KR20150027765A - 재조합 인자 Xa 유도체의 정제방법 - Google Patents

Abstract

본 명세서에는 세린 프로테아제를 정제하기 위한 방법 및 키트가 개시되어 있다. 상기 방법은 상기 세린 프로테아제를 대두 트립신 저해제(STI) 기반 친화도 크로마토그래피에 장입시키는 단계, 및 상기 세린 프로테아제를 STI와 상기 세린 프로테아제 간의 상호작용을 방해하는 작용제를 포함하는 용리 완충제로 용리시키는 단계를 수반한다.

Description

재조합 인자 Xa 유도체의 정제방법{METHOD FOR PURIFICATION OF RECOMBINANT FACTOR Xa DERIVATIVES}

관련출원에 대한 상호참조

본 출원은 2012년 6월 14일자로 출원된 미국 가출원 특허 제61/659,821호에 대한 미국 특허법(35 U.S.C. § 119(e)) 하의 유익을 주장하며, 이 기초출원의 내용은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.

항응고제는, 예를 들어, 응고장애가 있거나, 움직이지 않고 누워있거나 또는 의료 수술을 겪는 해당 환자와 같이 혈병을 형성하는 경향이 있는 환자에서의 원치 않는 혈전증의 치료 또는 예방에서 시장에서의 필요를 제공한다. 그러나, 항응고제 요법의 주된 제한 중 하나는 치료와 관련된 출혈 위험이며, 과다복용의 경우에 또는 응급 수술 절차가 필요하다면, 항응고제 활성을 빠르게 반전시키는 능력에 대한 제한이다. 따라서, 모든 형태의 항응고제 요법에 대해 특이적이고 효과적인 해독제(antidote)가 고도로 바람직하다. 안전성 고려를 위해, 새로운 항응고제 약물의 개발에서 항응고제 해독제 쌍을 갖는 것이 또한 유리하다.

인자 Xa(factor Xa: fXa) 단백질의 이전에 보고된 변형 유도체는 미국 특허 제8,153,390호 및 제8,268,783호에 기재된 것과 같은 항응고제 표적화 fXa에 대한 해독제로서 유용하다. fXa 단백질의 변형 유도체는 항응고제에 결합하고/하거나 항응고제를 실질적으로 중화시킨다. 그러나, 이들 fXa 유도체에 도입된 특정 변형은 정제를 위한 몇몇 도전을 제기하는데, 응고 인자의 정제를 위한 통상적인 방법이 이들 변형 fXa 단백질에 유효하지 않을 수도 있기 때문이다.

본 명세서에는 세린 프로테아제를 정제하기 위한 방법 및 키트가 개시되어 있다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 세린 프로테아제를 수지 또는 칼럼과 같은 대두 트립신 저해제(soybean trypsin inhibitor: STI) 기반 친화도 크로마토그래피에 장입시키는 단계, 및 용리 완충제를 이용하여 폴리펩타이드를 용리시키는 단계를 수반한다. 일부 실시형태에서, 용리 완충제는 STI와 세린 프로테아제 간의 상호작용을 방해하는 경쟁적 작용제(agent)와 같은 작용제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 용리 완충제는 염 및/또는 세정제를 추가로 포함한다.

일 실시형태에서, 세린 프로테아제를 대두 트립신 저해제(STI) 기반 친화도 크로마토그래피에 장입시키는 단계, 및 세린 프로테아제를 STI와 세린 프로테아제 간의 상호작용을 방해하는 작용제를 포함하는 용리 작용제를 이용하여 용리시키는 단계를 포함하는, 세린 프로테아제를 정제하는 방법이 제공된다.

일부 양상에서, 용리 완충제는 염, 세정제 및/또는 카오트로픽제(chaotropic agent)를 추가로 포함한다.

일부 양상에서, 작용제는 벤즈아미딘, p-아미노벤즈아미딘, 알기닌, 소분자 fXa 저해제, 펩타이드 fXa 저해제, 및 펩티도미메틱(peptidomimetic) fXa 저해제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 경쟁적 작용제이다. 일부 양상에서, 경쟁적 작용제는 알기닌이다.

일부 양상에서, 세린 프로테아제는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 서열번호 1 또는 2에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖고, Gla 도메인의 적어도 일부의 결실 및 활성 부위에서의 돌연변이를 갖는 폴리펩타이드이다.

일부 양상에서, 세린 프로테아제는 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 서열번호 2에 대해 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖고, Gla 도메인의 적어도 일부의 결실 및 활성 부위에서의 돌연변이를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 양상에서, 세린 프로테아제는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 양상에서, 용리 완충제의 pH는 약 4.5 내지 약 10.5이다. 일부 양상에서, 용리 완충제의 pH는 약 5.0이다. 일부 양상에서, 용리 완충제의 pH는 약 7.4이다.

일부 양상에서, 용리 완충제는 약 250mM 알기닌 내지 약 1000mM 알기닌을 포함한다. 일부 양상에서, 용리 완충제는 약 500mM 알기닌을 포함한다. 일부 양상에서, 용리 완충제의 pH는 약 5.0이다.

일부 양상에서, 상기 방법은 용리된 세린 프로테아제에 이온 교환 칼럼을 이용하는 정제를 실시하는 단계를 추가로 포함한다.

본 개시내용의 방법에 의해 제조된 정제된 세린 프로테아제가 또한 제공된다.

일 실시형태에서, 대두 트립신 저해제(STI) 기반 친화도 크로마토그래피, 및 STI와 세린 프로테아제 간의 상호작용을 방해하는 경쟁적 작용제를 포함하는 용리 완충제를 포함하는 키트가 제공된다.

일부 양상에서, 용리 완충제는 알기닌을 추가로 포함한다. 일부 양상에서, 용리 완충제의 pH는 약 4.5 내지 약 10.5이다. 일부 양상에서, 용리 완충제는 약 250mM 알기닌 내지 약 1000mM 알기닌을 포함한다. 일부 양상에서, 키트는 중성 pH에서 약 250mM NaCl을 포함하는 세척 완충제를 추가로 포함한다.

도 1은 서열번호 1, 즉, 아미노산 106 내지 111에서 링커인 -RKRRKR-(서열번호 3)를 지니는 fXa 유도체(또한 r-해독제 전구체로서 지칭됨)를 도시한 도면.
도 2는 서열번호 2, 즉, r-해독제 전구체로부터 링커가 제거된 fXa 유도체(또한 r-해독제로서 지칭됨)를 도시한 도면.
도 3은 실시예 1에 기재된 바와 같은 벤즈아미딘-아가로스 친화성 수지 상에서의 정제된 r-해독제를 사용하는 장입 프로파일을 도시한 도면.
도 4는 실시예 1에 기재된 바와 같은 L-리신-아가로스 친화성 수지 상에서의 정제된 r-해독제를 사용하는 장입 프로파일을 도시한 도면.
도 5는 실시예 1에 기재된 바와 같은 아프로티닌-아가로스 친화성 수지 상에서의 정제된 r-해독제를 사용하는 장입 프로파일을 도시한 도면.
도 6은 실시예 1에 기재된 바와 같은 STI-아가로스 친화성 수지 상에서의 정제된 r-해독제를 사용하는 장입 프로파일을 도시한 도면.
도 7은 세포 배양물로부터 채취한 조건화된 배지(채취한 세포 배양물 유체)를 사용하는 STI-아가로스 장입 프로파일로서, 기능성 단백질이 STI 수지에 의해 포획된다는 것을 입증하는 도면(실시예 2에 기재된 바와 같음).
도 8은 실시예 2에 기재된 바와 같이 HQ-세파로스 전치칼럼(병류(flow-through) 방식) 상에서의 채취한 세포 배양물 유체를 사용하는 장입 프로파일을 도시한 도면.
도 9는 기능성 단백질이 STI-수지에 의해 포획된다는 것을 입증하는 STI-아가로스에 장입된 HQ-세파로스 FT-분획의 장입 프로파일을 도시한 도면.
도 10a 내지 도 10b는 실시예 2에 기재된 바와 같이 결합 단백질이 1M 벤즈아미딘에 의해 용리된다는 것을 도시한 도면. 1M 벤즈아미딘을 사용하는 용리 프로파일을 도 10a에 나타내고, STI 용리 및 풀링(pooled) 분획에 의한 웨스턴 블롯을 도 10b에 나타낸다. 분자 마커를 레인 1 및 1A에 로딩하고; FXa를 레인 2 및 2B에 로딩하며; STI-아가로스 칼럼으로부터 용리된 r-해독제를 도 10b의 레인 4 및 4B에 로딩한다.
도 11은 실시예 2에 기재된 바와 같은 벤즈아미딘 구배에 의한 용리 프로파일을 도시한 도면.
도 12는 실시예 2에 기재된 바와 같은 규모확장 절차의 용리 프로파일을 도시한 도면.
도 13은 25ℓ 배지(웨이브 백(wave bag))에 대한 r-해독제 정제 계획을 도시한 도면. UF = 초미세여과; MWCO = 분자량 컷-오프; UF/DF = 초미세여과/정용여과.
도 14는 실시예 2에 기재된 바와 같은 정제된 r-해독제의 SDS PAGE를 도시한 도면.
도 15는 실시예 3에 기재된 바와 같이 알기닌 용리 완충제를 사용하는 STI 친화성 칼럼의 용리 프로파일을 도시한 도면.
도 16은 실시예 3에 기재된 바와 같이 상이한 STI-수지(A-E)를 지니는 다양한 STI 친화도 칼럼으로부터의 장입 용리액을 이용한 환원은 염색 겔을 도시한 도면. 알기닌 완충제의 용리로 벤즈아미딘에 의한 용리와 유사한 생성물 프로파일을 수득하였다.

