KR20150015936A

KR20150015936A - 신규한 미생물 균주 및 친환경 비료용 미생물제제

Info

Publication number: KR20150015936A
Application number: KR1020130092003A
Authority: KR
Inventors: 송홍규; 서미소
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2013-08-02
Filing date: 2013-08-02
Publication date: 2015-02-11
Also published as: KR101512653B1

Abstract

본 발명은 미생물 균주 Enterobacter asburiae m-4에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 ACC deaminase를 생성하여 식물의 생장을 저해하고 노화를 촉진시키는 식물호르몬 에틸렌의 수준을 낮추고 스트레스 조건 하의 식물의 생장을 지속시키는 균주 Enterobacter asburiae m-4에 관한 것이며 ACC deaminase 생성능과 활성을 조사하는 단계와; 식물호르몬의 생 성능을 조사하는 단계와; 토마토 뿌리신장을 조사하는 단계와; 토마토의 소규모 토양재배 실험을 하는 단계를 통하여 달성하였고 본 발명은 식물의 생장을 촉진시키는 효과가 있으며 식물의 생장을 촉진시키는 균주를 스트레스 하의 식물을 위한 미생물 비료로 사용한다면 작물을 보호할 수 있어 비료 및 작물재배 산업에 유용하다.

Description

신규한 미생물 균주 및 친환경 비료용 미생물제제{Novel strain of microbes and Ecofriendly fertilizer containing the same}

본 발명은 다양한 조건에서 식물의 생장 촉진에 관여하는 ACC deaminase 와 식물생장촉진 호르몬을 식물에 제공하는 균주에 관한 것이다.

폭염과 가뭄이 곡물의 성장에 영향을 미쳐 곡물 가격이 상승하고 지구온난화에 의한 일부 지역에서의 가뭄은 작물 생산에 피해를 미치므로 작물을 보호하는 효과적인 방법이 필요하다. 식물 환경의 다양한 조건 하에서 식물이 스트레스를 받게 되면 식물의 조직세포에서 에틸렌(ethylene)의 생성이 증가하는데(Morgan and Drew, 1997) 이는 식물의 뿌리생장과 개화를 억제한다.

한편, 식물생장촉진 근권세균(Plant growth promoting rhizobacteria,PGPR)은 근권이나 근면에 존재하는 다양한 종류의 세균으로 인하여 직간접적 방식으로 식물 생장을 촉진시킨다(Ahmad et al.,2008).

식물의 생장을 촉진시키는 방식으로는 세균으로부터 합성된 생장촉진 화합물을 식물에 제공하는 직접적 방식과 식물 병원체의 해로운 영향을 감소, 예방시키는 간접적 생장촉진이 있다. 간접적 생장촉진의 예로 1-아미노사이클로프로판-1-카박실레이트(ACC) 디아미나아제(1-aminocyclopropane-1-carboxylate;ACC deaminase)작용을 들 수 있는데 이는 식물생장촉진 호르몬을 식물에 제공하거나 스트레스에 따른 피해를 감소시켜 식물체 내의 에틸렌 농도를 저하시킨다(Glick,1995).

식물생장촉진 근권세균(PGPR)은 옥신(auxin), 시토키닌(cytokinin), 지베렐린(gibberellin),앱시스산(abscicisic acid; ABA) 같은 식물호르몬 분비로 식물 생장촉진에 기여한다.

대한민국 공개특허 제 10-2011-0122257 호에는 물억새(Miscanthus sacchariflorus) 뿌리로부터 분리한 미생물을 이용한 식물 생장 촉진방법에 관한 것으로 억새 뿌리로부터 분리한 투메바실러스 속(Tumebacillus sp .) BE501, 바실러스 속(Bacillus sp.) BE506, 아그로박테리움 속(Agrobacterium sp.) BE516 및 라시니바실러스 속(Lysinibacillus sp .) BE533 균주는 식물 생장을 촉진하는 옥신(Auxin) 및 ACC 탈아미노화 효소(ACC deaminase)를 생산하고, 억새, 밀, 보리, 벼, 수단그라스, 배추, 오이 및 토마토에 대하여 현저한 종자 발아 촉진 효과 및 생장촉진 효과를 나타낸다고 개시된 바 있다. 그러나 상기 특허문헌 어디에도 엔태로박터 애스베리애이(Enterobacter asburiae ) m-4가 식물체의 생장을 촉진하는데 기여한다는 내용에 대하여는 전혀 암시되거나 개시된 바 없다.

따라서 본 발명의 목적은 식물의 생장을 방해하는 stress ethylene을 감소시키는 효소 에이씨씨 디아미나아제(ACC deaminase)를 생성하고 더불어 식물생장촉진 효과가 있는 식물호르몬을 생성하는 균주를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 유효성분으로 하는 친환경비료용 미생물제제를 제공하는 데 있다.

