KR20150003058A - Composition for cryopreservating sperm comprising LDL and anti-oxidant and uses thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 저밀도 지질단백질과 항산화제를 포함하는 정자 동결보존용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 동결보존시에 정자의 활성저하를 억제할 수 있는 저밀도 지질단백질(LDL)과 항산화제를 포함하는 정자의 동결보존용 조성물 및 상기 조성물을 정자에 처리하고, 이를 동결보존하는 단계를 포함하는 동결보존된 정자의 활성을 향상시키는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a composition for sperm cryopreservation comprising a low density lipoprotein and an antioxidant and a use thereof. More particularly, the present invention relates to a low density lipoprotein (LDL) and a low density lipoprotein A composition for cryopreserving sperm containing an antioxidant and a method for improving the activity of a cryopreserved sperm comprising the step of treating the sperm with the composition and cryopreserving the composition.
정자의 동결과 저온 보관은 가축 등의 품종의 보존과 번식에 유용하며 생명공학 분야에서 활발히 연구되고 있는 분야이다. 특히, 동결 과정 중에 정자는 세포 내 빙정 형성, 삼투압의 차이 그리고 저온 스트레스에 의해 손상을 받게 되는데, 이러한 손상을 감소시키는 물질이 동결보존제이며 대표적인 물질로는 글리세롤(Glycerol)이 있다. 동결과정에 쓰이는 원 정액은 농도가 높기 때문에 희석액을 사용하여 묽히게 되는데, 희석 과정 중에 동결보존제가 희석액과 함께 투여된다. 글리세롤은 세포에 독성이 있는 물질이고 특히, 돼지의 정자는 다른 가축 동물의 정자보다 외부 자극에 대한 감수성이 높기 때문에 글리세롤에 의해 쉽게 손상을 받을 수 있다.Sperm freezing and cryopreservation are useful for the preservation and breeding of varieties such as livestock and are actively researched in biotechnology. In particular, during freezing, sperm are damaged by intracellular ice formation, osmotic pressure differences, and cold stress. Glycerol is a typical cryoprotectant. Since the concentration of the original semen used in the freezing process is diluted with a diluent, the cryopreservative is dispensed with the diluent during the dilution process. Glycerol is toxic to cells, and pig sperm can be easily damaged by glycerol because they are more susceptible to external stimuli than sperm of other livestock animals.
이러한 동결보존(cryopreservation)은 실험 및 인공수정(artificial insemination, AI)을 위한 정자 세포의 유용성을 확장시킨다. 다양한 기술적 제약에도 불구하고, 정자에의 접근가능성은 인공수정 및 시험관내 수정(in vitro fertilization, IVF)의 발전을 가능케 하였다. 그러나, 동결-융해된 정자는 신선 정자(fresh sperm)와 같은 동일한 수정능(fertilizing potential)을 가지지 못하는데, 이는 22℃에서 1℃로 냉각되는 동안 냉각 과정이 세포막 내 지질 및 단백질 재배열을 유도하기 때문이다. This cryopreservation extends the usefulness of sperm cells for experimental and artificial insemination (AI). Despite the various technical constraints, accessibility to sperm has allowed the development of artificial insemination and in vitro fertilization (IVF). However, frozen-thawed sperm do not have the same fertilizing potential as fresh sperm, which means that the cooling process leads to intracellular lipid and protein rearrangement during cooling from 22 ° C to 1 ° C Because.
이러한 변이는 저온에서 액상에서 겔상으로 변화하는 막에 의해 유도된다. 이는 동결보존 시 정자의 생존력 및 수정능을 감소시키는 주된 원인 중 하나이다. 그 중에서도 정자 막의 콜레스테롤/인지질 비율은 동결보존 시 막 유동성 및 안정성에 있어서 주요 결정인자이다. 인간 및 토끼 정자와 같은, 매우 높은 콜레스테롤/인지질 비율을 가지는 종에서 얻은 정자는 냉각될 때 이러한 막 손상을 겪지 않음이 보고되었다. These variations are induced by membranes that change from liquid to gel at low temperatures. This is one of the main causes of reducing sperm viability and fertility during cryopreservation. Among them, cholesterol / phospholipid ratio of sperm membrane is the main determinant of membrane fluidity and stability in cryopreservation. It has been reported that sperm obtained from species with very high cholesterol / phospholipid ratios, such as human and rabbit sperm, do not experience this membrane damage when cooled.
통상적으로, 막의 손상은 세포사멸에 대한 주요 원인 중 하나로 여겨지고 있다. 막의 주요 구성 요소인, 콜레스테롤은 막 기능의 조절과 같은 중요한 역할을 하고, 세포막에서 콜레스테롤은 막 유동성 및 투과성의 주요 결정인자로 알려져 있다. Typically, membrane damage is thought to be one of the major causes of cell death. Cholesterol, a major component of the membrane, plays an important role, such as regulation of membrane function, and cholesterol in the cell membrane is known as a major determinant of membrane fluidity and permeability.
한편, 콜레스테롤은 막의 전이온도를 낮추고, 낮아진 온도에서 그들을 액상으로 유지시켜 저온에서 발생하는 막손상을 감소시킨다고 알려져 있다. On the other hand, it is known that cholesterol lowers the transition temperature of the membrane and keeps them in a liquid state at a lower temperature to reduce membrane damage occurring at low temperatures.
이러한 콜레스테롤은 정자 막의 안정화에 중요한 역할을 한다. 특히, 정자의 수정능획득(capacitation) 시, 막은 콜레스테롤을 상실하고, 더욱 불안정한 막 구조를 갖게 함으로써 첨체반응을 가능하게 한다. 정자 수정능획득은 정자 막에서 콜레스테롤 유출로 유도될 수 있다. 유사하게, 정자가 냉각 또는 동결되면, 막들은 상전이가 일어나는데, 이는 막 지질과 단백질의 재배열 및 막으로부터 지질의 소실을 초래하고, 차례로, 막내 단백질과 지질 응집 및 막-선택적 투과성의 소실을 유발함으로써, 정자의 조숙한 수정능획득이 일어나게 하고, 이러한 조숙한 수정능획득은 정자의 수정 및 수명의 감소를 초래한다고 알려져 있다.
These cholesterol plays an important role in the stabilization of the sperm membrane. In particular, when the sperm is capacitated, the membrane loses cholesterol and makes the acrosome reaction possible by making the membrane structure more unstable. Acquisition of sperm fertilization can lead to cholesterol efflux from the sperm membrane. Similarly, when the sperm is cooled or frozen, the membranes undergo phase transitions, resulting in rearrangement of membrane lipids and proteins and loss of lipids from the membrane, which, in turn, leads to loss of membrane protein and lipid aggregation and membrane-selective permeability , It is known that spermatozoa acquire premature fertilization ability and that premature fertilization acquisition results in correction of sperm and decrease of life span.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 가축의 정자를 보다 효율적으로 동결보존할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 저밀도 지질단백질(LDL)과 항산화제를 포함하는 정자의 동결보존용 조성물을 이용할 경우, 종래의 동결보존제를 사용할 경우보다도 가축의 정자를 효율적으로 동결보존할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
Under these circumstances, the present inventors have made extensive efforts to develop a method for more effectively cryopreserving spermatozoa of livestock. As a result, it has been found that when a composition for cryopreserving sperm containing low density lipoprotein (LDL) and an antioxidant is used , It was confirmed that the spermatozoa of the livestock can be efficiently cryopreserved as compared with the case of using the conventional cryopreservation agent, and the present invention has been completed.
