KR20150089241A - Ethanol extracts of Moringa oleifera which promote the development, complexity of neuronal cytoarchitecture, synapse formation, a method for preparing them - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to ethanol extracts of Moringa oleifera leaves and manufacturing method thereof and, more specifically, to ethanol extracts of Moringa oleifera leaves (MOE) having a neurite (dendrite and axon) outgrowth promoting activity (NOPA), a neurite growth (branching and lengthening) promoting activity (NGPA), and a synapse formation promoting effect wherein the method comprises steps of: collecting samples of Moringa oleifera leaves; washing the collected samples; drying and grinding the washed samples; shaking after adding ethanol into the powdered sample; filtering out the supernatant after centrifugating a slurry after shaking; concentrating in a vacuum state and completely drying the solution produced from the previous step; weighting the dried ethanol extracts of Moringa oleifera leaves(MOE); producing an aliquot by dissolving the weighed MOE in dimethyl sulfoxide (DMSO); culturing primary hippocampal neurons; applying the aliquot of the MOE to the hippocampal neurons; and examining the neurite outgrowth promoting activity (NOPA), the neurite growth promoting activity (NGPA), and the synapse formation promoting effect.

Description

신경세포 구축의 발달, 복잡성 및 연접 생성을 촉진하는 모링가잎 에탄올 추출물, 및 이의 제조방법{Ethanol extracts of Moringa oleifera which promote the development, complexity of neuronal cytoarchitecture, synapse formation, a method for preparing them}FIELD OF THE INVENTION [0001] The present invention relates to a moringa leaf ethanol extract which promotes the development, complexity and synaptogenesis of nerve cell construction, and a method for preparing the same,

본 발명은 신경학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 인도 북서부 히말라야 산기슭에 자생하고 열대 전지역에서 재배하는 다목적 수종의 일종인 모링가 올레이페라(Moringa oleifera)의 에탄올 추출물(MOE)을 사용하여 신경돌기(가지돌기 및 축삭)의 생성 촉진 및 성장(분지 및 길이성장), 그리고 연접 생성을 촉진시키는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to the field of neurology. More particularly, the present invention relates to the use of an ethanol extract (MOE) of Moringa oleifera , a kind of multipurpose species native to the foot of the Himalayas in northwestern India and cultivated in the entire tropical region, Stimulation of growth and growth (branching and length growth), and methods of promoting synaptogenesis.

생활양식이 향상되고 발달된 의료혜택의 제공에 따라 기대생명이 증가되고 있기 때문에 노령에 따른 질환(예, 치매, 뇌졸중 등)이 증가하고 있다. 현재 이러한 퇴행성 질환에 대한 완전한 치료법은 없다. 신경학적으로 볼 때 이러한 질환들은 뇌의 국소적 신경세포 사멸과 관련이 있고, 신경 사멸은 주로 신경성장인자(neurotrophic factor)들의 결핍에 의한다(참조: Connor and Dragunow, 1998; 및 Siegel and Chauhan, 2000; Schaeffer et al., 2009). 따라서 신경세포들의 증식, 분화, 신경돌기들의 생성과 연접 생성을 조절하여 손상된 신경회로를 회복할 수 있는 인자들은 퇴행성 신경질환의 치료방안이 될 수 있다. 이러한 가설 하에 식물을 포함한 천연자원에서 신경 성장인자를 찾으려는 노력이 시도되고 있다.Elderly diseases (eg, dementia, stroke, etc.) are increasing because life expectancy is increasing and life expectancy is increasing with the provision of improved health benefits. Currently, there is no complete cure for these degenerative diseases. Neurologically, these diseases are associated with local nerve cell death in the brain, and neuronal death is largely due to deficiency of neurotrophic factors (Connor and Dragunow, 1998; and Siegel and Chauhan, 2000; Schaeffer et al., 2009). Thus, factors that regenerate damaged neuronal circuits by regulating the proliferation, differentiation, production and synaptogenesis of neuronal cells may be the treatment of degenerative neurological diseases. Under these hypotheses, efforts are being made to find nerve growth factors in natural resources, including plants.

모링가 올레이페라는 흔히 드럼스틱/홍당무 나무로 불리고, 속명 모링가세아에(Moringaceae)에 속하며 인도 북서부 히말라야 산기슭에 자생하고 열대 전지역에서 재배하는 다목적 수종의 일종이다. 모링가 올레이페라는 여러 가지 신경증, 마비, 천식, 당뇨, 혈압, 설사, 열병(fever), 감기, 경련, 감염, 위궤양 등의 치료에 이용되고 있다(참조: Mishra et al., 2011; Promkum et al., 2010; 및 Morton, 1991). 지난 수 십년간 모링가의 영양, 의약특성 등에 대한 많은 연구 보고가 있었다(참조: Fahey, 2005). 제조방식에 따라 모링가는 항생효능, 항트리파노솜(antitrypanosome), 고혈압(hypertensive), 항경련(antispasmodic), 항궤양(antiulcer), 항염증(anti-inflammatory), 콜레스테롤 저하(hypocholesterolemic) 및 당 저하활성(hypoglycemic) 등이 있다(참조: Anwar et al., 2007). 또한 동물실험을 통하여 신경계통에 영향을 주는 것이 밝혀졌다. 모한 등(참조: Mohan et al. 2005)에 의하면 모링가 올레이페라 잎은 기억증진 활성(nootropic activity)이 있어 기억을 향상시킨다. 또한 모링가 올레이페라 잎은 신경병적 통증을 완화시킨다(참조: Khongrum at el., 2012; Kirisattayakul et al., 2012). 활성산소(ROS), 저산소증, 흥분독성 등에 의한 산화스트레스는 신경학적 질환의 중요한 병리생리적 요인이 된다(참조: Shukla et al., 2011). 모링가 올레이페라 잎은 알츠하이머 치매 동물 모델에서 항산화제로 작용하고, 뇌의 모노아민(monoamine)의 변화에 따른 저바륨성 저산소증(hypobaric hypoxia)을 방지한다(참조: Ganguly and Guha, 2008). Moringa oleifera is a type of multipurpose species that is often called a drumstick / blush tree and belongs to the genus Moringaceae, native to the foot of the Himalayas in northwestern India and grown in the tropics. Moringa oleifera has been used for the treatment of various neuropathies, paralysis, asthma, diabetes, blood pressure, diarrhea, fever, cold, convulsions, infection, gastric ulcers and the like (Mishra et al., 2011; Promkum et al., 2010; and Morton, 1991). Over the past several decades, there have been many reports of Moringa's nutritional and medicinal properties (see Fahey, 2005). Depending on the manufacturing method, Moring's antimicrobial activity can be improved by antibiotic efficacy, antitrypanosome, hypertensive, antispasmodic, antiulcer, anti-inflammatory, hypocholesterolemic, And hypoglycemic (Anwar et al., 2007). It has also been shown that animal experiments affect the nervous system. According to Mohan et al. (Mohan et al. 2005), moringa oleifera leaves have nootropic activity and improve memory. Moringa oleifera leaves also alleviate neuropathic pain (Khongrum at el., 2012; Kirisattayakul et al., 2012). Oxidative stress due to reactive oxygen species (ROS), hypoxia, excitotoxicity, etc. is an important pathophysiological factor in neurological disease (Shukla et al., 2011). Moringa oleifera leaves act as antioxidants in Alzheimer's dementia animal models and prevent hypobaric hypoxia due to changes in the brain's monoamine (Ganguly and Guha, 2008).

모링가 올레이페라 잎의 효능에 대한 민간요법 및 과학적 근거자료에 따라, 본 발명자들은, 모링가 올레이페라 잎이 기억의 형성과 같은 고등 뇌기능에 중요한 역할을 하는 해마(hippocampus)의 신경세포에 어떠한 이로운 영향을 미치는 지를 조사하고자 하였다. 모링가 올레이페라 잎은 아스코르브산, 플라보노이드, 페놀수지류, 카로티노이드(β-카로텐 포함) 및 β-시토스테롤과 같은 다양한 식물성 화학물질(phytochemical)을 함유하고 있다(참조: Anwar et al., 2007). 특히 β-카로텐은 신경세포를 분화시키는 효능이 있는 것으로 알려지고 있다(참조: Lee et al., 2013). 이에 본 발명자들은 모링가 올레이페라 잎의 에탄올 추출물을 제조하고, 해마 신경세포의 일차 배양물을 이용하여 신경돌기(neurite)들의 생성촉진 효능 및 세포사 방지효능을 증명하였다.
Based on folk remedies and scientific evidence on the efficacy of the moringa oleifera leaves, the present inventors have found that the moringa oleifera leaves have an effect on the neurons of the hippocampus, which plays an important role in the function of the higher brain, And to investigate whether it has a beneficial effect. Moringa oleifera leaves contain a variety of phytochemicals such as ascorbic acid, flavonoids, phenolic resins, carotenoids (including β-carotene) and β-sitosterol (see Anwar et al., 2007). In particular, β-carotene has been shown to have the potential to differentiate neurons (Lee et al., 2013). Accordingly, the present inventors have produced an ethanol extract of Moringa oleifera leaf, and demonstrated the effect of promoting the production of neurites and preventing cell death using primary cultures of hippocampal neurons.