본 발명의 상기 목적은 균주의 에이씨씨 디아미나아제(ACC deaminase)의 생성능과 활성을 조사하는 단계와; 식물호르몬의 생성능을 조사하는 단계와; 토마토 뿌리신장을 조사하는 단계와; 토마토의 소규모 토양재배 실험하고 평가하는 단계를 통해 달성하였다.

본 발명은 다양한 조건에서 식물의 생장을 저해하고 노화를 촉진시키는 식물호르몬 에틸렌의 수준을 낮춤으로써 스트레스 조건 하의 식물의 생장을 촉진시키는 효과가 있으며 식물의 생장을 촉진시키는 균주들을 가뭄 스트레스 하의 식물을 위한 미생물 비료로 사용한다면 작물을 보호할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 L-tryptophan 을 첨가한 영양 배지에서 Enterobacter asburiae m-4의 시간 당 옥신생성량을 나타낸 그래프이다.
도 2는 에이씨씨 디아미나아제(ACC deaminase)와 식물호르몬 생성능을 지닌 균주들을 대상으로 토마토 종자발아 시 뿌리신장을 조사한 그래프이다.
도 3은 에이씨씨 디아미나아제(ACC deaminase)와 식물호르몬 생성능을 지닌 균주들을 대상으로 7일 동안 재배한 토마토 식물의 뿌리신장을 나타낸 그래프이다.
도 4는 에이씨씨 디아미나아제(ACC deaminase)와 식물호르몬 생성능을 지닌 균주들을 대상으로 7일 동안 재배한 토마토식물의 건조중량을 나타낸 그래프이다.

이하에서는, 본 발명의 구체적인 내용을 실시 예를 들어 더욱 상세히 설명하지만 본 발명의 권리범위가 이에만 한정하는 것은 아니다.

실시 예 1: 본 발명 미생물 균주 분리 및 동정

균주 분리를 위해 수분 결핍과 염분 스트레스를 받는 사구식물의 근권에서 균주를 분리하였다. 경기도 을왕리 해수욕장에서 갯씀바귀(Lxeris repens)와 통보리사초(Carex kobomugi)를 채취하였고 강원도 경포해변 사구에서 맥문동(Liriope platyphylla)을 채취하였다. 채취한 식물의 뿌리에 붙어 있는 토양을 털어내고 생리식염수(0.9% NaCl)와 혼합하여 희석하고 LB한천배지에 도말하였다. 30℃에서 계대배양을 반복하여 균주들을 순수분리하였다. 갯씀바귀와 통보리사초 근권에서 각각 순수분리한 균주 BD3-35와 BD2-26, 맥문동 근권에서 분리한 m-2와 m-4를 동정하기 위해 (주)마크로젠에 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석을 의뢰하였고 얻어진 16S rRNA 유전자의 전체 염기서열을 EzTaxon server 2.1 (http://147.47.212.35.8080/index.jsp)을 이용하여 동정하였다. 상기 유전자의 염기서열은 서열목록에 기재되어 있다.

실험결과는 맥문동 근권에서 분리한 균주 m-2와 m-4가 질소원이 없는 음성 대조군 배지에서 생장하지 않았으나 ACC를 유일 질소원으로 첨가한 실험군 배지에서 생장하였고, 질소원을 첨가한 양성 대조군 배지와 비교하여 대등하게 생장하였으므로 균주들이 ACC를 질소원으로 이용하여 배양된 것을 알 수 있었다. 이에 따라 균주들을 ACC deaminase 생성능이 있는 균주로 선별하였다. 이들의 16S rRNA 유전자 염기서열을 NCBI등록 균주들과 비교한 결과, m-2는 Escherichia hermannii와 98.579%, 그리고 m-4는 Enterobacter asburiae 와 99.774%의 상동성을 나타내어 각각의 균주로 동정되었다.

상기 동정된 균주는 국립농업과학원 농업유전자원센터에서 2013.07.15자로 m-4는 KACC91818P로 기탁되었다.

실시 예 2: 균주의 ACC deaminase 생성능과 활성 조사

ACC를 유일 질소원으로 사용하여 생장하는 능력에 근거하여 균주를 선별하였다. 질소원이 존재하지 않는 DF salts 최소 한천 배지에 10 mM ACC 100μl를 도말하여 실험군으로 사용하였다. 질소원으로 2.0 g/L (NH₄)₂SO₄를 첨가한 것은 양성 대조군으로 아무것도 첨가하지 않은 것은 음성 대조군으로 간주하였다.

순수분리한 균주들을 획선 접종하여 3-14일 동안 30℃에서 배양하였고, 음성 대조군에선 생장하지 않았으나 양성 대조군과 대등하게 실험군에서 생장한 균주들을 선별하여 이들을 대상으로 실험을 수행하였다.