본 발명의 하나의 목적은 저밀도 지질단백질(low density lipoprotein, LDL)과 항산화제를 포함하는 정자의 동결보존용 조성물을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a composition for cryopreserving sperm containing low density lipoprotein (LDL) and an antioxidant.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 정자에 처리하고, 이를 동결보존하는 단계를 포함하는 동결보존된 정자의 활성을 향상시키는 방법을 제공하는 것이다.
Another object of the present invention is to provide a method for improving the activity of a cryopreserved sperm comprising the step of treating the composition with sperm and cryopreserving the composition.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 저밀도 지질단백질(low density lipoprotein, LDL)과 항산화제를 포함하는 정자의 동결보존용 조성물을 제공한다.
In one embodiment of the present invention, the present invention provides a composition for cryopreserving sperm containing low density lipoprotein (LDL) and an antioxidant.
본 발명자들은 제주산 흑우를 개량하기 위하여 상기 흑우 중에서 우수한 품종으로부터 수득한 정자를 장기간 동안 보존하고자 하였다. 그러나, 종래의 정자보존용 조성물은 정자의 동결 및 융해시에 정자를 보존하는 효율이 낮기 때문에, 보다 높은 효율로 정자를 동결보존할 수 있는 성분을 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 정자의 동결 및 융해에 의하여 영향을 받는 주된 손상부위가 정자막이라는 점에 주목하였다. 다른 세포와는 달리, 정자는 세포질 성분이 거의 존재하지 않기 때문에, 동결 및 융해에 의하여 세포질 손상에 의한 영향을 거의 받지 않으므로, 정자를 둘러싼 정자막의 손상을 최소화할 경우에는, 동결 및 융해에 따른 정자의 손상을 현저하게 감소시킬 수 있을 것으로 예상하였다. 이에, 정자막에 상응하는 세포막에 대한 동결보호효과를 나타내는 것으로 알려진 LDL을 동결보호제로서 사용하여 그의 효과를 비교한 결과, 종래의 동결보호제로 사용되어온 글리세롤보다는 우수한 효과를 나타내지만, 현저한 효과를 나타내지는 못함을 확인하고, 상기 LDL의 정자막 보호효과를 보조할 수 있는 성분을 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과, 항산화제가 상기 LDL의 정자막 보호효과를 보조하여 상승효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다. ROS는 세포막의 유동성을 감소시키는 효과를 나타내기 때문에 정자막의 손상에 직접적인 영향을 미칠 수 있고, 이러한 ROS의 작용은 항산화제에 의하여 방지할 수 있기 때문에, 상기 LDL에 항산화제를 추가하면 정자의 동결 및 융해에 의하여 야기되는 정자막의 손상을 보다 효과적으로 방지할 수 있을 것으로 예상하고, 이를 실험적으로 확인하였다.
The present inventors intend to preserve the spermatozoa obtained from superior varieties in the above-mentioned black cattle for a long period of time in order to improve the cattle from Jeju. However, since the conventional sperm storage composition has low efficiency of preserving sperm at the time of freezing and thawing the sperm, various studies have been carried out to develop a component capable of preserving the sperm at a higher efficiency, And that the main damage site affected by the fusion is the sagittal film. Unlike other cells, sperm are almost free from cytoplasmic damage due to freezing and thawing because they contain little cytoplasmic components. Therefore, when minimizing damage to the spermatids surrounding the sperm, And could significantly reduce sperm damage. As a result of comparing the effects of LDL, which is known to exhibit a cryoprotective effect on cell membranes corresponding to the spermatogonial membranes, as a cryoprotectant, the cryoprotectant exhibits superior effects than glycerol used as a conventional cryoprotectant, but exhibits a remarkable effect And to develop a component capable of supporting the protection of the static film of the LDL. As a result, it was confirmed that an antioxidant can provide a synergistic effect by assisting the protective effect of the above-described latent epithelium of LDL. Since ROS has the effect of reducing the flowability of the cell membrane, it can directly affect the damage of the spermatocytes, and since the action of ROS can be prevented by the antioxidant, It is anticipated that it will be possible to more effectively prevent damage to the spermatids caused by freezing and thawing, and this has been experimentally confirmed.
본 발명의 용어 "저밀도 지질단백질(low density lipoprotein, LDL)"이란, β-리포단백질이라고도 하고, 콜레스테롤에스테르와 아포리포단백질 β로 구성되며, 비중 1.019~1.063의 비중을 갖는 혈장성 지질단백질을 의미한다. 상기 LDL의 주된 기능은 혈장내에 존재하는 콜레스테롤을 말초혈관까지 수송하는 것이며, 상기 LDL이 과량으로 존재할 경우 죽상동맥경화증과 같은 심혈관계 질환이 유발될 수 있다.The term " low density lipoprotein (LDL) "of the present invention means a plasma lipid protein having a specific gravity of 1.019 to 1.063, which is also referred to as? -Lipoprotein and is composed of cholesterol ester and apolipoprotein? do. The main function of the LDL is to transport cholesterol present in the blood plasma to peripheral blood vessels. If the LDL is present in an excessive amount, cardiovascular diseases such as atherosclerosis may be induced.
본 발명에 있어서, 상기 LDL은 정자의 동결보존시에 사용되는 동결보존용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있고, 상기 조성물에 포함된 LDL의 함량은 정자의 동결보존 효과를 나타내게 할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 조성물 최종 중량에 대하여 2 내지 10%(w/w), 보다 바람직하게는 3 내지 7%(w/w), 가장 바람직하게는 4%(w/w)가 될 수 있다.
In the present invention, the LDL can be used as an active ingredient of the composition for cryopreservation used for cryopreservation of spermatozoa, and the content of LDL contained in the composition is not particularly limited as long as it can exhibit the cryopreservation effect of spermatozoa But is preferably not more than 2 to 10% (w / w), more preferably 3 to 7% (w / w), most preferably 4% (w / w) .
본 발명의 용어 "항산화제"란, 생체내 또는 세포내에서 발생되는 활성산소(reactive oxygen species, ROS)를 흡착하여 제거할 수 있는 물질을 의미한다. 정자를 동결보존하기 위하여, 체외에서 작업할 경우에는 체내보다도 높은 농도의 산소에 노출되기 때문에, 과량의 ROS가 생성되고, 이처럼 생성된 ROS는 산화성 스트레스를 유발하여, 미토콘드리아의 호흡 억제, 세포막의 유동성 감소, 각종 효소의 불활성화 및 DNA와 RNA의 손상 등의 부작용을 나타내는 것으로 알려져 있다. The term "antioxidant" of the present invention means a substance capable of adsorbing and removing reactive oxygen species (ROS) generated in vivo or intracellularly. In order to preserve spermatozoa, when working outside the body, they are exposed to oxygen at a higher concentration than in the body, so that excessive ROS is produced. Such ROS causes oxidative stress, which causes mitochondrial respiratory depression, , Inactivation of various enzymes, and damage of DNA and RNA.
