KR20140135622A

KR20140135622A - 발효에 의한 감마-글루타밀시스테인 및 이 디펩티드의 유도체의 과다 생산을 위한 미생물 및 방법

Info

Publication number: KR20140135622A
Application number: KR1020140055455A
Authority: KR
Inventors: 마르셀 토엔; 토마스 슐뤠서
Original assignee: 와커 헤미 아게
Priority date: 2013-05-17
Filing date: 2014-05-09
Publication date: 2014-11-26
Also published as: EP2808394A1; JP2014226136A; DE102013209274A1; US20140342399A1; IN2014CH02384A; CN104164381A

Abstract

본 발명은 모균주로부터 제조될 수 있는 γ-글루타밀시스테인 및 그 유도체인 비스-γ-글루타밀시스틴 및 γ-글루타밀시스틴을 과다 생산할 수 있는 원핵 미생물 균주에 관한 것으로서, 상기 균주는 모균주와 비교하여 감소된 세포 글루타티온 신테타아제 활성을 가지며, 유사하게 감소된 세포 글루타티온 신테타아제 활성을 갖는 균주에서보다 더 크게 증가된 세포 γ-글루타밀시스테인 신테타아제 활성을 갖는다.

Description

발효에 의한 감마-글루타밀시스테인 및 이 디펩티드의 유도체의 과다 생산을 위한 미생물 및 방법{MICROORGANISM AND METHOD FOR OVERPRODUCTION OF GAMMA-GLUTAMYLCYSTEINE AND DERIVATIVES OF THIS DIPEPTIDE BY FERMENTATION}

본 발명은 γ-글루타밀시스테인(γGC) 및 이 디펩티드의 유도체인 γ-글루타밀시스틴 및 비스-γ-글루타밀시스틴의 과다 생산에 적합한 원핵 미생물 균주(주) (strain), 및 또한 이들 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.

γ-글루타밀시스테인은 원핵 및 진핵 유기체의 세포에서 아미노산 L-시스테인 및 L-글루탐산의 연결에 의해 형성되는 디펩티드이다.

비스-γ-글루타밀시스틴은 2개의 γ-글루타밀시스테인 분자의 산화에 의해 형성되는 디술피드이다. 이 반응은 가역적이며, 이는 비스-γ-글루타밀시스틴이 (예를 들어, 효소적으로 또는 화학적으로) 환원에 의해 γ-글루타밀시스테인으로 다시 전환될 수 있음을 의미한다.

γ-글루타밀시스틴은 1개의 γ-글루타밀시스테인 분자가 1개의 L-시스테인 분자에 의해 산화되어 형성되는 디술피드이다. 이 반응은 가역적이며, 이는 γ-글루타밀시스틴이 (예를 들어, 화학적으로) 환원에 의해 γ-글루타밀시스테인 및 L-시스테인으로 다시 전환될 수 있음을 의미한다.

티올 화합물인 γ-글루타밀시스테인은 다수의 유기체에서 글루타티온의 전구체로서의 역할을 한다. 글루타티온 생합성의 제1 단계는 ATP 의존성 효소인 γ-글루타밀시스테인 신테타아제(synthetase)에 의한 L-시스테인의 α-아미노기 및 L-글루탐산의 γ-카르복시기 사이의 γ-펩티드 결합의 연결이다. 게다가, 이 반응은 글루타티온 생합성에 있어서 제한 단계(limiting step)이며, 그 이유는 γ-글루타밀시스테인 신테타아제 효소가 글루타티온에 의해 저해되기 때문이다. 글루타티온 생합성에 있어서의 제2 단계는 L-글리신과 γ-글루타밀시스테인이 반응하여 글루타티온을 제공하는 것이며, 여기서, L-글리신은 α-펩티드 결합을 통하여 γ-글루타밀시스테인의 시스테이닐 작용체에 연결된다. 이러한 마찬가지인 ATP 의존성 반응도 글루타티온 신테타아제 효소에 의해 촉매된다.

글루타티온은, 그 산화방지 특성으로 인하여, 세포에서 중요한 역할을 하며, 다수의 세포 과정에 환원제, 보조 기질(cosubstrate) 및 보조 인자로서 참여한다. 그러나, 글루타티온 결함 유기체가 또한 공지되어 있으며, 여기서, 글루타티온 전구체, γ-글루타밀시스테인은 글루타티온의 생물학적 역할을 맡는다. 공지된 예로는 대표적인 호염성 고세균, 예컨대 할로박테륨 할로븀(Halobacterium halobium)이 있다(문헌[Sundquist and Fahey, 1989, J. Biol. Chem. 264: 719-725]).