정의

본 개시내용의 실행은, 달리 표시되지 않는 한, 당업계의 기술 내에 있는 조직 배양, 면역학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학 및 재조합체 DNA를 사용할 것이다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition; Ausubel et al., eds. (1987) Current Protocols In Molecular Biology; MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds., (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual; Harlow and Lane, eds. (1999) Using Antibodies, a Laboratory Manual; 및 R.I. Freshney, ed. (1987) Animal Cell Culture] 참조.

본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "약"은 일반적으로 언급된 값 + 또는 - 10%의 범위의 해당 값을 의미한다.

본 명세서 및 특허청구범위에서 사용되는 바와 같은 단수 형태는, 달리 명확하게 지시되지 않는 한, 복수 대상을 포함한다.

용어 "단백질", "펩타이드" 및 "폴리펩타이드"는 상호호환적으로 사용되며, 이들의 가장 넓은 의미에서 2 이상의 서브유닛 아미노산, 아미노산 유사체 또는 펩티도미메틱의 화합물을 지칭한다. 서브유닛은 펩타이드 결합에 의해 연결될 수 있다. 다른 실시형태에서, 서브유닛은 다른 결합, 예를 들어 에스터, 에터 등에 의해 연결될 수 있다. 단백질 또는 펩타이드는 적어도 2개의 아미노산을 함유하며, 단백질 서열 또는 펩타이드 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 수에 대한 제한은 없다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "아미노산"은 글라이신 및 D와 L 광학 이성질체 둘 다, 아미노산 유사체 및 펩티도미메틱을 포함하는, 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산을 지칭한다. "펩티도미메틱"은 펩타이드를 모방하도록 설계된 작은 단백질 유사 쇄이다. 그들은 현조 펩타이드의 변형으로부터, 또는 펩토이드(peptoid) 및 β-펩타이드와 같은 펩타이드를 모방하는 유사한 시스템을 설계함으로써 만들어질 수 있다.

DNA 또는 RNA와 같은 핵산에 대해 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "단리된" 또는 "재조합체"는 다른 DNA 또는 RNA로부터 분리된 분자를 지칭한다. 용어 "단리된"은 또한 본 명세서에서 다른 세포 단백질로부터 단리된 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및 단백질을 지칭하기 위해 사용되며, 정제된 폴리펩타이드와 재조합체 폴리펩타이드를 둘 다 포함하는 것으로 의미된다. 예를 들어, 단리된 세포는 다른 표현형 또는 유전자형의 조직 또는 세포로부터 분리된 세포이다. 단리된 폴리뉴클레오타이드는 그것이 그 본래의 또는 천연 환경에서, 예를 들어 염색체 상에서 정상적으로 결합된 3' 및 5' 인접 뉴클레오타이드로부터 분리된다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 비천연적으로 생기는 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 항체 또는 이들의 단편(들)은 그것을 그의 천연적으로 생기는 상대와 구별하기 위한 "단리"를 필요로 하지 않는다.

단백질, 펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 용어 "생물학적 동등물"은 적어도 약 80% 상동성 또는 서열 동일성 및 대안적으로, 적어도 약 85%, 또는 대안적으로 적어도 약 90%, 또는 대안적으로 적어도 약 95%, 또는 대안적으로 98% 백분율 동일성 또는 서열 동일성을 가지며, 기준 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산에 대해 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 나타내는 것을 지칭한다.

"혼성화"는 상이한 "엄격함"의 조건 하에서 수행될 수 있는 혼성화 반응을 지칭한다. 혼성화 반응의 엄격함을 증가시키는 조건은 당업계에 널리 공지되어 있고 공개되어 있다: 예를 들어, 문헌[Sambrook, et al., 상기 참조]. 적절한 조건의 예는(엄격함이 증가되는 순서로): 인큐베이션 온도 25℃, 37℃, 50℃ 및 68℃; 완충제 농도 10 X SSC, 6 X SSC, 1 X SSC, 0.1 X SSC(여기서 SSC는 0.15M NaCl 및 15mM 시트레이트 완충제임) 및 다른 완충 시스템을 사용하는 이들의 동등물; 폼아마이드 농도 0%, 25%, 50% 및 75%; 인큐베이션 시간 5분 내지 24시간 및 세척의 증가된 지속시간, 증가된 빈도 또는 감소된 완충제 농도를 포함한다.

다른 서열에 대해 특정 백분율(예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%)의 "서열 동일성"을 갖는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 영역(또는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 영역)은 정렬시켰을 때, 두 서열을 비교함에 있어서 염기(또는 아미노산)의 백분율이 동일한 것을 의미한다. 정렬 및 백분율 동일성 또는 서열 동일성은 당업계에 공지된 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1987) 부록 30, 부문 7.7.18, 표 7.7.1]에 기재된 것을 사용하여 결정될 수 있다. 바람직하게는, 디폴트 파라미터가 정렬을 위해 사용된다. 바람직한 정렬 프로그램은 디폴트 파라미터를 사용하는 BLAST이다. 특히, 바람직한 프로그램은 다음의 디폴트 파라미터를 사용하는 BLASTN 및 BLASTP이다: 유전적 코드 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 둘 다; 컷오프 = 60; 예측값 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 설명 = 50 서열; 정렬 = 높은 스코어; 데이터베이스 = 비다중, 젠뱅크(GenBank) + EMBL + DDBJ + PDB + 젠뱅크 CDS 번역 + 스위스단백질(SwissProtein) + SPupdate + PIR. 이들 프로그램의 상세한 설명은 다음의 인터넷 주소에서 찾을 수 있다: ncbi.nlm.nih.gov/cgi bin/BLAST.

"상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 두 펩타이드 간의 또는 두 핵산 분자 간의 서열 유사성을 지칭한다. 상동성은 비교 목적을 위해 정렬될 수 있는 각 서열에서의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교 서열에서의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유된다면, 분자는 해당 위치에서 상동성이다. 서열 간의 상동성 정도는 매칭 수 또는 서열에 의해 공유되는 상동성 위치의 함수이다. "관련없는" 또는 "비-상동성" 서열은 본 개시내용의 서열 중 하나와, 예를 들어 40% 미만 동일성, 또는 대안적으로 25% 미만의 동일성을 공유한다.

단백질 단리와 관련하여 사용될 때 용어 "분획"은 구체적 특성에 기반하여 분리된 물질의 수집을 지칭한다. 구체적 특성은 비제한적 예시의 방법으로서 크기, 질량, 등전점, 전하 등을 포함한다.

