KR20150080249A - Pharmaceutical composition for prevention or treatment of diseases induced by activation of NFAT5 containing protoberberine derivative or pharmaceutically acceptable salts as an active ingredient - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a pharmaceutical composition comprising protoberberine derivatives or pharmaceutically acceptable salts thereof as active ingredients for preventing or treating diseases related to activation of NFAT5. According to the present invention, oxoprotoberberine derivatives or pharmaceutically acceptable salts inhibit activation of NFAT5, thus can be effectively used as a pharmaceutical composition for preventing or treating diseases related to activation of NFAT5, particularly, rheumatoid arthritis or inflammatory disease or the like.

Description

프로토베르베린 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 NFAT5의 활성 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for prevention or treatment of diseases induced by activation of NFAT5 containing protoberberine derivative or pharmaceutically acceptable salts as an active ingredient}TECHNICAL FIELD The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating an activity-related disease of NFAT5 containing, as an active ingredient, a protoberberine derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof, salts as an active ingredient}

본 발명은 프로토베르베린 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 NFAT5의 활성 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating an activity-related disease of NFAT5 containing a protoberberine derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

류마티스 관절염은 자가면역질환으로 많은 조직과 장기에 만성적인 전신적 염증을 일으키나, 주로 유연한 활막(synovial)이 공격을 당하여 통증을 느끼고 변형되게 되며 적절히 치료되지 않으면 기능과 운동성을 상실하게 되는 질환이다. 또한 병의 진행에 따라 다량의 활막액으로 관절이 붓고 활막안의 섬유조직(pannus)이 발달하며 관절연골의 파괴와 관절의 강직(ankylosis), 폐, 심막(pericardium), 늑막(pleura), 눈의 공막(sclera) 등으로의 염증 확산이 일어나지만 아직 류마티스관절염을 유발하는 자가면역의 원인은 명확히 규명되지 않고 있다. 대략 0.6%의 미국 성인은 류마티스 관절염을 앓고 있고, 여성이 남성보다 2-3배 더 많다(비특허문헌 1).
Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that causes chronic systemic inflammation in many tissues and organs, but it mainly affects the synovial ligaments to feel pain and deformity. If not properly treated, the function and mobility are lost. In addition, as the disease progresses, a large amount of synovial fluid is poured and the pannus of the synovial membrane develops, resulting in the destruction of articular cartilage, joint ankylosis, lung, pericardium, pleura, The spread of inflammation to sclera and the like has yet to be elucidated, but the cause of autoimmunity that causes rheumatoid arthritis has not yet been clarified. Approximately 0.6% of American adults are suffering from rheumatoid arthritis, and women are 2-3 times more likely than men (non-patent document 1).

류마티스 관절염의 치료는 비약리적인 물리치료, 정형술(orthoses), 작업요법(occupational therapy) 및 영양치료와 진통제, 항염증제 등의 약리치료가 있고, 약리치료에 사용되는 약물은 비스테로이드성 항염증약물(non-steroidal anti-inflammatory drug: NSAID) 또는 항류마티스약물(disease-modified anti-rheumatic drug, DMARD)을 사용할 수 있다. 항염증약물로는 주로 염증의 중요한 매개자인 시클로옥시게나아제(COX) 효소 활성을 억제하여 프로스타글란딘 합성을 저해함으로써 항염증 작용을 나타내는 항염증 약물, 예를 들어 디클로페낙(diclofenac), 피록시캄(piroxicam), 인도메타신(indomethacin), 멜록시캄(meloxicam), 쎄리콕시브(celecoxib), 로페콕시브(rofecoxib), 루미라콕시브(lumiracoxib) 등에서 선택하여 사용할 수 있으나 관절의 손상진행을 멈추게 할 수는 없다. 질병의 진행을 느리게 하거나 멈추게 할 수 있는 항류마티스약물로는 메토트렉세이트(methotrexate), 레플루노마이드(leflunomide), (hydroxychloroquine), 설파살라진(sulfasalazine), 아자티오프린(azathioprine), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 사이클로스포린 A(cyclosporine A) 등의 약물과 TNF-α에 대한 항체치료제가 있고 2012년에 JAK3 저해제인 Xeljanz (Tofacitinib, Pfizer)가 저분자 치료제로서는 처음으로 시장에 진출하였으나 아직도 종래의 약물로 치료되지 않는 무반응 환자들이 많으므로 의료적 미충족 수요가 높고 새로운 기전의 치료제의 개발이 요구되고 있다.
The treatment of rheumatoid arthritis includes non-pharmacological physiotherapy, orthoses, occupational therapy, nutritional therapy, analgesics, and anti-inflammatory drugs. Drugs used for pharmacotherapy include non-steroidal anti-inflammatory drugs non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) or disease-modified anti-rheumatic drugs (DMARDs). Antiinflammatory drugs include antiinflammatory drugs that inhibit prostaglandin synthesis by inhibiting the activity of cyclooxygenase (COX) enzyme, an important mediator of inflammation, such as diclofenac, piroxicam Can be selected from indomethacin, meloxicam, celecoxib, rofecoxib, lumiracoxib, and the like, but can stop the progression of joint damage There is no. Anti-rheumatic drugs that can slow or stop the progression of the disease include methotrexate, leflunomide, hydroxychloroquine, sulfasalazine, azathioprine, cyclophosphamide ), Cyclosporine A, and anti-TNF-α antibodies. In 2012, the JAK3 inhibitor Xeljanz (Tofacitinib, Pfizer) entered the market for the first time as a low-molecular therapy drug, Since there are many patients who are not responding, there is a demand for medical untreated patients and the development of a new mechanism of treatment is required.

NFAT5 (nuclear factor of activated T cells 5)는 TonEBP (tonicity enhancer binding protein), OREBP, NFATL1, NFATz 등으로 불리우며 Rel family 중 가장 길이가 긴 전사조절인자로서 다른 NFAT 전사인자들{NFAT1 (NFATp, NFATc2), NFAT2 (NFATc, NFATc1), NFAT3 (NFATc4), NFAT4 (NFATx, NFATc3)}과는 구조적, 기능적으로 뚜렷한 차이를 가지고 있다(비특허문헌 2 및 3). NFAT5는 약 1,500개의 아미노산으로 되어 있고 거의 모든 조직에서 발현되며 특히 대사와 증식이 활발한 태아의 신장, 폐, 뇌하수체, 태반, 고환, 흉선 등에서 높은 발현을 보인다(비특허문헌 4). 구조적으로 NFAT5는 calcineurin 도메인을 가지고 있지 않기 때문에 칼슘농도에 의해 직접적인 영향을 받지 않으며 삼투압이 증가된 고장액에서 osmostress에 의해 활성화되어 항상성을 유지하는 역할을 한다. 또한, T세포에서 활성화된 NFAT5는 CD24의 promoter에 결합하여 CD24의 전사를 증가시키며 이에 의해 T세포의 증폭이 가능해지도록 하는 것으로 알려져 있다.
NFAT5 (NFATp, NFATc2) is the longest transcription factor in the Rel family, called TonEBP (Tonicity Enhancer Binding Protein), OREBP, NFATL1 and NFATz. , NFAT2 (NFATc, NFATc1), NFAT3 (NFATc4), NFAT4 (NFATx, NFATc3)) of the present invention have distinct structural and functional differences (Non-Patent Documents 2 and 3). NFAT5 has about 1,500 amino acids and is expressed in almost all tissues. In particular, NFAT5 shows high expression in fetal kidney, lung, pituitary gland, placenta, testis, thymus, etc., which are active in metabolism and proliferation (Non-Patent Document 4). Structurally, NFAT5 does not have a calcineurin domain and thus is not directly affected by calcium concentration. It is activated by osmostress and maintains homeostasis in hypertrophied osmotic fluid. It is also known that NFAT5 activated by T cells binds to the promoter of CD24, thereby increasing the transcription of CD24, thereby enabling the amplification of T cells.

최근에 NFAT5는 류마티스 환자의 관절활액에서 많이 발현되고 염증성 사이트카인인 IL-1β, TNF-α 등의 분비를 증가시킨다는 것이 보고되었다(비특허문헌 5). 또한 siRNA를 주입하여 NFAT5를 knockdown 시킨 활액세포나 혈관세포인 HUVEC 등에서 세포의 증식이나 혈관신생, 세포이동 등이 현저히 감소되는 것이 관찰되며 NFAT5(+/-)인 실험쥐에서는 관절의 염증이 현저히 줄어들었으므로 NFAT5의 활성을 저해하는 화합물은 류마티스관절염을 개선시키는 새로운 치료제로 개발될 수 있을 것으로 판단된다.
Recently, it has been reported that NFAT5 is highly expressed in joint synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis and increases the secretion of IL-1β and TNF-α, which are inflammatory cytokines (Non-Patent Document 5). In addition, cell proliferation, angiogenesis, and cell migration were observed to be significantly reduced in the synovial cells, which were injected with siRNA and knockdown of NFAT5, and HUVEC, which is a vascular cell. In the experimental mice with NFAT5 (+/-) The compounds that inhibit the activity of NFAT5 may be developed as a new therapeutic agent for improving rheumatoid arthritis.

베르베린은 이소퀴놀린 알카로이드의 4차 암모늄염으로서 황련에 함유된 생약제제로 잘 알려져 있고 항암작용, 항비만 및 당뇨치료효과 등이 보고되어 있다. 또한, 베르베린은 시판되는 천연물 정장제인 정로환의 주성분으로 장내 세균에 대한 억제작용, 진정진경작용, 동맥경화 예방작용, 소염작용, 이담작용, 췌장액분비촉진작용 등을 가지고 있다.
Berberine is a quaternary ammonium salt of isoquinoline alkaloids and is well known as a herbal medicine contained in phthalocyanines and has been reported to have anti-cancer, anti-obesity and diabetic therapeutic effects. In addition, berberine is a main component of the commercially available natural product formulations, and has an inhibitory action against intestinal bacteria, a soothing action, an arteriosclerosis-preventing action, an anti-inflammatory action, a dandruff action and a pancreatic secretion promoting action.

베르베린의 13위치(프로토베르베린 고리)에 다양한 치환기가 도입된 유도체로서 베르베린보다 월등히 향상된 NFAT5 저해효능과 COX 효소 저해효과를 보이며 관절염동물모델에서 우수한 염증억제효과를 나타낸다.
It is a derivative with various substituents introduced at the 13th position (protoberberine ring) of berberine. It exhibits greatly improved NFAT5 inhibitory effect and COX enzyme inhibitory effect than berberine, and exhibits excellent inflammation inhibitory effect in arthritis animal model.

이에, 본 발명자들은 관절염이나 자가면역질환은 지속적인 치료가 필요한 질환으로 약제내성에 대비하기 위한 새로운 기전의 약물을 개발하던 중, 프로토베르베린 유도체가 베르베린 유도체 보다 NFAT5 저해 효과 및 COX 효소 저해 효과가 우수하고 관절염 동물모델에서 우수한 염증억제 효과를 나타내어 류마티스 관절염 치료용 도는 염증 치료용 조성물로 유용할 수 있다는 것을 알아내어 본 발명을 완성하였다.
Accordingly, the inventors of the present invention have developed a novel medicament for the preparation of a drug against resistance to arthritis or autoimmune disease, which requires continuous treatment. The protobarin derivative has superior NFAT5 inhibitory effect and COX enzyme inhibitory effect than berberine derivative The present invention has been completed based on the finding that the use of rheumatoid arthritis for treating inflammation can be useful as a composition for treating inflammation.

