KR20150000246A - Method for Detecting Nucleic Acids and Biomolecules by Using Cerium Oxide Nanoparticles Having Oxidase Activity - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 산화효소 (oxidase) 활성을 가지는 산화세륨 나노입자에 의한 발색반응 현상을 이용하여 핵산을 검출하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 핵산 증폭산물이 존재하는 경우, 핵산 분자가 산화세륨 나노입자에 흡착하고 발색반응 기질과 상호작용함으로써 산화세륨 나노입자의 촉매작용을 저해하게 된다. 이는 발색반응의 감소로 이어지며, 이 현상을 이용하여 표적 핵산을 간편하게 검출하는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for detecting a nucleic acid using a chromogenic reaction phenomenon caused by cerium oxide nanoparticles having an oxidase activity. More particularly, the present invention relates to a method for detecting nucleic acid, Adsorbed on the nanoparticles and interacting with the chromogenic reaction substrate, thereby inhibiting the catalytic action of the cerium oxide nanoparticles. This leads to a reduction in color reaction, and a method for easily detecting a target nucleic acid using this phenomenon.
현재 대부분의 유전자 진단은, 표적 유전자를 중합연쇄반응(PCR; polymerase chain reaction) 기법으로 증폭한 후 전기영동(electrophoresis)을 통하여 젤 밴드의 유무를 확인함으로써 수행되고 있다. 이러한 기존의 전기영동을 기반으로 하는 진단 방법은 진단 시간이 길고 숙련된 기술을 요구하기 때문에 일반 병원이나 진단이 필요한 현장에서 직접 수행하기 어려운 문제점이 있었다. Currently, most of the genetic diagnoses are performed by amplifying the target gene by polymerase chain reaction (PCR) and then confirming the presence or absence of the gel band by electrophoresis. Such diagnostic methods based on conventional electrophoresis have a problem in that it is difficult to directly perform in a general hospital or a field requiring diagnosis because of a long diagnostic time and skilled skill.
이러한 문제점을 해결하기 위하여 현장에서 신속, 간편하게 육안으로 핵산을 진단할 수 있는 발색 진단 기술이 제안되어 왔으며, 이를 위하여 공액고분자 (Jung et al . Adv . Funct . Mater ., 18;701-708, 2008) 혹은 금속 나노입자 등이 이용되어 오고 있다. 그 중에서도 금 나노입자 콜로이드 용액을 이용하여 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 서열과 PCR 증폭 산물을 포함한 핵산을 색 전이 방법으로 탐지하는 기술이 주목받고 있다. 이를 위해 프로브(probe) 올리고뉴클레오타이드로 기능화된 금 나노 입자가 이용되며, 표적핵산 (target DNA) 존재 시, 프로브 올리고뉴클레오타이드와의 혼성화(hybridization)에 의해 교차결합(cross-linking)을 형성하게 되고, 이를 통해 콜로이드 용액이 색 전이를 보이게 된다 (Elghanian et al., Science, 277(5329): 1078-1081, 1997). 그 외에도 단일가닥 DNA와 이중가닥 DNA 의 금 나노입자에 대한 서로 다른 정전기적 성질을 이용하여 증폭된 핵산을 색 전이로 탐지하는 방법들이 보고되고 있다 (Li, H. X. et al ., J. Am . Chem . Soc . 126:10958-10961, 2004). 하지만, 금 나노 입자의 색 전이를 이용한 표적 핵산 진단 방법은 여러 문제점을 가지고 있다. 첫 번째로 표적 핵산의 진단 전에 금 나노입자 표면에 프로브 DNA 를 붙이는 과정이 필요하며, 이 과정은 시간이 오래 걸리고 숙련된 기술을 요구한다. 두 번째로 표적 핵산과 금 나노 입자의 반응 뒤에 색 전이를 유발하기 위해 용액 속에 염을 첨가해야 한다. 하지만, 이 과정에서 색 전이 현상이 염 농도에 매우 민감하기 때문에 잘못된 진단 결과를 유도할 수 있으며, 이를 방지하기 위해서는 오랜 시간의 최적화 과정이 필요하다.In order to solve these problems, a color development diagnostic technology capable of quickly and easily diagnosing nucleic acid in the visual field has been proposed. For this purpose, a conjugated polymer (Jung et al . Adv . Funct . Mater . , 18; 701-708, 2008) or metal nanoparticles have been used. Among them, a technology for detecting a nucleic acid including an oligonucleotide sequence and a PCR amplification product using a gold nanoparticle colloid solution by a color transfer method is attracting attention. For this purpose, gold nanoparticles functionalized with a probe oligonucleotide are used. When the target nucleic acid is present, cross-linking is caused by hybridization with the probe oligonucleotide, This leads to a colloidal solution showing color transfer (Elghanian et al ., Science , 277 (5329): 1078-1081, 1997). In addition, methods of detecting the amplified nucleic acid as a chromosome by using different electrostatic properties of single-stranded DNA and double-stranded DNA gold nanoparticles have been reported (Li, HX et al ., J. Am . Chem . Soc . 126: 10958-10961, 2004). However, the method of detecting target nucleic acid using color transfer of gold nanoparticles has various problems. First, the process of attaching probe DNA to the surface of gold nanoparticles is required before the diagnosis of the target nucleic acid, and this process is time consuming and requires skilled techniques. Second, the salt must be added to the solution to cause color transfer after the reaction of the target nucleic acid and the gold nanoparticles. However, since the color transition phenomenon is very sensitive to the salt concentration in this process, it may lead to a false diagnosis result, and a long time optimization process is required to prevent this.
또한 본 발명자는 한국공개특허 제10-2012-0038657호에서 과산화효소 활성을 가지는 자성 나노입자 기반의 발색반응 현상을 이용한 핵산 및 생체물질 검출방법을 출원 한 바 있다. 상기 특허의 기술은 종래 기술에 비하여 핵산의 검출이 용이하다는 장점이 있으나, 자성 나노입자의 과산화효소로서의 활성이 상대적으로 낮기 때문에, 발색 신호를 얻기 위해서는 incubation이 필수적으로 필요하며, 고농도의 과산화수소(H2O2)의 추가가 반드시 필요하다는 단점이 있었다. The present inventors have also filed a Korean Patent Application No. 10-2012-0038657 for a method of detecting nucleic acids and biomaterials using a phenomenon of color development reaction based on magnetic nanoparticles having peroxidase activity. However, since the activity of magnetic nanoparticles as a peroxidase is relatively low, incubation is essential to obtain a chromogenic signal, and a high concentration of hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) is necessarily required.
최근, 산화세륨 나노입자가 산화효소 활성을 가진다는 사실이 알려졌다 (Asati et al ., Angew . Chem. Int . Ed . 48:2308-2312, 2009). 이러한 사실을 기반으로, 증폭된 핵산산물이 산화세륨 나노입자의 산화효소 활성을 저해시키는 원리를 규명하고 이를 이용한 핵산 검출방법을 제공하고자 한다. Recently, it has been known that cerium oxide nanoparticles have oxidase activity (Asati et al ., Angew . Chem. Int . Ed . 48: 2308-2312, 2009). Based on these facts, the present inventors have elucidated the principle that the amplified nucleic acid products inhibit the oxidase activity of the cerium oxide nanoparticles and provide a nucleic acid detection method using the same.
이에, 본 발명자들은 전술한 종래 기술들의 문제점을 해결하며 육안으로 쉽고 간편하게 표적 물질의 유무를 감지할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 기질 혼합 용액 내의 표적 DNA로부터 증폭된 핵산이 존재하는 경우에는 핵산이 산화세륨 나노입자의 산화효소 활성을 저해하여 증폭된 핵산이 존재하지 않을 때와 비교할 때, 발색 반응의 결과가 큰 차이를 나타내는 것을 확인함과 아울러, 이 방법은 산화세륨 나노입자에 DNA를 표지하는 과정이나 추가적인 염의 첨가 과정이 필요 없이 빠르고 간단하게 핵산을 진단할 수 있다는 것을 확임함으로써, 핵산의 유무를 범용적 및 정략적으로 진단할 수 있는 본 발명을 완성하였다.
