KR20150043937A - 개체의 간암 진단용 조성물, 개체의 간암 진단하는 방법 및 개체의 간암 진단에 필요한 정보를 얻는 방법 - Google Patents
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Abstract
TMED2, CD43, 또는 그 조합에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 개체의 간암 진단용 조성물, 개체의 간암 진단하는 방법 및 개체의 간암 진단에 필요한 정보를 얻는 방법을 제공한다.
Description
개체의 간암 진단용 조성물, 개체의 간암 진단하는 방법 및 개체의 간암 진단에 필요한 정보를 얻는 방법에 관한 것이다.
최근 암 등의 질병 진단에 생검이 불가능하거나 어려운 경우, 혈액, 뇨, 타액과 같은 생물학적 액체 (biological fluid)를 통한 진단의 필요성이 높아지고 있다. 그러나, 정확도 높은 마커의 부재로 인하여 생물학적 액체를 이용한 진단에 어려움이 존재하고 있다. 간암의 경우 알파-페토프로틴 (alpha-fetoproetin: AFP)이 알려져 있지만, 간암 검출에 대한 민감도가 낮고, 간경변 환자에서도 증가하므로 간경변에서 간암으로 병이 진행되는 상황을 모니터링하는데 도움이 되지 않는다.
또한, 생검을 통한 진단의 경우, 절개 등의 침습적 과정으로 인한 환자의 고통이 수반되며 검체 채취시 오류가 발생하면 진단 정확도가 떨어지는 문제점을 지니고 있다.
TMED2 (transmembrane emp24 domain trafficking protein 2)는 사람에서는 TMED2 유전자에 의하여 코딩되는 단백질이다. TMED2는 GORASP1과 GORASP2와 결합하는 것으로 알려져 있다.
CD43 (cluster of differentiation 43)은 시알로포린 (sialophorin), SPN 또는 루코시알린 (leukosialin)이라고도 하며, 사람에서는 SPN 유전자에 의하여 코딩되는 막통과 세포 표면 단백질 (transmembrane cell surface protein)이다. CD43은 사람 T 림프구, 모노사이트, 그라눌로사이트, 및 일부 B 림프구의 표면 상의 주요 시알로글리코단백질이며, 면역기능에 중요한 것으로 보이며, T-세포 활성화에 관여된 생리적 리간드-수용체 복합체의 일부분일 수 있다.
그러나, TMED2, 및/또는 CD43이 간암과 연관된다는 것은 개시된 바 없다.
일 양상은 TMED2, CD43, 또는 그 조합에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는, 개체의 간암 진단용 조성물을 제공한다.
다른 양상은 개체의 간암 진단하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 개체의 간암 진단에 필요한 정보를 얻는 방법을 제공한다.
일 양상은 TMED2, CD43, 또는 그 조합에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는, 개체의 간암 진단용 조성물을 제공한다.
TMED2 (transmembrane emp24 domain trafficking protein 2)는 사람에서는 TMED2 유전자에 의하여 코딩되는 단백질이다. TMED2는 GORASP1과 GORASP2와 결합하는 것으로 알려져 있다. TMED2는 NP_006806의 아미노산 서열 (서열번호 1) 및 NM_006815의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 2)에 의하여 코딩되는 것일 수 있다.
CD43 (cluster of differentiation 43)은 시알로포린 (sialophorin), SPN 또는 루코시알린 (leukosialin)이라고도 하며, 사람에서는 SPN 유전자에 의하여 코딩되는 막통과 세포 표면 단백질 (transmembrane cell surface protein)이다. CD43은 사람 T 림프구, 모노사이트, 그라눌로사이트, 및 일부 B 림프구의 표면 상의 주요 시알로글리코단백질이며, 면역기능에 중요한 것으로 보이며, T-세포 활성화에 관여된 생리적 리간드-수용체 복합체의 일부분일 수 있다. CD43은 NP_001025459의 아미노산 서열 (서열번호 3) 및 NM_001030288의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 4)에 의하여 코딩되는 것일 수 있다.
상기 TMED2, CD43, 또는 그 조합은 마이크로베지클, 예를 들면 생체 유래의 마이크로베지클의 표면에 존재하는 것일 수 있다. 상기 TMED2, CD43, 또는 그 조합은 간암을 가진 개체로부터 분리된 마이크로베지클의 표면에 특이적으로 존재하는 것일 수 있다. 상기 TMED2, CD43, 또는 그 조합은 대조군 시료로부터 분리된 마이크로베지클에 비하여 간암 개체로부터 분리된 시료 중에 더 높은 수준으로 존재하는 것일 수 있다. 상기 대조군은 정상 개체, 간암 이외의 질병, 예를 들면, 간경변을 가진 개체, 또는 그 조합일 수 있다. 따라서, 상기 조성물에 의하면, 정상 개체 또는 간경변 개체로부터 간암 개체를 구분할 수 있다.
마이크로베지클의 분리는 알려진 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 상기 분리는 시료를 원심분리하는 단계, 시료를 여과시키는 단계, 마이크로베지클에 특이적으로 결합할 수 있는 물질 또는 마이크로베지클의 지질 이중층에 끼어들 수 있는 물질을 마이크로베지클와 인큐베이션시키는 단계, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 인큐베이션은 인 비트로에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 마이크로베지클의 분리는 예를 들면 고체 지지체 또는 원심력을 이용한 분리, 밀도구배법, 초원심분리, 여과, 투석, 항체를 이용한 면역친화성 크로마토그래피, 자유유동전기이동법 또는 이들을 혼합한 방법으로 수행될 수 있다. 상기 마이크로베지클에 특이적으로 결합할 수 있는 물질은 마이크로베지클의 표면 단백질, 지질, 또는 당에 결합할 수 있는 물질일 수 있다. 상기 표면 단백질은 CD63, CD83, CD9, 인테그린-베타1 (ITGB1), EpCAM, 카베올린, FasL, HLA-DRA, CD36, CD63, CD81, MUC1, ERBB4, GPER, ERBB2, MLANA, AMHR2, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 마이크로베지클에 특이적으로 결합할 수 있는 물질은 단백질에 결합 친화도를 갖는 물질, 효소의 기질, 조효소, 조절 인자, 수용체와 특이적으로 결합하는 물질, 렉틴, 당, 당단백질, 항원, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 호르몬, 신경 전달물질, 인지질-결합 단백질, 플렉스트린 상동성 도메인 (pleckstrin homology: PH)을 포함하는 단백질, 콜레스테롤-결합 단백질, 또는 이들의 조합일 수 있다. 항원 결합 단편은 항원 결합 부위를 포함하는 것으로, 예를 들면 단일-도메인 항체 (single-domain antibody), Fab, Fab' 또는 scFv일 수 있다. 상기 마이크로베지클의 지질 이중층에 끼어들 수 있는 물질은 친지성 모이어티, 양친매성 모이어티, 양쪽성 이온 모이어티, 또는 이들의 조합을 포함하는 물질일 수 있다. 친지성 모이어티는 예를 들면, 지방산, 스테롤, 또는 글리세리드일 수 있다. 양친매성 모이어티는 예를 들면, 인지질 또는 스핑고리피드일 수 있다. 양쪽성 이온 모이어티는 예를 들면, 술포베타인, 카르복시베타인, 또는 포스포릴콜린일 수 있다. 마이크로베지클에 특이적으로 결합할 수 있는 물질 또는 마이크로베지클의 지질 이중층에 끼어들 수 있는 물질은 고체 지지체와 결합한 것일 수 있다. 상기 고체 지지체는 구형, 다각면체, 플레이트, 선형 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 고체 지지체는 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 자성 입자 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 시료는 개체로부터 유래된 생물학적 물질을 나타낸다. 상기 생물학적 물질은 신선한 또는 보존된 기관 또는 조직 시료 또는 생검 (biopsy)와 같은 고체 조직 (solid tissue); 혈액 또는 혈액 구성성분; 양수 (amniotic fluid), 복수 (peritoneal fluid), 또는 세포간질액 (interstitial fluid)와 같은 체액 (bodily fluid); 세포 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 시료는 보존제, 항응고제, 버퍼, 고정제 (fixatives), 영양성분 (nutrients), 항생제 등과 같은 생물학적 물질과 자연적으로 혼합되어 있지 않은 화합물을 포함할 수 있다. 생물학적 시료는 예를 들면 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈액, 혈장, 혈청, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 시료는 순환 종양 세포 (circulating tumor cell: CTC)를 포함하는 것일 수 있다. 상기 TMED2, CD43, 또는 그 조합에 특이적으로 결합하는 물질은 생체로부터 분리된 마이크로베지클의 표면에 존재하는 TMED2, CD43, 또는 그 조합에 특이적으로 결합하는 물질인 것 일수 있다.
