KR20150035432A - A composition for preventing or treating retinopathy, comprising an ERR-γ inhibitor, and use thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 ERR-γ의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 포함하는, 망막병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 망막병증의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품 조성물, 및 망막병증 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating retinopathy comprising a substance which inhibits the expression or activity of ERR-y, a composition for health functional food for preventing or ameliorating retinopathy, and a method for screening a therapeutic agent for retinopathy .
ERR-γ(estrogen-related receptor gamma)는, NR3B3로 불리는 인간 핵 수용체 단백질로서, ESRRG 유전자에 의해 인코딩된다. ERR-γ는 전사에 있어서 지속적 활성제(constitutive activator)로서 기능한다. ERR-γ는 스테로이드 호르몬 수용체의 핵 호르몬 수용체 패밀리의 일 구성원이며, 아직 생리학적으로 활성인 리간드는 규명되지 않아, 오판(orphan) 수용체로 분류된다. ERR-γ 단백질은 심근에서 지방산 산화 및 미토콘드리아 바이오제네시스(biogenesis)에 연관된 다양한 유전자의 주요 조절자로 알려진 바 있다. 그러나, 망막병증에서의 ERR-γ의 역할은 아직 알려진 바 없으며, ERR-γ의 발현 또는 활성을 조절하는 물질을 안구 투여용 제제에 적용한 바 없었다.
ERR-gamma (estrogen-related receptor gamma) is a human nuclear receptor protein called NR3B3, encoded by the ESRRG gene. ERR-γ functions as a constitutive activator in transcription. ERR-γ is a member of the nuclear hormone receptor family of steroid hormone receptors, and yet physiologically active ligands are not identified and are classified as orphan receptors. The ERR-y protein has been known to be a major regulator of various genes involved in fatty acid oxidation and mitochondrial biogenesis in the myocardium. However, the role of ERR-gamma in retinopathy has not been known yet, and substances that regulate the expression or activity of ERR-gamma have not been applied to ocular administration formulations.
망막(retina)은, 안구의 가장 안쪽을 덮고 있는 신경조직으로 빛에 대한 정보를 전기적 정보로 전환하여 뇌로 전달하는 역할을 수행하는 기관이다. 망막병증(retinopathy)은 눈의 망막에 만성 또는 급성에 의한 손상으로 발병하는 질환으로, 계속 진행중인 염증 및 혈관 리모델링(vascular remodeling)을 수반한다. 또한, 망막병증은 당뇨병 또는 고혈압과 같은 전신 질환의 시각적 발현으로 나타나기도 한다. 이러한 망막병증에는 당뇨망막병증, 고혈압성 망막병증 및 미숙아 망막병증 등이 있다.
The retina is the nerve tissue that covers the innermost part of the eyeball. It is an organ that converts light information into electrical information and transmits it to the brain. Retinopathy is a disease caused by chronic or acute damage to the retina of the eye, followed by ongoing inflammation and vascular remodeling. In addition, retinopathy may be caused by visual manifestations of systemic diseases such as diabetes or hypertension. Such retinopathies include diabetic retinopathy, hypertensive retinopathy and retinopathy of prematurity.
그 중 당뇨망막병증은, 당뇨가 있는 환자에서 특유의 망막의 순환장애가 발생하여 발병하는 질환으로, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 신증과 함께 당뇨병에서 3대 미세혈관합병증 중 하나이다. 당뇨망막병증의 발생은 당뇨병을 앓은 유병기간과 연관이 있는데 제1형에 해당하는 30세 이전에 진단된 당뇨병의 경우 유병기간이 5년 이하일 때 17%, 15년 이상일 때 98%에서 당뇨망막병증이 발생하고, 이 중 더 악화된 증식당뇨망막병증은 10년 이하일 때는 약 1%, 35년 이상에서는 67%에서 발생한다. 제2형 당뇨병에서는 유병기간 5년 이하에서는 29%, 15년 이상에서는 78%이며, 증식당뇨망막병증은 5년 이하에서는 2%, 15년 이상에서는 16%에서 발생한다고 알려져 있다. 당뇨병 환자의 망막에서는 망막모세혈관 기저막의 비후, 혈관주위 세포의 소실, 미세혈관류의 발생 등 모세혈관에서 혈관의 변화가 나타나며, 시간이 경과함에 따라 광범위한 모세혈관 비관류에 이어 망막신생혈관 역시 발생할 수 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 당뇨망막병증은 당뇨 합병증의 일종이기는 하나, 일단 발병하게 되면 혈당 조절 등으로 그 진행을 막기 어려우며, 망막병증에 특이적인 치료 방법이 요구된다.
Among them, diabetic retinopathy is a disease caused by a circulatory disorder of the retina unique to diabetic patients, and it is one of the three major microvascular complications in diabetic patients with diabetic neuropathy and diabetic nephropathy. The incidence of diabetic retinopathy is related to the duration of diabetes mellitus. In the case of
이러한 배경 하에 본 발명자들은 망막병증을 효과적으로 치료할 수 있는 치료 표적을 규명하고자 예의 노력한 결과, ERR-γ 단백질이 망막병증에 있어서 효과적인 치료 표적이 됨을 규명하였고, ERR-γ 단백질의 활성을 억제시키는 경우, 망막병증의 치료 효과를 가져올 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
Under these circumstances, the inventors of the present invention have found that ERR-y protein is an effective therapeutic target for retinopathy as a result of efforts to identify therapeutic targets for effectively treating retinopathy. When ERR-y protein is inhibited, The present invention has been completed upon confirming that it can bring about the therapeutic effect of retinopathy.
본 발명의 하나의 목적은 ERR-γ(estrogen-related receptor gamma)의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 포함하는, 망막병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다. It is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating retinopathy, which comprises a substance that inhibits the expression or activity of ERR-gamma (estrogen-related receptor gamma).
본 발명의 또 다른 목적은 ERR-γ의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 포함하는, 망막병증의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a health functional food composition for preventing or ameliorating retinopathy comprising a substance that inhibits the expression or activity of ERR-y.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 약학적 조성물을 망막병증 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 망막병증의 치료 방법을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a method for treating retinopathy comprising the step of administering the pharmaceutical composition to a suspected retinopathy subject.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 망막병증이 유발된 분리된 망막 시료에 망막병증 치료 후보 물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 후보 물질이 처리된 망막 시료에서 ERR-γ 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준 또는 이의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 망막병증 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
Yet another object of the present invention is to provide a method of treating retinopathy, comprising the steps of: (a) treating a retinopathy treatment candidate substance in a separated retinopathy sample induced retinopathy; And (b) measuring mRNA of the ERR-y gene or a protein level thereof or an activity thereof in the retinal specimen treated with the candidate substance.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 ERR-γ(estrogen-related receptor gamma)의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 포함하는, 망막병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
In one aspect of the present invention, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating retinopathy comprising a substance that inhibits the expression or activity of ERR-gamma (estrogen-related receptor gamma) .
본 발명에서 용어, "ERR-γ(estrogen-related receptor gamma)"는 NR3B3로 불리는 인간 핵 수용체 단백질이다. ERR-γ는 전사에 있어서 지속적 활성제(constitutive activator)로서 기능하며, 이의 생리학적 리간드가 알려지지 않아 오판(orphan) 수용체로 분류된다. 본 발명에서는, 상기 ERR-γ가 망막병증 동물 모델에서 정상 대조군에 비하여 그 발현이 현저하게 증가되고, 이의 활성을 억제시키는 경우, 망막병증에 대한 치료 효과를 가져올 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 목적상 상기 ERR-γ는 망막병증의 예방 또는 치료를 위한 표적 분자 및 진단을 위한 표적 분자를 의미한다.