Accordingly, the present inventors have made intensive efforts to develop a method for detecting the presence or absence of a target substance easily and visually by solving the problems of the conventional techniques described above. As a result, when the amplified nucleic acid is present from the target DNA in the substrate mixture solution The present inventors confirmed that the result of the coloring reaction shows a large difference when the nucleic acid inhibits the oxidase activity of the cerium oxide nanoparticles and the nucleic acid is not present in the amplified nucleic acid, And that the nucleic acid can be diagnosed quickly and simply without the need of additional labeling step or additional salt addition step, thereby completing the present invention capable of diagnosing the presence or absence of nucleic acid in a universal and quantitative manner.
본 발명의 목적은, 산화세륨 나노입자 용액에 음전하의 핵산분자가 존재하면 이온결합에 의해 산화세륨 나노입자에 흡착하여 산화세륨 나노입자를 응집시키고, 발색반응 기질용액을 첨가할 경우에 핵산이 양전하를 띄는 발색반응 기질과 정전기적으로 상호작용함으로써 산화세륨 나노입자와 발색반응 기질의 접촉이 제한되어 산화세륨 나노입자의 산화효소 활성이 저해되므로, 핵산분자와 산화 세륨 나노입자 용액의 혼합물에 기질을 첨가하여 발색반응을 유도하고 색 변화를 측정함으로써, 핵산을 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.
An object of the present invention is to provide a cerium oxide nanoparticle adsorbing cerium oxide nanoparticles by adsorption to cerium oxide nanoparticles by ionic bonding in the presence of a negatively charged nucleic acid molecule in a cerium oxide nanoparticle solution, , The contact between the cerium oxide nanoparticles and the chromogenic reaction substrate is restricted and the oxidative enzyme activity of the cerium oxide nanoparticles is inhibited. Therefore, the substrate is mixed with the mixture of the nucleic acid molecule and the cerium oxide nanoparticle solution To thereby induce a color reaction and measure a change in color, thereby providing a method for detecting nucleic acid.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, According to an aspect of the present invention,
(a) 표적핵산 함유 시료에서 표적핵산을 증폭시키는 단계; (a) amplifying the target nucleic acid in a sample containing the target nucleic acid;
(b) 산화세륨 나노입자와 발색반응 기질을 첨가하여 발색반응을 유도하는 단계; 및(b) adding a cerium oxide nanoparticle and a coloring reaction substrate to induce a color reaction; And
(c) 상기 유도된 발색반응의 색 변화를 이용하여 시료 내 표적핵산을 검출하는 단계를 포함하는 산화세륨 나노입자의 발색반응을 이용한 시료 내 표적핵산을 검출하는 방법을 제공한다. (c) detecting the target nucleic acid in the sample using the color change of the induced coloring reaction. The present invention also provides a method for detecting a target nucleic acid in a sample using the color reaction of cerium oxide nanoparticles.
본 발명은 또한, The present invention also relates to
(a) 표적핵산 함유 시료에서 표적핸산을 증폭시킨 다음, 산화세륨 나노입자와 발색반응 기질을 첨가하여 발색반응을 유도하는 단계; 및 (a) amplifying a target H-acid in a target nucleic acid-containing sample, adding a cerium oxide nanoparticle and a chromogenic substrate to induce a color reaction; And
(b) 상기 유도된 발색반응에 따른 색 변화를 이용하여 시료 내 표적핵산을 정량하는 단계를 포함하는 산화세륨 나노입자의 발색반응을 이용한 시료 내 표적핵산의 정량방법을 제공한다. and (b) quantifying the target nucleic acid in the sample using the color change resulting from the color development reaction. The present invention also provides a method for quantifying a target nucleic acid in a sample using the color development reaction of cerium oxide nanoparticles.
본 발명은 또한, 산화세륨 나노입자 용액 및 발색반응 기질을 함유하는 산화세륨 나노입자의 발색반응을 이용한 시료 내 표적핵산 검출 또는 정량용 조성물을 제공한다.
The present invention also provides a composition for detecting or quantifying a target nucleic acid in a sample by using a color development reaction of a cerium oxide nanoparticle containing a cerium oxide nanoparticle solution and a chromogenic reaction substrate.
본 발명에 따른 산화세륨 나노입자를 이용한 핵산을 검출하는 방법은 표적핵산을 1~2분 내에 육안으로 간단하게 확인할 수 있고, 본 핵산 검출방법을 이용한 산화세륨 나노입자 기반 발색 센서를 제공함으로써 현장진단 관련 장치 및 시스템을 개발할 수 있으며, 다양한 원인균 감염 진단, 유전자 재조합 생물체 (GMO; genetically modified organisms) 검사, 법의학 수사 등에 보편적으로 활용될 수 있어 유용하다. 또한, 본 발명에 따른 산화세륨 나노입자를 이용한 검출방법은 핵산의 검출 뿐 아니라 다른 생체 물질 및 화학 물질의 검출에도 적용될 수 있다.
The method for detecting nucleic acid using cerium oxide nanoparticles according to the present invention can detect the target nucleic acid easily within 1 to 2 minutes and provide a cerium oxide nanoparticle-based color sensor using the nucleic acid detection method, Related apparatuses and systems, and is useful because it can be widely used for diagnosis of various causative microbial infections, genetically modified organisms (GMO) tests, forensic investigation, and the like. In addition, the detection method using the cerium oxide nanoparticles according to the present invention can be applied not only to detection of nucleic acid but also to detection of other biomaterials and chemicals.
도 1은 산화효소 활성을 가지는 산화세륨 나노입자에 의한 발색반응 현상을 이용한 표적핵산을 검출하는 원리를 나타낸 개략도이다.
도 2는 산화세륨 나노입자에 서로 다른 농도의 표적 핵산을 첨가하였을 때 산화세륨 나노입자의 산화효소 활성이 저해되어 결과적으로 감소된 발색반응 현상을 나타낸 사진과 자외선 및 가시광선 분광분석법으로 스캔한 결과 그래프이다. 삽도는 산화세륨 나노입자 센서를 이용해서 감지 가능한 핵산 농도를 확인하기 위한 calibration 곡선이다.
도 3은 표적핵산의 증폭산물의 길이가 각각 200bp, 600bp 및 900 bp 일 때, 산화세륨 나노입자의 산화효소 활성이 저해되어 결과적으로 감소된 발색반응 현상을 자외선 및 가시광선 분광분석법으로 스캔한 결과 그래프이다. 삽도는 발색기질 3,3',5,5'-tetramethyl benzidine (TMB)의 흡수파장 (652 nm) 에서 감소된 흡광도의 비교 그래프이다.
도 4는 이중가닥 DNA와 결합해 형광을 발생하는 Eva-green dye를 이용해 표적 핵산 물질이 산화세륨 나노입자에 흡착함을 보이는 공초점 현미경 (confocal microscope) 사진이다 (도 4a: 표적 핵산이 첨가된 산화세륨 나노입자, 도 4b: 산화세륨 나노입자; (1) 광학이미지 (2) 형광이미지 (3) 병합 이미지, 스케일 바: 20 m).