상기 TMED2, CD43, 또는 그 조합에 특이적으로 결합하는 물질은 천연 또는 비천연적으로 상기 TMED2, CD43, 또는 그 조합에 특이적으로 결합하는 물질일 수 있다. 천역적으로 결합하는 물질은 생체 내에서 상기 TMED2, CD43, 또는 그 조합에 특이적으로 결합하는 물질, 예를 들면, 단백질일 수 있다. 상기 TMED2, CD43, 또는 그 조합에 특이적으로 결합하는 물질은 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 리간드, 기질, 저해제, 작용제, 길항제, 보조인자, 또는 그 조합인 것일 수 있다. 상기 항체는 단일클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있다. 상기 항체의 항원 결합 단편은 단일-도메인 항체 (single-domain antibody), Fab, Fab', scFv 또는 그 조합일 수 있다.
상기 TMED2, CD43, 또는 그 조합에 특이적으로 결합하는 물질은 검출가능한 표지가 부착된 것일 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 광학적 표지, 전기적 표지, 방사능 표지, 효소 표지, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 광학적 표지는 형광 또는 인광을 발생시키는 물질일 수 있다. 상기 형광 물질은 예를 들면, 플루오로레신 (fluorescein), 로다민, 시아닌, 금속 포르피린 복합체, Cy-5 및 Cy-3 일 수 있다. 플루오레세인 염료의 예에는, 6-카르복실플루오레세인 (6-FAM) 1, 2',4',1,4,-테트라클로로플루오레세인 (TET) 2, 및 2',4',5',7',1,4-헥사클로로플루오레세인 (HEX) 3, 2',7'-디메톡시-4',5'-디클로로-6-카르복시로다민 (JOE) 4, 2'-클로로-5'-플루오로-7',8'-융합된 페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인 5, 및 2'-클로로-7'-페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인 6이 포함될 수 있다.
상기 TMED2, CD43, 또는 그 조합에 특이적으로 결합하는 물질은 유리 또는 고체 지지체에 고정된 것일 수 있다. 상기 고체 지지체는 나노 또는 마이크로입자일 수 있다. 상기 고체 지지체는 자성 또는 비자성 입자일 수 있다. 상기 고체 지지체는 비드, 구형, 다각형, 플레이트, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 고체 지지체는 특정한 영역에 상기 물질이 고정되어 있는 어레이의 형태를 가질 수 있다.
상기 조성물은 mir-210, mir-346, 또는 그 조합의 발현의 수준을 측정하는데 사용하기 위한 시약을 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 시약은 mir-210, mir-346, 또는 그 조합에 결합하거나, mir-210에 상보적인 뉴클레오티드 서열, mir-346에 상보적인 뉴클레오티드 서열, 또는 그 조합에 결합하는 것일 수 있다. 상기 시약은 천연, 합성, 또는 반합성 물질일 수 있다. 상기 시약은 핵산, 예를 들면, DNA, RNA, DNA-RNA 하이브리드, PNA, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 시약은 mir-210 또는 그 상보서열; 또는 mir-346 또는 그 상보서열에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 또는 이들의 안티센스 서열; 또는 그 조합일 수 있다. 상기 프라이머는 중합효소에 의한 중합 반응에서 중합 개시점을 제공하는 것일 수 있다. 상기 프라이머는 핵산 증폭 반응에서 사용되는 것일 수 있다. 용어 "증폭 (amplification)"은 표적 서열 또는 그의 상보적인 서열의 카피 수를 증가시키는 것을 나타낸다. 상기 핵산 증폭 반응은 당업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 핵산의 증폭은 증폭 동안 복수의 사이클을 필요로 하는 방법 또는 단일 온도에서 수행되는 방법을 포함한다. 순환 방법 (cycling techniques)의 예는 열 순환을 필요로 하는 방법을 포함한다. 열 순환을 필요로 하는 방법은 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 포함한다. PCR은 당업계에 알려져 있다. PCR은 보통 열변성에 의하여 이중가닥 DNA를 단일가닥 DNA으로 변성시키는 단계, 프라이머를 상기 단일가닥 DNA에 어닐링하는 단계; 및 상기 프라이머로부터 상보적 가닥을 합성하는 단계를 포함한다. 등온 증폭 방법은 단일 온도 또는 증폭 과정의 주요 양상이 단일 온도에서 수행되는 방법이다. 이중가닥을 분리하기 위하여 반응 산물을 가열하여 추가적 프라이머가 결합할 수 있도록 하는 PCR과는 대조적으로, 등온 방법은 이중가닥을 분리하고 주형을 재카피하기 위하여 가닥 치환 폴리머라제 (strand displacing polymerase)에 의존한다. 등온 방법은 반복 주형 카피 (reiterative template copying)를 개시하기 위하여 프라이머의 치환에 의존하는 방법과 단일 프라이머 분자의 연속된 재사용 또는 신규 합성에 의존하는 방법으로 구분할 수 있다. 프라이머의 치환에 의존하는 방법은 헬리카제 의존적 증폭 (helicase dependant amplification: HDA), 엑소뉴클레아제 의존적 증폭 (exonuclease dependant amplification), 리콤비나제 중합효소증폭 (recombinase polymerase amplification: RPA) 및 루프 매개된 증폭 (loop mediated amplification: LAMP)로 구성된 군으로부터 선택된 방법을 포함한다. 단일 프라이머 분자의 연속된 재사용 또는 신규 합성에 의존하는 방법은 가닥치환증폭 (strand displacement amplification: SDA) 및 핵산 기반 증폭 (nucleic acid based amplification : NASBA 및 TMA)로 구성된 군으로부터 선택된 방법을 포함한다. 상기 프라이머는 선택되는 증폭 방법에 따라 하나, 또는 2이상의 세트로 포함될 수 있다. 상기 프라이머는 PCR용 프라이머일 수 있다.
mir-210은 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 성숙한 mir-210 마이크로RNA (microRNA)를 나타낸다. mir-346은 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 성숙한 mir-346 마이크로RNA (microRNA)를 나타낸다.
상기 시약은 검출가능한 표지가 부착된 것일 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 상기한 바와 같다. 상기 시약은 유리 또는 고체 지지체에 고정된 것일 수 있다. 상기 고체 지지체는 상기한 바와 같다.
상기 조성물은 임의의 상을 가질 수 있다. 상기 조성물은 액체, 고체, 또는 그 조합을 갖는 조성물일 수 있다.
상기 개체는 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 사람, 마우스, 소, 돼지, 말, 양, 개, 고양이, 또는 그 조합일 수 있다.
다른 양상은 TMED2, CD43, 또는 그 조합에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는, 개체의 간암 진단용 키트를 제공한다.
TMED2, CD43, 또는 그 조합에 특이적으로 결합하는 물질에 대하여는 청구된 조성물에 대하여 기술한 바와 같다. 상기 키트는 개체의 간암 진단에 사용하기 위한 시약을 더 포함할 수 있다. 상기 시약은 버퍼, 지시약, 또는 그 조합을 포함할 수 있다.
다른 양상은 개체로부터 분리된 시료와 TMED2, CD43, 또는 그 조합에 특이적으로 결합하는 물질을 접촉시켜 상기 마이크로베지클과 상기 물질을 결합시키는 단계; 및 시료 중 상기 마이크로베지클 중의 상기 물질의 수준을 측정하는 단계;를 포함하는, 개체의 간암 진단하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 개체로부터 분리된 시료와 TMED2, CD43, 또는 그 조합에 특이적으로 결합하는 물질을 접촉시켜 상기 마이크로베지클과 상기 물질을 결합시키는 단계를 포함한다.
상기 접촉은 액체 매질 중에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 액체 매질은 액체 시료 자체, 물, 버퍼, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 접촉은 상기 시료와 상기 물질을 혼합함으로써 수행될 수 있다. 상기 접촉은 상기 시료와 상기 물질을 용기 중에서 교반함으로써 수행되는 것일 수 있다. 상기 교반은 마이크로베지클을 파괴하지 않은 수준으로 수행되는 것일 수 있다.
상기 개체는 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 영장류일 수 있다. 상기 포유동물은 사람, 마우스, 소, 돼지, 말, 양, 개, 고양이, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 시료는 개체로부터 유래된 생물학적 물질을 나타낸다. 상기 생물학적 물질은 신선한 또는 보존된 기관 또는 조직 시료 또는 생검 (biopsy)와 같은 고체 조직 (solid tissue); 혈액 또는 혈액 구성성분; 양수 (amniotic fluid), 복수 (peritoneal fluid), 또는 세포간질액 (interstitial fluid)와 같은 체액 (bodily fluid); 세포 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 시료는 보존제, 항응고제, 버퍼, 고정제 (fixatives), 영양성분 (nutrients), 항생제 등과 같은 생물학적 물질과 자연적으로 혼합되어 있지 않은 화합물을 포함할 수 있다. 생물학적 시료는 예를 들면 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈액, 혈장, 혈청, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 시료는 순환 종양 세포 (circulating tumor cell: CTC)를 포함하는 것일 수 있다.