본 발명에 있어서, 상기 항산화제는 정자의 동결보존 및 융해시에 발생하는 ROS를 제거하여 정자의 손상을 방지할 수 있으므로, 정자의 동결보존시에 사용되는 동결보존용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다. In the present invention, the antioxidant can prevent sperm damage by removing ROS generated during cryopreservation and thawing of spermatozoa. Therefore, the antioxidant can be used as an active ingredient of a composition for cryopreservation used in sperm cryopreservation have.
이때 사용되는 항산화제의 종류는 정자의 동결보존 효과를 나타내게 할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않고, 당업계에서 사용될 수 있는 통상적인 항산화제를 제한없이 사용할 수 있는데, 바람직하게는 베타-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol, β-ME), 글루타치온(Glutathione, GSH), 아스코르브산(ascorbic acid), 비타민 E, 베타카로틴, 라이코펜, 코엔자임 Q-10(coenzyme Q-10), 셀레늄, 크롬, 마그네슘 등을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 타우린(taurine), 하이포타우린(hypotaurine), 트레할로스(trehalose) 등을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 타우린을 사용할 수 있다.The type of antioxidant used herein is not particularly limited as long as it can exhibit a cryopreserving effect of sperm, and conventional antioxidants that can be used in the art can be used without limitation, preferably beta-mercaptoethanol beta-carotene, lycopene, coenzyme Q-10, selenium, chromium, magnesium, and the like, in combination with one or more agents selected from the group consisting of? -mercaptoethanol,? -ME, glutathione, GSH, ascorbic acid, vitamin E, More preferably, taurine, hypotaurine, trehalose and the like can be used, and taurine can be most preferably used.
또한, 상기 조성물에 포함된 항산화제의 함량은 정자의 동결보존 효과를 나타내게 할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 5 내지 100mM, 보다 바람직하게는 10 내지 60mM, 가장 바람직하게는 20mM이 될 수 있다.
The content of the antioxidant contained in the composition is not particularly limited as long as it can exhibit a cryopreserving effect of the sperm, but is preferably 5 to 100 mM, more preferably 10 to 60 mM, most preferably 20 mM .
본 발명의 용어 "정자"란, 정충이라고도 하고, 정자는 웅성동물의 고환에서 생산되는 성세포를 의미하는데, 길이는 약 0.02㎜이며, 머리, 경부 및 긴 꼬리의 세 부분으로 구성된다. 머리 부분에는 웅성 동물의 DNA가 들어 있고, 머리 부분의 맨 앞쪽에 존재하는 첨체에는 난자의 난막을 녹일 수 있는 효소가 포함되어 있고; 상기 경부에는 에너지 저장고인 당분을 함유한 미토콘드리아가 포함되어 있으며; 상기 꼬리는 가는 실 묶음으로 되어 있는데 가는 실 묶음이 교묘하게 신축하여 꼬리를 움직이게 한다. 본 발명의 목적상 상기 정자는 특별히 제한되지 않으나, 가축의 정자, 바람직하게는 소, 개, 고양이, 돼지, 양, 염소, 말 등의 정자가 될 수 있고, 바람직하게는 소의 정자가 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 제주산 흑우의 정자가 될 수 있다.
The term "spermatozoa ", as used herein, is also referred to as spermatozoa, and spermatozoa means sex cells produced in male testes. The spermatozoa are about 0.02 mm in length and consist of three parts: head, neck and long tail. The head contains the DNA of the male animal, and the acrosome at the front of the head contains an enzyme that can melt the eggshell of the egg; Said neck comprising mitochondria containing an energy store sugar; The tail is a thin thread bundle, which allows the thread bundle to be elaborately stretched to move the tail. For the purpose of the present invention, the spermatozoa are not particularly limited, but they can be spermatozoa of sperm, preferably cows, dogs, cats, pigs, sheep, goats, horses and the like, , And most preferably a sperm from a Korean beef cattle.
본 발명의 용어 "동결보존"이란, 냉동을 통해 장기간에 걸쳐 세포를 안정하게 유지시키는 행위를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 동결보존은 정자의 동결보존을 의미하는 것으로 해석될 수 있다.
The term "cryopreservation" of the present invention means an operation of stably maintaining the cells for a long period of time through freezing. For purposes of the present invention, the cryopreservation may be interpreted to mean cryopreserved sperm.
본 발명의 용어 "동결보존제(cryoprotectant)"란, 동결보호제라고도 하고, 생물세포를 동결상태에서 산채로 보존할 경우, 동해를 경감할 목적으로 매액(媒液)에 첨가시키는 물질을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 동결보존제는 가축의 정자를 동결보존하기 위하여 사용되며, 본 발명에서는 저밀도 지질단백질(LDL)을 사용할 수 있다.The term "cryoprotectant " of the present invention refers to a substance which is also referred to as a cryoprotectant, and which is added to a medium (liquid) for the purpose of alleviating the East Sea when the living cells are stored in a frozen state as alive. For the purpose of the present invention, the cryopreservative is used for cryopreserving livestock sperm, and low density lipoprotein (LDL) may be used in the present invention.
본 발명의 용어 "동결보존용 조성물"이란, 본 발명의 동결보존제로 사용되는 LDL과 항산화제를 포함하는 조성물을 의미한다.The term "composition for cryopreservation " of the present invention means a composition containing LDL and an antioxidant used as the cryopreservation agent of the present invention.
본 발명의 용어 "동결보존액"이란, 본 발명의 동결보존용 조성물과 희석액이 혼합된 액상의 정자 동결보존용 제제를 의미한다. 상기 동결보존액은 본 발명의 동결보존용 조성물에 더하여 희석액을 추가로 포함하여 구성할 수 있다. 상기 희석액은 원 정액의 농도를 저하시켜서, 동결보존시 정자간의 충돌로 인하여 발생할 수도 있는 손상을 방지하기 위하여 사용된다. 상기 희석액은 특별히 이에 제한되지 않으나, 당류, 유기산, 난황, 항생제 등을 포함하는 완충액이 될 수 있는데, 바람직하게는 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 덱스트란 등의 당류; 시트르산, 아세트산, 부티르산, 팔미트산, 옥살산, 타타르산 등의 유기산; 스트렙토마이신, 페니실린, 앰피실린, 카나마이신 등의 항생제; 및 난황을 포함하는 완충액이 될 수 있고, 이들 각성분은 당업자가 필요에 따라 조합하여 사용할 수 있다.
