KR20150084831A - Enrichment of antigen-specific plasmablasts - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항원-특이적 형질모세포의 풍부화 방법에 관한 것이다. 방법은 1종 초과의 항원을 인식하는 희귀 항체를 비롯한 항체의 동정에 유용하다.The present invention relates to a method for enriching antigen-specific plasma cells. Methods are useful for identifying antibodies, including rare antibodies that recognize more than one species of antigen.
Description
관련 출원Related application
본원은 2012년 11월 13일에 출원된 미국 가출원 61/725,764를 우선권 주장하며, 이 가출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.This application claims priority to U.S. Provisional Application No. 61 / 725,764, filed November 13, 2012, which application is incorporated herein by reference in its entirety.
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발명의 분야Field of invention
본 발명은 항원-특이적 형질모세포의 풍부화 방법에 관한 것이다. 방법은 1종 초과의 항원을 인식하는 희귀 항체를 포함하여 항체의 동정에 유용하다.The present invention relates to a method for enriching antigen-specific plasma cells. Methods are useful for identifying antibodies, including rare antibodies that recognize more than one antigen.
인간 이뮤노글로불린 유전자의 클로닝을 가능하게 하는 기술적 진보는 치료 가능성을 지닌 희귀한 기능성 인간 모노클로날 항체의 발견에 효과적인 것으로 증명되었다. 그러나, 수십만 인간 형질세포의 시험관내 배양과 분류 또는 불과 몇 개의 가능성이 있는 항체 후보자의 동정을 위하여 인간 형질세포로부터 거대 파지-제시 라이브러리의 생성을 수반하는, 그러한 희귀 인간 항체의 발견에 사용되는 다수의 방법은 종종 수고로움이 따른다.Technological advances that enable the cloning of human immunoglobulin genes have proven effective in the discovery of rare functional human monoclonal antibodies with therapeutic potential. However, many of the methods used to discover such rare human antibodies, involving in vitro culture and classification of hundreds of thousands of human plasma cells, or the generation of large phage-displaying libraries from human plasma cells for the identification of only a few potential antibody candidates The method of often follows the trouble.
희귀한 기능성 인간 모노클로날 항체의 동정 효율을 증가시키기 위한 다양한 방법이 개발되어 왔다. 브람스(Brams) 등은 항원으로 나이브 인간 비장세포의 시험관내 프라이밍, 뒤이어 면역손상 마우스로 프라이밍된 비장세포의 복막내 또는 정맥내 전달, 이어서 부가적인 항원으로 공여자 마우스의 후속 생체내 부스팅의 조합에 의한 항원-특이적 IgG 반응을 보고하였다. (문헌 [Brams et al., (1998) J Immunology 160:2051-2058]; 국제 출원 공개 번호 WO 1996/40252 참조). 항원-특이적 반응의 증강을 달성하기 위하여 시험관내 비장세포 배양과 시험관내 및 생체내 항원 챌린지 둘 다에 대한 필요조건에 주목하였다. 다른 일행들은 직접 면역손상 마우스의 비장으로 항원과 함께 인간 말초 혈액 백혈구 (PBL)의 생착 후에 일어나는 항원-선택적 인간 B 세포 팽창을 보고하였다. (문헌 [Depraetere et al., (2001) J Immunology 166:2929-2936]; 국제 출원 공개 번호 WO 1999/60846 참조).Various methods have been developed to increase the efficiency of identification of rare functional human monoclonal antibodies. Brams et al. Have shown that intraperitoneal or intravenous delivery of splenocytes primed with immunocompromised mice followed by in vitro priming of naive human splenocytes as an antigen, followed by combination of subsequent in vivo boosting of donor mice with additional antigen Antigen-specific IgG response. (See Brams et al., (1998) J Immunology 160: 2051-2058; International Application Publication No. WO 1996/40252). The need for both in vitro splenocyte cultures and in vitro and in vivo antigen challenge to achieve enhancement of antigen-specific responses was noted. Others have reported antigen-selective human B cell expansion following antigen-presenting human peripheral blood leukocytes (PBL) with the spleen of directly immunocompromised mice. (Depraetere et al., (2001) J Immunology 166: 2929-2936; International Publication No. WO 1999/60846).
항체 동정 기술에 있어서 이러한 진보에도 불구하고, 1종 초과의 항원을 인식하는 모노클로날 항체를 포함하여 희귀 모노클로날 항체의 동정에 유용한 항원-특이적 형질모세포의 풍부화 방법에 대한 필요성이 존재한다. 본 발명자들은 항원-특이적 형질모세포의 동정에 유효한 생체내 형질모세포 풍부화 기술을 개발하였다. 항원-특이적 세포 분류와 조합하여 사용될 때, 형질세포 증식 또는 파지-디스플레이 라이브러리의 생성을 필요로 하지 않고 희귀하고 기능적인 모노클로날 항체의 효율적인 고-빈도 동정을 가능하게 하는 생체내 항원-유도 형질모세포 풍부화 기술이 본원에 기재된다. 본 발명에 의하여 제공된 방법은 희귀 항체의 동정에 특히 유용하다. 본 발명에 의하여 제공된 방법은 또한 1종 초과의 항원에 대한 특이성을 갖는 항체 (예를 들어, 모노클로날 항체)의 동정에 특히 유용하다.Despite these advances in antibody identification technology, there is a need for an enrichment method of antigen-specific transformant cells useful for the identification of rare monoclonal antibodies, including monoclonal antibodies that recognize more than one antigen . The present inventors have developed an in vivo plasmodembrane enrichment technique effective for the identification of antigen-specific pluripotent stem cells. When used in combination with antigen-specific cell sorting, in vivo antigen-inducible assays that enable efficient high-frequency identification of rare and functional monoclonal antibodies without the need for the generation of plasma cells or phage-display libraries Plasma cell enrichment techniques are described herein. The method provided by the present invention is particularly useful for identification of rare antibodies. The methods provided by the present invention are also particularly useful for the identification of antibodies (e. G., Monoclonal antibodies) that have specificity for more than one antigen.
본 발명은 부분적으로는 항원-특이적 형질모세포를 풍부화하는 방법을 제공한다.The present invention provides, in part, methods for enriching antigen-specific plasma cells.
일부 측면에서, 본 발명은 공여자로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수득하는 단계, PBMC를 적어도 1종의 항원과 접촉시키는 단계, 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하는 단계, 및 면역손상 동물의 비장으로부터 형질모세포를 단리하여, 항원-특이적 형질모세포를 풍부화하는 단계를 포함하는, 항원-특이적 형질모세포를 풍부화하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, PBMC를 항원과 접촉시킨 후 및 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하기 전에 PBMC를 세척하여 잉여 또는 미결합 항원을 제거하는 부가적인 단계가 수행된다. 일부 실시양태에서, 형질모세포의 항원-특이적 단일-세포 분류의 부가적인 단계가 수행된다. 다른 실시양태에서, 단리된 형질모세포로부터의 이뮤노글로불린 클로닝의 부가적인 단계가 수행된다.In some aspects, the present invention provides a method for the treatment of an immunocompromised animal, comprising obtaining a peripheral blood mononuclear cell (PBMC) from a donor, contacting the PBMC with at least one antigen, delivering the PBMC to the spleen of the immunocompromised animal, Isolating the plasmoid cells from the spleen, and enriching the antigen-specific pluripotent cells. The present invention also provides methods for enriching antigen-specific transformed cells. In some embodiments, additional steps are performed to wash the PBMCs after contacting the PBMC with the antigen and prior to delivering the PBMC to the spleen of the immunocompromised animal to remove the surplus or unbound antigen. In some embodiments, additional steps of the antigen-specific single-cell sorting of the transforming cells are performed. In another embodiment, an additional step of immunoglobulin cloning from the isolated transformed cells is performed.
일부 측면에서, 본 발명은 공여자로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수득하는 단계, PBMC를 적어도 1종의 항원과 접촉시키는 단계, PBMC를 세척하여 잉여 또는 미결합 항원을 제거하는 단계, 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하는 단계, 및 면역손상 동물의 비장으로부터 형질모세포를 단리하여, 항원-특이적 형질모세포를 풍부화하는 단계를 포함하는, 항원-특이적 형질모세포를 풍부화하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 형질모세포의 항원-특이적 단일-세포 분류의 부가적인 단계가 수행된다. 다른 실시양태에서, 단리된 형질모세포로부터의 이뮤노글로불린 클로닝의 부가적인 단계가 수행된다.In some aspects, the invention provides a method of treating an immunocompromised animal, comprising obtaining a peripheral blood mononuclear cell (PBMC) from a donor, contacting the PBMC with at least one antigen, washing the PBMC to remove surplus or unbound antigen, , And isolating the plasmogenes from the spleen of the immunocompromised animal, thereby enriching the antigen-specific pluripotent stem cells. The present invention also provides a method for enriching antigen-specific transformed cells. In some embodiments, additional steps of the antigen-specific single-cell sorting of the transforming cells are performed. In another embodiment, an additional step of immunoglobulin cloning from the isolated transformed cells is performed.
일부 측면에서, PBMC는 항원에 이전에 노출된 공여자로부터 수득된다. 따라서, 일부 측면에서, 본 발명은 항원에 이전에 노출된 공여자로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수득하는 단계, PBMC를 항원 또는 그의 단편 또는 부분과 접촉시키는 단계, 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하는 단계, 및 면역손상 동물의 비장으로부터 형질모세포를 단리하여, 항원-특이적 형질모세포를 풍부화하는 단계를 포함하는, 항원-특이적 형질모세포를 풍부화하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, PBMC를 항원과 접촉시킨 후 및 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하기 전에 PBMC를 세척하여 잉여 또는 미결합 항원을 제거하는 부가적인 단계가 수행된다. 일부 실시양태에서, 형질모세포의 항원-특이적 단일-세포 분류의 부가적인 단계가 수행된다. 다른 실시양태에서, 단리된 형질모세포로부터의 이뮤노글로불린 클로닝의 부가적인 단계가 수행된다.In some aspects, PBMCs are obtained from donors previously exposed to the antigen. Accordingly, in some aspects, the invention provides a method of treating a subject suffering from an immunodeficiency disorder comprising: obtaining a peripheral blood mononuclear cell (PBMC) from a donor previously exposed to an antigen; contacting the PBMC with the antigen or a fragment or portion thereof; And isolating the transgenic cells from the spleen of the immunocompromised animal, thereby enriching the antigen-specific transgenic cells. The present invention also provides a method of enriching antigen-specific transgenic cells. In some embodiments, additional steps are performed to wash the PBMCs after contacting the PBMC with the antigen and prior to delivering the PBMC to the spleen of the immunocompromised animal to remove the surplus or unbound antigen. In some embodiments, additional steps of the antigen-specific single-cell sorting of the transforming cells are performed. In another embodiment, an additional step of immunoglobulin cloning from the isolated transformed cells is performed.
일부 측면에서, 본 발명은 공여자로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수득하는 단계, PBMC를 적어도 1종의 항원과 접촉시키는 단계, 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하는 단계, 면역손상 동물의 비장으로부터 형질모세포를 단리하는 단계, 및 단리된 항원-특이적 형질모세포를 분류하여, 항체를 동정 또는 단리하는 단계를 포함하는, 항체를 동정 또는 단리하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, PBMC를 항원과 접촉시킨 후 및 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하기 전에 PBMC를 세척하여 잉여 또는 미결합 항원을 제거하는 부가적인 단계가 수행된다. 일부 실시양태에서, 단리된 형질모세포로부터의 이뮤노글로불린 클로닝의 부가적인 단계가 수행된다.In some aspects, the invention provides a method of treating a subject suffering from an immune-compromised animal, comprising obtaining a peripheral blood mononuclear cell (PBMC) from the donor, contacting the PBMC with at least one antigen, delivering the PBMC to the spleen of the immunocompromised animal, And isolating the isolated antigen-specific transformed cells, thereby identifying or isolating the antibody. The method of identifying or isolating an antibody comprises: In some embodiments, additional steps are performed to wash the PBMCs after contacting the PBMC with the antigen and prior to delivering the PBMC to the spleen of the immunocompromised animal to remove the surplus or unbound antigen. In some embodiments, an additional step of immunoglobulin cloning from the isolated transformed cells is performed.
본 방법의 일부 측면에서, PBMC를 항원과 접촉시키는 단계에 사용된 항원은 공여자가 이전에 노출되었던 항원과 동일한 항원 (또는 그의 단편 또는 부분)이다. 다른 실시양태에서, PBMC를 항원과 접촉시키는 단계에 사용된 항원은 공여자가 이전에 노출되었던 항원과 상이한 항원이다 (예를 들어, 그 항원은 공여자가 이전에 노출되었던 항원의 변이체, 하위유형, 이소형 또는 상동체이다).In some aspects of the method, the antigen used in contacting the PBMC with the antigen is the same antigen (or fragment or portion thereof) as the antigen to which the donor was previously exposed. In another embodiment, the antigen used in the step of contacting the PBMC with the antigen is an antigen that is different from the antigen to which the donor was previously exposed (e.g., the antigen is a variant of the antigen to which the donor was previously exposed, Type or homolog).
일부 측면에서, 본 발명은 공여자로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수득하는 단계, PBMC를 항원 또는 그의 단편 또는 부분과 접촉시키는 단계, 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하는 단계, 및 면역손상 동물의 비장으로부터 형질모세포를 단리하여, 항원에 대한 특이성을 갖는 형질모세포에 대해 풍부화된 형질모세포 집단을 수득하는 단계를 포함하는, 항원에 대한 특이성을 갖는 형질모세포에 대해 풍부화된 형질모세포 집단을 수득하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, PBMC를 항원과 접촉시킨 후 및 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하기 전에 PBMC를 세척하여 잉여 또는 미결합 항원을 제거하는 부가적인 단계가 수행된다. 일부 실시양태에서, 풍부화된 형질모세포 집단은 항원에 대한 특이성을 갖는 적어도 1종의 항원-특이적 형질모세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 풍부화된 형질모세포 집단은 항원에 대한 특이성을 갖는 적어도 1종의 항원-특이적 항체-생산 형질모세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 형질모세포의 항원-특이적 단일-세포 분류의 부가적인 단계가 수행된다. 다른 실시양태에서, 단리된 형질모세포로부터의 이뮤노글로불린 클로닝의 부가적인 단계가 수행된다.In some aspects, the invention provides a method of treating an immunocompromised animal, comprising: obtaining a peripheral blood mononuclear cell (PBMC) from a donor; contacting the PBMC with the antigen or fragment or portion thereof; delivering the PBMC to the spleen of the immunocompromised animal; Isolated from the spleen of the spleen to obtain an enriched population of transformed cells with respect to the transformed cells having specificity for the antigen to obtain an enriched population of transformed cells with the antigen specificity ≪ / RTI > In some embodiments, additional steps are performed to wash the PBMCs after contacting the PBMC with the antigen and prior to delivering the PBMC to the spleen of the immunocompromised animal to remove the surplus or unbound antigen. In some embodiments, the enriched population of transformed cells contains at least one antigen-specific transforming cell with specificity for the antigen. In some embodiments, the enriched population of transformed cells contains at least one antigen-specific antibody-producing plasmogene that has specificity for the antigen. In some embodiments, additional steps of the antigen-specific single-cell sorting of the transforming cells are performed. In another embodiment, an additional step of immunoglobulin cloning from the isolated transformed cells is performed.
다른 측면에서, 본 발명은 항원에 이전에 노출된 공여자로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수득하는 단계, PBMC를 항원 또는 그의 단편 또는 부분과 접촉시키는 단계, 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하는 단계, 및 면역손상 동물의 비장으로부터 형질모세포를 단리하여, 항원에 대한 특이성을 갖는 형질모세포에 대해 풍부화된 형질모세포 집단을 수득하는 단계를 포함하는, 항원에 대한 특이성을 갖는 형질모세포에 대해 풍부화된 형질모세포 집단을 수득하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, PBMC를 항원과 접촉시킨 후 및 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하기 전에 PBMC를 세척하여 잉여 또는 미결합 항원을 제거하는 부가적인 단계가 수행된다. 일부 실시양태에서, 풍부화된 형질모세포 집단은 항원에 대한 특이성을 갖는 적어도 1종의 항원-특이적 형질모세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 풍부화된 형질모세포 집단은 항원에 대한 특이성을 갖는 적어도 1종의 항원-특이적 항체-생산 형질모세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 형질모세포의 항원-특이적 단일-세포 분류의 부가적인 단계가 수행된다. 다른 실시양태에서, 단리된 형질모세포로부터의 이뮤노글로불린 클로닝의 부가적인 단계가 수행된다.In another aspect, the present invention provides a method for the treatment of PBMCs, comprising obtaining peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from a donor previously exposed to an antigen, contacting the PBMC with the antigen or a fragment or portion thereof, Isolating the genome from the spleen of the immunocompromised animal to obtain an enriched population of transformed cells for the antigenic-specific transformed cells. Lt; RTI ID = 0.0 > transformed < / RTI > population. In some embodiments, additional steps are performed to wash the PBMCs after contacting the PBMC with the antigen and prior to delivering the PBMC to the spleen of the immunocompromised animal to remove the surplus or unbound antigen. In some embodiments, the enriched population of transformed cells contains at least one antigen-specific transforming cell with specificity for the antigen. In some embodiments, the enriched population of transformed cells contains at least one antigen-specific antibody-producing plasmogene that has specificity for the antigen. In some embodiments, additional steps of the antigen-specific single-cell sorting of the transforming cells are performed. In another embodiment, an additional step of immunoglobulin cloning from the isolated transformed cells is performed.
다른 측면에서, 본 발명은 공여자로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수득하는 단계, PBMC를 2종 이상의 상이한 항원과 접촉시켜 PBMC/항원 프리믹스를 수득하는 단계, 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하는 단계, 면역손상 동물의 비장으로부터 형질모세포를 단리하는 단계, 및 단리된 형질모세포의 항원-특이적 세포를 분류하여, 항원에 대한 특이성을 갖는 항체를 생산할 수 있는 형질모세포를 동정하는 단계를 포함하는, 1종 초과의 항원에 대한 특이성을 갖는 항체를 생산할 수 있는 형질모세포를 동정하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하기 전에 PBMC를 세척하여 PBMC/항원 프리믹스로부터 잉여 또는 미결합 항원을 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 방법은 단리된 형질모세포로부터의 이뮤노글로불린의 클로닝을 추가로 포함한다.In another aspect, the present invention provides a method of inhibiting PBMCs comprising: obtaining peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from a donor; contacting the PBMC with two or more different antigens to obtain a PBMC / antigen premix; Isolating the transformed cells from the spleen of the immunocompromised animal and sorting the antigen-specific cells of the isolated transformed cells, thereby identifying a transformed cell capable of producing an antibody having specificity for the antigen , And a method for identifying a transformed cell capable of producing an antibody having specificity for more than one kind of antigen. In some embodiments, the method further comprises washing the PBMC prior to delivering the PBMC to the spleen of the immunocompromised animal to remove the surplus or unbound antigen from the PBMC / antigen pre-mix. In another embodiment, the method further comprises cloning of the immunoglobulin from the isolated transformed cells.