상기 TMED2, CD43, 또는 그 조합은 마이크로베지클, 예를 들면 생체 유래의 마이크로베지클의 표면에 존재하는 것일 수 있다. 상기 TMED2, CD43, 또는 그 조합은 간암을 가진 개체로부터 분리된 마이크로베지클의 표면에 특이적으로 존재하는 것일 수 있다. 상기 TMED2, CD43, 또는 그 조합은 대조군 시료로부터 분리된 마이크로베지클에 비하여 간암 개체로부터 분리된 시료 중에 더 높은 수준으로 존재하는 것일 수 있다. 상기 대조군은 정상 개체, 간암 이외의 질병, 예를 들면, 간경변을 가진 개체, 또는 그 조합일 수 있다. 따라서, 상기 조성물에 의하면, 정상 개체 또는 간경변 개체로부터 간암 개체를 구분할 수 있다.
상기 TMED2, CD43, 또는 그 조합에 특이적으로 결합하는 물질은 천연 또는 비천연적으로 상기 TMED2, CD43, 또는 그 조합에 특이적으로 결합하는 물질일 수 있다. 천역적으로 결합하는 물질은 생체 내에서 상기 TMED2, CD43, 또는 그 조합에 특이적으로 결합하는 물질, 예를 들면, 단백질일 수 있다. 상기 TMED2, CD43, 또는 그 조합에 특이적으로 결합하는 물질은 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 리간드, 기질, 저해제, 작용제, 길항제, 보조인자, 또는 그 조합인 것일 수 있다. 상기 항체는 단일클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있다. 상기 항체의 항원 결합 단편은 단일-도메인 항체 (single-domain antibody), Fab, Fab', scFv 또는 그 조합일 수 있다.
상기 TMED2, CD43, 또는 그 조합에 특이적으로 결합하는 물질은 검출가능한 표지가 부착된 것일 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 광학적 표지, 전기적 표지, 방사능 표지, 효소 표지, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 광학적 표지는 형광 또는 인광을 발생시키는 물질일 수 있다. 상기 형광 물질은 예를 들면, 플루오로레신 (fluorescein), 로다민, 시아닌, 금속 포르피린 복합체, Cy-5 및 Cy-3 일 수 있다. 플루오레세인 염료의 예에는, 6-카르복실플루오레세인 (6-FAM) 1, 2',4',1,4,-테트라클로로플루오레세인 (TET) 2, 및 2',4',5',7',1,4-헥사클로로플루오레세인 (HEX) 3, 2',7'-디메톡시-4',5'-디클로로-6-카르복시로다민 (JOE) 4, 2'-클로로-5'-플루오로-7',8'-융합된 페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인 5, 및 2'-클로로-7'-페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인 6이 포함될 수 있다.
상기 TMED2, CD43, 또는 그 조합에 특이적으로 결합하는 물질은 유리 또는 고체 지지체에 고정된 것일 수 있다. 상기 고체 지지체는 나노 또는 마이크로입자일 수 있다. 상기 고체 지지체는 자성 또는 비자성 입자일 수 있다. 상기 고체 지지체는 비드, 구형, 다각형, 플레이트, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 고체 지지체는 특정한 영역에 상기 물질이 고정되어 있는 어레이의 형태를 가질 수 있다.
상기 방법은 또한, 시료 중의 상기 마이크로베지클 중의 상기 물질의 수준을 측정하는 단계;를 포함한다. 상기 측정은 TMED2, CD43, 또는 그 조합에 특이적으로 결합하는 물질이 마이크로베지클에 결합된 상태에서, 상기 물질의 존재 또는 그 양을 측정하는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 TMED2, CD43, 또는 그 조합에 특이적으로 결합하는 물질은 검출가능한 표지가 부착된 것일 수 있으며, 상기 표지로부터 신호를 측정함으로써 상기 물질의 수준을 측정할 수 있다. 상기 측정은 또한, TMED2, CD43, 또는 그 조합에 특이적으로 결합하는 물질이 마이크로베지클에 결합된 복합체를 혼합물로부터 분리한 후, 상기 물질의 존재 또는 그 양을 측정하는 것일 수 있다.
상기 TMED2, CD43, 또는 그 조합에 특이적으로 결합하는 물질은 검출가능한 표지가 부착된 것일 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 광학적 표지, 전기적 표지, 방사능 표지, 효소 표지, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 광학적 표지는 형광 또는 인광을 발생시키는 물질일 수 있다. 상기 형광 물질은 예를 들면, 플루오로레신 (fluorescein), 로다민, 시아닌, 금속 포르피린 복합체, Cy-5 및 Cy-3 일 수 있다. 플루오레세인 염료의 예에는, 6-카르복실플루오레세인 (6-FAM) 1, 2',4',1,4,-테트라클로로플루오레세인 (TET) 2, 및 2',4',5',7',1,4-헥사클로로플루오레세인 (HEX) 3, 2',7'-디메톡시-4',5'-디클로로-6-카르복시로다민 (JOE) 4, 2'-클로로-5'-플루오로-7',8'-융합된 페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인 5, 및 2'-클로로-7'-페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인 6이 포함될 수 있다.
상기 물질의 수준을 측정하는 것은 상기 물질을 직접적으로 분리하여 그 양을 측정하는 것, 또는 상기 물질을 분리하지 않고 간접적으로 그 양을 측정하는 것일 수 있다. 상기 측정은 상기 물질에 부착된 검출가능한 표지로부터 나오는 신호를 검출함으로써 이루어지는 것일 수 있다. 상기 물질을 분리하는 것은 원심분리, 침전, 염석, 투석, 여과, 크로마토그래피, 전기영동, 또는 그 조합에 의하여 수행되는 것일 수 있다. 상기 크로마토그래피는 친환성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 또는 그 조합을 포함할 수 있다. 상기 측정은 ELISA, 웨스턴 블롯팅, 전기영동, 질량 스펙트로메트리, 분광기, 또는 그 조합이 사용될 수 있다.
상기 방법은 대조군 대비 상기 물질의 수준이 높은 경우, 상기 개체는 간암에 걸린 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 대조군은 정상 개체, 간암 이외의 질병, 예를 들면, 간경변을 가진 개체, 또는 그 조합일 수 있다. 따라서, 상기 방법에 의하면, 정상 개체 또는 간경변 개체로부터 간암 개체를 구분할 수 있다.
상기 방법은, 상기 접촉시키는 단계 후, 접촉 혼합물로부터 상기 마이크로베지클을 분리하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 마이크로베지클의 분리는 상기 TMED2, CD43, 또는 그 조합에 특이적으로 결합하는 물질에 결합된 마이크로베지클을 특이적으로 분리하는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 분리는 상기 물질에 특이적으로 결합하는 물질, 예를 들면 항체를 사용하여 분리하는 것일 수 있다. 상기 물질에 특이적으로 결합하는 물질, 예를 들면 항체는 고체 지지체 예를 들면, 자성 입자 또는 플레이트에 고정된 것일 수 있다. 분리는 마이크로베지클-상기 물질 복합체를 상기 고체 지지체에 고정된 상기 물질에 특이적으로 결합하는 물질에 접촉시켜 상기 복합체와 상기 물질을 결합시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 결합 산물로부터 마이크로베지클을 분리할 수 있다.