In the present invention, the term "ERR-gamma (estrogen-related receptor gamma)" is a human nuclear receptor protein called NR3B3. ERR-γ functions as a constitutive activator in transcription, and its physiological ligand is not known and is classified as an orphan receptor. In the present invention, it was confirmed that ERR-y significantly enhanced the expression of ERR-y in an animal model of retinopathy compared to a normal control, and that the ERR-y inhibitory effect could have a therapeutic effect on retinopathy. Therefore, for the purpose of the present invention, ERR-y refers to a target molecule for the prevention or treatment of retinopathy and a target molecule for diagnosis.
본 발명에 따르면, ERR-γ의 발현 또는 활성을 저해하는 물질이라면, 이는 본 발명의 조성물에 포함되어 망막병증의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다. According to the present invention, if it is a substance that inhibits the expression or activity of ERR-y, it may be included in the composition of the present invention and used for the prevention or treatment of retinopathy.
본 발명에서 용어, "ERR-γ의 발현 또는 활성을 저해하는 물질"은 ERR-γ에 직접적으로 작용하거나 그의 리간드에 간접적으로 작용하는 등의 방식을 통해 ERR-γ의 발현을 전사 수준에서 감소시키거나 단백질로 번역 후 분해를 촉진시키는 방식으로 발현을 저해하는 물질, 또는 그 활성을 방해함으로써 ERR-γ 활성을 감소시키는 모든 물질을 포함할 수 있다. The term "a substance which inhibits the expression or activity of ERR-y" in the present invention means that the expression of ERR-y is reduced at the transcription level by a method such as directly acting on ERR-y or indirectly acting on its ligand Or to inhibit expression in a manner that promotes post-translational degradation into protein, or to reduce ERR-y activity by interfering with its activity.
상기 ERR-γ 발현을 저해하는 물질은 ERR-γ를 표적으로 하여 ERR-γ의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 화합물, 핵산, 펩타이드, 바이러스 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터 등 그 형태에 제한없이 사용 가능하다. 상기 ERR-γ 발현 또는 활성을 저해하는 물질의 예로, 바람직하게는 ERR-γ mRNA의 발현을 저해하는 올리고 뉴클레오티드, ERR-γ 단백질의 활성을 억제하는 항체, 앱타머 또는 화합물 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. The substance that inhibits the expression of ERR-y is not limited to a compound, a nucleic acid, a peptide, a virus, or a vector containing the nucleic acid, which can target ERR-y and inhibit the expression or activity of ERR- It is possible. Examples of the substance that inhibits ERR-y expression or activity include an oligonucleotide that inhibits the expression of ERR-y mRNA, an antibody, an aptamer, or a compound that inhibits the activity of ERR-y protein, But is not limited thereto.
본 발명에서 사용되는 용어 "올리고 뉴클레오티드"는 수 개 내지 수십 개의 뉴클레오티드가 인산디에스테르 결합(phosphodiester bond)으로 중합되어 형성된 중합체를 의미한다. 상기 ERR-γ mRNA의 발현을 저해하는 올리고 뉴클레오티드로의 예로, 바람직하게는 ERR-γ에 특이적인 안티센스 올리고 뉴클레오티드(antisense oligonucleotides), 앱타머, 또는 siRNA(small interfering RNA) 등을 들 수 있으나 이들에 한정되지 아니한다.The term "oligonucleotide " as used herein refers to a polymer formed by polymerizing several to several tens of nucleotides in a phosphodiester bond. Examples of oligonucleotides that inhibit the expression of ERR-y mRNA include antisense oligonucleotides, aptamers, or siRNA (small interfering RNA), which are specific for ERR-gamma, It is not limited.
본 발명에서 사용되는 용어 "안티센스 올리고 뉴클레오티드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 유도체를 의미하는 것으로서 mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명에서 상기 ERR-γ mRNA의 발현을 저해하는 올리고 뉴클레오티드는 ERR-γ mRNA에 상보적인 서열을 갖는 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 유도체로서, 상기 ERR-γ mRNA에 결합하여 상기 ERR-γ mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 등을 방해하거나 또는 ERR-γ mRNA의 그 밖의 다른 모든 생물학적 기능 또는 활성을 저해할 수 있다.As used herein, the term "antisense oligonucleotide" refers to DNA or RNA, or derivatives thereof, that contain a nucleic acid sequence complementary to the sequence of a specific mRNA, and binds to a complementary sequence in the mRNA, It acts to inhibit translation. In the present invention, the oligonucleotide which inhibits ERR-γ mRNA expression is DNA or RNA having a sequence complementary to ERR-γ mRNA, or a derivative thereof. The oligonucleotide binds to ERR-γ mRNA, Translation, translocation into the cytoplasm, maturation, or the like, or may inhibit all other biological functions or activities of ERR-y mRNA.
상기 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 길이는 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 6 내지 100 염기일 수 있고, 보다 바람직하게는 8 내지 60 염기일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 10 내지 40 염기일 수 있다. 상기 안티센스 올리고 뉴클레오티드는 당해 기술 분야에서 사용되는 통상의 방법에 따라 생체 내(in vivo) 에서 합성되거나, 시험관 내(in vitro)에서 합성되어 생체 내로 투여될 수 있다. 생체 내에서 안티센스 RNA를 합성하는 방법의 비제한적인 예로 다중 클로닝 부위 (Multi-cloning site; MCS)의 기원(origin)이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 방법을 들 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 RNA를 합성하는 방법의 비제한적인 예로 RNA 중합효소 I를 이용하는 방법을 들 수 있다.The length of the antisense oligonucleotide is not particularly limited, but may be preferably 6 to 100 bases, more preferably 8 to 60 bases, and still more preferably 10 to 40 bases. The antisense oligonucleotides may be synthesized in vivo according to a conventional method used in the art, or may be synthesized in vitro and administered in vivo. As a non-limiting example of a method for synthesizing antisense RNA in vivo, there is a method in which antisense RNA is transcribed using a vector whose origin is a multi-cloning site (MCS) in the opposite direction . As a non-limiting example of a method for synthesizing antisense RNA in vitro, there is a method using RNA polymerase I.
본 발명의 ERR-γ mRNA의 발현을 억제하는 안티센스 올리고 뉴클레오티드는 ERR-γ의 염기 서열을 참조하여 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 공지의 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다.The antisense oligonucleotides that inhibit the expression of ERR-y mRNA of the present invention can be easily produced by a known method having a knowledge in the art with reference to the nucleotide sequence of ERR-y.
본 발명에서 사용되는 용어 "앱타머"는 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 상기 앱타머는 그 염기 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가질 수 있으며, 항원-항체 반응과 같이 특정 물질에 대하여 높은 친화력을 가질 수 있다. 앱타머는 소정의 표적 분자에 결합함으로써 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다.As used herein, the term "aptamer " refers to a single-stranded oligonucleotide, which refers to a nucleic acid molecule having binding activity for a given target molecule. The aptamer may have various three-dimensional structures depending on its nucleotide sequence, and may have a high affinity for a specific substance such as an antigen-antibody reaction. An aptamer can inhibit the activity of a given target molecule by binding to a predetermined target molecule.
본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 변형된(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 그 형태가 직쇄상 또는 환상(環狀)일 수 있으나 이들에 한정되지 아니한다. 본 발명의 ERR-γ mRNA의 발현을 억제하는 앱타머는 ERR-γ의 염기 서열을 참조하여 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 공지의 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다.
The aptamer of the present invention may be RNA, DNA, modified nucleic acid, or a mixture thereof, and the form thereof may be linear or cyclic, but is not limited thereto. The aptamers which inhibit the expression of ERR-y mRNA of the present invention can be easily produced by a known method having a person skilled in the art with reference to the nucleotide sequence of ERR-y.