Handout on Health: Rheumatoid Arthritis. National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, April 2013;Handout on Health: Rheumatoid Arthritis. National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, April 2013; Biochem. Pharm. 72 (2006) 1597-1604;Biochem. Pharm. 72 (2006) 1597-1604; Nucleic Acids Res. 33 (2005) 3845-3854;Nucleic Acids Res. 33 (2005) 3845-3854; J. Immunol. 165 (2000) 4884-4894;J. Immunol. 165 (2000) 4884-4894; Arthritis and Rheumatism. 63 (2011) 1843-1852.Arthritis and Rheumatism. 63 (2011) 1843-1852.

본 발명의 목적은 프로토베르베린 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 NFAT5의 활성 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.It is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of an activity-related disease of NFAT5 containing a protoberberine derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

본 발명의 다른 목적은 프로토베르베린 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 NFAT5의 활성 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공하는데 있다.
Another object of the present invention is to provide a health food composition for preventing or ameliorating an activity-related disease of NFAT5 containing a protoberberine derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 프로토베르베린 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 NFAT5의 활성 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다:In order to achieve the above object, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating an activity-related disease of NFAT5, comprising a protoberberine derivative represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient:

[화학식 1][Chemical Formula 1]

Figure pat00001
Figure pat00001

상기 화학식 1에서,In Formula 1,

R1 및 R2는 독립적으로 직쇄 또는 측쇄의 C1 - 6알킬 또는 이들이 결합되어 있는 산소 원자와 함께 5 내지 6 원자 고리를 형성하고;To form a 5- to 6-membered ring together with the oxygen atoms to which they are bonded 6 alkyl or - R 1 and R 2 are independently a straight or branched C 1;

R3, R4 및 R5는 독립적으로 수소, 직쇄 또는 측쇄의 C1 - 6알킬, 이중 결합을 하나 이상 포함하는 직쇄 또는 측쇄의 C1 - 6알케닐 또는 C6 - 10아릴C1 - 4알킬이고, 여기서, 상기 아릴알킬은 비치환 또는 할로겐, 니트로 및 직쇄 또는 측쇄의 C1 - 6알킬 또는 C1 - 6할로알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상으로 더 치환될 수 있고;R 3 , R 4 And R 5 is independently hydrogen, a linear or branched C 1 - 6 alkyl, C 1 of a straight or branched chain containing at least one double bond alkenyl 6 Al or C 6 - 10 aryl C 1 - is 4-alkyl, wherein the aryl-alkyl is unsubstituted or halogen, nitro and straight-chain or branched C 1 - may be further substituted with at least one member selected from the group consisting of 6-haloalkyl-6 alkyl or C 1;

X는 할로겐이다.
X is halogen.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 프로토베르베린 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 NFAT5의 활성 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
The present invention also provides a health food composition for preventing or ameliorating an activity-related disease of NFAT5, comprising the protoberbene derivative represented by the above formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

본 발명에 따른 신규한 프로토베르베린 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 NFAT5 활성을 억제하므로, NFAT5 활성 관련 질환, 특히 류마티스관절염 또는 염증질환 등의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
The novel protobarbrelin derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention inhibits NFAT5 activity and thus can be usefully used as a pharmaceutical composition for preventing or treating NFAT5 activity-related diseases, particularly rheumatoid arthritis or inflammatory diseases .

도 1은 본 발명에 따른 프로토베르베린 유도체의 NFAT5 전사활성을 측정하기 위해 제작된 검색세포주에 삽입된 벡터 및 사진이고;
도 2는 본 발명에 따른 프로토베르베린 유도체가 NFAT5 전사활성에 미치는 효과를 FACS 분석으로 측정한 결과를 나타낸 그래프이고;
도 3은 본 발명에 따른 프로토베르베린 유도체가 NFAT5 이외의 다른 전사인자의 활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이고;
도 4의 A는 본 발명에 따른 프로토베르베린 유도체가 p38의 활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이고, B는 ROS의 활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이고;
도 5의 A는 본 발명에 따른 프로토베르베린 유도체가 NFAT5의 전사단계에 미치는지 영향을 real-time PCR로 조사한 사진이고; B는 NFAT5의 핵이동에 미치는 영향을 조사한 것이고;
도 6은 본 발명에 따른 프로토베르베린 유도체가 염화나트륨에 의해 증가되는 NFAT5의 전사체 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이고, 구체적으로 A는 AR, B는 BGT1, C는 SMIT의 전사체에 관한 그래프이고;
도 7은 본 발명에 따른 프로토베르베린 유도체의 COX-1(A), COX-2(B) 효소 억제효과를 나타낸 그래프이고;
도 8은 본 발명에 따른 프로토베르베린 유도체의 염증성사이토카인의 분비억제효과를 나타낸 그래프이고; 및
도 9는 본 발명에 따른 프로토베르베린 유도체의 관절염 동물모델에서의 항염증효과를 나타낸 그래프이다.Brief Description of the Drawings Figure 1 is a vector and a photograph inserted into a search cell line prepared for measuring NFAT5 transcriptional activity of a protobarbene derivative according to the present invention;
FIG. 2 is a graph showing the results of FACS analysis of the effect of the protobarbene derivative according to the present invention on NFAT5 transcriptional activity;
Figure 3 is a graph showing the effect of the protobarbene derivative according to the present invention on the activity of transcription factors other than NFAT5;
FIG. 4A is a graph showing the effect of the protoberberine derivative according to the present invention on the activity of p38, and B is a graph showing the effect on the activity of ROS; FIG.
FIG. 5A is a photograph showing the effect of the protoberberine derivative according to the present invention on the transcription of NFAT5 by real-time PCR; FIG. B investigated the effect of NFAT5 on nuclear migration;
FIG. 6 is a graph showing the effect of the protoberberine derivative according to the present invention on the expression of transcript of NFAT5 increased by sodium chloride. Specifically, A is AR, B is BGT1, and C is a graph relating to a transcript of SMIT;
FIG. 7 is a graph showing the COX-1 (A) and COX-2 (B) enzyme inhibitory effects of the protoberberine derivative according to the present invention;
8 is a graph showing the effect of inhibiting the secretion of inflammatory cytokines of the protobarbene derivative according to the present invention; And
9 is a graph showing the anti-inflammatory effect of the protobarbene derivative according to the present invention in an animal model of arthritis.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 프로토베르베린 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 NFAT5의 활성 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다:The present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating an activity-related disease of NFAT5, which comprises a protoberberine derivative represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient:

Figure pat00002
Figure pat00002

상기 화학식 1에서,In Formula 1,

R1 및 R2는 독립적으로 직쇄 또는 측쇄의 C1 - 6알킬 또는 이들이 결합되어 있는 산소 원자와 함께 5 내지 6 원자 고리를 형성하고;To form a 5- to 6-membered ring together with the oxygen atoms to which they are bonded 6 alkyl or - R 1 and R 2 are independently a straight or branched C 1;

R3, R4 및 R5는 독립적으로 수소, 직쇄 또는 측쇄의 C1 - 6알킬, 이중 결합을 하나 이상 포함하는 직쇄 또는 측쇄의 C1 - 6알케닐 또는 C6 - 10아릴C1 - 4알킬이고, 여기서, 상기 아릴알킬은 비치환 또는 할로겐, 니트로 및 직쇄 또는 측쇄의 C1 - 6알킬 또는 C1 - 6할로알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상으로 더 치환될 수 있고;R 3 , R 4 And R 5 is independently hydrogen, a linear or branched C 1 - 6 alkyl, C 1 of a straight or branched chain containing at least one double bond alkenyl 6 Al or C 6 - 10 aryl C 1 - is 4-alkyl, wherein the aryl-alkyl is unsubstituted or halogen, nitro and straight-chain or branched C 1 - may be further substituted with at least one member selected from the group consisting of 6-haloalkyl-6 alkyl or C 1;

X-는 할로겐 음이온 또는 HSO4 -이다.
X - is a halogen anion or HSO 4 - .

상기 R1 및 R2는 바람직하게는 독립적으로 직쇄 또는 측쇄의 C1 - 4알킬 또는 이들이 결합되어 있는 산소 원자와 함께 5 내지 6 원자 고리를 형성하고, 보다 바람직하게는 독립적으로 직쇄 또는 측쇄의 C1 - 2알킬 또는 이들이 결합되어 있는 산소 원자와 함께 5 원자 고리를 형성한다.
Wherein R 1 and R 2 are preferably independently linear or branched C 1 - 4 alkyl or form a five or six-membered ring together with the oxygen atom bonded to which they are attached, and more preferably independently selected from linear or branched C 1 - 3 alkyl or form a 5-membered ring together with the oxygen atoms to which they are bonded.

또한, 상기 R3, R4 및 R5는 바람직하게는 독립적으로 수소, 직쇄 또는 측쇄의 C1-4알킬, 이중 결합을 하나 이상 포함하는 직쇄 또는 측쇄의 C1 - 4알케닐 또는 벤질이고, 여기서, 상기 벤질은 비치환 또는 할로겐, 니트로 및 직쇄 또는 측쇄의 C1 - 4알킬 또는 C1 - 4할로알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상으로 더 치환될 수 있고, 보다 바람직하게는 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, 알릴 및 벤질이고, 여기서, 상기 벤질은 비치환 또는 할로겐, 니트로 및 메틸, 에틸, 트리플루오로메틸로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상으로 더 치환될 수 있다.
The above R 3 , R 4 And R 5 is preferably independently selected from hydrogen, straight or branched C 1-4 alkyl, straight or branched containing at least one double bond, C 1 - and 4-alkenyl or benzyl, where said benzyl is unsubstituted or halogen , nitro and straight-chain or branched C 1 - 4 alkyl or C 1 - 4 may be further substituted with at least one member selected from the group consisting of haloalkyl, and more preferably independently selected from hydrogen, methyl, ethyl, allyl and benzyl , Wherein the benzyl may be further substituted with one or more unsubstituted or halogen, nitro, and one or more members selected from the group consisting of methyl, ethyl, trifluoromethyl.

