KR20150009669A - Polydopamine-linked bioactive peptide-immobilized scaffold materials and the method for preparing the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 폴리도파민이 결합된 생리활성 펩타이드로 고정화된 고분자 지지체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a polymer scaffold immobilized with a physiologically active peptide conjugated with polydodamine and a method for producing the same.
최근에는, 재생의학과 관련하여 인체이식이 가능한 인공조직 개발을 위한 조직공학적인 기초 및 응용기술의 개발이 활발히 진행되고 있다. 특히, 세포 이식용 생체적합 삼차원적 지지체의 개발 및 줄기세포의 증식과 분화에 대한 연구는 핵심적인 연구 분야이다. 인체 조직을 재생시키기 위해 사용되는 지지체 재료는 조직세포가 재료 표면에 유착하여 3차원 구조를 가진 조직으로 형성될 때까지 기질 또는 틀의 역할을 원활히 수행해야 하며, 이식된 세포와 숙주 세포 사이에 위치하는 중간 매개체 역할도 필요로 한다. 또한, 이식된 세포가 정상 기능을 보여주게 되면 시간이 지남에 따라 생체 내에서 완전히 분해되어 사라지는 생분해성도 갖추어야 한다.In recent years, development of tissue engineering basis and application technology for development of artificial tissue capable of human implantation has been actively carried out in relation to regenerative medicine. In particular, the development of a biocompatible three-dimensional scaffold for cell transplantation and the study of stem cell proliferation and differentiation are key research areas. The support material used to regenerate the human tissue must function as a substrate or frame until the tissue cells adhere to the surface of the material to form a tissue having a three-dimensional structure, and the position between the grafted cell and the host cell It is also necessary to play an intermediary role. In addition, when the transplanted cells show normal function, they must have biodegradability that completely disappears in vivo over time.
중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)는 여러 종류의 결합조직의 수선세포(repair cell)로 알려져 있으며, 이들 세포는 중간엽계의 여러 종류의 세포로 분화할 수 있다. 미분화된 중간엽 줄기세포는 이식 조직 내에서 다른 형태의 세포로 분화할 수 있는 능력이 있어서 생체 내에서 이형조직이 형성될 위험이 있기 때문에 사용에 제한성이 있는 실정이다. 최근에는 줄기세포의 세포분화능을 향상시키기 위하여 고분자 지지체 내에 성장인자나 리간드 펩타이드와 같은 생리활성물질을 포함시키는 다양한 연구들이 시도되었는데, 성장인자를 이용하여 세포를 활성화시키는 방법(T. Motoki 등, Cell and Tissue Research 285: 205, 1996), 거품형성/염 침출을 이용하여 성장인자를 방출하는 방법(J.J. Yoon 등, Biomaterials 24: 2323, 2003), 성장인자를 함유한 다공성 젤라틴 미립구를 이용하여 골 조직을 형성하는 방법(Z.S. Patel 등, Bone 43: 931, 2008) 등이 보고되었다.Mesenchymal stem cells (MSCs) are known as repair cells of various connective tissues. These cells can differentiate into various types of mesenchymal stem cells. The undifferentiated mesenchymal stem cells have the ability to differentiate into different types of cells in the graft tissue, and thus there is a limitation in use because there is a risk of heterogeneous tissue formation in vivo. Recently, a variety of studies have been conducted in which a physiologically active substance such as a growth factor or a ligand peptide is included in a polymer scaffold to enhance the cell differentiation ability of stem cells. A method of activating cells using a growth factor (T. Motoki et al., Cell (JJ Yoon et al., Biomaterials 24: 2323, 2003), using porous gelatin microspheres containing growth factors to form bone tissue (ZS Patel et al., Bone 43: 931, 2008).