도 5는 표적 핵산에 의한 산화세륨 나노입자의 산화효소 활성 저해 원리 이해를 위해, 표적 핵산의 증폭산물이 첨가된 산화세륨 나노입자가 응집되는 현상을 관찰한 전자투과현미경 (TEM) 사진 (도 5(a)), 표적 핵산의 증폭산물이 존재하지 않는 대조군 TEM 사진 (도 5(b)) 이며, 도 5의 (c)는 표적 핵산의 증폭산물이 존재하지 않는 대조군 샘플 (도 5(c) (1)), 표적 핵산의 증폭 산물을 가한 샘플 (도 5(c) (3)) 및 표적 핵산의 증폭 산물을 가한 후 산화세륨 나노입자를 분리하여 상층액을 제거한 샘플 (도 5(c) (2))에 발색기질 TMB를 첨가하여 발색 반응시킨 후 나타난 색 차이를 자외선 및 가시광선 분광분석법으로 스캔한 결과 그래프이며 삽도는 발색기질 TMB의 흡수파장 (652 nm) 에서 감소된 흡광도의 비교 그래프이다. 도 5의 (d)는 표적 핵산의 증폭산물이 존재하지 않는 대조군 샘플 (도 5(d) (1)), 표적 핵산의 증폭 산물을 가한 샘플 (도 5(d) (3)) 및 표적 핵산의 증폭 산물을 가한 후 산화세륨 나노입자를 분리하여 상층액을 제거한 샘플 (도 5(d) (2))에 발색기질 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS)를 첨가하여 발색 반응시킨 후 나타난 색 차이를 자외선 및 가시광선 분광분석법으로 스캔한 결과 그래프이며 삽도는 발색기질 ABTS의 흡수파장 (420 nm) 에서 감소된 흡광도의 비교 그래프이다.
도 6은 정제 과정을 거치지 않은 PCR 증폭산물 (50 nM, 100 nM)을 첨가하였을 때 산화세륨 나노입자의 산화효소 활성이 저해되어 나타나는 발색반응 감소 현상을 자외선 및 가시광선 분광분석법으로 스캔한 결과 그래프이다 (도 6(a)). 정제 과정을 거친 PCR 증폭산물과 거치지 않은 PCR 증폭산물을 산화세륨 나노입자에 첨가하였을 때 발색기질 TMB의 흡수파장 (652 nm)에서 나타나는 감소된 흡광도의 비교 그래프이다 (도 6(b)). BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a schematic view showing a principle of detecting a target nucleic acid using a color development reaction phenomenon by cerium oxide nanoparticles having oxidase activity. FIG.
FIG. 2 is a photograph showing a state in which oxidative enzyme activity of cerium oxide nanoparticles is inhibited when a target nucleic acid having a different concentration is added to cerium oxide nanoparticles, resulting in a phenomenon of reduced color development reaction, and a result of scanning with ultraviolet and visible light spectroscopy Graph. The drawing is a calibration curve to identify the detectable nucleic acid concentration using a cerium oxide nanoparticle sensor.
FIG. 3 shows the results of scanning the ultraviolet and visible light spectroscopic analysis of the resultant reduced color reaction by inhibiting the oxidase activity of the cerium oxide nanoparticles when the amplification products of the target nucleic acid were 200 bp, 600 bp, and 900 bp, respectively Graph. The plot is a comparative graph of reduced absorbance at the absorption wavelength (652 nm) of the
FIG. 4 is a confocal microscope photograph showing that a target nucleic acid material is adsorbed to cerium oxide nanoparticles by using Eva-green dye which generates fluorescence by binding with double-stranded DNA (FIG. 4A: Cerium oxide nanoparticles, Fig. 4b: cerium oxide nanoparticles, (1) optical image (2) fluorescence image (3) merged image, scale bar: 20 m).
FIG. 5 is an electron transmission microscope (TEM) photograph (FIG. 5 (a)) showing the coagulation of cerium oxide nanoparticles to which an amplification product of a target nucleic acid is added for the purpose of understanding the principle of inhibiting the oxidase activity of the cerium oxide nanoparticles by the target nucleic acid (Fig. 5 (b)). Fig. 5 (c) shows a control sample without the amplification product of the target nucleic acid (Fig. 5 (Fig. 5 (c) (3)) obtained by adding the amplified product of the target nucleic acid and the amplified product of the target nucleic acid, and then removing the supernatant from the cerium oxide nanoparticles (2)), and the color difference was measured by ultraviolet and visible spectroscopy. The results are shown in the graph of the absorbance of the coloring substrate TMB (652 nm) to be. 5 (d) shows a control sample (FIG. 5 (d) (1)) in which no amplification product of the target nucleic acid is present, a sample to which the amplification product of the target nucleic acid is added (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (FIG. 5 (d) (2)) was prepared by dissolving the cerium oxide nanoparticles after removing the supernatant ABTS) was added and color difference was observed by ultraviolet and visible spectroscopy. The graph is a comparative graph of absorbance decreased at absorption wavelength (420 nm) of the chromogenic substrate ABTS.
FIG. 6 is a graph showing the results of scanning with ultraviolet and visible light spectroscopy for the reduction of the coloring reaction caused by the inhibition of the oxidase activity of the cerium oxide nanoparticles when a PCR amplification product (50 nM, 100 nM) (Fig. 6 (a)). (FIG. 6 (b)). FIG. 6 (b) is a graph showing the reduced absorbance at the absorption wavelength (652 nm) of the chromogenic substrate TMB when the purified and untreated PCR amplification products were added to the cerium oxide nanoparticles.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다. Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In general, the nomenclature used herein is well known and commonly used in the art.
본 발명에서는 산화세륨 나노입자가 산화효소 활성을 가진다는 공지의 사실 (Asati et al., Angew. Chem. Int. Ed. 48:2308-2312, 2009)을 토대로, PCR을 통해 증폭된 핵산산물이 산화세륨 나노입자의 산화효소 활성을 저해시킨다는 원리를 규명하였으며, 이를 이용하여 표적 핵산을 정량적으로 분석할 수 있음을 확인하였다. In the present invention, based on the known fact that cerium oxide nanoparticles have oxidase activity (Asati et al., Angew. Chem. Int. Ed. 48: 2308-2312, 2009) The principle of inhibiting the oxidase activity of cerium oxide nanoparticles was identified, and it was confirmed that the target nucleic acid can be quantitatively analyzed using this.
본 발명은 일 관점에서, (a) 표적핵산 함유 시료에서 표적핵산을 증폭시키는 단계; (b) 산화세륨 나노입자와 발색반응 기질을 첨가하여 발색반응을 유도하는 단계; 및 (c) 상기 유도된 발색반응의 색 변화를 이용하여 시료 내 표적핵산을 검출하는 단계를 포함하는 산화세륨 나노입자의 발색반응을 이용한 시료 내 표적핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다. In one aspect, the present invention provides a method of amplifying a target nucleic acid comprising: (a) amplifying a target nucleic acid in a target nucleic acid-containing sample; (b) adding a cerium oxide nanoparticle and a coloring reaction substrate to induce a color reaction; And (c) detecting the target nucleic acid in the sample using the color change of the induced color reaction. The present invention also relates to a method for detecting a target nucleic acid in a sample using the color reaction of cerium oxide nanoparticles.
본 발명에 있어서, 상기 산화세륨 나노입자의 발색반응 기질은 어느 것이나 쓸 수 있고, TMB(3,3',5,5'-tetramethyl benzidine), ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 및 OPD(o-phenylenediamine)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는 음전하를 띄는 표적 핵산과의 전기적 결합을 통해서 산화세륨 나노입자로의 접근을 최대한 저해할 수 있는 양전하를 띄는 TMB(3,3',5,5'-tetramethyl benzidine)인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, any of the color reaction substrates of the cerium oxide nanoparticles may be used, and TMB (3,3 ', 5,5'-tetramethyl benzidine), ABTS (2,2'-azino-bis ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) and OPD (o-phenylenediamine). (3,3 ', 5,5'-tetramethyl benzidine) capable of maximally inhibiting access to cerium oxide nanoparticles through electrical coupling with a target nucleic acid having a negative charge, .
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계에서 상기 유전자 증폭산물과 10 wt% 의 산화세륨 나노입자 용액을 8-11:1 의 부피비로 혼합하는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, in the step (b), the gene amplification product and the 10 wt% cerium oxide nanoparticle solution may be mixed in a volume ratio of 8: 11: 1.
본 발명에 있어서, 상기 산화세륨 나노입자의 크기는 25nm인 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the size of the cerium oxide nanoparticles may be 25 nm.
