9 clone 6 xenograft model with both EGFR delE746-A750 and EGFR delE746-A750 / T790M alleles showed tumor progression when treated with Compound A, Compound B, Dakomitinib or erlotinib as a single agent treatment. The model showed complete degeneration when treated with a high dose of Compound A as a combination therapy and a clinically relevant dose of dacomitinib or erlotinib, and also when treated with small doses of compound B and &lt; RTI ID = 0.0 &gt; Dose-dependent tumor regression. Thus, current preclinical animal studies have shown that combination therapy with EGFR T790M selective inhibitors and either dakomitinib or erlotinib is the strongest mechanism-based approach to developing EGFR T790M clinical candidates in NSCLC patients with both congenital and acquired FR mutations And has successfully demonstrated that it is a clinically convertible strategy.

<110> PFIZER INC. <120> Combination of an EGFR T790M Inhibitor and an EGFR Inhibitor for the Treatment of Non-Small Cell Lung Cancer <130> PC72016A <140> PCT/IB2014/059401 <141> 2014-03-03 <150> US 61/786,130 <151> 2013-03-14 <160> 3 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 13 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> RPC9 Clone 3 <400> 1 ctcatcatgc agc 13 <210> 2 <211> 13 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> RPC9 Clone 6 <400> 2 ctcatcatgc agc 13 <210> 3 <211> 13 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> PC9 <400> 3 ctcatcacgc agc 13                           <110> PFIZER INC.           <120> Combination of an EGFR T790M Inhibitor and an EGFR Inhibitor for        Treatment of Non-Small Cell Lung Cancer <130> PC72016A <140> PCT / IB2014 / 059401 <141> 2014-03-03 &Lt; 150 > US 61 / 786,130 <151> 2013-03-14 <160> 3 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 13 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> RPC9 Clone 3 <400> 1 ctcatcatgc agc 13 <210> 2 <211> 13 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> RPC9 Clone 6 <400> 2 ctcatcatgc agc 13 <210> 3 <211> 13 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> PC9 <400> 3 ctcatcacgc agc 13

Claims (27)

비가역성 EGFR T790M 억제제의 효과량을 EGFR 억제제의 효과량과 조합하여 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하는 비소세포 폐암의 치료 방법.Comprising administering an effective amount of an irreversible EGFR T790M inhibitor in combination with an effective amount of an EGFR inhibitor to a patient in need thereof. 제 1 항에 있어서,
비가역성 EGFR T790M 억제제가 1-{(3R,4R)-3-[({5-클로로-2-[(1-메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}옥시)메틸]-4-메톡시피롤리딘-1-일}프로프-2-엔-1-온 또는 이의 약학적으로 허용되는 염인 방법.The method according to claim 1,
The irreversible EGFR T790M inhibitor is selected from the group consisting of 1 - {(3R, 4R) -3 - [({5-chloro-2- [ 3-d] pyrimidin-4-yl} oxy) methyl] -4-methoxypyrrolidin-1-yl} prop-2-en-1-one or a pharmaceutically acceptable salt thereof. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
EGFR 억제제가 게피티닙, 에를로티닙, 이코티닙, 반데타닙, 라파티닙, 네라티닙, 아파티닙, 페리티닙, 다코미티닙, 카네르티닙, 세툭시맙 및 파니투무맙으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이의 약학적으로 허용되는 염인 방법.3. The method according to claim 1 or 2,
Wherein the EGFR inhibitor is selected from the group consisting of gefitinib, erlotinib, icocinib, vandetanib, lapatinib, neratinib, apatinate, peritinib, dakomitinib, caneritib, cetuximab, Or a pharmaceutically acceptable salt thereof. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
EGFR 억제제가 게피티닙, 에를로티닙, 아파티닙 및 다코미티닙으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이의 약학적으로 허용되는 염인 방법.3. The method according to claim 1 or 2,
Wherein the EGFR inhibitor is selected from the group consisting of gefitinib, erlotinib, apatinate, and docomitimin, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
EGFR 억제제가 에를로티닙 또는 이의 약학적으로 허용되는 염인 방법.3. The method according to claim 1 or 2,