Anwar, F., Latif, S., Ashraf, M.,Gilani, A.H., 2007.: afoodplantwithmultiplemedicinaluses.PhytotherapyResearch21, 17-25.Anwar, F., Latif, S., Ashraf, M., Gilani, A. H., 2007. afoodplantwithmultiplemedicinaluses.PhytotherapyResearch21, 17-25. Anwar, F., Ashraf, M., Bhanger, M.I., 2005. Interprovenance variation in the composition of Moringa Oleifera oilseeds from Pakistan. Journal of the American Oil Chemist's Society 82, 45-51.Anwar, F., Ashraf, M., Bhanger, M. I., 2005. Interprovenance variation in the composition of Moringa Oleifera oilseeds from Pakistan. Journal of the American Oil Chemist ' s Society 82, 45-51. Awodele, O., Oreagba, I.A., Odoma, S., da Silva, J.A., Osunkalu, V.O., 2012. Toxicological evaluation of the aqueous leaf extract of Moringa Oleifera Lam. (Moringaceae). Journal of Ethnopharmacology 139, 330-336.Awodele, O., Oreagba, I. A., Odoma, S., da Silva, J. A., Osunkalu, V. O., 2012. Toxicological evaluation of the aqueous leaf extract of Moringa Oleifera Lam. (Moringaceae). Journal of Ethnopharmacology 139, 330-336. Brewer, G.J., Torricelli, J.R., Evege, E.K., and Price, P.J. (1993). Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J. Neurosci. Res. 35, 567-576.Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., and Price, P.J. (1993). Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J. Neurosci. Res. 35, 567-576. Chucair, A.J., Rotstein, N.P., Sangiovanni, J.P., During, A., Chew, E.Y., Politi, L.E., 2007, Lutein and zeaxanthin protect photoreceptors from apoptosis induced by oxidative stress: relation with docosahexaenoic acid. Investigative Ophthalmology and Visual Science 48, 5168-5177.Chucair, A. J., Rotstein, N. P., Sangiovanni, J. P., During, A., Chew, E. Y., Politi, L.E., 2007, Lutein and zeaxanthin protect photoreceptors from apoptosis induced by relation to docosahexaenoic acid. Investigative Ophthalmology and Visual Science 48, 5168-5177. Connor, Dragunow, M., 1998. The role of neuronal growth factors in neurodegenerative disorders of the human brain. Brain Research Reviews 27, 1-39.Connor, Dragunow, M., 1998. The role of neuronal growth factors in neurodegenerative disorders of the human brain. Brain Research Reviews 27, 1-39. Dotti, C.G., Sullivan, C.A., Banker, G.A., 1988. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. Journal of Neuroscience 8, 1454-1488.Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A., 1988. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. Journal of Neuroscience 8, 1454-1488. Fahey, J.W., 2005. Moringa oleifera: a review of the medical evidence for its nutritional, therapeutic, and prophylactic properties. Part 1. " Phytochemistry 47, 123-157.Fahey, J.W., 2005. Moringa oleifera: a review of the medical evidence for its nutritional, therapeutic, and prophylactic properties. Part 1. "Phytochemistry 47, 123-157. Ganguly, R., Guha, D., 2008. Alteration of brain monoamines & EEG wave pattern in rat model of Alzheimer's disease & protection by Moringa oleifera. 128, 744-751.Ganguly, R., Guha, D., 2008. Alteration of brain monoamines and EEG wave pattern in rat model of Alzheimer's disease and protection by Moringa oleifera. 128, 744-751. Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G., 1998. Rat hippocampal neurons in low-density culture in Culturing nerve cells, eds. by Banker G and Goslin K. MIT Press, Cambridge, MA, pp. 339-370.Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G., 1998. Rat hippocampal neurons in low-density cultures in Culturing nerve cells, eds. by Banker G and Goslin K. MIT Press, Cambridge, MA, pp. 339-370. Gross, M.D., Bishop, T.D., Belcher, J.D., Jacobs, D.R. Jr., 1997. Induction of HL-60 cell differentiation by carotenoids. Nutrition and Cancer 27, 169-173.Gross, M.D., Bishop, T. D., Belcher, J. D., Jacobs, D.R. Jr., 1997. Induction of HL-60 cell differentiation by carotenoids. Nutrition and Cancer 27,169-173. Hannan, M.A., Kang, J.Y., Hong, Y.K., Lee, H., Chowdhury, M.T.H., Choi, J.S., Choi, I.S., Moon, I.S., 2012. A brown alga(Sargassum fulvellum) facilitates neuronal maturation and synaptogenesis. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal 48: 535-544.Lee, H., Chowdhury, M.T.H., Choi, J. S., Choi, I. S., Moon, I. S., 2012. A brown alga (Sargassum fulvellum) facilitates neuronal maturation and synaptogenesis. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal 48: 535-544. Hannan, M.A., Kang, J.Y., Hong, Y.K., Lee, H., Choi, J.S., Choi, I.S., Moon, I.S., 2013. The marine alga promotesthedevelopmentandcomplexity ofneuronalcytoarchitecture. PhytotherapyResearch 27, 21-29.Hannan, M. A., Kang, J. Y., Hong, Y. K., Lee, H., Choi, J. S., Choi, I. S., Moon, I. S., 2013. The marine alga promotes development and complexity of neuronal cytoarchitecture. Phytotherapy Research 27, 21-29. Khongrum, J., Wattanathorn, J., Muchimapura, S., Thukhum-mee, W., Thipkaew, C., Wannanon, P., Tong-un, T., 2012. Moringa oleifera leaves extract attenuates neuropathic pain induced by chronic constriction injury. American Journal of Applied Sciences 9, 1182-1187.Tong-un, T., 2012. Moringa oleifera leaves extract attenuates neuropathic pain induced by morphine, chronic constriction injury. American Journal of Applied Sciences 9, 1182-1187. Kirisattayakul, W., Wattanathorn, J., Tong-Un, T., Muchimapura, S., Wannanon, P., 2012. Moringa Oleifera Lam mitigates oxidative damage and brain infarct volume in focal cerebral ischemia. American Journal of Applied Sciences 9, 1457-1463.W., Wattanathorn, J., Tong-Un, T., Muchimapura, S., Wannanon, P., 2012. Moringa Oleifera Lam mitigates oxidative damage and brain infarct volume in focal cerebral ischemia. American Journal of Applied Sciences 9, 1457-1463. Lakshminarayana, R., Raju, M., Krishnakantha, T.P., Baskaran, V., 2005. Determination of major carotenoids in a few Indian leafy vegetables by high-performance liquid chromatography. Journal of Agricultural and Food Chemistry 53, 2838-2842.Lakshminarayana, R., Raju, M., Krishnakantha, T. P., Baskaran, V., 2005. Determination of major carotenoids in a few Indian leafy vegetables by high-performance liquid chromatography. Journal of Agricultural and Food Chemistry 53, 2838-2842. Lee, H. A., Park, S., & Kim, Y., 2013. Effect of β-carotene on cancer cell stemness and differentiation in SK-N-BE (2) C neuroblastoma cells. Oncology reports 30(4), 1869-1877.Lee, H., Park, S., & Kim, Y., 201. Effect of β-carotene on cancer cell stemness and differentiation in SK-N-BE (2) C neuroblastoma cells. Oncology reports 30 (4), 1869-1877. Luqman, S., Srivastava, S., Kumar, R., Maurya, A.K., Chanda, D., 2012. Experimental assessment of Moringa oleifera leaf and fruit for its antistress, antioxidant, and scavenging potential using in vitro and in vivo assays. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine 2012, 519084.In this study, we investigated the effects of antioxidant, antioxidant, and scavenging potential on morphine oleifera leaf and fruit in vitro and in vivo assays. . Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine 2012, 519084. McAllister, A.K., 2000. Cellular and molecular mechanisms of dendrite growth. Cerebral Cortex 10, 963-973.McAllister, A. K., 2000. Cellular and molecular mechanisms of dendrite growth. Cerebral Cortex 10, 963-973. Mishra, G., Singh, P., Verma, R., Kumar, S., Strivastav, S., Jha, K.K., Khosa, R.L., 2011. Traditional uses, phytochemistry and pharmacological properties of Moringa oleifera plant: An overview. Der Phamacia Lettre 3, 141-164.Mishra, G., Singh, P., Verma, R., Kumar, S., Strivastav, S., Jha, K. K., Khosa, R.L., 2011. Morninga oleifera plant: An overview. Der Phamacia Lettre 3, 141-164. Mohan, M., Kaul, N., Punekar, A., Girnar, R., Junnare, P., Patil, L., 2005. Nootropic activity of Moringa oleifera leaves., 59-62.Mohan, M., Kaul, N., Punekar, A., Girnar, R., Junnare, P., Patil, L., 2005. Nootropic activity of Moringa oleifera leaves., 59-62. Moon, I.S., Cho, S.J., Jin, I., Walikonis, R., 2007. A simple method for combined fluorescence in situ hybridization and immunocytochemistry. Molecules and Cells 24, 76-82.Moon, I. S., Cho, S. J., Jin, I., Walikonis, R., 2007. A simple method for combined fluorescence in situ hybridization and immunocytochemistry. Molecules and Cells 24, 76-82. Morton, J.F., 1991. The Horseradish Tree, Moringa pterygosperma (Moringaceae)-A Boon to Arid Lans? Economic Botany 45, 318-333.Morton, J. F., 1991. The Horseradish Tree, Moringa pterygosperma (Moringaceae) -A Boon to Arid Lans? Economic Botany 45, 318-333. Mu, Y., Gage, F.H., 2011. Adult hippocampal neurogenesis and its role in Alzheimer's disease. Molecular Neurodegeneration 6, 85.Mu, Y., Gage, F. H., 2011. Adult hippocampal neurogenesis and its role in Alzheimer's disease. Molecular Neurodegeneration 6, 85. Nambiar, V.S., Seshadri, S., 1998. Beta carotene content of some green leafy vegetables of Western India by HPLC. Journal of Food Science and Technologly 35, 365-367.Nambiar, V.S., Seshadri, S., 1998. Beta carotene content of some green leafy vegetables of Western India by HPLC. Journal of Food Science & Technolog 35, 365-367. Promkum, C., Kupradinun, P., Tuntipopipat, S., Butryee, C., 2010. Nutritive evaluation and effect of Moringa oleifera pod on clastogenic potential in the mouse. Asian Pacific Journal of Cancer Prevetnion 11, 627-632.Promkum, C., Kupradinun, P., Tuntipopipat, S., Butryee, C., 2010. Nutritive evaluation and effect of Moringa oleifera pod on clastogenic potential in the mouse. Asian Pacific Journal of Cancer Prev. 11, 627-632. Schaeffer, E.L., Novaes, B.A., da Silva, E.R., Skaf, H.D., Mendes-Neto, A.G., 2009. Strategies to promote differentiation of newborn neurons into mature functional cells in Alzheimer brain. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry 33, 1087-1102.Schaeffer, E. L., Novaes, B. A., da Silva, E.R., Skaf, H. D., Mendes-Neto, A.G., 2009. Strategies to promote differentiation of newborn neurons into mature functional cells in Alzheimer's brain. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry 33, 1087-1102. Sengev, A.I., Abu, J.O., Gernah, D.I., 2013. Effect of Moringa oleifera leaf powder supplementation on some quality characteristics of wheat bread. Food and Nutrition Sciences 4, 270-275.Sengev, A. I., Abu, J. O., Gernah, D. I., 2013. Effect of Moringa oleifera leaf powder supplementation on some quality characteristics of wheat bread. Food and Nutrition Sciences 4, 270-275. Shukla, V., Mishra, S.K., Pant, H.C., 2011. Oxidative stress in neurodegeneration. Advances in pharmacological sciences, 2011.Shukla, V., Mishra, S. K., Pant, H.C., 2011. Oxidative stress in neurodegeneration. Advances in pharmacological sciences, 2011. Sholl, D.A., 1953. Dendritic organization in the neurons of the visual and motor cortices of the cat. Journal of anatomy 87, 387-406.Sholl, D. A., 1953. Dendritic organization in the neurons of the visual and motor cortices of the cat. Journal of anatomy 87, 387-406. Siegel, G.J., Chauhan, N.B., 2000. Neurotrophic factors in Alzheimer's and Parkinson's disease brain. Brain Research Reviews 33, 199-227.Siegel, G. J., Chauhan, N. B., 2000. Neurotrophic factors in Alzheimer's and Parkinson's disease brain. Brain Research Reviews 33, 199-227. Teter, B., Ashford, J.W., 2002. Neuroplasticity in Alzheimer's disease. Journal of Neuroscience Research 70, 402-437.Teter, B., Ashford, J.W., 2002. Neuroplasticity in Alzheimer's disease. Journal of Neuroscience Research 70, 402-437.