본 발명에 있어서, 상기 산화세륨 나노입자 용액의 용매는 2.5 % 아세트산 용액을 사용하는 것이 바람직하다.In the present invention, the solvent of the cerium oxide nanoparticle solution is preferably a 2.5% acetic acid solution.
본 발명에 있어서, 상기 산화세륨 나노입자 용액의 농도는 10 wt% 인 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the concentration of the cerium oxide nanoparticle solution may be 10 wt%.
본 발명에 있어서, 색 변화는 표적핵산의 증폭산물과 산화세륨 나노입자 혼합용액에 기질을 첨가한 경우에, 산화세륨 나노입자의 발색반응으로 옅은 파란색으로 변화되는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the color change can be characterized in that when the amplification product of the target nucleic acid and the substrate are added to the mixed solution of the cerium oxide nanoparticles, the color change to light blue by the color reaction of the cerium oxide nanoparticles.
본 발명은 다른 관점에서, (a) 표적핵산 함유 시료에서 표적핸산을 증폭시킨 다음, 산화세륨 나노입자와 발색반응 기질을 첨가하여 발색반응을 유도하는 단계; 및 (b) 상기 유도된 발색반응에 따른 색 변화를 이용하여 시료 내 표적핵산을 정량하는 단계를 포함하는 산화세륨 나노입자의 발색반응을 이용한 시료 내 표적핵산 정량방법에 관한 것이다. In another aspect, the present invention provides a method of amplifying a target nucleic acid comprising the steps of: (a) amplifying a target H-acid in a sample containing a target nucleic acid, and then adding a cerium oxide nanoparticle and a chromogenic substrate to induce a chromogenic reaction; And (b) quantifying the target nucleic acid in the sample using the color change resulting from the coloring reaction. The present invention also relates to a method for quantifying a target nucleic acid in a sample using the color reaction of cerium oxide nanoparticles.
본 발명은 또 다른 관점에서, 표적핵산의 증폭산물, 산화세륨 나노입자 및 발색반응 기질을 함유하는 산화세륨 나노입자의 발색반응을 이용한 시료 내 표적핵산 검출 또는 정량용 조성물에 관한 것이다. In another aspect, the present invention relates to a composition for detecting or quantifying a target nucleic acid in a sample by using a chromogenic reaction of cerium oxide nanoparticles containing an amplification product of a target nucleic acid, cerium oxide nanoparticles and a chromogenic reaction substrate.
본 발명에 따른 핵산 검출방법은 데옥시리보오스-포스페이트 (deoxyribose-phosphate) 기본 골격구조로 인해 음전하를 띄는 표적핵산의 특성을 이용한다. 구체적으로는, 검사용액 내에 음전하를 띄는 표적 핵산이 양전하를 띄는 발색반응 기질과 정전기적으로 상호작용함으로써 발색반응 기질이 산화세륨 나노입자로 접근하는 것을 방해하고, 산화세륨 나노입자끼리의 응집을 유도하여 촉매 작용에 사용되는 표면적을 줄임으로써 산화 효소로서의 활성을 줄이게 된다. 또 다른 한편으로는 표적 핵산이 정전기적 상호작용에 의해 산화세륨 나노입자에 흡착함으로써 발색 기질이 산화세륨 나노입자와 직접적으로 접촉하는 것을 저해하게 된다. 이는 결과적으로 효소-기질 복합체 형성을 제한하게 되며, 이로 인하여 산화세륨 나노 입자는 감소된 산화효소 활성을 가지게 되고, 감소된 발색반응 기질의 산화로 인하여, 발색반응 기질의 흡수파장에서 줄어든 흡광도를 나타내게 된다. 이렇게 발생하는 색 차이를 이용하여 표적 핵산의 존재 유무를 진단할 수 있다.The nucleic acid detection method according to the present invention utilizes the property of a target nucleic acid that is negatively charged due to the deoxyribose-phosphate basic skeleton structure. Specifically, a target nucleic acid having a negative charge in the test solution electrostatically interacts with a positively-charged chromogenic substrate, thereby preventing the chromogenic substrate from approaching the cerium oxide nanoparticles, inducing agglomeration of the cerium oxide nanoparticles Thereby reducing the activity as an oxidizing enzyme by reducing the surface area used for catalysis. On the other hand, the target nucleic acid adsorbs to the cerium oxide nanoparticles due to the electrostatic interaction, which hinders direct contact of the chromogenic substrate with the cerium oxide nanoparticles. This results in the restriction of enzyme-substrate complex formation, which results in reduced cerium oxide nanoparticles having reduced oxidase activity and reduced absorbance at the absorption wavelength of the chromogenic substrate due to reduced oxidation of the chromogenic substrate do. Using this color difference, the presence or absence of the target nucleic acid can be diagnosed.
본 발명의 일 실시예에서는, 음전하를 띄는 표적 핵산과의 전기적 결합을 통해서 산화세륨 나노입자로의 접근이 최대한 저해될 수 있는 양전하를 띄는 TMB(3,3',5,5'-tetramethyl benzidine)를 발색반응 기질로써 사용하였다. 음전하를 띄는 표적 핵산이 양전하를 띄는 발색반응 기질 TMB와 정전기적으로 상호작용 함으로써, 발색반응 기질 TMB와 산화세륨 나노입자와의 효소-기질 복합체의 형성을 저해하고, 결국 TMB의 산화 발색반응을 감소시키게 된다. 따라서 TMB의 산화반응 산물로부터 발생하는 652 nm에서의 흡광도가 감소하게 되며, 이러한 광학적인 차이를 통하여 표적 핵산의 존재 유무를 진단할 수 있다는 것을 규명하였다. In one embodiment of the present invention, positively charged TMB (3,3 ', 5,5'-tetramethyl benzidine), which can be maximally inhibited from access to cerium oxide nanoparticles through electrical coupling with a negatively charged target nucleic acid, Was used as a color reaction substrate. The negatively charged target nucleic acid electrostatically interacts with the positively charged chromogenic substrate TMB, thereby inhibiting the formation of the enzyme-substrate complex between the chromogenic substrate TMB and the cerium oxide nanoparticle, thereby reducing the oxidative color reaction of the TMB . Therefore, the absorbance at 652 nm generated from the oxidation reaction product of TMB is decreased, and it is confirmed that the existence of the target nucleic acid can be diagnosed through the optical difference.
본 발명에서는 (a) 단계의 표적 핵산으로 임상적으로 유용한 비뇨생식기 감염균 중의 하나인 Chlamydia trachomatis 을 선택하고, 실제 임상 샘플을 이용하여 Chlamydia trachomatis 의 독성 단백질을 발현하는 유전자부분을 증폭하였다. Primer 3 (http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi) 프로그램을 사용하여 디자인된 프라이머를 이용하여 PCR 증폭이 수행되며 표적 핵산의 증폭 산물을 수득할 수 있고, 수득된 증폭산물은 DNA 정제 키트 (QIAGEN) 를 이용하여 프라이머, buffer의 염 및 dNTPs를 제거함으로 순수하게 정제된 증폭 핵산 산물을 얻을 수 있었다. 또한, (b)단계에서는 표적핵산 증폭산물과 산화세륨 나노입자의 혼합용액 43 를 106 0.2 M sodium acetate buffer (pH 4.0)에 첨가한 후, 1.5 500 mM TMB 를 마지막으로 첨가한 후에, 상온에서 1분간 반응시키고 10,000 G에서 30 초간 원심분리하여 산화세륨 나노입자를 분리한 후 상등액에서의 발색 반응을 관찰하였다. In the present invention, Chlamydia trachomatis ( Chlamydia trachomatis) , one of the genitourinary infectious microorganisms clinically useful as a target nucleic acid of step (a) , And using actual clinical samples, Chlamydia The gene fragment expressing the toxic protein of trachomatis was amplified. PCR amplification is carried out using primers designed using Primer 3 ( http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi ) program and an amplification product of the target nucleic acid can be obtained, The DNA purification kit (QIAGEN) was used to remove the primers, buffer salts and dNTPs to obtain purified purified nucleic acid products. In step (b), a mixed solution 43 of the target nucleic acid amplification product and the cerium oxide nanoparticles 43 was added to 106 0.2 M sodium acetate buffer (pH 4.0), 1.5 500 mM TMB was added lastly, After the reaction, the cerium oxide nanoparticles were separated by centrifugation at 10,000 G for 30 seconds, and the color reaction was observed in the supernatant.
