KR20150066859A - One-step real-time rt-pcr method using probe and primer sets for detection of evola and marburg viruses - Google Patents

One-step real-time rt-pcr method using probe and primer sets for detection of evola and marburg viruses Download PDF

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Abstract

The present invention relates to one step real-time reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) method using probes and primer sets for detecting evola and Marburg virus and, more specifically, to a probe and a primer set, which specifically amplify RNA base sequences expressing each N protein and a method for detecting and screening 7 types of Filoviridae including 5 types evola virus and 2 types Marburg virus in clinical materials with use of the primer set and the probe by performing one step real-time RT-PCR, wherein the method can accurately screen and detect whether evola virus and Marburg virus exist in the clinical material quickly with use of a result obtained from the one-step real-time RT PCR using the probe and the primer set compared with an existing method.

Description

에볼라 및 마버그 바이러스 검출용 프로브 및 프라이머 세트를 이용한 원 스텝 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응 방법{One―step Real―Time RT-PCR method using probe and primer sets for detection of evola and marburg viruses}[0001] The present invention relates to a one-step real-time RT-PCR method using probes and primer sets for detection of Ebola and Marburg viruses,

본 발명은 에볼라 및 마버그 바이러스 검출용 프로브 및 프라이머 세트, 이를 포함하는 에볼라 및 마버그 바이러스 검출용 키트, 및 상기 프로브 및 프라이머 세트를 이용한 에볼라 및 마버그 바이러스 검출 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to probes and primer sets for detecting Ebola and Marburg viruses, a kit for detecting Ebola and Marburg viruses containing the same, and a method for detecting Ebola and Marburg viruses using the probes and primer sets.

에볼라 바이러스(Ebola Virus)는 에볼라 출혈열을 일으키는 병원체로 현재 가장 치명적인 바이러스로 알려져 있다. 에볼라바이러스에 의한 출혈열은 1976년에 수단과 자이르(현재의 콩고민주공화국)에서 거의 동시에 발병되면서 처음으로 알려졌으며, 사람과 유인원에 감염시 출혈을 동반한 심한 임상증상을 유발하며 치사율(25-90%)이 매우 높은 급성의 열성 전염병이다. 현재 상용화된 백신이나 치료제는 없는 실정이다. The Ebola Virus is a pathogen that causes Ebola hemorrhagic fever and is now known as the most deadly virus. The first case of hemorrhagic fever caused by Ebola virus was first reported in 1976 in Sudan and Zaire (now the Democratic Republic of the Congo) at the same time, causing severe clinical symptoms with hemorrhagic infections in humans and apes, with a mortality rate of 25-90 %) Is a highly acute febrile epidemic. There are no commercially available vaccines or remedies.

에볼라 바이러스는 필로바이러스(Filoviridae)과에 속하는 바이러스로 현재까지 Tai Forest ebolavirus(이전 분류명; Cote d'Ivoire ebolavirus), Reston ebolavirus, Sudan ebolavirus, Zaire ebolavirus, Bundibugyo ebolavirus의 5가지 species로 구분되며 이 중 Reston ebolavirus를 제외한 4가지 바이러스가 사람에게 치명적인 것으로 밝혀져 있다. Ebola virus is a virus belonging to Filoviridae and is divided into five species, namely Tai Forest ebolavirus (formerly named Cote d'Ivoire ebolavirus), Reston ebolavirus, Sudan ebolavirus, Zaire ebolavirus and Bundibugyo ebolavirus. Except for ebolavirus, four viruses have been found to be fatal to humans.

에볼라 바이러스는 주로 바이러스에 감염된 사람의 혈액 또는 분비물의 직접적인 접촉이나 바이러스를 포함한 분비물에 오염되어 있는 기구를 통한 간접적인 접촉으로 인해 전파되므로 병원내 감염이 흔히 발생한다. 최근에는 에볼라 바이러스가 직접적인 접촉 없이도 다른 종간에 공기를 통해 전염될 수 있는 것으로 보고되고 있다. Ebola viruses are transmitted mainly by direct contact of the blood or secretion of a person infected with the virus or by indirect contact through a device contaminated with secretions including viruses, so infection in the hospital is common. Recently it has been reported that Ebola virus can be transmitted through air to other species without direct contact.

에볼라 바이러스는 뉴클레오캡시드에는 바이러스 RNA가 NP, VP35, VP30과 L을 포함하고 있으며, 뉴클레오캡시드는 지름이 약 40-50 nm이며 중앙에 지름 20-30 nm의 채널을 가지고 있고, 바이러스성 당단백질 돌기는 10 nm 정도의 길이로, 10 nm의 간격을 두고 외피에 돋아 있다. 외피와 뉴클레오캡시드 사이의 공간에는 바이러스성 단백질 VP40과 VP24가 있다(도 1).
Ebola viruses contain nucleosides with NP, VP35, VP30 and L, and nucleocapsids with a diameter of about 40-50 nm, channels with a diameter of 20-30 nm in the center, Protein protrusions are about 10 nm in length and sprout in the outer skin at intervals of 10 nm. There is viral protein VP40 and VP24 in the space between the envelope and the nucleocapsid (Figure 1).

마버그 바이러스(Marburg Virus)는 마버그 출혈열을 일으키는 병원체로 치명적인 바이러스로 알려져 있다. 마버그 출혈열은 치사율(약 25%)이 매우 높은 감염병으로 현재까지 치료법은 알려져 있지 않다. 이 질환은 1967년 독일 마버그 대학의 연구원이 아프리카 녹색원숭이의 신장세포를 사용하여 백신용 약독 폴리오바이러스를 배양하던 중 감염되어 사망함으로써 처음 발견되었고, 도시이름인 '마르부르크'에서 이름을 따 왔으며, 당시 환자 31명 중 7명이 사망하였다.The Marburg virus is known to be a deadly pathogenic virus causing hemorrhagic fever. Marburg hemorrhagic fever is a very high mortality rate (about 25%). The disease was first discovered in 1967 when a researcher at Marburg University in Germany was infected and died while cultivating a vaccine poliovirus using a kidney cell of African green monkey, named after the city name "Marburg" Seven of the patients died at the time.

마버그 바이러스는 필로바이러스(Filoviridae) 과에 속하는 바이러스로 하나의 종(Marburg marburgvirus)가 있으며 두 가지 바이러스(Marburg virus 및 Ravn virus)가 속해 있다. Musoke, Ratayczak, Popp, Voege, Ozolin, Marburg Ravn, Angola 등이 분리된 변형(strain)으로 보고되고 있다.The Marburg virus is a virus belonging to the family Filoviridae and has one species (Marburg marburgvirus) and two viruses (Marburg virus and Ravn virus). Muske, Ratayczak, Popp, Voege, Ozolin, Marburg Ravn, and Angola are reported as separate strains.