The term "frozen storage liquid " of the present invention means a liquid sperm cryopreservation preparation mixed with a cryopreservation composition of the present invention and a diluent. The cryopreservation liquid may further comprise a diluent in addition to the cryopreservation composition of the present invention. The diluent is used to lower the concentration of the semen and to prevent damage that may occur due to collision between sperm during cryopreservation. The diluent may be a buffer solution including saccharides, organic acids, egg yolk, antibiotics, etc., but is preferably a saccharide such as glucose, fructose, sucrose and dextran; Organic acids such as citric acid, acetic acid, butyric acid, palmitic acid, oxalic acid and tartaric acid; Antibiotics such as streptomycin, penicillin, ampicillin, and kanamycin; And egg yolk, and these components can be used in combination according to need by a person skilled in the art.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 종래의 동결보존제로 사용되어온 글리세롤을 포함하는 동결보존액(대조군)과 본 발명의 LDL과 항산화제를 포함하는 동결보존액(실험군)을 사용하여 제주산 흑우의 정자를 동결보존 및 해동시키고, 상기 해동된 정자의 운동성, 생존율, 정자막 온전성, 첨체막의 변화 및 난자로의 침투능력을 평가하였다. 그 결과, 운동성의 측면에서는 대조군과 실험군에 차이가 없었으나(표 1), 생존율(표 2), 정자막 온전성(표 3), 첨체막의 변화(도 1) 및 난자로의 침투능력(표 4)의 측면에서는 대조군 보다도 실험군이 현저하게 우수함을 확인하였다. 대부분의 비교항목에서 동결보존제로서 LDL을 단독으로 포함하는 것보다는 LDL과 항산화제를 같이 포함하는 경우에 더욱 효과가 우수하였으므로, 항산화제가 LDL의 효과를 배가시키는 것으로 분석되었다.
According to one embodiment of the present invention, a frozen storage solution (control group) containing glycerol, which has been used as a conventional cryopreservation agent, and a frozen storage solution (experimental group) containing LDL and an antioxidant of the present invention, Cryopreservation and thawing, and the motility, survival rate, cytotoxicity of the spermatozoa, changes in the acrosome membrane, and penetration ability into the oocytes were evaluated. As a result, there was no difference between the control group and the experimental group in terms of motility (Table 1), survival rate (Table 2), sperm integrity (Table 3), acrosomal change (Fig. 1) 4), the test group was significantly superior to the control group. Most of the comparison items were more effective when LDL and antioxidant were included together than LDL alone as a cryoprotectant. Therefore, the antioxidant was found to double the effect of LDL.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 (a) 상기 동결보존용 조성물을 포함하는 동결보존액에 정자를 혼합하는 단계; 및 (b) 상기 혼합물을 동결 및 보존하는 단계를 포함하는 동결보존된 정자의 활성을 향상시키는 방법을 제공한다.
According to another aspect of the present invention, there is provided a method for preparing a cryoprotectant, comprising the steps of: (a) mixing a sperm into a cryoprotectant containing the composition for cryopreservation; And (b) freezing and preserving the mixture. The present invention also provides a method for enhancing the activity of a cryopreserved spermatozoon.
이때, 상기 동결보존용 조성물은 LDL 및 항산화제를 포함할 수 있고, 바람직하게는 타우린, 하이포타우린, 트레할로스 등의 항산화제를 단독으로 또는 조합하여 LDL과 함께 포함할 수 있고; 상기 정자의 활성은 특별히 이에 제한되지 않으나, 정자의 운동성, 생존율, 정자막 온전성, 첨체막의 변화, 난자로의 침투능력 등을 단독으로 또는 조합한 특성이 될 수 있으며; 상기 조성물에 포함된 LDL의 함량은 조성물 최종 중량에 대하여 2 내지 10%(w/w)가 될 수 있고; 상기 조성물에 포함된 항산화제의 함량은 5 내지 100mM이 될 수 있다.At this time, the composition for cryopreservation may include LDL and an antioxidant. Preferably, antioxidants such as taurine, hypotaurine and trehalose may be included together with LDL alone or in combination; The activity of the sperm is not particularly limited, but it may be a sperm motility, a survival rate, a sperm morphology, a change of a sperm membrane, an ability to penetrate into an oocyte, or the like; The amount of LDL contained in the composition may be from 2 to 10% (w / w) based on the final weight of the composition; The content of the antioxidant contained in the composition may be 5 to 100 mM.
또한, 상기 동결보존액에 포함되는 동결보존용 조성물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 1 내지 80%(w/w), 보다 바람직하게는 10 내지 50%(w/w), 가장 바람직하게는 30%(w/w)가 될 수 있다.The content of the composition for cryopreservation contained in the above-mentioned frozen storage liquid is not particularly limited, but is preferably 1 to 80% (w / w), more preferably 10 to 50% (w / w) (W / w). ≪ / RTI >
또한, 상기 동결보존액은 본 발명의 동결보존용 조성물에 더하여, 글리세롤, 글루코스, 수크로스, 에틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜, DMSO, 덱스트란, 1,2-프로판디올, 히알루론산 등의 공지된 동결보존제를 단독으로 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수도 있다.The cryopreservation liquid may contain a known cryopreservation agent such as glycerol, glucose, sucrose, ethylene glycol, propylene glycol, DMSO, dextran, 1,2-propanediol, hyaluronic acid, Alone, or a combination thereof.
또한, 상기 동결보존액에 포함되는 정자의 수는 바람직하게는 동결보존액 단위부피(㎖)당 1 X 107 내지 10 X 107개 이고, 보다 바람직하게는 단위부피(㎖)당 3 X 107 내지 7 X 107개 이며, 가장 바람직하게는 단위부피(㎖)당 5 X 107개 이다.The number of spermatozoa included in the above-mentioned frozen storage liquid is preferably 1 × 10 7 to 10 × 10 7 cells per unit volume (㎖) of the frozen storage liquid, more preferably 3 × 10 7 to 10 × 10 7 cells per unit volume (ml) 7
또한, 상기 동결 및 보존은 정자를 동결보존할 수 있는 한 공지된 모든 수단에 의하여 수행될 수 있으나, 바람직하게는 액화질소를 사용하여 -196℃에서 동결 및 보존을 수행할 수 있고, 상기 동결된 정자는 반영구적으로 보존할 수 있다.Also, the freezing and preservation may be carried out by any means known in the art as long as it is capable of cryopreserving the sperm. Preferably, liquefied nitrogen may be used to freeze and store at -196 [deg.] C, Sperm can be preserved semi-permanently.
아울러, 본 발명의 방법은 상기 동결보존된 정자를 융해시키는 단계를 추가로 포함할 수도 있다.In addition, the method of the present invention may further comprise the step of melting said frozen-preserved sperm.