본 발명에 따르면, 표적 핵산이 존재하는 샘플은 검사용액 내에 음전하를 띄는 표적 핵산이 양전하를 띄는 발색반응 기질 TMB와 정전기적으로 상호작용함으로써 발색반응 기질이 산화세륨 나노입자로 접근하는 것을 방해하고, 산화세륨 나노입자끼리의 응집을 유도함으로써 촉매 작용에 사용되는 표면적을 줄임으로써 산화 효소로서의 활성을 줄이게 된다. 또 다른 한편으로는, 표적 핵산이 정전기적 상호작용을 통해 산화세륨 나노입자에 흡착함으로써 발색반응 기질 TMB가 산화세륨 나노입자와 직접적으로 접촉하는 것을 제한하게 되며, 결과적으로 효소-기질 복합체 형성을 저해하게 된다. 이로 인하여 산화세륨 나노입자는 감소된 산화효소 활성을 가지게 되고, 감소된 발색반응 기질의 산화로 인하여, 기질 TMB의 산화 반응 생성물이 보이는 652 nm에서의 흡광도가 감소하여 옅은 파란색을 나타낸다. 반면, 표적 핵산이 존재하지 않는 대조군 샘플은 산화세륨 나노입자의 산화효소 활성을 저해하는 요소가 없으므로, 발색반응 기질 TMB가 충분히 산화되어, TMB의 산화 반응 생성물로 인해 652 nm에서 높은 흡광도를 나타내고 진한 파란색을 나타내게 된다. 이러한 색 차이를 이용하여 표적 핵산을 손쉽게 검출할 수 있다(도 1). According to the present invention, in the sample in which the target nucleic acid is present, the target nucleic acid having a negative charge in the test solution electrostatically interacts with the positively charged chromogenic substrate TMB, thereby preventing the chromogenic substrate from approaching the cerium oxide nanoparticle, By inducing aggregation of the cerium oxide nanoparticles, the activity as an oxidizing enzyme is reduced by reducing the surface area used for the catalysis. On the other hand, adsorption of the target nucleic acid to cerium oxide nanoparticles through electrostatic interactions limits direct contact of the chromogenic reaction substrate TMB with the cerium oxide nanoparticles, resulting in inhibition of enzyme-substrate complex formation . Due to this, the cerium oxide nanoparticles have reduced oxidase activity and the light absorbance at 652 nm, which is the oxidation reaction product of the substrate TMB, is reduced due to the oxidation of the reduced chromogenic substrate, resulting in a light blue color. On the other hand, in the control sample in which the target nucleic acid is not present, the coloring reaction substrate TMB is sufficiently oxidized because there is no element that inhibits the oxidase activity of the cerium oxide nanoparticles, and the absorbance of the TMB oxidation product is high at 652 nm, Blue. Using this color difference, the target nucleic acid can be easily detected (Fig. 1).
본 발명에 따른, 산화세륨 나노입자의 발색반응 현상을 이용한 핵산 검출방법은 PCR 등의 증폭과정을 통해 수득한 표적핵산을 산화세륨 나노입자 용액과 혼합한 후, 발색반응 기질 용액의 첨가를 통해 이루어지며, 표적핵산의 산화효소 활성 저해를 통해 결과적으로 감소된 발색반응 현상을 나타내게 되고, 이러한 색 차이를 이용하여 표적핵산을 손쉽게 검출하는 것에 그 특징이 있다. 결국, 표적핵산이 존재할 경우, 특정 유전자의 프라이머가 PCR 증폭을 일으켜 표적핵산의 증폭산물이 생성되게 되고, 증폭된 표적 핵산은 용액 내의 발색 기질과 정전기적으로 상호작용함으로써 발색 기질이 산화세륨 나노입자로 접근하는 것을 방해하고, 산화세륨 나노입자끼리의 응집을 유도하여 촉매 작용에 사용되는 표면적을 줄임으로써 산화 효소로서의 활성을 줄이게 된다. 또 다른 한편으로는, 표적 핵산이 정전기적 상호작용을 통해 산화세륨 나노입자에 흡착함으로써 발색반응 기질이 산화세륨 나노입자와 직접적으로 접촉하는 것을 제한하게 되며, 결과적으로 효소-기질 복합체 형성을 저해하게 된다. 이로 인해 산화세륨 나노 입자는 감소된 산화효소 활성을 가지게 되고, 산화 생성물의 흡수파장에서 줄어든 흡광도를 나타내며 색 변화를 나타내게 된다. 반면, 표적핵산이 존재하지 않을 경우, PCR 증폭이 일어나지 않게 되어, 산화세륨 나노입자의 산화효소 활성을 저해시킬 인자가 존재하지 않게 되므로 발색반응 기질의 흡수파장에서 높은 흡광도를 나타낸다.The nucleic acid detection method using the color development reaction phenomenon of the cerium oxide nanoparticles according to the present invention can be performed by mixing the target nucleic acid obtained through the amplification process such as PCR with the cerium oxide nanoparticle solution and then adding the chromogenic reaction substrate solution The result is a phenomenon of reduced color reaction through the inhibition of the oxidase activity of the target nucleic acid, and the target nucleic acid can be easily detected using the color difference. As a result, when a target nucleic acid is present, a primer of a specific gene causes PCR amplification to generate an amplification product of the target nucleic acid, and the amplified target nucleic acid electrostatically interacts with the chromogenic substrate in the solution, And reduces the surface area used for the catalytic action by inducing aggregation of the cerium oxide nanoparticles, thereby reducing the activity as an oxidizing enzyme. On the other hand, adsorption of the target nucleic acid to cerium oxide nanoparticles through electrostatic interactions limits direct contact of the chromogenic substrate with the cerium oxide nanoparticles, resulting in inhibition of enzyme-substrate complex formation do. As a result, the cerium oxide nanoparticles have reduced oxidase activity, exhibit decreased absorbance at the absorption wavelength of the oxidation product, and exhibit a color change. On the other hand, when the target nucleic acid is not present, the PCR amplification does not occur, and there is no factor that inhibits the oxidase activity of the cerium oxide nanoparticles, so that it exhibits a high absorbance at the absorption wavelength of the chromogenic substrate.
