KR20150065560A - 연 캘러스 추출물을 함유한 항노화 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 연 캘러스 추출물을 함유하는 항노화 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 연 캘러스 초음파 추출물을 유효성분으로 함유하는 항노화 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 연 캘러스 초음파 추출물 함유 화장료 조성물은 피부 세포에 독성이 없으면서도 피부 주름 방지 또는 개선 효능을 가지고 있다.

Description

연 캘러스 추출물을 함유한 항노화 화장료 조성물 {Anti-aging Composition Including Nelumbo Nucifera Callus Extract}

본 발명은 연 캘러스 추출물을 함유하는 항노화 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 연 캘러스 초음파 추출물을 유효성분으로 함유하는 항노화 화장료 조성물에 관한 것이다.

햇빛은 우리의 삶에 꼭 필요한 반면 피부암이나 노화 등의 피부 장애, 백내장, 전신 면역 등에 좋지 않은 영향을 미치고 있다. 자외선에 오래 노출되면 인체의 피부에서는 생체반응으로 염증 및 조직손상, 암의 발생, 노화의 촉진 등 다양한 피부변화를 일으킨다. 자외선에 의한 피부 반응 중 일광화상은 주로 UVB가 관여하며 홍반형성 능력이 UVA에 비해 1,000배 정도 강한 것으로 알려져 있다.

인간의 피부는 시간이 지남에 따라 내적으로는 신진대사를 조절하는 각종 호르몬의 분비가 감소하고, 면역 세포의 기능과 세포들의 활성이 저하되어 생체에 필요한 면역 단백질 및 생체 구성 단백질들의 생합성이 줄어들게 되어 생기는 내인성 노화 (intrinsic aging)와, 외적으로는 각종 오염물질과 자외선에 의한 광노화(photoaging)에 의해, 피부가 얇아지며 (내인성 노화의 경우), 탄력이 감소하게 되며 자외선 조사에 노출됨에 따라 표피 내 각질형성세포와 멜라닌세포가 UVB에 의해 세포손상을 받게 된다. 피부 노화는 태양광선에 노출되지 않는 부위에서 나타나는 연대학적 노화 (chronologic aging)와 태양광선의 노출부에서 일어나는 퇴행성 변화가 연대학적 노화와 복합되어 일어나는 광인성 노화 (actinic ageing)로 구분된다. 연대학적 노화에서는 특징적인 임상 피부소견으로 미세한 주름, 진피의 위축, 피하지방층의 감소 등이 관찰된다. 광노화 과정에서는 거칠고 깊은 주름 (coatse wrinkling and furrowing)이 나타나고 비정상적인 탄력질양 물질 (elastotic material)이 축적되어 피부가 가죽같이 두터워지며 느슨해진다. 만성적 일광손상을 입은 피부에서 볼 수 있는 현상은 진피의 상부 쪽 교원질의 비정상적인 탄력질양 물질의 침착 (solar elastosis)과 프로테오글리칸 (proteoglycan)이 증가되고 진피의 주단백질인 콜라겐이 현저히 감소되는 것이다. 일반적으로 진피층은 대다수의 제 1형 콜라겐 (type I collagen)과 약간의 제 2형 콜라겐(type II collagen), 엘라스틴 (elastin), 프로테오글리칸 (proteoglycan), 피브로넥틴 (fibronectin) 등으로 구성되어 있다.

콜라겐은 피부에 강도와 장력을 부여하며 이로 인해 외부의 자극이나 힘으로부터 피부를 보호하는 역할을 하며 진피층의 90％를 차지하고 있어 콜라겐의 감소는 피부와 노화와 밀접한 관계를 가지고 있다.

피부를 구성하는 세포에서는 내인성 노화나, 광노화에 의해 세포활성이 떨어지고, 신호전달체계가 불완전해지면서 피부조직을 분해하는 효소인 MMPs (matrix metalloproteinases)의 생합성이 증가하고, 콜라겐의 생합성이 감소하여 주름살이 생기고 탄력이 감소하고, 피부흑화를 초래하는 멜라닌생성이 증가하는 것으로 알려져있다. 따라서 피부 세포를 증식시키거나, 피부를 구성하는 기질물질을 증가시킴으로써 피부를 두껍게 할 수 있는 물질, 피부를 구성하는 기질 물질인 콜라겐을 분해하는 MMPs의 생합성을 억제할 수 있는 물질, 멜라닌 생합성을 억제할 수 있는 물질 등이 주름, 탄력 상실, 피부흑화 등의 피부 증상을 완화시키는 것으로 밝혀져 있다.

전 세계적으로 약 30만종의 식물이 알려져 있으며, 다양한 생리활성을 나타내는 유용성분들이 식물에 함유되어 있음이 밝혀지고 있다. 그 유용성분들은 세포의 정상적인 대사과정에서 부차적으로 생산되어 세포 내 특수한 장소에 축적되는 2차 대사산물로서, 생화학적생태학적 관점에서 볼 때 미생물이나 외부 동물들로부터 식물체 자신을 방어하거나 생리활성 면에서 유리한 물질이라는 점에서 관심이 커지고 있다. 식물이 생산하는 2차 대사산물로는 알칼로이드(alkaloids), 플라보노이드(flavonoids), 카로티노이드(carotenoids), 글리코사이드(glycosides), 테르페노이드(terpenoids) 등이 있다. 이러한 2차 대사산물에는 보습, 피부진정 및 수렴, 자외선차단, 미백, 각질제거, 피부노화 방지, 항산화, 피부주름 개선, 항균, 항염, 항암 등의 효과를 나타내는 것들이 많다.

한편, 캘러스는 식물체에 상처가 났을 때, 상처의 세포가 분열 능력을 회복하여 상처를 막고 비대하여 지는 유상조직으로, 식물체에서 잘라낸 조직을 옥신을 함유한 배지에서 배양하는 방법 등에 의해 생기는 특수한 조직덩어리를 의미하며, 이러한 캘러스의 이용에 관해 최근 관심이 고조되고 있고, 다양한 방면에서 연구중에 있다.