본 발명자들은, 흰쥐 랫트의 해마 신경세포의 일차 배양물(primary culture)에서 모링가로부터의 에탄올 추출물(Moringa oleifera ethanol extracts; MOE)의 신경돌기발생(neuritogenesis) 및 연접 생성(synapse formation)에 대한 활성을 평가하였다. 그 결과, 본 발명자들은 모링가의 에탄올 추출물(MOE)이 강력한 신경돌기발생 및 연접 생성 활성을 나타냄을 발견하였다.The present inventors have found that the activity of neuritogenesis and synapse formation of moringa oleifera ethanol extracts (MOE) from moringa in primary cultures of hippocampal neurons of rat rats . As a result, the present inventors have found that the ethanol extract (MOE) of Moringa shows strong neurite outgrowth and synapse production activity.

이에, 본 발명의 목적은 모링가의 에탄올 추출물(MOE)의 제조 방법, 및 당해 방법으로 수득된, 신경세포구축의 발달 및 복잡성을 촉진하고, 연접 생성을 촉진하는 모링가의 에탄올 추출물(MOE)을 제공하는 것이다.
Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for producing ethanol extract (MOE) of moringa, and a method for producing ethanol extract (MOE) of moringa which promotes the development and complexity of neural cell establishment and promotes synaptogenesis, .

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 In order to accomplish the above object of the present invention,

(a) 모링가 시료를 수집하는 단계;(a) collecting a Moringa sample;

(b) 수집한 모링가 시료를 세척하는 단계;(b) washing the collected Moringa sample;

(c) 세척된 모링가 시료를 건조 및 분쇄하는 단계;(c) drying and crushing the washed Moringa sample;

(d) 단계 (c)의 모링가 시료의 분말에 에탄올을 붓고 진탕시키는 단계;(d) pouring and shaking ethanol into the powder of the Moringa sample of step (c);

(e) 진탕 후, 슬러리를 원심분리한 후, 상층액을 여과시키는 단계;(e) after shaking, centrifuging the slurry and filtering the supernatant;

(f) 단계 (e)에서 수득된 여액을 진공 하에 농축시키고 완전히 건조시키는 단계;(f) concentrating the filtrate obtained in step (e) under vacuum and completely drying;

(g) 단계 (f)에서 건조된 모링가의 에탄올 추출물(MOE)을 칭량하는 단계;(g) weighing the ethanol extract (MOE) of Moringa dried in step (f);

(h) 모링가의 에탄올 추출물(MOE)을 디메틸 설폭사이드(DMSO) 속에 용해시켜 분취량을 제조하는 단계;(h) dissolving an ethanol extract (MOE) of moringa in dimethylsulfoxide (DMSO) to prepare an aliquot;

(i) 일차 해마 신경세포(primary hippocampal neuron)를 배양하는 단계;(i) culturing primary hippocampal neurons;

(j) 단계 (i)에서 배양한 해마 신경세포에 단계 (h)에서 수득한 MOE의 분취량을 처리하는 단계; (j) treating an aliquot of the MOE obtained in step (h) to the hippocampal neuron cultured in step (i);

(k) MOE의 신경세포의 신경돌기 생성 및 성장 촉진 효능, 그리고 연접 생성 촉진효능을 검증하는 단계;(k) verifying neurite outgrowth and growth promoting activity and synergistic production promoting activity of MOE neurons;

(l) MOE 내에 β-카로텐을 정성적 및 정량적으로 분석하는 HPLC 분석 단 계 및(l) HPLC analysis to qualitatively and quantitatively analyze β-carotene in MOE System and

(m) β-카로텐의 신경세포 분화촉진 효능을 검증하는 단계를 포함하여, 모링가의 에탄올 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.(m) a step of verifying the neuronal differentiation promoting effect of? -carotene.

추가로, 본 발명은 상기한 방법들에 의해 수득된 것으로서 신경세포의 성숙촉진과, 신경돌기 발생 및 성장 촉진 효능, 그리고 연접 생성 촉진 효능을 가진 모링가의 에탄올 추출물(MOE)을 제공한다.
In addition, the present invention provides a moringa ethanol extract (MOE) obtained by the above-mentioned methods, which promotes neuronal cell maturation, neurite outgrowth and growth promoting activity, and synergistic production promoting activity.

본 발명에서 제공하는 모링가의 에탄올 추출물(MOE)은 신경세포의 제1 단계로부터 제2 단계로의 초기 분화를 유의적으로 촉진하며, 신경돌기의 수, 길이, 및 가지치기 빈도와 같은 축삭 및 가지돌기 발달의 지수를 증가시킨다. 또한 MOE는 신경세포의 연접 생성을 촉진시킨다. MOE의 이러한 효과의 최적 농도는 30㎍/mL이며 투여량-의존적이다. 이들 결과는, 모링가 잎이 신경영양 잠재능에 대한 촉망되는 후보물임을 나타낸다.The ethanol extract (MOE) of moringa provided in the present invention significantly promotes the early differentiation of the neural cells from the first stage to the second stage, and the axons such as number, length, and pruning frequency of neurites and Increases the index of dendritic development. In addition, MOE promotes synaptogenesis of neurons. The optimal concentration of this effect of MOE is 30 μg / mL and dose-dependent. These results indicate that Moringa leaves are a promising treasure for neurotrophic potential.

또한 MOE는 신경 영양인자로 작용하여 신경계의 발생 단계 뿐 아니라 정상적인 노화(normal ageing) 및 신경변성 질환(neurodegenerative disease)에서 신생 신경세포의 발달 촉진과 기존 신경세포들의 신경돌기 성장촉진 및 위축(atrophy) 방지를 통하여 뇌 질환을 예방하고 치료하며, 정상 뇌 기능을 향진시키는데 이용될 수 있다.
In addition, MOE acts as a neurotrophic factor that stimulates the development of new neurons in normal aging and neurodegenerative diseases as well as the developmental stages of the nervous system and promotes neurite growth and atrophy of existing neurons. Prevention and treatment of brain diseases, and can be used to promote normal brain function.