본 발명의 다른 실시예에서는, 산화세륨 나노입자에 서로 다른 농도의 표적 핵산을 첨가하였을 때 발색반응의 차이를 확인하기 위하여, 증폭 산물을 정제하여 각각 다른 농도에서 산화세륨 나노입자와 각각 반응시킨 후, 발색반응 용액을 첨가해 주고 상온에서 1분간 반응시킴으로써 일어난 발색 반응을 자외선 및 가시선 분광분석법을 이용하여 흡광도를 측정하였다. 증폭된 핵산 존재 시 산화세륨 나노 입자의 산화효소 활성을 저해하여 TMB의 산화 생성물로 인한 흡수파장 652 nm에서의 흡광도가 감소되었으며, 증폭 핵산의 농도가 증가함에 따라 선형적으로 흡광도가 감소하는 것을 관찰할 수 있었다(도 2). In another embodiment of the present invention, in order to confirm a difference in chromogenic reaction when different concentrations of target nucleic acids are added to cerium oxide nanoparticles, the amplification products are purified and reacted with cerium oxide nanoparticles at different concentrations, respectively , Color reaction solution was added and reacted at room temperature for 1 minute. The absorbance was measured by ultraviolet and visible spectroscopy. In the presence of the amplified nucleic acid, the activity of the oxidase of the cerium oxide nanoparticles was inhibited. As a result, the absorbance at 652 nm was decreased due to oxidation products of TMB, and the absorbance decreased linearly with increasing concentration of amplified nucleic acid (Fig. 2).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 표적핵산의 증폭산물의 길이에 따라 발색반응의 차이가 나타나는지를 확인하기 위하여 표적 핵산을 각각 200bp, 600bp 및 900bp 길이로 달리하여 산화세륨 나노입자와 각각 반응시킨 후, 발색 반응 용액을 첨가해 주고 상온에서 1분간 반응시킴으로써 일어난 발색 반응을 자외선 및 가시광선 분광분석법을 이용하여 흡광도를 측정한 결과, 200 bp 핵산이 산화세륨 나노입자의 산화효소 활성을 저해하는 정도가 600 bp 핵산에 비해서 대략 절반 정도인 것으로 확인되었다. 이는, 보다 긴 증폭산물이 산화세륨 나노입자의 산화효소로서의 활성을 보다 효과적으로 저해한다는 것을 말해 준다. 그러나 600 bp 와 900 bp 는 발색반응의 저해 정도에 큰 차이가 없었다. 이는, 대상 증폭산물의 길이가 600 bp 이상일 경우에는 활성 저해의 정도에 큰 차이가 없이 보편적으로 산화세륨 나노입자 기반 센서를 적용할 수 있음을 말해 주며 다양한 길이의 증폭산물에 대해 적용될 수 있음을 보인다(도 3). In another embodiment of the present invention, in order to confirm whether a difference in color development reaction occurs depending on the length of the amplification product of the target nucleic acid, target nucleic acids are respectively reacted with cerium oxide nanoparticles differing in lengths of 200 bp, 600 bp and 900 bp , Color reaction solution was added and the reaction was allowed to proceed for 1 minute at room temperature. The color development reaction was measured by ultraviolet and visible light spectroscopy. As a result, the degree of inhibition of the oxidase activity of the 200 bp nucleic acid by the cyanide oxide nanoparticles Which is about half that of the 600 bp nucleic acid. This suggests that a longer amplification product more effectively inhibits the activity of the cerium oxide nanoparticle as an oxidase. However, 600 bp and 900 bp showed no significant difference in inhibition of color reaction. This suggests that a cerium oxide nanoparticle-based sensor can be universally applied without any significant difference in the extent of activity inhibition when the length of the amplification product is greater than 600 bp and can be applied to amplification products of various lengths (Fig. 3).
또한, 핵산 증폭 산물이 산화세륨 나노입자에 흡착되는지를 확인하기 위하여, 핵산 물질과 산화세륨 나노입자를 혼합한 후, 이중가닥 DNA에 특징적으로 결합하여 형광을 발생하는 Eva-green fluorescence dye를 첨가하여 나노입자에 붙은 핵산을 관찰하였다. 그 결과, 공초점 현미경 (confocal microscope) 사진을 통하여 핵산 물질이 산화세륨 나노입자에 흡착하는 것을 확인하였다(도 4a). 반면, 핵산 물질이 첨가되지 않은 대조군에서는 형광을 관찰할 수 없었다(도 4b). In order to confirm that the nucleic acid amplification product is adsorbed on the cerium oxide nanoparticles, the nucleic acid material and the cerium oxide nanoparticles were mixed, and an Eva-green fluorescence dye, which specifically binds to the double-stranded DNA and generates fluorescence, was added Nucleic acid attached to the nanoparticles was observed. As a result, a confocal microscope photograph confirmed that the nucleic acid material adsorbed on the cerium oxide nanoparticles (FIG. 4A). On the other hand, fluorescence could not be observed in the control group to which no nucleic acid material was added (Fig. 4B).
도 5는 표적 핵산에 의한 산화세륨 나노입자의 산화효소 활성 저해 원리 이해를 위해 표적 핵산의 증폭산물이 첨가된 산화세륨 나노입자가 응집되는 현상을 관찰한 전자투과현미경 (TEM)사진(도 5a)과 표적 핵산의 증폭산물이 존재하지 않는 대조군 TEM 사진(도 5b)이며, 사진에 나타나 있듯이, 표적 핵산이 산화세륨 나노입자의 응집을 유도함을 확인할 수 있었다. 그리고, 자외선 및 가시광선 분광분석법을 통하여, 표적핵산의 증폭산물이 존재하지 않는 대조군 샘플은 산화세륨 나노 입자에 의한 발색 반응을 통해서 기질 TMB의 산화반응 생성물에 의한 652 nm에서의 높은 흡광도를 확인할 수 있었다(도 5c의 (1)). 반면, 표적 핵산의 증폭 산물을 가한 샘플은 표적 핵산의 산화효소 활성 저해를 통해 감소된 흡광도를 나타내었다(도 5c의 (3)). 그러나 표적 핵산의 증폭 산물을 가한 후 산화세륨 나노입자를 분리하여 상층액을 제거한 뒤 다시 사용한 샘플은 상기 표적 핵산의 증폭산물을 가한 샘플(도 5c의 (3))의 감소된 흡광도에 비해 70 % 만이 감소됨을 확인할 수 있었다 (도 5c의 (2)). 이 결과는, 표적 핵산이 산화세륨 나노입자와 직접적으로 흡착하는 방식 말고도 용액상에서도 나노입자의 산화효소 활성을 제한한다는 것을 나타낸다. 상기 효과가 용액 내의 표적 핵산이 발색 기질과 정전기적으로 상호작용함으로써 발색 기질이 산화세륨 나노입자로 접근하는 것을 방해하기 때문임을 증명하기 위해, 음전하를 띄고 있는 핵산과 정전기적으로 상호작용하지 않는 음전하를 띄고 있는 ABTS를 발색기질로 사용하여 도 5c 와 같은 실험을 진행하였다. 그 결과, 표적 핵산의 증폭 산물을 가한 후 산화세륨 나노입자를 분리하여 상층액을 제거한 뒤 다시 사용한 샘플(도 5d의 (2))과 상기 표적 핵산의 증폭산물을 가한 샘플(도 5d의 (3))이 비슷한 흡광도 감소를 보이는 것을 확인함으로써, 표적 핵산과 발색 기질과의 정전기적인 상호 작용이 산화세륨 나노입자의 산화효소 활성을 저해하는 원인 중 하나임을 확인할 수 있었다.FIG. 5 shows an electron transmission microscope (TEM) photograph (FIG. 5A) of observing the coagulation of cerium oxide nanoparticles to which an amplification product of a target nucleic acid is added in order to understand the principle of inhibiting oxidase activity of cerium oxide nanoparticles by a target nucleic acid. (FIG. 5b) in which there is no amplification product of the target nucleic acid. As shown in the photograph, it was confirmed that the target nucleic acid induces aggregation of the cerium oxide nanoparticles. Also, through UV and visible spectrophotometry, the control samples without the amplification product of the target nucleic acid were found to have high absorbance at 652 nm due to oxidation reaction products of the substrate TMB through the color reaction with cerium oxide nanoparticles ((1) of Fig. 5C). On the other hand, the sample to which the amplification product of the target nucleic acid was added exhibited decreased absorbance through inhibition of the oxidase activity of the target nucleic acid ((3) of FIG. 5C). However, after the amplification product of the target nucleic acid was added and the cerium oxide nanoparticles were separated and the supernatant was removed, the reused sample was subjected to a 70% reduction in the absorbance of the amplified product of the target nucleic acid ((3) (Fig. 5C (2)). This result indicates that the target nucleic acid is limited not only in the manner in which the target nucleic acid directly adsorbs the cerium oxide nanoparticles but also in the solution state, as well as the oxidase activity of the nanoparticles. To prove that this effect is due to the electrostatic interaction of the target nucleic acid in the solution with the chromogenic substrate, it prevents the approach of the chromogenic substrate to the cerium oxide nanoparticles. In order to prove that the negative charge does not interact electrostatically with the negatively charged nucleic acid 5C was used as a chromogenic substrate. As a result, after the amplification product of the target nucleic acid was added, the cerium oxide nanoparticles were separated and the supernatant was removed, and a sample ((2) of FIG. 5D) )) Showed similar decrease in absorbance, it was confirmed that the electrostatic interaction between the target nucleic acid and the chromogenic substrate is one of the causes of inhibiting the oxidase activity of the cerium oxide nanoparticles.