최근 들어 phytochemical 등 식물성 자원을 이용한 기능성 식품 개발 및 활용에 많은 연구가 이루어지고 있으나, 연잎에 대한 보고는 거의 전무하며, 일부 미백, 노화방지 및 주름개선을 위하여 연 캘러스 에 관한 연구(특허문헌 1)는 있었으나, 항노화능을 극대화한 연 캘러스 추출물 획득에 관한 연구는 미비한 수준이었다.

대한민국등록특허 10-0828193호

본 발명자들은 항노화 기능이 강화된 연 캘러스 추출물을 함유한 화장료 조성물을 제조하기 위해 노력하던 중, 연 캘러스를 배양한 배양물을 부틸렌 글리콜 용매로 하여 초음파 추출한 추출물이 항노화, 및 항산화 효능이 극대화되어 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 연 캘러스 초음파 추출물을 유효성분으로 함유하는 항노화 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 연 캘러스 초음파 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 연 캘러스 초음파 추출물을 유효성분으로 함유하는 항노화 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 연 캘러스 추출물은 초음파 추출물일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 연 캘러스 초음파 추출물은 알코올 용매로 한 추출물일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 연 캘러스 초음파 추출물은 부틸렌 글리콜 용매로 한 추출물일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 피부 주름 개선 또는 방지용일 수 있다.

본 발명은 또한, (a) 연 종자로부터 캘러스를 유도하여 배양하는 단계; 및 (b) 상기 캘러스 배양물을 초음파 추출하여 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 연 캘러스 추출물을 함유한 항노화 화장료 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 연 캘러스 초음파 추출물을 함유하는 화장료 조성물은 피부 세포에 독성이 없으면서도 항산화능이 우수하며, 피부 콜라겐 합성능이 탁월하여, 피부 주름 개선, 방지에 탁월한 효능을 가지고 있다.

도 1은 실시예 1의 방법에 따라 연 캘러스를 배양한 결과를 나타낸 사진이다.
도 2는 본 발명에서 사용된 고주파 세포배양기를 나타낸 구성도이다.
도 3은 본 발명에서 사용된 고주파 세포배양기를 구성하는 바이오 리액터를 나타낸 단면도이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.

연(Nelumbo Nucifera)은 연못에서 자라는 다년초(多年草)로서 뿌리가 옆으로 길게 뻗으며 원주형이고 마디가 많으며 가을철에 끝부분이 특히 굵어진다. 잎은 근경(根莖)에서 나와 물위에 높이 솟고 원형(圓形)에 가까우며 엽맥(葉脈)이 사방으로 퍼지며 직경 40 cm 정도이며 물에 잘 젖지 않으며 엽병(葉炳)에 가시 같은 돌기(돌기)가 있다. 7∼8월에 홍색, 백색의 꽃이 피고, 직경 15∼20cm이고, 화경(花梗)은 엽병(葉柄)처럼 가시가 있고 끝에 1개의 꽃이 달린다. 10월에 열매가 익으며 견과(堅果)는 타원형이고 길이 2 cm 정도로서 먹을 수 있다. 연(Nelumbo Nucifera)의 과실 또는 종자(種子)를 연자(蓮子), 연의 성숙한 종자의 녹색의 배아(胚芽)를 연자심(蓮子心), 연의 수술을 연수(蓮鬚), 잎을 하엽(荷葉), 근경(뿌리줄기)을 우(藕), 근경(뿌리줄기)의 마디를 우절(藕節)이라고 한다. 연(Nelumbo Nucifera)잎인 하엽은 설사 두통과 어지럼증, 토혈, 산후 어혈 치료, 야뇨증, 해독작용에 쓰이며 성분으로는 진통작용, 진정작용이 있는 nuciferin, armepavine, liriodenine, n-nornuciferine, tannin,citric acid, succinic acid 등이 포함되어 있다. 특히 연에 많이 함유되었다고 알려진 탄닌은 모공에 수분을 공급해주는 흡습작용과 피부 모공을 조여주는 수렴작용이 탁월하고, 항균력이 있어 피부 청결에 도움을 준다.

이러한 연잎이나 녹차 등에서 생리활성을 나타낼 수 있는 성분으로는 식이섬유와 항산화 비타민 및 flavonoid를 비롯한 polyphenol류 등을 들을 수 있다. 그 외에 -carotene, 비타민C, E와 같은 항산화 비타민은 free radical을 제거함으로써 관상동맥질환, 암, 백내장을 예방할 뿐만 아니라 노화의 지연에도 상당한 작용을 한다. 특히 녹색 잎에 많이 들어있는 flavonoids는 superoxide dismutase(SOD), glutathione peroxide, catalase와 peroxyl nitrate의 scavenging, Fe와 Cu의 chelating 뿐만 아니라 항산화 효소의 활성을 증가시킴으로써 지질 과산화와 low density lipoprotein(LDL)의 산화를 방지한다.

본 발명에 있어서 정의되는 연(蓮)은, 상기 연자(蓮子), 연자심(蓮子心), 연수(蓮鬚), 하엽(荷葉), 우(藕), 우절(藕節)을 모두 포함하여 통칭하는 용어이다.

본 발명에 있어서, "캘러스"는 식물체에서 잘라낸 조직을 옥신을 함유한 배지에서 배양하거나, 어떤 종류의 식물에 상처를 내거나, 상구를 옥신으로 처리하거나 할 때에 생기는 특수한 조직 또는 세포덩어리를 말한다. 보통 캘러스는 정상적인 기관형성이나 조직분화를 일으키는 능력을 잃은 무정형의 조직 또는 세포덩어리로 대부분 유세포로 되어 있다. 넓은 의미로는 아그로박테리움(agrobacterium) 등의 감염에 의해서 생기는 식물종양조직도 포함시키기도 한다.