마버그 바이러스는 주로 환자의 혈액, 구토물, 분비물, 장기, 정액 등 체액을 통해 전파되고, 오염된 주사기와 침 등에 의해 감염된 환자는 모두 사망하였다. The Marburg virus mainly spreads through body fluids such as blood, vomit, saliva, secretion, organs and semen, and all patients infected by contaminated syringes and saliva have died.

마버그 바이러스는 80 nm*800 ~ 1,000 nm의 크기로 외피를 지니고 있는 단일가닥의 (-)RNA 바이러스이며, 게놈 크기는 약 19 kb이며 7개 유전자로 구성되어 있다(도 2).
Marburg virus is a single-stranded (-) RNA virus with a coat of 80 nm * 800-1,000 nm in size, and has a genome size of about 19 kb and consists of seven genes (Figure 2).

본 발명자들은 검체 내 에볼라 및 마버그 바이러스의 존재 유무를 보다 더 신속하고 정확하게 감별 및 검출할 수 있는 방법을 개발하기 위해 예의노력한 결과, 현재까지 알려진 5종류의 에볼라 바이러스 및 2종류의 마버그 바이러스 각각의 N 단백을 발현하는 RNA 염기서열을 특이적으로 증폭하기 위한 7종류의 프로브(Probe) 및 프라이머(primer) 세트를 제작하고, 상기 7종류의 프로브(Probe) 및 프라이머(primer) 세트를 이용한 원 스텝 실시간(One-step Real-Time) RT-PCR 방법을 수행함으로써, 7종류의 에볼라 및 마버그 바이러스를 특이적으로 감별 및 검출할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
The present inventors have made intensive efforts to develop a method capable of discriminating and detecting the presence or absence of Ebola and Marburg virus in a sample more rapidly and accurately. As a result, it has been found that 5 kinds of Ebola viruses and 2 kinds of Marburg viruses 7 kinds of probes and primer sets for specifically amplifying the RNA base sequences expressing the N proteins of the N protein were prepared and the primers set using the 7 kinds of probes and the primer set The present invention has been accomplished by confirming that seven types of Ebola and Marburg viruses can be specifically discriminated and detected by performing a one-step real-time RT-PCR method.

본 발명의 목적은 에볼라 및 마버그 바이러스의 N 단백을 발현하는 RNA 염기서열을 특이적으로 증폭하기 위한 새롭고 특이성이 높은 프로브(Probe) 및 프라이머(primer) 세트를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a novel and highly specific probe and a set of primers for specifically amplifying an RNA base sequence expressing the N protein of Ebola and Marburg virus.

본 발명의 다른 목적은 상기 프로브(Probe) 및 프라이머(primer) 세트를 포함하는 7종류의 에볼라 및 마버그 바이러스를 특이적으로 감별 및 검출하는 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit for specifically discriminating and detecting seven kinds of Ebola and Marburg virus including the above probe and a set of primers.

본 발명의 또다른 목적은 상기 프로브(Probe) 및 프라이머(primer) 세트를 이용한 원 스텝 실시간(One-step Real-Time) RT-PCR을 수행하여 검체 내 7종류의 에볼라 및 마버그 바이러스를 특이적으로 감별 및 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
It is still another object of the present invention to provide a method for detecting one or more of Ebola and Marburg viruses in a sample by performing one step real-time RT-PCR using a probe and a primer set, And to provide a method for discriminating and detecting it.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 In order to achieve the above object,

에볼라(evola) 또는 마버그(marburg) 바이러스의 검출 또는 감별을 위한,For the detection or differentiation of evola or marburg viruses,

서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 3의 프로브;A primer set consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 1 and the reverse primer of SEQ ID NO: 2, and the probe of SEQ ID NO: 3;

서열번호 4의 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 6의 프로브;A primer set consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 4 and the reverse primer of SEQ ID NO: 5, and the probe of SEQ ID NO: 6;

서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 9의 프로브;A primer set consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 7 and the reverse primer of SEQ ID NO: 8, and the probe of SEQ ID NO: 9;

서열번호 10의 정방향 프라이머 및 서열번호 11의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 12의 프로브;A primer set consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 10 and a reverse primer of SEQ ID NO: 11, and a probe of SEQ ID NO: 12;

서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 15의 프로브;A primer set consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 13 and the reverse primer of SEQ ID NO: 14, and the probe of SEQ ID NO: 15;

서열번호 16의 정방향 프라이머 및 서열번호 17의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 18의 프로브; 및A primer set consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 16 and a reverse primer of SEQ ID NO: 17, and a probe of SEQ ID NO: 18; And

서열번호 19의 정방향 프라이머 및 서열번호 20의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 21의 프로브;A primer set consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 19 and a reverse primer of SEQ ID NO: 20, and a probe of SEQ ID NO: 21;

로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 및 프로브 세트를 제공한다.≪ / RTI > and a set of probes.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 에볼라 또는 마버그 바이러스의 검출 또는 감별용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for detecting or differentiating ebola or Marburg virus comprising the primer and the probe set according to the present invention.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 에볼라 또는 마버그 바이러스의 검출 또는 감별용 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for detecting or differentiating ebola or Marburg virus comprising the primer and the probe set according to the present invention.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 세트를 사용하여 원 스텝 실시간(One-step realtime) RT-PCR 수행하는 단계를 포함하는, 검체 내 에볼라 또는 마버그 바이러스의 검출 또는 감별 방법을 제공한다.The present invention further provides a method for detecting or discriminating ebola or Marburg virus in a sample, which comprises performing one-step real-time RT-PCR using the primer and probe set according to the present invention do.

아울러, 본 발명은 피검 개체로부터 분리된 시료로부터 상기 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 세트를 사용하여 원 스텝 실시간(One-step realtime) RT-PCR 수행하는 단계를 포함하는, 상기 개체의 에볼라 또는 마버그 바이러스의 감염 여부를 확인하는 방법을 제공한다.
In addition, the present invention relates to a method for detecting the presence or absence of Ebola or Marburg of the subject, comprising the step of performing one-step real-time RT-PCR using a primer and a probe set according to the present invention, Provides a way to determine if a virus is infected.

본 발명에 따르면, 5종류의 에볼라 바이러스 및 2종류의 마버그 바이러스 각각에 대해 총 7종류의 프로브 및 프라이머 세트를 이용하여 원 스텝 실시간(One-step realtime) RT-PCR을 수행함으로써, 검체 내 에볼라 및 마버그 바이러스의 존재 유무를 기존의 RT-PCR를 사용하는 검출 방법에 비해 더 신속하고 정확하게 감별 또는 검출할 수 있다. According to the present invention, by performing one-step real-time RT-PCR using seven types of probes and primer sets for each of five kinds of Ebola viruses and two kinds of Marburg viruses, And the presence or absence of Marburg virus can be discriminated or detected more quickly and accurately than the detection method using conventional RT-PCR.