이때, 상기 융해방법은 상기 동결보존된 정자를 정상상태로 회복시킬 수 있다면 특별히 제한되지 않고 사용될 수 있는데, 바람직하게는 동결보존된 정자를 상온에서 일정시간 동안 정치시킴으로써 상기 정자에 포함된 냉매를 휘발시켜 제거하고, 상기 냉매가 제거된 정자를 1 내지 10℃의 물에 2 내지 10분 동안 침지하거나, 30 내지 40℃의 물에 10 내지 30초 동안 침지하거나 또는 60 내지 80℃의 물에 1 내지 5초 동안 침지하여 수행될 수 있으며, 보다 바람직하게는 동결보존된 정자를 상온에서 10 내지 20초 동안 정치시켜서 냉매를 제거하고, 상기 냉매가 제거된 정자를 4℃의 물에 5분 동안 침지하거나, 37℃의 물에 20초 동안 침지하거나, 70℃의 물에 3초 동안 침지하여 수행될 수 있으며, 가장 바람직하게는 동결보존된 정자를 상온에서 20초동안 동안 정치시켜서 냉매를 제거하고, 상기 냉매가 제거된 정자를 37℃의 온수에서 20초 동안 침지함으로써 수행될 수 있다.
In this case, the melting method can be used without any particular limitation as long as the sperm cryopreserved can be restored to a normal state. Preferably, the sperm cryopreserved is allowed to stand at room temperature for a predetermined time to volatilize the refrigerant contained in the sperm. And the sperm from which the refrigerant has been removed is immersed in water at 1 to 10 ° C for 2 to 10 minutes or immersed in water at 30 to 40 ° C for 10 to 30 seconds, More preferably, the frozen sperm is allowed to stand at room temperature for 10 to 20 seconds to remove the refrigerant, and the sperm from which the refrigerant has been removed is immersed in water at 4 DEG C for 5 minutes , Immersing in water at 37 DEG C for 20 seconds, or immersion in water at 70 DEG C for 3 seconds, and most preferably, cryopreserved spermatozoa are incubated at room temperature for 20 seconds Stand may be removed to the refrigerant, and carried out by immersing the said refrigerant is removed from the arbor 37 ℃ hot water for 20 seconds.
본 발명의 정자 동결보존용 조성물을 이용하면, 가축의 정자를 동결 및 융해시킬 경우, 정자의 손상을 최소화 할 수 있으므로, 가축의 품종개량에 널리 활용될 수 있을 것이다.
Use of the composition for cryopreserving spermatozoa of the present invention can minimize damage to spermatozoa when frozen and thawed spermatozoa of the livestock can be widely used for breeding livestock.
도 1은 동결 융해된 정자의 첨체막 변화에 대한 동결보호제의 효과를 나타내는 그래프이다.Fig. 1 is a graph showing the effect of the cryoprotectant on the acrosomal membrane changes of frozen-thawed spermatozoa.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예Example
1: One:
제주흑우Jeju Black Sheep
정액 채취 Semen collection
정액채취에 이용된 흑우는 3세 이상의 수컷 6두를 선발하여 별도 공간에서 자유 급식하여 사육하였으며, 월 4회 정액을 채취하였다. 정액 채취는 인공질 (Model 66000-D, Nasco, FHK, Japan)을 사용하여 채정하였다. 정액 채취를 위하여 암컷을 안전하게 정액 채취실 보정틀에 고정시킨 후, 제주흑우 수컷을 2~3회 암컷의 주위를 맴돌게 하여 흥분을 유도하였다. 승가가 이루어지면 수컷의 penis 를 인공질에 삽입하여 정액을 채취하였다. 인공질의 온도는 38℃를 유지하였으며, 인공질에는 penis의 삽입을 원활하게 하기 위하여 젤을 도포하였다. 인공질 끝 부분에 15㎖ 시험관을 채취 전에 장착하여 사출된 정액을 회수하였다.
Sixteen male males aged 3 years or older were selected for semen collection and were fed free of food in a separate space and sampled four times a month. Sperm sampling was performed using artificial vagina (Model 66000-D, Nasco, FHK, Japan). For the sperm retrieval, the female was fixed to the correction frame of the semen collection room safely, and the excitement was induced by letting Jeju male and female two or three times around the female. When the temperature was reached, the male penis was inserted into the artificial vagina and semen was collected. The temperature of the artificial vagina was maintained at 38 ° C, and the artificial vagina was coated with gel to smoothly insert the penis. A 15 mL test tube was attached to the end of the artificial vagina prior to collection to recover the injected semen.
실시예Example
2: 정액의 처리 및 제조 2: Semen treatment and manufacture
상기 회수된 정액을 동일부피의 희석액(Tris 121.1 mM, Fructose 180.2 mM, Citric acid 294.1 mM, Egg yolk 10%, Streptomycin sulfate 10mg/㎖)과 혼합하고 냉각하는 방식을 2시간 동안 5회 반복수행하여 정자희석액을 수득하였다. 이어, 상기 정자희석액에 동결보호제(4% LDL과, 20mM의 타우린, 하이포타우린 또는 트레할로스를 각각 포함)를 가하고, 2시간 동안 방치한 다음, 상기 희석액을 사용하여 50×106/ml로 정자의 농도를 조절하고, 이를 0.5㎖ straw에 충전 봉합하였다. 충전된 straw는 액체질소 표면 5cm 높이에서 10분간 노출시켜 예비동결을 실시한 후에 액체질소에 침지하여 동결을 완료하였다. 동결된 정액은 LN2 tank에서 보관하고 필요시에는 공기중에서 약 10초간 정치한 다음, 37℃ 온수에 20초간 침지시켜 융해시켰다. 이때, 대조군으로는 동결보호제로서 7%의 글리세롤을 사용한 정자를 사용하였다.
The recovered semen was mixed with the same volume of diluent (121.1 mM Tris, 180.2 mM fructose, 294.1 mM citric acid, 10% egg yolk, 10 mg / ml of streptomycin sulfate) A diluted solution was obtained. Next, the above-sperm diluent freeze protecting agent was added to (4% LDL and, including in 20mM taurine, hypo taurine or trehalose, respectively), left to stand for 2 hours and then, using the dilution of sperm to 50 × 10 6 / ml The concentration was adjusted and this was filled in a 0.5 ml straw. The filled straws were exposed to liquid nitrogen at a height of 5 cm for 10 minutes, preliminarily frozen, and then immersed in liquid nitrogen to complete freezing. The frozen semen was stored in the LN 2 tank, allowed to stand for about 10 seconds in air if necessary, and then immersed in 37 ° C hot water for 20 seconds to melt. At this time, sperm using 7% glycerol as a cryoprotectant was used as a control group.
실시예Example
3: 정자의 운동성 평가 3: Evaluation of motility of sperm
정자의 운동성은 MicroLux 현미경 (X 70, Olympus, Japan)하에서 정자의 활력을 측정하여 평가하였다. 구체적으로, 혈구계산판에 5㎕의 정액을 가하고, 커버글래스로 덮은 후, 100배율에서 정자의 운동성을 평가하였다. 평가기준은, 혈구계산판의 격자 2군데를 반복적으로 관찰하여 거의 모든 정자들이 소용돌이 치며 활발하게 움직이는 것을 90% 이상으로, 생존 정자들을 격자 별로 100개 가량을 관찰하여 활발하게 움직이는 정자들이 80개 이상일 때 80%로, 70개 이상일 때 70%로 판단하고 움직이는 정도가 전진 운동 또는 느리게 전진 운동하는 수준일 때 50%, 느리게 전진운동 하거나 진자 운동 혹은 미동하는 수준일 때 30%로 평가하였다(표 1).