일부 측면에서, PBMC는 포유동물로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 마우스, 래트, 토끼 또는 염소로부터 수득된다. 다른 실시양태에서, PBMC는 인간으로부터 수득된다. 다른 측면에서, PBMC는 비-포유동물인 동물로부터 수득된다.In some aspects, PBMCs are obtained from mammals. In some embodiments, PBMCs are obtained from mice, rats, rabbits, or chlorine. In another embodiment, the PBMC is obtained from a human. In another aspect, PBMCs are obtained from non-mammalian animals.
도 1은 생체내 SCID 마우스에서의 형질모세포 분화를 보여주는 데이터를 도시한다. 이식전 (0일차로 표시) 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 (인간 PBMC의 비장내 주사 뒤) 4, 7 및 8일차에 SCID 마우스로부터 수득한 비장세포를 항-CD19 및 항-CD38로 염색하여 B 계통 세포를 구별하였다. 상부 원, 하부 원, 및 직사각형은 각각 형질모세포, 활성화된 배중심-유사 세포, 또는 나이브 B 세포를 나타낸다. 숫자는 각 하위세트의 빈도를 %로 나타낸다.
도 2a는 파상풍 백신접종후 7일차에서 인간 공여자 PBMC (파상풍 변독소-반응성)의 대표적인 프로파일을 도시한다. 도 2b는 파상풍-백신접종 공여자로부터 수득한 인간 PBMC의 이식후 8일차에서 SCID 마우스로부터 수득한 비장세포 (파상풍 변독소 반응성)의 대표적인 프로파일을 도시한다. 숫자는 각 하위세트의 빈도를 %로 나타낸다. 도 2c는 각각의 자극 조건하에서 개별 SCID 마우스로부터 수득한 비장 당 파상풍 변독소-반응성 세포의 수를 도시한다. 생체내 부스트는 SCID 마우스에 IP 주사한 100 ㎍ 파상풍 변독소를 함유하였다. 시토카인 칵테일은 SCID 마우스에 복막내 (i.p.) 주사한 인간 B 세포 활성화 인자 (BAFF, 50 ㎍)와 IL-2, IL-6 및 IL-21 (각각 50 ng)의 혼합물을 함유하였다.
도 3a 및 3b는 SCID 마우스 풍부화전 7일차 후-백신접종 PBMC로부터의 항-헤마글루티닌-양성 형질모세포 (H3 헤마글루티닌 및 H1 헤마글루티닌)의 FACS 분석을 보여주는 데이터 (도 3a) 및 각각 상부 및 하부 패널에 항원 프리믹스의 존재하 및 부재하에 SCID 마우스 풍부화 후 8일차 후-이식으로부터의 항-헤마글루티닌-양성 형질모세포 (H3 헤마글루티닌 및 H1 헤마글루티닌)의 FACS 분석을 보여주는 데이터 (도 3b)를 도시한다.
도 4는 PBMC/항원 프리믹스 부재하에 (원) 및 PBMC/항원 프리믹스 존재하에 (사각형) 개별 SCID/베이지 마우스로부터의 PBMC의 8일차 후-비장내 이식으로부터 수득한 비장세포의 분석을 %헤마글루티닌 (H1)+/CD38high 형질모세포로서 보여주는 데이터를 도시한다. 직사각형은 H1+ 형질모세포를 제시한 마우스를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 방법을 사용하여 수득한 항-헤마글루티닌 항체에 의한 다양한 A형 인플루엔자 군1 및 군2 바이러스 균주의 시험관내 중화를 보여주는 데이터를 도시한다.
도 6a 및 6b는 모노클로날 항체 39.29에 의한 다양한 A형 인플루엔자 군1 (도 6a) 및 군2 (도 6b) 바이러스 균주의 시험관내 중화를 보여주는 데이터를 도시한다.
도 7a 및 7b는 모노클로날 항체 81.39에 의한 다양한 A형 인플루엔자 군1 (도 7a) 및 군2 (도 7b) 바이러스 균주의 시험관내 중화를 보여주는 데이터를 도시한다.
도 8a, 8b, 8c 및 8d는 다양한 A형 인플루엔자 바이러스 균주 (A/PR/8/1934 (PR8), 도 8a; A/포트 챌머스(Port Chalmers)/1/1973 (PC73), 도 8b; A/홍콩/1/1968 (HK68), 도 8c; 및 A/아이치/2/1968 (아이치68), 도 8d)로 감염시키고 다양한 양의 모노클로날 항체 39.29를 투여한 마우스의 %생존을 보여주는 데이터를 도시한다.Figure 1 shows data showing transformed cell differentiation in SCID mice in vivo. Splenocytes obtained from SCID mice on
Figure 2a shows a representative profile of human donor PBMC (tetanus toxin-responsive) at
Figures 3a and 3b show data showing FACS analysis of anti-hemagglutinin-positive progenitor cells (H3 hemagglutinin and Hl hemagglutinin) from SCID mouse enriched 7 day post-vaccinated PBMC (Figure 3a ) And anti-hemagglutinin-positive plasma cells (H3 hemagglutinin and H1 hemagglutinin) from transplantation after 8 days after SCID mouse enrichment in the presence and absence of antigen premixes on upper and lower panels, respectively (FIG. 3B) showing the FACS analysis of FIG.
Figure 4 shows the analysis of spleen cells obtained from 8 day post-splenic transplantation of PBMCs from individual SCID / beige mice in the absence of PBMC / antigen premix (circle) and in the presence of PBMC / antigen pre-mix (square) 0.0 > (Hl) < / RTI & gt ; + / CD38 high progeny. The rectangle represents a mouse presenting H1 + plasma cells.
Figure 5 shows data showing in vitro neutralization of various strains of influenza A virus group 1 and group 2 virus by anti-hemagglutinin antibodies obtained using the method of the present invention.
Figures 6a and 6b show data showing in vitro neutralization of various strains of influenza A type 1 (Figure 6a) and group 2 (Figure 6b) virus strains by monoclonal antibody 39.29.
Figures 7a and 7b show data showing in vitro neutralization of various strains of Influenza A type 1 (Figure 7a) and group 2 (Figure 7b) virus strains by monoclonal antibody 81.39.
Figures 8a, 8b, 8c, and 8d illustrate the results of a variety of influenza A virus strains (A / PR / 8/1934 (PR8), Figure 8a, Port Chalmers / 1/1973 (PC73), Figure 8b; Showing the% survival of mice infected with various amounts of monoclonal antibody 39.29 and infected with A / Hong Kong / 1/1968 (HK68), Figure 8c and A / Aichi / 2/1968 Lt; / RTI >
본 발명은, 그 중에서도, 형질모세포의 항원-특이적 풍부화 방법을 제공한다. 본 방법은 항원-특이적 형질모세포의 신속한 동정 및 희귀 모노클로날 항체의 효율적인 동정을 제공한다.The present invention provides, among other things, an antigen-specific enrichment method of transforming cells. The method provides rapid identification of antigen-specific transforming cells and efficient identification of rare monoclonal antibodies.
정의Justice
용어 "형질모세포"는 형질세포에 대한 전구체인 세포를 언급한다.The term " transforming cells "refers to cells that are precursors to plasma cells.
용어 "비장세포"는 비장에 위치하거나 또는 비장 조직으로부터 수득한 상이한 혈액세포 유형 중 어느 하나를 언급한다.The term "splenocyte" refers to any of the different blood cell types obtained from spleen tissue or located in the spleen.
용어 형질모세포의 "풍부화하는" 또는 "풍부화"는 혼합 세포 집단에 함유된 목적하는 세포, 전형적으로 항원-특이적 세포의 빈도를 증가시키는 것을 언급한다. 따라서, 세포 집단 (예를 들어, 항원-특이적 형질모세포)의 "풍부화하는" 또는 "풍부화"는 풍부화하는 또는 풍부화 단계의 결과로서 보다 높은 빈도의 항원-특이적 세포 (예를 들어, 항원-특이적 형질모세포)를 보유하는 세포 집단을 포함한다.The term " enriching "or" enriching "of the term plasmogenesis refers to increasing the frequency of a desired cell, typically an antigen-specific cell, contained in a mixed cell population. Thus, "enriching" or "enriching" of a cell population (e. G., Antigen-specific transforming cells) results in a higher frequency of antigen- specific cells (e. Specific < / RTI > plasma cells).
"말초 혈액 단핵 세포" (PBMC)는 원형의 핵을 보유한 혈액세포를 언급하며, 림프구 (T 세포 및 B 세포), 단핵구, 대식구, 자연 살해 세포, 형질세포 및 형질모세포를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "말초 혈액 단핵 세포"는 림프구 (예를 들어, B 세포, T 세포, 자연 살해 세포)를 포함하는 용어 "말초 혈액 림프구" (PBL)와 교환가능하게 사용된다."Peripheral blood mononuclear cells" (PBMCs) refer to blood cells having a circular nucleus and include lymphocytes (T cells and B cells), monocytes, macrophages, natural killer cells, plasma cells and plasma cells. As used herein, the term "peripheral blood mononuclear cell" is used interchangeably with the term "peripheral blood lymphocyte" (PBL), including lymphocytes (eg, B cells, T cells, natural killer cells).
"항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 일부를 포함하는 무손상 항체 이외의 분자를 언급한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일 쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하며 이에 제한되지는 않는다.An "antibody fragment" refers to a molecule other than an intact antibody that includes a portion of an intact antibody that binds to an antigen to which the intact antibody binds. Examples of antibody fragments include Fv, Fab, Fab ', Fab'-SH, F (ab') 2 ; Diabody; Linear antibodies; Single chain antibody molecules (e. G., ScFv); And multispecific antibodies formed from antibody fragments.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되고, 반면에 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 언급한다.The term "chimeric" antibody refers to an antibody in which a portion of the heavy and / or light chain is derived from a particular source or species, while the remainder of the heavy and / or light chain is derived from a different source or species.
항체의 "부류"는 그의 중쇄가 보유한 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 언급한다. 항체의 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 좀더 세분될 수 있다. 이뮤노글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭된다."Class" of an antibody refers to the type of constant domain or constant region retained by its heavy chain. Antibody five major classes of: IgA, IgD, IgE, IgG, and and IgM are present, some of which are a subclass (isotype), such as IgG 1, IgG 2, IgG 3, IgG 4, IgA 1, and IgA 2 can be further subdivided. The heavy chain constant domains corresponding to the different classes of immunoglobulins are referred to as alpha, delta, epsilon, gamma and mu, respectively.
작용제, 예를 들어 제약 제제의 "유효량"은 필요한 투여량에서 및 필요한 기간 동안 목적하는 치료적 또는 예방적 결과의 달성에 유효한 양을 언급한다.An "effective amount" of an agonist, e. G., A pharmaceutical formulation, refers to an amount effective at achieving the desired therapeutic or prophylactic result, at the dosage required and for the requisite period of time.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "완전 항체"는 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 보유하거나 또는 본원에서 정의되는 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 보유하는 항체를 언급하도록 본원에서 교환가능하게 사용된다.The terms "full-length antibody "," intact antibody ", and "complete antibody" refer to an antibody that retains a structure that is substantially similar to that of a native antibody construct or that retains a heavy chain containing an Fc region as defined herein It is used interchangeably.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주", 및 "숙주 세포 배양물"은 교환가능하게 사용되며, 외인성 핵산을 도입시킨 세포 (그러한 세포의 자손 포함)를 언급한다. 숙주 세포는 "형질전환체", 및 일차 형질전환된 세포와 계대수에 관계없이 그로부터 유래된 자손을 포함하는 "형질전환된 세포"를 포함한다. 자손은 핵산 함량이 양친 세포와 완전히 동일하지는 않을 수 있지만 돌연변이를 함유할 수 있다. 최초 형질전환된 세포에서 스크리닝 또는 선택되는 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 보유하는 돌연변이체 자손은 본원에 포함된다.The terms "host cell," " host cell strain, " and "host cell culture" are used interchangeably and refer to a cell into which an exogenous nucleic acid has been introduced, including the progeny of such a cell. Host cells include "transformants" and "transformed cells" that include progeny derived therefrom, regardless of the number of transformants and passage number. The offspring may contain mutations, although the nucleic acid content may not be completely identical to the parental cells. Mutant progeny retaining the same function or biological activity screened or selected in the initially transformed cells are included herein.
"인간 항체"는 인간 또는 인간세포에 의하여 생산되거나 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-코딩 서열을 이용하는 비-인간 공급원으로부터 유래한 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 소유하는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 구체적으로는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다.A "human antibody" is one that possesses an amino acid sequence that is produced by human or human cells or that corresponds to that of an antibody derived from a non-human source that utilizes human antibody repertoires or other human antibody-encoding sequences. This definition of human antibodies specifically excludes humanized antibodies that contain non-human antigen-binding moieties.
"인간화" 항체는 비-인간 초가변 영역 (HVR)으로부터의 아미노산 잔기 및 인간 프레임워크 영역 (FR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 언급한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는, HVR (예를 들어, CDR)의 전체 또는 실질적으로 전체가 비-인간 항체의 것들에 상응하고 FR의 전체 또는 실질적으로 전체가 인간 항체의 것들에 상응하는, 적어도 1개, 전형적으로는 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전체를 포함할 것이다. 인간화 항체는 임의로는 인간 항체로부터 유래한 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 거친 항체를 언급한다."Humanized" antibodies refer to chimeric antibodies comprising an amino acid residue from a non-human hypervariable region (HVR) and an amino acid residue from a human framework region (FR). In certain embodiments, a humanized antibody is a humanized antibody, wherein all or substantially all of the HVR (e. G., A CDR) corresponds to that of a non-human antibody and all or substantially all of the FR corresponds to that of a human antibody 1, < / RTI > typically two variable domains. Humanized antibodies may optionally comprise at least a portion of an antibody constant region derived from a human antibody. A "humanized form" of an antibody, eg, a non-human antibody, refers to an antibody that has undergone humanization.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼, 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하며 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.An "individual" or "subject" is a mammal. Mammals include, but are not limited to, domestic animals (e.g., cows, sheep, cats, dogs and horses), primates (e.g., human and non-human primates such as monkeys), rabbits, But is not limited thereto. In certain embodiments, the subject or subject is a human.
"단리된" 항체는 그의 자연 환경의 성분으로부터 분리시킨 것이다. 일부 실시양태에서, 항체는 예를 들어 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전 포커싱 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)로 결정시에 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법에 대한 검토를 위해서는 예를 들어 문헌 [Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조한다.An "isolated" antibody is isolated from its natural environment components. In some embodiments, the antibody is present at a concentration of 95% at the time of, for example, electrophoresis (e.g., SDS-PAGE, isoelectric focusing (IEF), capillary electrophoresis) or chromatography (e.g. ion exchange or reverse phase HPLC) Or < / RTI > greater than 99%. For a review of methods for evaluating antibody purity, see, for example, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848: 79-87 (2007).
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득한 항체를 언급하며, 즉 그 집단을 구성하는 개별 항체는 동일하고/하거나 동일한 에피토프에 결합하며, 예를 들어 자연발생 돌연변이를 함유하거나 또는 모노클로날 항체 제제의 생산중에 발생하는 있을지 모르는 변이체 항체는 제외하며, 그러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 상이한 결정기 (에피토프)에 대하여 지향된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 대비하여, 모노클로날 항체 제제의 각 모노클로날 항체는 항원상의 단일 결정기에 대하여 지향된다. 따라서, 수식 어구 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득되는 것으로서 항체의 성격을 나타내며, 임의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지 제시법, 및 인간 이뮤노글로불린 좌위의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 포함하여 (이에 제한되지는 않음) 다양한 기술로 제조될 수 있으며, 모노클로날 항체 제조를 위한 그러한 방법 및 다른 예시적인 방법이 본원에 기재된다.The term "monoclonal antibody" as used herein refers to an antibody obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, i.e. individual antibodies that constitute the population bind to the same and / or the same epitope, Excludes variant antibodies that may be present during the production of a monoclonal antibody formulation, or that contain a developmental mutation, and such variants are generally present in minor amounts. In contrast to polyclonal antibody preparations that typically comprise different antibodies directed against different determinants (epitopes), each monoclonal antibody of the monoclonal antibody preparation is directed against a single crystal of the antigen. Thus, the expression "monoclonal" refers to the nature of the antibody as being obtained from a substantially homogeneous population of antibodies and is not to be construed as requiring production of the antibody by any particular method. For example, a monoclonal antibody to be used in accordance with the present invention includes a hybridoma method, a recombinant DNA method, a phage display method, and a method using transgenic animals containing all or part of a human immunoglobulin locus But are not limited to), and such methods and other exemplary methods for the production of monoclonal antibodies are described herein.
"네이키드 항체"는 이종 모이어티 (예를 들어, 세포독성 모이어티) 또는 방사성표지에 접합시키지 않는 항체를 언급한다. 네이키드 항체는 제약 제제에 존재할 수 있다."Naked antibody" refers to an antibody that is not conjugated to a heterologous moiety (e. G., A cytotoxic moiety) or a radioactive label. Naked antibodies can be present in pharmaceutical preparations.
