KR20150050712A - 갈색거저리 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 갈색거저리 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 항암효과를 갖는 갈색거저리 분획물의 제조방법은, 동결건조된 갈색거저리를 분쇄시키는 제1단계, 상기 제1단계에서 분쇄된 갈색거저리와 용매를 혼합하여 갈색거저리 추출액을 제조하는 제2단계, 상기 제2단계에서 제조된 갈색거저리 추출액에 물과 헥산(hexane)으로 이루어진 용매를 첨가하여 혼합한 후 헥산층(hexane)만을 분리해 내는 제3단계, 상기 제2단계에서 제조된 상기 갈색거저리 추출액에 물과 에틸아세테이트로(EtOAc)로 이루어진 용매를 첨가하여 혼합한 후 에틸아세테이트로(EtOAc)만을 분리해 내는 제4단계를 포함하는 것이 특징이다.
본 발명에 의해, 갈색거저리 추출물, 또는 이들의 분획물을 유효성분으로 포함하여, 항암용 조성물이 제공된다.

Description

갈색거저리 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물{Composition for anticancer comprising extract of Tenebrio molitor or its fraction as effective component}

본 발명은 갈색거저리 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 갈색거저리를 암을 예방 및 치료를 위한 약학 조성물로 사용할 수 있을 뿐 아니라 식품류 및 차 등의 식품조성물로서도 유용하게 사용가능하도록 한 갈색거저리 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다.

환경의 악화와 노년인구의 증가로 세계 암 발생률이 매년 5%이상 증가하고 있으며, 1997년 암을 원인으로 한 사망자가 600만 명으로 세계 사망률의 12%에 달했다. 국내에서도 매년 10만 명의 암환자가 새롭게 발생하고 5만여명이 매년 사망하고 있으며, 암환자 증가율도 10%에 이르고 있다. 1999년 국립암센터의 통계에 따르면 환자는 12만 명으로서 남자는 위암(24%), 간암(16%), 폐암(16%), 대장암(10%)의 순서이며, 여자는 위암(16%), 자궁경부암(12%), 유방암(15%), 대장암(10%)의 순서로 암 환자가 발생했다.

이러한 암의 치료를 위해서는 외과적 수술요법, 화학요법, 생물요법, 방사선요법 등이 이용되고 있다. 화학요법은 흔히 말하는 약물요법으로서 핵산 알킬화제, 대사 길항제, 천연물, 호르몬제 등의 합성된 화학물질을 이용한 것이며, 생물요법은 우리 몸이 원래 가지고 있는 면역 기능을 회복시키거나 증진시켜 암세포의 활동력을 약화시킴으로써 암의 진행을 막는 것으로서, 사이토카인, 면역요법제, 유전자 치료제, 암백신, 신생혈관형성 억제제 등이 있다. 현재까지는 이러한 방법들을 단독 혹은 병용하여 치료에 응용하고 있으나 부작용, 약제내성, 재발 등으로 완벽한 치료법이 없는 상태이다.

지금까지 항암제 연구는 암세포처럼 세포분열이 왕성한 조직에 대한 세포독성을 근거로 하여 행하여지기 때문에 세포분열이 빠른 피부, 점막, 골수 같은 정상조직 세포에도 독성을 나타내게 된다. 따라서 효과적인 항암제 개발을 위해서는 암세포에만 특이적으로 작용하고 정상세포에 대해서는 독성이 적은 항암 활성물질의 탐색이 이루어져야 한다. 현재 식물과 미생물 등에서 추출한 항암물질에 대한 연구가 많이 진행되고 있으나, 이들 대부분이 미생물의 2차 대사산물이거나 생약재에서 추출된 물질에 관한 연구가 주를 이루고 있다.

관련 선행기술로는 한국공개특허 10-2005-0051180호 "밀리타리스 동충하초 추출물을 함유하는 항암용 조성물"에 관한 것이 공개되어 있다.

그러나, 아직까지는 곤충을 대상으로 유효성분을 추출해 내어 이를 포함하는 항암용 조성물에 대해서는 알려진 바가 없다.

본 발명의 목적은 여러 곤충들 중 갈색거저리를 대상으로 에탄올로 추출한 추출물 및 이의 분획물이 항암효과를 나타냄으로서 이를 통하여 상기 갈색거저리의 다양한 유용성을 밝히는데 그 목적이 있다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 항암용 약학적 조성물은 암예방 및 치료효과를 나타내는 갈색거저리(Tenebrio molitor) 추출물 또는 갈색거저리(Tenebrio molitor) 추출물 유래 분획물을 유효성분으로 함유하는 것이 특징이다.