도 1. 신경세포 성장촉진에 대한 모링가의 에탄올 추출물(MOE)의 최적농도 결정.
태령 19일(E19)인 흰쥐의 해마 신경세포를 폴리-DL-라이신으로 피복된 커버스립에서 표시한 농도의 MOE 혹은 비히클(DMSO, <0.5%)이 들어간 배지 속에서 3일간 배양하였다.
A, 대표적인 위상차현미경 사진. 크기막대, 80μm (모든 사진에 적용됨).
B, 일차 신경돌기(primary neurite)의 수(a), 일차 신경돌기의 총 길이(total length of primary neurites, TLPN; b) 및 분지점 수(branching point, c)와 같은 형태계량 분석(morphometric analysis)의 결과는, MOE가 농도의존적으로 신경돌기 생성 촉진(neurite outgrowth promoting activity; NOPA) 효과를 나타냄을 보여준다. 데이터는 평균±SEM(n=20개의 개개의 신경세포)을 나타낸다. 통계적 의의는 비히클(대조군)과 비교하였다: *p < 0.05, **p < 0.01 및 ***p < 0.001 (ANOVA).
도 2. 신경세포 생존률에 미치는 MOE의 영향. 태령 19일(E19)인 흰쥐의 해마 신경세포를 폴리-DL-라이신으로 피복된 커버스립에서 표시한 농도의 MOE 혹은 비히클(DMSO, <0.5%)이 들어간 배지 속에서 7일간 배양하였다. 신경세포의 생존율을 트립판 블루 배척(trypan blue exclusion) 및 젖산탈수소효소(LDH) 활성 측정법으로 조사하였다.
A, 전형적인 트립판 블루 염색 사진. 화살표는 죽은 세포를 가르킨다. 크기막대, 40μm (모든 사진에 적용됨).
B, 신경세포 생존율을 총 세포수(생존+사망 세포)에 대한 생존 세포(비염색 세포)의 비율로 나타내었다. 대조군(비히클) 배양을 100%로 보정하였다. 막대 그래프는 평균±SEM(n= 3)을 나타내고, 통계학적 유의성은 비히클과 비교하였다. **p < 0.01, # p < 0.05, 및 ## p < 0.01 (ANOVA).
도 3. 신경세포의 초기 발달에 미치는 MOE의 영향. 태령 19일인 흰쥐의 해마 신경세포를 폴리-DL-라이신으로 피복된 커버슬립 위에 도 2와 같은 조건으로 24시간 배양하고 DiO로 염색하였다.
A, 다양한 발달 단계를 보여주는 형광 현미경 사진. 아래 왼쪽 패널: 발달 제1 단계[라멜리포디아(lamellipodia) 단계], 제2 단계(작은 돌기 단계 minor process stage), 제1.5 단계(1 내지 2 전이 단계, 부채 모양의 돌기); 아래 오른쪽 패널: 단극세포(unipolar), 두극세포(bipolar) 및 다극세포(multipolar neuron)의 대표적인 사진. 크기 막대; 위 패널, 80μm(모든 사진에 적용됨); 아래 패널, 40μm (모든 사진에 적용됨).
B, 배양 24시간 후 단극(unipolar), 두극(bipolar) 및 다극(multipolar neuron) 발달 단계에 있는 신경세포의 비율(%). 400 내지 500개의 신경 세포가 분석되었다.
도 4. 해마 신경세포의 가지돌기 형태생성(morphogenesis)에 미치는 MOE의 영향.
해마 신경세포들을 폴리-DL-라이신 피복된 커버슬립 위에 도 2와 같은 방법으로 3 내지 5일 동안 배양하였다. 신경세포들을 고정하고 안키린 G(적색) 및 α-투불린(녹색) 항체로 이중 염색하였다. 안키린 G는 축삭 시작 부위(axon initial segment, AIS; 화살표)에 많이 모여 있는 것이 특징이다.
A, 전형적인 배양(DIV) 3 및 5일째의 신경세포의 사진. 크기막대 40μm. (모든 사진에 적용됨).
B, 가지돌기 발달의 형태계량 분석(morphometric analysis). DIV 3 및 DIV 5 신경세포의 일차 가지돌기의 수(a), 일차 가지돌기의 총 길이(total length of primary dendtrites, TLPD; b), 1차, 2차 및 3차 가지돌기의 가지 수(c) 및 가지돌기 분지의 총 길이(total length of dendritic branches, TLDB; d)를 계측하였다. 통계학적 유의성은 비히클과 비교하였다: *p < 0.05, **p < 0.01, 및 ***p < 0.001 [스튜던츠 t-시험(Student's t test)]. 막대 그래프는 평균±SEM (n = 15)를 나타낸다.
C, 숄(Sholl) 분석. DIV 5 신경세포의 가지돌기 교차점(a) 및 분지점(b). 데이터는 평균±SEM (n = 15)을 나타낸다.
도 5. 해마 신경세포의 축삭 발달에 미치는 MOE의 영향. 도 4A와 같은 조건으로 배양한 신경세포들을 이용하여 계측하였다.
A, 축삭 발달의 형태계량 분석; 축삭 축(axon shaft)의 길이(a), 축삭 곁가지 수(number of axonal collateral branch, ACB; b), 축삭 곁가지 총 길이(total length of axonal collateral branch, TLACB; c). 통계학적 유의성은 비히클과 비교하였다: *p < 0.05, **p < 0.01, 및 ***p < 0.001 (스튜던츠 t-시험). 막대그래프는 평균±SEM (n = 15)를 나타낸다.
B, 숄 분석을 보여주는 대표적인 신경세포 이미지.
C, 숄 분석. 축삭 교차점 수(a), 축삭 곁가지 분지점 수(number of axonal collateral branch points, ACBP; b). 데이터 점은 평균±SEM (n = 15)를 나타낸다.
도 6. 해마 신경세포의 연접(synapse) 생성에 미치는 MOE의 영향.
해마 신경세포들을 도 2과 같은 조건으로 10일간 배양하였다. 신경세포들을 고정하고 PSD-95(적색, 연접후 표지자) 및 SV2(녹색, 연접전 표지자) 항체로 이중염색하였다.
A, 연접을 보여주는 전형적인 형광 현미경 사진. PSD-95, SV2 클러스터 및 연접 반점의 예를 MOE 세포 사진의 삽입도에 화살표로 표시하였다. 각각의 반점들을 확대하여 삽입도에 나타내었다. 크기막대, 10μm, (모든 사진에 적용됨); 삽입도, 1.5μm.
B, 통계. PSD-95 및 SV2 클러스터의 수(a) 및 연접의 수(b). 통계적 의의는 비히클(대조군)과 비교하였다. ***p < 0.001 (스튜던츠 t-시험). 막대 그래프는 평균±SEM을 나타낸다.
도 7. β-카로텐의 신경세포 돌기성장 촉진 효능. 해마 신경세포를 비히클(DMSO) 또는 β-카로텐이 포함된 배지 속에서 도 1과 같은 조건으로 3일 동안 배양하였다. 일차 가지돌기 수(a), 일차 가지돌기 총 길이(TLPN; b), 및 분지점(c)을 계측하였다. 통계적 의의는 비히클(대조군)과 비교하였다. *p < 0.05; **p < 0.01; 및 ***p < 0.001 (ANOVA). 데이터는 평균±SEM (n =15 내지 20)을 나타낸다.Figure 1. Determination of optimal concentration of moringa ethanol extract (MOE) for nerve cell growth promotion.
The hippocampal neurons of embryonic day 19 (E19) were cultured for 3 days in a medium containing MOE or vehicle (DMSO, <0.5%) at the indicated concentrations on poly-DL-lysine coated coverslips.
A, Representative phase contrast microscope photograph. Size bar, 80μm (applies to all pictures).
Morphometric analysis, such as B, number of primary neurites (a), total length of primary neurites (TLPN; b) and branching point (c) ) Show that MOE has a neurite outgrowth promoting activity (NOPA) effect in a concentration-dependent manner. Data represent mean ± SEM (n = 20 individual neurons). Statistical significance was compared with vehicle (control): * p <0.05, ** p <0.01 and *** p <0.001 (ANOVA).
Figure 2. Effect of MOE on neuronal survival. The hippocampal neurons of embryonic day 19 (E19) were cultured for 7 days in medium containing MOE or vehicle (DMSO, <0.5%) at the indicated concentrations in poly-DL-lysine coated coverslips. Survival of neurons was examined by trypan blue exclusion and lactate dehydrogenase (LDH) activity assay.
A, typical trippen blue dyed photograph. Arrows point to dead cells. Size bar, 40μm (applies to all pictures).
B, neuronal cell viability was expressed as the ratio of viable cells (non-stained cells) to total cell number (survival + death cells). The control (vehicle) culture was calibrated to 100%. The bar graphs represent the mean ± SEM (n = 3) and statistical significance was compared to the vehicle. ** p <0.01, # p <0.05, and ## p <0.01 (ANOVA).
Figure 3. Effect of MOE on early development of nerve cells. The hippocampal neurons of 19-day-old rats were cultured on poly-DL-lysine coated coverslips for 24 hours under the same conditions as in FIG. 2 and stained with Dio.
A, A fluorescence microscope photograph showing various developmental stages. Lower left panel: developmental first stage [lamellipodia stage], second stage (minor process stage), stage 1.5 (1 to 2 transition stages, fan-shaped protrusions); Below right panel: Typical photographs of unipolar, bipolar and multipolar neurons. Size bar; Upper panel, 80μm (applies to all pictures); Lower panel, 40μm (applies to all pictures).
B, percentage of neurons in unipolar, bipolar and multipolar neuron development at 24 hours post culture. 400 to 500 nerve cells were analyzed.
Figure 4. Effect of MOE on morphogenesis of hippocampal neurons.
Hippocampal neurons were cultured on poly-DL-lysine coated coverslips for 3 to 5 days in the same manner as in Fig. The neurons were fixed and double stained with anthraquine G (red) and α-tobuulin (green) antibodies. Ankyrin G is characterized by a large number of axon initial segments (arrows).
A, typical culture (DIV) Photographs of nerve cells on days 3 and 5. Size bar 40μm. (Applies to all photos).
B, morphometric analysis of dendritic development. The number of primary dendrites (a), total length of primary dendrites (TLPD; b), number of primary, secondary and tertiary dendrites (c ) And total length of dendritic branches (TLDB; d) were measured. Statistical significance was compared to vehicle: * p <0.05, ** p <0.01, and *** p <0.001 [Student's t test]. The bar graph represents the mean ± SEM (n = 15).
C, Sholl analysis. DIV 5 Dendritic crossing point (a) and branching point (b) of nerve cell. Data represent the mean ± SEM (n = 15).
Figure 5. Effect of MOE on axonal development of hippocampal neurons. The neurons cultured under the conditions shown in FIG. 4A were measured.
A, Morphometric analysis of axonal development; The length of the axon shaft (a), the number of axonal collateral branches (ACB), and the total length of the axonal collateral branch (TLACB; c). Statistical significance was compared to vehicle: * p <0.05, ** p <0.01, and *** p <0.001 (Student's t-test). The bar graph represents the mean ± SEM (n = 15).
B, a typical nerve cell image showing shawl analysis.
C, shawl analysis. Number of axonal intersections (a), number of axonal collateral branch points (ACBP; b). Data points represent the mean ± SEM (n = 15).
Figure 6. Effect of MOE on synapse formation in hippocampal neurons.
The hippocampal neurons were cultured for 10 days under the conditions shown in Fig. Neurons were fixed and double stained with PSD-95 (red, post-synaptic marker) and SV2 (green, pre-synaptic marker) antibodies.
A, Typical fluorescence microscope photograph showing synapse. Examples of PSD-95, SV2 clusters and concordant spots were indicated by arrows in the inset of MOE cell photographs. Each spot is magnified and shown in the inset. Size bar, 10μm, (applies to all pictures); Insertion degree is 1.5 μm.
B, statistics. Number of PSD-95 and SV2 clusters (a) and number of concatenations (b). Statistical significance was compared with vehicle (control). *** p < 0.001 (Student's t-test). The bar graph represents the mean ± SEM.
Fig. 7. Effect of β-carotene on nerve cell protrusion growth. Hippocampal neurons were cultured for 3 days under the same conditions as in Fig. 1 in a medium containing vehicle (DMSO) or? -Carotene. The number of primary dendrite (a), total length of primary dendrite (TLPN; b), and branch point (c) were measured. Statistical significance was compared with vehicle (control). * p < 0.05; ** p &lt; 0.01; And *** p &lt; 0.001 (ANOVA). The data represent the mean ± SEM (n = 15-20).

신경 영양인자는 신경세포 발달 뿐 아니라 신경변성 질환에서 성숙한 신경세포의 위축을 방지하기 위해서 필수적으로 필요하다. 본 출원인은 랫트 해마 신경세포를 발달시키는데 있어서 모링가의 에탄올 추출물(MOE)이 강력한 신경돌기 생성 및 길이성장 촉진 활성과 연접 생성 활성을 나타냄을 검증하였다. 또한 모링가에 많이 포함되어 있는 β-카로텐이 이러한 효능이 있음을 검증하였다. 이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
Neurotrophic factors are indispensable to prevent neuronal development as well as neuronal degeneration in mature neurons. The Applicant has verified that the ethanol extract (MOE) of Moringa exhibits strong neurite outgrowth and length growth promoting activity and synergistic production activity in developing rat hippocampal neurons. In addition, β-carotene, which is abundant in Moringa, proved to be effective. Hereinafter, the present invention will be described in detail.

물질 및 방법Materials and methods

모링가 시료의 수집 및 가공Collection and processing of Moringa samples

모링가 올레이페라의 잎은 미얀마(Myanmar)에서 수집하였다. 바우처(Voucher) 시료는 홍용기 박사의 실험실(부경대, 한국 부산 소재)에 기탁하였다. 시료를 상온에서 건조시키고, 분쇄기(HMF-340, 제조원: 한국 서울 소재의 Hanil Co.,)로 분쇄하고 밀봉된 시료봉지 속에 -20℃에서 암실 조건하에 추가의 시험을 위해 저장하였다.
Moringa oleifera leaves were collected from Myanmar. Voucher samples were deposited in Dr. Hong's laboratory (Pukyong National University, Busan, Korea). The samples were dried at room temperature and crushed with a grinder (HMF-340, Hanil Co., Seoul, Korea) and stored in a sealed sample bag at -20 캜 under dark conditions for further testing.

모링가 에탄올 추출물(MOE)의 제조Preparation of moringa ethanol extract (MOE)

모링가 시료 분말을 삼각 플라스크를 사용하여 95% 에탄올을 50:1(v/w)로 넣고 암실하, 상온에서 200 rpm으로 24시간 진탕하였다[orbital shaker (VS-202D, 제조원: 한국 서울 소재의 Vision Scientific Co. Ltd.]. 진탕이 완료된 후 슬러리를 10,000 rpm (17,888g; Sorvall T6000D benchtop centrifuge)으로 원심분리하고, 상등액을 멸균 솜으로 걸렀다. 걸러진 액을 감압하에 농축시키고 질소 가스로 완전히 건조시켰다. 건조한 에탄올 추출물을 디메틸 설폭사이드(DMSO) 속에 녹여 소량으로 분주하여 -20℃에서 보관하고, 실험에 사용하였다.
The moringa sample powder was shaken in a dark room at 200 rpm at 200 rpm for 24 hours in a dark room with 95% ethanol using an Erlenmeyer flask [orbital shaker (VS-202D, manufacturer: After shaking, the slurry was centrifuged at 10,000 rpm (17,888 g; Sorvall T6000D benchtop centrifuge) and the supernatant was sieved with sterile cotton. The filtrate was concentrated under reduced pressure and completely dried with nitrogen gas The dried ethanol extract was dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO) and dispensed in small quantities, stored at -20 ° C, and used in the experiment.