특히, 본 발명의 프라이머 및 프로브를 사용하는 경우, 에볼라 및 마버그 바이러스의 종(strain)에 대한 특이성이 높아서 동시에 진행이 가능하므로 미지의 시료가 어떤 에볼라 및 마버그 바이러스인지 감별 및 검출이 가능하다. Particularly, when the primers and probes of the present invention are used, the specificity of the strain of Ebola and Marburg virus is high and can proceed at the same time, so that it is possible to identify and detect any Ebola and Marburg viruses as unknown samples .

또한, 일반적으로 원 스텝 실시간 RT-PCR에 사용되는 RNA 농도는 50 ~ 100 ng으로 사용하는데 비해, 본 발명의 프라이머 및 프로브를 사용할 경우, 민감도가 5 펨토 그램(femto gram)에서도 수행 가능하기 때문에, 적은 양의 혈청에서 나오는 미량의 RNA에서도 바이러스 검출이 가능하다.
In addition, since the RNA concentration used in the one-step real-time RT-PCR is generally 50-100 ng, when the primer and the probe of the present invention are used, sensitivity can be performed even at 5 femtograms, Viruses can also be detected in trace amounts of RNA from a small amount of serum.

도 1은 에볼라 바이러스의 게놈 구조(genome structure)를 보여주는 그림이다.
도 2는 마버그 바이러스의 게놈 구조(genome structure)를 보여주는 그림이다.
도 3은 7종류의 필로바이러스(5종류의 에볼라 바이러스 및 2종류의 마버그 바이러스)에 대하여 실시간 RT-PCR의 특이성 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 7종류의 필로바이러스(5종류의 에볼라 바이러스 및 2종류의 마버그 바이러스)에 대하여 실시간 RT-PCR의 민감성 분석 결과를 나타내는 그래프이다.Figure 1 is a diagram showing the genome structure of Ebola virus.
Fig. 2 is a diagram showing the genome structure of Marburg virus.
FIG. 3 is a graph showing the results of analysis of specificity of real-time RT-PCR for seven kinds of piloviruses (five kinds of Ebola viruses and two kinds of Marburg viruses).
FIG. 4 is a graph showing the results of the sensitivity analysis of real-time RT-PCR for seven kinds of piloviruses (five kinds of Ebola viruses and two kinds of Marburg viruses).

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 The present invention

에볼라(evola) 또는 마버그(marburg) 바이러스의 검출 또는 감별을 위한,For the detection or differentiation of evola or marburg viruses,

서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 3의 프로브;A primer set consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 1 and the reverse primer of SEQ ID NO: 2, and the probe of SEQ ID NO: 3;

서열번호 4의 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 6의 프로브;A primer set consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 4 and the reverse primer of SEQ ID NO: 5, and the probe of SEQ ID NO: 6;

서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 9의 프로브;A primer set consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 7 and the reverse primer of SEQ ID NO: 8, and the probe of SEQ ID NO: 9;

서열번호 10의 정방향 프라이머 및 서열번호 11의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 12의 프로브;A primer set consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 10 and a reverse primer of SEQ ID NO: 11, and a probe of SEQ ID NO: 12;

서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 15의 프로브;A primer set consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 13 and the reverse primer of SEQ ID NO: 14, and the probe of SEQ ID NO: 15;

서열번호 16의 정방향 프라이머 및 서열번호 17의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 18의 프로브; 및A primer set consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 16 and a reverse primer of SEQ ID NO: 17, and a probe of SEQ ID NO: 18; And

서열번호 19의 정방향 프라이머 및 서열번호 20의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 21의 프로브;A primer set consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 19 and a reverse primer of SEQ ID NO: 20, and a probe of SEQ ID NO: 21;

로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 및 프로브 세트를 제공한다.≪ / RTI > and a set of probes.

상기 에볼라 바이러스는 분디부교 에볼라바이러스(Bundibugyo ebolavirus), 레스톤 에볼라바이러스(Reston ebolavirus), 수단 에볼라 바이러스(Sudan ebolavirus), 타이 포레스트 에볼라바이러스(Tai Forest ebolavirus) 및 자이르 에볼라바이러스(Zaire ebolavirus)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 한 종일 수 있으며, 상기 마버그 바이러스는 마버그 바이러스(Marbug virus) 또는 라븐 바이러스(Ravn virus) 중 어느 한 종일 수 있다.The Ebola virus is composed of Bundibugyo ebolavirus, Reston ebolavirus, Sudan ebolavirus, Tai Forest ebolavirus, and Zaire ebolavirus. , And the Marburg virus may be any one of Marbug virus or Ravn virus.

본 발명에 따른 7종류의 프라이머 및 프로브는 5종류의 에볼라 및 2종류의 마버그 바이러스의 종(strain) 각각에 대해 우수한 특이성 및 민감성을 가지고 있으므로, 신속하고 정확하게 감별 또는 검출할 수 있을 뿐만 아니라 동시에 진행이 가능하므로, 미지의 시료 내에 에볼라 및 마버그 바이러스가 존재하는지 검출이 가능하며, 또한 해당 바이러스가 어떤 에볼라 및 마버그 바이러스인지 감별이 가능하다.
The seven types of primers and probes according to the present invention have excellent specificity and sensitivity to each of the five kinds of Ebola and two kinds of Marburg virus strains so that they can not only quickly or accurately discriminate or detect, It is possible to detect the presence of Ebola and Marburg virus in an unknown sample, and it is also possible to discriminate which Ebola and Marburg virus is the virus.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 에볼라 또는 마버그 바이러스의 검출 또는 감별용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for detecting or differentiating ebola or Marburg virus comprising the primer and the probe set according to the present invention.

상기 에볼라 바이러스는 분디부교 에볼라바이러스(Bundibugyo ebolavirus), 레스톤 에볼라바이러스(Reston ebolavirus), 수단 에볼라 바이러스(Sudan ebolavirus), 타이 포레스트 에볼라바이러스(Tai Forest ebolavirus) 및 자이르 에볼라바이러스(Zaire ebolavirus)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 한 종일 수 있으며, 상기 마버그 바이러스는 마버그 바이러스(Marbug virus) 또는 라븐 바이러스(Ravn virus) 중 어느 한 종일 수 있다.The Ebola virus is composed of Bundibugyo ebolavirus, Reston ebolavirus, Sudan ebolavirus, Tai Forest ebolavirus, and Zaire ebolavirus. , And the Marburg virus may be any one of Marbug virus or Ravn virus.

상기 조성물의 전체 100 중량부에 대해 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 세트를 0.1 내지 10 중량부 포함할 수 있다.0.1 to 10 parts by weight of the primer and the probe set according to the present invention may be added to 100 parts by weight of the whole composition.

상기 조성물은 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 세트 외에 RT-PCR 조성물로서 사용하기 위한 완충용액, 효소 혼합물 또는 증류수 등을 더 포함할 수 있다.
The composition may further comprise, in addition to the primer and the probe set according to the present invention, a buffer solution, an enzyme mixture or distilled water for use as an RT-PCR composition.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 에볼라 또는 마버그 바이러스의 검출 또는 감별용 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for detecting or differentiating ebola or Marburg virus comprising the primer and the probe set according to the present invention.