또한, 본 발명의 식품 조성물은 암예방 및 치료효과를 나타내는 갈색거저리(Tenebrio molitor) 추출물 또는 갈색거저리(Tenebrio molitor) 추출물 유래 분획물을 유효성분으로 함유하는 것이 특징이다.

상기 갈색거저리 추출물은 갈색거저리 에탄올 추출물인 것이 특징이다.

상기 분획물은 상기 갈색거저리를 에탄올로 추출한 후 이를 분획하여 얻은 헥산(hexane)분획물 또는 에틸아세테이트(EtOAc)분획물 중 어느 하나 이상으로 이루어진 것이 특징이다.

상기 암은 전립선암, 자궁암, 간암, 직장암, 폐암, 유방암, 및 난소암 중 선택된 1종이상인 것이 특징이다.

본 발명의 항암효과를 갖는 갈색거저리 분획물의 제조방법은, 동결건조된 갈색거저리를 분쇄시키는 제1단계, 상기 제1단계에서 분쇄된 갈색거저리와 용매를 혼합하여 갈색거저리 추출액을 제조하는 제2단계, 상기 제2단계에서 제조된 갈색거저리 추출액에 물과 헥산(hexane)으로 이루어진 용매를 첨가하여 혼합한 후 헥산층(hexane)만을 분리해 내는 제3단계, 상기 제2단계에서 제조된 상기 갈색거저리 추출액에 물과 에틸아세테이트로(EtOAc)로 이루어진 용매를 첨가하여 혼합한 후 에틸아세테이트로(EtOAc)만을 분리해 내는 제4단계를 포함하는 것이 특징이다.

상기 제2단계의 갈색거저리 추출액은 상기 용매 12ℓ당 상기 분쇄된 갈색거저리 1∼2kg을 혼합시키는 것이 특징이다.

상기 제2단계의 상기 용매는 90~95% 에탄올인 것이 특징이다.

본 발명에 의해, 갈색거저리 추출물, 또는 이들의 분획물을 유효성분으로 포함하여, 항암용 조성물이 제공된다.

도 1은 본 발명의 실시예 2에 따른 갈색거저리 추출물 유래 분획물 획득 도식을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1의 갈색거저리 에탄올 추출물의 세포독성 활성을 나타낸 도면이다.
A; 암세포에서 에탄올 추출물의 세포독성 활성
(SK-HEP-1 과 Hep3B 세포를 24시간 동안 지시된 농도에서 처리한 후 MTT에 의해 분석)
B; Cardiomyocyte에서 에탄올 세포독성 활성
(분리된 마우스 cardiomyocyte는 24시간 동안 지시된 농도에서 처리한 후, MTT에 의해 분석)
C; Hepatocyte에서 에탄올 세포독성 활성
(분리된 마우스 Hepatocyte는 24시간 동안 지시된 농도에서 처리한 후, MTT에 의해 분석)
도 3은 본 발명의 실시예 2의 갈색거저리 추출물 유래 분획물인 헥산분획물 및 에틸아세테이트분획물의 항암활성을 나타낸 도면이다.
A; 분획물들의 세포독성 활성
(헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물을 간암세포주인 SK-HEP-1(left)과 Hep3B(right)에서 24시간 동안 지시된 농도로 배양한 후, MTT에 의해 분석)
B; 본 발명의 실시예 2의 헥산과 에틸아세테이트 분획물의 세포독성 활성
(헥산과 에틸아세테이트는 다양한 인간암세포인 전립선암세포 (PC3, CWR22Rv), 자궁암세포 (HeLa), 간암세포(PCL/PRF5, HepG2, Hep3B, and SK-HEP-1), 직장암세포(HCT116), 폐암세포(NCI-H460), 유방암세포(MDA-MB-231), 그리고 난소암세포(SK-OV3)에서 24시간 동안 2mg/ml의 농도로 처리한 후, MTT에 의해 분석)
C; primary culture cells에서 분획물들의 효과
(마우스 심장과 간에서 분리한 cardiomyocyte 와 hepatocyte는 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물로 24시간 동안 지시된 농도로 배양한 후, MTT에 의해 분석)
도 4는 분획물들의 생화학적 분석결과를 나타낸 도면이다.
A; SK-HEP-1 의 FACS 분석
(2mg/ml의 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물은 24시간 동안 배양한 후, 이 세포들은 Sytox 와 Annexin V로 표지하였고 flow cytometry로 분석)
B; Hep3B 의 FACS 분석
(1mg/ml의 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물은 24시간 동안 배양한 후, 이 세포들은 상기 도 4A와 같은 방법으로 분석)
C; 자식작용 유도
(분획물들은 SK-HEP-1 과 Hep3B에서 지시된 농도로 24시간 동안 배양한 후, Western blotting 방법으로 분석)
도 5는 in vivo에서 종양증식 억제능을 나타낸 도면이다.
A; in vivo 에서 헥산의 항암활성
(SK-HEP-1는 누드마우스에 심어져, 종양크기는 180mm³쯤 도달했을 때 헥산과 DMSO vehicle을 복강투여를 통해 주입)
B; 종양 부피
(첫번 째 투여 25일 후에 종양 부피는 캘리퍼로 측정 및 계산)
C; 마우스 무게 변화
(마우스 몸무게는 실험 종료까지 측정 및 기록)