하지만, 상기 방법들은 비교적 복잡한 제조과정을 거쳐야 하고, 고분자 열분해 등을 통해 표면을 개질할 때 분자량이 낮은 고분자의 경우 다공성 생분해성 고분자 지지체의 변형이 유발되기도 하며, 세포의 증식이나 분화를 유도할 수 있는 기능에 있어서 특정 조직으로의 분화 및 조직재생 시 세포친화성이 저하되는 문제점을 가지고 있다. 또한, PLGA와 같은 고분자 표면에 생리활성을 보유한 단백질/펩타이드를 고정화하기 위하여 화학적 수식 방법 또는 물리적 흡착 방법을 사용하였으나, 화학적 수식 방법에 사용하는 화학물질(EDC, NHS)들이 고가이고 화학 반응 중 쉽게 분해되는 단점이 있으며, 물리적 흡착 방법은 고정화 효율이 매우 낮고 특이적 반응성이 좋지 않다는 단점이 있다.However, the above methods require a relatively complicated preparation process. When a polymer having a low molecular weight is modified by polymer pyrolysis or the like, the porous biodegradable polymer scaffold may be deformed and may induce cell proliferation or differentiation There is a problem that cell affinity is deteriorated during differentiation and tissue regeneration into a specific tissue. In addition, chemical modification methods or physical adsorption methods have been used to immobilize physiologically active proteins / peptides on the surface of polymers such as PLGA, but chemical substances (EDC, NHS) used in chemical modification methods are expensive, And the physical adsorption method has a disadvantage in that the immobilization efficiency is very low and the specific reactivity is not good.
본 발명자들은 폴리도파민 코팅한 고분자 지지체에 생리활성을 보유한 단백질/펩타이드를 효과적으로 고정화시키고, 이에 의한 인간 신경줄기세포의 우수한 부착 및 신경세포로의 분화를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
The present inventors have completed the present invention by effectively immobilizing a protein / peptide having physiological activity on a polydodamine-coated polymer scaffold and confirming the excellent adhesion of human neural stem cells and their differentiation into neurons.
본 발명의 목적은 폴리도파민 코팅을 기반으로 단백질/펩타이드가 고정화된 조직공학 고분자 지지체 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
It is an object of the present invention to provide a tissue-based polymer scaffold on which a protein / peptide is immobilized based on a polydodamine coating and a method for producing the same.
본 발명의 일 구체예에서, 폴리도파민이 결합된 생리활성을 보유한 세포부착성 펩타이드를 고정화시킨 고분자 지지체를 제공한다. 상기 구체예에서, 상기 세포부착성 펩타이드는 파이브로넥틴 또는 라미닌이고, 상기 파이브로넥틴은 서열번호 1 또는 2로 표시되는 펩타이드이고 상기 라미닌은 서열번호 3 또는 4로 표시되는 펩타이드이며, 상기 펩타이드는 신경줄기세포의 신경세포로의 분화를 유도하는 것을 특징으로 하며, 상기 고분자는 폴리스티렌(PS), 폴리카프로락톤, 폴리디메틸실록산 또는 폴리락틱-글리콜산(PLGA)를 포함하는 군으로부터 선택된 어느 하나이며, 상기 펩타이드는 줄기세포의 배양 효과를 포함하며, 상기 지지체의 표면은 친수성인 것을 특징으로 하는 고분자 지지체를 제공한다. In one embodiment of the present invention, there is provided a polymer scaffold in which a cell adhesion peptide having a physiological activity to which polydodamine is bound is immobilized. In this embodiment, the cell adhesion peptide is fibronectin or laminin, the fibronectin is a peptide represented by SEQ ID NO: 1 or 2 and the laminin is a peptide represented by SEQ ID NO: 3 or 4, Wherein the polymer is any one selected from the group consisting of polystyrene (PS), polycaprolactone, polydimethylsiloxane, and polylactic-glycolic acid (PLGA) Wherein the peptide comprises a culture effect of stem cells, and the surface of the support is hydrophilic.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 고분자 지지체를 사용하여 신경줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법을 제공한다.In one embodiment of the present invention, there is provided a method of differentiating neural stem cells into neurons using the polymer scaffold.
본 발명의 일 구체예에서, (a) 고분자 지지체에 도파민을 코팅시키는 단계; 및 생리활성을 보유한 펩타이드를 상기 지지체 표면에 고정화시키는 단계;를 포함하는, 생리활성을 가진 단백질 유래 펩타이드 및 폴리도파민을 연결시킨 고분자 지지체의 제조 방법을 제공한다. 상기 구체예에서, 상기 도파민 코팅은 약염기성 조건(pH 8.5)에서 수행되는 중합 반응이고, 상기 생리활성을 보유한 펩타이드는 신경성장인자, 혈관성장인자 또는 세포부착성 펩타이드이며, 상기 세포부착성 펩타이드는 파이브로넥틴 또는 라미닌이며, 상기 파이브로넥틴은 서열번호 1 또는 2로 표시되는 펩타이드이고 상기 라미닌은 서열번호 3 또는 4로 표시되는 펩타이드이며, 상기 고분자는 폴리스티렌(PS), 폴리카프로락톤, 폴리디메틸실록산 또는 폴리락틱-글리콜산(PLGA)를 포함하는 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 고분자 지지체의 제조 방법을 제공한다.