조직배양을 통한 미분화세포덩어리인 캘러스가 형성되면, 즉, 식물체내의 세포는 증식하면 즉시 방향이 정해져서 특정한 조직 더 나아가서는 기관으로 규칙적으로 조립되어 간다. 그러나, 다양한 식물 성장 호르몬 등을 외부로부터 주게 되면 그때까지 유지되어 왔던 통제가 해제되어 세포가 제멋대로 증식하는 것으로 해석된다.

탈분화에 의해 얻어진 캘러스를 같은 조성을 가진 액체배지에 넣어서 진탕배양하면 세포는 따로 떨어져 현탁 상태로서 증식을 계속한다. 이 캘러스나 배양세포는 새로운 배지에 계대 배양함으로써 영구적으로 분열 및 증식할 수 있게 되어 완전 식물체가 노화해서 죽어가는 분화세포와는 본질적으로 차이가 있다. 몇 세대정도 계대 배양한 캘러스 또는 배양세포를 다양한 식물 성장 호르몬을 제거한 고형 배지에 도포해두면 눈과 뿌리가 나와서 개체 식물이 복원된다. 이 재생식물은 한 개의 배양세포의 분열증식에서 유래한 것이며, 그 배양세포의 근원을 말하면 배축이나 수조직에서 유도한 것이다. 다시 말하면, 식물체를 구성하는 한 개의 체세포에서 식물이 복원한다는 것이다. 원래의 식물체는 몇 억 개의 체세포로 구성되어 있고, 그 모든 것이 생식세포와 같은 개체를 창조하는데 필요한 유전자를 모두 갖추고 있다는 것을 의미한다. 모식물체로부터 분리된 식물조직세포는 적정배양환경에서 배양하면 완전한 식물체로 재생될 수 있는 잠재력 즉, 전형성능을 가지고 있다. 이 전형성능은 식물 발생학 등의 학술적인 중요성은 물론이지만 화장품 원료 등의 실용화를 위해서도 활용가치가 크다.

본 발명에 있어서, "연 캘러스 "는 연의 어느 부위로부터 유도된 것이든 모두 가능하나, 일 구체예로, 연 종자의 발아된 유묘로부터 자엽을 절취하여 유도시킨 캘러스일 수 있고, 연의 어느 조직이든지 일부 잘라내어 옥신 및 사이토키닌의 함량을 조절한 배지에 놓아두면 캘러스가 형성될 수 있다.

특히, 본 발명에 있어서, 연 캘러스는 캘러스 유도시에, 고주파를 240 ∼270kHz로 하여 1∼10분 간격으로 1∼5회 처리하고 이를 2∼4주간 반복하여 얻은 캘러스일 수 있다.

본 발명에 있어서, "추출물"은 상기 연 캘러스 배양물 자체 또는 연 캘러스 배양물을 분말화하거나, 열수추출법, 알코올 추출법, 초음파 추출법 등에 의해 수득한 추출물을 의미한다. 특히, 본 발명에서는 연 캘러스를 알코올, 예컨대, 부틸렌글리콜을 용매로하여 초음파 추출한 것일 수 있다.

종래에 부틸렌글리콜은 점성을 위해서 쓰는 방부력이 있는 원료일 뿐 이러한 직접 추출의 용매로 통상 사용되지 않는 물질이다.

본 발명에 있어서, "유효성분으로 함유하는"의 의미는, 화장료 조성물로써, 피부주름개선을 통한 항노화 기능, 항산화능을 가질 수 있는 정도로 함유하는 것을 의미한다.

본 발명은 일 관점에서, 상기 연 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

한편, 본 발명에 따른 연 캘러스 배양 추출물을 항노화 화장료에 사용할 경우 조성물 총 중량에 대하여 0.00120.0중량％인것이 바람직하며, 0.01∼10.0중량％로 함유하는 것이 보다 바람직하다. 이는 0.001중량％ 미만에서는 그 효과를 기대할 수 없고, 20.0중량％ 초과에서는 안전성 또는 제형상의 제조에 어려움이 있기 때문이다. 그러나, 상기의 연 캘러스 배양 추출물의 양은 특별히 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 연 캘러스 추출물은 조성물의 총 중량에 대하여 0.001 내지 20중량％, 바람직하게는 0.01∼10.0중량％를 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이는 0.001중량％ 미만에서는 그 효과를 기대할 수 없고, 20.0중량％ 초과에서는 안전성 또는 제형상의 제조에 어려움이 있기 때문이다. 그러나, 상기의 연 캘러스 배양 추출물의 양은 특별히 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 항노화, 항산화 효과를 발휘할 수 있는 화장품 및 세안제 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 각종 크림, 로션, 스킨 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.

본 발명의 화장료는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함한다.

본 발명의 화장료에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다. 이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

상기 화장료 조성물에 있어서는, 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서, "화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다.

상기 담체는 본 발명의 화장료 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량％ 내지 약 99.99 중량％, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 90 중량％ 내지 약 99.99 중량 ％로 포함될 수 있다. 그러나 상기 비율은 본 발명의 화장료 조성물이 제조되는 전술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴, 목 등)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

한편, 상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제,안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예로써, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기 연 캘러스 추출물 이외에 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글키롤, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유, 에탄올, 트리에탄올아민 등을 포함할 수 있으며, 방부제,항료, 색소, 정제수 등을 필요에 따라 미량 포함할 수 있다.

특히, 상기 화장료 조성물은 본 발명에 특별히 개시된 제조방법 이외에도, 통상적으로 알려진 제조방법을 이용하여, 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조될 수 있다. 화장료 조성물로 제조될 경우, 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 또한, 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.

또한, 적합한 화장품의 제형으로는, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일,염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 바람직하게는 0.01 - 5 ％ 중량 백분율, 보다 바람직하게는 0.01 - 3 ％ 중량 백분율로 배합된다.