이하, 본 발명을 상세하게 설명하며, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 상세한 설명은 생략한다.

본 발명에서는 통상적으로 간질환에 효과가 있다고 알려진 갈색거저리(Tenebrio molitor)이 항암 효과를 가진다는 것을 확인하고자 한다.

설명하면, 갈색거저리가 간 질환에 효과가 있다는 민간요법이 알려지면서 이를 건강보조용 약재로 이용하는 경향이 증가 되고 있다. 그러나 갈색거저리가 민간요법에서 널리 이용되는데 비해 이의 생리기능성에 대한 연구 자료는 매우 미흡한 실정이며, 특히 현재 갈색거저리를 이용한 항암효과에 관한 보고는 전무한 실정이다.

이에 본 발명의 발명자는 상기와 같은 갈색거저리를 천연물질을 유효성분으로 하는 것으로 부작용의 문제가 발생되지 아니하여 암을 치료 하고 또는 예방하기 위하여도 널리 사용할 수 있을 것으로 판단하였다.

암 중 특히, 간암(Hepatocellular carcinoma, HCC)은 6번째로 흔하게 진단되어지는 악성종양으로서, 암으로 인한 사망률에서는 3번째에 랭크되어 있는 질환이다.

현재, HCC에 대한 주요한 치료기법으로는 외과적인 수술, 간이식, 부분절제 등이 일반적으로 사용되고 있으나, 많은 경우의 진행된 HCC에 대해서는 뚜렷한 치료법이 없는 상황이다. 더욱이, HCC를 치료하기 위해 활용할 수 있는 약효가 좋은 항암치료제가 없는 실정으로, sorafenib이 HCC치료에 제한적인 약효임에도 불구하고 처방되고 있다.

이에 본 발명에서는 상기 문제점을 해소하기 위해 여러 연구한 결과, 천연물질 중 특히 통상적으로 간질환에 효과가 있다고 알려진 갈색거저리(Tenebrio molitor)가 항암효과를 가진다는 것을 확인하고자 한다.

이에 본 발명은 상기 문제점을 해소하기 위해 여러 연구한 결과, 천연물인 갈색거저리의 에탄올 추추물 및 이의 분획물인 헥산추출물과 에틸 아세테이트 분획물의 경우 우수한 항암 효과를 나타냄을 확인하였다.

설명하면, 갈색거저리 에탄올(EtOH) 추출물에서 암세포에 대한 항암활성과 더불어 정상세포에 대한 특히 심장세포에 대한 독성도 확인하였으며, 이런 독성을 제거하면서 항암활성을 확보하고자, 헥산(hexane), 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 부탄올(BuOH), 물(water)로 추가로 분획물을 확보하였다.

그 결과, hexane 분획물에서 상대적으로 강한 항암활성을 확인하였으며, 특히 암세포들에서는 광범위하게 독성을 보이는 반면에 심장세포에서의 독성은 현저하게 감소함을 확인하였다. 따라서 갈색거저리 에탄올 추출물에서 분리한 hexane 분획물은 항암활성은 유지하면서 원치않는 독성을 줄인 분획물임을 확인하였다.

또한, 동물실험(in vivo)에서 마우스 이종이식(mouse xenograft) 모델을 활용하여 항암효능을 검증한 바, 주어진 실험조건에서 암세포를 완벽하게 죽이지는 못하나 눈에 띄는 독성없이 암세포의 성장을 현저하게 감소시킴을 확인하였다.

또한, Ethyl acetate 분획물의 경우, hexane 분획물 보다는 다소 떨어지지만 이 또한 항암활성을 나타내었으며 특히 hexane 분획물 및 다른 추출물들에 비해서 자가소화작용(autophagy) 유도활성이 높은 분획물임을 확인하였다.