나아가, 상기 화학식 1로 표시되는 프로토베르베린 유도체를 보다 구체적으로 예시하면 하기와 같다:Further, the protobarbene derivative represented by the above formula (1) is more specifically exemplified as follows:

1) 13-(3-알릴)-9,10-디메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움아이오다이드;1) Preparation of 13- (3-allyl) -9,10-dimethoxy-5H- [1,3] dioxolo [4,5- g] isoquinolino [3,2- a] isoquinoline- Odides;

2) 9-(2-메틸-3-나이트로벤질옥시)-13-에틸-2,3,10-트리메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움아이오다이드;2) Preparation of 9- (2-methyl-3-nitrobenzyloxy) -13-ethyl-2,3,10-trimethoxy-5H- [1,3] dioxolo [4,5- [3,2-a] isoquinolin-7-ynyl iodide;

3) 9-(3-클로로벤질옥시)-13-에틸-2,3,10-트리메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움아이오다이드;3) 9- (3-chlorobenzyloxy) -13-ethyl-2,3,10-trimethoxy-5H- [l, 3] dioxolo [4,5- g] isoquinolino [ a] isoquinolin-7-ium iodide;

4) 9-(2-트리플루오로-4-플루오로벤질옥시)-13-에틸-2,3,10-트리메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움아이오다이드;4) Synthesis of 9- (2-trifluoro-4-fluorobenzyloxy) -13-ethyl-2,3,10-trimethoxy-5H- [1,3] dioxolo [4,5- Quinolino [3,2-a] isoquinolin-7-ynyl iodide;

5) 13-(2,6-디플루오로벤질)-9,10-디메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움클로라이드;5) Preparation of 13- (2,6-difluorobenzyl) -9,10-dimethoxy-5H- [1,3] dioxolo [4,5- g] isoquinolino [3,2- a] isoquinoline -7-ium chloride;

6) 13-(2-플루오로벤질)-9,10-디메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움클로라이드;6) 13- (2-Fluorobenzyl) -9,10-dimethoxy-5H- [1,3] dioxolo [4,5-g] isoquinolino [3,2-a] isoquinoline- Ium chloride;

7) 9-(2-메틸벤질옥시)-13-에틸-2,3,10-트리메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움아이오다이드;7) Synthesis of 9- (2-methylbenzyloxy) -13-ethyl-2,3,10-trimethoxy-5H- [1,3] dioxolo [4,5- g] isoquinolino [ a] isoquinolin-7-ium iodide;

8) 9-(4-트리플루오로메틸벤질옥시)-13-에틸-2,3,10-트리메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움아이오다이드;8) 9- (4-Trifluoromethylbenzyloxy) -13-ethyl-2,3,10-trimethoxy-5H- [l, 3] dioxolo [4,5- g] isoquinolino [ , 2-a] isoquinolin-7-ium iodide;

9) 13-에틸-9,10-디메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움아이오다이드;9) 13-Ethyl-9,10-dimethoxy-5H- [1,3] dioxolo [4,5-g] isoquinolino [3,2-a] isoquinoline-7-ium iodide;

10) 8-에틸-9,10-디메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움설페이트;10) 8-Ethyl-9,10-dimethoxy-5H- [1,3] dioxolo [4,5-g] isoquinolino [3,2-a] isoquinoline-7-ium sulfate;

11) 13-(3,4-디플루오로벤질)-9,10-디메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움클로라이드;11) Preparation of 13- (3,4-difluorobenzyl) -9,10-dimethoxy-5H- [1,3] dioxolo [4,5- g] isoquinolino [3,2- a] isoquinoline -7-ium chloride;

12) 9-알릴옥시-13-에틸-2,3,10-트리메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움아이오다이드; 및12) Synthesis of 9-allyloxy-13-ethyl-2,3,10-trimethoxy-5H- [1,3] dioxolo [4,5-g] isoquinolino [ 7-ium iodide; And

13) 9-(2,5-디메틸벤질옥시)-13-에틸-2,3,10-트리메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움아이오다이드.
13) Synthesis of 9- (2,5-dimethylbenzyloxy) -13-ethyl-2,3,10-trimethoxy-5H- [1,3] dioxolo [4,5- g] isoquinolino [ 2-a] isoquinolin-7-ium iodide.

본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 프로토베르베린 유도체의 바람직한 구조를 하기 표 1에 나타내었다.The preferred structures of the protoberberine derivatives represented by Formula 1 according to the present invention are shown in Table 1 below.

실시예Example 구조rescue 실시예Example 구조rescue 1One

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본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 프로토베르베린 유도체는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아질산, 아인산 등과 같은 무기산류, 지방족 모노 및 다이카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류 등과 같은 무독성 유기산, 아세트산, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산등과 같은 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염의 종류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 나이트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 다이하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-다이오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 등을 포함한다.
The protobarbene derivative represented by Formula 1 of the present invention can be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt. As the salt, an acid addition salt formed by a pharmaceutically acceptable free acid is useful. Acid addition salts include those derived from inorganic acids such as hydrochloric acid, nitric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, nitrous acid, phosphorous acid and the like, aliphatic mono- and dicarboxylates, phenyl-substituted alkanoates, Citric acid, lactic acid, maleic acid, gluconic acid, methanesulfonic acid, 4-toluenesulfonic acid, tartaric acid, fumaric acid and the like, which are non-toxic organic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, Examples of such pharmaceutically non-toxic salts include sulfates, pyrosulfates, bisulfates, sulfites, bisulfites, nitrates, phosphates, monohydrogenphosphates, dihydrogenphosphates, metaphosphates, pyrophosphate chlorides, bromides, But are not limited to, but are not limited to, but are not limited to, but are not limited to, but are not limited to, halides, halides, halides, halides, halides, halides, But are not limited to, lactose, sebacate, fumarate, maleate, butyne-1,4-dioate, hexane-1,6-diate, benzoate, chlorobenzoate, methylbenzoate, dinitrobenzoate, Methoxybenzoate, phthalate, terephthalate, benzene sulfonate, toluene sulfonate, Such as benzene sulfonate, benzene sulfonate, xylene sulfonate, phenylacetate, phenylpropionate, phenylbutyrate, citrate, lactate,? -Hydroxybutyrate, glycolate, maleate, tartrate, methanesulfonate, propanesulfonate, naphthalene -1-sulfonate, naphthalene-2-sulfonate, mandelate and the like.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 상기 화학식 1로 표시되는 프로토베르베린 유도체를 메탄올, 에탄올, 아세톤, 다이클로로메탄, 아세토나이트릴 등과 같은 유기용매에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조시켜 제조하거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조시켜 유기용매 하에서 결정화시켜셔 제조할 수 있다.
The acid addition salt according to the present invention can be prepared by a conventional method. For example, the protobarbene derivative represented by the above formula (1) is dissolved in an organic solvent such as methanol, ethanol, acetone, dichloromethane or acetonitrile, Or by filtering and drying the precipitate formed by adding an inorganic acid, or by evaporating the solvent and excess acid under reduced pressure, followed by drying and crystallization in an organic solvent.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
In addition, bases can be used to make pharmaceutically acceptable metal salts. The alkali metal or alkaline earth metal salt is obtained, for example, by dissolving the compound in an excess amount of an alkali metal hydroxide or an alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the insoluble compound salt, and evaporating and drying the filtrate. At this time, it is preferable for the metal salt to produce sodium, potassium or calcium salt. In addition, the corresponding salt is obtained by reacting an alkali metal or alkaline earth metal salt with a suitable salt (such as silver nitrate).

나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 프로토베르베린 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 용매화물, 수화물 등을 모두 포함한다.
Further, the present invention includes all of the protoberberin derivatives represented by the above formula (1) or pharmaceutically acceptable salts thereof, as well as solvates and hydrates thereof which can be prepared therefrom.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 프로토베르베린 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 NFAT5의 활성 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating an activity-related disease of NFAT5 containing the protoberbene derivative represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

본 발명에 따른 프로토베르베린 유도체는 종래 베르베린에 비해 본 발명에 따른 화합물들이 NFAF5 전사 활성에 대하여 강력한 억제 효과를 나타낸다(실험예 3 참조). 또한 동물 실험 결과, 본 발명에 따른 화합물을 처리한 군의 마우스 다리의 관절 부위가 육안으로 관찰하였을 경우 관절염의 증상이 완화된 것을 확인할 수 있고, 조직학적 염색을 통해서도 관절염 증상이 월등히 회복된 것을 확인할 수 있다(실험예 11). The protobarbene derivative according to the present invention shows a strong inhibitory effect on the NFAF5 transcriptional activity (see Experimental Example 3) compared with the conventional berberine. In addition, as a result of the animal test, it was confirmed that the symptoms of arthritis were alleviated when the joint area of the mouse legs of the group treated with the compound of the present invention was visually observed, and the arthritic symptoms were significantly restored by histological staining (Experimental Example 11).

따라서, 본 발명에 따른 유도체는 NFAT5의 활성 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
Accordingly, the derivative according to the present invention can be usefully used as a pharmaceutical composition for preventing or treating an activity-related disease of NFAT5.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 프로토베르베린 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충전제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다.
In the pharmaceutical composition according to the present invention, the protobarbene derivative represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be administered orally or parenterally in various formulations at the time of clinical administration. In the case of formulation, May be prepared using diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants and the like.

경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 프로토베르베린 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, troches, etc. These solid preparations may contain one or more of the protoberberine derivatives of formula (I) Possible salts may be prepared by mixing at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, or gelatin. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc, and the like may also be used. Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions or syrups. Various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives and the like are included in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. .

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories. Examples of the non-aqueous solvent and suspending agent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like. As a base for suppositories, witepsol, macrogol, tween 61, cacao paper, laurin, glycerol, gelatin and the like can be used.

또한, 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 프로토베르베린 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 Kg인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.1-1000 mg/일이며, 바람직하게는 1-500 mg/일이며, 또한 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
The dose of the protoberberine derivative of the present invention represented by the above formula (1) or its pharmaceutically acceptable salt in the human body may vary depending on the patient's age, weight, sex, dosage form, health condition and disease severity, It is generally 0.1-1000 mg / day, preferably 1-500 mg / day, based on adult patients weighing 70 Kg, and once a day at regular intervals, as determined by a physician or pharmacist May be administered in divided doses.

본 발명의 약학적 조성물은 류마티스 관절염의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
The pharmaceutical composition of the present invention can be used alone or in combination with methods for the prevention or treatment of rheumatoid arthritis or using surgery, hormone therapy, chemotherapy and biological response modifiers.

또한, 본 발명은 신규한 프로토베르베린 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 NFAT5의 활성 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
The present invention also provides a health food composition for preventing or ameliorating an activity-related disease of NFAT5 containing a novel protoberberine derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

본 발명에 따른 유도체는 NFAT5의 활성을 억제하는 효과가 우수하여 NFAT5의 활성 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
The derivatives according to the present invention are excellent in the effect of inhibiting the activity of NFAT5 and can be usefully used as a health food composition for preventing or ameliorating NFAT5 activity-related diseases.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
There is no particular limitation on the kind of the food. Examples of the food to which the above substance can be added include dairy products including dairy products, meat, sausage, bread, biscuits, rice cakes, chocolate, candies, snacks, confectionery, pizza, ramen and other noodles, gums, ice cream, Beverages, alcoholic beverages and vitamin complexes, dairy products, and dairy products, all of which include health functional foods in a conventional sense.

본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 프로토베르베린 유도체는 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
The protobarbene derivative represented by the above formula (1) according to the present invention can be added directly to food or used together with other food or food ingredients, and can be suitably used according to a conventional method. The amount of the active ingredient to be mixed can be suitably determined according to the intended use (for prevention or improvement). Generally, the amount of the compound in the health food may be 0.1 to 90 parts by weight of the total food. However, in the case of long-term consumption intended for health or hygiene purposes or for health control purposes, the amount may be less than the above range, and since there is no problem in terms of safety, the active ingredient may be used in an amount exceeding the above range.