"천연 항체"는 다양한 구조를 지닌 자연발생 이뮤노글로불린 분자를 언급한다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는 디술피드 결합되어 있는 2개의 동일한 경쇄와 2개의 동일한 중쇄로 이루어진 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. N-말단에서 C-말단쪽으로, 각각의 중쇄는 가변 영역 (VH) ("가변 중쇄 도메인" 또는 "중쇄 가변 도메인"으로도 지칭), 그 뒤에 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3)을 보유한다. 마찬가지로, N-말단에서 C-말단쪽으로, 각각의 경쇄는 가변 영역 (VL) ("가변 경쇄 도메인" 또는 "경쇄 가변 도메인"으로도 지칭), 그 뒤에 불변 경 (CL) 도메인을 보유한다. 항체의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 지칭되는 두 유형 중 하나에 배정될 수 있다."Natural antibody" refers to a naturally occurring immunoglobulin molecule having a variety of structures. For example, a native IgG antibody is a heterotetrameric glycoprotein of about 150,000 daltons consisting of two identical light chains and two identical heavy chains that are disulfide bonded. From the N-terminus to the C-terminus, each heavy chain contains a variable region (VH) (also referred to as a "variable heavy chain domain" or "heavy chain variable domain") followed by three constant domains (CH1, CH2 and CH3) do. Likewise, from the N-terminus to the C-terminus, each light chain has a variable region (VL) (also referred to as a "variable light chain domain" or "light chain variable domain") followed by an invariant (CL) domain. The light chain of an antibody may be assigned to one of two types referred to as kappa (kappa) and lambda ([lambda]) based on the amino acid sequence of its constant domain.
용어 "패키지 삽입물"은 그러한 치료제품의 사용에 관련한 적응증, 용법, 투여량, 투여, 조합요법, 금기사항 및/또는 주의사항에 관한 정보를 담고 있는, 치료제품의 상업적 패키지에 관례상 포함되는 사용설명서를 언급하는 데 사용된다.The term "package insert" is intended to include uses that are customarily included in the commercial package of the therapeutic product, including information regarding indications, usage, dosage, administration, contraindication, and / Used to refer to the manual.
용어 "제약 제제"는 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 해주기 위한 형태로 있고, 제제가 투여될 대상체에 용납하기 어렵게 유독한 부가적인 성분을 함유하지 않는 제제를 언급한다.The term "pharmaceutical formulation" refers to a formulation intended to render the biological activity of the active ingredient contained therein effective, and which does not contain additional ingredients that are unacceptably toxic to the subject to which the formulation is to be administered.
"제약상 허용되는 담체"는 대상체에 무독한, 활성 성분 이외의 제약 제제중의 성분을 언급한다. 제약상 허용되는 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하며 이에 제한되지는 않는다.A "pharmaceutically acceptable carrier" refers to a component in a pharmaceutical formulation other than the active ingredient that is non-toxic to the subject. Pharmaceutically acceptable carriers include, but are not limited to, buffers, excipients, stabilizers or preservatives.
본원에서 사용되는 바와 같이, "치료" (및 그의 문법적 변이, 예컨대 "치료하다" 또는 "치료하는")은 치료되는 개체의 자연 경과를 변경시키기 위한 일환으로의 임상적 개입을 언급하며, 임상 병리의 예방을 위해서 또는 그의 진행중에 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질환 발생 또는 재발의 예방, 증상의 경감, 질환의 어떤 직접적인 또는 간접적인 병리학적 귀결의 약화, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함하며 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질환의 발생을 지연시키거나 또는 질환의 진행을 둔화시키는 데 사용된다.As used herein, "treatment" (and grammatical variations thereof, such as "treating" or "treating") refers to clinical intervention as part of altering the natural course of the subject being treated, Or for the prevention of < / RTI > Preferred effects of the treatment include prevention of disease outbreak or recurrence, alleviation of symptoms, attenuation of any direct or indirect pathological consequences of the disease, reduction of disease progression rate, improvement or alleviation of disease state, and remission or improved prognosis But is not limited thereto. In some embodiments, the antibodies of the invention are used to delay the onset of the disease or to slow the progression of the disease.
본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 그것이 연결되는 또 다른 핵산을 전파할 수 있는 핵산 분자를 언급한다. 그 용어는 자기-복제성 핵산 구조로서의 벡터 및 그것이 도입되는 숙주 세포의 게놈에 혼입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그들이 작동가능하게 연결되는 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 그러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 언급된다.The term "vector" as used herein refers to a nucleic acid molecule capable of propagating another nucleic acid to which it is linked. The term includes a vector as a self-replicating nucleic acid construct and a vector incorporated into the genome of the host cell into which it is introduced. Certain vectors may direct expression of nucleic acids to which they are operably linked. Such vectors are referred to herein as "expression vectors ".
일반 방법General method
본 발명의 실시는, 달리 지시되지 않는 한, 통상의 기술자에게 알려져 있고 이용가능한 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이다. 그러한 기술은 다음과 같은 문헌에 기재되어 있다: Molecular Cloning: A laboratory Manual, third edition (Sambrook et al., 2001) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (P. Herdewijn, ed., 2004); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al ., eds., 1991); 및 Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999). 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현은 예를 들어 미국 특허 번호 5,648,237, 5,789,199 및 5,840,523에 기재되어 있다. (또한, 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254] (이. 콜라이에서의 항체 단편 발현에 대하여 기재하고 있음) 참조).The practice of the present invention will employ conventional techniques of cell biology, cell culture, molecular biology (including recombinant techniques), microbiology, biochemistry and immunology, which are known and available to those of ordinary skill in the art, unless otherwise indicated. Such techniques are described in Molecular Cloning: A laboratory Manual , third edition (Sambrook et al ., 2001) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (P. Herdewijn, ed., 2004); Animal Cell Culture (RI Freshney, eds., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology (FM Ausubel et al., Eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al ., Eds., 1994); Current Protocols in Immunology (JE Coligan et al . , eds., 1991); And Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999). Expression of antibody fragments and polypeptides in bacteria is described, for example, in U.S. Pat. Nos. 5,648,237, 5,789,199 and 5,840,523. (See also Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (BKC Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254 ).
달리 규정되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 발명이 속하는 관련 기술분야에서의 통상의 기술자에 의하여 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which the invention pertains.
본원에는 희귀 모노클로날 항체의 동정에 유용한 방법이 제공된다. 특히, 본 발명은 항체 및 그러한 항체를 코딩하는 핵산을 단리해 낼 수 있는 항원-특이적 형질모세포의 효율적이고 효과적인 동정을 위한 생체내 형질모세포 풍부화 방법론을 제공한다. 본 발명의 하나의 특정 측면은 형질모세포의 생체내 항원-특이적 풍부화를 이용하는 희귀 항체의 동정 및 단리 방법을 제공하는 것이며, 여기에서 항체는 희귀한 기능성 모노클로날 항체이다. 본 발명의 또 다른 특정 측면은 1종 초과의 항원을 인식 (예를 들어, 그들에 결합)하는 (예를 들어, 동일한 항원의 변이체, 이소형, 하위유형 또는 상동체를 인식하거나 또는 그들에 결합하는 또는 상이한 종의 동일한 항원을 인식하거나 또는 그에 결합하는) 항체의 동정 및 단리 방법을 제공하는 것이다. 본 방법은 공여자로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수득 (예를 들어, 단리)하는 단계, PBMC를 항원과 접촉시키는 단계 (본원에서는 "PBMC/항원 프리믹스"로 언급), 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 (주사, 이식, 또는 기타 수단에 의하여) 전달하는 단계, 주입한 PBMC를 면역손상 동물의 비장에 주재시키거나 또는 잔류시키는 단계, 및 비장으로부터 항원-특이적 형질모세포를 단리하는 단계를 포함한다. 비장으로부터 형질모세포를 단리하는 방법은 통상의 기술자에게 주지이고 이용가능하다.Methods are provided herein useful for identification of rare monoclonal antibodies. In particular, the present invention provides an in vivo plasm embryo enrichment methodology for the efficient and effective identification of antibodies and antigen-specific plasmids capable of isolating nucleic acid encoding such antibodies. One particular aspect of the present invention is to provide a method of identifying and isolating rare antibodies that utilize in vivo antigen-specific enrichment of a transformed cell, wherein the antibody is a rare functional monoclonal antibody. Another particular aspect of the present invention is the ability to recognize (e. G., Bind to) one or more than one antigen (e. G., To recognize or variants, isomorphs, subtypes or homologs of the same antigen, Or recognizes or binds to the same antigen of a different species). The method comprises the steps of obtaining (e.g., isolating) peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from a donor, contacting the PBMC with the antigen (referred to herein as "PBMC / antigen premix"), Transferring the PBMC (by injection, transplant, or other means), resuspending or retaining the injected PBMC in the spleen of the immunocompromised animal, and isolating the antigen-specific transgenic cells from the spleen do. Methods for isolating transgenic cells from spleen are well known and available to those of ordinary skill in the art.
일부 실시양태에서, PBMC를 항원과 접촉시키는 단계는 시험관내에서 수행된다. 일부 실시양태에서, PBMC/항원 프리믹스 후에 및 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하기 전에 PBMC로부터 미결합 항원을 세척하지 않는다. 다른 실시양태에서, PBMC를 세척하여 미결합 항원을 제거하는 부가적인 단계가 PBMC/항원 프리믹스 후에 및 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하기 전에 수행된다. 일부 실시양태에서, 항원-특이적 단일-세포 분류의 부가적인 단계가 비장으로부터 항원-특이적 형질모세포의 단리 후에 수행된다. 다른 실시양태에서, 단리된 세포로부터의 이뮤노글로불린 클로닝의 부가적인 단계가 비장으로부터 항원-특이적 형질모세포의 단리 후에 또는 단일-세포 분류 후에 수행된다.In some embodiments, contacting the PBMC with the antigen is performed in vitro. In some embodiments, the unbound antigen is not washed from the PBMC prior to delivery of the PBMC to the spleen of the PBMC / antigen pre-mix and of the immunocompromised animal. In another embodiment, an additional step of washing the PBMC to remove unbound antigen is performed after the PBMC / antigen pre-mix and prior to delivery of the PBMC to the spleen of the immunocompromised animal. In some embodiments, an additional step of antigen-specific single-cell sorting is performed after isolation of the antigen-specific pluripotent stem cells from the spleen. In another embodiment, an additional step of immunoglobulin cloning from the isolated cells is performed after isolation of the antigen-specific transforming cells from the spleen or after single-cell sorting.
파상풍 변독소 항원을 사용하여 생체내 형질모세포 풍부화를 위한 방법의 최적화를 수행하였다. 이들 연구에서, 본 발명자들은 본원 기재의 방법을 사용하여 증가된 개수의 파상풍 변독소-특이적 형질모세포가 수득되었음을 보여주었다. (실시예 1과 2 참조). 방법을 A형 인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글루티닌에 대하여 특이적인 희귀 형질모세포의 풍부화 및 동정에 추가 적용하였다. 본 발명의 형질모세포 풍부화 방법의 사용은, 군1 및 군2 헤마글루티닌 둘 다에의 결합에 효과적이고/이거나 군1 및 군2 A형 인플루엔자 바이러스 단리물 둘 다의 중화에 효과적인 인간 모노클로날 항체를 포함하여, 다양한 A형 인플루엔자 바이러스 단리물에의 결합 및 그들의 중화에 효과적인 인간 모노클로날 항체의 동정을 가져왔다. (실시예 3 내지 7 참조).Optimization of methods for enriching in vivo plasmatic cells using tetanus toxin antigens was performed. In these studies, the present inventors have shown that an increased number of tetanus toxin-specific progenitor cells have been obtained using the methods described herein. (See Examples 1 and 2). The method was further applied to the enrichment and identification of rare germ cells specific to hemagglutinin from influenza A virus. The use of the method of enriching the transformants of the present invention is effective for the binding of both Group 1 and Group 2 hemagglutinin and / or for human monoclonal antibodies effective against neutralization of both Group 1 and Group 2 influenza A virus isolates RTI ID = 0.0 > anti-influenza < / RTI > virus isolates and their neutralization. (See Examples 3 to 7).
본 방법은 효율적이고 증진된 항원-특이적 형질모세포 풍부화, 증가된 항원-특이적 반응, 높은 친화도와 기능을 보유한 항체의 동정, 및 1종 초과의 항원을 인식하는 항체의 동정을 포함하여 (이에 제한되지는 않음) 이전의 모노클로날 항체 동정 방법을 능가하는 이점을 제공한다.The methods include, but are not limited to, efficient and enhanced antigen-specific plasma cell enrichment, increased antigen-specific responses, identification of antibodies with high affinity and function, and identification of antibodies recognizing more than one antigen But are not limited to, methods of identifying monoclonal antibodies.
본 발명의 방법은 희귀한 기능성 모노클로날 항체를 동정하는 효율을 증가시킴으로써 종래기술 방법을 능가하는 부가적인 이점을 제공한다. 예를 들어, 본 방법은 면역손상 동물의 비장으로 PBMC의 전달시에 또는 그에 후속하여 관심 항원 또는 항원들로의 면역손상 동물 (예를 들어, 마우스)의 생체내 면역화 없이도 효과적이다. 부가적으로, 본 방법은 면역손상 동물의 비장으로 PBMC의 전달시에 또는 그에 후속하여 면역손상 동물을 관심 항원 또는 항원들로 부스팅시키지 않고도 효과적이다. 또한, 본 발명의 방법은, 항원-특이적 형질모세포를 풍부화하기 위한, 면역손상 동물의 비장으로 PBMC의 전달하기 전에 항-IL-2-Rb 항체로 동물의 전처리에 의한 것과 같은 면역손상 동물의 자연 살해 (NK) 세포의 제거 또는 사멸과 관련되지 않는다.The methods of the present invention provide additional advantages over prior art methods by increasing the efficiency of identifying rare functional monoclonal antibodies. For example, the method is effective without in vivo immunization of immunocompromised animals (e. G., Mice) with the antigen or antigens of interest at or subsequent to the transfer of PBMC to the spleen of immunocompromised animals. In addition, the method is effective at boosting PBMCs into the spleen of immunocompromised animals, or subsequent thereto, without boosting the immunocompromised animal with the antigen or antigens of interest. In addition, the method of the present invention is also useful for the enrichment of antigen-specific plasma cells, for the treatment of immune compromised animals such as by pretreatment of animals with anti-IL-2-Rb antibodies prior to delivery of PBMCs to the spleen of immunocompromised animals It is not associated with the elimination or death of natural killer (NK) cells.
(인플루엔자 바이러스 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한) 항-헤마글루티닌 항체의 동정에 관련해서, 이전의 보고에서는 모든 군1 및 군2 A형 인플루엔자 바이러스 단리물에 결합하여 그들을 중화시킬 수 있는 단일 항체를 발견하기 위한 대략 104,000개의 시험관내 배양한 인간 형질세포로부터의 헤마글루티닌-결합 항체의 직접 클로닝을 기재한 바 있다. (문헌 [Corti et al., (2011) Science 333:850-856] 참조). 그러나 본원 기재의 형질모세포 풍부화 방법은 다양한 헤마글루티닌 하위유형을 인식한 20종의 항-헤마글루티닌 항체의 동정을 도출하였으며, 그들 중 4종의 항-헤마글루티닌 항체는 불과 840개의 클로닝된 인간 모노클로날 항체를 스크리닝함으로써 다양한 군1 및 군2 A형 인플루엔자 바이러스 단리물의 중화에 효과적이었다.In connection with the identification of anti-hemagglutinin antibodies (for use in the treatment or prevention of influenza virus infections), previous reports have shown that all Group 1 and Group 2 influenza virus isolates, Direct cloning of hemagglutinin-binding antibodies from approximately 104,000 in vitro cultured human plasma cells to detect monoclonal antibodies has been described. (Corti et al., (2011) Science 333: 850-856). However, the method of enriching the transformed cells described herein resulted in the identification of 20 anti-hemagglutinin antibodies recognizing various hemagglutinin subtypes, of which four anti-hemagglutinin antibodies only 840 RTI ID = 0.0 > A < / RTI > type influenza virus isolate by screening the cloned human monoclonal antibodies.
본 발명의 항원-특이적 형질모세포 풍부화 방법은 형질모세포, 및 예를 들어 파상풍 변독소, 풍진, 홍역, 이하선염, 수두대상포진, 톡소플라스마증, 인플루엔자 바이러스, HIV, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 유두종바이러스, 효모, 기생충 (예를 들어, 말라리아), 박테리아, CMV, 라우스 육종 바이러스 등을 포함한 어떤 목적 항원에 대한 그들의 상응하는 항체를 동정하는 데에 유용하다.The method of enriching an antigen-specific transforming cell of the present invention is a method for enriching an antigen-specific transformed cell with the use of a transgenic plant such as a transformed cell, and a method for producing a transformed cell, for example, a tetanus toxin, rubella, measles, mumps, varicella herpes, toxoplasma, influenza virus, Are useful for identifying their corresponding antibodies to certain target antigens, including hepatitis C virus, papillomavirus, yeast, parasites (e.g., malaria), bacteria, CMV,
본 방법에 사용하기 위한 PBMC는 항원-특이적 항체를 원하는 임의 동물 (공여자)로부터 수득될 수 있다. 그러한 동물은 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 닭, 염소, 인간 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, PBMC는 예를 들어 인간과 같은 포유동물로부터 수득된다. 다른 실시양태에서, PBMC는 적어도 1종의 항원, 감염체 (예를 들어, 박테리아성 또는 바이러스성 인자), 또는 그들의 일부로 이전에 면역화되었거나 또는 그들에 노출된 인간으로부터 수득되며, 여기에서 그 항원은 항원에 대한 면역반응을 도출시키기에 충분하다. 이와 달리, PBMC는 비-인간 동물, 특히 비-인간 포유동물로부터 수득될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, PBMC는 적어도 1종의 항원, 감염체, 또는 그들의 일부로 이전에 면역화되었거나 또는 그들에 노출된 비-인간 동물로부터 수득된다. 항원은 임의의 자기- 또는 비-자기 항원일 수 있다. 특정 실시양태에서, 항원은 공여자에서 면역반응을 유도할 수 있으며 이는 조혈 및 림프단핵구 조직내 항원-특이적 형질모세포, 형질세포, 또는 B 세포의 주둔으로 이어진다.PBMCs for use in the methods can be obtained from any animal (donor) in which an antigen-specific antibody is desired. Such animals include, for example, mice, rats, rabbits, chickens, goats, humans and the like. In some embodiments, PBMCs are obtained from mammals such as, for example, humans. In another embodiment, the PBMCs are obtained from a human who has been previously immunized with or exposed to at least one antigen, an infectious agent (e. G., Bacterial or viral agent), or a portion thereof, wherein the antigen It is sufficient to elicit an immune response to the antigen. Alternatively, PBMCs can be obtained from non-human animals, particularly non-human mammals. Thus, in some embodiments, PBMCs are obtained from non-human animals that have been previously immunized with or exposed to at least one antigen, infectious agent, or portion thereof. Antigens may be any self- or non-self antigen. In certain embodiments, the antigen is capable of eliciting an immune response in the donor leading to the presence of antigen-specific pluripotent stem cells, plasma cells, or B cells in hematopoietic and lymphoid mononuclear tissues.