본 발명에서 사용되는 용어 "siRNA"는 RNA 간섭(interference) 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자로서, 21 내지 25 뉴클레오티드 크기의 작은 RNA 조각을 의미한다. 상기 siRNA는 표적 유전자의 발현을 저해할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운(knockdown) 방법 또는 유전자 치료 방법으로 사용될 수 있다. 이중 가닥의 RNA가 다이서(dicer)에 의해 절단되어 생성될 수 있는 상기 siRNA는 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 해당 mRNA의 발현을 억제할 수 있다.As used herein, the term "siRNA" is a nucleic acid molecule capable of mediating RNA interference or gene silencing, and refers to a small RNA fragment of 21-25 nucleotide size. Since the siRNA can inhibit the expression of the target gene, it can be efficiently used as a gene knockdown method or a gene therapy method. The siRNA, which can be produced by cleavage of double stranded RNA by a dicer, specifically binds to mRNA having a complementary sequence and can inhibit the expression of the mRNA.
본 발명에서 사용될 수 있는 siRNA는 ERR-γ의 염기 서열을 참조하여 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 공지의 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다. 상기 siRNA를 제작하는 방법의 비제한적인 예로는 siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법, 시험관 내 전사를 이용하여 siRNA를 합성하는 방법, 시험관 내 전사에 의해 합성된 긴 이중 가닥 RNA를 다이서를 이용해 절단하여 제작하는 방법, shRNA 발현 플라스미드 또는 바이러스성 벡터의 세포 내 전달을 통하여 발현시키는 방법 또는 PCR(polymerase chain reaction) 유도 siRNA 발현 카세트(cassette)의 세포 내 전달을 통하여 발현시키는 방법 등을 들 수 있다.The siRNA that can be used in the present invention can be easily prepared according to a known method having a knowledge in the art with reference to the nucleotide sequence of ERR-y. Non-limiting examples of methods for producing the siRNA include a method of directly synthesizing siRNA, a method of synthesizing siRNA using in vitro transcription, a method of cutting long double-stranded RNA synthesized by in vitro transcription using a dicer A method of expressing siRNA expression plasmid or viral vector through intracellular delivery, or a method of expressing siRNA expression through intracellular delivery of a polymerase chain reaction (siRNA) expression cassette.
본 발명에서 사용되는 용어 "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역 글로불린 분자를 포함하는 단백질 분자로, 체내에 특정 항원이 침입한 경우 이를 특이적으로 인식하여 반응하는 항원 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 말한다. 하나의 항체 분자는 두 개의 중사슬(heavy chain) 및 두 개의 경사슬(light chain)로 구성되어 있으며, 이들 각각의 중사슬 및 경사슬은 가변 영역과 고정 영역을 포함한다. 상기 가변 영역은 3개의 상보성 결정 부위 (Complementarity Cetermining Region: CDR) 및 4개의 구조 형성 부위 (Framework Region; FR)를 포함하며, 상기 상보성 결정 부위들에 의해 항체와 항원 사이의 결합 부위가 형성되어 특정 항원에 대한 항체의 결합 특이성이 생성될 수 있다.As used herein, the term "antibody" is a protein molecule that comprises an immunoglobulin molecule immunologically reactive with a specific antigen. The protein molecule serves as an antigen receptor that specifically recognizes and reacts when specific antigens intrude into the body Protein molecule. One antibody molecule consists of two heavy chains and two light chains, each of which has a variable region and a light chain. The variable region includes three complementarity determining regions (CDRs) and four framework regions (FRs), and binding sites between the antibody and the antigen are formed by the complementary crystal regions, The binding specificity of the antibody to the antigen can be generated.
본 발명에서 사용될 수 있는 항체는 ERR-γ 단백질의 활성을 억제하는 항체라면 특별히 제한되지 아니하며, 예를 들어, 다클론 항체, 단일클론 항체 또는 항체 단편 등을 모두 포함할 수 있다. 또한 키메라성 항체 또는 이종 결합 항체 등과 같이 유전 공학적으로 제작된 항체들도 모두 포함할 수 있다.The antibody that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it is an antibody that inhibits the activity of the ERR-y protein, and may include, for example, a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, or an antibody fragment. Also included are all genetically engineered antibodies, such as chimeric antibodies or heterologous binding antibodies.
또한, 상기 ERR-γ의 활성을 저해하는 물질을 화합물의 형태일 수 있으며, 바람직하게는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In addition, the substance that inhibits the activity of ERR-y may be in the form of a compound, preferably a compound represented by the following formula (1), but is not limited thereto.
[화학식 1][Chemical Formula 1]
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은, (Z)-4-(1-{4-[2-(디메틸라미노)에톡시]페닐}-5-히드록시-2-페닐펜트-1-엔일)페놀로 명명된다.
The compound represented by the above formula (1) is a compound represented by the formula (1): (Z) -4- (1- {4- [2- (dimethylamino) ethoxy] phenyl} -5- .
이러한 ERR-γ의 발현 또는 활성을 저해하는 물질은, 망막병증의 예방 또는 치료를 위하여 본 발명의 조성물에 포함된다. Such a substance that inhibits the expression or activity of ERR-y is included in the composition of the present invention for the prevention or treatment of retinopathy.
본 발명에서 용어, "망막병증(retinopathy)"은 눈의 망막에 만성 또는 급성에 의한 손상으로 발병하는 질환이다. 이러한 망막병증은 계속 진행중인 염증 및 혈관 리모델링(vascular remodeling)을 수반할 수 있다. 또한, 망막병증은 당뇨병 또는 고혈압과 같은 전신 질환의 시각적 발현으로 나타나기도 한다. 이러한 망막병증의 종류로는 당뇨망막병증(diabetic retinopathy) 및 미숙아 망막병증(retinopathy of prematurity, ROP) 등이 있다. The term "retinopathy" in the present invention refers to a disease caused by chronic or acute damage to the retina of the eye. Such retinopathy may involve ongoing inflammation and vascular remodeling. In addition, retinopathy may be caused by visual manifestations of systemic diseases such as diabetes or hypertension. The types of retinopathy include diabetic retinopathy and retinopathy of prematurity (ROP).
여기서, 당뇨망막병증은 전신 질환인 당뇨병에 의한 말초 순환 장애에 따라 장애가 생겨 시력 감소가 발생하는 눈의 합병증을 의미한다. 당뇨망막병증은 초기에는 증상이 없으나, 황반부의 침범이 일어나게 되면서 시력 저하를 나타낸다. 당뇨망막병증은 미세혈관류, 정맥확장, 망막출혈, 망막경색, 황반부종, 신생혈관, 초자체출혈, 견인성 막 등 다양한 병리학적 특징을 수반하여, 이러한 현상이 안저 증상으로 관찰되면 당뇨망막병증으로 진단된다. 당뇨망막병증은 상기와 같은 다양한 증상이 복합적으로 수반되어 발병 또는 진행하는 질환이다. Herein, diabetic retinopathy refers to complications of the eye in which visual acuity is reduced due to impairment of peripheral circulatory disorder due to diabetes, which is a systemic disease. Diabetic retinopathy is symptom-free in the early stages, but it causes a decrease in visual acuity as the macular involvement occurs. Diabetic retinopathy is associated with various pathological features such as microvascular, venous enlargement, retinal hemorrhage, retinal infarction, macular edema, neovascularization, vitreous hemorrhage, tractional membrane, Is diagnosed. Diabetic retinopathy is a disease that occurs or progresses due to a combination of various symptoms as described above.