또한, 본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 g당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
In addition, the health functional beverage composition of the present invention has no particular limitation on other components other than the above-mentioned compounds as essential components in the indicated ratios, and may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional components such as ordinary beverages have. Examples of the above-mentioned natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose and the like; And polysaccharides, for example, conventional sugars such as dextrin, cyclodextrin and the like, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol. Natural flavors (tau martin, stevia extracts (e.g., rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavors (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used as flavors other than those described above The ratio of the natural carbohydrate is generally about 1 to 20 g, preferably about 5 to 12 g per 100 g of the composition of the present invention.

나아가, 상기 외에 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 프로토베르베린 유도체는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 프로토베르베린 유도체는 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
In addition to the above, the protobarbene derivative represented by the formula (I) according to the present invention may be used as a flavorant, a coloring agent and a thickening agent (cheese, chocolate, etc.) such as various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavors and natural flavors, , A pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloid thickening agents, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonating agents used in carbonated beverages and the like. In addition, the protoberberine derivatives of the present invention may contain natural fruit juice and pulp for the production of fruit juice drinks and vegetable drinks.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples and Experimental Examples.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
However, the following Examples and Experimental Examples are merely illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following Examples and Experimental Examples.

<< 실시예Example 1 내지 13>  1 to 13> 프로토베르베린Protoberberin 유도체 derivative

하기 표 2에 나타낸 실시예 1 내지 실시예 13의 화합물은 한국화합물은행의 라이브러리(40,000종)를 iNOS induction 검색과 NFAT5 저해능 검색으로 얻어진 베르베린골격 화합물에 대해 다시 유도체검색으로 얻어진 화합물로서 화합물은행에서 재분양 받았고 동물실험을 위한 대용량은 메디진㈜에 의뢰하여 합성하였다.
The compounds of Examples 1 to 13 shown in the following Table 2 were obtained by searching the library of the Korean Compound Bank (40,000 kinds) again for the berberine skeleton compound obtained by the iNOS induction search and the NFAT5 inhibition search, The large volume for the animal experiment was purchased from MEDIGIN.

실시예 Example 화합물명Compound name 1One 13-(3-알릴)-9,10-디메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움아이오다이드1,3- dioxolo [4,5-g] isoquinolino [3,2-a] isoquinoline-7-ynyl iodide 22 9-(2-메틸-3-나이트로벤질옥시)-13-에틸-2,3,10-트리메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움아이오다이드Methyl-3-nitrobenzyloxy) -13-ethyl-2,3,10-trimethoxy-5H- [l, 3] dioxolo [4,5-g] isoquinolino [3 , 2-a] isoquinolin-7-ynyl iodide 33 9-(3-클로로벤질옥시)-13-에틸-2,3,10-트리메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움아이오다이드 Trimethyl-5H- [1,3] dioxolo [4,5-g] isoquinolino [3,2-a] Isoquinolin-7-ium iodide 44 9-(2-트리플루오로-4-플루오로벤질옥시)-13-에틸-2,3,10-트리메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움아이오다이드Synthesis of 9- (2-trifluoro-4-fluorobenzyloxy) -13-ethyl-2,3,10-trimethoxy-5H- [1,3] dioxolo [4,5-g] isoquinolino [3,2-a] isoquinolin-7-ynum iodide 55 13-(2,6-디플루오로벤질)-9,10-디메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움클로라이드Dihydroxybenzyl) -9,10-dimethoxy-5H- [1,3] dioxolo [4,5-g] isoquinolino [3,2-a] isoquinoline-7 - ium chloride 66 13-(2-플루오로벤질)-9,10-디메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움클로라이드1,3- dioxolo [4,5-g] isoquinolino [3,2-a] isoquinoline-7-ium chloride 77 9-(2-메틸벤질옥시)-13-에틸-2,3,10-트리메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움아이오다이드Trimethyl-5H- [1,3] dioxolo [4,5-g] isoquinolino [3,2-a] Isoquinolin-7-ium iodide 88 9-(4-트리플루오로메틸벤질옥시)-13-에틸-2,3,10-트리메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움아이오다이드9- (4-Trifluoromethylbenzyloxy) -13-ethyl-2,3,10-trimethoxy-5H- [1,3] dioxolo [4,5- g] isoquinolino [ -a] isoquinolin-7-ium iodide 99 13-에틸-9,10-디메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움아이오다이드13-Ethyl-9,10-dimethoxy-5H- [1,3] dioxolo [4,5-g] isoquinolino [3,2-a] isoquinoline- 1010 8-에틸-9,10-디메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움설페이트8-ethyl-9,10-dimethoxy-5H- [1,3] dioxolo [4,5-g] isoquinolino [3,2-a] isoquinoline- 1111 13-(3,4-디플루오로벤질)-9,10-디메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움클로라이드3,3-dioxolo [4,5-g] isoquinolino [3,2-a] isoquinoline-7 - ium chloride 1212 9-알릴옥시-13-에틸-2,3,10-트리메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움아이오다이드1,3-dioxolo [4,5-g] isoquinolino [3,2-a] isoquinoline-7- Iumi Iodaid 1313 9-(2,5-디메틸벤질옥시)-13-에틸-2,3,10-트리메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움아이오다이드Dimethyl-benzyloxy) -13-ethyl-2,3,10-trimethoxy-5H- [1,3] dioxolo [4,5- g] isoquinolino [3,2- a] isoquinolin-7-ium iodide

<< 비교예Comparative Example > > 베르베린Berber

Figure pat00016
Figure pat00016

상기 비교예로 사용한 베르베린은 시그마 알드리치사에서 구입하여 사용하였다.
The berberine used as the comparative example was purchased from Sigma-Aldrich and used.

<< 실험예Experimental Example 1>  1> iNOSiNOS 유전자 발현증가의 억제효과 측정 Measuring the inhibitory effect of increased gene expression

본 발명에 따른 유도체가 iNOS 유도를 저해하는 효과가 있는지 알아보기 위하여, 먼저 마우스의 대식세포인 Raw264.7세포를 384 웰플레이트에 3 x 104 세포/웰의 밀도로 분주하고 100 ng/ml 농도의 LPS를 처리하여 37℃에서 24시간 동안 배양하고 배지에 증가되는 Nitrate를 Griess 시약을 사용하여 측정하였다. 활성 저해율은 감지된 신호를 하기 수학식 1에 의하여 계산하여, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.In order to examine whether the derivatives according to the present invention have an effect of inhibiting iNOS induction, Raw264.7 cells, which are macrophages of mice, were firstly divided into 384 well plates at a density of 3 x 10 4 cells / Of LPS and cultured at 37 ° C for 24 hours. Nitrate increased in the medium was measured using Griess reagent. The active inhibition rate was calculated by the following equation (1), and the results are shown in Table 3 below.

[수학식 1][Equation 1]

Figure pat00017

Figure pat00017

화합물compound iNOS 유도활성
저해도(%)iNOS induction activity
Inhibition rate (%) 10 μM10 μM 1 μM1 [mu] M 실시예 1Example 1 95.295.2 8.28.2 실시예 2Example 2 99.299.2 18.418.4 실시예 3Example 3 87.087.0 9.29.2 실시예 4Example 4 84.184.1 1.71.7 실시예 5Example 5 102.6102.6 36.236.2 실시예 6Example 6 95.195.1 33.333.3 실시예 7Example 7 88.588.5 26.226.2 실시예 8Example 8 103.6103.6 39.639.6 실시예 9Example 9 99.299.2 26.426.4 실시예 10Example 10 101.4101.4 31.631.6 실시예 11Example 11 105.5105.5 40.040.0 실시예 12Example 12 88.388.3 23.323.3 실시예 13Example 13 110.5110.5 20.520.5 비교예Comparative Example 102.4102.4 22.822.8

상기 표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 화합물은 iNOS 유도 활성을 저해하는 효과가 있다는 것을 알 수 있다.As shown in Table 3, it can be seen that the compound according to the present invention has an effect of inhibiting the iNOS inducing activity.

따라서, 본 발명에 따른 유도체들은 iNOS의 유도활성 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
Accordingly, the derivatives according to the present invention can be usefully used as a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of an induction activity-related disease of iNOS.

<< 실험예Experimental Example 2>  2> NFAT5NFAT5 전사활성 억제효과 조사 Investigation of inhibition of transcriptional activity

본 발명에 따른 유도체가 NFAT5 전사활성 억제효과가 있는지 알아보기 위하여 NFAT5 리포터검색을 실시하였다. pEGFP-N1에 backbone 중에서 CMV promoter sequence 부분을 제거하고 NFAT5의 binding site sequence (TGGAAAATTACCG) 부분을 넣어 제작된 plasmid vector를 형질도입시킨 Raw264.7 대식 세포를 10% FBS-RPMI 배지(500 μg/ml의 G418 함유)에서 배양하였다. 세포를 96-웰플레이트에 3 x 103 세포/웰의 밀도로 분주하고 하루 동안 더 배양한 후에 LPS를 1 μg/ml의 농도로 48시간 처리한 후 세포를 고정시키고 GFP의 발현정도를 HCS 형광이미지로 측정하였다(Thermo, ArrayScanVI). 상기 실험결과를 하기 표 4 에 나타내었다.
To investigate whether derivatives according to the present invention have an inhibitory effect on NFAT5 transcriptional activity NFAT5 reporter search. Raw264.7 macrophages transfected with the plasmid vector prepared by removing the CMV promoter sequence portion from the backbone and introducing NFAT5 binding site sequence (TGGAAAATTACCG) into pEGFP-N1 were suspended in 10% FBS-RPMI medium (500 μg / ml G418). Dispensing the cells into 96-well density of 3 x 10 3 cells / well to the plate and fixed and then further the LPS after culture at a concentration of 1 μg / ml 48-time processing for one day the cells and the expression level of GFP fluorescence HCS (Thermo, ArrayScan VI ). The experimental results are shown in Table 4 below.

화합물compound NFAT5 전사활성
저해도(%)NFAT5 transcription activity
Inhibition rate (%) 10 μM10 μM 1 μM1 [mu] M 실시예 1Example 1 55.055.0 11.911.9 실시예 2Example 2 59.659.6 14.714.7 실시예 3Example 3 -- 68.268.2 실시예 4Example 4 -- 34.134.1 실시예 5Example 5 85.985.9 26.126.1 실시예 6Example 6 76.076.0 28.628.6 실시예 7Example 7 77.977.9 25.725.7 실시예 8Example 8 56.156.1 7.27.2 실시예 9Example 9 36.236.2 24.524.5 실시예 10Example 10 68.368.3 26.626.6 실시예 11Example 11 57.557.5 33.633.6 실시예 12Example 12 37.937.9 5.25.2 실시예 13Example 13 32.832.8 32.232.2 비교예Comparative Example 37.737.7 15.915.9

상기 표 4 에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 유도체들은 비교예로써 종래 베르베린보다 NFAT5의 활성을 저해하는 효과가 우수하다는 것을 알 수 있다.As shown in Table 4, the derivatives according to the present invention are comparative examples and, as a result, they are superior to berberine in inhibiting the activity of NFAT5.

따라서, 본 발명에 따른 유도체들은 NFAT5의 활성 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
Therefore, the derivatives according to the present invention can be usefully used as a pharmaceutical composition for preventing or treating an activity-related disease of NFAT5.