In one embodiment of the present invention, there is provided a process for preparing a polymeric material comprising: (a) coating a polymeric support with dopamine; And a step of immobilizing a peptide having physiological activity on the surface of the supporter. The present invention also provides a method for producing a polymer scaffold in which a protein-derived peptide having physiological activity and polydopamine are connected. In this embodiment, the dopamine coating is a polymerization reaction carried out under weakly basic conditions (pH 8.5), and the peptide having the physiological activity is a nerve growth factor, a vascular growth factor or a cell adhesion peptide, and the cell adhesion peptide Wherein the fibronectin is a peptide represented by SEQ ID NO: 1 or 2 and the laminin is a peptide represented by SEQ ID NO: 3 or 4, wherein the polymer is selected from the group consisting of polystyrene (PS), polycaprolactone, polydimethyl Siloxane, or polylactic-glycolic acid (PLGA). The present invention also provides a method for producing a polymer scaffold.
본 발명에서 "고분자 지지체"는 중합반응에 의해 형성된 고분자 물질로 이루어진 지지체를 의미하고, 상기 고분자는 이에 한정하지는 않지만 폴리스티렌(PS), 폴리카프로락톤, 폴리디메틸실록산 또는 폴리락틱-글리콜산(PLGA)이 있다. 또한, 상기 고분자 지지체는 임상적으로 사용시에 pH 6~8인 생리적 용액(physiological solution)에 노출되었을 때 분해되는 성질인 "생분해성" 지지체를 포함할 수 있으며, 이에 한정되지는 않지만 폴리락틱-글리콜산(PLGA)을 사용할 수 있으며, 이식된 세포가 조직으로서 목적하는 기능과 역할을 충분히 수행할 때까지 유지된 후 생체 내에서 완전히 분해되어 없어질 수 있는 특성이다.(PS), polycaprolactone, polydimethylsiloxane, or polylactic-glycolic acid (PLGA), but not limited thereto. The term " polymer scaffold " . The polymeric scaffold may also include a "biodegradable" support, which is degradable when exposed to a physiological solution at pH 6 to 8 in clinical use, including, but not limited to, polylactic-glycol (PLGA) can be used, and it is a characteristic that the transplanted cells can be completely decomposed and eliminated in vivo after being maintained until the desired function and role of the tissue is sufficiently carried out.
본 발명에서 "줄기세포"는 생체를 구성하는 서로 다른 세포나 장기로 성장 가능한 일종의 모세포 또는 전능세포를 의미하며, 배아줄기세포 및 성체줄기세포를 포함한다.In the present invention, "stem cell" means a kind of parent cell or omnipotent cell capable of growing into different cells or organs constituting a living body, and includes embryonic stem cells and adult stem cells.
본 발명에서 "세포부착펩타이드"는 세포가 접착될 수 있도록 하는 단백질이며, 신경성장인자(GDNF) 또는 세포부착성 펩타이드를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
In the present invention, the "cell adhesion peptide" is a protein that allows a cell to adhere thereto, including, but not limited to, a nerve growth factor (GDNF) or a cell adhesion peptide.
본 발명은 폴리도파민 코팅을 기반으로 단백질/펩타이드가 고정화된 조직공학 고분자 지지체 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 기존의 지지체에 비해 생리활성을 보유한 단백질/펩타이드를 표면에 효과적으로 고정화하여 신경줄기세포의 인간 신경세포로의 우수한 분화 및 부착이 가능하다. 또한, 표면에 다양한 생리활성물질을 안정적으로 고정화시킬 수 있기 때문에 다양한 조직이식 치료의 가능성을 제시한다.
TECHNICAL FIELD The present invention relates to a tissue-based polymer scaffold on which a protein / peptide is immobilized based on a polydodamine coating, and a method for producing the same. More specifically, the present invention relates to a method for efficiently immobilizing a protein / peptide having physiological activity on a surface, Good differentiation and attachment to cells is possible. In addition, since various physiologically active substances can be stably immobilized on the surface, the possibility of various tissue graft treatment is suggested.
도 1은 본 발명의 고분자 지지체를 제조하는 과정을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 고분자 지지체의 표면을 분석한 결과를 보여주는 것이다.
도 3은 본 발명의 고분자 지지체 표면에 고정화된 펩타이드와 단백질을 시각적으로 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 고분자 지지체 표면에 부착된 신경성장인자(GDNF) 또는 세포부착성 펩타이드가 고정화되어 유지되는 것을 ELISA 분석 또는 플루오레스카민 분석한 결과이다.