또한, 미숙아 망막병증은 미숙아, 특히 저체중 출생아에게서 발생할 수 있는 증식성 망막병증이다. 출생 시 망막의 혈관이 완전히 형성되지 않은 미숙아에게 출생 후 혈관형성 과정에 장애가 발생하면 망막의 혈관형성부위와 혈관무형성 부위의 경계에서 비정상적인 섬유혈관증식이 발생하며, 이에 의해 망막이 박리되면서 최종적으로 실명을 초래할 수 있다.
Also, retinopathy of prematurity is a proliferative retinopathy that can occur in premature babies, especially in underweight babies. If a premature infant with no retinal blood vessels is obstructed during postnatal angiogenesis, abnormal fibrovascular proliferation occurs at the border of the retinal angiogenic and vascular anomalous regions, resulting in retinal detachment and eventual blindness ≪ / RTI >
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"이란, 본 발명의 조성물을 투여에 의해 망막병증의 발병을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서 사용되는 용어 "치료"란, 본 발명의 조성물의 투여에 의해 망막병증의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.As used herein, the term "prevention" means any action that inhibits or delays the onset of retinopathy by administration of the composition of the present invention. As used herein, the term "treatment" refers to any action that causes the symptoms of retinopathy to be improved or benefited by administration of the composition of the present invention.
본 발명의 ERR-γ의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 포함하는 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체와 함께 제제화되어 식품, 의약품, 사료 첨가제 및 음용수 첨가제 등으로 제공될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 투여되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다.The composition comprising the substance that inhibits the expression or activity of ERR-y of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier. The composition may be formulated together with the carrier and used as a food, a medicine, a feed additive, a drinking water additive or the like Can be provided. The term "pharmaceutically acceptable carrier " as used herein refers to a carrier or diluent that does not disturb the biological activity and properties of the compound being administered, without irritating the organism.
본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다. 또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 희석제, 분산제, 계면 활성제, 결합제 및/또는 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화하여 사용할 수 있다.
The type of the carrier that can be used in the present invention is not particularly limited, and any carrier conventionally used in the art and pharmaceutically acceptable may be used. Non-limiting examples of the carrier include saline, sterilized water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and the like. These may be used alone or in combination of two or more. In addition, if necessary, other conventional additives such as an antioxidant, a buffer and / or a bacteriostatic agent can be added to the composition, and a diluent, a dispersant, a surfactant, a binder and / or a lubricant may be additionally added thereto to form an aqueous solution, a suspension, Capsules, granules, tablets or the like.
본 발명의 상기 약학적 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 상기 투여 방식의 비제한적인 예로, 조성물을 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있으며, 망막병증에 대한 치료제인 점에서 안구 투여 방식으로 투여할 수 있다.The mode of administration of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited and may be conventionally used in the art. As a non-limiting example of the above mode of administration, the composition can be administered orally or parenterally, and can be administered by eye administration in that it is a therapeutic agent for retinopathy.
상기 약학적 조성물은 목적하는 투여 방식에 따라 다양한 제형으로 제작될 수 있다. 경구 투여용 제형의 비제한적인 예로는, 트로키제(troches), 로젠지(lozenge), 정제, 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등을 들 수 있다.The pharmaceutical composition may be manufactured into various formulations depending on the intended administration mode. Non-limiting examples of formulations for oral administration include troches, lozenges, tablets, aqueous suspensions, oily suspensions, prepared powders, granules, emulsions, hard capsules, soft capsules, syrups, .
본 발명의 조성물을 정제 또는 캡슐 등과 같은 경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여, 락토오스, 사카로오스(Saccharose), 솔비톨(Sorbitol), 만니톨(Mannitol), 전분, 아밀로펙틴(Amylopectin), 셀룰로오스(Cellulose) 또는 젤라틴(Gelatin) 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트(dicalcium phosphate) 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕괴제; 스테아르산 마그네슘(magnesium stearate), 스테아르산 칼슘(calcium stearate), 스테아릴 푸마르산 나트륨(sodium stearyl fumarate) 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스(polyethylene glycol wax) 등과 같은 윤활유 등을 포함할 수 있다. 나아가 캡슐 제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체 등을 추가로 함유할 수 있다.In order to formulate the composition of the present invention into a form for oral administration such as tablets or capsules, it is possible to formulate the composition of the present invention by mixing it with lactose, saccharose, sorbitol, mannitol, starch, amylopectin, cellulose or gelatin Gelatin and the like; Excipients such as dicalcium phosphate and the like; Disintegrating agents such as corn starch or sweet potato starch; Lubricants such as magnesium stearate, calcium stearate, sodium stearyl fumarate or polyethylene glycol wax, and the like. Furthermore, in the case of a capsule formulation, in addition to the above-mentioned substances, a liquid carrier such as a fatty oil may be further contained.
본 발명의 상기 조성물을 비경구 투여하는 방법으로는, 예를 들어 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여 등을 이용할 수 있으며, 망막병증에 대한 치료제인 점에서 안구 투여 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Examples of the method for parenteral administration of the composition of the present invention include intravenous administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, subcutaneous administration or local administration, and the administration of ocular administration for the treatment of retinopathy And the like, but is not limited thereto.
상기 비경구 투여를 위한 제형으로는, 예를 들어 피하 주사, 정맥 주사 또는 근육 내 주사 등의 주사용 형태; 좌제 주입 방식; 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있으나 이에 제한되지 아니한다. 상기 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플(ampoule) 또는 바이알(vial)의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 상기 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.Formulations for such parenteral administration include, for example, injectable forms such as subcutaneous, intravenous or intramuscular injection; Suppository injection system; Or an aerosol formulation that allows for inhalation through the respiratory tract, but is not limited thereto. In order to formulate the injectable preparation, the composition of the present invention may be mixed with a stabilizer or a buffer in water to prepare a solution or suspension, which may be formulated for unit administration of an ampoule or a vial. When formulated for spraying with an aerosol or the like, a propellant or the like may be blended with the additive such that the water-dispersed concentrate or the wet powder is dispersed.
본 발명의 약학적 조성물에 적합한 도포, 분무 또는 투여량은, 상기 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로는 물론, 투여 대상이 되는 개체의 나이, 체중, 성별, 질병 증상의 정도, 섭취하는 음식, 배설 속도 등과 같은 요인들에 의해 다양해 질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.
The amount of application, spray or dose suitable for the pharmaceutical composition of the present invention can be determined by the formulation method, administration method, administration time and / or route of administration, as well as the age, weight, sex, The amount of food to be ingested, the rate of excretion, and the like, and those skilled in the art will readily determine and prescribe dosages effective for the desired treatment.
본 발명의 일 실시예에서는 망막병증 동물모델의 경우, 정상 대조군에 비하여 ERR-γ의 발현 수준이 현저하게 증가하는 것을 확인하여(실시예 2), ERR-γ가 망막병증에 있어 치료 표적이 될 수 있음을 확인하였다. 또한, 망막병증 모델에서 본 발명에 따른 ERR-γ 저해제인 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 처리에 의해 VEGF의 발현이 효과적으로 감소됨을 확인함으로써, ERR-γ 저해제가 망막병증의 예방 또는 치료 효과를 가지고 오는 것을 확인하였다(실시예 3 및 4).
In one embodiment of the present invention, ERR-gamma expression level was significantly increased in the retinopathy animal model compared to the normal control (Example 2), indicating that ERR-gamma is a therapeutic target in retinopathy Respectively. Further, by confirming that the expression of VEGF is effectively reduced by treatment of the compound represented by
또 하나의 양태로서, 본 발명은 ERR-γ의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 포함하는, 망막병증의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품 조성물을 제공한다. In another aspect, the present invention provides a health functional food composition for preventing or ameliorating retinopathy comprising a substance that inhibits the expression or activity of ERR-y.