β-카로텐의 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) Analysis of β-Carotene

β-카로텐 표준 시료(제조원: 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 Sigma)를 n-헥산 속에서 0 내지 0.1 mg/mL의 농도로 제조하고, 정량을 위하여 표준 측정 곡선을 그렸다. MOE를 50 mg/mL의 농도로 메탄올 속에 녹이고 50마이크로리터를 semiprep-C18 역상 HPLC 컬럼에 주입하였다. HPLC의 이동상(mobile phase)은 아세토니트릴:디클로로메탄:메탄올(70:20:10, v/v)을 사용하였으며, 2 mL/분의 속도로 등용매 유동(isocratic flow)을 유지하였다. 452 nm에서 UV 흡광도를 측정하고 표준곡선과 비교하여 β-카로텐을 정량하였다.
A .beta.-carotene standard sample (Sigma, St. Louis, Mo.) was prepared at a concentration of 0 to 0.1 mg / mL in n-hexane and a standard curve was drawn for quantification. MOE was dissolved in methanol at a concentration of 50 mg / mL and 50 microliters were injected into the semiprep-C18 reverse phase HPLC column. The mobile phase of HPLC was acetonitrile: dichloromethane: methanol (70:20:10, v / v) and maintained isocratic flow at a rate of 2 mL / min. The UV absorbance at 452 nm was measured and β-carotene was quantified by comparison with a standard curve.

일차 해마 신경세포의 배양 및 추출물 처리Cultivation and extraction of primary hippocampal neurons

세포 배양에 필요한 시약들은, 특별한 언급이 없는 한, 인비트론사(Invitrogen: 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)의 제품을 사용하였다. 임신중인 랫트[스플라그-다울리(Sprague-dawley)]를 임신 13일째에 주문하여 12/12시간의 암실 주기 및 사료와 물에 자유로이 접근할 수 있도록 한 우리에 조절된 온도로 가두었다. 실험은 동국대학교 실험동물 윤리위원회에 의해 승인되었다. 임신 18일째에, 임신한 랫트를 이소플루오란으로 마취시키고 태아를 수집하였다. 이후에 태아 해마를 뇌로부터 해부하고 신경세포 배양물을 앞서 보고된 바와 같이(참조: Brewer at el., 1993; 및 Goslin et al., 1998) 제조하였다.Reagents required for cell culture were obtained from Invitrogen (Carlsbad, Calif., USA) unless otherwise noted. The pregnant rats (Sprague-dawley) were ordered on the 13th day of pregnancy and confined to a controlled temperature of 12/12 hr dark cycle and free access to feed and water. The experiment was approved by Dongguk University Laboratory Animal Ethics Committee. On day 18 of pregnancy, pregnant rats were anesthetized with isoflurane and fetuses were collected. The fetal hippocampus was then dissected from the brain and neuronal cultures were prepared as previously reported (Brewer et al., 1993; and Goslin et al., 1998).

요약하면, 해부된 해마를 행크스 균형 염 용액(Hanks balanced salt solution: HBSS) 속에 수집하고, 조직을 HBSS 속에서 0.25%(w/v) 트립신으로 12분 동안 37℃에서 분해함으로써 해리시키고 불로 처리하여 등급화된 파스퇴르 피펫으로 연마하였다. 해리된 세포를 혈구계로 계수하고, 1.0x104 내지 2.0 x 104개의 세포/cm2의 밀도로 24-웰 배양 플레이트 속에서 폴리-DL-라이신(PDL)(제조원: 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 Sigma-Aldrich)으로 피복된 직경 12mm의 유리 커버슬립 위에 접종(플레이팅)하였다. 배양물을 B27 첨가물을 넣은, 혈청이 없는 뉴로베이잘 속에 유지하고 37℃에서 5% CO2/95% 공기 하에 배양하였다. MOE 또는 비히클[DMSO, 최종 농도 <1.0%(v/v)]을 세포 접종 전에 배지에 가하였다. 정상 대조군(배지만) 및 비히클 대조군(배지와 DMSO)을 시험 시료로 처리한 것과 항상 비교하였다.
Briefly, the dissected hippocampi were harvested in Hanks balanced salt solution (HBSS) and the tissue dissociated by dissolution at 37 [deg.] C with 0.25% (w / v) trypsin in HBSS for 12 min, And ground with a graded Pasteur pipette. The dissociated cell counts to Step blood cells, and in a 24-well culture plate in a density of 1.0x10 4 to 2.0 x 10 4 cells / cm 2 -DL- poly-lysine (PDL) (a product of American St. Louis, MO Sigma-Aldrich) on a 12 mm diameter glass cover slip. The cultures were maintained in serum-free neurobasic well with B27 additive and incubated at 37 ° C in 5% CO 2 /95% air. MOE or vehicle [DMSO, final concentration < 1.0% (v / v)] was added to the medium before cell inoculation. It is always compared to that of normal control (embryo) and vehicle control (medium and DMSO) treated with test samples.

면역세포 화학 염색Immunocytochemical staining

면역 염색을 위하여, 커버슬립 위에 배양한 세포를 파라포름알데하이드/메탄올 고정 과정(참조: Moon et al., 2007)으로 고정시켰다. 제1 항체를 넣고 4℃에서 16 내지 18시간 처리한 후, 이어서 제2 항체[Alexa Fluor 488-접합된 염소 항-마우스 IgG(1:1000) 및 Alexa Fluor 568-접합된 당나귀 항-토끼 IgG(1:1000), 제조원: Molecular Probes]를 넣고 상온에서 1시간 더 처리한 후, 기술된 바와 같이(참조: Moon et., 2007) 마운팅하고 형광현미경으로 관찰하였다. 사용한 제1 항체의 정보와 희석 배율은 다음과 같다: 투불린 알파-아단위(마우스 모노클로날 12G10, 1:1000 희석) 및 연접소포(SV2; 마우스 모노클로날, 1:1000 희석)[공급자: 미국 아이오와대(University of Iowa)의 Developmental Studies Hybridoma Bank], 안키린 G(토끼 모노클로날 h-215, 1:50 희석; 제조원: Santa Cruz Biotechnology Inc.), 연접이후치밀질(postsynaptic density)-95(PSD-95; 토끼 폴리클로날, 1:1000; 제조원: 미국 소재의 Upstate Biotechnology Inc.).
For immunostaining, cells cultured on cover slips were fixed with paraformaldehyde / methanol fixation (see Moon et al., 2007). After incubation of the first antibody at 4 ° C for 16-18 hours, the second antibody (Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (1: 1000) and Alexa Fluor 568-conjugated donkey anti-rabbit IgG 1: 1000), manufactured by Molecular Probes] was added and further treated at room temperature for 1 hour, and then mounted as described (Moon et., 2007) and observed with a fluorescence microscope. The information and dilution magnification of the first antibody used were as follows: Tumor cells (mouse monoclonal 12G10, 1: 1000 dilution) and synaptic vesicles (SV2; mouse monoclonal, 1: 1000 dilution) (Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, USA), Ankyrin G (rabbit monoclonal h-215, 1:50 dilution; Santa Cruz Biotechnology Inc.), postsynaptic density -95 (PSD-95; rabbit polyclonal, 1: 1000; manufactured by Upstate Biotechnology Inc., USA).

영상 획득Image acquisition

나타낸 시간에 커버슬립 위의 신경세포를 둘베코 인산염 완충 염수(Dulbeccos phosphate buffered saline: D-PBS, 제조원: Invitrogen)로 간단히 세척하고 일련의 파라포름알데하이드/메탄올 고정 과정(참조: Moon et al., 2007)에 의해 고정시켰다. I3 S, N2.1 S 및 Y5 여과기 시스템이 장착된 현미경 DM IRE2(제조원: 독일 베츨러 소재의 Leica Microsystems AG)를 사용하여 위상차 및 형광영상(1,388 x 1,039 픽셀)을 고 해상 CoolSNAP CCD 카메라(Photometrics Inc., 미국 아리조나 투손(Tucson) 소재)로 Leica FW4000 소프트웨어를 사용하는 컴퓨터의 제어하에 획득하였다.
At the indicated times, the neurons on the coverslip were briefly washed with Dulbeccos phosphate buffered saline (D-PBS, Invitrogen) and subjected to a series of paraformaldehyde / methanol fixation procedures (Moon et al. 2007). The phase difference and fluorescence images (1,388 x 1,039 pixels) were analyzed using a high resolution CoolSNAP CCD camera (Photometrics) using DM IRE2 (Leica Microsystems AG, Wetzlar, Germany) equipped with a I3 S, N2.1 S and Y5 filter system. Inc., Tucson, Arizona, USA) under the control of a computer using the Leica FW4000 software.

트리판블루 배제(Trypan blue exclusion) 방법을 이용한 세포 생존율 측정Cell viability measurement using Trypan blue exclusion method

총 생존 세포수는 트리판 블루 배재법(trypan blue exclusion)을 사용하여 혈구계로 측정하였다
Total viable cell counts were measured in the hemocytometer using trypan blue exclusion

젖산탈수소효소(lactate dehydrogenase, LDH) 활성을 이용한 세포 생존율 측정Measurement of cell viability using lactate dehydrogenase (LDH) activity

해마 신경세포를 비히클 또는 MOE(7.5 ~ 60 g/mL)가 포함된 배지에서 배양하였다. 배양 6일째에 세포 손상으로 배지에 유리된 LDH를 CytoTox96 비방사활성 검정(nonradioactive assay)(제조원: 미국 위스콘신 매디슨 소재의 Promega)를 사용하여 계수하였다.Hippocampal neurons were cultured in medium containing vehicle or MOE (7.5-60 g / mL). At 6 days of culture, LDH released in the medium due to cell damage was counted using the CytoTox 96 nonradioactive assay (Promega, Madison, Wis.).

DiO 형광 염색DiO fluorescent staining

배양 3일째 Vybrant DiO(제조원: Molecular Probes, Invitrogen)를 사용하여 신경세포를 염색하였다.
On the third day of culture, neurons were stained with Vybrant DiO (Molecular Probes, Invitrogen).