도 5는 본 발명의 고분자 지지체 표면상에 신경성장인자(GDNF) 또는 세포부착성 펩타이드가 효율적으로 고정화되어 있음을 AFM 표면 분석 또는 전자주사현미경(SEM) 표면 분석한 결과이다.
도 6은 본 발명의 고분자 표면이 신경성장인자(GDNF) 또는 세포부착성 펩타이드의 안정적인 부착에 의해 친수성으로 변화한 것을 보여주는 결과이다.
도 7은 본 발명의 신경성장인자 또는 세포부착성 펩타이드를 고정화한 폴리스티렌(PS) 또는 폴리락틱-글리콜산(PLGA) 고분자 지지체의 표면에서 배양한 인간 신경줄기세포의 부착 및 분화를 보여주는 결과이다.
도 8은 본 발명의 고분자 지지체 상에서 인간신경줄기세포, 인간중간엽줄기세포 및 인간혈관세포의 배양 및 증식을 보여주는 결과이다. Fig. 1 schematically shows a process for producing the polymer scaffold of the present invention.
2 shows the result of analysis of the surface of the polymer scaffold of the present invention.
FIG. 3 is a graph showing the results of visually confirming the peptides and proteins immobilized on the surface of the polymer scaffold of the present invention.
FIG. 4 shows the result of ELISA analysis or fluorescamine analysis that the nerve growth factor (GDNF) or cell adhesion peptide attached to the surface of the polymer scaffold of the present invention is immobilized and maintained.
FIG. 5 is a result of AFM surface analysis or electron microscope (SEM) surface analysis that nerve growth factor (GDNF) or cell adhesion peptide is efficiently immobilized on the surface of the polymer scaffold of the present invention.
Fig. 6 shows the result of showing that the surface of the polymer of the present invention was changed to hydrophilic by stable attachment of nerve growth factor (GDNF) or cell adhesion peptide.
FIG. 7 shows the results of adhesion and differentiation of human neural stem cells cultured on the surface of a polystyrene (PS) or polylactic-glycolic acid (PLGA) polymer scaffold immobilized with the nerve growth factor or cell adhesion peptide of the present invention.
FIG. 8 shows the results of culturing and proliferation of human neural stem cells, human mesenchymal stem cells, and human blood vessel cells on the polymer scaffold of the present invention.
이하, 본 발명의 구성요소와 기술적 특징을 다음의 실시예들을 통하여 보다상세하게 설명하고자 한다. 그러나 하기 실시예들은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the components and technical features of the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are intended to illustrate the contents of the present invention and are not intended to limit the scope of the invention.
PLGAPLGA 고분자 지지체의 제조 Preparation of polymer scaffold
1.1 폴리도파민 코팅1.1 Polydopamine coating
고분자 지지체 시료에 폴리도파민(PD, polydopamine)을 코팅하기 위해, 시료를 약염기성의 도파민 용액(농도: 2mg/ml in 10mM Tris-HCl, pH 8.5)에 담그고 18시간 동안 흔들면서 상온에서 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 시료 표면을 증류수로 씻어주면서 시료 표면에 부착되지 않은 도파민을 제거하였다(도1).
In order to coat polydodamine (PD, polydopamine) on the polymer scaffold sample, the sample was immersed in a weakly basic dopamine solution (concentration: 2 mg / ml in 10 mM Tris-HCl, pH 8.5) and reacted at room temperature while shaking for 18 hours. After the reaction, the surface of the sample was rinsed with distilled water to remove dopamine which was not attached to the surface of the sample (FIG. 1).
1.2 펩타이드 및 성장인자 고정화1.2 Peptide and Growth Factor Immobilization
폴리도파민이 코팅된 고분자 필름 시료 상에 세포부착성 펩타이드(파이브로넥틴 서열: CGG RGD , KGG RGD , 라미닌 서열: CGG YIGSR , KGG YIGSR ) 또는 신경성장인자(NGF, GDNF)를 고정화하였다. 폴리도파민이 코팅된 시료에 1mg/ml 농도의 펩타이드 용액과 1ug/ml 농도의 성장인자 용액을 첨가하고 상온에서 12시간 동안 반응시켰다. 증류수로 필름 표면을 씻어내어 고정화되지 않은 펩타이드 및 성장인자를 제거하였다(도1).