<< 실험예Experimental Example 3>  3> NFAT5NFAT5 전사활성에 대한 영향 평가 Evaluation of effects on transcriptional activity

본 발명에 따른 유도체가 NFAF5 전사 활성이 있는지 확인하기 위하여, NFAT5 리포터 검색을 실시하였다. NFAT5 리포터 벡터(pEGFP-N1 에 NFAT5가 붙는 유전자를 삽입한 벡터)로 형질전환 시킨 Raw 264.7 세포를 10% FBS-RPMI 배지에서 배양하였다. 이 형질전환된 세포를 12-웰플레이트에 1.5 x 105 세포/웰의 밀도로 배양을 하고, 하루 뒤에 본 화합물을 1 μM의 농도로 한 시간 동안 전처리를 해 주었다. 한 시간 후에 LPS를 1μg/ml의 농도로 24시간 동안 처리 한 뒤 GFP의 발현 정도를 FACScan cytometer (Becton Dickinson, San Jose, 캐나다) FITC 형광으로 측정 하였다. 또한 선별된 화합물과 양성 대조군으로 본 발명에 따른 실시예 1의 화합물을 이용하여, 세포에 0.25, 0.5, 1.5의 농도로 화합물을 전처리 한 후, LPS 자극을 통한 GFP 발현 변화를 유세포 분석기(FACS)로 분석한 결과를 하기 표 5 및 도 2에 나타내었다.
In order to confirm that the derivative according to the present invention has NFAF5 transcriptional activity, a NFAT5 reporter search was performed. Raw 264.7 cells transformed with the NFAT5 reporter vector (vector in which the gene with NFAT5 inserted into pEGFP-N1) was cultured in 10% FBS-RPMI medium. The transformed cells in the 12-well plate for culturing at a density of 1.5 x 10 5 cells / well, and made it to a pre-treatment for one hour with the compound after a day at a concentration of 1 μM. One hour later, LPS was treated at a concentration of 1 μg / ml for 24 hours, and the expression level of GFP was measured by FACScan cytometer (Becton Dickinson, San Jose, Canada) with FITC fluorescence. In addition, the compound of Example 1 according to the present invention was used as a positive control and the compounds were pretreated at a concentration of 0.25, 0.5, and 1.5, and the changes of GFP expression by LPS stimulation were analyzed by flow cytometry (FACS) The results are shown in Table 5 and FIG. 2 below.

도 2는 본 발명에 따른 프로토베르베린 유도체가 NFAT5 전사활성에 미치는 효과를 FACS 분석으로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
2 is a graph showing the results of FACS analysis of the effect of the protobarbene derivative according to the present invention on NFAT5 transcription activity.

화합물compound %저해도 1% Inhibition 1 %저해도 2% Inhibition 2 실시예 1Example 1 66.4966.49 89.2 89.2 실시예 2Example 2 73.8773.87 73.0 73.0 실시예 3Example 3 114.99114.99 108.0 108.0 실시예 4Example 4 92.0392.03 117.0 117.0 실시예 5Example 5 78.6478.64 98.7 98.7 실시예 6Example 6 80.2280.22 76.8 76.8 실시예 7Example 7 64.9864.98 99.1 99.1 실시예 8Example 8 63.5163.51 72.4 72.4 실시예 9Example 9 77.3477.34 72.7 72.7 실시예 10Example 10 65.9365.93 100.5 100.5 실시예 11Example 11 85.5285.52 123.9 123.9 실시예 12Example 12 90.2290.22 112.8 112.8 실시예 13Example 13 114.46114.46 118.3 118.3 비교예Comparative Example 10.510.5 17.417.4

상기 표 5 및 도 2에 나타난 바와 같이, 양성 대조군인 베르베린에 비해 본 발명에 따른 화합물들이 NFAF5 전사 활성에 대하여 강력한 억제 효과를 나타내었고, 특히 실시예 6의 화합물의 효과가 가장 우수하였다.
As shown in Table 5 and FIG. 2, the compounds according to the present invention exhibited a strong inhibitory effect on NFAF5 transcriptional activity, particularly the effect of the compound of Example 6, in comparison with the positive control group, berberine.

<< 실험예Experimental Example 4>  4> NFNF -κB, -KB, NFATcNFATc , , CREBCREB , , ELKELK 전사활성에 대한 영향 평가 Evaluation of effects on transcriptional activity

본 발명에 따른 유도체들의 NFAT 전사인자 이외의 NF-κB, NFATc, CREB, ELK 전사활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 다음과 같이 실험하였다.The effect of the derivatives according to the present invention on NF-κB, NFATc, CREB and ELK transcription activity other than NFAT transcription factor was examined as follows.

구체적으로, NF-κB 전사활성은 THP1-Lucia NF-κB 리포터세포를 10% FBS-RPMI 배지 (100 ug/ml의 Zeocin 함유)에서 배양하여 측정하였다. 세포를 96-웰플레이트에 2 x 104 세포/웰의 밀도로 배양하고, LPS 1 μg/ml과 화합물을 가하여 24시간 배양한 뒤 상등액 10 μl에 Luminesence assay reagent 50 μl를 가하여 발광을 측정하였다.Specifically, NF-κB transcription activity was measured by culturing THP1-Lucia NF-κB reporter cells in 10% FBS-RPMI medium (containing 100 ug / ml of Zeocin). The cells were cultured in 96-well plates at a density of 2 x 10 4 cells / well, and the compound was added to 1 μg / ml of LPS for 24 hours. Luminescence assay reagent (50 μl) was added to 10 μl of the supernatant.

또한, NFAT 전사활성 평가는 THP1-XBlue-MD2-CD14 세포를 10% FBS-RPMI 배지 (200 μg/ml의 Zeocin, 250 μg/ml의 G418 함유)에서 배양하여 측정하였다. 먼저 세포를 96-웰플레이트에 2 x 104 세포/웰의 밀도로 배양하고, LPS 1 μg/ml과 화합물을 가하여 24시간 배양한 뒤 상등액 20 μl에 secreted embryonic alkaline phosphatase (SEAP) detection medium 180 μl를 가하여 2시간 배양한 뒤 655 nm에서 흡광도를 측정하였다.In addition, NFAT transcriptional activity was evaluated by culturing THP1-XBlue-MD2-CD14 cells in 10% FBS-RPMI medium (containing 200 μg / ml Zeocin and 250 μg / ml G418). First, the cells were cultured at a density of 2 x 10 4 cells / well in a 96-well plate, added with 1 μg / ml of LPS and incubated for 24 hours, and then 180 μl of secreted embryonic alkaline phosphatase (SEAP) And incubated for 2 hours. Absorbance was measured at 655 nm.

나아가, CREB 및 ELK1 전사활성 평가는 CHO/CREB-luc, HEK293/CREB-luc, HLR/ELK1 세포를 이용하여 실시하였다. 세포는 각각 10% FBS-F12 (100 μg/ml의 hygromycin 함유), 10% FBS-DMEM (100 μg/ml의 hygromycin 함유), 10% FBS-DMEM (200 ug/ml의 G418 함유)에서 배양하여 96-웰플레이트에 1 x 104 세포/웰의 밀도로 배양하고 하루 동안 더 배양한 후, 10 μM의 Forskolin 또는 1 μg/ml의 PMA를 24시간 처리한 세포를 분쇄시키고 발광검색시약 25 μl를 가하여 발광을 측정하였다. 상기 실험결과들을 도 3에 나타내었다.
Furthermore, CREB and ELK1 transcriptional activity assays were performed using CHO / CREB-luc, HEK293 / CREB-luc and HLR / ELK1 cells. Cells were cultured in 10% FBS-F12 (containing 100 μg / ml hygromycin), 10% FBS-DMEM (containing 100 μg / ml hygromycin) and 10% FBS-DMEM (containing 200 μg / ml G418) Cells were cultured at a density of 1 x 10 4 cells / well in a 96-well plate and further cultured for one day. Cells treated with 10 μM of Forskolin or 1 μg / ml of PMA for 24 hours were pulverized and 25 μl of luminescence detection reagent And the luminescence was measured. The experimental results are shown in FIG.

도 3은 본 발명에 따른 유도체가 NFAT 전사인자 이외의 전사활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프로서, 구체적으로 A는 NF-κB, B는 NFAT, C는 CREB(CHO-K1), D는 CREB(HEK293), E는 ELK에 대한 전사활성의 억제를 나타낸 그래프이다.
3 is a graph showing the effect of derivatives according to the present invention on transcription activity other than NFAT transcription factors. Specifically, A is NF-κB, B is NFAT, C is CREB (CHO-K1), D is CREB ), And E is a graph showing inhibition of transcriptional activity against ELK.

도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 프로토베르베린 유도체 중, 실시예 6 및 12는 NF-κB, NFAT 및 CREB(HEK293)의 전사활성을 10 μM에서 상당히 억제하는 것을 알 수 있다.
As shown in FIG. 3, among the protobarbene derivatives according to the present invention, Examples 6 and 12 show that the transcriptional activity of NF-kB, NFAT and CREB (HEK293) is significantly inhibited at 10 μM.

<< 실험예Experimental Example 5>  5> ROSROS 의 발현 및 And p38p38 전사활성 대한 영향 평가 Evaluation of effects on transcriptional activity

본 발명에 따른 유도체의 p38의 인산화 및 ROS의 발현을 확인하기 위해서 12웰 플레이트에 RAW264.7 (10% FBS-RPMI 1640 배지) 을 1.5 x 105의 밀도로 배양하였다. 실시예 1(1μM)을 한 시간 전 처리하거나 처리하지 않은 뒤, LPS (1μg/ml)로 자극하여 시간(15, 30, 60분)에 따른 p38 단백질과 활성 상태 p38 단백질(인산화)의 발현 차이를 웨스턴 블롯(western blot)으로 확인하였고, ROS의 발현 변화도 유세포 분석기로 분석하였다. 또한, p38 이종효소에 대한 저해도를 0.1 μM 및 0.5 μM에서 분석하여 표 6에 나타내었다.
RAW264.7 (10% FBS-RPMI 1640 medium) was cultured in a 12-well plate at a density of 1.5 x 10 &lt; 5 &gt; to confirm phosphorylation of p38 of the derivative according to the present invention and expression of ROS. The expression level of the p38 protein and the active p38 protein (phosphorylated) at different times (15, 30, and 60 min) was stimulated with LPS (1 μg / ml) Were identified by western blot and the expression of ROS was analyzed by flow cytometry. In addition, the degree of inhibition against p38 heterozygous enzyme was analyzed at 0.1 [mu] M and 0.5 [mu] M, and is shown in Table 6.

도 4의 A는 본 발명에 따른 프로토베르베린 유도체가 p38의 활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이고, B는 ROS의 활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
FIG. 4A is a graph showing the effect of the protoberberine derivative according to the present invention on the activity of p38, and B is a graph showing the effect on the activity of ROS. FIG.

　화합물compound % 저해도% Inhibition p38p38 αalpha p38p38 βbeta p38p38 γgamma p38p38 δδ 비교예Comparative Example 0.1 μM0.1 μM 00 00 00 00 0.5 μM0.5 μM 00 00 00 00 실시예 6 Example 6 0.1 μM0.1 μM 00 99 00 00 0.5 μM0.5 μM 00 00 00 00 실시예 12 Example 12 0.1 μM0.1 μM 00 66 00 22 0.5 μM0.5 μM 00 55 00 22

상기 표 6 및 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 유도체를 처리한 군과 처리하지 않은 대조군에서 ROS 및 p38 단백질(인산화) 발현 정도의 차이가 없었다.
As shown in Table 6 and FIG. 4, there was no difference in the expression level of ROS and p38 protein (phosphorylation) in the group treated with the derivative according to the present invention and the control group not treated.