본 발명의 화장료는 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료 등으로 제조될 수 있으며, 구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 에멀젼, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저, 아이크림의 제형을 포함한다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제,에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트,사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 다른 관점에서, (a) 연 종자로부터 캘러스를 유도하여 배양하는 단계; 및 (b) 상기 캘러스 배양물을 초음파 추출하여 초음파 추출물을 함유하는 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 연 캘러스 추출물을 함유한 화장료 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

상기 (a)단계에서, 구체적으로는 연의 종자를 발아시켜 캘러스를 유도하기 위해 적절한 배지를 선택할 수 있다.

기술분야에서 캘러스 배양에 일반적으로 사용되고 있는 배지가 있다면, 제한없이 사용가능하다. 식물에서는 일반적으로 MS(Murashige-Skoog)배지, B5배지 등을 주로 사용하고, 일 예로, MS 기초 고체 배지(Murashige and Skoog 1962, Duchefa 사, Cat No. M0221)의 조성(1L기준시)은 NH4NO3 1650 mg, KNO3 1900 mg, CaCl2/2H2O 440mg, MgSO4/7H2O 370 mg, KH2PO4 170 mg, KI 0.83 mg, H3BO3 6.2 mg, MnSO4/4H2O 22.3mg, ZnSO4/7H2O 8.6 mg, Na2MoO4/2H2O 0.25 mg, CuSO4/5H2O 0.025 mg, CoCl2/6H2O 0.025 mg, FeSO4/7H2O 27.8 mg, Na2EDTA/2H2O 37.3 mg, Myoinositol 100 mg, Nicotinic acid 0.5 mg, Pyridoxine-HCl 0.5 mg, Thiamine-HCl 0.5 mg, Glycine 2 mg,Sucrose 30000 mg 이다.

본 발명에 있어서, 연 종자로부터 캘러스를 유도하기 위한 배지로써, 상기 MS 기초 고체 배지에 6-Benzylaminopurine, 2,4-D, Sucrose 40.0g/L, Agar 5∼10.0 g/L, NAA 0.5 mg/L, BAP 1.0 mg/L 등을 첨가한 배지를 이용할 수 있다. 여기서, 상기 배지의 pH는 5.5∼6.0이고, 바람직하게는, pH 5.7∼5.8이다. 이 고체 배지에 치상하여, 캘러스 유도가 가능하다.

이것 이외에도, 종래에 연 캘러스 유도 배지로써 알려진 다양한 배지들 또한 본 발명에서 적용가능할 것이다.

또한, 캘러스를 유용물질을 함유하는 배지에서 배양하면, 캘러스가 배지에 첨가된 유용물질을 흡수하여 캘러스 내에 유용물질을 함유하게 되므로, 캘러스는 유래된 식물의 생리 활성 뿐만 아니라, 배지 내 첨가된 유용물질에 의한 생리활성을 나타낼 수 있다. 이러한 캘러스 내 유용물질의 도입은, 상기 유도된 캘러스를 유용물질을 포함하는 배지내에 치상하는 단계를 추가적으로 수행하여 배양된 캘러스에 유용물질을 도입시킬 수도 있다.

일 구현예로, 실시예 1에서 나타난 바와 같이, 상기 (a) 단계에서, MS배지에 1mg/L 6-Benzylaminopurine, 0.3mg/L 2,4-D가 함유된 배지에서 25, 습도 70％ 조건으로 20L 풍선형 생물반응기에 공기공급량 0.1 vvm 정도로 5주간 배양할 수 있다.

본 발명에 있어서, 이러한 연 캘러스 유도시, 또는 유도한 후 (대량)생산하기 위해 배양하는 과정에 있어 고주파 처리하는 과정을 거칠 수 있으며, 이러한 고주파 처리를 위해 고주파 세포 배양기(대한민국특허출원 10-2012-0127017), 예컨대, 도 2 내지 3의 구성을 가진 고주파 세포 배양기(100)를 이용할 수 있다.

특히, 본 발명에서는, 고주파를 240 ∼270kHz로 하여 1∼10분 간격으로 1∼5회 처리하고 이를 2∼4주간 반복할 수 있다.

예컨대, 실시예에서는 캘러스 배양하면서 5주후 하루 동안 고주파를 240 kHz로 하여 5분 간격으로 3번 처리하고 이를 이주일간 반복하였다.

상기 고주파 세포 배양기를 상세하게 설명하면, 도 2 내지 3에 도시된 바와 같이, 고주파 세포 배양기(100)는 바이오 리액터(200)와, 상기 바이오리액터(200)에 고주파를 제공하는 고주파 공급기(300)와, 상기 바이오 리액터(200) 에 공기를 제공하는 공기 공급기(400)와, 상기 고주파 공급기(300)와 연결되고 상기 바이오 리액터(200)의 진동을 기록하는 진동기록기(500)로 구성된다.

상기 바이오 리액터(200)는 내부에 수용되는 세포배양에 고주파 및 공기를 제공하여 배양시키게 된다. 상기와 같은 역할을 수행하는 바이오 리액터(200)는 소정의 크기를 가지고 형성되는 케이스(210)와, 상기 케이스(210)의 상부에 착탈 가능하게 장착되는 상부 덮개(220)와, 상기 케이스(210)의 양측 동일선상에 장착되는 고주파 단자(230)와, 상기 케이스(210)를 지지하는 수평 지지판(240)과, 소정의 높이를 가지며 상기 수평 지지판(240)을 지지하는 고정봉(250)으로 구성된다.

그리고 상기 케이스(210)는 세포배양 및 배양액을 공급하는 주입구(211)가 상부에 형성되고, 양측 동일선상에는 고주파 장착부(212)가 형성되며, 하부에는 공기 주입부(213)가 형성된다.

즉 상기 케이스(210)는 상, 하부가 뒤집힌 호리병 형상으로 형성되면서 상부와 양측 동일선상 및 하부에 주입구(211)와 고주파 장착부(212) 및 공기 주입부(213)가 내부와 연통되도록 형성되는 것이다.