이와 같이 갈색거저리 추출물 및 이의 분획물이 항암활성이 실제로 존재함을 생화학적, 세포생물학적 분석방법 및 동물 모델에서 확인함으로써, 향후 항암활성을 가진 물질을 분리할 수 있는 가능성이 있으며, 특히 갈색거저리 추출물의 분획물의 autophagy 유도 활성을 확인함으로써, 세포죽음조절 뿐만 아니라 세포보호 효과를 줄 수 있는 활성물질을 분리할 수 있는 가능성을 제시할 수 있어 갈색거저리 추출물 및 이의 분획물은 항암용 조성물로써의 소재로 사용이 충분함을 알 수 있다.

이에, 본 발명인 항암 효과를 갖는 갈색거저리의 분획물의 제조방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

1. 제 1단계; 갈색거저리 분쇄

본 발명은 갈색거저리(Tenebrio molitor)를 준비한다.

상기 갈색거저리(Tenebrio molitor)는 딱정벌레목 거저리과의 곤충으로, 갈색쌀거저리 라고도 불리며 한국을 비롯하여 전 세계에 분포한다. 알, 유충, 번데기, 성충의 시기를 거치는 완전변태를 하는 곤충이며 현재 국내에 대량생산하고 있는 사육농가가 형성되어져 있다. 유충기간은 약 10주이나 인공 사육할 때에는 약 2주 정도이다.

갈색거저리는 다른 곤충들과 달리 변태기간이 비교적 짧기 때문에 애완용으로 많이 사육되며, 갈색거저리의 유충은 밀웜(mealworm)이라 하여 먹이곤충으로 이용되는데 이는 동물 중에서 단백질 함량이 높고 성장이 빠르며 번식률이 매우 높은 것으로 알려져 있다.

이러한 상기 갈색거저리(Tenebrio molitor)는 항암효과를 나타내는 유효성분이 최대로 함유되어 있는 갈색거저리를 사용하는 것이 좋다.

본 단계에서는 상기 준비된 갈색거저리(Tenebrio molitor)를 건조한 다음 분쇄하여 분말형태로 제조한다.

다시말해, 상기 갈색거저리(Tenebrio molitor)에는 다량의 수분이 함유되어 있기 때문에 수분이 완전히 없는 상태로 만들기 위해서는 건조과정을 거쳐야 한다. 이때, 상기 갈색거저리가 함유하고 있는 유효성분들의 변화를 최소화시키기 위해 동결건조를 통해 건조를 하는 것이 좋다.

그 다음 하기 추출의 용이성을 위해 상기 건조된 갈색거저리는 분쇄기를 이용하여 분말형태로 제조된다.

2. 제 2단계; 갈색거저리(Tenebrio molitor) 추출액 제조

본 단계에서는 상기 제조한 갈색거저리(Tenebrio molitor) 분말을 용매에 추출한 후 감압농축하여 갈색거저리 추출물을 제조한다.

이때, 상기 용매 12ℓ당 상기 분쇄된 갈색거저리 1∼2kg을 혼합하는 것이 좋으며, 사용된 용매로는 에탄올을 사용하는 것이 좋으며, 이 에탄올은 어떠한 것을 사용하여도 무관하나, 갈색거저리 내에 함유된 유효성분을 가장 적절히 추출할 수 있도록 90~95%의 에탄올을 사용하는 것이 좋다.

상기 갈색거저리 분말은 에탄올에 완전히 침지시킨 다음 이를 230~270rpm으로 실온(20~25℃)에서 추출한 후 감압농축하여 추출물을 제조할 시 단시간에 갈색거저리의 유효성분이 다량 함유된 추출물을 제조하게 된다.

3. 제 3, 4단계; 갈색거저리 분획물 제조

본 단계에서는 상기 갈색거저리 에탄올 추출물을 물(H₂0)과 헥산(Hexane) 또는 물(H₂0)과 에틸아세테이트(EtOAc)로 이루어진 용액으로 각각 분획하여 감압 농축한 후 헥산(Hexane)층 또는 에틸아세테이트(EtOAc)층으로 이루어진 갈색거저리 분획물을 획득한다.

이때, 상기 갈색거저리 에탄올 추출물에는 물(H₂0)과 헥산(Hexane)으로 이루어진 용액 또는 물(H₂0)과 에틸아세테이트(EtOAc)로 이루어진 용액을 넣되 동일한 비율로 첨가하는 것이 좋다.

이렇게 제조된 상기 갈색거저리 분획물에는 항암활성을 나타내는 유효성분의 수율이 가장 높게 함유되어 있어(도 1), 보다 경제적으로 항암효과를 나타내는 약학 또는 식품 조성물을 제공할 수 있게 된다.