마이크로베지클의 분리는 시료를 원심분리하는 단계, 시료를 여과시키는 단계, 마이크로베지클에 특이적으로 결합할 수 있는 물질 또는 마이크로베지클의 지질 이중층에 끼어들 수 있는 물질을 마이크로베지클와 인큐베이션시키는 단계, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 인큐베이션은 인 비트로에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 마이크로베지클의 분리는 예를 들면 고체 지지체 또는 원심력을 이용한 분리, 밀도구배법, 초원심분리, 여과, 투석, 항체를 이용한 면역친화성 크로마토그래피, 자유유동전기이동법 또는 이들을 혼합한 방법으로 수행될 수 있다. 상기 마이크로베지클에 특이적으로 결합할 수 있는 물질은 마이크로베지클의 표면 단백질, 지질, 또는 당에 결합할 수 있는 물질일 수 있다. 상기 표면 단백질은 CD63, CD83, CD9, 인테그린-베타1 (ITGB1), EpCAM, 카베올린, FasL, HLA-DRA, CD36, CD63, CD81, MUC1, ERBB4, GPER, ERBB2, MLANA, AMHR2, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 마이크로베지클에 특이적으로 결합할 수 있는 물질은 단백질에 결합 친화도를 갖는 물질, 효소의 기질, 조효소, 조절 인자, 수용체와 특이적으로 결합하는 물질, 렉틴, 당, 당단백질, 항원, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 호르몬, 신경 전달물질, 인지질-결합 단백질, 플렉스트린 상동성 도메인 (pleckstrin homology: PH)을 포함하는 단백질, 콜레스테롤-결합 단백질, 또는 이들의 조합일 수 있다. 항원 결합 단편은 항원 결합 부위를 포함하는 것으로, 예를 들면 단일-도메인 항체 (single-domain antibody), Fab, Fab' 또는 scFv일 수 있다. 상기 마이크로베지클의 지질 이중층에 끼어들 수 있는 물질은 친지성 모이어티, 양친매성 모이어티, 양쪽성 이온 모이어티, 또는 이들의 조합을 포함하는 물질일 수 있다. 친지성 모이어티는 예를 들면, 지방산, 스테롤, 또는 글리세리드일 수 있다. 양친매성 모이어티는 예를 들면, 인지질 또는 스핑고리피드일 수 있다. 양쪽성 이온 모이어티는 예를 들면, 술포베타인, 카르복시베타인, 또는 포스포릴콜린일 수 있다. 마이크로베지클에 특이적으로 결합할 수 있는 물질 또는 마이크로베지클의 지질 이중층에 끼어들 수 있는 물질은 고체 지지체와 결합한 것일 수 있다. 상기 고체 지지체는 구형, 다각면체, 플레이트, 선형 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 고체 지지체는 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 자성 입자 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 방법은 상기 접촉시키는 단계 전에 개체로부터 분리된 시료로부터 상기 마이크로베지클을 분리하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 분리에는 TMED2, CD43, 또는 그 조합에 특이적으로 결합하는 물질이 사용되지 않는 것일 수 있다. 이렇게 함으로써, 전체 마이크로베지클 중에서 TMED2, CD43, 또는 그 조합에 특이적으로 결합하는 물질이 표면에 존재하는 마이크로베지클의 수준을 측정할 수 있다. 마이크로베지클을 분리하는 것에 대하여는 상기한 바와 같다.
상기 방법은 상기 분리된 마이크로베지클 중의 종양 마커의 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 종양 마커는 간암 마커일 수 있다. 용어 "종양 마커 (tumor marker)"는 종양 세포 또는 조직에 특이적으로 발견되는 화합물 또는 모이어티일 수 있다. 상기 종양 마커는 단백질 또는 핵산일 수 있다. 상기 핵산 마커는 miRNA일 수 있다. 상기 종양 마커는 마이크로베지클에 존재하는 것일 수 있다. 상기 종양 마커의 수준을 측정하는 것은 상기 마커를 직접적으로 분리하여 그 양을 측정하는 것, 또는 상기 마커를 분리하지 않고 간접적으로 그 양을 측정하는 것일 수 있다. 상기 측정은 상기 마커에 부착된 검출가능한 표지로부터 나오는 신호를 검출함으로써 이루어지는 것일 수 있다. 상기 마커를 분리하는 것은 원심분리, 침전, 염석, 투석, 여과, 크로마토그래피, 전기영동, 또는 그 조합에 의하여 수행되는 것일 수 있다. 상기 크로마토그래피는 친환성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 또는 그 조합을 포함할 수 있다. 상기 측정은 ELISA, 웨스턴 블롯팅, 전기영동, 질량 스펙트로메트리, 분광기, 또는 그 조합이 사용될 수 있다. 상기 마커가 핵산인 경우, 핵산을 증폭하고 증폭 산물을 측정하는 것일 수 있다. 상기 증폭은 등온증폭 방법, 또는 PCR과 같은 열순환을 포함하는 증폭방법을 포함할 수 있다. 핵산 마커는 FRET 쌍을 포함하는 프로브를 사용하여, 증폭과 동시에 실시간으로 측정될 수 있다. 상기 증폭은 실시간-PCR일 수 있다.
상기 방법은, 상기 분리된 마이크로베지클 중의 mir-210, mir-346, 또는 그 조합의 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 측정은 mir-210, mir-346, 또는 그 조합을 직접 분리하여 그 양을 측정하거나, mir-210, mir-346, 또는 그 조합을 증폭하여 그 양을 측정하는 것일 수 있다. 상기 증폭은 mir-210, mir-346, 또는 그 조합에 결합하거나, mir-210에 상보적인 뉴클레오티드 서열, mir-346에 상보적인 뉴클레오티드 서열, 또는 그 조합에 결합하는 뉴클레오티드 서열을 프라이머 및/또는 프로브로 사용하는 것일 수 있다. 상기 뉴클레오티드 서열은 천연, 합성, 또는 반합성 물질일 수 있다. 상기 뉴클레오티드 서열은 핵산, 예를 들면, DNA, RNA, DNA-RNA 하이브리드, PNA, 또는 그 조합일 수 있다.
mir-210은 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 성숙한 mir-210 마이크로RNA (microRNA)를 나타낸다. mir-346은 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 성숙한 mir-346 마이크로RNA (microRNA)를 나타낸다.
상기 뉴클레오티드 서열은 검출가능한 표지가 부착된 것일 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 상기한 바와 같다. 상기 뉴클레오티드 서열은 유리 또는 고체 지지체에 고정된 것일 수 있다. 상기 고체 지지체는 상기한 바와 같다.
상기 방법은, 대조군 대비 시료 중의 TMED2, CD43, mir-210, mir-346, 또는 그 조합의 수준이 높은 경우, 개체는 간암에 걸린 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 대조군은 정상 개체, 간암 이외의 질병, 예를 들면, 간경변을 가진 개체, 또는 그 조합일 수 있다. 따라서, 상기 방법에 의하면, 정상 개체 또는 간경변 개체로부터 간암 개체를 구분할 수 있다.
다른 양상은 개체로부터 분리된 시료와 TMED2, CD43, 또는 그 조합에 특이적으로 결합하는 물질을 접촉시켜 상기 마이크로베지클과 상기 물질을 결합시키는 단계; 및 시료 중 상기 마이크로베지클 중의 상기 물질의 수준을 측정하는 단계;를 포함하는, 개체의 간암 진단에 필요한 정보를 얻는 방법을 제공한다.
"개체로부터 분리된 시료와 TMED2, CD43, 또는 그 조합에 특이적으로 결합하는 물질을 접촉시켜 상기 마이크로베지클과 상기 물질을 결합시키는 단계"; 및 "시료 중 상기 마이크로베지클 중의 상기 물질의 수준을 측정하는 단계"는 상기한 바와 같다.
일 양상에 따른 개체의 간암 진단용 조성물에 의하면, 개체의 간암을 효율적으로 진단하는데 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 개체의 간암 진단하는 방법에 의하면, 개체의 간암을 효율적으로 진단할 수 있다.
다른 양상에 따른 개체의 간암 진단에 필요한 정보를 얻는 방법에 의하면, 개체의 간암 진단에 필요한 정보를 효율적으로 얻을 수 있다.
도 1은 항-TMED2가 코팅된 비드를 사용하여 분리된 마이크로베지클에 대하여 측정된 단백질 밴드 세기 값에 기초한 시료에 대한 간경변, 또는 간암을 결정하기 위한 ROC 곡선을 나타낸다.
도 2는 항-CD43이 코팅된 비드를 사용하여 분리된 마이크로베지클에 대하여 측정된 단백질 밴드 세기 값에 기초한 시료에 대한 간경변, 또는 간암을 결정하기 위한 ROC 곡선을 나타낸다.
도 3은 항-TMED2가 코팅된 비드와 항-CD43이 코팅된 비드를 사용하여 분리된 마이크로베지클에 대하여 측정된 단백질 밴드 세기 값에 기초한 시료에 대한 간경변, 또는 간암을 결정하기 위한 ROC 곡선을 나타낸다.
도 4는 항-TMED2, 및 항-CD43이 코팅된 비드를 사용하여 분리된 마이크로베지클에 대하여 각 mir-210, 및 mir-346을 측정한 값에 기초한 시료에 대한 간경변, 또는 간암을 결정하기 위한 ROC 곡선을 나타낸다.
도 2는 항-CD43이 코팅된 비드를 사용하여 분리된 마이크로베지클에 대하여 측정된 단백질 밴드 세기 값에 기초한 시료에 대한 간경변, 또는 간암을 결정하기 위한 ROC 곡선을 나타낸다.
도 3은 항-TMED2가 코팅된 비드와 항-CD43이 코팅된 비드를 사용하여 분리된 마이크로베지클에 대하여 측정된 단백질 밴드 세기 값에 기초한 시료에 대한 간경변, 또는 간암을 결정하기 위한 ROC 곡선을 나타낸다.