상기 ERR-γ 및 이의 발현 또는 활성을 저해하는 물질에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.The substances that inhibit ERR-y and its expression or activity are as described above.
본 발명의 상기 건강기능식품 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.When the health functional food composition of the present invention is used as a food additive, the composition may be added as it is or may be used together with other food or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method.
상기 식품의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 비제한적인 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.The kind of the food is not particularly limited, and includes food in a conventional sense. Non-limiting examples of foods to which the material can be added include dairy products including meats, sausages, breads, chocolates, candies, snacks, confectionery, pizza, ramen noodles, other noodles, gums, ice creams, , A drink, an alcoholic beverage, and a vitamin complex.
본 발명의 상기 건강기능식품 조성물이 음료 조성물인 경우, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비제한적인 예로 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 수크로오스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 들 수 있다. 상기 첨가되는 추가 성분의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.When the health functional food composition of the present invention is a beverage composition, various flavoring agents, natural carbohydrates, and the like may be contained as additional components such as ordinary beverages. Non-limiting examples of such natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose and fructose; Disaccharides such as maltose and sucrose; Natural sweetening agents such as dextrin, cyclodextrin; Synthetic sweetening agents such as saccharin and aspartame, and the like. The proportion of the additional component added may be appropriately determined by a person skilled in the art.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 주스, 과일 음료 또는 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 사용되거나 2 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가물의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
In addition to the above, the health functional food composition of the present invention may contain various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloid thickening agents, pH adjusting agents, stabilizers, , Alcohols, carbonating agents used in carbonated drinks, and the like. In addition, the food composition of the present invention may contain flesh for the production of natural fruit juice, fruit drinks or vegetable drinks and the like. These components may be used independently or in combination of two or more. The ratios of these additives can also be suitably selected by those skilled in the art.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 망막병증 의심 개체 내에 투여하는 단계를 포함하는, 망막병증 치료 방법을 제공한다. In another aspect, the present invention provides a method of treating retinopathy comprising administering the pharmaceutical composition in a subject suspected of retinopathy.
상기 약학적 조성물, 망막병증 및 치료에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다. The pharmaceutical composition, retinopathy and treatment are as described above.
본 발명의 상기 예방 또는 치료 방법은 구체적으로, 망막병증이 발병하였거나 발병할 위험이 있는 개체에 상기 ERR-γ의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 약학적 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함한다. 상기 약학적 조성물의 적합한 1일 총 사용량은 올바른 의학적 판단 범위 내에서 당업자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.Specifically, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising, as an active ingredient, a substance which inhibits the expression or activity of ERR-y in a subject who has developed or is at risk of developing retinopathy, And a pharmaceutically acceptable carrier. The appropriate total daily usage of the pharmaceutical composition may be suitably determined by those skilled in the art within the scope of sound medical judgment.
특정 동물에 대한 상기 ERR-γ의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 조성물의 구체적인 약학적 유효량은, 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 해당 개체의 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 성별 또는 식이는 물론, 상기 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간 등을 고려하여 결정될 수 있으며, 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있다.The specific pharmaceutically effective amount of the composition comprising the substance that inhibits the expression or activity of ERR-γ in a specific animal as an active ingredient depends on the kind and degree of the reaction to be achieved, the age, weight, general health status, Gender, or diet, as well as factors such as the time of administration of the composition, the route of administration and the fraction of the composition, the duration of treatment, and the like, as well as various factors, Lt; RTI ID = 0.0 > well-known < / RTI >
본 발명의 상기 예방 또는 치료 방법에서 상기 조성물을 투여하는 투여 경로 및 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며 목적하는 해당 부위에 상기 ERR-γ의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 조성물이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 구체적으로, 상기 ERR-γ의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 그 투여 경로의 비제한적인 예로는, 구강, 직장, 국소, 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 동맥 내, 경피, 비측 내 또는 흡입 등을 통하여 투여되는 것을 들 수 있다.
In the above-mentioned preventive or therapeutic method of the present invention, the administration route and method of administering the composition are not particularly limited, and a composition containing a substance that inhibits the expression or activity of the ERR-γ as an active ingredient reaches the target site As far as possible, depending on the route of administration and the mode of administration. Specifically, the composition containing the substance that inhibits the expression or activity of ERR-y as an active ingredient can be administered through various routes of oral or parenteral administration. Non-limiting examples of the administration route include oral, rectal, Intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, transdermal, intrathecal, or inhalation, and the like.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 망막병증이 유발된 분리된 망막 시료에 망막병증 치료 후보 물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 후보 물질이 처리된 망막 시료에서 ERR-γ 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준 또는 이의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 망막병증 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. In another aspect, the present invention provides a method of treating retinopathy, comprising the steps of: (a) treating a retinopathy treatment candidate substance in a separated retinopathy sample induced retinopathy; And (b) measuring mRNA of the ERR-y gene or a protein level thereof or an activity thereof in the retinal specimen treated with the candidate substance.
상기 ERR-γ 및 망막병증에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.The above ERR-y and retinopathy are as described above.
본 발명에 따르면, 망막병증에 있어서 ERR-γ 유전자는 치료 표적이 될 수 있으므로, 망막병증 치료 후보 물질을 분리된 망막 시료 또는 망막병증 동물 모델에 처리한 후, 망막 시료에서 이의 발현 또는 활성 변화를 측정함으로써 망막병증 치료제를 스크리닝할 수 있다. 구체적으로, 망막병증인 개체의 경우, 정상 대조군 개체에 비하여 망막에서 ERR-γ의 발현이 증가되어 있으므로, 망막병증인 개체에서 ERR-γ 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준 또는 이의 활성을 감소시킬 수 있는 물질은 망막병증 치료제로 판단될 수 있다.
According to the present invention, the ERR-gamma gene may be a therapeutic target in retinopathy. Therefore, it is preferable to treat the retinopathy therapy candidate substance in a separate retinal or retinal disease model, By screening, the therapeutic agent for retinopathy can be screened. Specifically, in the case of retinopathy, ERR-γ expression is increased in the retina as compared with the normal control, and thus it is possible to reduce the ERR-γ gene mRNA or its protein level or its activity in a retinopathy subject The substance can be judged as a remedy for retinopathy.
상기 스크리닝 방법에서 (a) 단계는 망막병증이 유발된 분리된 망막 시료, 구체적으로 망막병증 개체로부터 분리된 망막 시료 또는 망막병증 유발 물질이 처리된 망막 시료에 망막병증 치료 후보 물질을 처리하는 단계이다. In the above screening method, step (a) is a step of treating a retinal disease therapeutic candidate to a retinal specimen treated with a separated retinal specimen in which retinopathy has been induced, specifically, a retinal specimen separated from the retinopathic subject or a retinopathy inducing material .
본 발명에서 용어, "시료"란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 망막 세포 또는 조직이나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 망막병증 치료 후보 물질과 반응시킬 수 있다. In the present invention, the term "sample" includes tissue, cells, whole blood, serum, plasma, tissue autopsy sample (brain, skin, lymph node, spinal cord, etc.), cell culture supernatant, ruptured eukaryotic cell and bacterial expression system , Preferably retinal cells or tissue, but is not limited thereto. These biological samples can be reacted with candidate retinopathic remedies without manipulation or manipulation.
본 발명에서의 용어 "후보 물질"은 ERR-γ의 발현 또는 활성 수준을 감소시킬 수 있는 물질로, 올리고 뉴클레오티드, 단백질, 화합물 등을 제한없이 포함한다.
The term "candidate substance" in the present invention is a substance capable of reducing the level of expression or activity of ERR-y, and includes, without limitation, oligonucleotides, proteins, compounds and the like.