Sperm motility was evaluated by measuring the vitality of the sperm under a MicroLux microscope (X 70, Olympus, Japan). Specifically, 5 μl of semen was added to a blood cell count plate, covered with a cover glass, and then evaluated for motility of the sperm at a magnification of 100 ×. The criterion for evaluation was repeatedly observing two lattice points on a hemocytometer, and it was confirmed that almost all sperm swirl and actively move more than 90%, and live sperm were observed about 100 per lattice, (80%), 70% (70%), 50% when the level of movement was the forward or slow forward movement, 30% when the level was slow or forward ).
LDL+타우린
LDL+하이포타우린
LDL+트레할로스LDL
LDL + taurine
LDL + hypotaurine
LDL + trehalose
70.00±5.00
68.00±5.70
70.00±5.0067.00 ± 5.70
70.00 5.00
68.00 + - 5.70
70.00 5.00
a, b Values with different superscripts within same column are significantly different by ANOVA (p<0.05). a, b Values with different superscripts within same column are significantly different by ANOVA (p <0.05).
Data are presented as mean ± SD.
Data are presented as mean ± SD.
상기 표 1에서 보듯이, 대조군과 실험군의 동결보호제를 처리한 경우에, 동결 융해된 정자의 운동성에서는 유의한 차이가 나타나지 않았다.
As shown in Table 1, there was no significant difference in the motility of the frozen-thawed sperm treated with the cryoprotectant of the control and experimental groups.
실시예Example
4: 정자의 생존율 평가 4: Evaluation of sperm survival rate
정자의 생존율은 Eosin-Y 염색법을 이용하여 평가하였다. 구체적으로, 융해된 정액 0.5㎖와 37℃의 DPBS 1㎖를 혼합하고, 이를 400 Xg에서 3분간 원심분리하여 침전물을 수득함으로써, 동결보호제를 제거하였다. 상기 수득한 침전물에 500㎕의 DPBS를 가하고 현탁시킨 다음, 상기 현탁액 10㎕를 슬라이드 글라스에 가하고, 동량의 Eosin-Y 염색액을 가하여 혼합하였으며, 상기 혼합액의 상부에 커버슬라이드를 덮고, MicroLux 현미경 (X 70, Olympus, Japan)를 이용하여 100배율에서 염색 상태를 관찰하여 2개표본(200개의 정자/1개 표본)에서 붉게 염색된 죽은 정자를 계수하고, 이들의 비율을 측정하는 방식으로 정자의 생존율을 평가하였다(표 2). 이때, 상기 Eosin-Y 염색액은 0.9% NaCl 용액에 0.5% Eosin-Y를 용해하여 제조하였다.
Sperm survival rate was assessed using Eosin-Y staining. Specifically, 0.5 mL of the molten semen and 1 mL of DPBS at 37 DEG C were mixed and centrifuged at 400 Xg for 3 minutes to obtain a precipitate to remove the cryoprotectant. To the obtained precipitate was added 500 μl of DPBS and suspended. 10 μl of the suspension was added to a slide glass, and the same amount of Eosin-Y staining solution was added and mixed. A cover slide was placed on the upper part of the mixed solution, and a MicroLux microscope X 70, Olympus, Japan), and the number of dead sperm stained red in two samples (200 sperm / one sample) was counted by observing the staining state at a magnification of 100, Survival rates were evaluated (Table 2). At this time, the Eosin-Y staining solution was prepared by dissolving 0.5% Eosin-Y in 0.9% NaCl solution.
a, b Values with different superscripts within same column are significantly different by ANOVA (p<0.05). a, b Values with different superscripts within same column are significantly different by ANOVA (p <0.05).
Data are presented as mean ± SD.
Data are presented as mean ± SD.
상기 표 2에서 보듯이, 대조군에 비하여 다양한 동결보호제를 처리한 실험군에서 생존율이 유의하게 증가함을 알 수 있었다.
As shown in Table 2, the survival rate was significantly increased in the experimental group treated with various cryoprotectants compared with the control group.
실시예Example
5: 5:
정자막Closed caption
온전성Fullness
평가 evaluation
정자막 온전성은 Jeyendran 등 (1984)의 방법을 변형하여 저삼투압 용액을 이용한 정자 미부의 팽창형태를 분석(Hypo-Osmetic Swelling Test: HOST)함으로써 평가하였다. 구체적으로, 37℃의 저장액(150mOsm/kg, 0.45% NaCl 용액) 1㎖에 융해된 정액 100㎕를 가하고, 혼합한 다음 37℃에서 5분간 정치시켰으며, 이를 슬라이드 글라스에 도말하였다. 도말한 표본으로부터 각 표본당 200개의 정자 중에서 정자막이 정상상태인 것을 계수하고, 이의 비율을 측정하는 방식으로 정자막 온전성을 평가하였다(표 3).
Positive membrane integrity was assessed by modifying the method of Jeyendran et al. (1984) and analyzing the dilation pattern of the sperm tail using hypotonic solution (Hypo-Osmetic Swelling Test: HOST). Specifically, 100 μl of a semen which had been dissolved in 1 ml of a stock solution (150 mOsm / kg, 0.45% NaCl solution) at 37 ° C was added, mixed and allowed to stand at 37 ° C for 5 minutes, which was then spread on a slide glass. From the smear samples, the spermatic membrane was counted from 200 sperm per specimen in the normal state, and the ratio of the spermatids was measured to evaluate the sanitary membrane integrity (Table 3).
a, b, c Values with different superscripts within same column are significantly different by ANOVA (p<0.05). a, b, c Values with different superscripts within same column are significantly different by ANOVA (p <0.05).
Data are presented as mean ± SD.
Data are presented as mean ± SD.
상기 표 3에서 보듯이, 대조군에 비하여 다양한 동결보호제를 처리한 실험군에서 정자막 온전성이 유의하게 증가함을 알 수 있었다. 특히, LDL과 타우린을 포함하는 동결보호제는 가장 높은 수준의 정자막 온전성을 나타냄을 확인하였다.
As shown in Table 3, it was found that the cytotoxicity was significantly increased in the experimental group treated with various cryoprotectants compared to the control group. In particular, it was confirmed that the cryoprotectant containing LDL and taurine exhibited the highest level of spermatogenicity.
실시예Example
6: 6:
첨체막Acrosome film
변화 양상의 평가 Assessment of Change Patterns
Chlortetracyclin (CTC) 염색법을 사용하여, 정자 첨체막의 변화 양상을 평가하였다. Chlortetracyclin (CTC) staining was used to evaluate changes in the sperm acrosome.