도 4는 항-TMED2, 및 항-CD43이 코팅된 비드를 사용하여 분리된 마이크로베지클에 대하여 각 mir-210, 및 mir-346을 측정한 값에 기초한 시료에 대한 간경변, 또는 간암을 결정하기 위한 ROC 곡선을 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 간암 특이적 단백질
마커의
선별
본 실시예에서는 간경변 환자 및 간암 환자로부터 유래된 혈액 중의 마이크로베지클에 존재하는 간암 특이적 마커를 확인하였다.
간경변 환자 13명 및 간암 환자 13명으로부터 혈액을 8ml 내지 10ml 씩 BD Vacutainer® Plus plastic whole blood tube에 채취한 후 4℃에서 1300g에서 10분 동안 각각 원심분리하여, 혈장을 분리하였다. 분리된 혈장은 -80℃에서 보관하고 사용시 녹여서 4℃에서 3000g에서 5분 동안 원심분리한 후 침전물을 제외한 상층액을 시료로 사용하였다.
상기 시료 300ul를 항-CD9 항체 (R&D Systems), 항-TMED2 항체 (Santa Cruz Biotechnology), 및 항-CD43 항체 (R&D System)가 각각 코팅된 비드 (bead) 30ul (항체 0.8ug/비드 ul)를 테스트 튜브(Axygen) 중에서 혼합한 후, 상온에서 4 시간 동안 Grant Bio 로테이터를 사용하여 인큐베이션시키고, 자성을 이용하여 상기 비드를 분리하였다. 다음으로, 상기 비드를 PBS 300ul와 혼합하고 상온에서 3 시간 동안 인큐베이션하여 세척하였다. 상기 비드 (bead)는 Dynabead M-270 Amine (Life technologies 사, catalog 번호 143080, 직경 2.8um)에 단백질 G (protein G) (Sigma)를 NHS/EDC를 사용한 가교 반응을 통해서 코팅한 후, 상기 항체를 각각 반응시키고 디메틸피멜이미데이트 (dimethylpimelimidate)를 이용하여 코팅하였다. 얻어진 비드는 PBS 1ul 중에서 2x106 개의 비드가 포함되어 있다.
PBS를 제거한 후 리튬 도데실 술페이트를 포함하고 있는 pH 8.4의 파쇄 버퍼 (lysis buffer)인 NuPAGE LDS sample buffer (Life Technologies) 30ul를 상기 튜브에 첨가하여, 95℃ 10분 동안 히팅블록에서 열처리하여 마이크로베지클을 파쇄시켰다. 파쇄물 (lysate)에 대하여 전기영동한 후 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 웨스턴 블롯팅에서의 검출은 제1차 항체로서 토끼 (rabbit) 항-인테그린-β1을 사용하고, 제2차 항체로서 HRP-접합된 항-토끼 항체를 사용하여, Las min 4000으로 발광 이미지를 분석하였다. 인테그린-β1은 마이크로베지클에 일반적으로 존재하는 마커이다.
측정된 인테그린-β1 단백질 밴드 세기 값을 기초로 하여, 항-CD9 항체가 코팅된 비드를 사용하여 분리된 마이크로베지클에 대하여 측정된 인테그린-β1 단백질 밴드 세기 값에 대하여, 항-TMED2 항체 또는 항-CD43 항체가 코팅된 비드를 사용하여 분리된 마이크로베지클에 대하여 측정된 인테그린-β1 단백질 밴드 세기 값을 보정하였다. CD9는 마이크로베지클에 일반적으로 존재하는 마커이므로, 항-CD9 항체가 코팅된 비드를 사용하여 분리된 마이크로베지클에 대하여 측정된 인테그린-β1 단백질 밴드 세기 값은 시료 중의 전체 마이크로베지클의 양 또는 그 마이크로베지클 중의 인테그린-β1을 나타낸다.
항-TMED2 및 항-CD43가 코팅된 비드를 사용하여 분리된 마이크로베지클에 대하여 측정된 인테그린-β1 단백질 밴드 세기 값 또는 그 조합을 사용하여 ROC (receiver operator characteristic) 곡선 분석을 하였다.
항-TMED2가 코팅된 비드를 사용하여 분리된 마이크로베지클에 대하여 측정된 인테그린-β1 단백질 밴드 세기 값에 기초한 시료에 대한 간경변, 또는 간암 판정 결과는 표 1과 같다. 이 경우, 곡선하 면적 (AUC)는 0.693이며, 민감도 (sensitivity)는 0.692, 특이도 (specificity)는 0.692이다. 도 1은 항-TMED2가 코팅된 비드를 사용하여 분리된 마이크로베지클에 대하여 측정된 인테그린-β1 단백질 밴드 세기 값에 기초한 시료에 대한 간경변, 또는 간암을 결정하기 위한 ROC 곡선을 나타낸다.
실제 간경변 | 실제 간암 | |
예측된 간경변 | 9 | 4 |
예측된 간암 | 4 | 9 |
항-CD43이 코팅된 비드를 사용하여 분리된 마이크로베지클에 대하여 측정된 인테그린-β1 단백질 밴드 세기 값에 기초한 시료에 대한 간경변, 또는 간암 판정 결과는 표 2와 같다. 이 경우, 곡선하 면적 (AUC)는 0.538이며, 민감도 (sensitivity)는 0.308, 특이도 (specificity)는 0.769이다. 도 2는 항-CD43이 코팅된 비드를 사용하여 분리된 마이크로베지클에 대하여 측정된 인테그린-β1 단백질 밴드 세기 값에 기초한 시료에 대한 간경변, 또는 간암을 결정하기 위한 ROC 곡선을 나타낸다.
실제 간경변 | 실제 간암 | |
예측된 간경변 | 10 | 9 |
예측된 간암 | 3 | 4 |
항-TMED2가 코팅된 비드를 사용하여 분리된 마이크로베지클에 대하여 측정된 인테그린-β1 단백질 밴드 세기 값과 과 항-CD43이 코팅된 비드를 사용하여 분리된 마이크로베지클에 대하여 측정된 인테그린-β1 단백질 밴드 세기 값에 기초한 시료에 대한 간경변, 또는 간암 판정 결과는 표 3과 같다. 이 경우, 곡선하 면적 (AUC)는 0.692이며, 민감도 (sensitivity)는 0.692, 특이도 (specificity)는 0.692이다. 도 3은 항-TMED2가 코팅된 비드와 항-CD43이 코팅된 비드를 사용하여 분리된 마이크로베지클에 대하여 측정된 인테그린-β1 단백질 밴드 세기 값에 기초한 시료에 대한 간경변, 또는 간암을 결정하기 위한 ROC 곡선을 나타낸다.
실제 간경변 | 실제 간암 | |
예측된 간경변 | 9 | 4 |
예측된 간암 | 4 | 9 |
이상의 결과로부터, TMED2, 및 CD43을 마커로 사용하여 간경변과 간암 시료를 구분할 수 있었다.
실시예
2: 간암 특이적 단백질 및
miRNA
마커의
선별
본 실시예에서는 간경변 환자 및 간암 환자로부터 유래된 혈액 중의 마이크로베지클에 존재하는 간암 특이적 단백질 및 miRNA 마커를 확인하였다.
간경변 환자 13명 및 간암 환자 13명으로부터 혈액을 8ml 내지 10ml 씩 BD Vacutainer® Plus plastic whole blood tube에 채취한 후 4℃에서 1300g에서 10분 동안 각각 원심분리하여, 혈장을 분리하였다. 분리된 혈장은 -80℃에서 보관하고 사용시 녹여서 4℃에서 3000g에서 5분 동안 원심분리한 후 침전물을 제외한 상층액을 시료로 사용하였다.
상기 시료 300ul를 항-CD9 항체 (R&D Systems), 항-TMED2 항체 (Santa Cruz Biotechnology), 및 항-CD43 항체 (R&D System)가 각각 코팅된 비드 (bead) 30ul (항체 0.8ug/비드 1ul)를 테스트 튜브(Axygen) 중에서 혼합한 후, 상온에서 4 시간 동안 Grant Bio 로테이터를 사용하여 인큐베이션시키고, 자성을 이용하여 상기 비드를 분리하였다. 다음으로, 상기 비드를 PBS 300ul와 혼합하고 상온에서 3 시간 동안 인큐베이션하여 세척하였다. 상기 비드 (bead)는 Dynabead M-270 Amine (Life technologies 사, catalog 번호 143080, 직경 2.8um)에 단백질 G (protein G) (Sigma)를 NHS/EDC를 사용하여 가교 반응을 통해 코팅한 후, 상기 항체를 각각 반응시키고 디메틸피멜이미데이트 (dimethylpimelidate)를 이용하여 코팅하였다. 얻어진 비드는 PBS 1ul 중에서 2x106 개의 비드가 포함되어 있다.