"인자 Xa" 또는 "fXa" 또는 "fXa 단백질"은 혈액 응고 경로에서 세린 프로테아제를 지칭하는데, 이는 불활성 인자 X(fX)로부터 생성된다. 인자 Xa는 고유한 X아제(Xase)로서 알려진 복합체에서 인자 IXa와 그의 보조인자, 인자 VIIIa, 또는 외인성 X아제로서 알려진 복합체에서 인자 VIIa와 그의 보조인자, 조직 인자에 의해 활성화된다. fXa는 인자 Va와 막 결합 프로트롬빈분해효소 복합체를 형성하며, 프로트롬빈의 트롬빈으로의 전환을 촉매하는 프로트롬빈분해효소 복합체에서의 활성 성분이다. 트롬빈은 피브리노겐의 피브린으로의 전환을 촉매하는 효소인데, 이는 궁극적으로 혈병 형성을 야기한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "fXa 유도체"는 프로트롬빈분해효소 복합체로 조립됨에 있어서 fXa와 경쟁하지 않고 또한 fXa 저해제와 같은 항응고제에 결합하고/하거나 항응고제를 실질적으로 중화시키는 변형된 fXa 단백질을 지칭한다. 일부 실시형태에서, fXa 유도체는 응혈촉진(procoagulant) 활성이 감소되었거나 또는 응혈촉진 활성이 없다. fXa 유도체의 예는 본 명세서에서 서열번호 2(도 2) 또는 이의 생물학적 동등물로서 제공된다.

용어 "활성 부위"는 화학 반응이 일어나는 효소 또는 항체의 부분을 지칭한다. "변형된 활성 부위"는 증가되거나 또는 감소된 화학적 반응성 또는 특이성을 지니는 활성 부위를 제공하도록 구조적으로 변형된 활성 부위이다. 활성 부위의 예는 235 내지 488 아미노산 잔기를 포함하는 인간 인자 X의 촉매적 도메인, 및 fXa의 195 내지 448 아미노산 잔기를 포함하는 인간 인자 Xa의 촉매적 도메인을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 변형된 활성 부위의 예는 위치 rg306, Glu310, Arg347, Lys351, Lys414 또는 Arg424에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 지니는 인간 인자 Xa의 촉매적 도메인을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.

상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 유도체는 변형된 Gla 도메인을 가질 수 있거나, 또는 전체 Gla 도메인이 제거될 수 있다. fXa의 Gla 도메인은 야생형 fXa 단백질의 아미노산 잔기 1 내지 45를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 유도체는 완전한(1 내지 45) 또는 부분적 결실의(예를 들어, 1 내지 44, 1 내지 39, 또는 6 내지 39) Gla 도메인을 가진다.

"r-해독제 전구체"는 인간 야생형 fXa에 대해 3개의 돌연변이를 함유하는 서열번호 1로 표시되는 fXa 유도체를 지칭한다. 제1 돌연변이는 위치 6 내지 39에서 야생형 fX 단백질의 Gla-도메인의 결실이다. 제2 돌연변이는 활성화 펩타이드 서열 143 내지 194 아미노산을 -RKR-로 대체하는 것이다. 이는 경쇄와 중쇄를 연결하는 -RKRRKR-(서열번호 3) 링커를 만든다. 분비 시, 이 링커는 CHO에서 절단되어 절단된 2-쇄 폴리펩타이드를 생성한다. 용어 "절단된 2-쇄 폴리펩타이드"는 서열번호 2의 폴리펩타이드, 또는 서열번호 2에 대해 80% 동일성을 가지고, 2개의 쇄를 가지며 이황화 결합에 의해 함께 연결되는 폴리펩타이드를 지칭한다. N-말단 쇄는 서열번호 2의 아미노산 1 내지 105로 이루어지며, C-말단 쇄는 서열번호 2의 아미노산 106 내지 359로 이루어진다. 선택적으로, LC 쇄는 링커의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 추가적인 잔기는 링커 폴리펩타이드의 불완전한 제거로부터 초래된다. 제3 돌연변이는 활성 부위 잔기 S379의 Ala 잔기로의 돌연변이이다(분비된 인간 fX 서열에 기반한 아미노산 넘버링). 이 아미노산 치환은 서열번호 1 및 2의 아미노산 296 및 290에 각각 대응한다.

용어 "r-해독제"는 링커(서열번호 1)의 제거 전의 또는 링커(서열번호 2)의 제거 후의 폴리펩타이드를 지칭할 수 있다. 본 명세서에 전문이 참조로서 포함된 미국 출원 제13/766,652호는 fXa 저해제에 대한 해독제로서 작용하는 절단된 2-쇄 r-해독제 단백질로의 1 쇄 r-해독제 전구체의 개선되거나 또는 향상된 처리를 위한 방법 및 세포를 기재한다.

"STI" 또는 "대두 트립신 저해제"는 대두 또는 이의 생물학적 동등물로부터 단리된 트립신 저해제를 지칭한다. 트립신 저해제는 크기가 약 20kDa이며, 트립신(단백질 분해 효소)뿐만 아니라 칼리크레인, 인자 Xa 및 플라스민 활성을 감소시킨다. STI는 라이프 테크놀로지즈(Life Technologies)(뉴욕주 그랜드 아이슬란드에 소재)와 같은 공급업자로부터 상업적으로 입수가능하다. STI의 예는 젠뱅크 등록번호 NP_001238611을 갖는 글라이신 맥스(Glycine max)(대두)로부터의 KTI3 쿠나이츠(Kunitz) 트립신 저해제이다.

용어 "경쟁적 작용제"는 STI와 세린 프로테아제 간의 전하-전하 상호작용의 방해에 의해, 또는 세린 프로테아제에 결합을 위해 STI와 경쟁함으로써, STI 친화성 칼럼으로부터의 세린 프로테아제의 용리를 도울 수 있는 분자이다. 비제한적 예는 벤즈아미딘, p-아미노벤즈아미딘, 알기닌, 소분자 fXa 저해제, 펩타이드 fXa 저해제, 및 펩티도미메틱 fXa 저해제를 포함한다.

용어 "인자 Xa 저해제" 또는 "인자 Xa의 저해제"는 시험관내 및/또는 생체내에서 프로트롬빈의 트롬빈으로의 전환을 촉매하는 응고 인자 Xa의 활성을 직접적으로 또는 간접적으로 저해할 수 있는 화합물, 펩타이드, 펩타이드모방체를 지칭한다. 공지된 fXa 저해제의 예는, 폰다파리눅스(fondaparinux), 이드라파리눅스(idraparinux), 바이오티닐화된 이드라파리눅스, 에녹사파린(enoxaparin), 프라그민(fragmin), NAP-5, rNAPc2, 조직 인자 경로 저해제, DX-9065a(예를 들어, 문헌[Herbert, J.M., et al, J Pharmacol Exp Ther . 1996 276(3):1030-8]에 기재된 바와 같음), YM-60828(예를 들어, 문헌[Taniuchi, Y., et al, Thromb Haemost . 1998 79(3):543-8]에 기재된 바와 같음), YM-150(예를 들어, 문헌[Eriksson, B.I. et. al, Blood 2005;106(11), 초록 1865]에 기재된 바와 같음), 아픽사반(apixaban), 리바록사반(rivaroxaban), PD-348292(예를 들어, 문헌[Pipeline Insight: Antithrombotics - Reaching the Untreated Prophylaxis Market, 2007]에 기재된 바와 같음), 오타믹사반(otamixaban), 라작사반(razaxaban)(DPC906), BAY 59-7939(예를 들어, 문헌[Turpie, A.G., et al, J. Thromb . Haemost . 2005, 3(11):2479-86]에 기재된 바와 같음), DU-176b(예를 들어, 문헌[Hylek EM, Curr Opin Invest Drugs 2007 8(9):778-783]에 기재된 바와 같음), LY517717(예를 들어, 문헌[Agnelli, G., et al, J. Thromb . Haemost . 2007 5(4):746-53]에 기재된 바와 같음), GSK913893, 베트릭사반(betrixaban)(이하에 기재되는 바와 같음) 및 이들의 유도체를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 저분자량 헤파린(Low molecular weight heparin: "LMWH")은 또한 인자 Xa 저해제로 여겨진다.

용어 "카오트로픽제"는 단백질 및 핵산과 같은 거대분자의 구조를 방해하며 변성시키는 물질을 의도한다. 카오트로픽제는, 예를 들어 뷰탄올, 에탄올, 구아니디늄 클로라이드, 리튬 퍼클로레이트, 염화마그네슘, 페놀, 프로판올, 도데실황산나트륨, 티오유레아 및 유레아를 포함한다.