<실험예 6> NFAT5의 전사단계 및 핵 이동 조사<Experimental Example 6> NFAT5 transcription step and nuclear transfer assay

본 발명에 따른 유도체가 NFAT5의 mRNA 발현에 영향을 미치는지 확인해 보았다.  And examined whether the derivatives according to the present invention had an effect on mRNA expression of NFAT5.

구체적으로, 12웰 플레이트에 RAW264.7(10% FBS-RPMI 1640 배지)을 1.5 x 105 세포/웰의 밀도로 배양한 뒤 하루 동안 안정화를 시켰다. 본 발명에 따른 실시예 1의 화합물을 1μM 의 농도로 한 시간 전처리 한 후, LPS로 12시간 동안 세포에 자극 시켰다. 12시간 후 세포에서 mRNA를 분리하여 cDNA를 합성한 후, 실시간 중합 효소반응을 통해서 NFAT5의 mRNA 발현 양을 측정하였다. 또한, 전사 조절 물질인 NFAT5가 세포질에서 핵으로 이동하는 정도를 확인하였다. 6 웰 플레이트에 RAW264.7(10% FBS-RPMI 1640 배지)의 6 x 105 세포/웰의 밀도로 배양한 뒤, 화합물 6(1μM)을 한 시간 전처리 하고, LPS(1μg/ml)를 24시간 처리하였다. 자극된 세포에서 세포질과 핵의 단백질 분리를 통해서, NFAT5와 NF-κB의 subunit인 p65의 단백질을 확인하여 도 5에 나타내었다.
Specifically, in a 12-well plate RAW264.7 (10% FBS-RPMI 1640 medium) to 1.5 x 10 5 after the culture at a density of cells / well was the stabilizing for a day. The compound of Example 1 according to the present invention was pretreated for 1 hour at a concentration of 1 μM and stimulated with LPS for 12 hours. After 12 hours, the mRNA was isolated from the cells to synthesize cDNA, and the amount of mRNA expression of NFAT5 was measured by real-time PCR. In addition, the degree of transfer of the transcriptional regulatory substance, NFAT5, from the cytoplasm to the nucleus was confirmed. 6 μl / well of LPS (1 μg / ml) was cultured in a 6-well plate at a density of 6 × 10 5 cells / well of RAW 264.7 (10% FBS-RPMI 1640 medium) Time. The protein of p65, a subunit of NFAT5 and NF-κB, was identified through the separation of cytoplasmic and nuclear proteins from the stimulated cells and is shown in FIG.

도 5는 본 발명에 따른 유도체가 전사단계 및 핵 이동에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
FIG. 5 is a graph showing the effect of the derivatives according to the present invention on the transferring step and nuclear migration.

도 5에 나타난 바와 같이, LPS의 처리로 인해 NFAT5의 발현은 세포질로부터 분리한 단백질에서 보다 핵에서 분리한 단백질에서 증가한 것을 알 수 있었고, 본 발명에 따른 실시예 6의 화합물을 전처리하였을 경우 LPS 처리로 인해 증가했던 단백질 양이 감소하는 양상을 보였다. 또한, LPS 자극으로 인해 증가된 NFAT5의 활성이 본 발명에 따른 유도체로부터 전사체 단계부터 억제되고 순차적으로 하위 단계 표적 유전자에도 영향을 미쳐 발현을 감소시키는 것을 나타낸다.As shown in FIG. 5, the expression of NFAT5 was increased in the protein isolated from the nucleus, compared with the protein isolated from the cytoplasm. When the compound of Example 6 according to the present invention was pretreated, LPS treatment And the amount of protein that was increased due to the decrease was decreased. In addition, the increased activity of NFAT5 due to LPS stimulation indicates that the derivative according to the present invention is inhibited from the transcriptional stage and subsequently affects the sub-stage target gene, thereby decreasing expression.

따라서, LPS에 의해 발현이 증가된 NFAT5을 유효물질이 특이적으로 전사체 단계부터 억제시켜 NFAT5의 단백질 발현의 억제를 유도할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
Thus, it was found that NFAT5, whose expression was increased by LPS, could specifically inhibit protein expression of NFAT5 by inhibiting the active substance specifically from the transcriptional stage.

<실험예 7> 고장성에서 반응하는 인자들에 대한 효과 조사&Lt; Experimental Example 7 > Investigation of effects on reactivity factors in hyperactivity

고장성 조건에서 NFAT5가 조절하는 인자들이 실시예 1에 의해서 영향을 미치는지 확인해 보았다. 6웰 플레이트에 Raw264.7 세포를 (10% FBS-RPMI 1640 배지) 1.5 x 105 세포/웰의 밀도로 배양하여 안정화를 시켰다. 실시예 6의 화합물(1μM)을 한 시간 전 처리한 후, NaCl(45 mM)을 3시간 자극해 준 뒤, 추출한 mRNA에서 cDNA를 합성하여 NFAT5 전사체를 실시간 중합효소 반응으로 확인하여 도 6에 나타내었다.
We examined whether the factors regulated by NFAT5 in the hypertrophic condition were influenced by Example 1. 6 the Raw264.7 cells in the well plates (10% FBS-RPMI 1640 medium) was 1.5 x 10 5 stabilized by culture at a density of cell / well. After the compound (1 μM) of Example 6 was pretreated for one hour, NaCl (45 mM) was stimulated for 3 hours, cDNA was synthesized from the extracted mRNA, and the NFAT5 transcript was confirmed by real- Respectively.

도 6은 본 발명에 따른 프로토베르베린 유도체가 염화나트륨에 의해 증가되는 NFAT5의 전사체 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이고, 구체적으로 A는 AR, B는 BGT1, C는 SMIT의 전사체에 관한 그래프이다.
FIG. 6 is a graph showing the effect of the protoberberine derivative according to the present invention on the expression of transcripts of NFAT5 increased by sodium chloride. Specifically, A is AR, B is BGT1, and C is a graph relating to a transcript of SMIT.

도 6에 나타난 바와 같이 NaCl을 처리하였을 때 NFAT5의 전사체인 BGT1 및 AR의 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었고, 이렇게 증가된 상기 전사체는 본 발명에 따른 실시예 6의 화합물로 처리한 경우에도 차이를 보이지 않았다.
As shown in FIG. 6, when NaCl was treated, it was confirmed that the expression of NFAT5 transcripts BGT1 and AR was increased, and even when the transcripts thus treated were treated with the compound of Example 6 according to the present invention, .

<< 실험예Experimental Example 8>  8> COXCOX 효소 저해효과 조사 Enzyme inhibition effect investigation

COX 효소 저해는 대표적인 항염증 기전으로서 선별된 화합물이 COX1 및 COX2 효소에 대한 저해효과를 보이는지 확인하기 위하여 본 발명에 따른 실시예 6 및 12의 저해도를 베르베린과 비교하여 조사하였다. The inhibition of COX enzyme was investigated in comparison with berberine in the inhibition of Examples 6 and 12 according to the present invention in order to confirm whether the selected compound showed an inhibitory effect on COX1 and COX2 enzymes as a typical antiinflammatory mechanism.

구체적으로, Cayman사의 COX assay kit (Cat# 760111)를 사용하였다. 완충액 69 μl와 Heme 5 μl, 효소 5 μl를 실시예 6의 1 μl 또는 실시예 12의 1 μl 와 섞은 후 상온에서 5분간 미리 반응시키고 기질 10 μl와 아라키도닉산 10 μl를 넣어 빛이 없는 상태에서 10분간 반응을 시킨 후, 590 nm에서 흡광을 측정하여, 그 결과를 하기 표 7(COX1) 및 표 8(COX2) 및 도 7에 나타내었다.
Specifically, Cayman's COX assay kit (Cat # 760111) was used. 69 μl of buffer and 5 μl of Heme and 5 μl of enzyme were mixed with 1 μl of Example 6 or 1 μl of Example 12 and reacted for 5 minutes at room temperature in advance. 10 μl of substrate and 10 μl of arachidonic acid were added to the solution in the absence of light And the absorbance at 590 nm was measured. The results are shown in Table 7 (COX1) and Table 8 (COX2) and in FIG. 7, respectively.

도 7은 본 발명에 따른 프로토베르베린 유도체의 COX-1(A), COX-2(B) 효소 억제효과를 나타낸 그래프이다.
7 is a graph showing the COX-1 (A) and COX-2 (B) enzyme inhibitory effects of the protoberberine derivative according to the present invention.

농도(μM)Concentration (μM) 인도메타신Indomethacin 비교예Comparative Example 실시예 6Example 6 실시예 12Example 12 100100 101.7101.7 90.690.6 53.553.5 51.551.5 72.672.6 70.670.6 92.692.6 87.687.6 2020 93.693.6 86.686.6 24.424.4 31.431.4 62.562.5 63.563.5 71.671.6 79.679.6 44 72.672.6 71.671.6 18.418.4 20.420.4 50.550.5 45.545.5 62.562.5 63.563.5 0.80.8 62.562.5 66.666.6 12.412.4 13.413.4 39.539.5 34.434.4 51.551.5 48.548.5 0.160.16 41.541.5 39.539.5 3.33.3 5.45.4 12.412.4 13.413.4 34.434.4 33.433.4 0.0320.032 17.417.4 15.415.4 2.32.3 00 2.32.3 00 3.33.3 8.48.4 0.00640.0064 11.411.4 8.48.4 　 　 　 　 0.001280.00128 2.32.3 00 　 　 　 　 IC50(μM)IC50 ([mu] M) 0.380.38 96.396.3 6.06.0 1.11.1

농도(μM)Concentration (μM) 인도메타신Indomethacin 비교예Comparative Example 실시예 6Example 6 실시예 12Example 12 100100 104.5104.5 96.996.9 50.350.3 53.753.7 75.775.7 72.372.3 90.190.1 88.488.4 2020 83.383.3 84.284.2 41.041.0 39.339.3 60.560.5 59.659.6 79.179.1 78.278.2 44 75.775.7 75.775.7 28.228.2 29.929.9 49.449.4 49.449.4 66.466.4 68.968.9 0.80.8 63.863.8 65.565.5 17.217.2 19.819.8 34.234.2 36.736.7 46.046.0 41.841.8 0.160.16 54.554.5 40.140.1 8.88.8 7.97.9 23.223.2 18.118.1 25.725.7 24.024.0 0.0320.032 26.626.6 31.631.6 00 00 2.02.0 00 2.02.0 7.17.1 0.00640.0064 9.69.6 8.88.8 　 　 　 　 0.001280.00128 00 00 　 　 　 　 IC50 (μM)IC50 ([mu] M) 0.260.26 58.458.4 5.7 5.7 1.31.3

상기 표 7 및 8 및 도 7에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 6 및 12는 COX1과 COX2 효소저해효과가 미미함을 알 수 있다.
As shown in Tables 7 and 8 and FIG. 7, it can be seen that Examples 6 and 12 according to the present invention have insufficient COX1 and COX2 enzyme inhibitory effects.