구체적으로, 융해된 정액을 400 Xg에서 2분간 원심분리하여 침전물을 수득하고, 상기 침전물에 500㎕의 CTC 용액(750μM CTC, 130mM NaCl, 5mM cystein in 20mM Tris buffer; pH 7.8)을 가하여 혼합한 다음, 상온 및 암실조건에서 20초 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 10㎕의 12.5% glutaradehyde를 가하여 반응을 종결시키고, 평가기준에 따라 평가하였다. 상기 평가기준은 Fraser (1995)의 분류에 따라, 정자 두부가 전체적으로 형광 발광을 할 경우 수정능이 없는 F pattern으로 평가하고, 적도면 부분에 띠가 형성되어 첨체 아랫부분에서 형광 발광을 할 경우 수정능이 있는 B pattern으로 평가하였으며, 마지막으로 정자 두부가 형광 발광을 하지 않거나, 얼룩덜룩한 발광을 할 경우 첨체반응이 일어난 AR pattern으로 평가하였다(도 1). 도 1은 동결 융해된 정자의 첨체막 변화에 대한 동결보호제의 효과를 나타내는 그래프이다. 도 1에서 보듯이, F pattern의 경우에는 LDL을 단독으로 사용한 경우를 제외하고는 대조군에 비하여 다양한 동결보호제를 처리한 실험군에서 높은 수준을 나타내었고, B pattern의 경우에는 LDL을 단독으로 사용한 경우에 대조군에 비하여 높은 수준을 나타낸 반면 나머지 동결보호제를 처리한 경우에 대조군과 유의한 차이를 나타내지 않았으며, AR pattern의 경우에는 대조군에 비하여 다양한 동결보호제를 처리한 실험군에서 낮은 수준을 나타내었고, 특히 LDL과 타우린을 포함하는 동결보호제는 가장 낮은 수준을 나타냄을 확인하였다.
Specifically, the fused semen was centrifuged at 400 xg for 2 minutes to obtain a precipitate. To the precipitate was added 500 μl of a CTC solution (750 μM CTC, 130 mM NaCl, 5 mM cystein in 20 mM Tris buffer, pH 7.8) , And allowed to react at room temperature and dark room conditions for 20 seconds. After the reaction was completed, 10 [mu] l of 12.5% glutaradehyde was added to terminate the reaction and evaluated according to the evaluation criteria. According to the classification of Fraser (1995), the evaluation criterion was evaluated as F pattern with no correction ability when the sperm head was fluorescently emitted as a whole, and a band was formed on the equatorial portion, B pattern. Finally, when the sperm head did not emit fluorescence or speckled light emission, it was evaluated as an AR pattern in which acrosome reaction occurred (Fig. 1). Fig. 1 is a graph showing the effect of the cryoprotectant on the acrosomal membrane changes of frozen-thawed spermatozoa. As shown in FIG. 1, in the case of the F pattern, the LDL concentration was higher in the experimental group treated with various cryoprotectants than in the control group, except for the case where the LDL alone was used. In contrast, the AR pattern showed lower levels in the experimental group treated with various cryoprotectants than in the control group, and LDL And cryoprotectants containing taurine showed the lowest levels.
실시예Example
7: 난자로의 침투능력 평가 7: Evaluation of infiltration ability into oocytes
10주~ 15주령 자성 햄스터에 30 IU의 PMSG를 복강주사하고, 48시간이 경과된 시점에서 30 IU의 hCG를 복강 주사하여 배란을 유도하였다. hCG 주사시점으로부터 15시간이 경과한 후에, 상기 햄스터로부터 배란된 난자를 수득하였다. 수득한 난자에 0.1% hyaluronidase를 처리하여 난구세포를 제거하고, 0.1% trypsin을 처리하여 투명대를 제거하였다. 30 IU of PMSG was intraperitoneally injected into the
융해된 정액을 400 Xg에서 2분간 원심분리하여 침전물을 수득하고, 수득한 침전물을 PBS에 현탁시킨 후, 다시 원심분리하여 침전물을 수득하여 동결보존액을 제거하고, 상기 침전물을 10㎍/㎖의 헤파린이 포함된 TALP 배양액에 현탁시킨 후, 39℃ 및 5% CO2 배양기에서 10분간 반응시켜 수정능이 회복된 정자를 수득하였다. 상기 정자를 2×10^5 live sperm/㎖의 농도로 조절하고, 상기 투명대가 제거된 햄스터 난자에 가한 후, 3.5시간 동안 공배양하였다. 배양이 종료된 후, 난자를 세척하고 슬라이드 글라스위에 놓은 다음, methanol : acetic acid (3:1, v/v) 용액을 가하고 24시간 동안 고정시켰다. 상기 고정된 난자에 1% lacmoid를 가하여 염색하고, 위상차 현미경(X 400)을 이용하여 난자로의 정자의 침투여부를 확인하였다(표 4). 이때, 정자의 침투능력은 Oh 등의 방법 (2010a)을 이용하여 평가하였다.
The frozen semen was centrifuged at 400 xg for 2 minutes to obtain a precipitate. The obtained precipitate was suspended in PBS and then centrifuged again to obtain a precipitate to remove the frozen stock solution. The precipitate was suspended in 10 μg / ml of heparin , And then reacted for 10 minutes at 39 ° C. and 5% CO 2 incubator to obtain a fertilized sperm. The spermatozoa were adjusted to a concentration of 2x10 < -5 > live sperm / ml, added to the hamster oocytes from which the zona pellucida was removed, and co-cultured for 3.5 hours. After the incubation, the oocytes were washed and placed on a slide glass, followed by a solution of methanol: acetic acid (3: 1, v / v) and fixed for 24 hours. The fixed oocytes were stained with 1% lacmoid, and the sperm was infiltrated into the oocyte using a phase contrast microscope (X400) (Table 4). At this time, sperm penetration ability was evaluated using Oh et al. (2010a).
PN: Pronucleus, PN: Pronucleus,
DC: Decondenced sperm, DC: Decondenced sperm,
EN: Enlarged sperm EN: Enlarged sperm
SFI: Sperm fertility index. SFI: Sperm fertility index.
SFI= (PN × 2 + DC + EN)/No. of oocytes. SFI = (PN x 2 + DC + EN) / No. of oocytes.
SFI was calculated by method of Oh et al., (2010a).SFI was calculated by the method of Oh et al., (2010a).
a, b, c Values with different superscripts within same column are significantly different by ANOVA (p<0.05). a, b, c Values with different superscripts within same column are significantly different by ANOVA (p <0.05).
Data are presented as mean ± SD.
Data are presented as mean ± SD.