방법

본 개시내용은 세린 프로테아제를 함유하는 샘플로부터의 활성 형태에서 세린 프로테아제를 정제하기 위한 방법을 기재한다. 이들 방법은 세린 프로테아제의 정제를 위한 통상적인 방법보다 더 우수하다. 추가로, 상기 방법은 심지어 변형된 세린 프로테아제의 정제에서 효과적인데, 야생형 fXa에 비해 r-해독제에서의 변형과 같은 변형은 프로테아제의 결합 및/또는 효소적 활성에 영향을 미친다.

인자 Xa 및 다른 세린 프로테아제는 벤즈아미딘-세파로스 친화성 크로마토그래프를 사용하여 정제될 수 있다는 것이 나타났다. 초기 검사(예를 들어 실시예 1참조)는 Gla 도메인이 없는 특정 fXa 유도체가 Gla 도메인의 결실에 기인하여 Q 세파로스와 같은 통상적인 이온 교환 크로마토그래프에 대해 낮은 친화성을 가진다는 것을 나타낸다. 놀랍게도, r-해독제는 벤즈아미딘-세파로스 친화성 크로마토그래프, 또는 소 리간드의 다른 유사한 상업적으로 입수가능한 친화성 크로마토그래프에 결합되지 않는다. 본 개시내용은 STI-기반 친화도 크로마토그래피 및 경쟁적 작용제 및 선택적으로 염 및 세정제에 의한 용리 단계를 사용하는 세린 프로테아제의 정제를 기재한다.

세린 프로테아제는 앞서 기재된 바와 같이, 예를 들어 제13/766,652호, 또는 당업계에 공지된 재조합체 단백질 생성의 다른 방법에 의해 재조합적으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 단백질은 DNA 작제물(즉, 플라스미드, 바이러스 벡터, 코스미드, 발현 벡터, 파지미드(phagemid), 포스미드(fosmid), 및 인공 염색체, 예컨대, 박테리아 인공 염색체, 효모 인공 염색체 및 인간 인공 염색체)에 클로닝될 수 있고, 유전자 전달 기술, 예컨대, 인산칼슘 형질감염 및 폴리펙틴과 같은 화학물질 기반 형질감염, 및 전기천공법, 광학 형질감염, 및 유전자 전기이동과 같은 비화학물질 기반 형질감염에 의해 적합한 숙주 세포 내로 도입된다. 적합한 숙주 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 동물 세포, 포유류 세포, 뮤린 세포, 래트 세포, 양 세포, 시미안 세포 및 인간 세포를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아닌 원핵 세포 및 진핵 세포를 포함한다. 세포는 이어서 초음파 또는 동결 융해와 같은 물리적 기법에 의해 또는 세정제 또는 용해 완충제(lysis buffer), 예컨대, 150mM NaCl, 1.0% 이게팔(IGEPAL)(등록상표) CA 630, 0.5% 데옥시콜산나트륨, 0.1% SDS 및 50mM 트리스(Tris)를 함유하는 RIPA 완충제(라디 면역침강 분석(Radi Immunoprecipitation Assay)), pH 8.0의 사용에 의해, 또는 원심분리 또는 여과와 같은 물리적 분리에 의해 용해되어 포유류 세포 배양물로부터 분명하게 채취된 배양 유체를 얻을 수 있다. 얻어진 가용성 단백질 추출물은 이어서 본 명세서에 기재된 정제 방법에서 사용될 수 있다.

단백질 추출물은 대두 트립신 저해제(STI) 기반 친화도 크로마토그래피에 적용된다. 대두 트립신 저해제는 20kDa 단백질이고, 특정 단백질의 정제를 위해 고체 지지체 수지 상에 고정될 수 있다. 대두 트립신 저해제에 추가로, 다른 트립신 저해제 단백질, 예컨대, 혈청, 리마콩, 소 췌장 또는 난백점소 또는 이들의 변형된 형태로부터 단리된 것이 또한 사용될 수 있다. 또한 특정 프로테아제 저해제, 특히 세린 프로테아제 저해제가 r-해독제, 세린 프로테아제 또는 다른 인자 Xa 유도체를 정제하기 위한 목적을 위해 친화도 수지를 제조하는데 사용될 수 있다는 것이 상정된다. 이들 프로테아제 저해제로부터의 적합한 프로테아제 저해제의 동정은 본 명세서에 개시된 방법을 이용하여 수행될 수 있다.

이어서 세린 프로테아제는 경쟁적 작용제, 염, 세정제 또는 카오트로픽제를 포함하는 용리 완충제를 이용하여 용리될 수 있다. 경쟁적 작용제는 세린 프로테아제에 결합을 위해 STI와 경쟁함으로써 STI와 세린 프로테아제 간의 상호작용을 방해한다. 경쟁적 작용제의 비제한적 예는 벤즈아미딘, 알기닌, 소분자 fXa 저해제, 펩타이드 fXa 저해제, 또는 펩티도미메틱 fXa 저해제를 포함한다. 직접적 인자 Xa 저해제는 NAP-5, rNAPc2, 조직 인자 경로 저해제, DX-9065a, YM-60828, YM-150, 아픽사반, 리바록사반, TAK-442, PD-348292, 오타믹사반, 에독사반(edoxaban), LY517717, GSK913893, 라작사반, 베트릭사반 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 이들의 조합물을 포함한다. fXa의 펩타이드 저해제는 본 명세서에 모든 목적을 위하여 참조로서 포함되는 문헌[Betz et al., "Inhibition of Factor Xa by a Peptidyl-α-ketothiazole Involves Two Steps. Evidence for a Stabilizing Conformational Change," Biochemistry (1999), 38, 14582-14591]에 기재된 바와 같은 트라이펩타이드 케토 티아졸 및 대응하는 알데하이드를 포함한다.

일 실시형태에서, 경쟁적 작용제는 알기닌이다. 알기닌에 의한 용리는 그것이 GRAS(일반적으로 안전하다고 인정되는 물질(Generally Recognized As Safe)) 부형제이고 정제 단백질로부터 제거될 필요가 없기 때문에 유리하다. 알기닌의 추가적인 이점은 그것이 세린 프로테아제(예를 들어, r-해독제)의 용해도를 사실상 개선시키며, 최종 제형에서 부형제로서 사용될 수 있다는 것이다.

용리 완충제에 사용되는 알기닌 또는 경쟁적 작용제의 농도는 약 250mM 내지 약 1000mM일 수 있다. 일 실시형태에서, 용리 완충제에서 알기닌 또는 경쟁적 작용제의 농도는 약 500mM이다. 추가 실시형태에서, 농도는 약 250mM, 또는 약 300mM, 또는 약 350mM, 또는 약 400mM, 또는 약 450mM, 또는 약 550mM, 또는 약 600mM, 또는 약 650mM, 또는 약 700mM, 또는 약 750mM, 또는 약 800mM, 또는 약 850mM, 또는 약 900mM, 또는 약 1M이다. 용리 완충제는 선택적으로 염, 세정제, 또는 카오트로픽제를 추가로 포함한다. 본 명세서에 개시된 방법 및 키트의 용리 완충제에서 유용한 염은 염화나트륨, 염화암모늄, 시트르산나트륨, 시트르산칼륨, 염화칼륨, 염화마그네슘, 염화칼슘, 인산나트륨, 인산칼슘, 인산암모늄, 인산마그네슘, 인산칼륨, 황산나트륨, 황산암모늄, 황산칼륨, 황산마그네슘, 황산칼슘 등을 포함한다. 본 명세서에 개시된 방법 및 키트의 용리 완충제에서 유용한 세정제는, 예를 들어, 폴리솔베이트 80, 유레아, 구아니딘 등을 포함한다.