상기 에볼라 바이러스는 분디부교 에볼라바이러스(Bundibugyo ebolavirus), 레스톤 에볼라바이러스(Reston ebolavirus), 수단 에볼라 바이러스(Sudan ebolavirus), 타이 포레스트 에볼라바이러스(Tai Forest ebolavirus) 및 자이르 에볼라바이러스(Zaire ebolavirus)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 한 종일 수 있으며, 상기 마버그 바이러스는 마버그 바이러스(Marbug virus) 또는 라븐 바이러스(Ravn virus) 중 어느 한 종일 수 있다.The Ebola virus is composed of Bundibugyo ebolavirus, Reston ebolavirus, Sudan ebolavirus, Tai Forest ebolavirus, and Zaire ebolavirus. , And the Marburg virus may be any one of Marbug virus or Ravn virus.

상기 키트는 프라이머 및 프로브 세트 외에 분리 시약, 증폭 시약 또는 검출 시약으로 사용가능한 물질들을 한 이상 더 포함할 수 있다.The kit may further comprise at least one substance usable as a separation reagent, an amplification reagent or a detection reagent in addition to the primer and the probe set.

상기 분리 시약으로는 생물학적 샘플로부터 에볼라 또는 마버그 바이러스의 RNA 분자를 분리하기 위한 시약이고, 증폭 시약은 표적 분자의 증폭을 위한 시약으로서 프라이머 및 프로브 세트 외에 RT-PCR 조성물로서 사용하기 위한 완충용액, 중합효소 또는 증류수 등을 포함하며, 검출 시약은 표적 분자의 검출을 위한 시약으로서 염료 또는 형광물질 등을 포함한다.
The separation reagent is a reagent for separating RNA molecules of Ebola or Marburg virus from a biological sample. The amplification reagent may be a buffer for use as an RT-PCR composition in addition to a primer and a probe set as a reagent for amplification of a target molecule, Polymerase or distilled water, and the detection reagent includes a dye or a fluorescent substance as a reagent for detection of a target molecule.

또한, 본 발명은 시험관내(In Vitro)에서 검체 시료로부터 상기 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 세트를 사용하여 원 스텝 실시간(One-step realtime) RT-PCR 수행하는 단계를 포함하는, 시험관내(In Vitro)에서 검체 시료 내 에볼라 또는 마버그 바이러스의 검출 또는 감별 방법을 제공한다.In addition, the present invention relates to a method for detecting the presence or absence of In (1-step real time) RT-PCR using a primer and a probe set according to the present invention from a test sample in vitro Vitro) provides a method for detecting or discriminating ebola or Marburg virus in a sample.

상기 에볼라 바이러스는 분디부교 에볼라바이러스(Bundibugyo ebolavirus), 레스톤 에볼라바이러스(Reston ebolavirus), 수단 에볼라 바이러스(Sudan ebolavirus), 타이 포레스트 에볼라바이러스(Tai Forest ebolavirus) 및 자이르 에볼라바이러스(Zaire ebolavirus)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 한 종일 수 있으며, 상기 마버그 바이러스는 마버그 바이러스(Marbug virus) 또는 라븐 바이러스(Ravn virus) 중 어느 한 종일 수 있다.The Ebola virus is composed of Bundibugyo ebolavirus, Reston ebolavirus, Sudan ebolavirus, Tai Forest ebolavirus, and Zaire ebolavirus. , And the Marburg virus may be any one of Marbug virus or Ravn virus.

상기 검체 시료는 생물학적 시료로서 혈액, 혈청, 혈장, 말초혈 단핵세포, 말초혈 백혈구, 타액, 소변, 분변, 인두 면봉 스와브(throat swabs), 피부 상처 스와브(dermal lesion swabs), 뇌척수액(cerebrospinal fluids), 경부 도말 표본(cervical smears), 농즙 샘플, 식품 기질(food matrices), 및 뇌, 비장 및 간을 포함하는 신체의 다양한 부분의 조직을 포함할 수 있다.
The sample of the sample may be a blood sample, serum, plasma, peripheral blood mononuclear cells, peripheral blood leukocytes, saliva, urine, feces, throat swabs, dermal lesion swabs, cerebrospinal fluid fluids, cervical smears, nectar samples, food matrices, and tissues of various parts of the body including the brain, spleen and liver.

아울러, 본 발명은 피검 개체로부터 분리된 시료로부터 상기 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 세트를 사용하여 원 스텝 실시간(One-step realtime) RT-PCR 수행하는 단계를 포함하는, 상기 개체의 에볼라 또는 마버그 바이러스의 감염 여부를 확인하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention relates to a method for detecting the presence or absence of Ebola or Marburg of the subject, comprising the step of performing one-step real-time RT-PCR using a primer and a probe set according to the present invention, Provides a way to determine if a virus is infected.

상기 에볼라 바이러스는 분디부교 에볼라바이러스(Bundibugyo ebolavirus), 레스톤 에볼라바이러스(Reston ebolavirus), 수단 에볼라 바이러스(Sudan ebolavirus), 타이 포레스트 에볼라바이러스(Tai Forest ebolavirus) 및 자이르 에볼라바이러스(Zaire ebolavirus)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 한 종일 수 있으며, 상기 마버그 바이러스는 마버그 바이러스(Marbug virus) 또는 라븐 바이러스(Ravn virus) 중 어느 한 종일 수 있다.The Ebola virus is composed of Bundibugyo ebolavirus, Reston ebolavirus, Sudan ebolavirus, Tai Forest ebolavirus, and Zaire ebolavirus. , And the Marburg virus may be any one of Marbug virus or Ravn virus.

상기 개체는 인간 뿐만 아니라, 원숭이, 침팬지 및 고릴라 등을 포함하는 유인원, 돼지, 소, 말, 개, 고양이 및 토끼 등의 포유류, 마우스, 랫트, 햄스터 및 기니아피그 등의 설치류, 또는 닭, 오리, 비둘기 및 앵무새 등의 조류, 및 다양한 어류를 모두 포함할 수 있다.The object is not only a human but also a rodent such as an ape including a monkey, a chimpanzee and a gorilla, a mammal such as a pig, a cow, a horse, a dog, a cat and a rabbit, a rodent such as a mouse, a rat, a hamster and a guinea pig, Birds such as pigeons and parrots, and various fishes.

상기 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 세포 또는 조직을 포함하는 개체의 다양한 부분을 포함할 수 있다.
The sample may comprise various parts of an individual, including blood, serum, plasma, cells or tissue.

이하에서는 본 발명의 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples of the present invention.

다만, 하기 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 제한되는 것은 아니다.
However, the following examples are intended to assist the understanding of the present invention, and the scope of the present invention is not limited to the following examples.