또한 상기 케이스(210)의 상부에 착탈 가능하게 장착되는 상부 덮개(220) 는 고정 또는 분리를 통해 상기 케이스(210)의 내부를 개방 또는 폐쇄하게 된다.

다음으로 상기 케이스(210)를 구성하는 고주파 장착부(212)에 각각 장착되는 고주파 단자(230)는 고주파 공급기(300)를 통해 전달되는 고주파를 케이스(210)의 내부에 전달하게 된다.

그리고 본원발명에서 상기 고주파 단자(230)는 "ㅓ"자 형상으로 형성되는 단자부(231)와, 상기 단자부(231)의 일 측에 장착되면서 케이스(210)의 고주파 장착부(212)와 밀착되는 밀봉부재(232)와, 상기 단자부(231)에 일 측이 결합되고 반대 측이 고주파 공급기(300)에 전달되는 연결선(233)으로 구성된다.

즉 상기 고주파 단자(230)는 고주파 공급기(300)와 연결되는 연결선(233)을 통해 고주파를 전달받은 후 상기 고주파를 단자부(231)를 통해 케이스(210)의 내부에 전파되도록 한 것이다.

또한 상기 케이스(210)를 지지하는 수평 지지판(240)은 소정의 두께와 지름을 가지는 판으로 제작되고 중앙에는 케이스(210)를 고정하는 고정공(241)이 관통형성된다.

그리고 상기 수평 지지판(240)의 가장자리 둘레를 따라 하부에 수직으로 장착되는 고정 봉(250)은 소정의 높이를 가지는 공지된 봉이나 바를 택일하여 구성된다.

이때 상기 케이스(210) 및 수평 지지판(240)과 상기 수평 지지판(240) 및 고정 봉(250)의 연결부분에는 충격 및 진동의 감소를 위하여 고무, 실리콘, 합성수지 중 선택된 재질로 형성되는 완충부재(260)가 각각 장착된다.

여기서 상기 완충부재(260)는 중공형상으로 형성되면서 상, 하부에 간격을 두고 엠보싱 돌기가 선택적으로 형성될 수 있음을 밝힌다.

상기 고주파 공급기(300)는 고주파를 발생시키는 작동부(미도시)와, 온/오프 작동 및 고주파를 조절하는 조작부(310)와, 현재상태 및 작동상태를 나타내는 표시부(320)와, 주파수의 상태를 표시하는 레벨메타(330)로 구성되어 상기 바이오 리액터(200)에 고주파를 제공하게 된다.

여기서 상기 작동부는 공지된 고주파 공급기를 구성하는 작동부의 구성을 택일하여 구성되고 별도의 설명은 생략하기로 한다.

즉 상기 고주파 공급기(300)는 조작부(310)의 작동에 따라 작동부가 연동작동하면서 상기 바이오 리액터(200)의 고주파 단자(230)에 고주파를 공급하고, 현재 상태는 표시부(320)와 레벨 메타(330)를 통해서 실시간으로 확인할 수 있게 되는 것이다.

상기 공기 공급기(400)는 소정의 크기를 가지며, 내부에 공기 생성부(미도시)가 장착되고, 전방에는 공기를 배출하는 배출구(420)가 형성되며, 상기 배출구(420)에는 공기를 전달하는 공기 호스(440)가 장착되어 상기 바이오 리액터(200)에 공기를 제공하게 된다.

여기서 상기 공기 생성부는 공지된 공기 공급기나 공기 공급장치를 구성하는 공기 생성부의 구성을 택일하여 구성되고 별도의 설명은 생략하기로 한다.

즉 상기 공기 생성부(400)는 입력되는 신호에 따라서 공기 생성부를 통해 공기를 생성한 후 상기 배출구(420)와 공기 호스(440)를 통해 상기 바이오 리액터(200)의 케이스(210)에 공기를 공급하게 되는 것이다.

상기 진동기록기(500)는 진동을 변환 및 기록하는 진동 작동부(미도시)와, 온/오프 작동 및 각종 기능을 조절하는 진동 조작부(510)와, 현재상태를 나타내는 진동 표시부(520)와, 상기 고주파 공급기(300)와 연결되는 연결선(530)으로 구성된다.

여기서 상기 진동 작동부는 공지된 진동기록기에 장착되는 진동 작동부를 택일하여 구성되고 별도의 설명은 생략하기로 한다.

즉 상기 진동기록기(500)는 고주파 공급기(300)와 연결되는 연결선(530)와 진동 표시부(520)를 통해 상기 바이오 리액터(200)의 진동상태를 시간으로 확인할 수 있게 되는 것이다.

상기와 같이 구성되는 고주파 세포 배양기(100)를 준비 및 구동하는 과정을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

먼저, 소정의 크기를 가지고 형성되는 케이스(210)와, 상기 케이스(210)의 상부에 착탈 가능하게 장착되는 상부 덮개(220)와, 상기 케이스(210)의 양측 동일선상에 장착되는 고주파 단자(230)와, 상기 케이스(210)를 지지하는 수평 지지판(240)과, 소정의 높이를 가지며 상기 수평 지지판(240)을 지지하는 고정봉(250)으로 구성되는 바이오 리액터(200)를 준비한다.

그리고 상기 바이오 리액터(200)와 간격을 두고 고주파를 발생시키는 작동부(미도시)와, 온/오프 작동 및 고주파를 조절하는 조작부(310)와, 현재상태 및 작동상태를 나타내는 표시부(320)와, 주파수의 상태를 표시하는 레벨메타(330)로 구성되는 고주파 공급기(300)를 설치한다.

다음으로 상기 고주파 공급기(300)와 간격을 두고 소정의 크기를 가지며, 내부에 공기 생성부(미도시)가 장착되고, 전방에는 공기를 배출하는 배출구(420)가 형성되며, 상기 배출구(420)에는 공기를 전달하는 공기 호스(440)가 장착되는 공기공급기(400)를 설치한다.