이하, 본 발명인 항암 효과를 나타내는 갈색거저리(Tenebrio molitor)의 추출물 및 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물 또는 식품 조성물에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

설명하면, 본 발명에는 상기 갈색거저리(Tenebrio molitor) 추출물, 또는 이들의 분획물이 항암용 약학조성물의 유효성분으로 포함된다.

이때, 상기 갈색거저리(Tenebrio molitor) 추출물 또는 이의 분획물은 상기 약학조성물 전체 중량을 기준으로 0.01~50중량% 함유되는 것이 좋으며, 더욱 바람직하게는 0.1~20중량%를 함유하는 것이 좋다. 이는 상기 갈색거저리(Tenebrio molitor) 추출물 또는 이의 분획물이 0.01 중량%미만으로 함유되는 경우 항암효과가 떨어져 본 발명이 목적하는 항암용으로 사용하기 적합하지 않으며, 50 중량%를 초과하여 함유되는 경우 오히려 사용되는 유기용제로 인한 악영향이 발생될 우려가 있다.

이러한 상기 본 발명의 약학 조성물은 암 예방 및 치료를 목적으로 항암효과를 갖는 천연물의약품에 함유될 수 있다. 이때 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

이때 제형은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 중 어느 하나의 형태로 구성되며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수도 있다. 즉, 이는 사용 목적에 따라서 당업자가 어려움 없이 선정하여 이루어질 수 있으며, 그 첨가량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위내에서 선택될 수 있음을 의미한다.

상기 약학적으로 허용되는 담체로는 제제 할 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하며, 또한, 약학적으로 허용되는 부형제로는 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또 다른 관점에서의 본 발명에서는 상기 갈색거저리(Tenebrio molitor) 추출물 또는 이의 분획물을 암 예방 및 개선용을 목적으로 식품 조성물의 유효성분으로 포함한다. 즉, 갈색거저리(Tenebrio molitor) 추출물 또는 이의 분획물을 식품 조성물의 유효성분으로 사용할 경우, 상기 그대로 사용하거나 다른 통상의 식품 조성물의 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품용 조성물 제조시에는 유효성분의 원료에 대하여 0.01 ~ 10 중량부, 바람직하게는 0.05 ~ 1 중량부의 양으로 첨가된다.

그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

이러한 상기 식품용 조성물은 암 예방 및 개선을 위한 목적으로 건강식품에 함유될 수 있으며 그 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

상기 외에 본 발명의 상기 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육으로 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하에서는 실시예 및 실험예를 들어 본 발명에 관하여 더욱 상세하게 설명할 것이나, 이들 실시예 및 실험예는 단지 설명의 목적을 위한 것으로 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

< 실시예 1> 본 발명의 항암 효과를 갖는 갈색거저리 추출물 제조

먼저, 최대 성장단계의 갈색거저리를 동결건조하여 수분이 완전히 제거된 상태의 건조물을 분쇄하여 얻은 갈색거저리 분말을 준비하였다.

갈색거저리 분말 1.2kg을 95%의 에탄올(EtOH) 12L에 완전히 침지시켰다.

그 다음 250rpm, 23℃에서 7일동안 2회반복하여 추출한 후, 감압농축하여 갈색거저리 에탄올 추출물을 제조하였다.

<실시예 2> 본 발명의 항암 효과를 갖는 갈색거저리 추출물 유래 분획물 제조

상기 실시예1에서 제조한 갈색거저리 에탄올 추출물을 분비하였다.

이렇게 준비된 갈색거저리 에탄올 추출물 379.66g을 물(H₂0)과 헥산(Hexane), 물(H₂0)과 에틸아세테이트(EtOAc)로 이루어진 용액으로 각각 분획하였다.

그 다음 분획깔대기를 이용하여 헥산(Hexane), 에틸아세테이트(EtOAc)로 이루어진 층을 분리하여 감압농축한 후 각각의 갈색거저리 분획물을 제조하였다(도 1).