ACC 이용능을 가진 균주들을 ACC 3mM이 첨가된 7.5ml DF 배지에 접종하여 배양한 후 원심분리를 통해 세척 후 0.1M Tris-HCl(pH 8.5) 600 μl와 톨루엔(toluene) 30μl를 첨가하여 toluenized cell을 만들었다.

ACC deaminase 활성은 toluenized cell을 이용하여 측정하고 단백질 정량은 toluenized cell을 Bradford assay를 이용하여 측정하였다.

효소활성 결과는 균주 1g이 한 시간 동안 생성한 알파-케토부티레이트(α-ketobutyrate)의 농도로 환산하여 나타내었다.

실시 예 3: 식물호르몬 생성능 조사

본 발명 ACC 이용능을 가진 선별 균주들의 대표적인 옥신 화합물인 인돌아세트산(indole acetic acid, IAA)와 인돌부티르산(indole butyric acid, IBA) 생성능을 측정하기 위해 전구물질인 L-tryptophan 3 mM을 넣은 90 ml 영양배지(nutrient broth)에 균주를 접종하였고 배양하였다(30℃, 130 rpm).

24시간마다 배양액 1ml을 추출하여 원심분리하고 상등액 0.5ml 와 살코프스키(Salkowski) 용액 2ml를 상온에서 30분간 반응시킨 후 IAA는 530 nm에서 IBA는 450 nm에서 흡광도를 측정하고 표준곡선을 만들어 정량하였다.

실험결과는 도 1에 나타내었으며 m-4 균주가 IAA는 배양 2일째에 763 ㎍/mg protein으로 최대 생성능을 보이며 IBA는 3일째 426 ㎍/mg으로 최대 생성능을 나타내었다.

균주들의 다른 식물호르몬인 앱시스산(abscicisic acid, ABA) 과 cytokinin 생성능을 조사하였다.

균주들을 brain heart broth 배지 100 ml에서 선 배양 후 (72 h, 30℃) 분광광도계를 이용하여 OD 600 이 1이 되도록 보정하였다.

90 ml BHB(brain heart broth, BHB) 배지에 보정 한 균주 10 ml를 접종하고 빛이 없는 조건에서 배양하였다(30℃, 200 rpm).

배양액을 원심 분리한 뒤 상등액 100 ml를 pH 2.5로 보정하고 에틸아세테이트(ethyl acetate) 15 ml를 첨가하고 분별깔때기에 넣고 extraction shaker로 15분간 추출 후 ethyl acetate 층을 모으는 과정을 3번 반복해 총 45 ml의 ethyl acetate를 회수하였다.

모아진 ethyl acetate는 진공회전농축기로 증발시킨 후에 메탄올(methanol) 5 ml에 녹여 0.22μm 지용성 필터로 여과하였다. 정량분석은 HPLC(high performance liquid chromatograph)로 Luna 5μC18 column을 이용하였고 유량(Flow rate)은 1 ml/min로 설정하였다. ABA는 0.1M acetic acid를 첨가한 55% methanol, 그리고 cytokinin은 70% methanol을 이동상으로 사용하였고 각각 265 nm와 254 nm 파장에서 분석하였다. 균주의 모든 식물호르몬 생성능은 단백질 대비값(㎍/mg protein)으로 나타내었다.

실시예 4: 토마토 뿌리신장 조사

에틸렌 생성을 억제하여 뿌리생장을 촉진하는 것을 조사하기 위해 에틸렌 생성 억제물질인 CoCl₂를 대조군으로 처리하였다.

멸균된 여과지가 깔린 멸균된 유리 페트리 접시에 알코올로 소독한 토마토종자 20개씩을 놓은 후 균주 6 ml와 2 μM CoCl₂6 ml 그리고 멸균 증류수 6 ml를 각각 처리하였다. 6일 동안 30℃ 조건에서 암 조건으로 배양한 후에 발아된 토마토 유묘의 뿌리길이를 측정하였고, 결과는 분산분석(Analysis of Variance (ANOVA, SYSTAT ver. 10, 2000, Systat Software, USA)) 이용해 통계처리 하였다.

실험결과는 도 2에 나타낸 바와 같이 균주 m-4와 BD2-26은 발아된 토마토 유묘의 뿌리길이를 각각 171%, 161%로 가장 크게 증가시켰다.

실시예 5: 토마토의 소규모 토양재배 실험

토양을 2 mm 체로 거른 후 토양과 시판되는 부산물 퇴비의 비율이 70:30이 되도록 혼합한 후 250 g씩을 직경 7.5 cm 인 플라스틱 용기 3개에 각각 담았다.