영상 분석 및 정량화Image analysis and quantification

형태 분석 및 정량화를 단일 신경돌기 트레이서 플러그-인(simple neurite tracer plug-in: National Institute of Health, USA) 및 숄 플러그-인(Sholl plug-in)(참조: http://biology.ucsd.edu/labs/ghosh/software)을 사용하여 영상 J(Image J 버젼 1.45) 소프트웨어로 수행하였다. 일차 신경돌기(세포체로부터 직접 기원한 신경돌기)의 수, 일차 신경돌기의 총 길이(TLPN; 일차 신경돌기의 길이의 합) 및 축삭 길이와 같은 형태 계측을 하였다. 가지돌기 분지 및 축삭 곁가지 차수(order)를 또한 분석하였다. 일차 분지는 일차 신경돌기로부터 기원한 것들이며; 이차 및 삼차 분지는 일차 및 이차 분지 각각으로부터 기원한 것들이다. 축삭 및 가지돌기 나무의 가지상 정도를 평가하기 위하여, 본 출원인은 숄 분석(Sholl analysis)(참조: Sholl, 1953)을 사용하였다. 가지돌기 또는 축삭 교차는, 가지돌기, 축삭 또는 이들의 분지/2차 분지가 숄 동심원을 교차하는 지점이다. 연속적인 동심원 사이, 즉 각각의 연속적인 10μm의 방사상 원내에서 분지 점 및 분지 끝(tip)의 수를 계수하였다. 인접한 신경세포와 가지가 서로 섞이지 않는 신경세포(최저 30개의 세포)를 선택하여 분석하였다. 상이한 발달 단계(참조: Dotti et al., 1988)에 있는 신경세포를 획득한 영상에서 계수하였다. 또한, 단극, 두극 또는 다극 특징에 이른 세포를 계수하였다. 연접(synapse) 형성을 조사하기 위하여 50μm의 가지돌기에 있는 PSD-95 및 SV2의 반점(puncta)을 반점 분석기 플러그-인(puncta analyzer plug-in) (참조: Ippolito & Eroglu, 2010)을 이용하여 계수하였다. 본 연구에서, 배지에 아무 것도 첨가하지 않은 정상 대조군과 비히클[DMSO, 1.0%(v/v) 이하] 대조군의 신경세포는 매우 유사한 성장 패턴을 나타내었다. 따라서, 본 출원인은 형태 계측 분석 동안 추출물-처리된 배양물을 비히클 대조군과 항상 비교하였다.
Morphology analysis and quantification were performed using a single neurite tracer plug-in (National Institute of Health, USA) and a Sholl plug-in (see http://biology.ucsd.edu / labs / ghosh / software) using Image J (Image J version 1.45) software. The morphometric measurements such as the number of primary neurites (neurons originating directly from the cell body), the total length of primary neurites (TLPN; sum of lengths of primary neurites) and axon length were measured. Branching bifurcation and axon branch order were also analyzed. The primary branch originates from the primary neurite; The secondary and tertiary basins are those originating from the primary and secondary basins, respectively. To evaluate the branching degree of axon and dendritic trees, Applicants used Sholl analysis (Sholl, 1953). The dendritic or axonal crossover is the point at which the dendrites, axons, or branch / second branches of them intersect the concentric circle of the shawl. The number of branch points and branch tips was counted in successive concentric circles, i.e. in each successive 10 [mu] m radial circle. Neurons (at least 30 cells) that do not mix with adjacent neurons were selected and analyzed. Neurons in different developmental stages (see Dotti et al., 1988) were counted in acquired images. Cells with unipolar, bipolar or multi-pole characteristics were also counted. To investigate synapse formation, the puncta of PSD-95 and SV2 in a 50-μm bump were analyzed using a puncta analyzer plug-in (Ippolito & Eroglu, 2010) Respectively. In this study, the neurons of the control group with no additions to the medium and with the vehicle [DMSO, 1.0% (v / v) or less] showed very similar growth patterns. Thus, Applicants have always compared extract-treated cultures with vehicle controls during morphometric analysis.

데이터 분석Data Analysis

유의적인 통계학적 차이(p < 0.05)를 SPSS 소프트웨어(버젼 16.0)로 포스트 훅 둔칸 다중 비교(post hoc Duncan multiple comparison)로 변이의 단일-방식 분석(one-way analysis)을 사용하여 분석하였다.Significant statistical differences (p <0.05) were analyzed using post-hoc Duncan multiple comparison with one-way analysis of variance with SPSS software (version 16.0).

모든 데이터는 최소 3번의 독립된 실험으로 얻었으며 평균±SEM로 나타내었다. 통계적 비교는 스튜던츠 t-시험, 카이-자승 검증(chi-square tests)(x2) 및 포스트 훅 둔칸 다중 비교로 변이의 단일-방식 분석(one-way analysis)을 사용하여 분석하였다. 유의적인 통계학적 차이(p < 0.05)를 SPSS 소프트웨어(버젼 16.0)로 시행하였다.
All data were obtained at least 3 independent experiments and expressed as mean ± SEM. Statistical comparisons were performed using one-way analysis of variance with the Student's t-test, chi-square tests (x2) and post-hook haze multiple comparison. Significant statistical differences (p <0.05) were analyzed using SPSS software (version 16.0).

신경돌기 생성 촉진 효과(neurite outgrowth promoting activity, NOPA)와 길이성장(lengthening) 활성을 위한 MOE의 최적 농도Optimal concentration of MOE for neurite outgrowth promoting activity (NOPA) and lengthening activity

NOPA와 길이성장 활성에 대한 MOE의 농도 의존성을 평가하기 위하여, 본 출원인은 해마 신경세포 배양물에 1 내지 60㎍/mL 범위의 MOE를 가하였다. 3일 (DIV 3) 동안 성장시킨 배양물의 대표적인 위상차 현미경 상을 도 1A에 나타내었다. 1차 신경돌기의 수 및 총 길이(TLPN), 및 분지수와 같은 성장 지수는 MOE-처리된 배지에서 배양시킨 신경세포에서 농도-의존적으로 증가하였으며 30㎍/mL에서 최대에 이르렀다(도 1B). 따라서, MOE를 다음 시험부터는 30㎍/mL로 첨가하였다.
To assess the concentration dependence of MOE on NOPA and length growth activity, Applicants applied MOE in hippocampal neuron cultures ranging from 1 to 60 μg / mL. Representative phase contrast microscope images of the cultures grown for 3 days (DIV 3) are shown in Figure 1A. Growth indices such as the number and total length of primary neurite (TLPN), and branching index increased in a concentration-dependent manner in neurons cultured in MOE-treated medium and reached a maximum at 30 μg / mL (FIG. 1B) . Thus, MOE was added at 30 μg / mL from the next test.

MOE의 세포사 방지효능Anti-apoptosis of MOE

트리판 블루 배제(trypan blue exclusion) 및 LDH 활성측정 방법으로 배양 7일째 생존 세포를 조사한 결과 30㎍/mL의 농도까지 MOE는 세포독성이 없었으며 오히려 세포생존율을 증가시켰다(도 2).
As a result of trypan blue exclusion and LDH activity assay, MOE was not cytotoxic to the concentration of 30 μg / mL on the 7th day of culture but rather increased cell viability (FIG. 2).

MOE의 신경세포 분화촉진 효능Promoting neuronal differentiation of MOE

1) 신경돌기 생성 촉진 활성(neurite outgrowth promoting activity, NOPA) 활성1) neurite outgrowth promoting activity (NOPA) activity

배아 신경세포(embryonic neuron)들을 생체에서 분리하여(흰쥐의 경우 보통 태령 18-19일) PDL 피복된 커버스립에 배양하면 기질에 부착함과 거의 동시에 부채 모양의 라멜리포디아를 내고(발달 제1 단계), 12시간 정도 후에는 몇 개의 작은 돌기(small processes 또는 small neurites)들이 생성된다(발달 제2 단계). 이렇게 생성된 돌기 가운데 하나가 급격히 자라기 시작하여 축삭(axon)이 되고(발달 제3 단계), 그 후에 나머지 돌기들이 자라기 시작하여 가지돌기(dendrite)가 된다(발달 제4 단계). 이어서 축삭과 가지돌기는 많은 분지(가지치기 branching)를 하게 되고, 특히 가지돌기들은 수많은 분지를 하여 복잡한 형태의 가지돌기나무(dendritic tree)를 형성하는 성숙단계(발달 제5 단계)에 들어간다. 따라서 신경세포의 성숙 촉진은 신경세포 발달 초기(발달 제1 및 제2 단계)에 세포체로부터 새로운 돌기가 싹트는 신경돌기 생성 촉진 활성(neurite outgrowth promoting activity, NOPA)과, 발달 제3 내지 제5 단계에서 신경돌기(가지돌기 및 축삭)들의 길이가 길어지고 분지가 생성되는 신경돌기 성장 촉진활성(neurite growth promoting activity; NGPA)으로 나누어 볼 수 있다(도 3A).Embryonic neurons were isolated from the body (usually 18-19 days of age in rats) and cultured on a PDL-covered cover slip, attaching to the substrate and leaving a fan-shaped lamellipodia at approximately the same time Stage 1), and after 12 hours several small processes or small neurites are produced (stage 2 of development). One of the protrusions thus formed starts to grow rapidly, becoming an axon (development phase 3), and then the other protrusions begin to grow to become a dendrite (development phase 4). The axons and branches then undergo branching. In particular, the dendrites enter the maturation phase (development phase 5), which forms a complex dendritic tree with numerous branches. Thus, the promotion of maturation of neurons is accompanied by neurite outgrowth promoting activity (NOPA), which is a neurite outgrowth promoting activity (NOPA) that buds from the cell body in the early stage of neuronal development (developmental stages 1 and 2) Neurite growth promoting activity (NGPA) in which the length of neurites (dendrites and axons) is prolonged and branches are generated (Fig. 3A).

배양 24시간째에 MOE를 처리한 배양(도 3A; MOE)은 대조군에 비하여 발달 제2 단계(작은 돌기단계)로 들어간 세포가 60% 증가되었다(도 3B). 작은 돌기들이 발달한 정도를 조사한 결과, MOE를 처리한 배양물은 대조군(도 3A; Vehicle)에 비하여 3개 이상의 돌기를 갖는 다극 신경세포(multipolar neuron)로 분화한 세포가 약 30% 정도 증가하였다(도 3B). 이 결과는, MOE가 신경세포의 발달 초기에 세포체(soma)에서 신경돌기가 생성되는(neurite outgrowth) 것을 촉진(즉, NOPA 효능)하여 신경세포를 보다 이른 시간에 성숙시키는 효능이 있음을 증명한다.
At 24 hours after culture, MOE-treated culture (FIG. 3A; MOE) showed 60% increase in cells entering the developmental second stage (small prominence stage) compared to the control (FIG. 3B). As a result of examining the degree of development of small protrusions, the culture treated with MOE showed about 30% increase in the number of multipolar neurons differentiated into 3 or more protrusions compared to the control (Fig. 3A; Vehicle) (Fig. 3B). These results demonstrate that MOE promotes neurite outgrowth in soma early in development of neurons (ie, NOPA efficacy) and thus has the potential to mature neurons at an earlier time .