<실시예 3> 본 발명의 항암 효과를 갖는 갈색거저리 분획물을 포함하는 정제 제조

실시예 2의 갈색거저리 헥산 분획물...........200 ㎎

유당........................................100 ㎎

전분........................................100 ㎎

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다

<실시예 4> 본 발명의 항암 효과를 갖는 갈색거저리 분획물을 포함하는 건강식품 제조

실시예 2의 갈색거저리 에틸아세테이트 분획물...1000 ㎎

비타민 혼합물..............................적량

비타민 A 아세테이트........................70 ㎍

비타민 E..................................1.0 ㎎

비타민 B1.................................0.13 ㎎

비타민 B2.................................0.15 ㎎

비타민 B6.................................0.5 ㎎

비타민 B12................................0.2 ㎍

비타민 C..................................10 ㎎

비오틴....................................10 ㎍

니코틴산아미드...........................1.7 ㎎

엽산......................................50 ㎍

판토텐산 칼슘............................0.5 ㎎

무기질 혼합물............................적량

황산제1철...............................1.75 ㎎

산화아연................................0.82 ㎎

탄산마그네슘............................25.3 ㎎

제1인산칼륨..............................15 ㎎

제2인산칼슘..............................55 ㎎

구연산칼륨...............................90 ㎎

탄산칼슘................................100 ㎎

염화마그네슘............................24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

< 실험예 1> 본 발명의 갈색거저리 추출물 또는 이의 분획물에서의 항암활성 확인

1. 실험방법

1) 세포생존능과 세포사멸유도의 분석

세포(5×10³cells/well)는 96 웰 플레이트(well plate)에서 하루 정도 배양하고 24시간 동안 지시된 농도에서 상기 실시예 1에서 제조된 갈색거저리 추출물 및 실시예 2에서 제조된 갈색거저리 추출물 유래 분획물들을 처리하였다.

세포생존능을 측정하기 위해 세포는 MTT에 노출하였고 그 후 결정화된 포르마잔(formazan)은 마이크로플레이트 리더기(Infinity M200 microplate reader)를 이용하여 595nm에서 흡광도를 측정함으로써 정량화하였다.

흡광도 값은 vehicle 대조군과 비교하여 세포생존을 백분율로 표현하였다.

양자택일로, 상기 추출물 또는 분획물들을 처리한 후에 세포의 DNA양(propidium iodide, red 파장) 그리고 카스파제(caspase) 활성(DEVDase 활성, green 파장)은 Millipore회사의 CaspaTag in situ apoptosis detection kit를 이용하여 분석하였다.

표지된 세포는 FACS CaliburTM system으로 분석하였다. 데이터는 FlowJo software로 처리하였다.

2) 마우스 이종이식 모델

동물실험은 UNIST에서 승인하였다. 멸균된 PBS에 부유한 SK-HEP-1(1×10⁷)세포는 6주된 누드마우스 양쪽 측면에 피하주사 하였고 평균 약 180 mm³부피로 자랄 때까지 두었다.

마우스는 무작위 두 그룹으로 나누었다(2개의 종양/마우스, 3마리/그룹).

PBS에 녹인 20% 크레모포르(Cremophor) EL로 용해시킨 헥산 분획물 또는 DMSO는 복막 내에 투여하였다.

마우스는 15일 동안 1g/kg의 헥산 분획물을 투여하였다.

종양은 캘리퍼로 매일 측정하고 종양 부피는 공식(부피=1/2X(너비)²×길이)을 사용하여 계산하였다.

2. 실험결과

1) 실시예 1에서 제조된 갈색거저리 에탄올 추출물의 세포독성 활성확인

갈색거저리의 항암활성을 생화학적으로 확인하기 위해서 상기 실시예1에서 제조된 추출물을 냉동건조하였다.

이 추출물은 암세포에 선택적으로 세포독성활성을 가지는지를 평가하기 위해서 인간 간암세포주인 SK-HEP-1, Hep3B와 마우스의 기본적인 간세포(primary hepatocytes), 심장근육세포(cardiomyocytes)에 처리하였다.

그 결과 도 2A에 나타나 있듯이, SK-HEP-1, Hep3B에 대한 세포독성은 0.4 mg/ml 와 2 mg/ml 농도에서 50% 이상의 세포 치사를 나타내었다.

또한, 심장이나 간에서의 독성 부작용을 평가하기 위해서 마우스로부터 primary hepatocytes, cardiomyocytes를 분리하였다.

그 결과 도 2B에 나타나 있듯이, Cardiomyocyte는 0.5 mg/ml의 농도에서 완벽하게 죽었음을 확인하였다.

또한. 도 2C에 나타나 있듯이, primary hepatocytes는 2 mg/ml에서 추출물의 영향이 미미하게 나타남을 확인하였다.

따라서 본 발명의 실시예 1의 갈색거저리 에탄올 추출물은 암세포와 cardiomyocytes 둘 다에서 세포죽음을 유도할 수 있는 세포독성 성분을 포함하고 있음을 알 수 있었다.