<< 실시예Example 1>  1> 프라이머primer 및  And 프로브Probe 제작 making

7종류의 필로바이러스(Filoviridae)(5종류의 에볼라 바이러스 및 2종류의 마버그 바이러스)의 NP 유전자 염기서열을 GenBank로부터 다운로드(download) 받았다(표 1).NP gene sequences from seven species of Filoviridae (5 Ebola viruses and 2 Marburg viruses) were downloaded from GenBank (Table 1).

7종류의 필로바이러스Seven types of pill virus 속 (Genus)Genus 종 (Species)Species 바이러스 (Virus)Virus 에볼라 바이러스Ebola virus 분디부교 에볼라바이러스(Bundibugyo ebolavirus)Bundyugyo ebola virus (Bundibugyo ebolavirus) 분디부교 바이러스(Bundibugyo virus)Bundibugyo virus 레스톤 에볼라바이러스(Reston ebolavirus)Reston ebolavirus (Reston ebolavirus) 레스톤 바이러스(Reston virus)Reston virus 수단 에볼라 바이러스(Sudan ebolavirus)Sudan ebolavirus 수단 바이러스(Sudan virus)Sudan virus 타이 포레스트 에볼라바이러스(Tai Forest ebolavirus)Tai Forest ebolavirus (Tai Forest ebolavirus) 타이 포레스트(Tai Forest virus)Tai Forest virus 자이르 에볼라바이러스(Zaire ebolavirus)Zaire ebolavirus (Zaire ebolavirus) 에볼라 바이러스(Ebola virus)Ebola virus 마버그 바이러스Marburg virus 마버그 마버그바이러스(Marbug marburgvirus)Marbug marburgvirus (Marbug marburgvirus) 마버그 바이러스(Marbug virus)Marbug virus 라븐 바이러스(Ravn virus)Ravn virus

각 서열(sequence)을 Lasergene program(DNASTAR)의 Clustal W 방법을 이용하여 얼라인(align) 수행하였다. primer express software(Applied Biosystem)을 이용하여 각 바이러스 주에 대한 가장 특이적인 염기서열을 선택하였다. 프라이머 및 프로브의 합성을 인비트로젠에 의뢰하였다(Invitrogen, USA)(표 2). 모든 프로브의 리포터 염료(reporter dye)는 FAM(6-carboxy-fluorescein) 사용하였다.Each sequence was aligned using the Clustal W method of Lasergene program (DNASTAR). The most specific base sequences for each virus strain were selected using primer express software (Applied Biosystem). Synthesis of primers and probes was commissioned to Invitrogen (Invitrogen, USA) (Table 2). The reporter dye of all probes was FAM (6-carboxy-fluorescein).

본 발명에 사용된 프라이머들 및 프로브들The primers and probes used in the present invention 바이러스virus 프라이머primer 서열(5'-> 3')Sequences (5 '-> 3') 위치location 농도(uM)Concentration (uM) 크기(bp)Size (bp) 분디부교Buddy bridge 정방향(Forward)Forward GCAGAAATATGCTGAATCTCGTGAAC (서열번호: 1)GCAGAAATATGCTGAATCTCGTGAAC (SEQ ID NO: 1) 1062-10871062-1087 1818 108108 역방향(Reverse)Reverse AAAAGAATGAGATCAGCTTCCAGC (서열번호: 2)AAAAGAATGAGATCAGCTTCCAGC (SEQ ID NO: 2) 1145-11691145-1169 1818 프로브(F)The probe (F) ATGATCAGGAAAAGAAAATC (서열번호: 3)ATGATCAGGAAAAGAAAATC (SEQ ID NO: 3) 1106-11251106-1125 55 레스톤Reston 정방향Forward CCAACAATATGCTGAGTCCAGAGAA (서열번호: 4)CCAACAATATGCTGAGTCCAGAGAA (SEQ ID NO: 4) 1062-10861062-1086 1818 111111 역방향Reverse AAGAAAAACGAAATTAGTTTCCAGCAGAC (서열번호: 5)AAGAAAAACGAAATTAGTTTCCAGCAGAC (SEQ ID NO: 5) 1144-11721144-1172 1818 프로브(F)The probe (F) ACGATCAGGAAAGAAGAATA (서열번호: 6)ACGATCAGGAAAGAAGAATA (SEQ ID NO: 6) 1106-11251106-1125 55 수단Way 정방향Forward ACACGTGAGTTGGACAACCTT (서열번호: 7)ACACGTGAGTTGGACAACCTT (SEQ ID NO: 7) 1078-10881078-1088 1818 6666 역방향Reverse AAGATTCTCATGAGCTTCCACCAG (서열번호: 8)AAGATTCTCATGAGCTTCCACCAG (SEQ ID NO: 8) 1120-11431120-1143 1818 프로브(R)The probe (R) GGGCTTGATGAACAGG (서열번호: 9)GGGCTTGATGAACAGG (SEQ ID NO: 9) 1099-11141099-1114 55 타이 포레스트Thai Forest 정방향Forward AATCTCGCGAGCTTGACCAT (서열번호: 10)AATCTCGCGAGCTTGACCAT (SEQ ID NO: 10) 1076-10951076-1095 1818 9292 역방향Reverse TCAGAAGAAAAATGAAATCAGCTTCCAG (서열번호: 11)TCAGAAGAAAAATGAAATCAGCTTCCAG (SEQ ID NO: 11) 1140-11671140-1167 1818 프로브(F)The probe (F) CTCGATGATCAAGAGAAGAA (서열번호: 12)CTCGATGATCAAGAGAAGAA (SEQ ID NO: 12) 1102-11211102-1121 55 에볼라Ebola 정방향Forward CGAACTTGACCATCTTGGACTTG (서열번호: 13)CGAACTTGACCATCTTGGACTTG (SEQ ID NO: 13) 1083-11051083-1105 1818 8686 역방향Reverse AAAAGAACGAAATCAGCTTCCAGC (서열번호: 14)AAAAGAACGAAATCAGCTTCCAGC (SEQ ID NO: 14) 1145-11681145-1168 1818 프로브(F)The probe (F) ATGATCAGGAAAAGAAAATT (서열번호: 15)ATGATCAGGAAAAGAAAATT (SEQ ID NO: 15) 1106-11251106-1125 55 마버그Marburg 정방향Forward AGGCGACATGAACATCAGGAAATT (서열번호: 16)AGGCGACATGAACATCAGGAAATT (SEQ ID NO: 16) 1012-10351012-1035 1818 8989 역방향Reverse TTAGAACAATTCCACCTTCAGAAAACTGA (서열번호: 17)TTAGAACAATTCCACCTTCAGAAAACTGA (SEQ ID NO: 17) 1072-11001072-1100 1818 프로브(R)The probe (R) AGCTATTGCCGAGGAT (서열번호: 18)AGCTATTGCCGAGGAT (SEQ ID NO: 18) 1038-10531038-1053 55 라븐Raven 정방향Forward GCGACATGAACACCAGGAAATTC (서열번호: 19)GCGACATGAACACCAGGAAATTC (SEQ ID NO: 19) 1014-10361014-1036 1818 8585 역방향Reverse TTAGAACAGTTCCATCTCCAGAAGACT (서열번호: 20)TTAGAACAGTTCCATCTCCAGAAGACT (SEQ ID NO: 20) 1072-10981072-1098 1818 프로브(R)The probe (R) GGCCATCGCCGAGG (서열번호: 21)GGCCATCGCCGAGG (SEQ ID NO: 21) 1038-10511038-1051 55