(Fibronectin sequence: CGG RGD , KGG RGD , laminin sequence: CGG YIGSR , KGG YIGSR ) or nerve growth factor (NGF, GDNF) was immobilized on a polydodamine coated polymer film sample. 1 mg / ml of peptide solution and 1 ug / ml of growth factor solution were added to the sample coated with polydodamine and reacted at room temperature for 12 hours. The film surface was rinsed with distilled water to remove unimmobilized peptides and growth factors (Figure 1).
1.3 시료 표면의 분석1.3 Analysis of sample surface
광전자 분광기(XPS)를 통해 고분자 시료 표면의 화학적 원소 성분을 분석하고 정량화하였다. N 원소 및 S 원소 함량의 증가를 통해 고분자 지지체 표면상에서 성장인자 단백질 및 세포부착펩타이드의 효율적인 고정화를 확인하였다(도2). 펩타이드 및 성장인자 단백질의 고정화 정도를 정량하기 위해 반응 후 용액 내 남아 있는 부착되지 않은 펩타이드와 성장인자의 양을 각각 플루오레스카민(fluorescamine) 방법과 ELISA 방법을 통해 분석하였다. 고정화된 펩타이드와 단백질을 시각적으로 검출하기 위해 형광염료가 부착된 펩타이드(FITC-CGGRGD)와 단백질(Texas-Red-BSA)을 폴리도파민이 코팅된 표면에 고정화한 후 형광분석기를 통해 확인하였다(도3). ELISA 분석과 플루오레스카민 분석을 통해 지지체에 부착된 단백질 또는 펩타이드의 고정화가 유지됨을 확인하였다(도4). 고분자 지지체의 표면 형태와 표면의 조도는 원자간력현미경(AFM)과 전자주사현미경(SEM)으로 분석하여 신경성장인자 또는 세포부착성 펩타이드가 고분자 지지체 표면상에 효율적으로 고정화되어 있음을 확인하였다(도5). 또한, 고분자 지지체 표면상에서 물방울의 표면 접촉각을 측정하여 표면의 친수성 정도를 분석하여 신경성장인자 또는 세포부착성 펩타이드의 부착 및 고정화에 의해 고분자 지지체의 표면이 친수성으로 변화하는 것을 확인하였다(도6).
Chemical elements of the surface of polymer samples were analyzed and quantified by photoelectron spectroscopy (XPS). Through the increase of N element and S element content, efficient immobilization of growth factor protein and cell adhesion peptide on the surface of polymer scaffold was confirmed (Fig. 2). To quantify the degree of immobilization of peptide and growth factor proteins, the amounts of unattached peptides and growth factors remaining in the solution after the reaction were analyzed by the fluorescamine method and the ELISA method, respectively. (FITC-CGGRGD) and protein (Texas-Red-BSA) were immobilized on the surface coated with polydodamine to confirm the immobilized peptides and proteins visually, followed by fluorescence analysis 3). Immobilization of proteins or peptides attached to the support was confirmed through ELISA analysis and fluorocammin analysis (Fig. 4). The surface morphology and surface roughness of the polymer scaffold were analyzed by atomic force microscopy (AFM) and scanning electron microscopy (SEM) to confirm that the nerve growth factor or cell adhesion peptide was efficiently immobilized on the surface of the polymer scaffold 5). Further, the surface contact angle of the water droplet was measured on the surface of the polymer scaffold to analyze the degree of hydrophilicity of the surface, and it was confirmed that the surface of the polymer scaffold was changed to hydrophilic by attachment and immobilization of nerve growth factor or cell adhesive peptide (Fig. 6) .
신경 줄기세포(Neural stem cells ( NeuralNeural StemStem CellCell , , NSCNSC )의 배양) Culture
2.1 인간 신경줄기세포의 배양2.1 Culture of human neural stem cells
인간 태아 유래 신경줄기세포는 대뇌피질로부터 분리하였다. 세포는 6.0 x 105/ml 농도로 부착시켰으며, 섬유아세포 성장인자(bFGF, 20 ng/ml), 표피성장인자Human fetal-derived neural stem cells were isolated from the cerebral cortex. Cells were adhered at a concentration of 6.0 x 10 5 / ml. Fibroblast growth factor (bFGF, 20 ng / ml), epidermal growth factor
(EGF, 20 ng/ml), 백혈병억제인자(LIF, 10 ng/ml)와 N2 supplement를 첨가한 Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) 배지, 5%의 이산화탄소 농도 및 37°C 조건에서 배양하였다.