게다가, 다양한 종의 상이한 글루타티온 결함 미생물 균주, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)(문헌[Grant et al., 1997, Mol. Biol. Cell. 8: 1699-1707]), 시네코시스티스(Synechocystis ) sp.(문헌[Cameron and Pakrasi, 2011, Plant Signal. Behav. 6: 89-92]) 또는 에스케리키아 콜라이(Eschericha coli)(문헌[Fuchs and Warner, 1975, J. Bacteriol. 124: 140-148])가 문헌에 기술되어 있다. 이들 균주는 글루타티온 신테타아제를 코딩하는 상응하는 유전자(예를 들어, 이. 콜라이 및 시네코시스티스 sp.의 경우 gshB 또는 에스. 세레비지애의 경우 gsh2) 내에 돌연변이 또는 결실을 갖는다. 글루타티온 신테타아제 활성의 변형 또는 손실에 의해 이들 균주는 더 이상 글루타티온을 합성할 수 없거나, 단지 제한된 정도로 글루타티온을 합성할 수 있다. 따라서, 세포 γ-글루타밀시스테인 수준이 증가한다. 이들 돌연변이 균주는 생존가능하며, 그 이유는 지금 존재하는 향상된 형성량 및 상승된 농도의 γ-글루타밀시스테인이 다수의 글루타티온 특이적 기능을 인계받기 때문이다. 그러나, 흔히 이들은, 상응하는 야생형 균주와 비교하여 반응성 산소 화학종 중금속 이온에 대한 감수성이 증가하여서 그 성장이 부분적으로 손상되는 것을 특징으로 한다(문헌[Cameron and Pakrasi, 2011 Plant Signal. Behav. 6: 89-92]; 문헌[Helbig et al., 2008, J. Bacteriol. 190: 5439-5454]).

반응성 산소 화학종, 중금속 이온 및 비생체 물질(xenobiotics)의 해독이 글루타티온에 의해 많은 유기체에서, 또한 특히 인간에 있어서 매우 빈번하게 일어난다(문헌[Grant et al., Mol. Biol. Cell. 8: 1699-1707]). 게다가, 낮은 글루타티온 수준은 흔히 다양한 질환, 예컨대 자폐증, 파킨슨병, 낭포성 섬유증, HIV, 암 또는 정신 분열증의 증상 및/또는 근거이다(문헌[Wu et al., 2004, J. Nutr. 134: 489-492]). 따라서, 일정한 세포내 글루타티온 수준을 유지하거나 심지어 이를 증가시키는 것에 상당한 관심이 있다. γ-글루타밀시스테인은 세포 글루타티온 수준 증가에 있어서 전도 유망한 물질로서 이미 성공적으로 테스트되었다(문헌[Anderson and Meister, 1983, P.N.A.S. 80: 707-711]).

국제 특허 공개 제WO2006102722호에는 γ-글루타밀시스테인의 효소적 제조 방법이 기술되어 있으며, 이는 고정된 γ-글루타밀시스테인 트랜스펩티다아제에 의한 시스테인 유도체와 γ-글루타밀 공여체의 반응을 기반으로 한다.

γ-글루타밀시스테인의 미생물 생산자는 주로 사카로마이세스목(order Saccharomycetales)의 진균류 균주, 예컨대 사카로마이세스 세레비지애 또는 칸디다 유틸리스(Candida utilis)이지만, 이들은 글루타티온의 생성에 일차적으로 이용된다. 이러한 균주들은 예를 들어 국제 특허 공개 제WO2010116833A1호, 미국 특허 제7371557B2호 및 미국 특허 공개 제2005074835A1호에 개시되어 있다. 예외적으로 높은 γ-글루타밀시스테인 생성 능력을 갖는 동일한 속의 다른 진균류 균주가 특히 유럽 특허 제2251413A1호, 미국 특허 제7569360B2호, 미국 특허 공개 제2004214308A1호, 미국 특허 공개 제2003124684A1호, 미국 특허 제7410790B2호 및 유럽 특허 제1489173B1호에 기술되어 있다. 이들 진균류 균주는, 다양한 균주 특이적 특성, 예컨대 세룰레닌 또는 니트로소구아니딘 내성 또는 판토텐산 영양 요구성 이외에, 글루타티온 신테타아제 활성 감소를 일반적인 특징으로서 갖는다.

게다가, 미국 특허 공개 제2005042328A1호에는 글루타티온 신테타아제 활성이 감소되고 gsh1 발현이 상승된 씨. 유틸리스 균주에서의 γ-글루타밀시스테인의 세포내 농후화가 기술되어 있다(gsh1은 γ-글루타밀시스테인 신테타아제를 코딩한다).

진균류 γGC 생성 시스템의 불리한 점은 비교적 낮은 γ-글루타밀시스테인 수율, 및 또한 γ-글루타밀시스테인의 세포내 축적인데, 이는 γ-글루타밀시스테인에 대한 가능한 워크업(workup)으로서 진균류 세포의 파괴가 필요해지게 한다.