상기 스크리닝 방법에서 (b) 단계는 상기 후보 물질이 처리된 망막 시료에서 ERR-γ 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준 또는 이의 활성을 측정하는 단계이다. 이 단계에서 ERR-γ 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 검출은 노던 블롯(Northern blot), 웨스턴 블롯(western blot), 면역조직화학적 염색(immunohistochemical staining), 인 시추 혼성화 방법(in situ hybridization), 역전사효소 중합반응(Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR), 실시간 정량적 RT-PCR(real-time quantitative RT-PCR), ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 등을 이용하여 수행할 수 있다.
In the above screening method, step (b) is a step of measuring the mRNA of the ERR-γ gene or its protein level or its activity in the retinal specimen treated with the candidate substance. The detection of the ERR-y protein or the gene encoding the ERR-y protein at this stage can be carried out by Northern blotting, western blotting, immunohistochemical staining, in situ hybridization, (RT-PCR), real-time quantitative RT-PCR, and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
또한, 본 발명의 방법은, 추가로 (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 ERR-γ 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준 또는 이의 활성이 후보 물질이 처리되지 않은 시료에 비해 감소하면 망막병증 치료제로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
In addition, the method of the present invention further comprises the steps of: (c) if the mRNA or protein level of the ERR-y gene measured in the step (b) or its activity is decreased as compared with a sample not treated with the candidate substance, May further comprise a step of judging.
본 발명의 ERR-γ의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 포함하는 조성물은 망막병증을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
A composition comprising a substance that inhibits the expression or activity of ERR-y of the present invention can effectively prevent or treat retinopathy.
도 1은, 산소유도 망막병증 동물 모델에서, 망막병증의 유도 여부를 확인한 실험이다.
도 2는, 산소유도 망막병증 동물 모델의 망막에서 ERR-γ의 발현을 확인한 것으로, A는 대조군을, B는 산소유도 망막병증 동물 모델에 대한 실험 결과를 나타낸다.
도 3은, hVEGF 프로모터 및 ERR-γ 발현 벡터를 공동-형질감염(co-transfection)한 C2C12 세포에 화학식 1로 표시되는 화합물을 처리한 다음, VEGF 프로모터 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4에서, A는 생후 7일부터 12일까지 고산소 처리한 다음, 생후 12일부터 17일까지 정상산소로 복귀시켜 망막병증을 유도한 산소유도 망막병증 쥐에서 안구를 적출한 후, 망막을 분리하여 mRNA를 추출한 다음, PCR을 진행하여 VEGF mRNA의 발현을 확인하여 수치화한 결과를 나타내는 것이다. 또한, B는 생후 7일부터 12일까지 고산소 처리한 다음, 생후 12일에 정상 산소로 복귀시킨 쥐가 생후 14일이 되었을 때, 화학식 1로 표시되는 화합물을 망막 내 주입하고, 같은 개체의 반대쪽 눈에는 30% PEG(polyethylene glycol)을 주입하여 화학식 1로 표시되는 ERR-γ 저해제의 효과를 VEGF mRNA 측정으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5에서, RGC-5 세포에 데페록사민(Deferoxamine)을 100μM의 농도로 처리하고 ERR-γ 저해제를 도면에 표시된 농도로 동시에 처리한 다음, 12시간 후 mRNA를 추출하여 VEGF 및 액틴(actin)에 대한 PCR을 수행한 결과를 A에 나타내었다. 상기 도 5의 A 결과를 수치화한 결과를 B에 나타내었다. Fig. 1 is an experiment for confirming the induction of retinopathy in an animal model of oxygen induced retinopathy.
FIG. 2 shows the expression of ERR-y in the retina of an oxygen-induced retinopathy model animal, wherein A represents a control group and B represents an experimental result on an oxygen-induced retinopathy animal model.
FIG. 3 shows the results of measuring the VEGF promoter activity after treating a compound represented by
In Fig. 4, A is a high oxygen treatment from 7th to 12th day of life, and after returning to normal oxygen from 12th to 17th day of life, the eye is extracted from oxygen induced retinopathy rats induced retinopathy, MRNA was extracted and then PCR was performed to confirm the expression of VEGF mRNA. In addition, when B mice were hyperoxially treated from day 7 to 12 after birth, and the mice returned to normal oxygen at day 12 after 14 days of age, the compound represented by
In FIG. 5, RGC-5 cells were treated with deferoxamine at a concentration of 100 μM, ERR-γ inhibitors were simultaneously treated at the indicated concentrations, and 12 hours later, mRNA was extracted to form VEGF and actin, The results are shown in Fig. The results obtained by digitizing the results of A in FIG. 5 are shown in B.
이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 예에 의해 제한되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the following examples. However, the following examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited by the following examples.
실시예 1: 산소 유도 망막병증 유도 Example 1 Induction of Oxygen Induced Retinopathy
생후 7일 된 C57BL/6 마우스를 어미 쥐와 같이 75% 고산소(hyperoxia)에 총 5일간 노출시켰다(생후 7일-11일). 생후 12일에 고산소 챔버에서 꺼내어 다시 정상 산소(21% 산소)에 노출시켜 신생혈관 형성을 유도하였다. 5일 뒤인 생후 17일에 최대 혈관신생을 확인하였다. 대조군의 경우 같은 기간 동안 정상 산소에서 유지하였다.
Seven days old C57BL / 6 mice were exposed to 75% hyperoxia for 5 days (7 days to 11 days after birth) like mice. On the 12th day after birth, they were taken out of the high oxygen chamber and exposed again to normal oxygen (21% oxygen) to induce angiogenesis. Five days later, the maximal angiogenesis was confirmed at 17 days of age. The control group was maintained in normal oxygen for the same period.
고산소에 노출시킨 생후 12일과 17일 마우스의 안구를 각각 적출하여 4% 파라포름알데히드(PFA)에 4 ℃의 온도에서 고정시켰다. 1시간 고정 후, 각막과 공막, 렌즈, 유리체 등을 제거하고 망막만을 분리해내었다. 분리한 망막을 1% PFA에 1시간 고정시킨 후, 0.1% Tween 20을 이용하여 투과성(permeabilization)으로 만들었다. 그 다음, 1% BSA와 0.1% Triton X-100을 녹인 PBS에 망막을 넣어서 블롯킹을 하고, 햄스터 항-마우스 CD31 단일클론항체(Millipore, no. MA1398z), 다클론 래빗 항-신경교 섬유질 산성 단백질(glial fibrillary acidic protein) 항체(DakoCytomation, no. Z0334)를 넣어 반응시켰다(4 ℃, 밤새). 다음날, 알렉사 플루오르 488-컨쥬게이션된 항-햄스터 항체(Jackson ImmunoResearch, no. 127-545-160), 알렉사 플루오르 568-컨쥬게이션된 항-래빗 항체(Life Technologies, no. A11011)를 반응시키고, 망막의 가장 자리를 잘라 마운팅하였다.
At 12 and 17 days after exposure to high oxygen, the eyeballs of the mice were individually extracted and fixed at 4 ° C in 4% paraformaldehyde (PFA). After fixing for 1 hour, the cornea, sclera, lens, vitreous body, etc. were removed and only the retina was removed. The separated retinas were fixed in 1% PFA for 1 hour and permeabilized with 0.1% Tween 20. Then, the retina was blotted with PBS containing 1% BSA and 0.1% Triton X-100, and the hamster anti-mouse CD31 monoclonal antibody (Millipore, no. MA1398z), polyclonal rabbit anti- (DakoCytomation, no. Z0334) was added and reacted (4 ° C, overnight) with a glial fibrillary acidic protein antibody. The following day, Alexa Fluor 488-conjugated anti-hamster antibody (Jackson ImmunoResearch, No. 127-545-160), Alexa Fluor 568-conjugated anti-rabbit antibody (Life Technologies, The edge of the frame was cut and mounted.