(DMEM / F12) medium, 5
2.2 마우스 신경줄기세포의 배양2.2 Culture of mouse neural stem cells
마우스 태아 유래 신경줄기세포는 13일된 ICR 마우스의 배아로부터 분리하였다. 대뇌피질로부터 추출된 신경줄기세포는 6.0 x 105/ml 농도로 부착시켰으며, 섬유아세포 성장인자(bFGF, 20 ng/ml), 표피성장인자(EGF, 20 ng/ml)와 N2 supplemeThe mouse embryo-derived neural stem cells were isolated from embryos of 13-day-old ICR mice. Neural stem cells from the cerebral cortex were adhered at a concentration of 6.0 × 10 5 / ml. Fibroblast growth factor (bFGF, 20 ng / ml), epidermal growth factor (EGF, 20 ng / ml)
nt를 첨가한 DMEM/F12 배지, 5%의 이산화탄소 농도 및 37°C 조건에서 배양하였다.
nt supplemented DMEM / F12 medium, 5
2.3 인간 유도만능줄기세포 유래 신경줄기세포의 배양2.3 Culture of human induced pluripotent stem cell-derived neural stem cells
인간 유도만능줄기세포로부터 분화된 신경줄기세포는 5.0 x 104/ml의 농도로 부착시켰으며, 섬유아세포 성장인자(bFGF,20 ng/ml), 표피성장인자(EGF,20 ng/ml)와 N2 supplement를 첨가한 DMEM/F12 배지, 5%의 이산화탄소 농도 및 37°C 조건에서 배양하였다.
(BFGF, 20 ng / ml), epidermal growth factor (EGF, 20 ng / ml) and N2 (10 ng / ml) were adhered at a concentration of 5.0 × 10 4 / supplemented DMEM / F12 medium, 5
펩타이드Peptides
/성장인자가 고정화된 고분자 필름 시료에서의 신경줄기세포 배양/ Culturing neural stem cells in polymer film samples immobilized with growth factors
인간 및 마우스 신경줄기세포는 2.0 x 105/ml 농도로, 인간 유도만능줄기세포 유래 신경줄기세포는 2.0 x 104/ml의 농도로 자발적 분화(spontaneous differenHuman and mouse neural stem cells were cultured at a concentration of 2.0 x 10 5 / ml, and human induced pluripotent stem cell-derived neural stem cells were spontaneously differentiated at a concentration of 2.0 x 10 4 / ml
tiation)를 유도하기 위해 bFGF, EGF, LIF 성장인자를 포함하지 않은 DMEM/F12 배지에서 배양하였다. 코팅되지 않은 고분자 시료를 음성대조군으로, 매트리젤(matrigel)이 코팅된 고분자 시료는 양성대조군으로 사용하였다. 신경줄기세포 분화는 세포면역염색(immunocytochemistry)과 정량적 실시간 중합효소연쇄반응(quantitative real-time polymerase chain reaction; qRT-PCR)을 통해 분석하였고 세포 증식은 알라마 블루(Alamar Blue) 방법으로 조사하였다.
The cells were cultured in DMEM / F12 medium containing no bFGF, EGF, or LIF growth factor. Uncoated polymer samples were used as negative controls, and matrigel coated polymer samples were used as positive controls. Neural stem cell differentiation was analyzed by immunocytochemistry and quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Cell proliferation was examined by the Alamar Blue method.
신경 줄기세포 분화Neural stem cell differentiation
4.1 세포 면역 염색(Immunohistochemistry)4.1 Immunohistochemistry
고분자 시료 위에 배양한 신경줄기세포는 4%의 파라포름알데히드(para-formThe neural stem cells cultured on the polymer sample were 4% paraformaldehyde (para-form
aldehyde)로 15분간 고정화하고 0.1% Triton X-100으로 5분간 처리하여 세포 내로 항체 투과가 용이하게 하였다. 비특이적 항체 반응을 최소화하기 위해서 2%의 염소(goat) 혈청으로 45분간 blocking을 하고 4°C에서 일차 항체[mouse monoclonal anti-neuronal class III β-tubulin (Tuj1), mouse monoclonal anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP)]를 하룻밤 동안 반응시켰다. PBS용액으로 씻어준 후 형광염료가 부착된 이차 항체를 상온에서 45분간 반응시켰다. 세포핵은 4'-6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)로 염색하였으며 세포 내 염색된 신호는 형광현미경으로 관찰하였다(도7a; A,C & 도7b; E,G).