본 방법은 마우스 또는 다른 동물 종을 포함하여 임의 면역손상 동물에 적용될 수 있다. 면역손상 동물은 전형적으로 이식한 이종이식편 또는 동종이식편 혈액 백혈구/림프구 (예를 들어, PBMC, PBL) 또는 비장세포에 대한 유효 면역반응 유발 능력이 제한될 것이거나 또는 결여될 것이다. 특정 측면에서, 면역손상 동물은 보유하는 경우에 이식된 세포를 거부할 수도 있는 기능성 T 세포 또는 B 세포를 보유하지 않는다. 본 방법에 사용하기 위한 면역손상 동물의 예는 예를 들어 SCID/베이지 마우스, NOD-SCID 마우스, 누드 마우스 등을 포함한다.The method can be applied to any immunocompromised animal, including a mouse or other animal species. Immune compromised animals will typically have limited or no ability to induce an effective immune response to transplanted xenograft or allograft blood leukocyte / lymphocytes (e. G., PBMC, PBL) or spleen cells. In certain aspects, the immunocompromised animal does not possess functional T cells or B cells that, when retained, may reject the transplanted cells. Examples of immunocompromised animals for use in the present methods include, for example, SCID / beige mice, NOD-SCID mice, nude mice, and the like.
일부 측면에서, PBMC/항원 프리믹스에 사용하기 위한 항원은 정제되거나 또는 실질적으로 정제된 항원이다. 항원은 재조합 수단 (즉, 재조합 항원)에 의하여 생산되거나 또는 자연생산된 항원일 수 있다. 항원은 전장 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있거나, 또는 단백질 또는 폴리펩티드의 부분 또는 단편, 예컨대 예를 들어 단백질분해 단편을 포함할 수 있다. 항원은 또한 합성 수단에 의하여 생산된 합성 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 부가적으로, PBMC/항원 프리믹스에 사용하기 위한 항원은 1종의 항원 또는 1종 초과의 항원 (예를 들어, 1종 초과의 항원의 혼합물)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항원은 1종 초과의 항원, 예컨대 예를 들어 상이한 A형 인플루엔자 바이러스 단리물로부터의 1종 초과의 헤마글루티닌 하위유형 (예를 들어, 군1 및 군2 헤마글루티닌 하위유형)의 혼합물일 수 있다.In some aspects, the antigen for use in a PBMC / antigen pre-mix is a purified or substantially purified antigen. Antigens may be produced by recombinant means (i. E., Recombinant antigens) or may be naturally produced antigens. The antigen may be a full-length protein or polypeptide, or it may comprise a portion or a fragment of a protein or polypeptide, such as a proteolytic fragment. Antigens may also be synthetic proteins or polypeptides produced by synthetic means. Additionally, an antigen for use in a PBMC / antigen pre-mix may comprise one antigen or more than one antigen (e.g., a mixture of more than one antigen). For example, the antigen can be an antigen of more than one kind, such as one or more hemagglutinin subtypes (e. G., Group 1 and group 2 hemagglutinin subtypes from e. G. Different A type influenza virus isolates Type).
본 방법에 따른 PBMC/항원 프리믹스용으로 사용된 항원의 양은 다양할 수 있다. 본 발명은 PBMC/항원 프리믹스 중 각 1x106개 B 세포에 대한 약 0.1 내지 2 ㎍의 항원이 항원-특이적 형질모세포의 효과적이고 강건한 풍부화를 가져왔음을 보여주는 예시적인 데이터를 제공한다. 그러나 본 방법은 PBMC/항원 프리믹스에 사용된 항원의 양에 제한되지 않는다. 일반적으로, PBMC/항원 프리믹스용으로 사용된 항원의 양은 1x106개 B 세포당 약 0.001 ㎍, 0.005 ㎍, 0.01 ㎍, 0.05 ㎍, 0.1 ㎍, 0.2 ㎍, 0.3 ㎍, 0.4 ㎍, 0.5 ㎍, 0.75 ㎍, 1.0 ㎍, 2 ㎍, 5 ㎍ 또는 10 ㎍이거나; 또는 1x106개 B 세포당 약 0.001 ㎍ 내지 10 ㎍의 범위일 것이다. 항원-특이적 형질모세포의 풍부화를 위해 PBMC/항원 프리믹스용으로 사용된 항원의 양을 (일상 실험에 의하여) 측정하는 것은 통상의 기술자의 기술 범위 내에 속한다.The amount of antigen used for the PBMC / antigen pre-mix according to the present methods may vary. The present invention provides exemplary data showing that about 0.1 to 2 < RTI ID = 0.0 > pg < / RTI > of antigen for each 1x10 6 B cells in the PBMC / antigen premix resulted in effective and robust enrichment of antigen-specific progenitor cells. However, the method is not limited to the amount of antigen used in the PBMC / antigen pre-mix. Generally, PBMC / antigen the amount 1x10 6 gae about 0.001 ㎍ per B cells of the antigen used for the premix, 0.005 ㎍, 0.01 ㎍, 0.05 ㎍, 0.1 ㎍, 0.2 ㎍, 0.3 ㎍, 0.4 ㎍, 0.5 ㎍, 0.75 ㎍ , 1.0 占 퐂, 2 占 퐂, 5 占 퐂, or 10 占 퐂; Or from about 0.001 [mu] g to 10 [mu] g per 1 x 10 < 6 > B cells. It is within the skill of the ordinary artisan to measure (by routine experiment) the amount of antigen used for PBMC / antigen pre-mix for enrichment of antigen-specific plasma cells.
본 방법에 따른 PBMC/항원 프리믹스를 위한 시간의 길이는 다양할 수 있다. 본 발명은 30분 PBMC/항원 프리믹스가 항원-특이적 형질모세포의 효과적이고 강건한 풍부화를 가져왔음을 보여주는 예시적인 데이터를 제공한다. 일반적으로, PBMC/항원 프리믹스를 위한 시간의 길이는 약 10분 내지 약 180분, 예컨대, 예를 들어 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 30분, 약 45분, 약 60분, 약 75분, 약 90분, 약 120분, 약 150분 또는 약 180분일 것이다. 항원-특이적 형질모세포의 풍부화를 위해 PBMC/항원 프리믹스를 위한 시간의 길이를 (일상 실험에 의하여) 측정하는 것은 통상의 기술자의 기술 범위 내에 속한다.The length of time for the PBMC / antigen pre-mix according to the present method may vary. The present invention provides exemplary data showing that a 30 minute PBMC / antigen pre-mix resulted in an effective and robust enrichment of antigen-specific progenitor cells. Generally, the length of time for the PBMC / antigen pre-mix is from about 10 minutes to about 180 minutes, such as about 10 minutes, about 15 minutes, about 20 minutes, about 30 minutes, about 45 minutes, about 60 minutes, About 75 minutes, about 90 minutes, about 120 minutes, about 150 minutes, or about 180 minutes. It is within the skill of the ordinary artisan to measure (by routine experimentation) the length of time for the PBMC / antigen pre-mix for enrichment of antigen-specific pluripotent cells.
본 방법에 따라 PBMC/항원 프리믹스가 일어나는 온도는 다양할 수 있다. 본 발명은 예로서 37℃에서 (30분 동안) PBMC/항원 프리믹스의 수행이 항원-특이적 형질모세포의 효과적이고 강건한 풍부화를 가져왔음을 보여준다. PBMC/항원 프리믹스가 일어나는 온도를 (일상 실험에 의하여) 측정하는 것은 통상의 기술자의 기술 범위 내에 속한다. 일반적으로, 보다 낮은 온도는 보다 긴 PBMC/항원 프리믹스 시간을 필요로 할 수 있다. 예를 들어, 37℃에서보다는 30℃에서의 PBMC/항원 프리믹스의 수행이 30분보다 긴, 예컨대, 예를 들어 약 45분, 약 60분, 약 90분 등의 항원 프리믹스 시간을 필요로 할 수 있다.The temperature at which the PBMC / antigen premix occurs according to the present method may vary. The present invention shows that, for example, the performance of PBMC / antigen premix at 37 占 (for 30 minutes) resulted in an effective and robust enrichment of antigen-specific progenitor cells. It is within the skill of the ordinary artisan to measure (by routine experiment) the temperature at which the PBMC / antigen premix occurs. Generally, lower temperatures may require longer PBMC / antigen pre-mix times. For example, the performance of a PBMC / antigen pre-mix at 30 ° C rather than 37 ° C may require an antigen pre-mix time of greater than 30 minutes, such as for example about 45 minutes, about 60 minutes, about 90 minutes, have.
일부 측면에서, PBMC/항원 프리믹스는 아주반트, 예를 들어 완전 프로인트 아주반트, 알룸, 사포닌 등의 부재하에 또는 존재하에 수행될 수 있다. 그 밖의 알려져 있는 아주반트 또한 PBMC/항원 프리믹스에 사용될 수 있다.In some aspects, the PBMC / antigenic premix can be performed in the absence or in the presence of a conjugate, such as complete Freund's adjuvant, alum, saponin, and the like. Other known adjuvants can also be used in PBMC / antigen primmix.
임의 개수의 세포를 PBMC/항원 프리믹스 단계에서 항원과 혼합시키거나 또는 접촉시킬 수 있다. 본 방법은 PBMC/항원 프리믹스에서 항원과 접촉된 세포의 수에 제한되지 않는다. 항원-특이적 형질모세포의 풍부화를 위해 PBMC/항원 프리믹스용으로 사용된 세포의 수를 (일상 실험에 의하여) 측정하는 것은 통상의 기술자의 기술 범위 내에 속한다.Any number of cells can be mixed or contacted with the antigen at the PBMC / antigen pre-mix step. The method is not limited to the number of cells contacted with the antigen in the PBMC / antigen pre-mix. It is within the skill of the ordinary artisan to measure (by routine experimentation) the number of cells used for PBMC / antigen pre-mix for enrichment of antigen-specific plasma cells.
본 방법에 따라 면역손상 동물의 비장으로 이식된 세포 (예를 들어, PBMC)의 수 역시도 다양할 수 있다. 본 발명은 면역손상 마우스의 비장으로 이식된 50x106개 PBMC가 희귀 항원-특이적 형질모세포의 성공적인 동정을 가져왔음을 보여주는 예시적인 데이터를 제공한다. 그러나 본 방법은 면역손상 동물의 비장으로 이식된 세포의 수에 제한되지 않는다. 면역손상 동물의 비장으로 이식된 세포의 수를 (일상 실험에 의하여) 측정하는 것은 통상의 기술자의 기술 범위 내에 속한다. 일반적으로, 세포의 수는 약 1x105, 약 1x106, 약 5x106, 약 1x107, 약 5x107, 약 1x108, 약 5x108, 약 1x109, 약 5x109 또는 약 1x1010개일 것이다.The number of cells (e. G., PBMC) transplanted into the spleen of immunocompromised animals according to the present method may also vary. The present invention provides exemplary data showing that 50 x 10 < 6 > PBMCs transplanted into the spleen of immunocompromised mice resulted in successful identification of rare antigen-specific progenitor cells. However, the method is not limited to the number of cells transplanted into the spleen of immunocompromised animals. It is within the skill of the ordinary artisan to measure (by routine experimentation) the number of cells transplanted into the spleen of immunocompromised animals. In general, the number of cells is from about 1x10 5, about 1x10 6, about 5x10 6, about 1x10 7, about 5x10 7, about 1x10 8, 5x10 about 8, about 1x10 9, 5x10 9 to about 10 days or about 1x10.
비장내 이식 뒤에, 이식된 PBMC로 하여금 단리되기 전에 다양한 양의 시간 동안 비장에 잔류하도록 할 수 있다. 본 발명은 이식된 PBMC로 하여금 면역손상 마우스의 비장내에 7 또는 8일 동안 잔류하게 하는 것이 파상풍 변독소 및 헤마글루티닌에 대한 항원-특이적 형질모세포의 효과적이고 강건한 풍부화으로 귀결되었음을 보여주는 예시적인 데이터를 제공한다. 일반적으로, 이식된 PBMC가 단리되기 전에 비장 안에 잔류하는 시간의 길이는 약 4일 내지 약 14일, 약 7일 내지 약 10일, 약 7일, 또는 약 8일이 될 것이다. 그러나, 이식된 PBMC는 비장내 주사 후에 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 또는 14일 초과 동안 비장 안에 잔류할 수 있다. 14일이 넘어가면, 이식된 PBMC는 마우스 자연 살해 (NK) 세포에 대한 공격을 개시할 수 있는 것으로 예상되거나 또는 예감된다. 보다 적은 수의 세포의 비장내 이식은 이식된 PBMC로 하여금 그들의 단리 전에 비장에 보다 긴 시간 동안 잔류하게 할 수 있다. 항원-특이적 형질모세포의 풍부화를 위한 단리 전에 PBMC가 비장에 잔류할 시간의 길이를 (일상 실험에 의하여) 측정하는 것은 통상의 기술자의 기술 범위 내에 속한다.Following intra-spleen transplantation, the transplanted PBMCs may be allowed to remain in the spleen for various amounts of time before isolation. The present invention provides an exemplary method of demonstrating that allowing the grafted PBMC to remain in the spleen of the immunocompromised mouse for 7 or 8 days resulted in an effective and robust enrichment of antigen-specific growth cells for tetanus toxin and hemagglutinin Data. Generally, the length of time that the implanted PBMC remains in the spleen before isolation is from about 4 days to about 14 days, from about 7 days to about 10 days, about 7 days, or about 8 days. However, the transplanted PBMC may be administered at about 1 day, about 2 days, about 3 days, about 4 days, about 5 days, about 6 days, about 7 days, about 8 days, about 9 days, about 10 days, About 11 days, about 12 days, about 13 days, about 14 days, or more than 14 days. After 14 days, the transplanted PBMC is expected or predicted to be able to initiate an attack on mouse natural killer (NK) cells. Intra-spleen transplantation of a smaller number of cells may allow the transplanted PBMC to remain in the spleen for a longer time before their isolation. It is within the skill of the art to measure (by routine experimentation) the length of time that PBMC remain in the spleen prior to isolation for enrichment of antigen-specific pluripotent cells.
일부 실시양태에서, PBMC는 하나의 개별 공여자로부터 수득된다. 다른 실시양태에서, PBMC는 하나 초과의 개별 공여자로부터 수득된다. 하나 초과의 공여자로부터 수득한 PBMC는 PBMC/항원 프리믹스 전에 또는 PBMC/항원 프리믹스에 이어 비장내 주사 전에 풀링되거나 또는 함께 혼합될 수 있다.In some embodiments, the PBMCs are obtained from one individual donor. In another embodiment, PBMCs are obtained from more than one individual donor. PBMCs obtained from more than one donor can be pooled prior to intra-spleen injection or mixed together prior to PBMC / antigen pre-mix or PBMC / antigen pre-mix.
본 방법은 공여자로부터 수득한 항원-특이적 형질모세포의 풍부화를 위한 PBMC 또는 PBL의 사용에 제한되지 않는다. 형질모세포 및 B 세포에 대한 다른 공여자 세포 공급원, 예컨대 예를 들어 비장세포, 골수 세포, 편도세포, 림프선으로부터 수득한 세포, 줄기세포 등이 본 방법과 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 측면에서, 비장세포 (즉, 비장 세포)는 본 발명에 따른 항원-특이적 형질모세포의 풍부화에 사용하기 위한 공여자로부터 수득될 수 있다. 비장세포는 1종 이상의 항원으로 면역화시킨 마우스로부터 단리되고, 혼합된 다음, 인큐베이션하거나, 또는 본원 기재의 방법에 따라 항원과 접촉시키고 (항원 프리믹스), 그 후 면역손상 동물의 비장으로 주입시킬 수 있다. 항원 프리믹스 전에, 비장세포는 예를 들어 피콜(Ficoll) 분리 기술을 포함하여 통상의 기술자에 의하여 잘 알려진 방법을 이용하여 단핵세포 (예를 들어, 형질모세포, B 세포 등)에 대하여 풍부화될 수 있다.The method is not limited to the use of PBMCs or PBLs for enriching antigen-specific pluripotent cells obtained from a donor. Plasma cells and other donor cell sources for B cells, such as spleen cells, bone marrow cells, tonsil cells, cells obtained from the lymphatic system, stem cells, etc., can be used with the present methods. For example, in certain aspects, spleen cells (i.e., spleen cells) can be obtained from a donor for use in enriching antigen-specific transformed cells according to the present invention. Splenocytes can be isolated from mice immunized with one or more antigens, mixed, incubated, or contacted with antigen (antigenic premix) according to the methods described herein, and then injected into the spleen of immunocompromised animals . Prior to antigenic premixing, spleen cells may be enriched for mononuclear cells (e. G., Plasma cells, B cells, etc.) using methods well known to those of ordinary skill in the art, including, for example, Ficoll separation techniques .
본 발명은 1종 초과의 항원에 대하여 또는 동일한 항원의 상이한 변이체, 단리체, 하위유형 또는 상동체에 대하여 특이성을 갖는 (예를 들어, 그들을 인식할 수 있거나 또는 그들에 결합할 수 있는) 희귀 형질모세포 (및 희귀 B 세포) (및 그들의 상응하는 모노클로날 항체)를 동정하는 효율적이고 효과적인 수단을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 1종 초과의 항원을 인식할 수 있거나 그들에 결합할 수 있거나 또는 동일한 항원의 상이한 변이체, 단리체, 하위유형 또는 상동체를 인식할 수 있거나 그들에 결합할 수 있는 항체를 생산하는 항원-특이적 형질모세포를 동정하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 예로서, 개별적으로 A형 인플루엔자 바이러스 군1 및 군2 헤마글루티닌 하위유형을 인식하는 모노클로날 항체를 포함하여 헤마글루티닌에 대하여 지향된 희귀 인간 모노클로날 항체를 동정하기 위한 본 방법의 사용을 보여준다.The present invention encompasses the use of a rare trait (e. G., Capable of recognizing or capable of binding to) one or more antigens or having specificity for different variants, islets, subtypes or homologs of the same antigen (And rare B cells) (and their corresponding monoclonal antibodies). In one aspect, the invention provides antibodies capable of recognizing, binding to, or recognizing more than one antigen, or capable of recognizing, or capable of binding to, different variants, islets, subtypes or homologs of the same antigen Lt; RTI ID = 0.0 > of the < / RTI > antigen-specific progenitor cells. For example, the invention encompasses, by way of example, non-limiting examples of a rare human monoclonal antibody directed against hemagglutinin, including a monoclonal antibody that recognizes subtypes of influenza A virus group 1 and group 2 hemagglutinin individually ≪ / RTI > antibody.