<실험예 9> 세포독성조사 <Experimental Example 9> Cytotoxicity investigation

본 발명에 따른 유도체의 세포 독성을 알아보기 위하여, 구체적으로 5종의 세포(VERO: African green monkey kidney cell line, HFL-1: human embryonic lung cell line, L929: NCTC clone 929, mouse fibroblast cell line, NIH 3T3: mouse embryonic fibroblast cell line, CHO-K1: Chinese hamster ovary cell line)를 1 x 104개/웰의 밀도로 96-웰플레이트에 분주하여 화합물을 24시간동안 처리하고 수용성의 WST-8이라는 테트라졸륨염를 가한 후 살아있는 세포에 존재하는 dehydrogenase에 의해 분해되어 오렌지색의 포르마잔 염료를 흡광에서 읽은 후 ㅂ비선형회귀분석(nonlinear regression)을 하고 50% 성장저해농도 (Growth Inhibition)를 결정하여, 그 결과를 표 9에 나타내었다.
In order to examine the cytotoxicity of the derivatives according to the present invention, five types of cells (VERO: African green monkey kidney cell line, HFL-1: human embryonic lung cell line, L929: NCTC clone 929, mouse fibroblast cell line, NIH 3T3: mouse embryonic fibroblast cell line, CHO-K1: Chinese hamster ovary cell line) was dispensed into a 96-well plate at a density of 1 x 10 4 / well to treat the compound for 24 hours, After adding the tetrazolium salt, the orange formazan dye was decomposed by dehydrogenase present in living cells, and then the nonlinear regression was performed and the 50% growth inhibition was determined. Are shown in Table 9.

화합물compound GI50 (μM)GI50 ([mu] M) VEROVERO L929L929 HFL-1HFL-1 NIN3T3NIN3T3 CHO-K1CHO-K1 비교예Comparative Example >100> 100 >100> 100 >100> 100 >100> 100 >100> 100 실시예 6Example 6 　32.832.8 19.919.9 63.463.4 52.252.2 30.530.5 실시예 12Example 12 >100> 100 32.332.3 >100> 100 75.875.8 91.891.8

표 9에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 유도체 중 실시예 12의 화합물은 독성이 낮았고, 실시예 6의 화합물은 비교예인 베르베린 보다 독성이 증가하였으나 10 μM 이하에서 세포에 미치는 독성은 미미한 수준이었다.
As shown in Table 9, the compound of Example 12 was low in toxicity and the compound of Example 6 was more toxic than berberine of the comparative example. However, the toxicity of the compound of Example 12 to cells was insignificant at 10 μM or less.

<< 실험예Experimental Example 10>  10> 염증성사이토카인의Inflammatory cytokine 분비억제효과 조사  Investigation of secretion inhibition effect

본 발명에 따른 유도체가 NFAT5의 표적 유전자인 IL-6, TNF-α, GM-CSF2, iNOS의 발현에 영향을 미치는지 보기 위하여, Real time PCR, ELISA, Western blot을 수행하였다. Raw264.7 세포를 12-웰플레이트에 1.5 x 106 세포/웰의 밀도로 10% FBS-RPMI 배지에 배양을 하고 다음날 실시예 6 및 12의 화합물을 1μM로 한 시간 전처리 후에 LPS (1μg/ml)를 6시간 동안 처리하였다. 6시간 처리 후에 웰의 상층액을 따서 ELISA로 측정하여 도 8에 나타내었다.
Real time PCR, ELISA and Western blotting were performed to examine whether the derivatives according to the present invention affect the expression of IL-6, TNF-a, GM-CSF2 and iNOS, the target genes of NFAT5. The Raw264.7 cells in 12-well plate at 1.5 x 10 6 cells / culture in 10% FBS-RPMI medium to a density of the well and after one hour pretreatment the compounds of Examples 6 and day 12 with 1μM LPS (1μg / ml ) For 6 hours. After 6 hours of treatment, the supernatant of the wells was counted by ELISA, and the results are shown in FIG.

도 8은 본 발명에 따른 프로토베르베린 유도체의 염증성사이토카인의 분비억제효과를 나타낸 그래프이다.
8 is a graph showing the effect of inhibiting the secretion of inflammatory cytokines of the protobarbene derivative according to the present invention.

도 8에 나타낸 바와 같이, LPS 자극으로 인해 증가된 IL-6, TNF-α 및 GM-CSF2의 단백질 발현이 본 발명에 따른 유도체의 처리로 인해 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있다.
As shown in Fig. 8, it can be seen that the protein expression of IL-6, TNF-a and GM-CSF2 increased due to LPS stimulation was significantly reduced by the treatment of the derivatives according to the present invention.

<< 실험예Experimental Example 11> 콜라겐으로 유도된  Collagen-induced 류마티스관절염Rheumatoid arthritis 마우스모델 시험 Mouse model test

본 발명에 따른 실시예 6의 화합물이 in vivo 상에서 관절염의 유도를 억제시킬 수 있는지 조사하였다. 7-8주령의 수컷 DBA/1 마우스(Jackson Laboratories, BarHarbor, ME)를 bovine 타입 II 콜라겐(CII : Chondrex, Redmond, WA)으로 면역반응을 유도한 뒤, 3주부터 매일 5주 동안 실시예 6(3 mg/kg)을 복강 내로 주입시켰다. 다음과 같은 관절염 증상 정도를 기준으로 (0점은 정상, 1점=미약함, 2점=약함, 3점=보통, 4점=심함) 점수를 측정하였다. 실시예 6을 주입하는 5주 동안 마우스 다리의 관절염 정도를 평가하여 도 9에 나타내었다.
It was investigated whether the compound of Example 6 according to the present invention can inhibit the induction of arthritis in vivo. Immunoreactivity was induced with bovine type II collagen (CII: Chondrex, Redmond, WA) at 7-8 weeks of age in male DBA / 1 mice (Jackson Laboratories, BarHarbor, ME) (3 mg / kg) was injected intraperitoneally. The scores of the following arthritic symptoms were scored based on the degree of arthritis symptoms (0 for normal, 1 for weak, 2 for weak, 3 for normal, 4 for severe). The degree of arthritis of the mouse legs was evaluated during 5 weeks of injecting Example 6 and is shown in FIG.

[수학식 2]&Quot; (2) &quot;

Figure pat00018
Figure pat00018

도 9에 나타난 바와 같이, 음성 대조군과 비교하면 본 발명에 따른 실시예 6의 화합물을 처리한 군의 마우스 다리의 관절 부위가 육안으로 관찰하였을 경우 관절염의 증상이 완화된 것을 확인할 수 있었고, 조직학적 염색을 통해서도 관절염 증상이 월등히 회복된 것을 확인할 수 있었다. As shown in FIG. 9, when compared to the negative control group, it was confirmed that the symptoms of arthritis were alleviated when the joint region of the mouse legs of the group treated with the compound of Example 6 according to the present invention was visually observed, It was also confirmed that the symptoms of arthritis were significantly restored through dyeing.

따라서, 본 발명에 따른 유도체는 관절염 질환을 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용할 수 있다는 것을 알 수 있다.
Thus, it can be seen that the derivatives according to the invention may be useful as pharmaceutical compositions for the prevention or treatment of arthritis diseases.

<< 제제예Formulation example 1> 약학적 제제의 제조 1> Preparation of pharmaceutical preparations

<1-1> <1-1> 산제의Sanje 제조 Produce

화학식 1로 표시되는 유도체 2 gThe derivative represented by the formula (1) 2 g

유당 1 gLactose 1 g

상기의 성분을 혼합한 후, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
After mixing the above components, the mixture was packed in an airtight container to prepare a powder.

<1-2> 정제의 제조<1-2> Preparation of tablets

화학식 1로 표시되는 유도체 100 ㎎The derivative represented by the formula (1) 100 mg

옥수수전분 100 ㎎Corn starch 100 mg

유 당 100 ㎎Yu 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 ㎎Magnesium stearate 2 mg

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
After mixing the above components, tablets were prepared by tableting according to a conventional method for producing tablets.

<1-3> 캡슐제의 제조&Lt; 1-3 > Preparation of capsules

화학식 1로 표시되는 유도체 100 ㎎The derivative represented by the formula (1) 100 mg

옥수수전분 100 ㎎Corn starch 100 mg

유 당 100 ㎎Yu 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 ㎎Magnesium stearate 2 mg

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
After mixing the above components, the capsules were filled in gelatin capsules according to the conventional preparation method of capsules.

<1-4> 주사액제의 제조<1-4> Preparation of Injection Solution

화학식 1로 표시되는 유도체 10 ㎍/㎖The derivative represented by the formula (1)   10 [mu] g / ml

묽은 염산 BP pH 3.5로 될 때까지Dilute hydrochloric acid BP until pH 3.5

주사용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖Injectable sodium chloride BP Up to 1 ml

적당한 용적의 주사용 염화나트륨 BP 중에 본 발명에 따른 화합물을 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 사용하여 pH 3.5로 조절하고, 주사용 염화나트륨 BP를 사용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120 ℃에서 15 분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.
The compound according to the invention was dissolved in a suitable volume of injected sodium chloride BP and the pH of the resulting solution was adjusted to pH 3.5 using dilute hydrochloric acid BP and the volume was adjusted using injectable sodium chloride BP and mixed thoroughly. The solution was filled in a 5 ml type I ampoule made of transparent glass, sealed in an upper lattice of air by dissolving the glass, sterilized by autoclaving at 120 DEG C for 15 minutes or longer, and an injection solution was prepared.

<< 제조예Manufacturing example 2> 건강식품의 제조 2> Manufacture of health food

화학식 1로 표시되는 유도체 500 ngThe derivative represented by the formula (1)  500 ng

비타민 혼합물 적량Vitamin mixture Suitable amount

비타민 A 아세테이트 70 ㎍Vitamin A acetate 70 [mu] g

비타민 E 1.0 ㎎Vitamin E 1.0 mg

비타민 0.13 ㎎vitamin 0.13 mg

비타민 B2 0.15 ㎎Vitamin B2 0.15 mg

비타민 B6 0.5 ㎎Vitamin B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 ㎍Vitamin B12 0.2 [mu] g

비타민 C 10 ㎎Vitamin C 10 mg

비오틴 10 ㎍Biotin 10 [mu] g

니코틴산아미드 1.7 ㎎Nicotinic acid amide 1.7 mg

엽산 50 ㎎Folic acid 50 mg

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎Calcium pantothenate 0.5 mg

무기질 혼합물 적량Mineral mixture Suitable amount

황산제1철 1.75 ㎎Ferrous sulfate 1.75 mg

산화아연 0.82 ㎎Zinc oxide 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3 ㎎Magnesium carbonate 25.3 mg

제1인산칼륨 15 ㎎Potassium monophosphate 15 mg

제2인산칼슘 55 ㎎Dicalcium phosphate 55 mg

구연산칼륨 90 ㎎Potassium citrate 90 mg

탄산칼슘 100 ㎎Calcium carbonate 100 mg

염화마그네슘 24.8 ㎎Magnesium chloride 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
Although the composition ratio of the above-mentioned vitamin and mineral mixture is comparatively mixed with a composition suitable for health food as a preferred embodiment, the compounding ratio may be arbitrarily modified, and the above ingredients are mixed according to a conventional method for producing healthy foods , Granules can be prepared and used in the manufacture of health food compositions according to conventional methods.