본 명세서에 기재된 방법 및 키트에서 용리 완충제의 pH는 세린 프로테아제의 불활성화 및/또는 침강을 야기하는 일 없이 수지 상에 흡수된 세린 프로테아제 단백질을 효과적으로 용리시키는 것이다. 특정 fXa 유도체, 예컨대, r-해독제는 낮은 pH에서 불활성화되거나 또는 침전된다. 특정 실시형태에서, 용리 완충제의 pH는 약 4.5 내지 약 10.5이다. 다른 실시형태에서, 용리 완충제의 pH는 약 pH 5.0이다. 다른 실시형태에서, 용리 완충제의 pH는 약 pH 7.4이다. 대안적으로, 용리 완충제의 pH는 적어도 약 4.5, 약 5.5, 약 6, 약 6.5, 약 7, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.5, 약 9, 약 9.5, 또는 적어도 약 10이다. 다른 실시형태에서, 용리 완충제의 pH는 약 5.5, 약 6, 약 6.5, 약 7, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.5, 약 9, 약 9.5, 약 10 이하, 또는 약 10.5 이하이다. 일 실시형태에서, 용리 완충제의 pH는 벤즈아미딘이 경쟁적 작용제로서 사용될 때 약 7.4이고, 알기닌이 경쟁적 작용제로서 사용될 때 pH 5.0이다.

특정 실시형태에서, 세린 프로테아제는, 예를 들어 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 서열번호 1 또는 2에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드인 fXa 유도체이다. 일부 실시형태에서, 서열번호 1 또는 2에 대해 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 2와 실질적으로 동일한 활성을 가진다. 서열번호 1로 표시하는 fXa 유도체는 fXa에 대해 3개의 돌연변이를 함유한다. 제1 돌연변이는 야생형 단백질 내 위치 6 내지 39에서 FX의 Gla-도메인에서의 결실이다. 제2 돌연변이는 활성화 펩타이드 서열 143 내지 194 aa을 -RKR-로 대체한다. 이는 경쇄와 중쇄를 연결하는 -RKRRKR-(서열번호 3) 링커를 만들었다. 분비 시, 이 링커는 2-쇄 fXa 분자(서열번호 2)를 야기하는 CHO에서 절단된다. 제3 돌연변이는 활성 부위 잔기 S379의 Ala 잔기로의 돌연변이이다(분비된 인간 fX 아미노산 서열에 기반함). 이 아미노산 치환은 서열번호 1 및 2의 아미노산 296 및 290에 각각 대응한다. fXa 유도체는 프로트롬빈분해효소 복합체 내로 조립됨에 있어 fXa와 경쟁하지 않지만, 대신에 fXa 저해제와 같은 항응고제에 결합하고/하거나 항응고제를 실질적으로 중화시킨다. 해독제로서 유용한 유도체는 고유한 응혈촉진 및 항응고제 활성이 감소되거나 또는 제거되도록 변형되는 반면, 저해제에 결합되는 능력은 남아있다. 구조적으로, 유도체는 응혈촉진 활성이 없거나 또는 감소된 응혈촉진 활성을 제공하도록 변형된다. "응혈촉진 활성"은 본 명세서에서 혈액 응고 또는 혈병 형성을 야기하는 작용제의 능력으로서 지칭된다. 감소된 응혈촉진 활성은 응혈촉진 활성이 야생형 fXa에 비해 적어도 약 50%, 또는 약 90% 초과, 또는 약 95% 초과만큼 감소되었다는 것을 의미한다. 관련 실시형태에서, 서열번호 2에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 야생형 인자 Xa에 비해 감소된 응혈촉진 활성을 가진다. 추가 실시형태에서, 서열번호 2에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 프로트롬빈분해효소 복합체 내로 조립되지 않는다.

일 실시형태에서, 세린 프로테아제는 칼럼 상에 세린 프로테아제를 흡수시키는 조건 하에서 칼럼에 첨가(장입)되고, 칼럼은 병류에서 상기 칼럼 및 오염 단백질 또는 분자에 세린 프로테아제를 지속적으로 흡수시키는 세척 완충제로 세척될 수 있다. 일 실시형태에서, 세척 완충제는 염을 포함하며 중성 pH에 있을 수 있다. 용어 "중성 pH"는 약 6 내지 약 8의 pH를 의미하는 것으로 의도된다. 특정 실시형태에서, 세척 완충제는 중성 pH에서 약 200 내지 약 500mM NaCl을 포함한다. 다른 실시형태에서, pH는 약 6, 또는 약 7 또는 약 8이다.

본 명세서에 개시된 방법은, 예를 들어 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 혼합 모드 수지, 배제 크로마토그래피, 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동, 친화성 크로마토그래피, 또는 등전점 전기영동과 같은 다른 정제 및 크로마토그래피 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 이온 교환 칼럼에 폴리펩타이드를 함유하는 용액을 적용하는 단계를 추가로 포함한다.

적합한 양이온-교환 수지는 넓은 pH 범위에 걸쳐 폴리펩타이드를 결합시킬 수 있는 것을 포함하여, 당업계에 공지된 매우 다양한 물질을 포함한다. 예를 들어, 카복시메틸화, 설폰화된, 아가로스계 또는 중합체 폴리스타이렌/다이비닐 벤젠 양이온 교환 매트릭스가 특히 바람직하다. 다른 유용한 매트릭스 물질은 셀룰로스 매트릭스, 예컨대, 섬유성, 미세과립성 및 비드 매트릭스; 덱스트란, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐, 폴리스타이렌, 실리카 및 폴리에터 매트릭스; 및 복합체를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 양이온 교환 크로마토그래피에서 사용을 위한 다른 적합한 물질은 당업자의 지식 내에 있다.

음이온-교환 크로마토그래피는 당업계에 공지된 바와 같이 이에 대해 적절한 매질을 사용하여 수행된다. 적합한 매질은, 예를 들어 중합체 폴리스타이렌/다이비닐 벤젠 수지 및 아가로스계, 덱스트란 비드, 폴리스타이렌 비드, 불용성의 3차 또는 4차 아미노기로 유도체화된 미립자 지지체, 및 트라이메틸아미노에틸기로 유도체화된 지지체를 포함한다. 적합한 이러한 매질의 예는 DE92(다이에틸아미노에틸 셀룰로스, 와트만(Whatman)); DEAE 셀룰로스(DEAE CELLULOSE)(시그마(Sigma)), 베이커본드 에이비엑스 40 뮤(BAKERBOND ABX 40 mu)(제이. 티, 베이커 인코포레이티드(J. T. Baker, Inc.)); DEAE 수지, 예컨대, 프락토겔(FRACTOGEL) EMD DEAE-650(이엠 세퍼레이션즈(EM Separations)), 프락토겔 EMD TMAE-650(S) TM(뉴저지주 깁스타운에 소재한 이엠 사이언스), TSK 겔 DEAE-SPW(토소하스(Tosohaas)), DEAE-세파로스 CL-6BT" 및 킬레이팅 세파로스(아머샴 파마시아 바이오테크 아베(Amersham Pharmacia Biotech AB)), DEAE MERE SEP. IOOOTM(밀리포어(Millipore)), 및 DEAE 스페로덱스(SPHERODEX)(세프라코(Sepracor)); 리소스(RESOURCE) QTm 및 Q 세파로스(QSFF)(아머샴 파마시아 바이오테크 아베); 마크로(MACRO)-PEP QTM(캘리포니아주 허큘리스에 소재한 바이오-래드 래버러토리즈); 큐-하이퍼드(Q-HYPERD)(매사추세츠주 말버러에 소재한 바이오세프라 인코포레이티드(BioSepra, Inc.)) 등을 포함한다. 다른 적합한 음이온 교환 크로마토그래피 물질뿐만 아니라 본 적용을 위한 이들 물질의 사용은 당업계에서 통상적이다.

이온 교환 크로마토그래피, 여과, 나노여과 또는 추가적인 정제 단계는 STI 친화성 크로마토그래피 전 또는 후일 수 있다. 추가적인 단계는 또한, 단백질 추출물의 용매 및 세정제 처리에 의해 또는 나노여과를 통해 바이러스 불활성화 단계를 포함할 수 있다.

일반적으로, "정제"는 샘플 내의 단백질 또는 펩타이드의 농도 및/또는 순도를 증가시키는 것을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 정제 과정은 단백질 또는 펩타이드가 그것의 생물학적 활성을 실질적으로 보유하는 동안 다양한 다른 성분을 제거하도록 샘플을 분획화한다. 조성물에서 실질적으로 정제된 단백질 또는 펩타이드는 조성물의 주요 성분을 형성하며, 예컨대, 샘플 용액의 건조 성분에서 단백질의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 이상을 구성한다.