따라서, 본 방법은 동일한 항원 (예를 들어, 단백질, 폴리펩티드 등)의 1종 이상의 상이한 변이체, 상동체, 하위유형 또는 이소형을 인식하거나, 그들에 결합하거나 또는 그들에 대한 특이성을 갖는 항체 (예컨대, 모노클로날 항체, 특히 인간 모노클로날 항체), 예컨대, 예를 들어 하나 초과의 종으로부터의 동일한 또는 상동 항원을 인식하거나, 그에 결합하거나 또는 그에 대한 특이성을 보유하거나, 상이한 종으로부터의 동일한 또는 상동 항원을 인식하거나, 그에 결합하거나 또는 그에 대한 특이성을 보유하거나, 하나 초과의 종에 공통인 동일한 또는 상동 항원을 인식하거나, 그에 결합하거나 또는 그에 대한 특이성을 갖는 항체 (예를 들어, 예컨대 인간 및 마우스로부터의 동일한 또는 상동 항원을 인식하거나, 그에 결합하거나 또는 그에 대한 특이성을 갖는 항체)의 동정에 유용하다. 그러한 항체는 상이한 종, 하위유형, 단리물 (예를 들어, 바이러스 단리물), 균주 등으로부터의 동일한 항원 또는 상동 항원을 인식하고/하거나 그 항원에 결합하는 그들의 능력에 의해 특히 유용하다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 교차반응성 항체 (예를 들어, 인간 항원뿐만 아니라 비-인간 동물 항원에도 결합하거나 또는 그들을 인식할 수 있는 항체)의 동정에 유용하다.Thus, the present methods can be used to identify, bind to, or have antibodies specific for one or more different variants, homologs, subtypes or isoforms of the same antigen (e. G., Protein, , Monoclonal antibodies, particularly human monoclonal antibodies), such as, for example, recognizing, binding to, or retaining specificity for the same or homologous antigen from more than one species, (E. G., Human and / or human) antibodies that recognize, bind to, or have specificity for a homologous antigen, recognize, bind to, or have specificity for the same or homologous antigen common to more than one species Recognizing, binding to, or specific for the same or homologous antigen from a mouse, It is useful for the identification of antibodies) having. Such antibodies are particularly useful by their ability to recognize and / or bind to the same or homologous antigen from different species, subtypes, isolates (e.g., viral isolates), strains, In some embodiments, the methods are useful for identifying cross-reactive antibodies (e. G., Antibodies that bind to or recognize human antigens as well as non-human animal antigens).
본 방법에 의하여 수득한 항체는 다양한 연구, 의학적, 치료적 (예를 들어, 수동 면역요법), 및 진단적 적용에 유용하다.The antibodies obtained by this method are useful in a variety of research, medical, therapeutic (e.g., passive immunotherapy), and diagnostic applications.
재조합 방법 및 조성물Recombinant methods and compositions
본 발명의 방법을 사용하여 동정된 항체는 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 바와 같은 재조합 방법과 조성물을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따라 동정된 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자가 단리될 수 있다. 그러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 코딩할 수 있다. 추가 실시양태에서, 그러한 핵산을 포함하는 1종 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가 실시양태에서, 그러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 하나의 그러한 실시양태에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열과 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터와 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다 (예를 들어, (1) 또는 (2)로 형질전환된다). 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다.Antibodies identified using the methods of the present invention may be produced using recombinant methods and compositions such as those described, for example, in U.S. Patent No. 4,816,567. For example, an isolated nucleic acid molecule encoding an antibody identified according to the present invention can be isolated. Such a nucleic acid may encode an amino acid sequence comprising the VL of the antibody and / or an amino acid sequence comprising the VH of the antibody (e.g., the light and / or heavy chain of the antibody). In a further embodiment, one or more vectors (e. G., Expression vectors) comprising such nucleic acids are provided. In a further embodiment, host cells comprising such nucleic acids are provided. In one such embodiment, the host cell comprises (1) a vector comprising a nucleic acid encoding an amino acid sequence comprising the VL of the antibody and an amino acid sequence comprising the VL of the antibody, or (2) a vector comprising a VL of the antibody (E. G., Transformed into (1) or (2)) a first vector comprising a nucleic acid encoding a sequence and a second vector comprising a nucleic acid encoding an amino acid sequence comprising the VH of the antibody . In one embodiment, the host cell is an eukaryotic cell, such as a Chinese hamster ovary (CHO) cell or a lymphoid cell (e.g., Y0, NS0, Sp20 cells).
항체의 재조합 생산을 위해, 항체, 예를 들어 본원 기재의 방법을 사용하여 동정된 항체를 코딩하는 핵산은 단리된 다음 숙주 세포에서의 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입된다. 그러한 핵산은 통상적인 절차를 이용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄와 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 쉽사리 단리 및 서열분석될 수 있다.For recombinant production of the antibody, the antibody, e.g., the nucleic acid encoding the antibody identified using the methods described herein, is isolated and inserted into one or more vectors for further cloning and / or expression in host cells. Such nucleic acids can be readily isolated and sequenced using conventional procedures (e.g., by using oligonucleotide probes capable of specifically binding to the genes encoding the heavy and light chains of the antibody).
항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 본원 기재의 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 항체는 특히 당화 및 Fc 이펙터 기능을 필요로 하지 않을 때 박테리아에서 생산될 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,648,237, 5,789,199 및 5,840,523을 참조한다. (또한, 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254] (이. 콜라이에서의 항체 단편 발현에 대하여 기재하고 있음) 참조). 발현 후, 항체는 박테리아 세포 페이스트로부터 가용성 분획으로 단리될 수 있고 추가 정제될 수 있다.Suitable host cells for cloning or expression of the antibody-coding vector include prokaryotic or eukaryotic cells as described herein. For example, antibodies can be produced in bacteria, especially when they do not require glycation and Fc effector function. For the expression of antibody fragments and polypeptides in bacteria, see, for example, U.S. Patent Nos. 5,648,237, 5,789,199 and 5,840,523. (See also Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (BKC Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254 ). After expression, the antibody can be isolated from the bacterial cell paste into soluble fractions and further purified.
원핵생물 이외에도, 자신의 당화 경로가 "인간화"되고, 그에 따라 부분적 또는 완전 인간 당화 패턴을 지닌 항체의 생산을 가져오는 진균 및 효모 균주를 포함하여 사상균 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 항체-코딩 벡터를 위한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 문헌 [Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)]을 참조한다.In addition to prokaryotes, eukaryotic microbes such as molds or yeast, including fungal and yeast strains, whose own glycation pathway is "humanized" and thus result in the production of antibodies with partial or full human glycation patterns, Lt; RTI ID = 0.0 > cloning < / RTI > Gerngross, Nat. Biotech . 22: 1409-1414 (2004), and Li et al., Nat. Biotech . 24: 210-215 (2006).
당화된 항체의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 생물 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스 균주가 동정되었다.Suitable host cells for the expression of glycated antibodies are also derived from multicellular organisms (invertebrates and vertebrates). Examples of invertebrate cells include plant and insect cells. Especially Spodoptera A number of baculovirus strains have been identified that can be used with insect cells for transfection of frugiperda cells.
식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서 항체를 생산하기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES)TM 기술에 관하여 기재하고 있음)를 참조한다.Plant cell cultures can also be used as hosts. See, for example, U.S. Patent Nos. 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 and 6,417,429 (describing PLANTIBODIES TM technology for producing antibodies in transgenic plants).
척추동물 세포가 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁 성장하도록 순응되는 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의하여 형질전환시킨 원숭이 신장 CV1 계통 (COS-7); 인간 태아 신장 계통 (예를 들어 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 베이비 햄스터 신장세포 (BHK); 마우스 세르톨리(sertoli) 세포 (예를 들어 문헌 [Mather, Biol . Reprod . 23:243-251 (1980)]에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 개 신장세포 (MDCK); 버팔로 래트 간세포 (BRL 3A); 인간 폐세포 (W138); 인간 간세포 (Hep G2); 마우스 유방 종양 (MMT 060562); 예를 들어 문헌 [Mather et al., Annals N.Y . Acad . Sci . 383:44-68 (1982)]에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR- CHO 세포 (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))를 비롯한 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포; 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0를 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해서는, 예를 들어 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다.Vertebrate cells can also be used as hosts. For example, mammalian cell lines adapted for suspension growth may be useful. Other examples of useful mammalian host cell lines are SV40-infected monkey kidney CV1 line (COS-7); 293 or 293 cells as described in the human fetal kidney line (see, e.g., Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); Baby hamster kidney cells (BHK); Mouse Sertoli cells (for example, TM4 cells as described in Mather, Biol . Reprod . 23: 243-251 (1980)); Monkey kidney cells (CV1); African green monkey kidney cells (VERO-76); Human cervical carcinoma cells (HELA); Canine kidney cells (MDCK); Buffalo rat hepatocytes (BRL 3A); Human lung cells (W138); Human hepatocytes (Hep G2); Mouse breast tumor (MMT 060562); See, e.g., Mather et al., Annals NY . Acad . Sci . 383: 44-68 (1982);
실시예Example
하기는 본 발명의 방법과 조성물의 예이다. 상기 제공된 개요가 주어지면 다양한 다른 실시양태가 실시될 수 있다고 이해된다.The following are examples of the methods and compositions of the present invention. It is understood that various other embodiments may be practiced given the above provided summary.
실시예 1. 형질모세포 풍부화 및 팽창Example 1. Plasma cell enrichment and expansion
하기 실험은 SCID/베이지 마우스로 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 비장내 이식 후에 일어나는 PBMC 팽창 및 분화의 효과를 평가하기 위하여 수행되었다.The following experiments were performed to evaluate the effects of PBMC dilation and differentiation following spleen implantation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with SCID / beige mice.
정상인 공여자로부터의 류코팩(leukopac)을 태평양 혈액센터(Blood Centers of the Pacific, 미국 캘리포니아주 샌프란시스코)로부터 입수하였다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 표준 방법론을 이용하여 류코팩으로부터 단리하였다. 6 내지 8주령 암컷 SCID/베이지 마우스를 찰스 리버 래보러토리즈 (Charles River Laboratories, 미국 캘리포니아주 홀리스터)로부터 구입하였으며 미국 실험동물 관리 협회 지침(American Association of Laboratory Animal Care guidelines)에 따라 제넨테크(Genentech)에 수용하고 유지시켰다. 모든 실험 연구는 실험동물의 관리 및 사용 지침서(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals) 및 준거 법률 및 규정에 따라 AAALACi-인가 시설에서 제넨테크 실험동물 연구의 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committees of Genentech Lab Animal Research)의 승인하에 수행되었다. 건강인 공여자로부터의 류코팩 또는 혈액은 동의서가 제공되고 서부 기관윤리심의위원회(Western Institutional Review Board)로부터 윤리심사에 의한 승인이 허여된 후 입수되었다.Leukopac from normal donors was obtained from Blood Centers of the Pacific (San Francisco, CA, USA). Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from Ryukopak using standard methodology. Six to eight week old female SCID / beige mice were purchased from Charles River Laboratories (Hollister, CA) and were purchased from Genentech, Inc. under the American Association of Laboratory Animal Care guidelines ). ≪ / RTI > All experimental studies are conducted at the AAALAC-accredited facilities in accordance with the Guidelines for the Management and Use of Laboratory Animals and in accordance with the relevant laws and regulations, and the Institutional Animal Care and Use of Genentech Laboratory Animal Research Committees of Genentech Lab Animal Research. Ryukopaq or blood from a healthy donor was obtained after a written consent was provided and approved by ethics review from the Western Institutional Review Board.
6 내지 8주령 암컷 SCID/베이지 마우스 (찰스 리버 래보러토리즈, 미국 캘리포니아주 홀리스터)에 세슘-137 공급원을 사용하여 350 rad로 준치사적으로 조사하였다. 폴리믹신 B (110 mg/L) 및 네오마이신 (1.1 g/L)을 조사 후에 오는 7일 동안 식수에 첨가하였다. 조사한지 4시간 후, 각 마우스의 좌측 옆구리를 제모한 다음 베타딘(Betadine)®(퍼듀 파마(Purdue Pharma), 미국 코네티컷주 스탬포드)과 70% 알콜로 준비시켰다. 무균 외과적 절차를 이용하여 마취하에 외과적 절차를 수행하였다. 각 마우스의 늑골 경계 바로 밑에 1 cm 피부 절개를 행하고, 뒤이어 복벽 및 복막의 절개를 행하였다. 각 마우스의 비장을 신중을 기하여 노출시키고 30 ㎕ PBS에 재현탁시킨 50x106개 인간 PBMC를 주입하였다. 각각 5-O 비크릴(Vicryl)® 봉합사 (에티콘(Ethicon), 미국 뉴저지주 서머빌) 및 외과용 스테이플을 사용하여 근육층에서 및 피부에서 절개부를 봉합하였다. 마우스를 이식후 8일차에서 희생시키고, 그들의 비장을 수확하였다.Were irradiated sub-specially at 350 rad using a cesium-137 source at 6-8 week old female SCID / beige mice (Charles River Laboratories, Hollister, CA). Polymyxin B (110 mg / L) and neomycin (1.1 g / L) were added to the drinking water for the following 7 days after irradiation. It was prepared to investigate whether after 4 hours, the epilation the left flank of each mouse, and then Dean Beta (Betadine) ® (Purdue Pharma (Purdue Pharma), United States Stamford, Conn.) And 70% alcohol. Surgical procedures were performed under anesthesia using aseptic surgical procedures. A 1 cm skin incision was made right below the frame boundary of each mouse, followed by incision of the abdominal wall and peritoneum. The spleen of each mouse was carefully exposed and 50 x 106 human PBMCs resuspended in 30 [mu] l PBS were injected. Each 5-O ratio creel (Vicryl) was sutured ® suture (in dimethicone (Ethicon), Somerville, New Jersey, USA), and using surgical staples for the muscle layer and skin incision in the parts. Mice were sacrificed on
B 계통 세포를 구별하기 위하여 비장세포의 단일 세포 현탁액을 항-인간 mAb (CD38 PECy7, 비디 바이오사이언시스(BD Biosciences), 미국 캘리포니아주 산호세; 및 CD19)의 칵테일로 염색하였다.Single cell suspensions of spleen cells were stained with a cocktail of anti-human mAbs (CD38 PECy7, BD Biosciences, San Jose, CA and CD19) to differentiate B lineage cells.
도 1은 생체내 SCID 마우스에서의 형질모세포 분화의 결과를 도시한다. 이식전 (0일차로 표시) PBMC 또는 (인간 PBMC의 비장내 주사 후에 오는) 4, 7 및 8일차에 SCID 마우스로부터 수득한 비장세포를 항-CD19 및 항-CD38로 염색하고 분류하여 B 계통 세포를 구별하였다. 상부 원, 하부 원, 및 직사각형은 각각 형질모세포, 활성화된 배중심-유사 세포, 또는 나이브 B 세포를 나타낸다. 숫자는 %로 환산한 각 하위세트의 빈도를 나타낸다. 도 1에 도시된 바와 같이, 인간 형질모세포는 5x107개 인간 PBMC의 이식후 8일차에 총 비장세포 집단의 거의 40%로 팽창하였다.Figure 1 shows the results of transforming cell differentiation in SCID mice in vivo. Splenocytes obtained from SCID mice on
실시예 2. 파상풍 독소-특이적 인간 형질모세포의 풍부화Example 2. Enrichment of tetanus toxin-specific human plasma cells
헌혈 7일전 DT (디프테리아 및 파상풍 변독소) 백신을 투여받은 정상인 공여자로부터의 류코팩을 태평양 혈액센터(미국 캘리포니아주 샌프란시스코)로부터 입수하였다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 표준 방법론을 이용하여 류코팩으로부터 단리하였다. 6 내지 8주령 암컷 SCID/베이지 마우스를 찰스 리버 래보러토리즈 (미국 캘리포니아주 홀리스터)로부터 구입하였으며 미국 실험동물 관리 협회 지침에 따라 제넨테크에 수용하고 유지시켰다. 모든 실험 연구는 실험동물의 관리 및 사용 지침서 및 준거 법률 및 규정에 따라 AAALACi-인가 시설에서 제넨테크 실험동물 연구의 동물실험윤리위원회의 승인하에 수행되었다. 건강인 공여자로부터의 류코팩 또는 혈액은 동의서가 제공되고 서부 기관윤리심의위원회로부터 윤리심사에 의한 승인이 허여된 후 입수되었다.Seven days prior to donation, Ryukopak from a normal donor receiving a DT (diphtheria and tetanus toxin) vaccine was obtained from the Pacific Blood Center (San Francisco, CA, USA). Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from Ryukopak using standard methodology. Six to eight week old female SCID / beige mice were purchased from Charles River Laboratories (Hollister, CA) and were housed and maintained in Genentech under the guidelines of the American Laboratory Animal Care Association. All experimental studies were conducted under the approval of the Animal Experimental Ethics Committee of the Genentech Laboratory Animal Research at AAALACI-accredited facilities in accordance with the Guidelines for the Management and Use of Laboratory Animals and the relevant laws and regulations. Ryukopaq or blood from a health donor was obtained after a written consent was provided and approved by the Ethics Review Board of the Western Institutional Ethics Committee.