그리고 상기 공기 공급기(400)의 일 측으로 진동을 변환 및 기록하는 진동작동부(미도시)와, 온/오프 작동 및 각종 기능을 조절하는 진동 조작부(510)와, 현재상태를 나타내는 진동 표시부(520)와, 상기 고주파 공급기(300)와 연결되는 연결선(530)으로 구성되는 진동기록기(500)를 장착하면 고주파 세포 배양기(100)의 조립은 완료되는 것이다.

여기서 상기 고주파 세포 배양기(100)의 조립 순서는 상기와 다르게 구성될 수 있음을 밝힌다.

다음으로 상기와 같이 구성되는 고주파 세포 배양기(100)의 사용상태를 살펴보면 다음과 같다.

먼저 상기 바이오 리액터(200)를 구성하는 케이스(210)의 주입구(211)를 폐쇄하고 있는 상부 덮개(220)를 개방한 후 상기 케이스(210)의 내부에 배양액과 세포배양을 공급한 상기 주입구(211)를 상부 덮개(220)를 이용하여 폐쇄한다.

그리고 상기 고주파 공급기(300)를 구성하는 조작부(310)를 이용하여 고주파의 설정 값을 조절한 후 연결선(233)을 이용하여 바이오 리액터(200)의 고주파 단자(230)에 고주파를 전달한다.

동시에 상기 공기 공급기(400)에서 발생하는 공기를 공기 호스(440)를 이용하여 상기 바이오 리액터(200)의 공기 주입부(213)에 공급한다.

다음으로 상기 케이스(210)의 내부에 수용된 세포배양은 고주파 단자(230)를 통해 전달되는 고주파의 영향을 전달받게 되고, 사용자는 표시부(320)와 레벨메타(330)를 통해 실시간으로 공급되는 고주파의 정보를 확인하게 된다.

더불어 상기 고주파 공급기(300)에 전달되는 바이오 리액터(200)의 진동을 진동기록기(500)를 통해 기록하면 된다.

본 발명에 있어서, 상기 (b)단계에서 있어서, (a)단계의 배양을 통해 얻어진 연 캘러스 배양물(배양체)을 초음파 추출하는 과정을 거칠 수 있으며, 이때, 알코올 용매, 예컨대, 부틸렌글리콜을 용매로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 초음파 추출시 사용되는 부틸렌 글리콜은 물과 글리콜부틸렌이 20∼80％(v/v) 농도인 부틸렌 글리콜 또는 30∼60％(v/v) 부틸렌 글리콜일 수 있고, 30분 내지 3시간 정도 추출할 수 있다. 초음파 추출 조건은 종래 알려진 초음파 추출방법이 사용될 수 있으며, 예컨대, 초음파에너지(170 KHz, 300 Watt±2)를 적용하였으며, 추출 온도는 반응기내 물을 chiller를 통해 순환시켜(25 ℃±, 1)를 고정하고, 초음파추출시간은 30 ∼ 60분 동안으로 수행할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1-1: 본 발명에 따른 연종자로부터 발아 및 캘러스 유도

본 발명에 사용된 연 종자는 인천 서구 백석동에서 수확한 것으로 무균적인 발아를 위하여, 연 종자를 70％ 에탄올에 30초 동안 침지한 후 멸균수로 세척하고 다시 소독액 (30％ 락스 +Tween20)으로 20분 소독한 후 멸균수로 3회 수세하여 마젠타 박스(Magenta box)내에서 치상하여 25℃, 습도 70％ 생장상 조건으로 발아를 유도하였다. 이때, 사용된 배지는 기본 1/2 MS 고체 배지(Murashige and Skoog 1962, Duchefa 사, Cat No. M0221)이다.

발아 후, 날카로운 칼을 이용하여 단번에 상처를 내어 1mg/L 6-Benzylaminopurine, 0.3mg/L 2,4-D, 3％ Sucrose 및 agar 8g/L 가 포함된 기본 MS배지에서 25℃, 습도 70％ 의 생장상 조건으로 암배양하며 초기 캘러스를 유도하였다.

실시예 1-2: 본 발명에 따른 연 캘러스 대량생산 및 유인제 처리

연 종자로부터 무균적으로 유도되어 배양된 연 캘러스 를 대량생산하기 위하여, 상기와 같이 MS배지에 1mg/L 6-Benzylaminopurine, 0.3mg/L 2,4-D가 함유된 배지에서 25℃, 습도 70％ 조건으로 20L 풍선형 생물반응기에 공기공급량 0.1 vvm 정도로 5주간 배양하였다. 물리적 유인제의 한 종류인 고주파를 풍선형 생물반응기와 연결하여 (특허출원번호, 10-2012-0127017, 특허권자 바이오에프디엔씨) 배양하면서 5주후 하루 동안 고주파를 240 kHz로 하여 5분 간격으로 3번 처리하고 이를 이주일간 반복하였다.

실시예 1-3: 본 발명에 따른 연 캘러스 캘러스 배양 추출물 제조

실시예 1-2에서 배양하여 얻은 연 캘러스 배양물을 수확하여 깨끗한 티슈로 충분히 수분을 제거한 후 60℃로 2일 동안 건조기에서 건조하였다. 건조된 연 캘러스 배양물 분말 50g을 용기에 담고, 1L의 정제수를 넣은 후 50％ Butylene Glycol (부틸렌글라이콜) 용매로 1시간 초음파 추출(초음파에너지 : 170 KHz, 300 Watt±2, 추출 온도 : 25℃±1)하였다. 추출 후, mesh로 여과하여 고형분을 제거하고, 여과하여 나온 연 캘러스 배양 추출물을 본 발명에 사용하였다.