단백질 또는 펩타이드의 정제 정도를 정량화하는 다양한 방법은 본 개시내용에 비추어 당업자에게 공지될 것이다. 이들은, 예를 들어 활성 분획의 특이적 활성을 결정하는 것, 또는 SDS/PAGE 분석에 의해 분획 내에서 폴리펩타이드의 양을 평가하는 것을 포함한다. 분획의 순도를 평가하기 위한 바람직한 방법은 분획의 특이적 활성을 계산하는 것, 그것을 초기 추출물의 특이적 활성과 비교하는 것, 및 그에 따라 본 명세서에서 "배수적 정제 수"에 의해 평가되는 순도를 계산하는 것이다. 활성의 양을 나타내기 위해 사용되는 실제 단위는 물론 정제 후 선택된 특정 분석 기법 및 발현 단백질 또는 펩타이드가 검출가능한 활성을 나타내는지 여부에 의존할 것이다.

단백질 정제에서 사용에 적합한 다양한 기법은 당업자에게 잘 공지될 것이다. 이들은, 예를 들어 황산암모늄, PEG(폴리에틸렌 글라이콜), 항체 등을 통한 침강 또는 열 변성에 의한 다음 원심분리; 크로마토그래피 단계, 예컨대, 이온 교환, 겔 여과, 역상, 하이드록실아파타이트 및 친화성 크로마토그래피; 등전위점 초점화; 겔 전기영동; 및 이러한 기법 및 다른 기법의 조합을 포함한다.

본 명세서에 개시된 추가 양태는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열 또는 서열번호 1 또는 2와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 정제된 세린 프로테아제에 관한 것이되, 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 1 또는 2에 대해 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 2와 실질적으로 동일한 활성을 가진다.

본 출원은 또한 대두 트립신 저해제 친화성 수지; 경쟁적 작용제 및/또는 알기닌을 포함하는 용리 완충제; 및 사용을 위한 설명서를 포함하는 키트를 기재한다. 일 실시형태에서, 키트는 세척 완충제를 추가로 포함한다. 관련 실시형태에서, 세척 완충제는 중성 pH에서 약 250mM NaCl을 포함한다.

실험 실시예

본 개시내용은 순수하게 본 개시내용의 예시가 되는 것으로 의도되는 다음의 실시예를 참조로 하여 추가로 이해된다. 본 개시내용은 예시된 실시형태에 의한 범주로 제한되지 않으며, 이는 단지 개시내용의 단일 양상의 예시로서 의도된다. 기능적으로 동일한 임의의 방법은 본 개시내용의 범주 내에 있다. 본 명세서에 기재된 것에 추가로 개시내용의 다양한 변형은 앞서 언급한 설명 및 수반하는 도면으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 첨부되는 특허청구범위의 범주 내에 속한다.

달리 언급되지 않는 한, 모든 온도는 섭씨온도이다. 또한 이들 실시예 및 다른 곳에서, 약어는 다음의 의미를 가진다:

hr = 시간

㎝ = 센티미터

ℓ = 리터

M = 몰농도

㎎ = 밀리그램

㎎/㎏ = 밀리그램/킬로그램

㎎/㎖ = 밀리그램/밀리리터

min = 분

㎖ = 밀리리터

㎕ 또는 uL = 마이크로리터

μM = 마이크로몰

fX = 인자 X

fXa = 인자 Xa

HC = 중쇄

LC = 경쇄

MTX = 메토트렉세이트

PBS = 인산 완충 식염수

STI = 대두 트립신 저해제

실시예 1

상업적으로 입수가능한 친화성 수지의 선별

상업적으로 입수가능한 친화성 수지를 r-해독제를 정제함에 있어 그의 효능에 대해 선별하였다. 다양한 친화성 수지를 1㎖의 수지를 지니는 칼럼(예컨대, 트리콘(Tricorn) 칼럼, GE)에 채웠다. 제조업자의 권고에 따라 위생처리한 후, 칼럼을 pH 7.4에서 20mM 트리스/150mM NaCl로 평형을 유지시킨 다음, 동일한 완충제 중에서 r-해독제에 결합하는 그의 능력을 검사하였다. PBS(인산 완충 식염수) 중의 0.145㎎/㎖ 농도에서 r-해독제를 주사에 의해(1㎖) 1㎖/분의 유속에서 칼럼에 장입시켰다. 놀랍게도, 벤즈아미딘-아가로스(카탈로그# A7155, 시그마)(도 3), L-리신-아가로스(카탈로그# L5631)(도 4) 및 아프로티닌-아가로스(카탈로그# A2268)(도 5) 친화성 칼럼에 대한 r-해독제의 결합은 관찰되지 않았다. 대조적으로, r-해독제는 STI 친화성 수지에 결합하는 것을 발견하였다(도 6).

실시예 2

벤즈아미딘을 함유하는 용리 완충제를 이용하는 STI 친화성 수지에 의한 r-해독제의 정제

r-해독제를 함유하는 채취한 세포 배양물 조건화 배지를 pH 7.4에서 20mM 트리스 및 250mM NaCl의 용액 중에서 완충시킨 Q-세파로스 패스트 플로우(카탈로그# 17-0510-01, GE 헬스케어(GE Healthcare)) 전치칼럼을 통과시켰다. 이어서 r-해독제를 함유하는 전치칼럼으로부터의 병류를 칼럼에 r-해독제를 흡수시키는 조건 하에서 STI 아가로스(시그마, T-0635) 칼럼에 적용하였다. 칼럼을 pH 7.4(1X Q-BF)에서 20mM 트리스 및 250mM NaCl을 함유하는 용액으로 세척하였다. 이어서 r-해독제를 0.5M 또는 1.0M 벤즈아미딘 중 하나를 이용하여 pH 7.4에서 20mM 트리스, 150mM NaCl을 함유하는 용리 완충제로 용리시켰다. 상업적 데이터 삽입물에 기반한 STI 아가로스 용량은 1 내지 3㎎/㎖ 트립신이다.

본 실시예에 기재한 다양한 검사에서 사용한 세포 배양물 배지를 50 nM 메토트렉세이트(methotrexate: MTX) 하에 선택한 CHO-DUXB 11 클론(1C2로서 지정)으로부터 만들었다. STI-아가로스 칼럼에 장입하기 전에, 세포 배양물 배지를 Q-세파로스 전치-칼럼에 대해 사용한 동일 완충제(pH 7.4에서 20mM 트리스 및 250mM NaCl)에 투석하였다.

50㎖의 투석 세포 배양물 배지를 STI-아가로스 친화성 칼럼 상에 직접 장입시켰을 때, 기능성 r-해독제를 STI 수지에 의해 포획하였다(도 7). 기능성 r-해독제는 병류 분획에서 검출되지 않았다(주의: fXa 색원체 활성 분석 설명이 필요. r-해독제 적용으로부터 복사할 수 있음). fXa 저해제의 존재에서 fXa 색원체 활성 분석을 사용하여 r-해독제 기능을 검출하였다. r-해독제는 저해제에 결합할 수 있으며, 따라서 그의 저해제 활성을 감소시킨다. FXa 활성(%)을 하기와 같이 계산하였다:

FXa 활성(%) = fXa 활성(저해제 있음)/fXa 활성(저해제 없음) x 100.

바로 상기에 기재한 STI-아가로스 수지와 달리(도 7), 동일한 투석 세포 배양물 배지(50㎖)를 HQ 세파로스 전치칼럼(125㎖)에 장입시켰을 때, 그러나 표적 단백질은 병류 분획에 있다(도 8). HQ 세파로스 전치칼럼을 분획 25까지 1X Q-BF를 이용하여 세척하였다. 세척 완충제를 분획 25에서 pH 7.4에서 20mM 트리스, 1M NaCl로 전환시켰다. HQ 세파로스 병류 분획을 fXa 기능 활성 분석에 기반하여 풀링시켰다(총 475㎖). 이 결과는 HQ-세파로스가 STI-아가로스 친화성 칼럼 전에 사용한 전치 칼럼으로서 또는 STI-아가로스 친화성 칼럼 후의 후속 단계로서, r-해독제 정제를 위한 병류 방식에서 사용될 수 있다는 것을 입증한다.