생체내 항원-유도 형질모세포 풍부화 및 팽창은 다음과 같이 PBMC의 비장내 이식을 이용하여 수행되었다. 상기 기재된 바와 같이 수득한 단리된 PBMC를 각 1x106개 B 세포에 대하여 0.1 내지 2 ㎍으로 파상풍 변독소 (TT) (리스트 바이올로지컬 래보러토리즈, 인크.(List Biological Laboratories, Inc.), 미국 캘리포니아주 캠벨)와 재현탁시키고 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다 (PBMC/항원 프리믹스). PBMC/항원 프리믹스에 이어서, PBMC를 비장내 주사 전에 부드럽게 세척하여 잉여 또는 미결합 항원을 제거하였다. 실험의 이러한 시리즈에서, 일부 PBMC는 파상풍 독소-특이적 형질모세포의 풍부화의 범위 또는 정도에 미치는 항원 프리믹스의 효과를 비교하기 위하여 비장내 주사 전에 어떠한 항원 프리믹스에도 투입하지 않았다.In vivo antigen-induced plasma cell enrichment and expansion was performed using splenic transplantation of PBMC as follows. The one described for the isolated PBMC in the range of 0.1 to 2 ㎍ for each 1x10 6 B cells gae tetanus toxin sides (TT) (see list Biology logical below grease soil, Inc.. (List Biological Laboratories, Inc.) obtained as described, USA (Campbell, Calif.) And incubated for 30 min at 37 [deg.] C (PBMC / antigen pre-mix). Following PBMC / antigen pre-mix, PBMC were gently rinsed prior to intra-spleen injection to remove excess or unbound antigen. In this series of experiments, some PBMCs did not enter any antigenic premixes prior to intra-spleen injection to compare the effects of antigenic premixes on the extent or extent of enrichment of tetanus toxin-specific plasmogenesis cells.
6 내지 8주령 암컷 SCID/베이지 마우스 (찰스 리버 래보러토리즈, 미국 캘리포니아주 홀리스터)에 세슘-137 공급원을 사용하여 350 rad로 준치사적으로 조사하였다. 폴리믹신 B (110 mg/L) 및 네오마이신 (1.1 g/L)을 조사 후에 오는 7일 동안 식수에 첨가하였다. 조사한지 4시간 후, 각 마우스의 좌측 옆구리를 제모한 다음 베타딘®(퍼듀 파마, 미국 코네티컷주 스탬포드)과 70% 알콜로 준비훈련시켰다. 무균 외과적 절차를 이용하여 마취하에 외과적 절차를 수행하였다. 각 마우스의 늑골 경계 바로 밑에 1 cm 피부 절개를 행하고, 뒤이어 복벽 및 복막의 절개를 행하였다. 각 마우스의 비장을 신중을 기하여 노출시키고 30 ㎕ PBS에 재현탁시킨 50x106개 인간 PBMC를 주입하였다. 각각 5-O 비크릴® 봉합사 (에티콘, 미국 뉴저지주 서머빌) 및 외과용 스테이플을 사용하여 근육층에서 및 피부에서 절개부를 봉합하였다. 항원-특이적 세포 분류 실험을 위해, 마우스를 이식후 8일차에서 참수하고, 그들의 비장을 수확하였다.Were irradiated sub-specially at 350 rad using a cesium-137 source at 6-8 week old female SCID / beige mice (Charles River Laboratories, Hollister, CA). Polymyxin B (110 mg / L) and neomycin (1.1 g / L) were added to the drinking water for the following 7 days after irradiation. Survey after four one hour after depilation the left flank of each mouse was ready for the next beta Dean ® training (Purdue Pharma, Stamford, Conn., USA) with 70% alcohol. Surgical procedures were performed under anesthesia using aseptic surgical procedures. A 1 cm skin incision was made right below the frame boundary of each mouse, followed by incision of the abdominal wall and peritoneum. The spleen of each mouse was carefully exposed and 50 x 106 human PBMCs resuspended in 30 [mu] l PBS were injected. Each non-5-O methacrylic ® suture (a dimethicone, Somerville, NJ) and used by the surgical staples were suture an incision in the muscle layer and skin. For antigen-specific cell sorting experiments, mice were beheaded at
비장세포의 단일 세포 현탁액을 인간 IgG+ 형질모세포를 CD38highIgG+ 발현으로서 정의하는 항-인간 mAb (CD38 PECy7, 비디 바이오사이언시스, 미국 캘리포니아주 산호세; 및 IgG 다일라이트(Dylight), 잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈, 인크.(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브)의 칵테일로 염색하였다. 파상풍 변독소-반응성 형질모세포는 rTTc.PE (파상풍 독소 C-단편, 리스트 바이올로지컬 래보러토리즈, 인크., 미국 캘리포니아주 캠벨) 및 형질세포에서 발견되는 막관통 단백질인 인간 p63을 인식하는 모노클로날 마우스 항체인 VS38c-FITC (다코(Dako), 미국 캘리포니아주 카핀테리아)로 염색함으로써 동정하였다.Wherein defining the single cell suspension of spleen cells in the human IgG + transfected cells as CD38 high IgG + expression-human mAb (CD38 PECy7, video bio Cyan System, USA, San Jose, California; and IgG Dail light (Dylight), Jackson immunometric Research below (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA). Tetanus toxin-reactive phenotypic cells were identified as rTTc.PE (tetanus toxin C-fragment, Listbiologic Laboratories, Inc., Campbell, CA) and monoclonal antibodies recognizing human p63, a transmembrane protein found in plasma cells And stained with VS38c-FITC (Dako, Carpinteria, CA, USA).
이어서 샘플을 아리아(Aria) 고속 세포 선별기 (비디 바이오사이언시스, 미국 캘리포니아주 산호세)상에서 프로피디움 아이오다이드 사멸 세포 배제의 존재하에서 분석하였으며, 항-파상풍 독소-특이적 형질모세포를 5% 낮은 IgG 태아 소 혈청 (깁코(Gibco), 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)으로 보충한 50 ㎕ RPMI 세포 배양배지를 함유한 96-웰 조직 배양 플레이트에 단일 세포 방식으로 분류하였다. 5x106개 생존 세포를 모든 분석 프로파일에 대하여 기록하였다. 프로파일은 플로우조(Flowjo) 버전 9.4.11 소프트웨어로 분석하였다.Samples were then analyzed in the presence of propidium iodide apoptotic cells on an Aria high-speed cell sorter (Vidi Biosciences, San Jose, CA, USA) and anti-tetanus toxin-specific progenitor cells were treated with 5% lower IgG Well tissue culture plates containing 50 [mu] l RPMI cell culture medium supplemented with fetal bovine serum (Gibco, Grand Island, NY, USA). 5 x 10 < 6 > viable cells were recorded for all assay profiles. Profiles were analyzed with Flowjo version 9.4.11 software.
SCID/베이지 수용자의 비장내 이식시, 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 고속 팽창 및 인간 형질모세포로의 분화를 위한 B-세포 활성화를 겪었다. 구체적으로, TT 항원 프리믹스에 투입되지 않은 인간 형질모세포는 5x107개 인간 PBMC의 이식후 8일차에 총 비장세포 집단의 거의 40%로 팽창하였다.In splenic transplantation of SCID / beige recipients, human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) underwent B-cell activation for rapid expansion and differentiation into human plasma cells. Specifically, human plasma cells not injected into the TT antigen premix expanded to approximately 40% of the total spleen cell population on
항원-특이적 형질모세포를 풍부화하기 위하여 당해 과정을 개선시킬 수 있는지를 결정하기 위하여, B-세포 수용체 복합체에의 항원 결합을 통해 생존 신호를 제공하도록 파상풍-백신접종한 인간 공여자로부터의 PBMC를 비장내 주사 전에 파상풍 변독소와 인큐베이션하였다 (PBMC/항원 프리믹스). 당해 기술은 이식 전에 항원과 인큐베이션하지 않았던 세포와 비교하여 파상풍 변독소-결합 모노클로날 항체를 생산하는 형질모세포의 20배 풍부화를 가져왔다.In order to determine whether the process can be improved to enrich antigen-specific pluripotent cells, PBMCs from human donors with tetanus-vaccinated to provide a survival signal through antigen binding to the B-cell receptor complex are spleen The cells were incubated with tetanus toxin (PBMC / antigen pre-mix) prior to injection. The technique resulted in a 20-fold enrichment of the transforming cells producing the tetanus toxin-binding monoclonal antibody compared to the cells that were not incubated with the antigen prior to transplantation.
도 2a는 백신접종후 7일차에서 인간 공여자 항-TT+ PBMC의 대표적인 프로파일을 도시한다. 도 2b는 비장내 이식후 8일차에서 SCID 마우스의 비장으로부터 취한 항-TT+ 세포의 대표적인 프로파일을 도시한다. 도 2c는 표지한 바와 같이 각 자극 조건하에서 개별 마우스에서의 비장당 항-TT+ 세포의 정량화를 도시한다. 시토카인 칵테일은 hSCID 마우스에 ip 주사한 인간 BAFF (50 ㎍)와 IL-2, IL-6 및 IL-21 (각각 50 ng)의 혼합물을 함유하였다.Figure 2a shows a representative profile of human donor anti-CT + PBMC at
도 2에 도시된 바와 같이, 검사된 모든 조건 중에서, 가장 높은 수의 항-TT+ 형질모세포는 본원 기재의 방법을 사용하는 PBMC/항원 프리믹스에서 관찰되었다. 이들 발견은 파상풍 변독소-백신접종한 공여자로부터 수득한 PBMC를 사용하는 시험관내 PBMC/항원 프리믹스가 SCID/베이지 수용자내에 파상풍 독소 항원-특이적 형질모세포의 풍부화를 가져왔음을 나타내었다.As shown in Figure 2, among all the conditions tested, the highest number of anti-TT + plasmogenes was observed in the PBMC / antigen pre-mix using the method described herein. These findings showed that in vitro PBMC / antigen premixes using PBMCs obtained from tetanus toxin-vaccinated donors resulted in enrichment of tetanus toxin antigen-specific transfected cells in SCID / beige recipients.
실시예 3. A형 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 -특이적 인간 형질모세포의 풍부화 Example 3. Enrichment of type A influenza virus hemagglutinin -specific human plasma cells
헌혈 7일전 계절성 인플루엔자 플루비린(Fluvirin)® 백신 (노파르티스(Novartis) Lot #111796P1)을 투여받은 정상인 공여자로부터의 류코팩을 태평양 혈액센터(미국 캘리포니아주 샌프란시스코)로부터 입수하였다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 표준 방법론을 이용하여 류코팩으로부터 단리하였다. 6 내지 8주령 암컷 SCID/베이지 마우스를 찰스 리버 래보러토리즈 (미국 캘리포니아주 홀리스터)로부터 구입하였으며 미국 실험동물 관리 협회 지침에 따라 제넨테크에 수용하고 유지시켰다. 모든 실험 연구는 실험동물의 관리 및 사용 지침서 및 준거 법률 및 규정에 따라 AAALACi-인가 시설에서 제넨테크 실험동물 연구의 동물실험윤리위원회의 승인하에 수행되었다. 건강인 공여자로부터의 류코팩 또는 혈액은 동의서가 제공되고 서부 기관윤리심의위원회로부터 윤리심사에 의한 승인이 허여된 후 입수되었다.Ryukopak from a normal donor who received a seasonal influenza Fluvirin ( R ) vaccine (Novartis Lot # 111796P1) 7 days before donation was obtained from the Pacific Blood Center (San Francisco, CA, USA). Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from Ryukopak using standard methodology. Six to eight week old female SCID / beige mice were purchased from Charles River Laboratories (Hollister, CA) and were housed and maintained in Genentech under the guidelines of the American Laboratory Animal Care Association. All experimental studies were conducted under the approval of the Animal Experimental Ethics Committee of the Genentech Laboratory Animal Research at AAALACI-accredited facilities in accordance with the Guidelines for the Management and Use of Laboratory Animals and the relevant laws and regulations. Ryukopaq or blood from a health donor was obtained after a written consent was provided and approved by the Ethics Review Board of the Western Institutional Ethics Committee.
생체내 항원-유도 형질모세포 풍부화 및 팽창은 다음과 같이 PBMC의 비장내 이식을 이용하여 수행하였다. 단리된 PBMC를 헤마글루티닌 항원 (각 1x106개 B 세포에 대하여 0.1 내지 2 ㎍)과 재현탁시키고 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다 (PBMC/항원 프리믹스). 당해 인큐베이션에 이어서, PBMC를 세척하여 미결합 항원을 제거하였다. 교차반응성 헤마글루티닌 항체를 생산한 형질모세포를 풍부화하기 위하여, PBMC/항원 프리믹스 및 단일 세포 분류를 위해 사용된 헤마글루티닌 항원 변이체는 인플루엔자 플루비린® 백신 안에 함유된 헤마글루티닌 항원 변이체와 다르도록 특이적으로 선택되었다. 당해 연구에 사용된 헤마글루티닌 항원은 따라서 A형 인플루엔자 바이러스 단리물 A/NWS/1933으로부터의 H1 헤마글루티닌 (군1 A형 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌), A형 인플루엔자 바이러스 단리물 A/홍콩/8/1968로부터의 H3 헤마글루티닌 (군2 A형 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌), 및 A형 인플루엔자 바이러스 단리물 A/네덜란드/219/2003으로부터의 H7 헤마글루티닌 (군2 A형 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌)을 포함하였다. 헤마글루티닌 항원은 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 제넨테크에서 생산하였다.In vivo antigen-induced plasma cell enrichment and expansion were performed using the following transplantation of spleen cells in PBMCs. Isolated PBMCs were resuspended with hemagglutinin antigen (0.1 to 2 [mu] g for each 1x10 < 6 > B cells) and incubated for 30 min at 37 [deg.] C (PBMC / antigen premix). Following this incubation, the PBMCs were washed to remove unbound antigen. In order to enrich the cross-reactivity hemagglutinin antibodies transfected cell produces, the hemagglutinin antigen variant is the hemagglutinin antigen variants contained in influenza flu fishy ® vaccine used for PBMC / antigen premix and single cell sorting . ≪ / RTI > The hemagglutinin antigens used in the study were therefore identified as H1 hemagglutinin (group 1A influenza virus hemagglutinin) from type A influenza virus isolate A / NWS / 1933, type A influenza virus isolate A / H3 hemagglutinin from the Hong Kong / 8/1968 (group 2 A influenza virus hemagglutinin) and H7 hemagglutinin from group A influenza virus isolate A / Netherlands / 219/2003 (group 2 Type A influenza virus hemagglutinin). Hemagglutinin antigens were produced in Genentech using standard molecular biology techniques.
6 내지 8주령 암컷 SCID/베이지 마우스 (찰스 리버 래보러토리즈, 미국 캘리포니아주 홀리스터)에 세슘-137 공급원을 사용하여 350 rad로 준치사적으로 조사하였다. 폴리믹신 B (110 mg/L) 및 네오마이신 (1.1 g/L)을 조사 후에 오는 7일 동안 식수에 첨가하였다. 조사한지 4시간 후, 각 마우스의 좌측 옆구리를 제모한 다음 베타딘®(퍼듀 파마, 미국 코네티컷주 스탬포드)과 70% 알콜로 준비훈련시켰다. 무균 외과적 절차를 이용하여 마취하에 외과적 절차를 수행하였다. 각 마우스의 늑골 경계 바로 밑에 1 cm 피부 절개를 행하고, 뒤이어 복벽 및 복막의 절개를 행하였다. 각 마우스의 비장을 신중을 기하여 노출시키고 30 ㎕ PBS에 재현탁시킨 50x106개 인간 PBMC를 주입하였다. 각각 5-O 비크릴® 봉합사 (에티콘, 미국 뉴저지주 서머빌) 및 외과용 스테이플을 사용하여 근육층에서 및 피부에서 절개부를 봉합하였다. 항원-특이적 세포 분류 실험을 위해, 마우스를 이식후 8일차에서 참수하고, 그들의 비장을 수확하였다.Were irradiated sub-specially at 350 rad using a cesium-137 source at 6-8 week old female SCID / beige mice (Charles River Laboratories, Hollister, CA). Polymyxin B (110 mg / L) and neomycin (1.1 g / L) were added to the drinking water for the following 7 days after irradiation. Survey after four one hour after depilation the left flank of each mouse was ready for the next beta Dean ® training (Purdue Pharma, Stamford, Conn., USA) with 70% alcohol. Surgical procedures were performed under anesthesia using aseptic surgical procedures. A 1 cm skin incision was made right below the frame boundary of each mouse, followed by incision of the abdominal wall and peritoneum. The spleen of each mouse was carefully exposed and 50 x 106 human PBMCs resuspended in 30 [mu] l PBS were injected. Each non-5-O methacrylic ® suture (a dimethicone, Somerville, NJ) and used by the surgical staples were suture an incision in the muscle layer and skin. For antigen-specific cell sorting experiments, mice were beheaded at
마우스로부터 수득한 비장세포의 단일 세포 현탁액을 인간 IgG+ 형질모세포를 CD38high/IgG+ 발현으로서 정의하는 항-인간 모노클로날 항체 CD38 PECy7 (비디 바이오사이언시스, 미국 캘리포니아주 산호세)과 IgG 다일라이트 (잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈, 인크., 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브)의 칵테일로 염색하였다. 단리된 비장세포의 현탁액내 헤마글루티닌-교차반응성 형질모세포를 동정하기 위하여, 라이트닝-링크(Lightning-Link)® 표지 키트 (이노바 바이오사이언시스(Innova Biosciences), 영국 캠브리지)를 사용하여 각각 FITC 또는 PE와 사전에 접합시켜 놓은 A형 인플루엔자 바이러스 단리물 A/NWS/1933으로부터의 헤마글루티닌 H1 및 A형 인플루엔자 바이러스 단리물 A/홍콩/8/1968로부터의 헤마글루티닌 H3으로 세포를 염색하였다.Single cell suspensions of spleen cells obtained from mice were incubated with anti-human monoclonal antibody CD38 PECy7 (Vidi Biosciences, San Jose, Calif., USA) and IgG daille (Jackson), which define human IgG + plasmids as expression of CD38 high / IgG + Immunology Laboratories, Inc., West Grove, Pennsylvania, USA). In order to identify hemagglutinin-cross-reactive phenotypic cells in suspension of isolated splenocytes, cells were cultured using Lightning-Link ( R ) ® labeling kit (Innova Biosciences, Cambridge, England) Hemagglutinin H1 from type A influenza virus isolate A / NWS / 1933 pre-conjugated with FITC or PE and hemagglutinin H3 from type A influenza virus isolate A / Hong Kong / 8/1968 Lt; / RTI >
도 3a는 SCID/베이지 마우스 풍부화 전 (즉, PBMC/항원 프리믹스 전) 7일차 후-백신접종 PBMC로부터의 항-헤마글루티닌-양성 (H3 및 H1) 형질모세포의 대표적인 FACS 분석을 도시한다. 도 3b는 각각 상부 및 하부 패널에서 프리믹스-무함유와 항원 프리믹스를 비교하는, SCID/베이지 마우스 풍부화 후 8일차 후-이식으로부터의 헤마글루티닌-양성 (H3 및 H1) 형질모세포의 대표적인 FACS 데이터 분석을 도시한다. 도 3a 및 3b에 도시된 바와 같이, 비장내 이식전 PBMC/항원 프리믹스는 H3+/H1+ 항-헤마글루티닌-반응성 형질모세포의 보다 높은 빈도를 가져왔다.3A shows a representative FACS analysis of anti-hemagglutinin-positive (H3 and H1) plasma cells from
하기 표 1은 본원 기재의 SCID 풍부화 전후의 항-H1+/항-H3+ 형질모세포 빈도의 비교를 도시한다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 항-H1+/항-H3+ 형질모세포의 빈도는 SCID/베이지 마우스 풍부화 없이 관찰된 것과 비교하여 본 발명의 SCID/베이지 마우스 풍부화 방법을 사용하여 대폭 증가되었다.Table 1 shows the enrichment after SCID wherein -H1 + / + -H3 wherein transfected cells comparison of the frequency of the herein described. As shown in Table 1, the frequency of anti-H1 + / anti-H3 + plasma cells was greatly increased using the SCID / beige mouse enrichment method of the present invention compared with that observed without SCID / beige mouse enrichment.