PBS를 제거한 후 miRNeasy kit를 제조자의 지시에 따라 miRNA를 추출하고, Universal cDNA synthesis kit (Exiqon)을 사용하여 cDNA를 합성하였다. 이후 SYBR Green master mix kit (Exiqon)을 제조자의 지시에 따라 실시간 (real time)-PCR을 수행하였다. 이때 프라이머는 제조사에서 제공한 것을 사용하였다.
RT-PCR에서 측정된 483-533nm에서 측정된 흡광도 값에 근거하여, 항-TMED2가 코팅된 비드를 사용하여 분리된 마이크로베지클에 대하여 측정된 흡광도 값으로서, mir-210에 대한 값과 항-CD43이 코팅된 비드를 사용하여 분리된 마이크로베지클에 대하여 측정된 흡광도 값으로서, mir-346에 대한 값을 조합하여 ROC 곡선 분석을 수행하였다.
항-TMED2가 코팅된 비드를 사용하여 분리된 마이크로베지클에 대하여 측정된 흡광도 값으로서, mir-210에 대한 값과 항-CD43이 코팅된 비드를 사용하여 분리된 마이크로베지클에 대하여 측정된 흡광도 값으로서, mir-346에 대한 값에 기초한 시료에 대한 간경변, 또는 간암 판정 결과는 표 4와 같다. 이 경우, 곡선하 면적 (AUC)는 0.85이며, 민감도 (sensitivity)는 0.85, 특이도 (specificity)는 0.85이다. 도 4는 항-TMED2, 및 항-CD43이 코팅된 비드를 사용하여 분리된 마이크로베지클에 대하여 각 mir-210, 및 mir-346을 측정한 값에 기초한 시료에 대한 간경변, 또는 간암을 결정하기 위한 ROC 곡선을 나타낸다.
실제 간경변 | 실제 간암 | |
예측된 간경변 | 11 | 2 |
예측된 간암 | 2 | 11 |
이상의 결과로부터, TMED2, CD43, mir-210 및 mir-346을 마커로 사용하여 간경변과 간암 시료를 구분할 수 있었다.
<110> Samsung Electronics Co., Ltd.
<120> A compositon for diagnosing a liver cancer in a subject, method
for diagnosing a liver cancer in a subject and method for
obtaining information for diagnosing a liver cancer in a subject
<130> PN102613
<160> 6
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 201
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Val Thr Leu Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala
1 5 10 15
Thr Val Ser Gly Tyr Phe Val Ser Ile Asp Ala His Ala Glu Glu Cys
20 25 30
Phe Phe Glu Arg Val Thr Ser Gly Thr Lys Met Gly Leu Ile Phe Glu
35 40 45
Val Ala Glu Gly Gly Phe Leu Asp Ile Asp Val Glu Ile Thr Gly Pro
50 55 60
Asp Asn Lys Gly Ile Tyr Lys Gly Asp Arg Glu Ser Ser Gly Lys Tyr
65 70 75 80
Thr Phe Ala Ala His Met Asp Gly Thr Tyr Lys Phe Cys Phe Ser Asn
85 90 95
Arg Met Ser Thr Met Thr Pro Lys Ile Val Met Phe Thr Ile Asp Ile
100 105 110
Gly Glu Ala Pro Lys Gly Gln Asp Met Glu Thr Glu Ala His Gln Asn
115 120 125
Lys Leu Glu Glu Met Ile Asn Glu Leu Ala Val Ala Met Thr Ala Val
130 135 140
Lys His Glu Gln Glu Tyr Met Glu Val Arg Glu Arg Ile His Arg Ala
145 150 155 160
Ile Asn Asp Asn Thr Asn Ser Arg Val Val Leu Trp Ser Phe Phe Glu
165 170 175
Ala Leu Val Leu Val Ala Met Thr Leu Gly Gln Ile Tyr Tyr Leu Lys
180 185 190
Arg Phe Phe Glu Val Arg Arg Val Val
195 200
<210> 2
<211> 2126
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
gcggagctta ggcggcggtg gctgagaagg cagcggggcg gcggcggcgg cggcggcggc 60
ggctgtggag gccgcagtcc gggtcctggc ttcggcctca gccccaccat ggtgacgctt 120
gctgaactgc tggtgcttct ggccgctctc ctggccacgg tctcgggcta tttcgttagc 180
atcgacgccc atgctgaaga gtgcttcttt gagcgggtca cctcgggcac caagatgggc 240
ctcatcttcg aggtggcgga gggcggcttc ctggacatcg acgtggagat tacaggacca 300
gataacaaag gaatttacaa aggagacaga gaatccagtg ggaaatacac atttgctgct 360
cacatggatg gaacatacaa attttgtttt agtaaccgga tgtccaccat gactccaaaa 420
atagtgatgt tcaccattga tattggggag gctccaaaag gacaagatat ggaaacagaa 480
gctcaccaga acaagctaga agaaatgatc aatgagctag cagtggcgat gacagctgta 540
aagcacgaac aggaatacat ggaagtccgg gagagaatac acagagccat caacgacaac 600
acaaacagca gagtggtcct ttggtccttc tttgaagctc ttgttctagt tgccatgaca 660
ttgggacaga tctactacct gaagagattt tttgaagtcc ggagagttgt ttaaaaagcc 720
tcttcctgat gatcccaact cagaattcac tgtttaccaa acaccttggt cataataatg 780
tcattagttt ctccattttt attttctgaa ctgtacattc acaacttatg tttctttgag 840
attaatagat attgggggaa aaacgccttt ttaggaaaat tatagtgaaa atttgacagt 900
tgattggcat aatttcttgt ttgaatgctg cctccattat ataggtcctt ccaggaactc 960
aaacactgta agtgaaatat gggagtatag tttttattat ttcttctttt ccttttgttt 1020
tcataatata atgcagtttg ttcaggaaat cagcacaaag cctgatagta ctttactaaa 1080
atgactgcat tctttggatt ccttcagtct atggttcaag tcactaaaga ttcatttttg 1140
ttgagtcctt atgagaaaca gcagtatgaa tcttgacggt ttctgcccgt cctaatggca 1200
gagctctctg acttgggtgt atgctgccag gctgggtact ttcatacttt gttttcttgt 1260
tttgctttaa aactacgact cagcatacat tttcccacat acatttttac attgtacctt 1320
aggactcagt catctccact taaattgatg acacaagcag ctaataacca tttctgggtt 1380
tctgcctaac cccctaattg tctgttaaag ccaattctct gggtgtccca gtgagtggtg 1440
gctttttttc tttccacatt ggcacattca cttctcccac tcttggcatg taagaaataa 1500
gcatttacat aattggaaaa atctggattt ctgatgccaa agggttaaag cttcttggat 1560
ttcatttcat tgatatacag ccactatttt atttttgatc agtggccttt gggccactgt 1620
tcagggtact gaccatcagt gtcagcatta gggttttggt ttttgtttct tttgggtctt 1680
tcttttttgg cacatgtgaa tcttgttttg tgtaaaatga aattactttc tcttgttctc 1740
tgatgatggg tttaaaatta aaagagcatc cggttttggt atggggatga tccaggatta 1800
tgttgtgact gatacatatt agttacttgt gctttttttt ttttttttgg atctttgcaa 1860
gggcaaaact acaagtaacg agttttatat aattaattta aatttgttac aggttttcat 1920
gttcaggata aaccatactt ccaccttggg tgagaacact tgcaacagtt tattaatgag 1980
gtgactttca ccttaggaca actgttgcat gccaagtttt ttgtgtgtgt gaaacacttc 2040
aaaactgatt taaaagatgt aaatttaaaa ttggttgtat ctaatatgcc ccaggttcgg 2100
taaataaaca attcttttta aaaaca 2126
<210> 3
<211> 400
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 3
Met Ala Thr Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Leu Val Val Ser Pro Asp
1 5 10 15
Ala Leu Gly Ser Thr Thr Ala Val Gln Thr Pro Thr Ser Gly Glu Pro
20 25 30
Leu Val Ser Thr Ser Glu Pro Leu Ser Ser Lys Met Tyr Thr Thr Ser
35 40 45
Ile Thr Ser Asp Pro Lys Ala Asp Ser Thr Gly Asp Gln Thr Ser Ala
50 55 60
Leu Pro Pro Ser Thr Ser Ile Asn Glu Gly Ser Pro Leu Trp Thr Ser
65 70 75 80
Ile Gly Ala Ser Thr Gly Ser Pro Leu Pro Glu Pro Thr Thr Tyr Gln
85 90 95
Glu Val Ser Ile Lys Met Ser Ser Val Pro Gln Glu Thr Pro His Ala
100 105 110
Thr Ser His Pro Ala Val Pro Ile Thr Ala Asn Ser Leu Gly Ser His
115 120 125
Thr Val Thr Gly Gly Thr Ile Thr Thr Asn Ser Pro Glu Thr Ser Ser
130 135 140
Arg Thr Ser Gly Ala Pro Val Thr Thr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Thr