HQ-세파로스 병류 분획으로부터 풀링시킨 분획을 STI 아가로스 친화성 수지(10㎖) 상에 장입시키고, 이어서, 수지를 1X Q BF로 세척하였다. 도 9는 r-해독제가 STI 친화성 수지에 흡수된다는 것을 입증한다. 이어서 결합 단백질을 20mM 트리스, pH 7.4에서 150mM NaCl 및 1M 벤즈아미딘의 용리 완충제로 용리시켰다. 도 10a는 벤즈아미딘 용리 완충제를 이용하는 용리 프로파일을 나타낸다. 용리 완충제 중의 벤즈 아미딘이 fXa 기능성 활성 분석을 방해하기 때문에, 인간 fX/fXa(FX-EIA, 엔자임 리서치 래버러토리즈 인코포레이티드(Enzyme Research Laboratories Inc.))를 인식하는 상업적으로 입수가능한 쌍-항체를 이용하는 효소-결합 면역흡착 분석(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)에 의해 용리 분획 중의 r-해독제를 정량화하였다. r-해독제-함유 분획을 풀링시키고, 벤즈아미딘을 PBS를 이용하는 투석에 의해 제거하였다.

인간 fX/fXa(엔자임 리서치 래버러토리즈 인코포레이티드)의 중쇄(HC) 및 경쇄(LC)를 특이적으로 인식하는 항체를 사용하여 친화성 정제된 r-해독제를 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다(도 10b). 도 10b는 r-해독제가 벤즈아미딘에 의해 용리된다는 것을 나타낸다.

STI-아가로스 수지로부터 r-해독제를 용리하는데 필요한 벤즈아미딘 농도를 추가로 결정하기 위해, STI 아가로스 칼럼으로부터의 r-해독제의 용리를 또한 벤즈아미딘 구배를 사용하여 수행하였다(도 11).

세포 배양물 배지를 우선 1㎖ STI-아가로스 칼럼 상에 장입시키고, 앞서 기재한 바와 같이 세척하였으며(도 7), 결합한 r-해독제를 완충제 A 및 완충제 B의 10 칼럼 용적(column volume: CV)을 포함하는 구배에 의해 용리시켰다. 완충제 A(pH 20mM 트리스, 7.4에서 150mM NaCl), 완충제 B는 20mM 트리스, pH 7.4에서 150mM NaCl 및 1M 벤즈아미딘으로 이루어진다. 벤즈아미딘 농도(구배)를 각 분획에서 280㎚에서 흡광도를 측정함으로써 추정하였고, r-해독제를 ELISA에 의해 분석하였다. 표적 단백질 용리 피크는 약 250mM 벤즈아미딘에 있으며, 표적 단백질 용리는 약 500mM 벤즈아미딘에서 끝났다(도 11). 따라서, 용리 완충제에서 최적 벤즈아미딘 농도는 약 500mM이다.

정제 절차의 규모를 확장하여 더 다량의 생성물을 얻을 수 있다. 예를 들어, 10ℓ의 채취 세포 배양물 유체로부터 r-해독제를 정제하기 위해, 500㎖의 HQ 세파로스 칼럼을 우선 사용한 다음, 200㎖의 STI 아가로스를 사용할 수 있다. 규모 확장 절차에서의 용리는 1X Q 완충제 중의 1M 벤즈아미딘으로 행하였다(도 12).

따라서, 상기 발견을 세포 배양물 유체(10 내지 25ℓ)의 다양한 배취(batch)로부터의 r-해독제 정제를 위해 정제 계획(도 13)에 통합시킬 수 있다. 규모 확장 계획에서 정제된 r-해독제의 품질을 결정하기 위해, 3.5㎍의 정제 단백질을 SDS PAGE 겔(10% 비스 트리스 겔/MES 완충제, 환원)의 별개 웰에 로딩하였다(도 14). 레인을 1) 분자량 마커; 2) FXa 단백질; 3) 로트 1 - 16ℓ; 4) 로트 2 - 8ℓ; 5) 로트 4 - 첫번째 25ℓ; 6) 로트 5 - 두번째 25ℓ; 7) 로트 6 - 세번째 25ℓ 및 8) 로트 7 - 네번째 25ℓ(각각의 로트 번호 다음에 세포 배양물 유체의 시작 용적)로 로딩하였다.

실시예 3

알기닌을 함유하는 용리 완충제를 이용하는 STI 친화성 수지에 의한 r-해독제의 정제

r-해독제가 알기닌에 의해 용리될 수 있는지를 검사하기 위해, 세포 배양물로부터의 5 내지 10㎎ r-해독제 단백질 추출물을 0.2㎖/분(약 61㎝/hr)에서 펌프를 통해 1㎖ STI 친화성 칼럼 상에 장입시켰다. pH 5.0에서 25mM Na-아세테이트 중에서 0.5M 알기닌으로 단백질을 용리시키고, pH를 즉시 적절한 용적의 1M 트리스(pH 8.0)의 첨가에 의해 약 pH 7.4까지 조절하였다. 이어서, 칼럼을 1.0M 알기닌, pH 5에서 25mM 아세트산Na 다음에 0.5M 벤즈아미딘, 20mM 트리스, 및 pH 7.4에서 150mM NaCl로 스트리핑하였다. 도 15는 알기닌 용리 완충제를 이용하는 대표적인 용리 프로파일을 나타낸다. 0.5M 알기닌을 함유하는 용리 완충제는 STI-친화성 수지의 r-해독제를 용리시킬 수 있다. 1M 알기닌 또는 0.5M 벤즈아미딘 중 하나를 이용하여 분획을 스트리핑함에 있어서 추가적인 r-해독제 단백질은 발견되지 않았다.

더 나아가, 알기닌 완충제를 이용하는 용리로 벤즈아미딘에 의한 용리와 유사한 생성물 프로파일을 수득하였다(도 16). 따라서, 알기닌-함유 용리 완충제를 이용한 STI-친화성 기반 수지가 세포 배양물 조건화 배지로부터 r-해독제를 효과적으로 정제하기 위해 사용될 수 있다는 것을 발견하였다.

다양한 특이적으로 변형된-STI-친화성 수지의 결합 능력을 결정하기 위해, 수지(수지 A 내지 K)의 결합 능력을 유사한 조건(1㎖ 칼럼) 하에 검사하였다. 0.5M 알기닌을 함유하는 용리 완충제를 이용하여 결합 단백질을 용리시켰다. 용리 분획 중의 r-해독제를 ELISA와 280㎚에서의 흡광도에 의해 정량화하였다. 280㎚에서의 흡광도에 기반한 결합 능력을 이하의 표에 나타낸다.

본 명세서에 언급되거나 또는 인용된 논문, 특허 및 특허 출원 및 모든 다른 문헌 및 전자적으로 입수가능한 정보의 내용은 각각 개개의 간행물이 구체적이고 개별적으로 참조로서 표시하는 것과 동일한 정도로 그 전문이 참조로서 본 명세서에 참조로서 포함된다. 출원인은 임의의 이러한 논문, 특허, 특허출원 또는 다른 물리적 및 전자적 문헌으로부터의 임의의 및 모든 재료 및 정보를 본 출원에 물리적으로 포함시킬 권리를 보유한다.

본 개시내용은 본 명세서에 넓게 그리고 일반적으로 기재되었다. 일반적 개시내용 내에 속하는 더 좁은 종 및 하위속 그룹의 각각은 본 개시내용의 부분을 형성한다. 이는 삭제된 재료가 본 명세서에 구체적으로 인용되는지 여부와 관계없이, 조건부로 또는 속으로부터의 임의의 대상 물질을 제거하는 부정적 제한에 의해 본 명세서의 일반적 설명을 포함한다.