뿌리길이가 1cm 이하의 길이로 발아한 토마토 유묘 4개씩을 약 2cm 깊이로 심고 7일간 plant growth chamber에서 광조건(12h, 30℃, 6,000 lux)과 암조건(12h, 24℃)하에 2일에 한 번씩 증류수 20 ml를 공급하여 토양 수분 보유능의 20%로 재배하였다.

균주는 LB 배지에서 배양(72h, 30℃, 200 rpm) 후 원심분리를 통해 멸균 증류수로 세척하고, 토양 1g 당 균주 10⁸cell로 토마토 유묘에 처리하였다.

실험결과는 도 3에 나타난 바와 같이 Enterobacter asburiae m-4 균주가 대조군에 비해 유의성 있게 35% 증가시켜 균주들 중에서 가장 높았다.

재배 7일 후에 전체 식물을 회수하여 뿌리길이, 줄기길이와 건조중량을 측정하였고 결과는 ANOVA를 이용해 통계처리 하였다.

실험결과는 도 4에 나타난 바와 같이 BD3-35 균주가 유의성 있게 대조군 대비 68% 증가시켰고 시토키닌 생성능이 있는 BD2-26 균주와 ABA 생성능이 있는 m-2 균주는 건조중량을 대조군 대비 각각 33%와 22% 증가시킨 것으로 나타났다.

농업생명공학연구원

KACC91818

20130715

<110> Kangwon national university <120> Novel strain of microbes and Ecofriendly fertilizer containing the same <130> P13-073 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1570 <212> RNA <213> Enterobacter asburiae m-4 <400> 1 aatttggggg gggggttttt ttttttttgg ggttttttcc gtcagattga acgctggcgg 60 caggcctaac acatgcaagt cgaacggtag cacagagagc ttgctctcgg gtgacgagtg 120 gcggacgggt gagtaatgtc tgggaaactg cctgatggag ggggataact actggaaacg 180 gtagctaata ccgcataacg tcgcaagacc aaagaggggg accttcgggc ctcttgccat 240 cagatgtgcc cagatgggat tagctagtag gtggggtaat ggctcaccta ggcgacgatc 300 cctagctggt ctgagaggat gaccagccac actggaactg agacacggtc cagactccta 360 cgggaggcag cagtggggaa tattgcacaa tgggcgcaag cctgatgcag ccatgccgcg 420 tgtatgaaga aggccttcgg gttgtaaagt actttcagcg aggaggaagg cggtgaggtt 480 aataacctca tcgattgacg ttactcgcag aagaagcacc ggctaactcc gtgccagcag 540 ccgcggtaat acggagggtg caagcgttaa tcggaattac tgggcgtaaa gcgcacgcag 600 gcggtctgtc aagtcggatg tgaaatcccc gggctcaacc tgggaactgc attcgaaact 660 ggcaggctag agtcttgtag aggggggtag aattccaggt gtagcggtga aatgcgtaga 720 gatctggagg aataccggtg gcgaaggcgg ccccctggac aaagactgac gctcaggtgc 780 gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgtcg 840 acttggaggt tgtgcccttg aggcgtggct tccggagcta acgcgttaag tcgaccgcct 900 ggggagtacg gccgcaaggt taaaactcaa atgaattgac gggggcccgc acaagcggtg 960 gagcatgtgg tttaattcga tgcaacgcga agaaccttac ctactcttga catccagaga 1020 acttaccaga gatgcattgg tgccttcggg aactctgaga caggtgctgc atggctgtcg 1080 tcagctcgtg ttgtgaaatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttatcctttg 1140 ttgccagcgg ttaggccggg aactcaaagg agactgccag tgataaactg gaggaaggtg 1200 ggggatgacg tcaagtcatc atggccctta cgagtagggc tacacacgtg ctacaatggc 1260 gcatacaaag agaagcgacc tcgcgagagc aagcggacct cataaagtgc gtcgtagtcc 1320 gggattggag tctgcaactc gactccatga agtcggaatc gctagtaatc gtagatcaga 1380 atgctacggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtccacca tggggaagtg 1440 ggttgcaaaa agaagtaggt agcttaacct tcggggaggg cgcttaccac tttgtgattc 1500 atgactgggg tgattaaaaa aaaaaacacc gaaaaaaaaa aaaaaaaagg aaaaaaaaaa 1560 cccgggggtg 1570

Claims

서열목록의 유전자를 가지며 에이씨씨 디아미나아제(ACC deaminase)를 생성하는 것이 특징인 엔테로박터 애스베리애이 m-4(Enterobacter asburiae m-4)균주(KACC91818P).
Enterobacter asburiae m-4 균주(KACC91818P)를 유효성분으로 함유하는 친환경 비료용 미생물 제제.