도 6a 는 DNA 정제키트에 의한 정제 과정 없이 PCR 증폭 산물을 바로 산화세륨 나노입자에 첨가하여 산화효소 저해에 따른 발색반응의 결과를 자외선 및 가시광선 분광분석법으로 스캔한 그래프이다. 상기 그래프에 나타나 있듯이, 정제 과정을 거치지 않은 표적핵산의 증폭산물(50 nM, 100 nM)도 산화세륨 나노입자의 산화효소 활성저해를 통해 감소된 흡광도를 나타냄을 확인할 수 있었다. 하지만, 정제를 하지 않은 경우에는 정제를 할 경우에 비해서 산화반응 생성물에 의한 흡광도의 감소가 70% 정도였다. 이 결과는, 프라이머, buffer 의 염 및 dNTPs 등이 제거되는 경우 더욱 민감하게 표적핵산을 분석할 수 있다는 것을 말해 준다. 하지만 정제되지 않은 경우도 표적핵산 증폭산물의 유무를 육안으로 관찰하기에 충분하였다(도 6b). FIG. 6A is a graph showing the result of colorimetric reaction by the addition of PCR amplification product to cerium oxide nanoparticles immediately without purification by a DNA purification kit and by oxidation inhibition, by ultraviolet and visible light spectroscopy. FIG. As shown in the graph, it was confirmed that the amplification product (50 nM, 100 nM) of the target nucleic acid not subjected to the purification process showed a reduced absorbance by inhibiting the oxidase activity of the cerium oxide nanoparticles. However, when the tablets were not purified, the reduction of the absorbance by the oxidation reaction product was about 70% as compared with the case of the purification. This result indicates that target nucleic acids can be analyzed more sensitively when primers, buffer salts and dNTPs are removed. However, in the case of not purified, the presence of the target nucleic acid amplification product was sufficient to be visually observed (Fig. 6B).
본 발명에서, 표적핵산은 질병과 관련된 유전자, 감염 (세균성, 바이러스성 등)과 관련된 유전자, 유전자 재조합 생물체 (GMO; genetically modified organisms)에 관련된 유전자, 법의학 수사를 위한 유전자 또는 이들의 하나 이상의 혼합물을 포함한다. 따라서, 본 발명은 신속하고 간편하게 보편적으로 핵산을 감지할 수 있는 진단 방법을 제공할 뿐만 아니라 현장진단을 위한 바이오센서로 이용될 수 있는 가능성을 제공한다. 또한, 위 현상을 이용하여 핵산의 검출뿐 아니라, 생체물질 및 화학물질의 검출에도 적용될 수 있다.
In the present invention, the target nucleic acid may be a gene related to a disease, a gene related to an infection (bacterial, viral, etc.), a gene related to genetically modified organisms (GMO), a gene for forensic investigation, . Therefore, the present invention not only provides a diagnostic method capable of rapidly and easily detecting nucleic acids universally, but also provides a possibility to be used as a biosensor for on-site diagnosis. Further, the present invention can be applied not only to the detection of nucleic acid but also to the detection of biomaterials and chemicals using the above phenomenon.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples. It will be apparent to those skilled in the art that these embodiments are merely illustrative of the present invention and that the scope of the present invention is not limited to these embodiments.
특히 하기 실시예에서는 핵산의 검출만을 확인하였으나, 표적 물질에 의한 산화세륨 나노입자의 산화효소 활성 저해에 따른 색 변화를 관찰하는 본 발명을 이용하여 핵산 이외에 생체물질 또는 화학물질을 검출할 수 있음은 당업자에게 자명한 사항이라고 할 것이다.
In the following examples, only the detection of nucleic acid was confirmed. However, it is possible to detect a biomaterial or a chemical substance in addition to the nucleic acid using the present invention for observing the color change due to the inhibition of the oxidase activity of the cerium oxide nanoparticles by the target substance It will be obvious to those skilled in the art.
실시예Example
실시예Example 1: 표적핵산의 1: of the target nucleic acid 증폭산물Amplification product 제조 Produce
비뇨생식기 감염균인 Chlamydia trachomatis 유전자의 증폭은 PCR 방법을 사용하여 수행되었다. 선정된 프라이머를 이용하여 600 bp의 최종 증폭 산물을 얻었다. 실제 환자의 샘플에서 추출한 C. trachomatis 유전자, 0.4 M의 프라이머쌍 (서열번호 1 및 서열번호 2), 1X PCR reaction buffer (30 mM Tris-HCl, 30 mM KCl, 30 mM (NH4)2SO4 , 2 mM MgCl2), 0.2 mM dNTPs 및 4 U i-starMAXTM II DNA polymerase (Intronbio, Korea) 로 이루어진 반응 혼합물을 Perkin-Elmer 9200 thermo-cycler (Perkin-Elmer, Norwalk, CT)를 사용하여 증폭시켰다. 94에서 5분간 heating 하여 이중가닥 DNA를 denaturation 시킨 뒤, 94에서 50초, 57C에서 45초, 72에서 50초간의 사이클을 35번 반복한 뒤, 72에서 10분간의 마지막 extension 과정을 거쳐 핵산 증폭 과정을 마쳤다. PCR 산물은 아가로오스 전기영동 (agarose gel electrophoresis)을 이용하여 PCR 여부와 사이즈를 확인하였다. 수득된 증폭산물은 DNA 정제 키트(QIAGEN)를 이용하여 프라이머, buffer의 염 및 dNTPs등을 제거함으로 순수하게 정제된 증폭 핵산 산물을 얻을 수 있었고, 정제 전의 증폭 핵산 산물을 얻기 위해서는 DNA 정제 과정을 사용하지 않았다.
Chlamydia , a genitourinary infection Amplification of the trachomatis gene was performed using the PCR method. A final amplification product of 600 bp was obtained using the selected primers. Extracted from a sample of the actual patient C. trachomatis primer pairs of the gene, 0.4 M (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2), 1X PCR reaction buffer ( 30 mM Tris-HCl, 30 mM KCl, 30 mM (NH 4) 2 SO 4 , 2 mM MgCl 2), amplified using 0.2 mM dNTPs and 4 U i-starMAX TM II DNA polymerase (Intronbio, Korea) and the reaction mixture Perkin-Elmer 9200 thermo-cycler ( Perkin-Elmer, Norwalk, CT made of a) . The DNA was heated at 94 for 5 min to denature the double stranded DNA. After repeating the cycle of 94 to 50 sec, 57C to 45 sec and 72 to 50 sec for 35 cycles, the DNA was subjected to final extension at 72 for 10 min. . PCR products were confirmed by PCR using agarose gel electrophoresis. The purified amplified nucleic acid product was obtained by removing the primer, buffer salt and dNTPs using a DNA purification kit (QIAGEN). To obtain the amplified nucleic acid product before purification, a DNA purification process was used Did not do it.
서열번호 1 : 5'-CCATCTTCTTTGAAGCGTTGT-3' (Forward primer)SEQ ID NO: 1: 5'-CCATCTTCTTTGAAGCGTTGT-3 '(Forward primer)
서열번호 2 : 5'-ACAGGATGACTCAAGGAATAG-3' (Reverse primer)
SEQ ID NO: 2: 5'-ACAGGATGACTCAAGGAATAG-3 '(Reverse primer)
실시예Example 2: 증폭된 표적핵산과 산화세륨 나노입자 용액의 혼합용액 제조 2: Preparation of mixed solution of amplified target nucleic acid and cerium oxide nanoparticle solution
실시예 1에서 제조된, Chlamydia trachomatis 유전자 증폭산물 40 (100-600 nM) 과 산화세륨 나노입자 용액 3 (10 wt%) 을 혼합하여 혼합용액을 제조하였다. 또한, 산화세륨 나노입자 (25 nm) 는 Sigma/Aldrich에서 구입하여 사용하였으며, 10 wt% 의 농도로 2.5 % acetic acid 에 분산시켜 보관되었다.