상기 표 4에서 보듯이, LDL과 타우린을 포함하는 동결보호제를 처리한 실험군이 대조군에 대하여 유의적으로 높은 웅성전핵 형성율(PN)과 SFI를 나타냈을 뿐만 아니라, LDL의 단독 처리에 비하여도 유의적으로 높은 수준의 PN과 SFI를 나타냄을 확인하였다. 그러나, LDL과 하이포타우린을 포함하는 동결보호제를 처리한 실험군 및 LDL과 트레할로스를 포함하는 동결보호제를 처리한 실험군과 비교한 경우에는, LDL과 타우린을 포함하는 동결보호제를 처리한 실험군이 다소 높은 PN과 SFI를 나타내었다. 또한, decondenced sperm 비율(DC)에서는 대조군에 비하여 다양한 동결보호제를 처리한 실험군에서 유의하게 증가함을 확인하였다.
As shown in Table 4, not only the experimental group treated with the cryoprotectant containing LDL and taurine exhibited significantly higher male pronuclear formation rate (PN) and SFI than the control group, but also the LDL-treated group It is confirmed that PN and SFI are high. However, when compared with the experimental group treated with the cryoprotectant containing LDL and hypotaurine and the experimental group treated with the cryoprotectant containing LDL and trehalose, the experimental group treated with the cryoprotectant containing LDL and taurine showed a somewhat higher PN And SFI. In addition, the decondensed sperm ratio (DC) was significantly increased in the experimental group treated with various cryoprotectants compared with the control group.
상기 실시예 3 내지 7의 결과를 종합하면, 동결 융해된 정자에 LDL을 처리하면, 정자의 생존율이 증가하고, 정자막의 온전성을 높은 수준으로 유지시킬 수 있으며, AR pattern의 비율을 감소시키고, 난자에 대한 침투능력을 향상시키는 효과를 나타냄을 확인하였고, 타우린, 하이포타우린, 트레할로스 등의 항산화제는 상술한 LDL의 효과를 배가시킴을 확인하였다. 아울러, 상술한 항산화제의 효과는 동결 및 융해시에 발생되는 ROS로부터 정자를 보호함에 의하여 나타나는 것으로 분석되었다.
The results of Examples 3 to 7 suggest that treatment of LDL with frozen-thawed sperm increases the survival rate of the sperm, maintains the integrity of the sperm membrane at a high level, reduces the proportion of the AR pattern , And oocyte penetration ability, and the antioxidants such as taurine, hypotaurine and trehalose were found to double the effect of LDL. In addition, the effect of the above-described antioxidants was analyzed as a result of protecting sperm from ROS generated during freezing and thawing.
Claims (16)
A composition for cryopreserving sperm containing low density lipoprotein (LDL) and an antioxidant.
상기 LDL의 함량은 조성물 최종중량에 대하여 2 내지 10%(w/w)인 것인 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the content of LDL is 2 to 10% (w / w) based on the final weight of the composition.
상기 항산화제는 베타-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol, β-ME), 글루타치온(Glutathione, GSH), 아스코르브산(ascorbic acid), 비타민 E, 베타카로틴, 타우린(taurine), 하이포타우린(hypotaurine), 트레할로스(trehalose), 라이코펜, 코엔자임 Q-10(coenzyme Q-10), 셀레늄, 크롬, 마그네슘 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
The method according to claim 1,
The antioxidant may be selected from the group consisting of beta-mercaptoethanol, beta-ME, glutathione, GSH, ascorbic acid, vitamin E, beta carotene, taurine, hypotaurine, Wherein the composition is selected from the group consisting of trehalose, lycopene, coenzyme Q-10, selenium, chromium, magnesium, and combinations thereof.
상기 항산화제는 타우린, 하이포타우린, 트레할로스 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the antioxidant is selected from the group consisting of taurine, hypotaurine, trehalose, and combinations thereof.
상기 항산화제의 함량은 5 내지 100mM인 것인 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the content of said antioxidant is from 5 to 100 mM.
상기 정자는 가축의 정자인 것인 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the sperm is the sperm of a livestock.
상기 가축은 제주산 흑우인 것인 조성물.
The method according to claim 6,
Wherein the livestock is from Jeju.
글리세롤, 글루코스, 수크로스, 에틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜, DMSO, 덱스트란, 1,2-프로판디올, 히알루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 동결보존제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the composition further comprises a cryopreservative selected from the group consisting of glycerol, glucose, sucrose, ethylene glycol, propylene glycol, DMSO, dextran, 1,2-propanediol, hyaluronic acid, and combinations thereof.
(b) 상기 혼합물을 동결 및 보존하는 단계를 포함하는 동결보존된 정자의 활성을 향상시키는 방법.
(a) mixing a sperm into a frozen storage solution containing the composition for cryopreservation according to any one of claims 1 to 8; And
(b) freezing and preserving the mixture.
상기 동결보존용 조성물의 함량은 1 내지 80%(w/w)인 것인 방법.
10. The method of claim 9,
Wherein the content of the composition for cryopreservation is 1 to 80% (w / w).
상기 정자의 수는 동결보존액 단위부피(㎖)당 1 X 107 내지 10 X 107개인 것인 방법.
10. The method of claim 9,
Wherein the number of sperm is 1 X 10 7 to 10 X 10 7 per unit volume (ml) of cryopreservation solution.
상기 동결 및 보존은 액화질소를 사용하여 -196℃에서 수행되는 것인 방법.
10. The method of claim 9,
RTI ID = 0.0 > -196 C < / RTI > using liquefied nitrogen.
상기 동결보존기간은 반영구적인 것인 방법.
10. The method of claim 9,
Wherein the cryopreservation period is semi-permanent.
상기 정자의 활성은 정자의 운동성, 생존율, 정자막 온전성, 첨체막의 변화, 난자로의 침투능력 및 이들의 조합으로 구성된 군으로 선택되는 특징인 것인 방법.
10. The method of claim 9,
Wherein the activity of the sperm is selected from the group consisting of sperm motility, survival rate, cytotoxicity, acrosomal alteration, penetration into the oocyte, and combinations thereof.
상기 동결보존된 정자를 융해시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
10. The method of claim 9,
Lt; RTI ID = 0.0 > cryopreserved < / RTI > sperm.
상기 동결보존된 정자의 융해는 (a) 동결보존된 정자를 상온에서 정치시킴으로써 상기 정자에 포함된 냉매를 휘발시켜 제거하는 단계; 및, (b) 상기 냉매가 제거된 정자를 1 내지 10℃의 물에 2 내지 10분 동안 침지하거나, 30 내지 40℃의 물에 10 내지 30초 동안 침지하거나 또는 60 내지 80℃의 물에 1 내지 5초 동안 침지하는 단계에 의하여 수행되는 것인 방법.
16. The method of claim 15,
The thawing of the sperm cryopreserved comprises: (a) volatilizing and removing the refrigerant contained in the sperm by keeping the sperm cryopreserved at room temperature; And (b) immersing the sperm from which the refrigerant has been removed in water at 1 to 10 占 폚 for 2 to 10 minutes, immersing in water at 30 to 40 占 폚 for 10 to 30 seconds, ≪ / RTI > for 5 seconds.
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- 2013-06-28 KR KR1020130076066A patent/KR101546487B1/en active IP Right Grant
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