145 150 155 160
Ser Arg Gly Thr Ser Gly Pro Pro Leu Thr Met Ala Thr Val Ser Leu
165 170 175
Glu Thr Ser Lys Gly Thr Ser Gly Pro Pro Val Thr Met Ala Thr Asp
180 185 190
Ser Leu Glu Thr Ser Thr Gly Thr Thr Gly Pro Pro Val Thr Met Thr
195 200 205
Thr Gly Ser Leu Glu Pro Ser Ser Gly Ala Ser Gly Pro Gln Val Ser
210 215 220
Ser Val Lys Leu Ser Thr Met Met Ser Pro Thr Thr Ser Thr Asn Ala
225 230 235 240
Ser Thr Val Pro Phe Arg Asn Pro Asp Glu Asn Ser Arg Gly Met Leu
245 250 255
Pro Val Ala Val Leu Val Ala Leu Leu Ala Val Ile Val Leu Val Ala
260 265 270
Leu Leu Leu Leu Trp Arg Arg Arg Gln Lys Arg Arg Thr Gly Ala Leu
275 280 285
Val Leu Ser Arg Gly Gly Lys Arg Asn Gly Val Val Asp Ala Trp Ala
290 295 300
Gly Pro Ala Gln Val Pro Glu Glu Gly Ala Val Thr Val Thr Val Gly
305 310 315 320
Gly Ser Gly Gly Asp Lys Gly Ser Gly Phe Pro Asp Gly Glu Gly Ser
325 330 335
Ser Arg Arg Pro Thr Leu Thr Thr Phe Phe Gly Arg Arg Lys Ser Arg
340 345 350
Gln Gly Ser Leu Ala Met Glu Glu Leu Lys Ser Gly Ser Gly Pro Ser
355 360 365
Leu Lys Gly Glu Glu Glu Pro Leu Val Ala Ser Glu Asp Gly Ala Val
370 375 380
Asp Ala Pro Ala Pro Asp Glu Pro Glu Gly Gly Asp Gly Ala Ala Pro
385 390 395 400
<210> 4
<211> 6944
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
agttctcagg ctcacattcc caccacccac ctctgagccc agccctccct agcatcacca 60
cttccatccc attcctcagc caagagccag gaatcctgat tccagatccc acgcttccct 120
gcctccctca ggtcccagct cttgctcctg cctgtttgcc tggaaatggc cacgcttctc 180
cttctccttg gggtgctggt ggtaagccca gacgctctgg ggagcacaac agcagtgcag 240
acacccacct ccggagagcc tttggtctct actagcgagc ccctgagctc aaagatgtac 300
accacttcaa taacaagtga ccctaaggcc gacagcactg gggaccagac ctcagcccta 360
cctccctcaa cttccatcaa tgagggatcc cctctttgga cttccattgg tgccagcact 420
ggttcccctt tacctgagcc aacaacctac caggaagttt ccatcaagat gtcatcagtg 480
ccccaggaaa cccctcatgc aaccagtcat cctgctgttc ccataacagc aaactctcta 540
ggatcccaca ccgtgacagg tggaaccata acaacgaact ctccagaaac ctccagtagg 600
accagtggag cccctgttac cacggcagct agctctctgg agacctccag aggcacctct 660
ggaccccctc ttaccatggc aactgtctct ctggagactt ccaaaggcac ctctggaccc 720
cctgttacca tggcaactga ctctctggag acctccactg ggaccactgg accccctgtt 780
accatgacaa ctggctctct ggagccctcc agcggggcca gtggacccca ggtctctagc 840
gtaaaactat ctacaatgat gtctccaacg acctccacca acgcaagcac tgtgcccttc 900
cggaacccag atgagaactc acgaggcatg ctgccagtgg ctgtgcttgt ggccctgctg 960
gcggtcatag tcctcgtggc tctgctcctg ctgtggcgcc ggcggcagaa gcggcggact 1020
ggggccctcg tgctgagcag aggcggcaag cgtaacgggg tggtggacgc ctgggctggg 1080
ccagcccagg tccctgagga gggggccgtg acagtgaccg tgggagggtc cgggggcgac 1140
aagggctctg ggttccccga tggggagggg tctagccgtc ggcccacgct caccactttc 1200
tttggcagac ggaagtctcg ccagggctcc ctggcgatgg aggagctgaa gtctgggtca 1260
ggccccagcc tcaaagggga ggaggagcca ctggtggcca gtgaggatgg ggctgtggac 1320
gccccagctc ctgatgagcc cgaaggggga gacggggctg ccccttaagt gtcggtgaat 1380
agtgaggctg gaggccggaa tctcagccag cctccagcac cttccctctc accatcccac 1440
tgccccctcg ctcccatgtt tccacccggc accctgatcc tcacccgaat ctcctttttt 1500
tttttctttt gagacagagt ttcgctttgt cgcccaggct ggagtgcaat gcacgatctc 1560
agttcactgc aacctctgcc tcctaagttc aggcgattct cctgcctcag cttcccgagt 1620
aactgagatt acaggcaccc accaccatgc ccagctgctt ttttgtattt ttggtagaga 1680
tggggtttca ccatgttggc taggctggtc tcaaactcct gacctcaggt gatctacctg 1740
cctcagcctc ccaaagtgct gagattacag acatgagcct ccgcgccttg cctcctcacc 1800
cacctcttca ctctgaatcc tcatgaggct tctcagccct ggatttcctg ctgccatcct 1860
cacccagcac ccacaactag cgcctgggca gggcagggct ggcacctctc aacgtctgtg 1920
gactgaatga ataaaccctc ctcatccacc cctatttatc tccatcacca tttccccctc 1980
tttcttgttc ctggaaacgg ctgctgagtc tccatcggcc aaacttatct gccctgtgat 2040
ttctttgaca attctccttt tcccccagaa cccaccctgg gttgaccaga gtctgggaag 2100
aaggacaaga gaacccggca aactccctcc taggattaac tttgtaaagc acccttgccc 2160
tgtagctgca agggctgtgg aacctgggca gcccgcaacc acctttagct ctgggccccc 2220
caggccagcc tggagcatgg ctgggtgggg ccaccagccc atgctctcag gcgggcctgt 2280
gatctttccc agggcacatg gactgtaggc tggccctggc ccacaccacc acactctccc 2340
cagccatgga cagaggcagc cagaggcctc acggtttctc ctccgagttt ctggctgggt 2400
gtagttctca gaaaccccag tgcctgcgtg tgtccactcg tgggtgtggt ttgtgtgcaa 2460
gagctgagga tttggcgatg cttgggaggg gtagttgtgg gtacagacgg tgtgggggtg 2520
ggaagtggtg cagagactga agagggtcaa cctgggcatg ggggacacag ggactgctga 2580
gaacgtgcgt gtcatctttg ctctgatggg gtggacatag cagaaaatct aactctgtct 2640
gtagccccat acagaatgcc agggtgagca cagtggctgg tgcctttaat cccagcactt 2700
tggaaagttg aggcaggagg atcgcttgag cccaggagtt cgagtctgaa gtgagctgtg 2760
attgcaccac tgcacttcag cctgggcaac agagtgagcc cctgtctcaa aaaagaaaag 2820
aaaaagaaag ccaggcttca tggaaagatc gtatgtgtga cccaaatatg agttcttcag 2880
ctcagccatg gtaatccctt ccttgaagtc tccatttctg cagtacacat gcatgtgcgc 2940
tctctctctc tctctctctc tcacacacac acacacacac acacacacac gcgcgcgcgc 3000
gcgcgctctc ctgcgaacag aggcaggggg agaggggttt gccctggtct cggggactgg 3060
tctggctggc gcttccccac tgcacgtttc caggtttagt ttgtctgtgt ctcctcttcc 3120
atcccagggg ctgagcccct tccatcctcc aagaggaacc agtgagagtg agtgaaggag 3180
gggcctggag ccagggactt cccctgtggg gcctgggtgg agaggggaga actcaatggt 3240
gctgcctttg agaccagccc aggctacagc ccaggagcac acatgggcca gggcagttgg 3300
tatttcccga ggacaaagag gaaattttca aagaggaagt tgttgagtta gagcttgcgg 3360
tggctgagag cagacaggtt gacctgcaaa aaaagacagg ggaggcatgt gagtgtgaca 3420
gccctgctct gtggcctggg caggagatgg gggaaagggt caggtggggg atgggctcgt 3480
gcagtgggag aggagacgga gggagggagc gggaaggggc ttgcttagtg ggtgggaaga 3540
gctgagctcg gatggaacca gcttctacca gccaggctgg gcacccactg ggctgcatct 3600
ggtggccttt tctgattgct atttggactc actgcagctg cagaatgaca gaggccatgt 3660
ccaaaatccc ttagagacac tgttgtctta gagttgttaa aataagagcc cccatatcag 3720
gtttagaaaa tactgtcacc gaacgaacgt cgctgtcctc agctccacct ccctttcctt 3780