비교실험을 위하여, 실시예 1-2에서 배양하여 얻은 연 캘러스 배양물을 70％ 에탄올 추출 및 열수추출(100℃, 3시간 추출)과 비교하였다.

실험예 1: 연 캘러스 배양 추출물의 세포 생존율 (Cell Viability)

실시예 1-3에서 제조한 조성물에 대한 피부 세포 생존율을 알아보기 위하여, 인간섬유아세포(Human Skin Fibroblast, CCD-986Sk)는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 분주 받아서 배양하였다. 각 세포를 1×10⁴cells/ml의 농도로 하여 24 well 배양판에 접종하였다. 배지는 10 ％ FBS를 함유한 DMEM(Dubelcco'S Modified Eagle Medium, BRL,USA)을 사용하였다. 10％ FBS를 함유하는 DMEM에서 48시간 배양하여 배양용기 표면적의 25 ∼ 30％만큼 배양되면, 실시예 1-3에서 제조된 조성물이 0.1 ∼ 10 ％가 함유된 FBS-free DMEM으로 교체하여 24시간 더 배양하였다. 배양 후 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸리움 브롬화물 (MTT, Sigma M5655, USA) 용액 (2.5 mg/ml)을 50㎕ 첨가하고 3시간동안 추가로 배양한 후 상등액을 제거하고, 각 well 당 200㎕ 의 Dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma D2650, USA)용액을 가한 후 20분간 교반하여 형성된 포르마잔(formazan) 결정을 녹인 다음, 100㎕ 씩을 96 well 로 취하여 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)로 570 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 피부 세포의 생존율 정도는 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 하기 수학식에 따라 계산하여 백분율로 표시하였고, 결과는 표 1에 나타난 바와 같았다.

생리활성물질함량을 증가시키기 위하여 물리적 유인제인 고주파를 처리하여 배양된 연 캘러스 를 20％ Butylene Glycol, 50％ Butylene Glycol, 80％ Butylene Glycol 용매로 초음파 추출된 추출물 및 열수추출, 70％ 에탄올 추출, Isopropyl alcoho을 용매로 추출하여 피부세포 생존율 영향을 확인해봤으나, Isopropyl alcohol 추출을 제외하고는 세포 생존율에 영향을 미치지 않았다.

실험예 2: 연 캘러스 배양 추출물의 항산화 효과 (ABTS Radical Scavenging Activity)

ABTS radical을 이용한 항산화능의 측정은 potassium persulfate와의 반응에 의해 생성된 ABTS free radical이 추출물 내의 항산화 물질에 의해 제거되어 radical 특유의 색인 청록색이 탈색되는 것을 이용한 방법으로 Van den Berg 등의 방법을 변형하여 측정하였다.

1.0 mM의 AAPH(2,2'-azo-bis 2-amidinopropanedeihydrochloride)는 100 mM PBS buffer에 녹인 2.5 mM ABTS(2,2'-azino-bis 3-ethylbenzenothiazolin-6-sulfonic acid)와 혼합한 후 68℃ 의 항온조에서 12분 동안 반응시켰다. 농도별로 희석한 실시예1의 연 캘러스 배양추출물 20㎕ 와 980㎕ ABTS 용액을 37℃ water bath에서 10분간 반응시키면서 734 nm에서 감소하는 흡광도의 정도를 측정하였으며 이때 양성대조군은 Trolox 0.1 ％ 을 사용하였다. ABTS radical 소거능은 다음의 수학식 2에 따라 계산하였으며, 결과는 표 2와 같았다.

생리활성물질함량을 증가시키기 위하여 물리적 유인제인 고주파를 처리하여 배양된 연 캘러스 를 20％ Butylene Glycol, 50％ Butylene Glycol, 80％ Butylene Glycol 용매로 초음파 추출된 추출물 및 열수추출, 70％ 에탄올 추출, Isopropyl alcoho을 용매로 추출하여 항산화 효과를 확인해보았다. 50％ Butylene glycol 용매로 초음파 추출된 추출물이 연 캘러스 배양 추출물 함량이 증가함에 따라 항산화 효과가 더 우수함을 확인하였고, 20％ Butylene Glycol, 80％ Butylene Glycol용매에 의한 초음파 추출 및 열수추출, 70％에탄올 추출, Isopropyl Alcohol 추출은 항산화 효과가 50％ Butylene Glycol 보다는 미비한 항산화효과를 보였다.

실험예 3: 연 캘러스 배양 추출물의 자외선 조사에 의한 피부 주름 감소 효과

3.1: Procollagen 발현 증가

인간섬유아세포(Human Skin Fibroblast)를 37℃, 5％ CO₂ 배양기에서 일정한 습도를 유지하는 세포 배양기내에서 10％ FBS, Penicillin(50U/ml), Streptomycin(50/ml)를 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco, USA)으로 배양하여, 1×10⁵개/ml로 24 well plate에 500㎕씩 분주한 다음 24시간 배양한 후, UVB를 조사하였다. 대조군(DMEM 배지)과 0.1 ∼ 10 ％의 다양한 농도의 실시예 1의 추출물을 함유한 배지를 넣고 48시간동안 37℃, 5％ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 48시간 후, 배지의 상층액을 각각 20㎕을 취해 Procollagen Type I C-Peptide EIA Kit(PICP, Takara, Cat No. MK101)를 이용하여 측정함으로써 새로 합성된 Procollagen 발현양을 측정하였다.

PICP양은 ng/1×10⁵세포로 환산하였으며, 하기 수학식 3에 따라 계산하여 그 결과는 표 3에 나타나 있다.