본 발명의 사용된 대조군(control)은 다음과 같이 제작하였다. 우선, 상기 7종류의 바이러스 주에 대한 NP 유전자 확보하였다. 이때, 6가지 바이러스의 NP 유전자는 합성을 의뢰하였고, 자이르 에볼라 바이러스(Zaire ebola virus)의 NP 유전자가 포함되어 있는 클론은 미국 NIH로부터 분양받았다. 상기 각 NP 유전자를 T7 프로모터가 있는 벡터에 클로닝하였다. 클로닝된 플라스미드(plasmid)에서 3' 말단 부위를 적당한 제한효소로 절단하였다. 3' 말단 부위가 절단된 DNA를 mMESSAGE mMACHINE® T7 Kit (Ambion)를 이용하여 시험관내 전사(in vitro transcription)를 수행하였다. 합성된 RNA를 정제 후 정량하여 사용하였다.
The control used in the present invention was prepared as follows. First, NP genes were obtained for the seven virus strains. At this time, the NP gene of six viruses was commissioned for synthesis, and the clone containing the NP gene of Zaire ebola virus was distributed from the NIH. Each NP gene was cloned into a vector having the T7 promoter. The 3 ' end of the cloned plasmid was digested with appropriate restriction enzymes. In vitro transcription was performed using mMESSAGE mMACHINE® T7 Kit (Ambion) at the 3'-terminal truncated DNA. The synthesized RNA was purified and then quantitatively used.

<< 실시예Example 2> 원 스텝 실시간( 2> One step real time ( OneOne -- stepstep realtimerealtime ) ) RTRT -- PCRPCR 세트의 구성 Composition of the set

원 스텝 실시간(One-step realtime) RT-PCR은 7종류의 필로바이러스(5종류의 에볼라 바이러스 및 2종류의 마버그 바이러스)에 대하여 각각의 바이러스를 특이적으로 감별 검출할 수 있는 방법으로, AgPath-ID One-Step RT-PCR Kit를 사용하였고 (Ambion), 기기는 Step One Plus (Applied Biosystems) 사용하였다. 원 스텝 실시간 RT-PCR을 위한 조성 및 조건은 다음과 같이 수행하였다(표 3 및 표 4).One-step realtime RT-PCR is a method that can specifically detect and detect each virus against 7 types of Pirovirus (5 types of Ebola virus and 2 kinds of Marburg virus). AgPath -ID One-Step RT-PCR Kit (Ambion) was used and the instrument was a Step One Plus (Applied Biosystems). The composition and conditions for one-step real-time RT-PCR were as follows (Table 3 and Table 4).

원 스텝 실시간 RT-PCR을 위한 조성물Composition for one-step real-time RT-PCR 2X RT-PCR buffer2X RT-PCR buffer 12.5 ul12.5 μl 25X RT-PCR enzyme mix25X RT-PCR enzyme mix 1 ul1 μl Primer (400 nM)/ Probe (120 nM)Primer (400 nM) / Probe (120 nM) 1 ul1 μl RNA (50 ng~)RNA (50 ng) 1 ul1 μl D.WD.W 9.5 ul9.5 μl TotalTotal 25 ul25 μl

원 스텝 실시간 RT-PCR을 위한 열순환(Thermocycling) 조건Thermocycling conditions for one-step real-time RT-PCR 온도Temperature 시간time 순환 (Cycle)Cycle 45 ℃45 ° C 10 min10 min 1One 95 ℃95 ℃ 10 min10 min 1One 95 ℃95 ℃ 15 sec15 sec 4040 60 ℃60 ° C 45 sec45 sec

<< 실시예Example 3> 원 스텝 실시간  3> One step real time RTRT -- PCRPCR 반응 결과  Reaction result

<3-1> <3-1> 프라이머primer 및  And 프로브의Of the probe 특이성 확인 Identification of specificity

7종류의 필로바이러스(5종류의 에볼라 바이러스 및 2종류의 마버그 바이러스) 각각의 유전자에 다른 프라이머 및 프로브가 작용하는지 알아보기 위해, 1종류의 유전자에 7종류의 프라이머 및 프로브 세트를 모두 넣고 비특이적인 반응이 일어나는지 확인하였다.To investigate whether different primers and probes act on each gene of seven kinds of piloviruses (five kinds of Ebola viruses and two kinds of Marburg viruses), seven types of primers and probe sets were put into one type of gene and non-specific Phosphorylation reaction.

실험 결과, 각각의 유전자에 해당하는 프라이머 및 프로브 세트만 특이적으로 작용하여 하나의 그래프만이 나타나는 것을 확인하였다(도 3).
As a result of experiments, it was confirmed that only one primer and probe set corresponding to each gene acted specifically and only one graph appeared (FIG. 3).

<3-2> <3-2> 프라이머primer 및  And 프로브의Of the probe 민감도 확인 Sensitivity check

7종류의 필로바이러스(5종류의 에볼라 바이러스 및 2종류의 마버그 바이러스) 각각의 유전자에 대한 각각의 프라이머 및 프로브 세트의 민감도를 알아보기 위해, 7종류의 유전자를 10-1부터 10-7까지 단계적으로 희석하여 각 유전자에 해당하는 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 반응이 일어나는지 확인하였다.To determine the sensitivity of each primer and probe set for each of the seven genes of the seven piloviruses (five Ebola viruses and two types of Marburg virus), seven genes were cloned from 10 -1 to 10 -7 Stepwise dilution was performed and primer and probe sets corresponding to each gene were used to confirm whether the reaction occurred.

실험 결과, 각각의 유전자에 해당하는 프라이머 및 프로브 세트의 민감도는 5 펨토(femto) 그램까지 희석된 유전자를 검출하는 것을 확인하였다(도 4).
As a result of the experiment, it was confirmed that the sensitivity of the primer and the probe set corresponding to each gene was detected as a gene diluted to 5 femto grams (FIG. 4).

본 발명을 통해, 에볼라 및 마버그 바이러스의 동시 검출 또는 감별을 하기 위한 바이오칩 및 키트를 개발하는데 유용하게 사용될 수 있다.
The present invention can be used to develop biochips and kits for simultaneous detection or discrimination of Ebola and Marburg viruses.