그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서, A는 생후 12일 마우스의 망막에서 산소유도 망막병증의 유도를 확인한 결과로서, 망막 중앙(central retina) 중심에 비관류 지역(nonperfusion area)가 존재함을 나타낸다. 도 1에서, B는 생후 17일 마우스의 망막에서 산소유도 망막병증의 유도를 확인한 결과로서, 혈관신생이 유도되어 산소유도 망막병증이 유도되었음을 나타내었다. The results are shown in Fig. In FIG. 1, A indicates the presence of a nonperfusion area in the center of the central retina as a result of confirming the induction of oxygen-induced retinopathy in the retina of the mouse at day 12. In FIG. 1, B indicates the induction of oxygen induced retinopathy in the retina of the mouse at day 17 after birth, inducing angiogenesis and inducing oxygen induced retinopathy.
실시예 2: 산소유도망막병증 모델과 대조군에서의 ERR-γ 발현 비교 Example 2: Comparison of ERR-γ expression in oxygen-induced retinopathy model and control group
생후 17일된 쥐의 안구를 적출하여 4% PFA에 넣어 4℃에서 밤새 고정시키고, 파라핀 블록에 조직을 포매하여 4 ㎛ 두께로 절편을 잘랐다. 에피토프 회수 용액(IHC World, IW 1100)을 사용하여 항원 회수를 하였고, 3% H2O2로 내재적 퍼옥시다제를 블록킹하였다. IHC 과정은 울트라 비젼 LP 검출 시스템 HRP 폴리머 키트(Thermo Scientific, TL-060-HL)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 단일클론 항-인간 ERR-γ 항체(PPMX, no. H6812)는 1:200으로 희석하였고, 4 ℃에서 밤새 반응시켰다.
17-day-old rat eyes were removed, fixed in 4% PFA overnight at 4 ° C, and cut into sections with a thickness of 4 μm by embedding tissue in a paraffin block. Antigen retrieval was performed using an epitope recovery solution (IHC World, IW 1100) and the intrinsic peroxidase was blocked with 3% H 2 O 2 . The IHC procedure was performed using the UltraVision LP Detection System HRP Polymer Kit (Thermo Scientific, TL-060-HL) according to the manufacturer's instructions. Monoclonal anti-human ERR-y antibody (PPMX, no. H6812) was diluted 1: 200 and reacted overnight at 4 ° C.
그 결과를 도 2에 나타내었다. 그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 정상 산소에 둔 대조군(생후 17일)에 대한 결과(A)와 비교하였을 때, 망막병증 모델에서 ERR-γ의 발현이 증가한 결과를 나타내었다(B). 상기와 같은 결과는 ERR-γ 단백질이 망막병증의 진단 및 치료에 있어 효과적인 표적이 될 수 있음을 나타내는 결과이다.
The results are shown in Fig. As a result, as shown in FIG. 2, ERR-γ expression was increased in the retinopathy model (B) when compared with the result (A) for the control group (17 days after birth) in the normal oxygen. These results show that ERR-y protein can be an effective target in the diagnosis and treatment of retinopathy.
실시예 3: ERR-γ 저해제의 VEGF 프로모터 활성 억제 효과 확인Example 3 Confirmation of Inhibitory Effect of ERR-y Inhibitor on VEGF Promoter Activity
C2C12 세포를 실험 전 날 플레이트에 분주하여 자라게 하였다. 다음 날 hVEGF 프로모터와 ERR-γ, β-갈락토시다제(galactosidase) 발현 벡터를 TransIT®-LT1(Mirus, MIR 2305)와 반응시켜 형질감염(transfection)을 위한 소포(Liposome)를 형성하게 하였다. 일정 시간 반응 후, 발현 벡터 소포체를 C2C12 세포에 넣어주고 하루 동안 배양하였다. 다음 날 ERR-γ 저해제를 농도별로 처리하고 다시 하루 동안 배양하였다. 형질감염 48시간 후에 세포를 용해 (lysis) 시켜 프로모터 활성도를 측정하였다. 프로모터 활성도는 루시퍼라아제(Luciferase) 활성도를 측정하여 확인하고, 형질감염 효율의 확인은 β-갈락토시다제(galactosidase)의 활성도를 측정하여 한다. 프로모터의 활성도를 β- 갈락토시다제의 활성도로 보정하여 대조군 대비 실험 조건의 배수로 나타내었다.C2C12 cells were allowed to grow on the plate on the day before the experiment. The next day, the hVEGF promoter and ERR-γ, β-galactosidase expression vector were reacted with TransIT®-LT1 (Mirus, MIR 2305) to form a liposome for transfection. After a certain period of reaction, expression vector vesicles were added to C2C12 cells and cultured for one day. The next day, the ERR-γ inhibitor was treated by concentration and cultured again for one day. After 48 hours of transfection, the cells were lysed to measure the promoter activity. The activity of the promoter is checked by measuring the activity of luciferase, and the activity of β-galactosidase is determined by confirming the transfection efficiency. The activity of the promoter was corrected by the activity of? -Galactosidase and expressed as a multiple of the experimental conditions relative to the control group.
여기서 사용한 ERR-γ 저해제는 화학식 1로 표시되는 화합물 단일 종류로 ERR-γ 특이적 저해제이고, 첨단의료복합단지에서 합성 의뢰하여 사용하였다.
The ERR-y inhibitor used herein is a single type of compound represented by the formula (1), which is an ERR-y specific inhibitor, and was synthesized and used in a state-of-the-art medical complex.
그 결과를 도3에 나타내었다. 그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, ERR-γ의 발현 증가에 따라 증가된 VEGF 프로모터의 활성이 본 발명에 따른 ERR-γ 저해제의 처리에 따라 농도 의존적으로 감소하는 결과를 나타내었다.
The results are shown in Fig. As a result, as shown in FIG. 3, the activity of the VEGF promoter increased with increasing expression of ERR-y, which was dependent on the treatment with the ERR-y inhibitor according to the present invention.
실시예 4: 망막병증 모델에서 ERR-γ 저해제의 VEGF 발현 억제 효과 확인Example 4: Inhibitory effect of ERR-y inhibitor on VEGF expression in retinopathy model
(1) 산소유도망막병증 동물 모델에서 ERR-γ 저해제의 VEGF 발현 억제 효과 확인(1) Inhibitory effect of ERR-γ inhibitor on VEGF expression in an animal model of oxygen induced retinopathy
생후 7일 된 C57BL/6 마우스를 어미 쥐와 같이 75% 고산소(hyperoxia)에 총 5일간 노출시켰다(생후 7일-11일). 생후 12일에 고산소 챔버에서 꺼내어 다시 정상 산소(21% 산소)에 노출시켜 신생혈관 형성을 유도하였다. 정상 대조군의 경우 같은 기간 동안 정상 산소에서 유지하였다. 고산소에 노출시킨 생후 17일 마우스 및 정상 대조군의 안구를 각각 적출하여 각막과 공막, 렌즈, 유리체 등을 제거하고 망막만을 분리해내었다. 분리한 망막을 QIAzol Lysis 용액(QIAZEN, 79306)을 이용하여 mRNA를 추출하고, cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific, K1622)를 이용해 cDNA를 합성하였다. VEGF 프라이머는 정방향(forward) 5'-TTACTGCTGTACCTCCACC-3' (서열번호 1)/ 역방향(reverse) 5'-ACAGGACGGCTTGAAGATG-3' (서열번호 2)를 사용하여 1) 95 ℃ 10 min - 2) 95 ℃ 30s - 3) 57 ℃ 30s - 4) 72 ℃ 30s - 5) 72℃ 5min의 조건(2번에서 4번까지는 총 28번 반복)으로 PCR을 진행하였다. PCR 결과는 Image J 소프트웨어를 사용하여 수치화 하고, VEGF의 결과를 액틴(Actin) 결과로 보정하여 정상군 대비 산소유도 망막병증의 차이를 비교하였다. Seven days old C57BL / 6 mice were exposed to 75% hyperoxia for 5 days (7 days to 11 days after birth) like mice. On the 12th day after birth, they were taken out of the high oxygen chamber and exposed again to normal oxygen (21% oxygen) to induce angiogenesis. Normal controls were maintained in normal oxygen for the same period. After removal of the cornea, sclera, lens, vitreous body and the like, the retina was separated from the eyes of mice and normal controls on the 17th day after exposure to high oxygen. The separated retina was extracted with QIAzol Lysis solution (QIAZEN, 79306) and cDNA was synthesized using cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, K1622). The VEGF primer was amplified by PCR using 1) 95 °
그 결과를 도 4A에 나타내었다. 도 4A에 나타나있듯, 산소유도망막병증 모델에서는 정상군에 비하여 VEGF mRNA 발현이 증가한 결과를 나타내었다.