상기 표 3에서 볼 수 있듯이, 자외선 UVB 조사한 결과와 비교할 경우, 본 발명의 조성물인 생리활성물질함량을 증가시키기 위하여 물리적 유인제인 고주파를 처리하여 배양된 연 캘러스를 20％ Butylene Glycol, 50％ Butylene Glycol, 80％ Butylene Glycol 용매로 초음파 추출된 추출물 및 열수추출, 70％ 에탄올 추출, Isopropyl alcohol을 용매로 추출하여 Procollagen 생합성 효과를 확인해보았다. 50％ Butylene glycol 용매로 초음파 추출된 추출물이 연 캘러스 배양 추출물 함량이 증가함에 따라 Procollagne 생합성 효과가 증가하여 주름개선,방지에 우수함을 확인하였고, 20％ Butylene Glycol, 80％ Butylene Glycol용매에 의한 초음파 추출 및 열수추출, 70％에탄올 추출, Isopropyl Alcohol 추출은 Procollagne 생합성 효과가 50％ Butylene Glycol 보다는 미비함을 알 수 있었다.

3.2: MMP-1 발현 억제 효과

피부의 주름은 콜라겐의 합성과 분해의 불균형에 기안하는데 보통 피부에서 type I 콜라겐의 합성과 그 분해 효소인 MMP-1이 균형을 이루고 있다. 그러나 광노화된 피부에서는 type I, III 콜라겐의 합성이 저하되고, MMP-1의 활성이 증가된다. 이러한 MMPs(matrix metalloproteinases)는 단백분해효소로 세포외 기질(extracellular matrix)을 분해하는 기능을 나타내며 정상적인 상태에서는 상처 치유나 조직재생과정에 관여하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 조성물이 MMP-1 생성 억제 효과가 있는지를 확인하기 위해, 아래와 같은 실험을 하였다.

인간섬유아세포(Human Skin Fibroblast)를 37℃, 5％ CO₂ 배양기에서 일정한 습도를 유지하는 세포 배양기내에서 10％ FBS, Penicillin(50U/ml), Streptomycin(50/ml)를 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco, USA)으로 배양하여, 1×10⁶개/ml로 48 well plate에 분주한 다음 24시간 배양한 후, UVB를 조사하였다. 대조군(DMEM 배지)과 0.1 ∼ 10 ％ 농도의 미세조류 추출물을 함유한 배지를 넣고 48시간동안 37℃, 5％ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 48시간 후, 배지의 상층액을 각각 20㎕을 취해 Matrix Metalloproteinase-1, Biotrack Activity(Amersham, Cat No. RPN2629)를 이용하여 측정함으로써 새로 합성된 MMP-1의 양을 측정한 뒤, mg/ml 환산하여, 하기 수학식 4에 따라 계산하여 그 결과는 표 4에 나타나 있다.

상기 표 4에서 볼 수 있듯이, 자외선 UVB 조사한 결과와 비교할 경우, 본 발명의 조성물인 생리활성물질함량을 증가시키기 위하여 물리적 유인제인 고주파를 처리하여 배양된 연 캘러스를 20％ Butylene Glycol, 50％ Bulylene Glycol, 80％ Butylene Glycol 용매로 초음파 추출된 추출물 및 열수추출, 70％ 에탄올 추출, Isopropyl alcoho을 용매로 추출하여 MMP-1 생합성 억제 효과를 확인해보았다. 50％ Butylene glycol 용매로 초음파 추출된 추출물이 연 캘러스 배양 추출물 함량이 증가함에 따라 MMP-1 생합성 억제 효과가 증가하여 주름개선,방지에 우수함을 확인하였고, 20％ Butylene Glycol, 80％ Butylene Glycol용매에 의한 초음파 추출 및 열수추출, 70％에탄올 추출, Isopropyl Alcohol 추출은 MMP-1 생합성 억제 효과가 50％ Butylene Glycol 보다는 미비함을 알 수 있었다.

화장료 조성물의 제조

본 발명의 연 캘러스 배양 추출물을 함유하는 항노화 화장료의 제형은 임의로 선택할 수 있으며, 종래의 화장료 제형인 스킨토너, 클렌징크림, 에멀젼, 크림, 에센스, 아이크림 등 여러 가지 형태로 제조할 수 있다.

[제형예 1] 스킨 토너

하기에 기재된 조성으로 연 캘러스 배양 추출물을 함유하는 스킨토너를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

[제형예 2] 클렌징 크림

하기에 기재된 조성으로 연 캘러스 배양 추출물 함유하는 클렌징 크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

[제형예 3] 에멀젼

하기에 기재된 조성으로 연 캘러스 배양 추출물을 함유하는 에멀젼을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

[제형예 4] 영양 크림

하기에 기재된 조성으로 연 캘러스 배양 추출물을 함유하는 영양 크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

[제형예 5] 에센스

하기에 기재된 조성으로 연 캘러스 배양 추출물을 함유하는 에센스를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

[제형예 6] 아이크림

하기에 기재된 조성으로 연 캘러스 배양 추출물을 함유하는 아이크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

100: 고주파 세포 배양기 200: 바이오 리액터
210: 케이스 211: 주입구
212: 고주파 장착부 220: 상부 덮개
230: 고주파 단자 231: 단자부
232: 밀봉부재 233: 연결선
240: 수평 지지판 241: 고정공
250: 고정봉 260: 완충부재
300: 고주파 공급기 310: 조작부
320: 표시부 330: 레벨메타
400: 공기 공급기 420: 배출구
440: 공기 호스 500: 진동기록기
510: 진동 조작부 520: 진동 표시부
530: 연결선

Claims (6)

1. 연 (Nelumbo nucifera) 캘러스 추출물을 함유하는 항노화 화장료 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 연 캘러스 추출물은 초음파 추출물인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 연 캘러스 초음파 추출물은 알코올 용매로 이용한 추출물인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 연 캘러스 초음파 추출물은 부틸렌 글리콜 용매로 한 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 피부 주름 개선 또는 방지용인 것을 특징으로 하는 조성물.
6. (a) 연 종자로부터 캘러스를 유도하여 배양하는 단계; 및 (b) 상기 캘러스 배양물을 초음파 추출하여 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 연 캘러스 추출물을 함유한 항노화 화장료 조성물의 제조 방법.

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