aldehyde) for 15 minutes and treated with 0.1% Triton X-100 for 5 minutes to facilitate antibody penetration into cells. To minimize nonspecific antibody response, the cells were blocked with 2% goat serum for 45 min and incubated with primary antibody (mouse monoclonal anti-neuronal class III β-tubulin (Tuj1), mouse monoclonal anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP)] were reacted overnight. After washing with PBS solution, secondary antibody with fluorescent dye was reacted at room temperature for 45 minutes. The nucleus was stained with 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), and the intracellular staining signal was observed with a fluorescence microscope (Fig. 7a; A, C &
4.2 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR)4.2 Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR)
각각의 고분자 필름 시료 상에서 배양된 줄기세포로부터 RNA를 추출하였고, 분광광도계(UV-Vis spectrophotometer)를 사용하여 260 nm 파장에서 시료들의 흡광도를 측정함으로써 RNA 농도를 측정하였다. 역전사반응(reverse transcription)은 500 ng RNA로 수행하였으며, qRT-PCR 분석은 StepOnePlus Real-Time PCR System을 사용하여 진행하였다. TaqMan 유전자 발현 분석 진단 키트(assay kit)를 사용하여 분화된 신경줄기세포 내의 신경세포 마커(Tuj1) 및 성상교세포 마커(GFAP)의 유전자 발현을 정량하였다(도7a; B, D & 도7b; F, H). GDNF, NGF 성장인자 단백질 또는 YIGSR, RGD 펩타이드가 고정화된 폴리스티렌(PS) 및 폴리락틱-글리콜산(PLGA) 표면 상에서 배양된 신경줄기세포의 분화가 촉진되었음이 확인되었다.
RNA was extracted from the stem cells cultured on each polymer film sample, and the RNA concentration was measured by measuring the absorbance of the samples at a wavelength of 260 nm using a spectrophotometer (UV-Vis spectrophotometer). Reverse transcription was performed with 500 ng of RNA, and qRT-PCR analysis was performed using the StepOnePlus Real-Time PCR System. Gene expression of neuronal marker (Tuj1) and astrocytic marker (GFAP) in differentiated neural stem cells was quantified using TaqMan gene expression assay kit (Fig. 7a; B, D & H). It was confirmed that the differentiation of neural stem cells cultured on the surface of polystyrene (PS) and polylactic-glycolic acid (PLGA) immobilized with GDNF, NGF growth factor protein or YIGSR, RGD peptide was promoted.
인간 줄기세포 및 Human stem cells and
혈관세포의Vascular cell
부착 및 증식 Attachment and proliferation
폴리도파민을 이용하여 폴리스티렌(PS) 또는 폴리락틱-글리콜산(PLGA) 고분자 지지체의 표면에 다양한 성장인자 단백질(신경; GDNF, NGF, 혈관; VEGF, bFGF, 세포부착성펩타이드; RGD, YIGSR)을 고정화한 후, 인간 신경줄기세포, 인간 중간엽 줄기세포 및 인간 혈관세포를 배양하고 알라마 블루(Alamar Blue) 분석을 통해 각각의 세포의 증식을 조사하였다. GDNF, NGF, VEGF, bFGF, RGD, YIGSR) on polystyrene (PS) or polylactic-glycolic acid (PLGA) polymer scaffolds using polydodamine After immobilization, human neural stem cells, human mesenchymal stem cells and human vascular cells were cultured and the proliferation of each cell was examined through Alamar Blue analysis.
폴리도파민을 통해 성장인자 단백질 및 세포부착성 펩타이드가 부착된 고분자 지지체의 표면 상에서 배양된 줄기세포 및 혈관 세포는 일반적인 세포배양 표면The stem cells and vascular cells cultured on the surface of the polymer scaffold to which the growth factor protein and the cell adhesion peptide are attached through the polydodamine,
(단백질/펩타이드가 고정화되지 않은 표면)에서의 증식에 비해 향상된 증식능을 보여주었다(도8).
(Surface where the protein / peptide is not immobilized) (Fig. 8).
지금까지 예시적인 실시예를 참조하여 본 발명을 기술하여 왔지만, 본 발명의 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고서도 다양한 변화를 실시할 수 있으며 그의 요소들을 등가물로 대체할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 본질적인 범주를 벗어나지 않고서도 많은 변형을 실시하여 특정 상황 및 재료를 본 발명의 교시내용에 채용할 수 있다. 따라서, 본 발명이 본 발명을 실시하는데 계획된 최상의 양식으로서 개시된 특정 실시예로 국한되는 것이 아니며, 본 발명이 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시예를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.While the present invention has been described with reference to exemplary embodiments, it will be understood by those skilled in the art that various changes may be made and equivalents may be substituted for elements thereof without departing from the scope of the invention. You will know. In addition, many modifications may be made to adapt a particular situation and material to the teachings of the invention without departing from the essential scope thereof. Accordingly, it is intended that the invention not be limited to the particular embodiment disclosed as the best mode contemplated for carrying out this invention, but that the invention will include all embodiments falling within the scope of the appended claims.