2) 신경돌기 성장 촉진활성(neurite growth promoting activity; NGPA): MOE가 가지돌기(dendrite)의 복잡성(complexity)에 미치는 영향2) Neurite growth promoting activity (NGPA): The effect of MOE on the complexity of dendrite

가지돌기는 신경세포의 입력정보를 처리하여 통합하는 주된 부분으로서 신경회로의 기능성에 매우 중요하다. 가지돌기의 길이증가 뿐 아니라, 가지치기에 의한 가지돌기 복잡성의 증가는 신경세포의 기능성에 긍정적인 영향을 미친다. 배양한 뇌 신경세포 가지돌기의 길이 성장과 가지치기는 발달 제4 단계(가지돌기 생장)이며, 이는 대게 배양한지 3 내지 5일 사이에 일어난다. 따라서, 본 출원자들은 배양 초기(배양 3일 및 5일) 동안에 배양 신경세포의 가지치기 차수(branching order), 1차 가지돌기의 수 및 총 길이(total length of primary dendrite, TLPD)를 조사하였다. 가지돌기와 축삭을 구분하기 위하여, 신경세포를 안키린(ankyrine) G(적색)와 알파-투불린(녹색)으로 이중 면역염색하였다. 안키린 G는 축삭 시작 분절(axon initial segment, AIS)에 높은 밀도로 존재하며, 알파-투불린은 세포골격의 미세소관(microtubule)을 형성하는 단백질로 세포 전체에 분포한다. 대표적인 형광염색사진(도 4A)에서 보는 바와 같이, MOE는 일차 가지돌기 수를 약 30%(도 4B-a), 그리고 일차 가지돌기 총 길이(TLPD)를 약 90 내지 100%로 증가시켰다(도 4B-b). 이는, MOE가 가지돌기수 및 길이를 증가시키는 효능이 있음을 의미한다. MOE는 가지돌기의 일차 및 이차 가지치기(branching)도 상당히 증가시켰다(도. 4B-c). 이 기간 동안에 일부 세포들은 이미 삼차 가지까지 발달하기도 하였다(도 4B-c,d). MOE는 일차 및 이차 가지 총 길이도 유의적으로 증가시켰다(도 4B-d).The bifurcation is very important for the function of the neural circuit as a main part to process and integrate input information of the neuron. In addition to increasing the length of the bifurcation, increasing the bifurcation complexity by pruning has a positive effect on the functionality of the neuron. Growth and pruning of cultured cranial nerve cell dendrites are developmental stage 4 (dendritic growth), which usually occurs between 3 and 5 days after cultivation. Thus, we investigated the branching order, the number of primary dendrites, and the total length of primary dendrites (TLPD) of cultured neurons during the initial stage of culture (3 days and 5 days of culture). To distinguish the dendrites and axons, the neurons were double immunostained with ankyrine G (red) and alpha-tobulin (green). Ancillin G is present at high density in the axon initial segment (AIS), and alpha-tobulin is a protein that forms microtubules in the cytoskeleton and is distributed throughout the cell. 4A), MOE increased the number of primary dendrites by about 30% (Fig. 4B-a) and the total primary dendritic length (TLPD) by about 90 to 100% (Fig. 4B) 4B-b). This means that MOE has the effect of increasing the number of bumps and length. MOE also significantly increased the primary and secondary branching of the dendrites (Fig. 4B-c). During this period, some cells have already developed to the third branch (Fig. 4B-c, d). MOE also significantly increased the total length of the primary and secondary branches (Fig. 4B-d).

가지돌기나무(dendritic arborization)의 복잡성에 미치는 MOE의 영향을 알아보기 위하여, DIV 3 및 5 신경세포들을 숄(Sholl) 분석하였다. 숄 분석법은 세포체 중심을 중점으로 반지름을 증가시키면서 그린 동심원이 가지돌기와 교차하는 교차점 수를 계측하는 것이다. 교차점 뿐 아니라, 연속되는 두 동심원 사이에 위치하는 분지점(branching point)도 계측하였다. 대조군에 비하여 MOE는 가지돌기와 동심원의 교차점 수를 최대 72% 증가시켰으며(도 4C-a), 최장 110μm에까지 교차점이 있었다. 그러나 대조군 신경세포는, 세포 중심에서 60μm 이후에는 교차점이 없었다. 총 분지점 수도 최대 50% 증가시켰다. 대조군 신경세포는 세포 중심에서 40μm 이후에는 분지점이 없었으나, MOE를 처리한 신경세포는 70μm까지 분지점이 존재하였다(도 4C-b). 이 결과들을 종합하면, MOE가 가지돌기의 성숙(즉, 길이 성장 및 가지치기)을 촉진하는 효능이 있음을 증명한다.
To investigate the effect of MOE on the complexity of dendritic arborization, DIV 3 and 5 neurons were Sholl analyzed. The shawl method measures the number of intersections where the concentric circles intersect with the dendrites while increasing the radius centered on the cell body center. Branching points located between two successive concentric circles were measured as well as the intersection points. Compared with the control group, MOE increased the number of crossing points of dendrites and concentric circles by up to 72% (Fig. 4C-a), and there was a crossing point of up to 110μm. However, control neurons did not cross after 60 μm from the cell center. The total number of branches increased by up to 50%. Control neurons had no branch after 40 μm in the cell center, but neurons treated with MOE had branches up to 70 μm (FIG. 4C-b). Taken together, these results demonstrate that MOE has the potential to promote the maturation of dendritic processes (ie, length growth and pruning).

MOE가 축삭(axon) 발달에 미치는 영향Effects of MOE on axon development

가지돌기 뿐 아니라 축삭의 성장이 빠르고 곁가지(axon collateral branch, ACB)가 잘 쳐지는 것은 성장기 뇌의 발생과 성숙 후 뇌 손상의 회복 단계에서 신경회로의 형성과 재생에 긍정적으로 작용한다. 따라서, 축삭의 형태계측 지수(morphometric parameter)들을 측정하여 GAE가 축삭의 발달에 미치는 영향을 알아보았다. MOE는 축삭축(axonal shaft)의 길이를 대조군에 비하여 50% 증가시켰다(도 5A-a). 더구나 MOE 배지에서 자란 신경세포들의 1/4 정도가 삼차 ACB를 발달시켰다. 그러나 대조군 신경세포에서는 DIV 5까지 이런 삼차 곁가지가 생성되지 않았다. 축삭 곁가지 총 길이(total length of axonal collateral branches, TLACB) 역시 증가하였다(도 5A-c).The axon collateral branch (ACB), as well as the growth of the axon, as well as the growth of the axon, play a positive role in the formation and regeneration of the neural circuit in the developmental stage of the growing brain and the recovery of the brain damage after maturation. Therefore, morphometric parameters of axons were measured and the effect of GAE on axonal development was examined. MOE increased the length of the axonal shaft by 50% relative to the control (Fig. 5A-a). Furthermore, about a quarter of the neurons grown in the MOE medium developed tertiary ACB. However, in the control neurons, this side branch was not generated until DIV 5. The total length of axonal collateral branches (TLACB) also increased (Fig. 5A-c).

숄 분석을 해보면(도 5B), MOE가 축삭의 교차점 수(axon collateral branch point, ACBP)와 분지점 수(collateral branch point, ACBP)가 증가됨을 알 수 있다. MOE를 처리한 신경세포의 축삭 교차점 수는 대조군에 비하여 최고 147%(80μm의 동심원) 증가되었으며, 200μm의 동심원에 이르기까지 교차점이 존재하였다(도 5C-a). 반면, 대조군 신경세포들은 140μm의 동심원까지만 교차점이 존재하였다(도 5B-a). 또한, MOE는 곁가지 분지점을 154% 증가시켰다(도 5C-b). 이 결과는, MOE가 축삭의 길이 성장 및 곁가지치기를 촉진함을 증명한다.
Analysis of the shawl (FIG. 5B) shows that the MOE increases the axon collateral branch point (ACBP) and the collateral branch point (ACBP). The number of axon crossings of MOE-treated neurons increased up to 147% (80 袖 m concentric circle) compared to the control group, and there was a crossing point to the concentric circle of 200 탆 (Fig. 5C-a). On the contrary, control neurons were only crossed to a concentric circle of 140 m (Fig. 5B-a). In addition, the MOE increased the branch point by 154% (Fig. 5C-b). These results demonstrate that MOE promotes axon length growth and side chain stiffness.

MOE가 연접 생성(synaptogenesis)에 미치는 영향Effect of MOE on Synaptogenesis

연접(synapse)은, 두 신경세포가 만나는 접점으로, 연접의 생성은 신경회로의 생성을 의미하며, 이는 신경계통의 기능성을 증가시키는 중요한 요인으로 작용한다. 따라서, 본 출원자들은, MOE가 연접 생성에 어떠한 영향을 미치는지를 조사하였다. 연접의 생성은 신경세포 발달 제5 단계(성숙 단계)에서 일어나기 때문에 DIV 10 세포를 이용하였다. 세포를 연접후 단백질인 PSD-95와 연접전 단백질인 SV2로 이중염색하였다(도 6A). MOE는 가지돌기가시(PSD-95로 표지)를 대조군에 비하여 45%, 축삭말단(SV2로 표지)의 밀도를 대조군에 비하여 100%로 유의적으로 증가시켰다(도 6A-a). 또한, PSD-95와 SV2가 이웃하거나 공존하는 경우가 대조군에 비하여 115% 증가되었다. 이는, 연접의 전후구조가 만나 연접이 생성되었음을 의미하는 것으로, MOE가 연접 생성을 매우 촉진함을 증명한다(도 6B-b).
Synapse is the contact point between two nerve cells, and the generation of synapses means generation of neural circuits, which is an important factor in increasing the functionality of the nervous system. Thus, the present applicants investigated how MOE affects synaptogenesis. DIV 10 cells were used because synapse formation occurs in the fifth stage of nerve cell development (maturation stage). Cells were stained with PSD-95, a post-synaptic protein, and SV2, a pre-synaptic protein (Fig. 6A). MOE significantly increased the density of axon terminals (labeled with PSD-95) to 45% and axon terminals (labeled SV2) to 100% compared to the control (Fig. 6A-a). In addition, PSD-95 and SV2 neighbors or coexisted increased by 115% compared to the control group. This means that the posterior structure of the synapse is met and the synapse is generated, which proves that MOE greatly promotes synapse formation (Fig. 6B-b).

β-카로텐의 신경돌기 성장 효능Effect of β-carotene on neurite growth

β-카로텐은 MOE의 주요 구성 화합물이다. 모링가의 잎으로부터 MOE(95% 에탄올, v/v)의 수율은 12.77% (w/w)이었다. HPLC 정량을 하였을 때, β-카로텐의 함량은 1 그람의 건조된 MOE당 1.5242 mg이었다(3번 반복). 이는 건조된 모링가 잎의 분말 100 gram 당 β-카로텐이 7.62 mg 포함되어 있음을 의미한다. β-카로텐을 배지에 포함하였을 경우, 0 내지 60 ㎍/mL의 농도에서 신경돌기의 수와 길이 및 분지점 수가 농도의존적으로 유의하게 증가하였다(도 7). 이러한 증가정도는 MOE에 미치지는 못하였다. 따라서, 이 결과는, MOE에 포함된 β-카로텐이 신경성장 효능을 지니고 있음을 증명하지만, MOE에는 β-카로텐 외에 다른 유효물질이 있음을 암시한다.
β-Carotene is a major constituent of MOE. The yield of MOE (95% ethanol, v / v) from the leaves of Moringa was 12.77% (w / w). When HPLC quantitation was performed, the content of beta -carotene was 1.5242 mg per 1 gram of dried MOE (repeat 3 times). This means that 7.62 mg of β-carotene is contained per 100 grams of dried moringa leaf powder. When β-carotene was added to the medium, the number of the nerve processes, the length of the nerve processes, and the number of branch points were significantly increased in a concentration-dependent manner at a concentration of 0 to 60 μg / mL (FIG. 7). This increase did not reach MOE. Thus, this result demonstrates that beta-carotene contained in MOE has neurogenesis, but MOE implies that there are other active substances besides beta-carotene.