이어서 샘플을 아리아 고속 세포 선별기 (비디 바이오사이언시스, 미국 캘리포니아주 산호세)상에서 프로피디움 아이오다이드 사멸 세포 배제의 존재하에서 분석하였으며, 항-헤마글루티닌-특이적 형질모세포를 5% 낮은 IgG 태아 소 혈청 (깁코, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)으로 보충한 50 ㎕ RPMI 세포 배양배지를 함유한 96-웰 조직 배양 플레이트에 단일 세포 방식으로 분류하였다. 5x106개 생존 세포를 모든 분석 프로파일에 대하여 기록하였다. 프로파일은 플로우조 버전 9.4.11 소프트웨어로 분석하였다.The samples were then analyzed in the presence of propidium iodide depletion cells on an Arya high-speed cell sorter (Vidi Biosciences, San Jose, CA, USA) and anti-hemagglutinin-specific progenitor cells were stained with 5% Were seeded into 96-well tissue culture plates containing 50 [mu] l RPMI cell culture medium supplemented with bovine serum (Gibco, Grand Island, NY, USA) in a single cell format. 5 x 10 < 6 > viable cells were recorded for all assay profiles. Profiles were analyzed with flow-driven version 9.4.11 software.
도 4는 프리믹스-무함유 (원)와 항원-프리믹스 (사각형)를 비교하는, 확률(stochastic) 반응을 나타내는 개별 SCID/베이지 마우스로부터의 8일차 후-이식으로부터 수득한 비장세포의 분석을 도시한다. 데이터는 %항-H1+/CD38high 형질모세포로서 제시된다. 직사각형은 항-H1+ 형질모세포를 제시한 마우스를 나타낸다.Figure 4 shows the analysis of splenocytes obtained from the eighth day post-transplantation from individual SCID / beige mice showing a stochastic response, comparing the premix-free (circles) and antigen-premixes (squares) . Data are presented as% anti-H1 + / CD38 high progeny. The rectangle represents a mouse presenting anti-H1 + plasma cells.
이들 결과는 A형 인플루엔자 바이러스 군1 (예를 들어, H1) 및 군2 (예를 들어, H3, H7) 헤마글루티닌 항원을 비장내 이식 전에 PBMC와 인큐베이션하였을 경우 광범위 헤마글루티닌-교차반응성 형질모세포가 검출되었음을 보여주었다. 이들 결과는 인플루엔자-백신접종한 공여자로부터의 헤마글루티닌 항원-프라이밍 PBMC의 시험관내 자극이 SCID/베이지 마우스 수용자 안에서 형질모세포의 헤마글루티닌 항원-특이적 풍부화를 촉진하였음을 추가로 나타내었다.These results indicate that when incubated with PBMC prior to intra-spleen transplantation, group A influenza virus group 1 (e.g., H1) and group 2 (e.g., H3, H7) hemagglutinin antigen were broadly hemagglutinin- Reactive phenotypes were detected. These results further demonstrate that in vitro stimulation of hemagglutinin antigen-primed PBMC from influenza-vaccinated donors promoted hemagglutinin antigen-specific enrichment of the progenitor cells in SCID / beige mouse recipients .
실시예Example 4. 단일 4. Single 형질모세포로부터의From transformed cells IgGIgG 클로닝Cloning
헤마글루티닌 H1 및 H3 교차반응성 인간 형질모세포 (상기 기재)를 단일-세포 분류하였으며, 그에 따라 대략 950개의 형질모세포가 도출되었다. 단일 형질모세포는 5% 낮은 IgG 태아 소 혈청을 함유하는 50 ㎕ RPMI가 들어있는 U자형 바닥 96-웰 마이크로웰 플레이트에 직접 분류하였다. 플레이트를 5분 동안 600 x g로 원심분리시켰고 (베크만 쿨터(Beckman Coulter), 미국 캘리포니아주 브레아), 배지를 조심스럽게 흡인 제거하였다. 동일한 절차 후에 세포를 재현탁시키고 90 ㎕의 PBS에서 2회 세척하였다.Hemagglutinin Hl and H3 cross-reactive human plasma cells (described above) were single-cell sorted, resulting in approximately 950 transformed cells. Monoplasms were directly sorted into U-shaped bottom 96-well microwell plates containing 50 [mu] l RPMI containing 5% low IgG fetal bovine serum. Plates were centrifuged at 600 x g for 5 minutes (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) and the medium was carefully aspirated off. After the same procedure, the cells were resuspended and washed twice in 90 [mu] l of PBS.
가변 중쇄와 경쇄를 코딩하는 cDNA를 생성하기 위하여, 2 유닛 RNaseout (인비트로젠(Invitrogen), 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드), 0.5 mM 4dNTP (퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 미국 매사추세츠주 월탐), 1.5 mM MgCl2, 37.5 mM KCl, 10 mM DTT (디티오트레이톨), 0.25% 노니뎃(Nonidet) P40 (유에스 바이올로지컬(US Biological), 미국 매사추세츠주 마블헤드), 0.1 mg/ml 소 혈청 알부민 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)), 25 mM 트리스(Tris) pH 8.3, 0.25 pmol의 IgG1 -4 불변, 카파 쇄 불변, 및 람다 쇄 불변 영역 특이적 올리고뉴클레오티드 (아래에 나타냄) 및 40 U 슈퍼스크립트(Superscript) III (인비트로젠, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)을 함유하는 6 ㎕의 역전사효소 (RT) 반응 혼합물에 각각의 세포를 재현탁시켰다.(Invitrogen, Grand Island, NY), 0.5 mM 4 dNTP (Perkin Elmer, Waltham, Mass., USA), 1.5 mM < RTI ID = 0.0 > MgCl 2 , 37.5 mM KCl, 10 mM DTT (dithiothreitol), 0.25% Nonidet P40 (US Biological, Marblehead, Mass.), 0.1 mg / ml bovine serum albumin (Sigma-Aldrich), 25 mM Tris pH 8.3, 0.25 pmol of IgG 1 -4 constant, kappa chain constant, and lambda chain constant region specific oligonucleotides (shown below) and 40 U superscript (RT) reaction mixture containing Superscript III (Invitrogen, Grand Island, NY, USA).
반응을 3 x 30분 간격 동안 각각 45℃, 50℃ 및 55℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션에 이어서, 반응 혼합물을 TE 완충제 (10 mM 트리스 HCl, 1 mM EDTA)로 15 ㎕가 되도록 희석하였다. 상기로부터의 희석된 RT 칵테일 2 ㎕와 어드밴티지(Advantage)-GC 2 폴리머라제 믹스 (클론테크(Clontech), 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰)를 사용하여 제조업체가 제공한 프로토콜에 따라 초기 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 수행하여 IgG 중쇄, 카파 쇄 및 람다 쇄를 증폭시켰다. 아래에 나타낸 가변 중쇄 및 경쇄 배선 및 불변 영역 서열에 기초하여 축중성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR 증폭을 수행하였다.The reactions were incubated at 45 [deg.] C, 50 [deg.] C and 55 [deg.] C for 3 x 30 minute intervals, respectively. Following incubation, the reaction mixture was diluted to 15 μl with TE buffer (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA). PCR was performed according to the protocol provided by the manufacturer using 2 μl of the diluted RT cocktail from above and Advantage-GC 2 polymerase mix (Clontech, Mountain View, CA, USA) ) Was performed to amplify the IgG heavy chain, kappa chain and lambda chain. PCR amplification was performed using axial neutral oligonucleotides based on the variable heavy and light chain interconnection and constant region sequences shown below.
중쇄 및 경쇄 PCR 증폭 반응은 다음과 같이 두 반응으로 각각 나누었다: 중쇄 패밀리 VH.1,2,3 (프라이머 IGVH1a, IGVH1b, IGVH2, IGVH3) 및 VH.4,5,6,7 (프라이머 IGVH4, IGVH5, IGVH6 및 IGVH7); 카파 쇄 패밀리 VK.1,2,3 (프라이머 IGKV1, IGKV2 및 IGKV3) 및 VK.4,5,6 (프라이머 IGVK4, IGVK5 및 IGVK6); 및 람다 쇄 패밀리 VL.1,2,3,4,5 (IGLV1, IGLV2, IGLV3, IGLV4 및 IGLV5) 및 VL.6,7,8,9 (프라이머 IGLV6, IGLV7, IGLV8 및 IGLV9). 온도 사이클링을 위해 터치다운 PCR 증폭 프로토콜이 사용되었다.The heavy and light chain PCR amplification reactions were each split into two reactions as follows: heavy chain family VH.1,2,3 (primers IGVH1a, IGVH1b, IGVH2, IGVH3) and VH.4,5,6,7 (primers IGVH4, IGVH5 , IGVH6 and IGVH7); The kappa chain family VK.1,2,3 (primers IGKV1, IGKV2 and IGKV3) and VK.4,5,6 (primers IGVK4, IGVK5 and IGVK6); And lambda chain families VL.1,2,3,4,5 (IGLV1, IGLV2, IGLV3, IGLV4 and IGLV5) and VL.6,7,8,9 (primers IGLV6, IGLV7, IGLV8 and IGLV9). A touchdown PCR amplification protocol was used for temperature cycling.
반응에 이어서, PCR 증폭 생성물을 엑소뉴클레아제1 (Exo)과 새우 알칼리성 포스파타제 (SAP)로 처리하여 PCR 증폭 반응의 각각으로부터 잉여 뉴클레오티드와 프라이머를 제거하였다 (유.에스. 바이올로지컬스(U.S. Biologicals), 미국 매사추세츠주 마블헤드). 생어(Sanger) 서열분석을 이용하여 초기 PCR 증폭 생성물을 직접 서열분석하여 중쇄와 경쇄 둘 다의 가변 서열을 결정하였다. 하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 포유동물 신호 및 불변 영역 클로닝 서열을 삽입하기 위하여 배선-매칭 중쇄 및 경쇄 가변 올리고뉴클레오티드를 사용하여 제2 네스팅 PCR 증폭을 수행하였다.Following the reaction, the PCR amplification products were treated with exonuclease 1 (Exo) and shrimp alkaline phosphatase (SAP) to remove surplus nucleotides and primers from each of the PCR amplification reactions (US Biologicals ), Marblehead, Massachusetts, USA). The initial PCR amplification products were directly sequenced using Sanger sequence analysis to determine the variable sequences of both heavy and light chains. A second nested PCR amplification was performed using the interconnection-matched heavy and light chain variable oligonucleotides to insert the mammalian signal and the constant region cloning sequence using the following oligonucleotide primers.
제조업체의 권장에 따라 프라임스타(PrimeStar) HS DNA 폴리머라제와 GC (다카라 바이오(Takara Bio), 일본 시가)를 사용하여 PCR 증폭 반응을 셋업하였다. PCR 증폭 반응에 이어서, 증폭 생성물을 상기 기재된 바와 같은 Exo/SAP로 처리하였다. 무제한 엔도뉴클레아제 절차를 이용하여 PCR 증폭 생성물을 코딩하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포유동물 발현 벡터에 삽입하였다. 쿤켈(Kunkel) 돌연변이유발 프로토콜을 이용하여 20 ㎕의 PCR 증폭 생성물을 IgG1, 카파 및 람다 쇄에 대한 단일 가닥 DNA 인간 주형에 어닐링하였다. (문헌 [Kunkel (1985) PNAS 82:488-492] 참조). DNA 서열분석에 의하여 정확히 삽입된 구축물을 확인하였다. 중쇄와 경쇄를 코딩하는 핵산을 함유하는 플라스미드를 일시적인 발현을 위해 퓨진(Fugene) 형질감염 시약 (로슈 디아그노스틱(Roche Diagnostic), 미국 인디애나주 인디애나폴리스)을 사용하여 293T 인간 배아 신장세포로 공-형질감염시키고, 실시예 5에 이하에서 기재한 바와 같이 발현 및 결합에 대하여 분석하였다.PCR amplification reactions were set up using PrimeStar HS DNA polymerase and GC (Takara Bio, Japan) according to the manufacturer's recommendations. Following the PCR amplification reaction, the amplification product was treated with Exo / SAP as described above. The variable heavy and variable light chains encoding the PCR amplification products were inserted into mammalian expression vectors using an unlimited endonuclease procedure. Using the mutagenesis protocol Kunkel (Kunkel) was annealed to a PCR amplification product of 20 ㎕ the single stranded DNA template for the human IgG 1, kappa and lambda chains. (See Kunkel (1985) PNAS 82: 488-492). DNA sequence analysis confirmed the correctly inserted construct. Plasmids containing nucleic acids encoding the heavy and light chains were co-transfected with 293T human embryonic kidney cells using Fugene transfection reagent (Roche Diagnostic, Indianapolis, IN) for transient expression. Transfected and analyzed for expression and binding as described below in Example 5.
실시예 5. 헤마글루티닌 ELISA 스크리닝 검정Example 5 Hemagglutinin ELISA screening assay
본 발명의 방법을 사용하여 수득한 각 모노클로날 항-헤마글루티닌 항체의 다양한 헤마글루티닌 하위유형에의 결합능을 다음과 같이 ELISA에 의하여 검사하였다. 다양한 헤마글루티닌-발현 플라스미드를 상기 기재된 바와 같이 293T 세포에 형질감염시켰다. 이들은 H1N1/사우스 캐롤라이나/1918로부터의 헤마글루티닌 H1, H3N2/퍼스/2009로부터의 헤마글루티닌 H3, H5N1/Viet/2004로부터의 헤마글루티닌 H5, 및 H7N7/네덜란드/2003 A형 인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글루티닌 H7을 포함하였다. 2일 후, 세포를 50 mM 트리스, pH 8, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% 트리톤(Triton) X-100 + 프로테아제 억제제 칵테일 (로슈)에 용해시켰다. 핵을 원심분리에 의하여 정화된 다음 생성되는 용해물을 -80℃에서 저장하였다.The binding ability of each monoclonal anti-hemagglutinin antibody obtained using the method of the present invention to various hemagglutinin subtypes was examined by ELISA as follows. A variety of hemagglutinin-expression plasmids were transfected into 293T cells as described above. These include hemagglutinin H1 from H1N1 / SC / 1918, hemagglutinin H3 from H3N2 / Perth / 2009, hemagglutinin H5 from H5N1 / Viet / 2004, and H7N7 / Netherlands / 2003 influenza A And hemagglutinin H7 from the virus. Two days later, cells were lysed in 50 mM Tris,
ELISA 스크리닝을 위하여, 384-웰 플레이트 (눈크 맥시소르프(Nunc MaxiSorp))를 PBS중 5 ㎍/ml 갈란투스 니발리스(Galanthus nivalis) 렉틴 (시그마)으로 코팅하였다. 플레이트를 세척하고 이어서 다양한 발현된 헤마글루티닌을 함유하는 세포 용해물의 희석액으로 코팅하였다. 플레이트를 세척한 다음 항-헤마글루티닌 항체의 다양한 희석액과 그리고 후속하여 염소-항-인간-HRP 2차 항체 (잭슨)와 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고 TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘) 기질 검출을 위해 프로세싱하였다.For ELISA screening, 384-well plates (Nunc MaxiSorp) were incubated with 5 [mu] g / ml Galanthus nobilis in PBS nivalis lectin (Sigma). The plates were washed and then coated with a dilution of cell lysate containing various expressed hemagglutinin. Plates were washed and incubated with various dilutions of anti-hemagglutinin antibody followed by chlorine-anti-human-HRP secondary antibody (Jackson). The plates were washed and processed for TMB (3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine) substrate detection.
실시예 2에 상기 기재된 단일-세포 분류로부터 대략 950개의 형질모세포를 수득하였다. 이중에서 840개의 모노클로날 항체를 293T 세포에서 일시적으로 발현시키고 H1, H3, H5 및 H7 헤마글루티닌 하위유형에의 결합에 대하여 ELISA에 의하여 스크리닝하였으며, 그에 따라 A형 인플루엔자 바이러스 군1 또는 군2 헤마글루티닌에 결합한 82개의 모노클로날 항체, 및 A형 인플루엔자 바이러스 군1 및 군2 헤마글루티닌 둘 다에 결합한 20개의 모노클로날 항체가 도출되었다.Approximately 950 transformed cells were obtained from the single-cell assays described above in Example 2. Of these, 840 monoclonal antibodies were transiently expressed in 293T cells and screened by ELISA for binding to the H1, H3, H5 and H7 hemagglutinin subtypes, and thus were assigned to group 1 or group A influenza virus 2 monoclonal antibodies bound to both hemagglutinin, and 20 monoclonal antibodies bound to both A and group 2 influenza virus group 1 and group 2 hemagglutinin were derived.
실시예 6. 시험관내 A형 인플루엔자 바이러스 중화Example 6. In vitro A-type influenza virus neutralization
본 발명의 방법을 사용하여 동정된 항-헤마글루티닌 항체의 시험관내에서 A형 인플루엔자 군1 및 군2 바이러스 단리물의 패널의 광범위한 헤마글루티닌 하위유형 결합 및 중화 도출능을 다음과 같이 검사하였다.The broad hemagglutinin subtype binding and neutralizing ability of a panel of influenza A virus group 1 and group 2 virus isolates in vitro of anti-hemagglutinin antibodies identified using the method of the present invention was tested as follows Respectively.