2) 실시예 2에서 제조된 헥산분획물의 다양한 암세포대한 세포독성 활성확인

상기 1)의 결과를 토대로, 갈색거저리 에탄올 추출물이 암세포 특이적 또는 비특이적으로 세포 독성 성분을 가지고 있는 혼합물인지 예측되는 바, 이에 상기 실시예 1의 에탄올 추출물을 액체-액체 분배방법을 이용하여 비특이적인 구성성분을 제거하기 위해서 실시예 2의 분획과정을 토대로 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물을 사용하여 분획물들을 획득하였다.

그 결과 도 1에 나타나 있듯이, 에탄올 추출물 379.66g으로부터 313.90g의 헥산, 0.78g의 에틸아세테이트, 24.80g의 부탄올 그리고 24.80g 물을 얻었다.

또한, 도 3A에 나타나 있듯이, 헥산과 에틸아세테이트 추출물은 인간간암세포주인 SK-HEP-1, Hep3B에서 농도에 의존적으로 세포 생존율을 감소시켰음을 확인하였다. 대조적으로 부탄올과 물은 가장 높은 농도(2mg/ml)에서 암세포 생존율에 미미한 영향을 보여주었다.

이에, 도 3B에 나타나 있듯이, 다양한 인간암세포인 전립선암세포 (PC3, CWR22Rv), 자궁암세포 (HeLa), 간암세포(PCL/PRF5, HepG2, Hep3B, and SK-HEP-1), 직장암세포(HCT116), 폐암세포(NCI-H460), 유방암세포(MDA-MB-231), 그리고 난소암세포(SK-OV3)에 헥산과 에틸아세테이트의 세포독성활성을 확인하였다

그 결과, 전체적으로 헥산은 에틸아세테이트보다 더 강한 세포독성활성을 보여주었다.

또한, 도 3C에 나타나 있듯이, 암세포에서의 독성효과와는 반대로 헥산과 에틸아세테이트는 cardiomyocyte와 hepatocyte의 생존능에 확연하게 영향이 없었다.

이에, 에탄올 추출물로부터 90%이상의 가장 높은 수득율로 획득한 헥산 추출물이 암세포에서 세포독성활성을 잃지 않는 에탄올 추출물만큼 비선택적인 독성요소로 작용할 것임을 알 수 있었다.

3) 세포죽음 유도에서 헥산의 작용 메커니즘 확인

분획물들의 세포독성활성의 메커니즘을 더 관찰하기 위해서 간암세포인 SK-HEP-1에 각 분획물을 2mg/ml로 처리하여 세포자살 유도와 세포죽음을 평가하기 위해서 AnnexinV 와 Sytox로 분석하였다.

그 결과 도 4A에 나타나 있듯이, MTT 결과와 마찬가지로 헥산을 처리한 SK-HEP-1에서 세포자살이 유도된 죽은 세포 군집(Sytox and Annexin V double positive)이 90%이상 증가함을 확인하였다.

이에 반해 도 4B에 나타나 있듯이, Hep3B에서는 세포괴사가 유도된 군집(sytox positive and Annexin V negative)과 세포자살이 유도된 군집이 증가하였음을 확인하였다.

이런 이질적인 세포죽음 유도는 세포 종류와 헥산에 의한 세포 항상성 경로의 복합적인 변화에 의존적인 것임을 의미한다.

이에 도 4A와 도 4B에 나타나 있듯이, 에틸아세테이트, 부탄올, 물에서도 SK-HEP-1과 Hep3B 둘 다 지시된 농도에서 세포죽음 유도에 미미한 영향을 보여줌을 확인하였다.

또한, 세포 죽음의 방식을 좀 더 이해하기 위해서 자식작용의 생물지표인 미소관과 연관되어있는 단백질 light chain 3 (LC3)[,]의 phosphatidylethanolamine (PE) 활용으로 분석하였다.

그 결과, 도 4C에 나타나 있듯이 EA분획은 두 개의 암세포에서 LC3가 PE에 의해 LC3-II 형태로 강하게 유도되었고, 헥산은 SK-HEP-1에서만 LC3-II 형태가 유도되었다.

종합적으로 헥산은 세포자살, 세포괴사, 자식작용을 유도하는 활성요소를 포함하는 반면 에틸아세테이트는 강한 자식작용의 유도인자임을 확인할 수 있었다.

4) in vivo 에서 헥산의 항암활성 확인

in vivo 에서 헥산의 항암활성을 이해하기 위해서 우리는 간암세포주인 SK-HEP-1을 심은 누드 마우스를 사용하였다.