Chlamydia prepared in Example 1 trachomatis Gene amplification product 40 (100-600 nM) and cerium oxide nanoparticle solution 3 (10 wt%) were mixed to prepare a mixed solution. In addition, cerium oxide nanoparticles (25 nm) were purchased from Sigma / Aldrich and dispersed in 2.5% acetic acid at a concentration of 10 wt%.
실시예Example 3: 혼합용액에 발색반응 용액을 첨가하여 산화세륨 나노입자의 발색반응 유도 3: The color reaction solution was added to the mixed solution to induce the color reaction of the cerium oxide nanoparticles
실시예 2에서 제조된 혼합용액 43 에 106 0.2 M sodium acetate buffer (pH 4.0), 1.5 500 mM TMB 를 차례로 넣어 준 뒤, 상온에서 1분 반응시킨 후 30 초간 10,000 G에서 원심분리를 통해 산화세륨 나노입자를 분리시킨 후 상등액에서의 발색반응을 관찰하였다. The mixed solution 43 prepared in Example 2 was mixed with 106 0.2 M sodium acetate buffer (pH 4.0) and 1.5 500 mM TMB. The mixture was reacted at room temperature for 1 minute and centrifuged at 10,000 G for 30 seconds to obtain cerium oxide nanoparticles After separating the particles, the color reaction was observed in the supernatant.
실시예4Example 4 : 산화세륨 나노입자의 발색반응에 의한 색 차이 관찰: Observation of color difference by color reaction of cerium oxide nanoparticles
실시예 3에서의 산화세륨 나노입자와 발색반응 용액을 이용한 산화반응을 통해 발생된 색의 차이를 관찰한 결과, PCR 증폭 산물이 존재하지 않을 경우에는 발색 기질 TMB의 산화 생성물에 해당하는 흡수파장 652 nm에서의 흡광도가 매우 높았으며, 진한 파란색을 나타내었다. 반면, 표적 핵산의 존재에 의해 PCR 이 일어난 경우에는 표적핵산의 산화세륨 나노입자의 산화효소 활성 저해를 통해서 발색기질 TMB의 산화 생성물에 의한 652 nm에서의 흡광도가 감소하였으며, 옅은 파란색을 나타내는 것을 확인하였다.
As a result of observing the color difference caused by the oxidation reaction using the cerium oxide nanoparticles and the color reaction solution in Example 3, when the PCR amplification product was not present, the
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to specific embodiments thereof, those skilled in the art will readily appreciate that many modifications are possible in the exemplary embodiments without materially departing from the novel teachings and advantages of this invention. something to do. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Method for Detecting Nucleic Acids and Biomolecules by Using Cerium Oxide Nanoparticles Having Oxidase Activity <130> P13-B148 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 1 ccatcttctt tgaagcgttg t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 2 acaggatgac tcaaggaata g 21 <110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Method for Detecting Nucleic Acids and Biomolecules by Using Cerium Oxide Nanoparticles Having Oxidase Activity <130> P13-B148 <160> 2 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 1 ccatcttctt tgaagcgttg t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 2 acaggatgac tcaaggaata g 21
Claims (12)
(a) 표적핵산 함유 시료에서 표적핵산을 증폭시키는 단계;
(b) 산화세륨 나노입자와 발색반응 기질을 첨가하여 발색반응을 유도하는 단계; 및
(c) 상기 유도된 발색반응의 색 변화를 이용하여 시료 내 표적핵산을 검출하는 단계.
A method for detecting a target nucleic acid using a color reaction of cerium oxide nanoparticles comprising the steps of:
(a) amplifying the target nucleic acid in a sample containing the target nucleic acid;
(b) adding a cerium oxide nanoparticle and a coloring reaction substrate to induce a color reaction; And
(c) detecting the target nucleic acid in the sample using the color change of the induced coloring reaction.
The method of claim 1, wherein the color reaction substrate is selected from the group consisting of TMB (3,3 ', 5,5'-tetramethyl benzidine), ABTS [2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline- (o-phenylenediamine). The method of detecting a target nucleic acid using the color reaction of cerium oxide nanoparticles.
The method according to claim 1, wherein the cerium oxide nanoparticles have a size of 10-50 nm.
The method of detecting a target nucleic acid according to claim 1, wherein the solvent of the cerium oxide nanoparticle solution is an organic solvent.
The method according to claim 1, wherein the color change is a detection method of a target nucleic acid using a chromogenic reaction of cerium oxide nanoparticles, characterized in that the amplification product of the target nucleic acid and the mixed solution of cerium oxide nanoparticles are represented by light blue by the addition of a substrate .
(a) 표적핵산 함유 시료에서 표적핸산을 증폭시킨 다음, 산화세륨 나노입자와 발색반응 기질을 첨가하여 발색반응을 유도하는 단계; 및
(b) 상기 유도된 발색반응에 따른 색 변화를 이용하여 시료 내 표적핵산을 정량하는 단계.
A method for quantifying a target nucleic acid in a sample using a color development reaction of cerium oxide nanoparticles comprising the steps of:
(a) amplifying a target H-acid in a target nucleic acid-containing sample, and then adding a cerium oxide nanoparticle and a chromogenic substrate to induce a color reaction; And
(b) quantifying the target nucleic acid in the sample using the color change according to the induced coloring reaction.
7. The method of claim 6, wherein the color reaction substrate is selected from the group consisting of TMB (3,3 ', 5,5'-tetramethyl benzidine), ABTS [2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline- (o-phenylenediamine). 2. A method for quantifying a target nucleic acid using a chromogenic reaction of cerium oxide nanoparticles.
7. The method of claim 6, wherein the cerium oxide nanoparticles have a size of 10-50 nm.
The method for quantitatively determining a target nucleic acid according to claim 6, wherein the solvent of the cerium oxide nanoparticle solution is an organic solvent.
8. The method according to claim 6, wherein the color change is a method for quantitatively determining a target nucleic acid using a chromogenic reaction of cerium oxide nanoparticles, characterized in that the amplification product of the target nucleic acid and the cerium oxide nanoparticle mixed solution are represented by light blue .
A composition for detecting or quantifying a target nucleic acid in a sample by using a color reaction of cerium oxide nanoparticles containing a cerium oxide nanoparticle solution and a chromogenic reaction substrate.
12. The method of claim 11, wherein the color reaction substrate is selected from the group consisting of TMB (3,3 ', 5,5'-tetramethyl benzidine), ABTS [2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline- (o-phenylenediamine). The present invention also provides a composition for quantifying a target nucleic acid using a chromogenic reaction of cerium oxide nanoparticles.
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| KR1020130072462A KR101546887B1 (en) | 2013-06-24 | 2013-06-24 | Method for Detecting Nucleic Acids and Biomolecules by Using Cerium Oxide Nanoparticles Having Oxidase Activity |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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|---|---|
| KR (1) | KR101546887B1 (en) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105368709A (en) * | 2015-11-25 | 2016-03-02 | 中国科学院长春光学精密机械与物理研究所 | Detection device for tuberculosis diagnosis |
| CN110023506A (en) * | 2016-11-10 | 2019-07-16 | 东丽株式会社 | The detection method of nucleic acid |
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| KR20230140137A (en) | 2022-03-29 | 2023-10-06 | 강원대학교산학협력단 | Cerium oxide nanoparticles decorated with 5-fluorouracil-loaded chitosan nanoparticles and method for preparing the same |
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