Wherein the EGFR inhibitor is erlotinib or a pharmaceutically acceptable salt thereof. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
EGFR 억제제가 다코미티닙 또는 이의 약학적으로 허용되는 염인 방법.3. The method according to claim 1 or 2,
Wherein the EGFR inhibitor is Dakomitimin or a pharmaceutically acceptable salt thereof. EGFR T790M 억제제의 효과량을 panHER 억제제와 조합하여 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하는 비소세포 폐암의 치료 방법으로, 상기 panHER 억제제를 비표준 임상 투여 양생법에 따라 투여하는 방법.A method for treating non-small cell lung cancer comprising administering an effective amount of an EGFR T790M inhibitor in combination with a panHER inhibitor to a patient in need thereof, wherein the panHER inhibitor is administered according to a non-standard clinical administration regimen. 제 7 항에 있어서,
비표준 임상 투여 양생법이 비표준 임상 투여량 또는 비표준 투여 일정인 방법.8. The method of claim 7,
Wherein the non-standard clinical dosage regimen is a non-standard clinical dose or a non-standard dosage schedule. 제 7 항에 있어서,
비표준 임상 투여 양생법이 적은 투여량의 panHER 억제제인 방법.8. The method of claim 7,
Wherein the non-standard clinical dosage regimen is a low dose panHER inhibitor. 제 7 항에 있어서,
비표준 임상 투여 양생법이 간헐적인 투여 양생법인 방법.8. The method of claim 7,
Wherein the non-standard clinical administration regimen is intermittent administration regimen. 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
EGFR T790M 억제제가 Go6976, PKC412, AP26113, HM61713, WZ4002, CO-1686 및 TAS-2913으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이의 약학적으로 허용되는 염인 방법.11. The method according to any one of claims 7 to 10,
Wherein the EGFR T790M inhibitor is selected from the group consisting of Go6976, PKC412, AP26113, HM61713, WZ4002, CO-1686 and TAS-2913 or a pharmaceutically acceptable salt thereof. 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
EGFR T790M 억제제가 1-{(3R,4R)-3-[({5-클로로-2-[(1-메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}옥시)메틸]-4-메톡시피롤리딘-1-일}프로프-2-엔-1-온 또는 이의 약학적으로 허용되는 염인 방법.11. The method according to any one of claims 7 to 10,
Wherein the EGFR T790M inhibitor is 1 - {(3R, 4R) -3 - [({5-chloro-2- [ -d] pyrimidin-4-yl} oxy) methyl] -4-methoxypyrrolidin-1-yl} prop-2-en-1-one or a pharmaceutically acceptable salt thereof. 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
panHER 억제제가 라파티닙, 네라티닙, 아파티닙, 페리티닙, 다코미티닙 및 카네르티닙으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이의 약학적으로 허용되는 염인 방법.11. The method according to any one of claims 7 to 10,
wherein the panHER inhibitor is selected from the group consisting of lapatinib, neratinib, apatinate, peritinib, dakomitinib and carnertinib, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
panHER 억제제가 아파티닙 또는 이의 약학적으로 허용되는 염인 방법.11. The method according to any one of claims 7 to 10,
wherein the panHER inhibitor is apatamin or a pharmaceutically acceptable salt thereof. 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
panHER 억제제가 다코미티닙 또는 이의 약학적으로 허용되는 염인 방법.11. The method according to any one of claims 7 to 10,
wherein the panHER inhibitor is docomitimin or a pharmaceutically acceptable salt thereof. EGFR T790M 억제제를 EGFR 억제제와 조합하여 상승적인 양으로 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하는 비소세포 폐암의 치료 방법.A method of treating non-small cell lung cancer, comprising administering to a patient in need thereof a synergistic amount of an EGFR T790M inhibitor in combination with an EGFR inhibitor. 제 16 항에 있어서,
EGFR T790M 억제제가 Go6976, PKC412, AP26113, HM61713, WZ4002, CO-1686 및 TAS-2913으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이의 약학적으로 허용되는 염인 방법.17. The method of claim 16,
Wherein the EGFR T790M inhibitor is selected from the group consisting of Go6976, PKC412, AP26113, HM61713, WZ4002, CO-1686 and TAS-2913 or a pharmaceutically acceptable salt thereof. 제 16 항에 있어서,