토의discussion

본 발명자들의 연구는, MOE가 배양한 해마 신경세포의 발달을 농도의존적으로 촉진함을 증명하였다. 또한, 최적 농도에서 MOE는 배양과정 동안 자연적으로 일어나는 세포사를 방지하는 효능이 있었다. 신경세포 성숙 효능은, 복수의 가지돌기를 갖는 다극 특성을 획득하는데 걸리는 시간이 단축됨에 의해 증명되었다. 가지돌기와 축삭의 성장촉진 효능은 길이, 가지치기, 총 가지 길이 등의 형태계측적 지표가 증가됨으로써 증명되었다. 또한 연접형성 촉진은, 연접말단과 연접후 가지돌기가시의 증가 및 인접/공존(co-localization)이 증가에 의해 증명되었다. 연접형성은 신경계 기능의 확립에 필요불가결하기 때문에, MOE는 퇴행성신경질환(neurodegenerative disease)에서 손상된 신경회로를 회복시킬 수 있다.The present inventors' studies have demonstrated that MOE promotes the development of cultured hippocampal neurons in a concentration-dependent manner. In addition, at optimal concentrations, MOE was effective in preventing cell death that occurs naturally during the incubation period. Neuronal maturation efficiency has been demonstrated by the shortened time to acquire multipolar properties with multiple bifurcations. The growth promoting effect of dendrites and axons was demonstrated by increasing morphometric indicators such as length, pruning, and total branch length. Promoting synaptogenesis has also been demonstrated by an increase in synaptic prickness and an increase in co-localization after synaptic terminals and synaptic connections. Because synaptic connections are indispensable for the establishment of neural function, MOE can restore damaged neuronal circuits in neurodegenerative disease.

세포사 방지 효능은, 항산화 기능을 갖는 아스코르브산, 플라보노이드, 페놀수지류, 및 카로테노이드 등이 MOE에 포함되어 있기 때문일 것이다(참조: Anwar et al., 2005; 및 Luqman et al., 2012). 본 발명자들은, MOE가 신경세포의 초기 발생단계 뿐 아니라 성숙 단계(연접생성 단계)에서도 성장 촉진 효능이 있음을 증명하였다.The anti-apoptotic effect may be due to the inclusion of ascorbic acid, flavonoids, phenolic resins, and carotenoids with antioxidant functions in MOE (Anwar et al., 2005; and Luqman et al., 2012). The present inventors have demonstrated that MOE has a growth promoting effect not only in the early developmental stage of neuron but also in the mature stage (synaptogenesis stage).

퇴행성 신경질환(neurodegenerative diseases)에서 신경망(neural network)은 신경돌기(neurite)의 퇴축에 의하여 손상된다(참조: Mu and Gage, 2011). 초기 발달 단계에서 생체내 신경 성장인자들은 축삭과 가지돌기를 성장시켜 신경망을 발달시킨다(참조: McAllister, 2000). 또한 신경 성장인자들은 퇴행성 뇌에서 축삭과 가지돌기를 성장시켜 손상된 신경망을 부분적으로 회복한다(참조: Teter and Ashford, 2000). 본 발명자들은 MOE가 축삭 및 가지돌기의 길이 성장 및 가지치기를 촉진하는 기능이 있으며, 더 나아가 연접형성을 촉진함을 증명하였다. 따라서, MOE는 퇴행성 신경질환에서 나타나는 신경망 손상의 회복에 중요한 재료를 제공할 수 있다.In neurodegenerative diseases, the neural network is damaged by the degeneration of neurites (Mu and Gage, 2011). In the early developmental stages, in vivo nerve growth factors develop axon and dendrites to develop neural networks (McAllister, 2000). Nerve growth factors also partially regenerate damaged neurons by growing axons and dendrites in the degenerative brain (Teter and Ashford, 2000). The present inventors have demonstrated that MOE has a function of promoting the growth and pruning of axons and dendrites, and further promotes synapse formation. Thus, MOE can provide important materials for the recovery of neural network damage in degenerative neurological diseases.

본 발명자들은, 모링가의 잎의 β-카로텐이 이러한 신경세포 성장인자로 작용할 수 있음을 구체적으로 증명하였다. 모링가의 잎에는 β-카로텐이 많이 포함되어 있음이 이미 잘 알려져 있다(참조: Nambiar and Seshadri, 1998; 및 Sengev et al., 2013). β-카로텐은, 신경발생 세포(neuroblast)인 BE(2)C의 신경돌기 생성과 성장을 촉진한다는 보고가 있었다(참조: Lee et al., 2013). 본 발명에서 보면 β-카로텐이, 신경세포 성장촉진 효능이 있지만 MOE보다는 약하였다. 이는 MOE에 β-카로텐 외에 다른 신경세포 성장인자가 있음을 시사한다. 모링가의 잎에는 β-카로텐 뿐 아니라, 루테인 및 β-시토스테롤이 포함되어 있다(참조: Lakshminarayana et al., 2005). 루테인은 백혈구계 세포인 골수 세포주 HL-60(참조: Gross et al., 1997)와 광수용 세포(photoreceptor cells, 참조: Chucair et al., 2007)를 분화시키는 효능이 있기 때문에, 이러한 물질들이 종합하여 신경세포의 성장 분화를 촉진한 것으로 해석된다. The present inventors have specifically demonstrated that? -Carotene of the leaves of Moringa can act as such a neuronal cell growth factor. It is well known that the leaves of Moringa contain many β-carotene (see Nambiar and Seshadri, 1998; and Sengev et al., 2013). β-carotene has been reported to promote neurite outgrowth and development of BE (2) C, a neuroblast (Lee et al., 2013). In the present invention, beta -carotene has the effect of promoting neuronal cell growth but is weaker than MOE. This suggests that there are other neuronal growth factors besides β-carotene in MOE. Moringa leaves contain not only β-carotene, but also lutein and β-sitosterol (see Lakshminarayana et al., 2005). Lutein has the potential to differentiate leukocyte-derived cell line HL-60 (Gross et al., 1997) and photoreceptor cells (Chucair et al., 2007) , Which is thought to promote the differentiation of neurons.

모링가의 잎에는 기억력증진 활성(nootropics activity)이 있으며(참조: Mohan et al., 2005), 항산화 활성이 있어 알츠하이머병 동물 모델에서 산화 스트레스를 감소시킨다(참조: Ganguly and Guha, 2008). 모링가의 잎은, 안정성이 입증되어 있으며(참조: Awodele et al., 2012; 및 Luqman et al., 2012), 독성이 보고된 바가 없기 때문에 신경계 건강과 복지에 유용하게 이용될 수 있다. Moringa leaves have nootropic activity (Mohan et al., 2005) and antioxidant activity, which reduces oxidative stress in Alzheimer's disease models (Ganguly and Guha, 2008). Moringa leaves have been proven to be stable (see Awodele et al., 2012; and Luqman et al., 2012) and can be usefully used for nervous system health and well-being since no toxicity has been reported.

이상, 본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구체적인 양태들을 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 이상에서 기술한 양태들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is evident that many alternatives, modifications and variations will be apparent to those skilled in the art. It will be understood that the invention may be practiced. Accordingly, it should be understood that the aspects described above are illustrative in all aspects and not restrictive.

Claims (3)

(a) 모링가 시료를 수집하는 단계;
(b) 수집한 모링가 시료를 세척하는 단계;
(c) 세척된 모링가 시료를 건조 및 분쇄하는 단계;
(d) 단계 (c)의 모링가 시료의 분말에 에탄올을 붓고 진탕시키는 단계;
(e) 진탕 후, 슬러리를 원심분리한 후, 상층액을 여과시키는 단계;
(f) 단계 (e)에서 수득된 여액을 진공하에 농축시키고 완전히 건조시키는 단계;
(g) 단계 (f)에서 건조된 모링가의 에탄올 추출물(MOE)을 칭량하는 단계;
(h) 칭량된 모링가의 에탄올 추출물(MOE)을 디메틸 설폭사이드(DMSO) 속에 용해시켜 분취량을 제조하는 단계;
(i) 일차 해마 신경세포(primary hippocampal neuron)를 배양하는 단계;
(j) 단계 (i)에서 배양한 해마 신경세포에 단계 (h)에서 수득한 MOE의 분취량을 처리하는 단계 및
(k) MOE의 신경세포의 신경돌기(가지돌기 및 축삭) 생성 촉진 활성[neurite (dendrite and axon) outgrowth promoting activity; NOPA), 신경돌기(가지돌기 및 축삭) 성장(분지 및 길이성장) 촉진 활성[neurite growth (branching and lengthening) promoting activity; NGPA) 및 연접 생성(synapse formation) 촉진 효능을 검증하는 단계를 포함하여, 모링가의 에탄올 추출물(MOE)을 제조하는 방법.(a) collecting a Moringa sample;
(b) washing the collected Moringa sample;
(c) drying and crushing the washed Moringa sample;
(d) pouring and shaking ethanol into the powder of the Moringa sample of step (c);
(e) after shaking, centrifuging the slurry and filtering the supernatant;
(f) concentrating the filtrate obtained in step (e) under vacuum and completely drying;
(g) weighing the ethanol extract (MOE) of Moringa dried in step (f);
(h) dissolving an ethanol extract (MOE) of weighed moringa in dimethylsulfoxide (DMSO) to prepare an aliquot;
(i) culturing primary hippocampal neurons;
(j) treating an aliquot of the MOE obtained in step (h) to the hippocampal neuron cultured in step (i) and
(k) neurite (dendrite and axon) outgrowth promoting activity of neurons of MOE (dendrite and axon); Neurite growth (branching and lengthening) promoting activity (NOPA), neurite (dendritic and axon) growth (branching and lengthening) (MOE), comprising the step of: (a) inspecting the effect of promoting the synapse formation of NGPA and NGPA. 신경돌기 생성 촉진 활성(NOPA), 신경돌기 성장 촉진 활성(NGPA), 및 연접 생성 촉진 효능을 가진, 제1항에 따른 방법에 따라 제조된 모링가의 에탄올 추출물.An ethanol extract of Moringa, prepared according to the method of claim 1, having neurite outgrowth promoting activity (NOPA), neurite outgrowth activity (NGPA), and synergistic production promoting activity. 제2항에 있어서, 효능을 나타내는 최적 농도가 신경세포 배양 배지 mL 당 1㎍ 내지 60㎍인 모링가의 에탄올 추출물.3. The ethanol extract of Moringa according to claim 2, wherein the optimal concentration exhibiting the effect is 1 占 퐂 to 60 占 퐂 per mL of the neural cell culture medium.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108040535A (en) * 2018-01-19 2018-05-18 云南省德宏热带农业科学研究所 A kind of Moringa green cultivation management method
KR102239719B1 (en) * 2019-11-11 2021-04-14 동국대학교 경주캠퍼스 산학협력단 Composition Comprising 3β, 6β-dichloro-5-hydroxy-5α-cholestane for Improving Neuronal Development and Method Using The Same

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