<110> YONSEI UNIVERSITY
<120> Polydopamine-linked bioactive peptide-immobilized scaffold
materials and the method for preparing the same
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Claims (14)
A polymer scaffold immobilized with a cell adhesion peptide having physiological activity to which polydodamine is bound.
상기 세포부착성 펩타이드는 파이브로넥틴 또는 라미닌인 것을 특징으로 하는 고분자 지지체.
The method according to claim 1,
Wherein the cell adhesion peptide is fibronectin or laminin.
상기 파이브로넥틴은 서열번호 1 또는 2로 표시되는 펩타이드이고 상기 라미닌은 서열번호 3 또는 4로 표시되는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 고분자 지지체.
3. The method of claim 2,
Wherein the fibronectin is a peptide represented by SEQ ID NO: 1 or 2 and the laminin is a peptide represented by SEQ ID NO: 3 or 4.
상기 펩타이드는 신경줄기세포의 신경세포로의 분화를 유도하는 것을 특징으로 하는 고분자 지지체.
The method according to claim 1,
Wherein the peptide induces differentiation of neural stem cells into neurons.
상기 고분자는 폴리스티렌(PS), 폴리카프로락톤, 폴리디메틸실록산 또는 폴리락틱-글리콜산(PLGA)를 포함하는 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 고분자 지지체.
The method according to claim 1,
Wherein the polymer is any one selected from the group consisting of polystyrene (PS), polycaprolactone, polydimethylsiloxane, and polylactic-glycolic acid (PLGA).
상기 펩타이드는 줄기세포의 배양 효과를 포함하는 것을 특징으로 하는 고분자 지지체.
The method according to claim 1,
Wherein the peptide comprises a culture effect of stem cells.
상기 지지체의 표면은 친수성인 것을 특징으로 하는 고분자 지지체.
The method according to claim 1,
Wherein the surface of the support is hydrophilic.
A method for differentiating neural stem cells into neurons on the polymer scaffold of any one of claims 1 to 7.
(b) 생리활성을 보유한 펩타이드를 상기 지지체 표면에 고정화시키는 단계;
를 포함하는, 생리활성을 가진 단백질 유래 펩타이드 및 폴리도파민을 연결시킨 고분자 지지체의 제조 방법.
(a) coating the polymeric support with dopamine; And
(b) immobilizing a peptide having physiological activity on the surface of the support;
A protein-derived peptide having physiological activity, and a polydodamine.
상기 도파민 코팅은 약염기성 조건에서 수행되는 중합 반응인 것을 특징으로 하는 고분자 지지체의 제조 방법.
10. The method of claim 9,
Wherein the dopamine coating is a polymerization reaction under weakly basic conditions.
상기 생리활성을 보유한 펩타이드는 신경성장인자, 혈관성장인자 또는 세포부착성 펩타이드인 것을 특징으로 하는 고분자 지지체의 제조 방법.
10. The method of claim 9,
Wherein the peptide having the physiological activity is a nerve growth factor, a vascular growth factor, or a cell adhesion peptide.
상기 세포부착성 펩타이드는 파이브로넥틴 또는 라미닌인 것을 특징으로 하는 고분자 지지체의 제조 방법.
10. The method of claim 9,
Wherein the cell adhesion peptide is fibronectin or laminin.
상기 파이브로넥틴은 서열번호 1 또는 2로 표시되는 펩타이드이고 상기 라미닌은 서열번호 3 또는 4로 표시되는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 고분자 지지체의 제조 방법.
13. The method of claim 12,
Wherein the fibronectin is a peptide represented by SEQ ID NO: 1 or 2 and the laminin is a peptide represented by SEQ ID NO: 3 or 4.
상기 고분자는 폴리스티렌(PS), 폴리카프로락톤, 폴리디메틸실록산 또는 폴리락틱-글리콜산(PLGA)를 포함하는 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 고분자 지지체의 제조 방법.
10. The method of claim 9,
Wherein the polymer is any one selected from the group consisting of polystyrene (PS), polycaprolactone, polydimethylsiloxane, and polylactic-glycolic acid (PLGA).
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