The results are shown in Fig. 4A. As shown in FIG. 4A, the expression of VEGF mRNA was increased in the oxygen-induced retinopathy model compared to the normal group.
또한, 상기 생후 12일에 정상산소로 복귀시킨 마우스의 생후 14일 시점에 ERR-γ 저해제인 (Z)-4-(1-{4-[2-(디메틸라미노)에톡시]페닐}-5-히드록시-2-페닐펜트-1-엔일)페놀 1mM의 농도로 망막 내 주입하였다. 같은 개체의 반대쪽 눈에는 30% PEG를 망막 내 주입하여, 본 발명에 따른 ERR-γ 저해제의 효과를 서로 비교하였다. 생후 17일에 상기 기술한 방법으로 망막을 수득하고, PCR을 진행하였다. (Z) -4- (1- {4- [2- (dimethylamino) ethoxy] phenyl} -1-piperidinone as an ERR-γ inhibitor at the 14th day of life of the mouse, 5-hydroxy-2-phenylpent-1-enyl) phenol at a concentration of 1 mM. 30% PEG was injected intrathecally into the opposite eye of the same subject to compare the effects of the ERR-y inhibitor according to the present invention with each other. On the 17th day after birth, retina was obtained by the above-described method and PCR was performed.
그 결과를 도 4B에 나타내었다. 도 4B에 나타나있듯, 산소유도 망막병증 마우스에서 30% PEG를 처리한 대조군에 비하여 본 발명에 따른 ERR-γ 저해제를 처리한 군에서 VEGF mRNA가 현저히 감소하는 결과를 나타내었다. 이러한 결과는 ERR-γ 저해제 처리를 통하여 망막병증의 치료 효과를 나타낼 수 있음을 시사하는 것이다.
The results are shown in Fig. 4B. As shown in FIG. 4B, VEGF mRNA was significantly reduced in the group treated with ERR-y inhibitor according to the present invention, as compared with the control group treated with 30% PEG in oxygenated retinopathy mice. These results suggest that ERR-γ inhibitor treatment may be effective for the treatment of retinopathy.
(2) 데페록사민 유도 망막병증 모델에서 ERR-γ 저해제의 VEGF 발현 억제 효과 확인(2) Inhibitory effect of ERR-γ inhibitor on VEGF expression in deferoxamine-induced retinopathy model
데페록사민을 망막신경절세포(retinal ganglion cell, RGC)인 RGC-5 세포(Rat RGC)에 처리하여 망막병증 상태를 유도하였다. 또한, ERR-γ 저해제인 (Z)-4-(1-{4-[2-(디메틸라미노)에톡시]페닐}-5-히드록시-2-페닐펜트-1-엔일)페놀을 5μM 또는 10μM의 농도로 데페록사민 처리와 동시에 처리하고, 12시간 동안 배양하였다. 그 후 mRNA를 추출하여 cDNA를 합성하고, VEGF 프라이머 정방향 5'- ATCATGCGGATCAAACCTCACCA-3' (서열번호 3)/ 역방향 5'- GAGCACTTT GGGTCCGGAGG-3' (서열번호 4)를 사용하여 상기 기술된 방법과 동일하게 PCR을 진행하였다. PCR 결과는 Image J 소프트웨어를 사용하여 수치화 하고, VEGF의 결과를 Actin 결과로 보정하여 나타내었다.
RGC-5 cells (Rat RGC), a retinal ganglion cell (RGC), were treated with deferoxamine to induce retinopathy. In addition, a solution of (Z) -4- (1- {4- [2- (dimethylamino) ethoxy] phenyl} -5-hydroxy-2-phenylpent-
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 ERR-γ 저해제의 처리에 의해 데페록사민 처리에 의해 증가된 VEGF의 발현이 농도 의존적으로 감소하는 결과를 나타내었다. 이러한 결과는 ERR-γ 저해제가 망막병증의 치료를 가지고 올 수 있음을 뒷받침하는 것이다.
As a result, as shown in Fig. 5, the expression of VEGF increased by treatment with the ERR-y inhibitor according to the present invention was decreased in a concentration-dependent manner. These results support that ERR-γ inhibitors can be used to treat retinopathy.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, it will be understood by those skilled in the art that the present invention may be embodied in other specific forms without departing from the spirit or essential characteristics thereof. In this regard, it should be understood that the above-described embodiments are to be considered in all respects as illustrative and not restrictive. The scope of the present invention should be construed as being included in the scope of the present invention without departing from the scope of the present invention as defined by the appended claims.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> A composition for preventing or treating retinopathy, comprising an ERR-gamma inhibitor, and use thereof <130> PA130521-KR-P1 <150> KR 10-2013-0114012 <151> 2013-09-25 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for VEGF <400> 1 ttactgctgt acctccacc 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for VEGF <400> 2 acaggacggc ttgaagatg 19 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for VEGF <400> 3 atcatgcgga tcaaacctca cca 23 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for VEGF <400> 4 gagcactttg ggtccggagg 20 <110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> A composition for preventing or treating retinopathy, comprising an ERR-gamma inhibitor, and use thereof <130> PA130521-KR-P1 <150> KR 10-2013-0114012 <151> 2013-09-25 <160> 4 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for VEGF <400> 1 ttactgctgt acctccacc 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for VEGF <400> 2 acaggacggc ttgaagatg 19 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for VEGF <400> 3 atcatgcgga tcaaacctca cca 23 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for VEGF <400> 4 gagcactttg ggtccggagg 20
Claims (7)
A pharmaceutical composition for preventing or treating retinopathy comprising a substance that inhibits the expression or activity of ERR-gamma (estrogen-related receptor gamma).
The composition according to claim 1, wherein the substance that inhibits expression or activity of ERR-y is an oligonucleotide, an antibody, or a compound that inhibits the expression of ERR-y mRNA.
[화학식 1]
3. The composition according to claim 2, wherein the substance inhibiting the activity of ERR-y is a compound represented by the following formula (1).
[Chemical Formula 1]
2. The composition of claim 1, wherein the composition is for ocular administration.
A composition for health functional food for preventing or ameliorating retinopathy comprising a substance which inhibits the expression or activity of ERR-y.
(b) 상기 후보 물질이 처리된 망막 시료에서 ERR-γ 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준 또는 이의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 망막병증 치료제의 스크리닝 방법.
(a) treating a retinopathy treatment candidate substance in a separate retinal sample in which retinopathy has been induced; And
(b) measuring mRNA of the ERR-gamma gene or a protein level thereof or an activity thereof in the retinal specimen treated with the candidate substance.
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