<< 제제예Formulation example 3>  3> 건강음료의Health drink 제조 Produce

화학식 1로 표시되는 유도체 500 ngThe derivative represented by the formula (1) 500 ng

구연산 1000 ㎎Citric acid 1000 mg

올리고당 100 goligosaccharide 100 g

매실농축액 2 gPlum concentrate 2 g

타우린 1 gTaurine 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖Purified water is added to the entire 900 ml

통상의 건강 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 건강 음료 조성물 제조에 사용하였다.The above components were mixed according to a conventional health drink manufacturing method, and the mixture was stirred and heated at 85 DEG C for about 1 hour. The resulting solution was filtered to obtain a sterilized container, which was sealed and sterilized, And used for manufacturing.

상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호 도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.Although the composition ratio is relatively mixed with the ingredient suitable for the favorite drink, it is also possible to arbitrarily modify the blending ratio according to the regional and national preference such as the demand class, the demanding country, and the use purpose.

Claims (9)

하기 화학식 1로 표시되는 프로토베르베린 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 NFAT5의 활성 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
[화학식 1]
Figure pat00019

(상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 독립적으로 직쇄 또는 측쇄의 C1-6알킬 또는 이들이 결합되어 있는 산소 원자와 함께 5 내지 6 원자 고리를 형성하고;
R3, R4 및 R5는 독립적으로 수소, 직쇄 또는 측쇄의 C1 - 6알킬, 이중 결합을 하나 이상 포함하는 직쇄 또는 측쇄의 C1 - 6알케닐 또는 C6 - 10아릴C1 - 4알킬이고, 여기서, 상기 아릴알킬은 비치환 또는 할로겐, 니트로 및 직쇄 또는 측쇄의 C1 - 6알킬 또는 C1-6할로알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상으로 더 치환될 수 있고;
X-는 할로겐 음이온 또는 HSO4 -이다).
1. A pharmaceutical composition for preventing or treating an activity-related disease of NFAT5 comprising, as an active ingredient, a protoberberine derivative represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
[Chemical Formula 1]
Figure pat00019

(In the formula 1,
R 1 and R 2 independently form a 5- to 6-membered ring together with straight or branched C 1-6 alkyl or an oxygen atom to which they are attached;
R 3 , R 4 And R 5 is independently hydrogen, a linear or branched C 1 - 6 alkyl, C 1 of a straight or branched chain containing at least one double bond alkenyl 6 Al or C 6 - 10 aryl C 1 - is 4-alkyl, wherein the aryl-alkyl is unsubstituted or halogen, nitro and straight-chain or branched C 1 - may be further substituted with at least one member selected from the group consisting of 6 alkyl or C 1-6 haloalkyl;
X - is a halogen anion or HSO 4 - ).
제1항에 있어서,
상기 R1 및 R2는 독립적으로 직쇄 또는 측쇄의 C1 - 4알킬 또는 이들이 결합되어 있는 산소 원자와 함께 5 내지 6 원자 고리를 형성하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein R 1 and R 2 are independently a C straight or branched 1 - 4 alkyl, or a pharmaceutical composition characterized in that they form a 5- to 6-membered ring together with the oxygen atoms to which they are attached.
제1항에 있어서,
상기 R3, R4 및 R5는 독립적으로 수소, 직쇄 또는 측쇄의 C1 - 4알킬, 이중 결합을 하나 이상 포함하는 직쇄 또는 측쇄의 C1 - 4알케닐 또는 벤질이고, 여기서, 상기 벤질은 비치환 또는 할로겐, 니트로 및 직쇄 또는 측쇄의 C1 - 4알킬 또는 C1 - 4할로알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상으로 더 치환될 수 있는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
The method according to claim 1,
R 3 , R 4 And R 5 is independently hydrogen, a linear or branched C 1 - 4 alkyl, a linear or branched chain containing one or more double bonds, C 1 - and 4-alkenyl or benzyl, where said benzyl is unsubstituted or halogen, nitro and straight or branched C 1 - 4 alkyl or C 1 - 4, characterized in that the pharmaceutical composition, which may be further substituted with at least one member selected from the group consisting of haloalkyl.
제1항에 있어서,
상기 R3, R4 및 R5는 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, 알릴 및 벤질이고, 여기서, 상기 벤질은 비치환 또는 할로겐, 니트로 및 메틸, 에틸, 트리플루오로메틸로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상으로 더 치환될 수 있는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
The method according to claim 1,
R 3 , R 4 And R 5 is independently hydrogen, methyl, ethyl, allyl, and benzyl, wherein said benzyl may be unsubstituted or substituted with one or more substituents selected from the group consisting of halogen, nitro, and methyl, ethyl, trifluoromethyl Or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
제1항에 있어서,
상기 프로토베르베린 유도체는:
1) 13-(3-알릴)-9,10-디메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움아이오다이드;
2) 9-(2-메틸-3-나이트로벤질옥시)-13-에틸-2,3,10-트리메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움아이오다이드;
3) 9-(3-클로로벤질옥시)-13-에틸-2,3,10-트리메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움아이오다이드;
4) 9-(2-트리플루오로-4-플루오로벤질옥시)-13-에틸-2,3,10-트리메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움아이오다이드;
5) 13-(2,6-디플루오로벤질)-9,10-디메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움클로라이드;
6) 13-(2-플루오로벤질)-9,10-디메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움클로라이드;
7) 9-(2-메틸벤질옥시)-13-에틸-2,3,10-트리메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움아이오다이드;
8) 9-(4-트리플루오로메틸벤질옥시)-13-에틸-2,3,10-트리메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움아이오다이드;
9) 13-에틸-9,10-디메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움아이오다이드;
10) 8-에틸-9,10-디메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움설페이트;
11) 13-(3,4-디플루오로벤질)-9,10-디메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움클로라이드;
12) 9-알릴옥시-13-에틸-2,3,10-트리메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움아이오다이드; 및
13) 9-(2,5-디메틸벤질옥시)-13-에틸-2,3,10-트리메톡시-5H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-7-이움아이오다이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
The method according to claim 1,
The protobarbene derivative may be:
1) Preparation of 13- (3-allyl) -9,10-dimethoxy-5H- [1,3] dioxolo [4,5- g] isoquinolino [3,2- a] isoquinoline- Odides;
2) Preparation of 9- (2-methyl-3-nitrobenzyloxy) -13-ethyl-2,3,10-trimethoxy-5H- [1,3] dioxolo [4,5- [3,2-a] isoquinolin-7-ynyl iodide;
3) 9- (3-chlorobenzyloxy) -13-ethyl-2,3,10-trimethoxy-5H- [l, 3] dioxolo [4,5- g] isoquinolino [ a] isoquinolin-7-ium iodide;
4) Synthesis of 9- (2-trifluoro-4-fluorobenzyloxy) -13-ethyl-2,3,10-trimethoxy-5H- [1,3] dioxolo [4,5- Quinolino [3,2-a] isoquinolin-7-ynyl iodide;
5) Preparation of 13- (2,6-difluorobenzyl) -9,10-dimethoxy-5H- [1,3] dioxolo [4,5- g] isoquinolino [3,2- a] isoquinoline -7-ium chloride;
6) 13- (2-Fluorobenzyl) -9,10-dimethoxy-5H- [1,3] dioxolo [4,5-g] isoquinolino [3,2-a] isoquinoline- Ium chloride;
7) Synthesis of 9- (2-methylbenzyloxy) -13-ethyl-2,3,10-trimethoxy-5H- [1,3] dioxolo [4,5- g] isoquinolino [ a] isoquinolin-7-ium iodide;
8) 9- (4-Trifluoromethylbenzyloxy) -13-ethyl-2,3,10-trimethoxy-5H- [l, 3] dioxolo [4,5- g] isoquinolino [ , 2-a] isoquinolin-7-ium iodide;
9) 13-Ethyl-9,10-dimethoxy-5H- [1,3] dioxolo [4,5-g] isoquinolino [3,2-a] isoquinoline-7-ium iodide;
10) 8-Ethyl-9,10-dimethoxy-5H- [1,3] dioxolo [4,5-g] isoquinolino [3,2-a] isoquinoline-7-ium sulfate;
11) Preparation of 13- (3,4-difluorobenzyl) -9,10-dimethoxy-5H- [1,3] dioxolo [4,5- g] isoquinolino [3,2- a] isoquinoline -7-ium chloride;
12) Synthesis of 9-allyloxy-13-ethyl-2,3,10-trimethoxy-5H- [1,3] dioxolo [4,5-g] isoquinolino [ 7-ium iodide; And
13) Synthesis of 9- (2,5-dimethylbenzyloxy) -13-ethyl-2,3,10-trimethoxy-5H- [1,3] dioxolo [4,5- g] isoquinolino [ 2-a] isoquinoline-7-ium iodide.
제1항에 있어서,
상기 화학식 1로 표시되는 프로토베르베린 유도체는 NFAT5 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the protobarbene derivative represented by Formula 1 inhibits NFAT5 activity.
제1항에 있어서,
상기 NFAT5 활성 관련 질환은 류마티스관절염 또는 염증질환인 것을 특징으로 하는 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein said NFAT5 activity-related disease is rheumatoid arthritis or inflammatory disease.
제1항의 프로토베르베린 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 NFAT5 활성 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
A health food composition for preventing or ameliorating NFAT5 activity-related diseases containing the protoberberine derivative of claim 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
제8항에 있어서,
상기 NFAT5 활성 관련 질환은 류마티스관절염 또는 염증질환인 것을 특징으로 하는 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.9. The method of claim 8,
Wherein said NFAT5 activity-related disease is rheumatoid arthritis or inflammatory disease.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190086920A (en) 2018-01-15 2019-07-24 연세대학교 산학협력단 novel compound having Ras degrading activity and composition for preventing or treating cancer comprising the same
WO2019196955A1 (en) * 2018-04-13 2019-10-17 中国医学科学院药物研究所 Hydrophilic berberine derivative with r10 and r11 connected and application thereof in preparation of drugs

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101161652A (en) * 2006-10-14 2008-04-16 黄振华 Quinolizine derivatives having antibacterial activity

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101161652A (en) * 2006-10-14 2008-04-16 黄振华 Quinolizine derivatives having antibacterial activity

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Arthritis and Rheumatism. 63 (2011) 1843-1852.
Biochem. Pharm. 72 (2006) 1597-1604;
Handout on Health: Rheumatoid Arthritis. National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, April 2013;
J. Immunol. 165 (2000) 4884-4894;
Nucleic Acids Res. 33 (2005) 3845-3854;

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190086920A (en) 2018-01-15 2019-07-24 연세대학교 산학협력단 novel compound having Ras degrading activity and composition for preventing or treating cancer comprising the same
WO2019196955A1 (en) * 2018-04-13 2019-10-17 中国医学科学院药物研究所 Hydrophilic berberine derivative with r10 and r11 connected and application thereof in preparation of drugs
CN110372690A (en) * 2018-04-13 2019-10-25 中国医学科学院药物研究所 R10With R11The hydrophily berberine type derivative of connection and its application for preparing drug
CN110372689A (en) * 2018-04-13 2019-10-25 中国医学科学院药物研究所 R9With R10The hydrophily berberine type derivative of connection and its application for preparing drug

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