tgacagatat ggttgttttc taagccagga ctggttttag tcaggtcctg ggcgaatcct 3840
gaaaaaaaga ggtagtacgg gtaaggaagg cacccaacag ggctttcaca atccagaaaa 3900
tatcaaaata taagtgttaa aagagaggca caggccgggt gcggtggctc acgcctgtaa 3960
tctcagcact ttgggaggcc aaggtgggca gatcatgagg tcaggagttt gagaccagcc 4020
tggccaatat gatgaaaccc cgtttctact aaaaatacaa aagttagcca ggcatggtgg 4080
tgtgctcctg taatcccagc tacttaggag gctgaggcca gagaattgct tgaaccctgg 4140
agtcagaggt tgcagtgagc cgggatcatg ccactgtact ccaggctggg tgacaaagtg 4200
agactgtctc aaaaaataaa aataaataaa ataaataaaa gagaggcaca aacagtgtta 4260
tgaatgcacc aaggaaaatg gtgcattcat aactctcagg tgaagcctac caagccatgc 4320
gtgtgtgcac atatgtgtgt acgtgtgcat gtgcgtgcgt gcatgtgcgt gcgtgcatgt 4380
gcctgtgtgt gtatgtgtgc acatgtgtgt gcgcatgtgt gtgtgtgcgc gcatgtgtgt 4440
gtgcatgcat gttctcccat gcatgtgtac tgtggcaagg gagactttga ggaagagatt 4500
ccagtggctg agcagaaggg ctcgcattgc cctggcgaaa ggttggaagg cttcacctga 4560
gagtgtgtcg tggcctttgt catatccact gcttgattcc tttctttaaa aattattttt 4620
attgttttct acatatgaga accaccacac ctggctaatt tttgtatttt ttgtagagat 4680
ggggtttcac catgttgtcc cggctggtct caaactcccg ggcacaagag atccacctgc 4740
ctcagcctcc caaaatgctg ggactatagg catgagccac tgcacccagc cactgcttca 4800
ttcctggtgg ctgctgtgcc tggcatgttg cagatcctcc atgaatatgc atttgaatga 4860
atgaatgaat gaatgaatga atgaatggag atgacgcctc agagattctt tcttttgaga 4920
tgaggtctca ttctgtcacc cagactagag ggcagtggtg caatcacagc tcaccacagc 4980
ctcaacctcc tgggcctccc aagtagctgc gatcacaggt gtgcaccaac atgcccagct 5040
aatttttttt tttaattttt aatttgtaca gacagggtct tgctgtgttg cccaggctgg 5100
tctcaaactc ctgggctcaa gtggtcctcc cacctaagct tccccaaata ctgggattat 5160
aggtgtgagc cactgtgccc aggcttgcct cagatatttg aaggctggga aggattttgc 5220
aaagctggga aaaggaaaag gcattcccag cagaggggat agcaggtgga aatacataat 5280
taaaaaaaaa aaacgtggag cagatccagc gcagtggctc atgcctgtaa tcccagcact 5340
ttgggaggca gagcagggag gattgcttga gtctaggagt tcaagaccag cctgggtaac 5400
atagaaagac cctgtctcta caaaaacaca aaaaattagc caggcgtggt ggtgcatgcc 5460
tgtagtacca gctacttgag aagctgaggc aggaggactg cttgaagcca ggagtttgag 5520
accagcctgg gcaacatagt gagaccccgt gtctacaaaa agtaaacatt tatatatata 5580
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tttttttttt ttttgagatg gagttttcac tcttgttacc caggctggag tgcaatggcg 5700
tgatcttggc tcaccagaac ctccgcctcc tgggttcaaa caattctcct gcctcagcct 5760
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gatgtctttt aattttctgg aggaaaaagc aaagcaaaag aagcagtgga tattttaaga 6000
ctaaaaagga aaacaaaaaa aggagataga gcaggccaga cgtggtggct caacgtctgt 6060
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agcctgacca acatggtgaa accctgtttc aaaatacaaa aaattagctg ggcgtggtgg 6180
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aggtggaggt tgcagtgagc cgagatcacg ccattgcact ccagcctggg cgacaagtaa 6300
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gtgcagtggc tatgcggtgg cactatagga ggctgaggcg ggcagatcac ctgaggtcag 6420
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aaaattagcc aggtgtagtg gtgtgcgcct gtggtaccag ctactcaaga ggcgaaggca 6540
gggaagattg cttgagccca ggagtttgag gctatagtga gctgtgatca tgccactgca 6600
ctccagcctg ggcaatagtg tgagactctg tctcaaaaga aagaacatgg ccaggcgtgg 6660
tggctcacac ctgtaatccc agcactttgg gaggccgagg cagtcagatc atgaggccag 6720
tttgaaacca gcctggccaa catggtgaaa ccctgtctct actaaaaata caaaaattag 6780
ccaggcgtgg tggcatgccc ccgtaatccc agctacttgg gggtctgagg cagaagaatt 6840
gcttgaaacc gggaggcaga ggttgcagtg agccgagatc gtgtcattgc actctagtct 6900
gggcgacaga gcaagactcc gtcttggaaa aaaatttaaa aaaa 6944
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<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
cugugcgugu gacagcggcu ga 22
<210> 6
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
ugucugcccg caugccugcc ucu 23
Claims (17)
- TMED2, CD43, 또는 그 조합에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는, 개체의 간암 진단용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 물질은 생체로부터 분리된 마이크로베지클의 표면에 존재하는 TMED2, CD43, 또는 그 조합에 특이적으로 결합하는 물질인 것인 간암 진단용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, mir-210, mir-346, 또는 그 조합의 발현을 측정하는데 사용하기 위한 시약을 더 포함하는 것인 조성물.
- 청구항 3에 있어서, 상기 시약은 mir-210, mir-346, 또는 그 조합에 결합하거나, mir-210에 상보적인 뉴클레오티드 서열, mir-346에 상보적인 뉴클레오티드 서열, 또는 그 조합에 결합하는 것인 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 물질은 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 리간드, 기질, 저해제, 작용제, 길항제, 보조인자, 또는 그 조합인 것인 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 물질은 검출가능한 표지가 부착된 것인 조성물.
- 개체로부터 분리된 시료와 TMED2, CD43, 또는 그 조합에 특이적으로 결합하는 물질을 접촉시켜 상기 마이크로베지클과 상기 물질을 결합시키는 단계; 및
시료 중 상기 마이크로베지클 중의 상기 물질의 수준을 측정하는 단계;를 포함하는, 개체의 간암 진단하는 방법. - 청구항 7에 있어서, 대조군 대비 상기 물질의 수준이 높은 경우, 상기 개체는 간암에 걸린 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 청구항 8에 있어서, 상기 대조군은 개체가 정상인, 간경변 (cirrhosis), 또는 그 조합인 것을 제외하고는 동일한 조건에 측정된 것인 방법.
- 청구항 7에 있어서, 상기 접촉시키는 단계 후, 접촉 산물로부터 상기 마이크로베지클을 분리하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 청구항 10에 있어서, 상기 분리하는 단계는 원심분리, 자성을 이용한 분리, 고체 지지체에 결합시키는 단계를 포함하는 분리, 또는 그 조합을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 11에 있어서, TMED2, CD43, 또는 그 조합에 특이적으로 결합하는 물질은 검출가능한 표지가 부착된 것인 방법.
- 청구항 7에 있어서, 상기 마이크로베지클 중의 종양 마커의 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 청구항 13에 있어서, 상기 분리된 마이크로베지클 중의 mir-210, mir-346, 또는 그 조합의 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 청구항 14에 있어서, 대조군 대비 TMED2, CD43, mir-210, mir-346, 또는 그 조합의 수준이 높은 경우, 개체는 간암에 걸린 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 청구항 14에 있어서, 상기 시약은 검출가능한 표지가 부착된 것인 방법.
- 개체로부터 분리된 시료와 TMED2, CD43, 또는 그 조합에 특이적으로 결합하는 물질을 접촉시켜 상기 마이크로베지클과 상기 물질을 결합시키는 단계; 및
시료 중 상기 마이크로베지클 중의 상기 물질의 수준을 측정하는 단계;를 포함하는, 개체의 간암 진단에 필요한 정보를 얻는 방법.
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