EGFR T790M 억제제가 1-{(3R,4R)-3-[({5-클로로-2-[(1-메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}옥시)메틸]-4-메톡시피롤리딘-1-일}프로프-2-엔-1-온 또는 이의 약학적으로 허용되는 염인 방법.17. The method of claim 16,
Wherein the EGFR T790M inhibitor is 1 - {(3R, 4R) -3 - [({5-chloro-2- [ -d] pyrimidin-4-yl} oxy) methyl] -4-methoxypyrrolidin-1-yl} prop-2-en-1-one or a pharmaceutically acceptable salt thereof. 제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
EGFR 억제제가 게피티닙, 에를로티닙, 이코티닙, 반데타닙, 라파티닙, 네라티닙, 아파티닙, 페리티닙, 다코미티닙, 카네르티닙, 세툭시맙 및 파니투무맙으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이의 약학적으로 허용되는 염인 방법.19. The method according to any one of claims 16 to 18,
Wherein the EGFR inhibitor is selected from the group consisting of gefitinib, erlotinib, icocinib, vandetanib, lapatinib, neratinib, apatinate, peritinib, dakomitinib, caneritib, cetuximab, Or a pharmaceutically acceptable salt thereof. 제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
EGFR 억제제가 게피티닙, 에를로티닙, 아파티닙 및 다코미티닙으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이의 약학적으로 허용되는 염인 방법.19. The method according to any one of claims 16 to 18,
Wherein the EGFR inhibitor is selected from the group consisting of gefitinib, erlotinib, apatinate, and docomitimin, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. 제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
EGFR 억제제가 에를로티닙 또는 이의 약학적으로 허용되는 염인 방법.19. The method according to any one of claims 16 to 18,
Wherein the EGFR inhibitor is erlotinib or a pharmaceutically acceptable salt thereof. (a) EGFR T790M 억제제; 및
(b) EGFR 억제제
의 상승적인 조합으로, 상기 성분 (a) 및 성분 (b)가 상승적인 조합.(a) an EGFR T790M inhibitor; And
(b) an EGFR inhibitor
(A) and (b) are a synergistic combination. 제 22 항에 있어서,
EGFR T790M 억제제가 Go6976, PKC412, AP26113, HM61713, WZ4002, CO-1686 및 TAS-2913으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이의 약학적으로 허용되는 염인 조합.23. The method of claim 22,
Wherein the EGFR T790M inhibitor is selected from the group consisting of Go6976, PKC412, AP26113, HM61713, WZ4002, CO-1686 and TAS-2913 or a pharmaceutically acceptable salt thereof. 제 22 항에 있어서,
EGFR T790M 억제제가 1-{(3R,4R)-3-[({5-클로로-2-[(1-메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}옥시)메틸]-4-메톡시피롤리딘-1-일}프로프-2-엔-1-온 또는 이의 약학적으로 허용되는 염인 조합.23. The method of claim 22,
Wherein the EGFR T790M inhibitor is 1 - {(3R, 4R) -3 - [({5-chloro-2- [ -d] pyrimidin-4-yl} oxy) methyl] -4-methoxypyrrolidin-1-yl} prop-2-en-1-one or a pharmaceutically acceptable salt thereof. 제 22 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
EGFR 억제제가 게피티닙, 에를로티닙, 이코티닙, 반데타닙, 라파티닙, 네라티닙, 아파티닙, 페리티닙, 다코미티닙, 카네르티닙, 세툭시맙 및 파니투무맙으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이의 약학적으로 허용되는 염인 조합.25. The method according to any one of claims 22 to 24,
Wherein the EGFR inhibitor is selected from the group consisting of gefitinib, erlotinib, icocinib, vandetanib, lapatinib, neratinib, apatinate, peritinib, dakomitinib, caneritib, cetuximab, Or a pharmaceutically acceptable salt thereof. 제 22 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
EGFR 억제제가 게피티닙, 에를로티닙, 아파티닙 및 다코미티닙으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이의 약학적으로 허용되는 염인 조합.25. The method according to any one of claims 22 to 24,
Wherein the EGFR inhibitor is selected from the group consisting of gefitinib, erlotinib, apatinate, and dakomitinib, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. 제 22 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
EGFR 억제제가 에를로티닙 또는 이의 약학적으로 허용되는 염인 조합.25. The method according to any one of claims 22 to 24,
Wherein the EGFR inhibitor is erlotinib or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
KR1020157024916A 2013-03-14 2014-03-03 Combination of an egfr t790m inhibitor and an egfr inhibitor for the treatment of non-small cell lung cancer KR20150119210A (en)

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