<110> Korea Center for Disease Control and Prevention <120> One-step Real-Time RT-PCR method using probe and primer sets for detection of evola and marburg viruses <130> NP13-1190 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Bundibugyo Virus <400> 1 gcagaaatat gctgaatctc gtgaac 26 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Bundibugyo Virus <400> 2 aaaagaatga gatcagcttc cagc 24 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(F) for Bundibugyo Virus <400> 3 atgatcagga aaagaaaatc 20 <110> Korea Center for Disease Control and Prevention <120> One-step Real-Time RT-PCR method using probe and primer sets for          detection of evola and marburg viruses <130> NP13-1190 <160> 3 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Bundibugyo Virus <400> 1 gcagaaatat gctgaatctc gtgaac 26 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Bundibugyo Virus <400> 2 aaaagaatga gatcagcttc cagc 24 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (F) for Bundibugyo Virus <400> 3 atgatcagga aaagaaaatc 20

Claims (13)

서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 3의 프로브;
서열번호 4의 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 6의 프로브;
서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 9의 프로브;
서열번호 10의 정방향 프라이머 및 서열번호 11의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 12의 프로브;
서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 15의 프로브;
서열번호 16의 정방향 프라이머 및 서열번호 17의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 18의 프로브; 및
서열번호 19의 정방향 프라이머 및 서열번호 20의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 21의 프로브;
로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 에볼라(evola) 또는 마버그(marburg) 바이러스의 검출 또는 감별용 조성물.
A primer set consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 1 and the reverse primer of SEQ ID NO: 2, and the probe of SEQ ID NO: 3;
A primer set consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 4 and the reverse primer of SEQ ID NO: 5, and the probe of SEQ ID NO: 6;
A primer set consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 7 and the reverse primer of SEQ ID NO: 8, and the probe of SEQ ID NO: 9;
A primer set consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 10 and a reverse primer of SEQ ID NO: 11, and a probe of SEQ ID NO: 12;
A primer set consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 13 and the reverse primer of SEQ ID NO: 14, and the probe of SEQ ID NO: 15;
A primer set consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 16 and a reverse primer of SEQ ID NO: 17, and a probe of SEQ ID NO: 18; And
A primer set consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 19 and a reverse primer of SEQ ID NO: 20, and a probe of SEQ ID NO: 21;
, And a set of probes comprising at least one primer selected from the group consisting of: &lt; RTI ID = 0.0 &gt; (a) &lt; / RTI &gt;
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 원 스텝 실시간(One-step realtime) RT-PCR에 사용되는 것을 특징으로 하는 에볼라 또는 마버그 바이러스의 검출 또는 감별용 조성물.
2. The composition according to claim 1, wherein the composition is used in one-step real-time RT-PCR.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 에볼라 바이러스는 분디부교 에볼라바이러스(Bundibugyo ebolavirus), 레스톤 에볼라바이러스(Reston ebolavirus), 수단 에볼라 바이러스(Sudan ebolavirus), 타이 포레스트 에볼라바이러스(Tai Forest ebolavirus) 및 자이르 에볼라바이러스(Zaire ebolavirus)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 한 종 이상인 것을 특징으로 하는 에볼라 또는 마버그 바이러스의 검출 또는 감별용 조성물.
The method according to claim 1 or 2, wherein the Ebola virus is selected from the group consisting of Bundibugyo ebolavirus, Reston ebolavirus, Sudan ebolavirus, Tai Forest ebolavirus, Wherein the virus is one or more selected from the group consisting of Zaire ebolavirus.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 마버그 바이러스는 마버그 마버그바이러스(Marbug marburgvirus)인 것을 특징으로 하는 에볼라 또는 마버그 바이러스의 검출 또는 감별용 조성물.
The composition according to claim 1 or 2, wherein the Marburg virus is Marburg marburg virus. 2. The composition according to claim 1 or 2, wherein the Marburg virus is Marbug marburg virus.
서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 3의 프로브;
서열번호 4의 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 6의 프로브;
서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 9의 프로브;
서열번호 10의 정방향 프라이머 및 서열번호 11의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 12의 프로브;
서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 15의 프로브;
서열번호 16의 정방향 프라이머 및 서열번호 17의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 18의 프로브; 및
서열번호 19의 정방향 프라이머 및 서열번호 20의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 21의 프로브;
로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 에볼라(evola) 또는 마버그(marburg) 바이러스의 검출 또는 감별용 키트.
A primer set consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 1 and the reverse primer of SEQ ID NO: 2, and the probe of SEQ ID NO: 3;
A primer set consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 4 and the reverse primer of SEQ ID NO: 5, and the probe of SEQ ID NO: 6;
A primer set consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 7 and the reverse primer of SEQ ID NO: 8, and the probe of SEQ ID NO: 9;
A primer set consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 10 and a reverse primer of SEQ ID NO: 11, and a probe of SEQ ID NO: 12;
A primer set consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 13 and the reverse primer of SEQ ID NO: 14, and the probe of SEQ ID NO: 15;
A primer set consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 16 and a reverse primer of SEQ ID NO: 17, and a probe of SEQ ID NO: 18; And
A primer set consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 19 and a reverse primer of SEQ ID NO: 20, and a probe of SEQ ID NO: 21;
And a kit for detecting or differentiating an ebola or marburg virus comprising at least one primer and a probe set selected from the group consisting of:
제 5항에 있어서, 상기 에볼라 바이러스는 분디부교 에볼라바이러스(Bundibugyo ebolavirus), 레스톤 에볼라바이러스(Reston ebolavirus), 수단 에볼라 바이러스(Sudan ebolavirus), 타이 포레스트 에볼라바이러스(Tai Forest ebolavirus) 및 자이르 에볼라바이러스(Zaire ebolavirus)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 한 종 이상인 것을 특징으로 하는 에볼라 또는 마버그 바이러스의 검출 또는 감별용 키트.
6. The method of claim 5, wherein the Ebola virus is selected from the group consisting of Bundibugyo ebolavirus, Reston ebolavirus, Sudan ebolavirus, Tai Forest ebolavirus, and Zyre ebola virus Zaire ebolavirus). &Lt; RTI ID = 0.0 &gt; 25. &lt; / RTI &gt;
제 5항에 있어서, 상기 마버그 바이러스는 마버그 마버그바이러스(Marbug marburgvirus)인 것을 특징으로 하는 에볼라 또는 마버그 바이러스의 검출 또는 감별용 키트.
6. The kit for detecting or differentiating Ebola or Marburg virus according to claim 5, wherein the Marburg virus is Marburg marburg virus.
시험관내(In Vitro)에서 피검 시료로부터
서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 3의 프로브;
서열번호 4의 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 6의 프로브;