MDCK 세포를 10% FBS로 보충한 DMEM 배지중에 단일 25% 융합성(confluent) 단층으로서 투명한 바닥 영상화 플레이트를 갖춘 96-웰 블랙 (코스타(Costar) 3904)에서 성장시켰다. 각각의 A형 인플루엔자 바이러스 하위유형/균주를 인플루엔자 배지 (DMEM + 0.2% BSA, 2 ㎍/ml TPCK-처리 트립신)에 1의 MOI가 되게 희석한 다음 1시간 동안 37℃에서 다양한 농도 (0.02 nM 내지 1,600 nM 범위)의 각 항체와 인큐베이션하였다. 차가운 100% 에탄올로의 세포 고정 전에 5% CO2 인큐베이터중 37℃에서 16시간 동안 각각의 항체/인플루엔자 바이러스 혼합물이 MDCK 세포를 감염시키도록 하였다. 이어서 고정된 세포를 훽스트(Hoechst) 33342 (인비트로젠, Cat# H3570)로 염색하여 세포핵을 가시화하고 총 세포수를 측정하였다. 세포를 또한 A형 인플루엔자 바이러스 핵단백질에 특이적인 광범위하게 반응성인 모노클로날 항체 (밀리포어(Millipore) Cat# MAB8258)로 염색하여 감염된 세포의 수를 측정하였다.MDCK cells were grown in 96-well black (Costar 3904) with a clear bottom imaging plate as a single 25% confluent monolayer in DMEM medium supplemented with 10% FBS. Each type A influenza virus subtype / strain was diluted to an MOI of 1 in influenza medium (DMEM + 0.2% BSA, 2 ug / ml TPCK-treated trypsin) 1,600 nM) of each antibody. Each antibody / influenza virus mixture was allowed to infect MDCK cells for 16 hours at 37 ° C in a 5% CO 2 incubator prior to cell fixation with cold 100% ethanol. The fixed cells were then stained with Hoechst 33342 (Invitrogen, Cat # H3570) to visualize the nucleus and total cell counts. Cells were also stained with a widely reactive monoclonal antibody specific for type A influenza virus nuclear protein (Millipore Cat # MAB8258) to determine the number of infected cells.
세포를 이미지 익스프레스 마이크로(Image Express Micro, 몰리큘라 디바이시스(Molecular Devices))를 사용하여 영상화하고, 데이터 영상을 메타엑스프레스(MetaXpress) 3.1 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 감염된 세포의 %를 측정하여 Y-축 상에 플롯팅하고 그와 대비하여 Log 10 항체 농도를 X-축 상에 플롯팅하였다. 모든 중화 검정은 삼중으로 완료하였다. 비-선형 회귀 용량-반응 곡선을 이용하여 데이터를 맞추고, 도 5에 IC50 값 (nM)으로서 95% 신뢰 구간 (95% CI)으로 제시하였다.Cells were imaged using Image Express Micro (Molecular Devices) and data images were analyzed using MetaXpress 3.1 software. Percent of infected cells were measured and plotted on the Y-axis and compared to the
각 A형 인플루엔자 바이러스 균주의 헤마글루티닌 (HA) 하위유형을 도 5에 제공하였다.The hemagglutinin (HA) subtype of each strain of influenza A virus was provided in FIG.
A형 인플루엔자 군1 및 군2 바이러스 균주의 광역 패널에 대하여 본원 기재 모노클로날 항체의 다양한 농도를 사용하여 시험관내 중화 용량-반응 곡선을 생성하였다. 도 6a 및 6b는 각각 A형 인플루엔자 군1 및 군2 바이러스 균주의 패널에 대한 mAb 39.29의 중화 곡선을 도시한다. 도 6a 및 6b에 도시된 바와 같이, mAb 39.29는 시험된 모든 A형 인플루엔자 바이러스 균주의 시험관내 중화에 효과적이었다. 부가적으로, 도 7a 및 7b는 각각 A형 인플루엔자 군1 및 군2 바이러스 균주의 패널에 대한 mAb 81.39의 중화 곡선을 도시한다. 도 7a 및 7b에 도시된 바와 같이, mAb 81.39는 시험된 모든 A형 인플루엔자 바이러스 균주의 시험관내 중화에 효과적이었다.Various concentrations of the monoclonal antibodies described herein were used for a wide panel of influenza A and group 2 virus strains to generate an in vitro neutralization dose-response curve. Figures 6a and 6b show the neutralization curves of mAb 39.29 for panels of influenza A group 1 and group 2 virus strains, respectively. As shown in Figures 6a and 6b, mAb 39.29 was effective in in vitro neutralization of all strains of influenza A virus tested. In addition, Figures 7a and 7b show the neutralization curves of mAb 81.39 for panels of influenza A and group 2 virus strains, respectively. As shown in Figures 7a and 7b, mAb 81.39 was effective in in vitro neutralization of all strains of influenza A virus tested.
이들 결과는 본 발명의 방법을 사용하여 동정된 항-헤마글루티닌 항체가 다양한 A형 인플루엔자 바이러스 균주에 대하여 중화 활성을 나타내었음을 보여주었다. 구체적으로, 2종의 항-헤마글루티닌 항체 (mAb 39.29 및 mAb 81.39)가 군1 A형 인플루엔자 바이러스 균주 (A/CA/7/2009, A/브리스반/59/2007, A/솔로몬/3/2006, A/뉴 칼도니아 (칼레도니아?)/20/1999, A/PR/8/1934, 및 A/일본/305/1957)와 군2 A형 인플루엔자 바이러스 균주 (A/빅토리아/361/2011, A/퍼스/16/2009, A/브리스반/10/2007, A/위스콘신/67/2005, A/빅토리아/3/1975, A/포트 챌머스/1/1973, A/HK/8/1968, 및 A/아이치(Aichi)/2/1968) 둘 다의 중화를 포함하여 검사된 모든 A형 인플루엔자 바이러스 균주의 중화에 효과적이었다.These results showed that the anti-hemagglutinin antibody identified using the method of the present invention exhibited neutralizing activity against various strains of influenza A virus. Specifically, two types of anti-hemagglutinin antibodies (mAb 39.29 and mAb 81.39) were selected from the group 1 A-type influenza virus strains (A / CA / 7/2009, A / Brisbane / 59/2007, A / Solomon / A / Victorian / 361/1957) and group A influenza virus strains (A / V / A / V / 3 / A / Victorian / 3/1975, A / Port Chalmers / 1/1973, A / HK / 8, A / / 1968, and A / Aichi / 2/1968) were neutralized in all tested influenza A virus strains tested.
종합하면, 이들 결과는 본 발명의 항원-특이적 형질모세포 풍부화 방법론을 사용함으로써 1종 초과의 항원에 대한 특이성을 갖는 (즉, 다양한 헤마글루티닌 하위유형에 대한 특이성을 갖는) 모노클로날 항체의 동정을 가져왔음을 보여주었다. 부가적으로, 이들 결과는 본원 기재의 형질모세포 풍부화 방법론이 불과 950개의 단리된 형질모세포로부터 군1 및 군2 A형 인플루엔자 바이러스 균주 둘 다를 중화할 수 있는 모노클로날 항체의 동정을 가져왔음을 보여주었다.Taken together, these results demonstrate that monoclonal antibodies with specificity for more than one antigen (i.e., having specificity for a variety of hemagglutinin subtypes) by using the antigen-specific plasmocobal enrichment methodology of the present invention And that he had brought the sympathy of God. Additionally, these results demonstrate that the plasmaplet enrichment methodology described herein resulted in the identification of monoclonal antibodies capable of neutralizing both Group 1 and Group 2 influenza virus strains from only 950 isolated transforming cells gave.
실시예Example 7. 마우스에서 7. From the mouse mAbmAb 39. 39. 29의 생체내29 in vivo 효능 efficacy
본 발명의 방법을 사용하여 수득한 항-헤마글루티닌 항체를 추가 특성해석하였다. 마우스에서 A형 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 mAb 39.29 (mAb 39.29 NC v1)의 생체내 효능은 다음과 같이 수행되었다. DBA/2J 마우스 (잭슨 랩(Jackson Lab), 미국 메인주 바 하버)를 인플루엔자 배지 (DMEM, 0.2% BSA, 2 ㎍/mL TPCK-처리 트립신)에 희석한 50 ㎕의 다양한 A형 인플루엔자 바이러스 균주로 최소 LD100 용량으로 비내 감염시켰다. 다음의 것들을 포함하여 광범위한 시험관내 IC50 값을 보이는 4종의 상이한 A형 인플루엔자 바이러스 균주를 당해 시리즈의 실험에 사용하였다: H1N1 A/PR/8/1934 (제넨테크; IC50 2.0 nM), 마우스당 40 PFU로 사용; H3N2 A/홍콩/1/1968 (비라퍼(ViraPur), 미국 캘리포니아주 샌디에고; IC50 45.1 nM), 마우스당 3 PFU로 사용; H3N2 A/포트 챌머스/1/1973 (비라퍼, 미국 캘리포니아주 샌디에고; IC50 2.2 nM), 마우스당 1.5x104개 PFU로 사용; 및 H3N2 A/아이치/2/1968 (비라퍼, 미국 캘리포니아주 샌디에고; IC50 35 nM), 마우스당 2x102개 PFU로 사용. mAb 39.29의 정맥내 투여 전에 72시간 동안 인플루엔자 바이러스 감염이 진행하도록 하였다.Further characterization of the anti-hemagglutinin antibodies obtained using the method of the present invention has been made. The in vivo efficacy of mAb 39.29 (mAb 39.29 NC v1) on influenza A virus infection in mice was performed as follows. 50 [mu] l of a variety of influenza A virus strains diluted in DBA / 2J mice (Jackson Lab, Bar Harbor, Maine, USA) in influenza medium (DMEM, 0.2% BSA, 2 ug / mL TPCK-treated trypsin) Infected with a minimum LD 100 dose. Four different types of influenza A virus strains exhibiting broad in vitro IC 50 values including the following were used in the series of experiments: H1N1 A / PR / 8/1934 (Genentech; IC 50 2.0 nM), mouse Used at 40 PFU per dose; H3N2 A / Hong Kong / 1/1968 (ViraPur, San Diego, CA; IC 50 45.1 nM), used with 3 PFU per mouse; H3N2 A / Port Chalmers / 1/1973 (Virapur, IC 50, 2.2 nM, San Diego, CA), 1.5x10 4 PFU per mouse; And H3N2 A / Aichi / 2/1968 (Virafert, San Diego, CA;
A형 인플루엔자 바이러스 감염후 72 시간 후, 다양한 양의 mAb 39.29를 200 ㎕ PBS 중 900 ㎍/마우스 (대략 45 mg/kg), 300 ㎍/마우스 (대략 15 mg/kg), 및 100 ㎍/마우스 (대략 5 mg/kg)의 용량으로 마우스에 정맥내 투여하였다. 대조군-처리 동물에는 mAb gD5237 (단순 포진 바이러스 (HSV)의 당단백질 D에 특이적인 모노클로날 항체)을 mAb 39.29의 가장 높은 시험된 등가 용량 (즉, 대략 45 mg/kg)으로 투여하였다. 마우스를 신체 상태조절 및 생존에 대하여 매일 모니터링하였으며, 또한 감염 후 21일까지 매일 체중을 측정하였다. 모든 4가지 A형 인플루엔자 바이러스 균주 감염에서의 모든 mAb39.29 용량 대 대조군은 P<0.01의 Log-랭크 시험을 부여하였다.After 72 hours after infection with influenza A virus, various amounts of mAb 39.29 were injected into the mice at a dose of 900 μg / mouse (approximately 45 mg / kg), 300 μg / mouse (approximately 15 mg / kg), and 100 μg / mouse Approximately 5 mg / kg) intravenously. Control-treated animals received mAb gD5237 (a monoclonal antibody specific for glycoprotein D of herpes zoster virus (HSV)) at the highest tested equivalent dose of mAb 39.29 (i.e., approximately 45 mg / kg). Mice were monitored daily for physical condition and survival, and body weight was measured daily until 21 days post infection. All mAb 39.29 doses in all four A-type influenza virus strain infections versus controls were given a log-rank test of P <0.01.
도 8a, 8b, 8c 및 8d는 각각 A형 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/1934, A/포트 챌머스/1/1973, A/홍콩/1/1968 및 A/아이치/2/1968로의 감염 72시간 후 다양한 양의 mAb 39.29를 투여한 마우스의 %생존 (시간경과에 따른, 일수로 표시)을 도시한다. 도 8a, 8b, 8c 및 8d에 도시된 바와 같이, 대조군 항체를 투여한 감염된 마우스에서는 14일차에 가서 100% 폐사율이 관찰되었다. 그러나, 본 발명의 모노클로날 항체를 투여한 감염된 마우스는 증가된 생존을 나타내었다. 특히, 인플루엔자 바이러스 A/포트 챌머스/1/1973 또는 인플루엔자 바이러스 A/아이치/2/1968로 감염시킨 마우스에서는 시험된 39.29의 모든 용량에서 100% 생존이 관찰되었다. (도 8b 및 8d 참조).Figures 8a, 8b, 8c and 8d show infections 72 with infection of type A influenza virus A / PR / 8/1934, A / Port Chorus / 1/1973, A / Hong Kong / 1/1968 and A / Aichi / 2 / % Survival (expressed in days, over time) of mice given various amounts of mAb 39.29 over time. As shown in Figures 8a, 8b, 8c, and 8d, 100% mortality was observed on day 14 in infected mice receiving the control antibody. However, infected mice receiving the monoclonal antibody of the present invention showed increased survival. In particular, in mice infected with influenza virus A / Port Chalmers / 1/1973 or influenza virus A / Aichi / 2/1968, 100% survival was observed at all doses of 39.29 tested. (See Figs. 8B and 8D).
이들 결과는 본 발명의 방법에 따라 수득한 모노클로날 항체가 다양한 A형 인플루엔자 바이러스 하위유형 감염의 치료에 효과적임을 보여주었다.These results showed that the monoclonal antibodies obtained according to the method of the present invention are effective for the treatment of various types of influenza A virus type A infections.
비록 상기 기재된 발명이 명확을 기하고 이해를 위한 목적상 실례로서 다소 상세하게 기재되었지만, 상세한 설명과 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 명백히 그 전문이 참조로 포함된다.Although the foregoing invention has been described in some detail as illustrative and for the purposes of understanding, the description and examples are not to be construed as limiting the scope of the invention. The disclosures of all patents and scientific publications cited herein are expressly incorporated by reference in their entirety.
SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. 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Claims (19)
PBMC를 항원 또는 그의 단편 또는 부분과 접촉시켜 PBMC/항원 프리믹스를 수득하는 단계;
면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하는 단계; 및
면역손상 동물의 비장으로부터 형질모세포를 단리하여, 항원에 대한 특이성을 갖는 형질모세포에 대해 풍부화된 형질모세포 집단을 수득하는 단계
를 포함하는, 항원에 대한 특이성을 갖는 형질모세포에 대해 풍부화된 형질모세포 집단을 수득하는 방법.Obtaining peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from a donor;
Contacting the PBMC with the antigen or a fragment or portion thereof to obtain a PBMC / antigen pre-mix;
Delivering PBMC to the spleen of an immunocompromised animal; And
Isolating the plasmogenesis cells from the spleen of the immunocompromised animal to obtain an enriched population of transformed cells with the antigenic specificity
Wherein the population of transformed cells is enriched for a transformed cell having specificity for an antigen.
PBMC를 적어도 1종의 항원과 접촉시켜 PBMC/항원 프리믹스를 수득하는 단계;
면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하는 단계; 및
면역손상 동물의 비장으로부터 형질모세포를 단리하여, 항원-특이적 형질모세포를 풍부화하는 단계
를 포함하는, 항원-특이적 형질모세포를 풍부화하는 방법.Obtaining peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from a donor;
Contacting the PBMC with at least one antigen to obtain a PBMC / antigen pre-mix;
Delivering PBMC to the spleen of an immunocompromised animal; And
Isolating transgenic cells from the spleen of immunocompromised animals and enriching the antigen-specific transgenic cells
Lt; RTI ID = 0.0 > antigen-specific < / RTI >
PBMC를 적어도 1종의 항원과 접촉시켜 PBMC/항원 프리믹스를 수득하는 단계;
면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하는 단계;
면역손상 동물의 비장으로부터 형질모세포를 단리하는 단계; 및
단리된 형질모세포의 항원-특이적 세포를 분류하여, 항원에 대한 특이성을 갖는 항체를 생산할 수 있는 형질모세포를 동정하는 단계
를 포함하는, 항원에 대한 특이성을 갖는 항체를 생산할 수 있는 형질모세포를 동정하는 방법.Obtaining peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from a donor;
Contacting the PBMC with at least one antigen to obtain a PBMC / antigen pre-mix;
Delivering PBMC to the spleen of an immunocompromised animal;
Isolating the genome from the spleen of the immunocompromised animal; And
Isolating the antigen-specific cells of the isolated transforming cells to identify a transformed cell capable of producing an antibody having an antigen specificity
Wherein the antibody is capable of producing an antibody having specificity for an antigen.
PBMC를 2종 이상의 상이한 항원과 접촉시켜 PBMC/항원 프리믹스를 수득하는 단계;
면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하는 단계;
면역손상 동물의 비장으로부터 형질모세포를 단리하는 단계; 및
단리된 형질모세포의 항원-특이적 세포를 분류하여, 항원에 대한 특이성을 갖는 항체를 생산할 수 있는 형질모세포를 동정하는 단계
를 포함하는, 1종 초과의 항원에 대한 특이성을 갖는 항체를 생산할 수 있는 형질모세포를 동정하는 방법.Obtaining peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from a donor;
Contacting the PBMC with two or more different antigens to obtain a PBMC / antigen pre-mix;
Delivering PBMC to the spleen of an immunocompromised animal;
Isolating the genome from the spleen of the immunocompromised animal; And
Isolating the antigen-specific cells of the isolated transforming cells to identify a transformed cell capable of producing an antibody having an antigen specificity
Wherein the antibody is capable of producing an antibody having specificity for more than one antigen.
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