그 결과 도 5A에 나타나 있듯이, 종양 증식은 헥산을 매일 복강 투여하는 동안 확연하게 감소하였다. 또한, 헥산은 암세포를 완전하게 죽이지는 않았지만, 헥산 투여 중단 즉시 나타나는 증식의 재발로 고려되는 종양 증식을 억제하였다.

또한, 도 5B와 5C에 나타나 있듯이, 헥산은 DMSO와 헥산 사이에 마우스 몸무게의 변화가 없는 것으로 보아 마우스에서 확연하게 독성효과 없이 항 종양활성을 나타냄을 확인하였다.

이와 같이 본 발명의 갈색거저리(Tenebrio molitor) 추출물 또는 이의 분획물은 항암활성을 나타냄으로써 이들을 유효성분으로 포함하여, 항암효과를 갖는 항암용 조성물 제공이 가능함을 알 수 있다.

상기의 본 발명은 바람직한 실시예를 중심으로 살펴보았으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 실시예들을 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (13)

1. 암예방 및 치료효과를 나타내는 갈색거저리(Tenebrio molitor) 추출물 또는 갈색거저리(Tenebrio molitor) 추출물 유래 분획물을 유효성분으로 함유하는,
   항암용 약학 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 갈색거저리 추출물은 갈색거저리 에탄올 추출물인 것이 특징인,
   항암용 약학 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 분획물은 상기 갈색거저리를 에탄올로 추출한 후 이를 분획하여 얻은 헥산(hexane)분획물 또는 에틸아세테이트(EtOAc)분획물 중 어느 하나 이상으로 이루어진,
   항암용 약학 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 암은 전립선암, 자궁암, 간암, 직장암, 폐암, 유방암, 및 난소암 중 선택된 1종 이상인 것이 특징인,
   항암용 약학 조성물.
   
5. 암예방 및 개선효과를 나타내는 갈색거저리(Tenebrio molitor) 추출물 또는 갈색거저리(Tenebrio molitor) 추출물 유래 분획물을 유효성분으로 함유하는,
   식품 조성물.
   
6. 제5항에 있어서,
   상기 갈색거저리 추출물은 갈색거저리 에탄올 추출물인 것이 특징인,
   식품 조성물.
   
7. 제5항에 있어서,
   상기 분획물은 상기 갈색거저리를 에탄올로 추출한 후 이를 분획하여 얻은 헥산(hexane)분획물 또는 에틸아세테이트(EtOAc)분획물 중 어느 하나 이상으로 이루어진,
   식품 조성물.
   
8. 제5항에 있어서,
   상기 암은 전립선암, 자궁암, 간암, 직장암, 폐암, 유방암, 및 난소암 중 선택된 1종 이상인 것이 특징인,
   식품 조성물.
   
9. 동결건조된 갈색거저리를 분쇄시키는 제1단계;
   상기 제1단계에서 분쇄된 갈색거저리와 용매를 혼합하여 갈색거저리 추출액을 제조하는 제2단계;
   상기 제2단계에서 제조된 갈색거저리 추출액에 물과 헥산(hexane)으로 이루어진 용매를 첨가하여 혼합한 후 헥산층(hexane)만을 분리해 내는 제3단계;
   상기 제2단계에서 제조된 상기 갈색거저리 추출액에 물과 에틸아세테이트로(EtOAc)로 이루어진 용매를 첨가하여 혼합한 후 에틸아세테이트로(EtOAc)만을 분리해 내는 제4단계;를 포함하는,
   항암효과를 갖는 갈색거저리 분획물의 제조방법.
   
10. 제9항에 있어서,
    상기 제2단계의 갈색거저리 추출액은 상기 용매 12ℓ당 상기 분쇄된 갈색거저리 1∼2kg을 혼합시키는 것을 특징으로 하는,
    항암효과를 갖는 갈색거저리 분획물의 제조방법.
    
11. 제9항에 있어서,
    상기 제2단계의 상기 용매는 90~95% 에탄올인 것을 특징으로 하는,
    항암효과를 갖는 갈색거저리 분획물의 제조방법.
    
12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 갈색거저리 분획물을 유효성분으로 포함하는, 항암용 조성물.
    
13. 제12항의 항암용 조성물은 전립선암, 자궁암, 간암, 직장암, 폐암, 유방암, 및 난소암 중 선택된 1종 이상의 예방 및 개선용 식품 조성물 또는 전립선암, 자궁암, 간암, 직장암, 폐암, 유방암, 및 난소암 중 선택된 1종 이상의 예방 및 치료용 약학 조성물로 사용되는,
    항암용 조성물의 사용방법.
    
    
    

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