서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 9의 프로브;
서열번호 10의 정방향 프라이머 및 서열번호 11의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 12의 프로브;
서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 15의 프로브;
서열번호 16의 정방향 프라이머 및 서열번호 17의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 18의 프로브; 및
서열번호 19의 정방향 프라이머 및 서열번호 20의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 21의 프로브;
로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 및 프로브 세트를 사용하여 원 스텝 실시간(One-step realtime) RT-PCR 수행하는 단계를 포함하는,
시험관내(In Vitro)에서 피검 시료내 에볼라 또는 마버그 바이러스의 검출 또는 감별 방법.
From the test sample in In Vitro
A primer set consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 1 and the reverse primer of SEQ ID NO: 2, and the probe of SEQ ID NO: 3;
A primer set consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 4 and the reverse primer of SEQ ID NO: 5, and the probe of SEQ ID NO: 6;
A primer set consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 7 and the reverse primer of SEQ ID NO: 8, and the probe of SEQ ID NO: 9;
A primer set consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 10 and a reverse primer of SEQ ID NO: 11, and a probe of SEQ ID NO: 12;
A primer set consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 13 and the reverse primer of SEQ ID NO: 14, and the probe of SEQ ID NO: 15;
A primer set consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 16 and a reverse primer of SEQ ID NO: 17, and a probe of SEQ ID NO: 18; And
A primer set consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 19 and a reverse primer of SEQ ID NO: 20, and a probe of SEQ ID NO: 21;
Performing one-step real-time RT-PCR using one or more primers and probe sets selected from the group consisting of &lt; RTI ID = 0.0 &gt;
Detection or differentiation of Ebola or Marburg virus in a test sample in vitro.
제 8항에 있어서, 상기 에볼라 바이러스는 분디부교 에볼라바이러스(Bundibugyo ebolavirus), 레스톤 에볼라바이러스(Reston ebolavirus), 수단 에볼라 바이러스(Sudan ebolavirus), 타이 포레스트 에볼라바이러스(Tai Forest ebolavirus) 및 자이르 에볼라바이러스(Zaire ebolavirus)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 한 종 이상인 것을 특징으로 하는 시험관내(In Vitro)에서 피검 시료내 에볼라 또는 마버그 바이러스의 검출 또는 감별 방법.
9. The method according to claim 8, wherein the Ebola virus is selected from the group consisting of Bundibugyo ebolavirus, Reston ebolavirus, Sudan ebolavirus, Tai Forest ebolavirus and Zyre ebola virus Zaire &lt; / RTI &gt; ebolavirus). &Lt; RTI ID = 0.0 &gt; 11. &lt; / RTI &gt;
제 8항에 있어서, 상기 마버그 바이러스는 마버그 마버그바이러스(Marbug marburgvirus)인 것을 특징으로 하는 시험관내(In Vitro)에서 피검 시료내 에볼라 또는 마버그 바이러스의 검출 또는 감별 방법.
The method according to claim 8, wherein the Marburg virus is Marbug marburg virus. A method for detecting or discriminating ebola or Marburg virus in a test sample in vitro.
피검개체로부터 분리된 시료에서,
서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 3의 프로브;
서열번호 4의 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 6의 프로브;
서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 9의 프로브;
서열번호 10의 정방향 프라이머 및 서열번호 11의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 12의 프로브;
서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 15의 프로브;
서열번호 16의 정방향 프라이머 및 서열번호 17의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 18의 프로브; 및
서열번호 19의 정방향 프라이머 및 서열번호 20의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 21의 프로브;
로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 및 프로브 세트를 사용하여 원 스텝 실시간(One-step realtime) RT-PCR 수행하는 단계를 포함하는,
개체의 에볼라 또는 마버그 바이러스 감염 여부에 관한 정보를 제공하기 위한 원 스텝 실시간 RT-PCR 방법.
In the sample separated from the test subject,
A primer set consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 1 and the reverse primer of SEQ ID NO: 2, and the probe of SEQ ID NO: 3;
A primer set consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 4 and the reverse primer of SEQ ID NO: 5, and the probe of SEQ ID NO: 6;
A primer set consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 7 and the reverse primer of SEQ ID NO: 8, and the probe of SEQ ID NO: 9;
A primer set consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 10 and a reverse primer of SEQ ID NO: 11, and a probe of SEQ ID NO: 12;
A primer set consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 13 and the reverse primer of SEQ ID NO: 14, and the probe of SEQ ID NO: 15;
A primer set consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 16 and a reverse primer of SEQ ID NO: 17, and a probe of SEQ ID NO: 18; And
A primer set consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 19 and a reverse primer of SEQ ID NO: 20, and a probe of SEQ ID NO: 21;
Performing one-step real-time RT-PCR using one or more primers and probe sets selected from the group consisting of &lt; RTI ID = 0.0 &gt;
One-step real-time RT-PCR method to provide information on whether an individual has an Ebola or Marburg virus infection.
제 11항에 있어서, 상기 에볼라 바이러스는 분디부교 에볼라바이러스(Bundibugyo ebolavirus), 레스톤 에볼라바이러스(Reston ebolavirus), 수단 에볼라 바이러스(Sudan ebolavirus), 타이 포레스트 에볼라바이러스(Tai Forest ebolavirus) 및 자이르 에볼라바이러스(Zaire ebolavirus)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 한 종 이상인 것을 특징으로 하는 개체의 에볼라 또는 마버그 바이러스 감염 여부에 관한 정보를 제공하기 위한 원 스텝 실시간 RT-PCR 방법.
12. The method according to claim 11, wherein the Ebola virus is selected from the group consisting of Bundibugyo ebolavirus, Reston ebolavirus, Sudan ebolavirus, Tai Forest ebolavirus and Zyre ebola virus Zaire ebolavirus). The present invention relates to a one-step real-time RT-PCR method for providing information on whether an individual has an Ebola or Marburg virus infection.
제 11항에 있어서, 상기 마버그 바이러스는 마버그 마버그바이러스(Marbug marburgvirus)인 것을 특징으로 하는 개체의 에볼라 또는 마버그 바이러스 감염 여부에 관한 정보를 제공하기 위한 원 스텝 실시간 RT-PCR 방법.

The one-step real-time RT-PCR method according to claim 11, wherein the Marburg virus is Marbug marburgvirus. The one-step real-time RT-PCR method provides information on whether an individual is infected with Ebola or Marburg virus.

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20200056346A (en) * 2019-12-30 2020-05-22 대한민국(관리부서 질병관리본부장) Primers and probes for simultaneous detection of subtypes of Ebola virus and detecting method for ebola virus using the same
KR20200056347A (en) * 2019-12-30 2020-05-22 대한민국(관리부서 질병관리본부장) Primers and probes for simultaneous detection of subtypes of Marburg virus and detecting method for Marburg virus using the same

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KR20200056346A (en) * 2019-12-30 2020-05-22 대한민국(관리부서 질병관리본부장) Primers and probes for simultaneous detection of subtypes of Ebola virus and detecting method for ebola virus using the same
KR20200056347A (en) * 2019-12-30 2020-05-22 대한민국(관리부서 질병관리본부장) Primers and probes for simultaneous detection of subtypes of Marburg virus and detecting method for Marburg virus using the same

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