다른 실시형태는 다음의 특허청구범위 내에 있다. 추가로, 개시내용의 특징 또는 양상이 마쿠쉬 그룹에 관하여 기재된 경우, 이에 의해 당업자는 개시내용이 또한 마쿠쉬 그룹의 임의의 개개 구성원 또는 구성원의 하위그룹에 관해 기재된다는 것을 인식할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> PORTOLA PHARMACEUTICALS, INC. <120> METHOD FOR PURIFICATION OF RECOMBINANT FACTOR XA DERIVATIVES <130> 070545-5310 <140> PCT/US2013/045496 <141> 2013-06-12 <150> 61/659,821 <151> 2012-06-14 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 365 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 1 Ala Asn Ser Phe Leu Phe Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Gln Cys 1 5 10 15 Glu Thr Ser Pro Cys Gln Asn Gln Gly Lys Cys Lys Asp Gly Leu Gly 20 25 30 Glu Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu 35 40 45 Leu Phe Thr Arg Lys Leu Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys Asp Gln 50 55 60 Phe Cys His Glu Glu Gln Asn Ser Val Val Cys Ser Cys Ala Arg Gly 65 70 75 80 Tyr Thr Leu Ala Asp Asn Gly Lys Ala Cys Ile Pro Thr Gly Pro Tyr 85 90 95 Pro Cys Gly Lys Gln Thr Leu Glu Arg Arg Lys Arg Arg Lys Arg Ile 100 105 110 Val Gly Gly Gln Glu Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala Leu 115 120 125 Leu Ile Asn Glu Glu Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu Ser 130 135 140 Glu Phe Tyr Ile Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln Ala Lys Arg 145 150 155 160 Phe Lys Val Arg Val Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu Glu Gly Gly 165 170 175 Glu Ala Val His Glu Val Glu Val Val Ile Lys His Asn Arg Phe Thr 180 185 190 Lys Glu Thr Tyr Asp Phe Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr Pro 195 200 205 Ile Thr Phe Arg Met Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Arg Asp 210 215 220 Trp Ala Glu Ser Thr Leu Met Thr Gln Lys Thr Gly Ile Val Ser Gly 225 230 235 240 Phe Gly Arg Thr His Glu Lys Gly Arg Gln Ser Thr Arg Leu Lys Met 245 250 255 Leu Glu Val Pro Tyr Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu Ser Ser Ser 260 265 270 Phe Ile Ile Thr Gln Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Lys Gln 275 280 285 Glu Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ala Gly Gly Pro His Val Thr Arg Phe 290 295 300 Lys Asp Thr Tyr Phe Val Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys 305 310 315 320 Ala Arg Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr Ala Phe Leu 325 330 335 Lys Trp Ile Asp Arg Ser Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro Lys Ala Lys 340 345 350 Ser His Ala Pro Glu Val Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys 355 360 365 <210> 2 <211> 359 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 2 Ala Asn Ser Phe Leu Phe Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Gln Cys 1 5 10 15 Glu Thr Ser Pro Cys Gln Asn Gln Gly Lys Cys Lys Asp Gly Leu Gly 20 25 30 Glu Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu 35 40 45 Leu Phe Thr Arg Lys Leu Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys Asp Gln 50 55 60 Phe Cys His Glu Glu Gln Asn Ser Val Val Cys Ser Cys Ala Arg Gly 65 70 75 80 Tyr Thr Leu Ala Asp Asn Gly Lys Ala Cys Ile Pro Thr Gly Pro Tyr 85 90 95 Pro Cys Gly Lys Gln Thr Leu Glu Arg Ile Val Gly Gly Gln Glu Cys 100 105 110 Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala Leu Leu Ile Asn Glu Glu Asn 115 120 125 Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu Ser Glu Phe Tyr Ile Leu Thr 130 135 140 Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln Ala Lys Arg Phe Lys Val Arg Val Gly 145 150 155 160 Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu Glu Gly Gly Glu Ala Val His Glu Val 165 170 175 Glu Val Val Ile Lys His Asn Arg Phe Thr Lys Glu Thr Tyr Asp Phe 180 185 190 Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr Pro Ile Thr Phe Arg Met Asn 195 200 205 Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Arg Asp Trp Ala Glu Ser Thr Leu 210 215 220 Met Thr Gln Lys Thr Gly Ile Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr His Glu 225 230 235 240 Lys Gly Arg Gln Ser Thr Arg Leu Lys Met Leu Glu Val Pro Tyr Val 245 250 255 Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu Ser Ser Ser Phe Ile Ile Thr Gln Asn 260 265 270 Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Lys Gln Glu Asp Ala Cys Gln Gly 275 280 285 Asp Ala Gly Gly Pro His Val Thr Arg Phe Lys Asp Thr Tyr Phe Val 290 295 300 Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Arg Lys Gly Lys Tyr 305 310 315 320 Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr Ala Phe Leu Lys Trp Ile Asp Arg Ser 325 330 335 Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro Lys Ala Lys Ser His Ala Pro Glu Val 340 345 350 Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys 355 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 3 Arg Lys Arg Arg Lys Arg 1 5

Claims (22)

1. 세린 프로테아제를 정제하는 방법으로서,
   상기 세린 프로테아제를 대두 트립신 저해제(soybean trypsin inhibitor: STI) 기반 친화도 크로마토그래피에 장입시키는 단계, 및
   상기 세린 프로테아제를 상기 STI와 상기 세린 프로테아제 간의 상호작용을 방해하는 작용제(agent)를 포함하는 용리 완충제로 용리시키는 단계를 포함하는, 세린 프로테아제의 정제방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 용리 완충제는 염, 세정제 및/또는 카오트로픽제(chaotropic agent)를 더 포함하는 것인, 세린 프로테아제의 정제방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 작용제는 상기 세린 프로테아제의 상기 STI에 경쟁적으로 결합하는 경쟁적 작용제인 것인, 세린 프로테아제의 정제방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 경쟁적 작용제는 벤즈아미딘, p-아미노벤즈아미딘, 알기닌, 소분자 fXa 저해제, 펩타이드 fXa 저해제 및 펩티도미메틱 fXa 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 세린 프로테아제의 정제방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 경쟁적 작용제는 알기닌인 것인, 세린 프로테아제의 정제방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 세린 프로테아제는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 서열번호 1 또는 2에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖고 Gla 도메인의 적어도 일부의 결실 및 활성 부위에서의 돌연변이를 갖는 폴리펩타이드인 것인, 세린 프로테아제의 정제방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 세린 프로테아제는 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 서열번호 2에 대해 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖고 Gla 도메인의 적어도 일부의 결실 및 활성 부위에서의 돌연변이를 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 것인, 세린 프로테아제의 정제방법.
8. 제6항에 있어서, 상기 세린 프로테아제는 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 세린 프로테아제의 정제방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용리 완충제의 pH는 약 4.5 내지 약 10.5인 것인, 세린 프로테아제의 정제방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 용리 완충제의 pH는 약 5.0인 것인, 세린 프로테아제의 정제방법.
11. 제9항에 있어서, 상기 용리 완충제의 pH는 약 7.4인 것인, 세린 프로테아제의 정제방법.
12. 제5항에 있어서, 상기 용리 완충제는 약 250mM 알기닌 내지 약 1000mM 알기닌을 포함하는 것인, 세린 프로테아제의 정제방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 용리 완충제는 약 500mM 알기닌을 포함하는 것인, 세린 프로테아제의 정제방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 용리 완충제의 pH는 약 5.0인 것인, 세린 프로테아제의 정제방법.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용리된 세린 프로테아제에 이온 교환 칼럼을 이용하는 정제를 실시하는 단계를 더 포함하는, 세린 프로테아제의 정제방법.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세린 프로테아제를 용리시키기 전에, 염을 포함하며 중성 pH에 있는 세척 완충제로 크로마토그래프를 세척하는 단계를 더 포함하는, 세린 프로테아제의 정제방법.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되는 정제된 세린 프로테아제.
18. 대두 트립신 저해제(STI) 기반 친화도 크로마토그래피, 및
    STI와 세린 프로테아제 간의 상호작용을 방해하는 경쟁적 작용제를 포함하는 용리 완충제를 포함하는 키트.
19. 제18항에 있어서, 상기 용리 완충제는 알기닌을 더 포함하는 것인 키트.
20. 제18항에 있어서, 상기 용리 완충제의 pH는 약 4.5 내지 약 10.5인 것인 키트.
21. 제19항에 있어서, 상기 용리 완충제는 약 250mM 알기닌 내지 약 1000mM 알기닌을 포함하는 것인 키트.
22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 중성 pH에서 약 250mM NaCl을 포함하는 세척 완충제를 더 포함하는 키트.

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