다양한 이. 콜라이 균주가 γ-글루타밀시스테인의 원핵 생산자로서 미국 특허 공개 제20100203592A1호에 기술되어 있으며, 상기 균주 모두는 상승된 gshA 발현을 갖는다. 게다가, 이들 균주는 상응하는 모균주(parent strain)와 비교하여 상승된 글루타티온 신테타아제 활성을 갖거나 정상적인 글루타티온 신테타아제 활성을 갖는다. 진균류 시스템과는 대조적으로 γ-글루타밀시스테인의 배양 배지 내로의 분비가 이들 균주에서 가능하다. 이들 균주에서의 최대 수율은 262 mg/l의이며, 이는 경제적인 방법의 확립에는 불충분하다.

전도 유망한 생물활성 화합물 γ-글루타밀시스테인 및 그 유도체인 비스-γ-글루타밀시스틴 및 γ-글루타밀시스틴을 과다 생산할 수 있는, 그리고 게다가 이들 화합물을 배양 배지 내로 g/l의 규모로 분비시키는 미생물 균주는 아직 존재하지 않는다.

따라서, 본 발명의 목적은 γ-글루타밀시스테인 및 그 유도체인 비스-γ-글루타밀시스틴 및 γ-글루타밀시스틴을 과다 생산할 수 있는, 그리고 이외에도 배양 배지에서의 이들 화합물의 세포외 축적을 가능하게 하는 미생물 균주를 제공하는 것이다.

이 목적은 모균주로부터 제조될 수 있고, 모균주와 비교하여 감소된 세포 글루타티온 신테타아제 활성을 갖고, 유사하게(similarly) 감소된 세포 글루타티온 신테타아제 활성을 갖는 균주에서보다 더 크게 증가된 세포 γ-글루타밀시스테인 신테타아제 활성을 갖는 원핵 미생물 균주에 의해 달성된다.

도 1은 플라스미드 pACYC184-LH의 제한효소 및 기능적 지도를 나타낸다.
도 2는 pgshA_p-gshA^TTG의 제한효소 및 기능적 지도를 나타낸다.
도 3은 ptufB의 제한효소 및 기능적 지도를 나타낸다.
도 4는 ptufB_p-gshA^ATG의 제한효소 및 기능적 지도를 나타낸다.
도 5는 pgshA^ATG-serA2040의 제한효소 및 기능적 지도를 나타낸다.
도 6은 pgshA^ATG-cysE14의 제한효소 및 기능적 지도를 나타낸다.
도 7은 pgshA^ATG-cysE14-serA2040의 제한효소 및 기능적 지도를 나타낸다.
도 8은 pgshA^ATG-serA2040-orf306의 제한효소 및 기능적 지도를 나타낸다.
도 9는 pgshA^ATG-cysE14-orf306의 제한효소 및 기능적 지도를 나타낸다.
도 10은 pgshA^ATG-cysE14-serA2040-orf306의 제한효소 및 기능적 지도를 나타낸다.
도 11은 A) 비처리된(산화된) 샘플 및 B) DTT로 처리된(환원된) 샘플의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.

본 발명에 따른 균주에서의 글루타티온 신테타아제 활성은 상기 활성이 상응하는 야생형 균주의 글루타티온 신테타아제 활성의 50% 이하가 되도록 감소되는 것이 바람직하다.

원핵 미생물 균주는 야생형의 글루타티온 신테타아제 활성의 변경 전 야생형 글루타티온 신테타아제 활성의 25% 이하를 갖는 것이 바람직하다. 균주의 감소된 글루타티온 신테타아제 활성은 이 균주에 있어서 글루타티온 신테타아제 활성의 부재를 의미하는 것으로 이해되는 것이 특히 바람직하다.

본 발명에 따른 균주에 있어서 γ-글루타밀시스테인 신테타아제 활성은 유사하게 감소된 글루타티온 신테타아제 활성을 갖는 균주에서보다 대략 5배 이상 더 높은 것이 바람직하다.

상기에 기술된 바와 같이 글루타티온 신테타아제 활성 및 γ-글루타밀시스테인 신테타아제 활성 둘 모두가 변경된 본 발명에 따른 미생물 균주가 특히 바람직하다.

DNA 동일성 정도는 blastn 알고리즘을 기반으로 하는, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ 사이트에서 발견될 수 있는 "뉴클레오티드 블라스트(blast)" 프로그램에 의해 결정된다. 둘 이상의 뉴클레오티드 서열의 정렬에 있어서, 디폴트(default) 파라미터를 알고리즘 파라미터로서 사용하였다. 디폴트 일반 파라미터는 다음과 같다: 최대 표적 서열 = 100; 짧은 질문 = "짧은 입력 서열에 대한 파라미터의 자동 조정[Automatically adjust parameters for short input sequences]"; 예상 역치 = 10; 단어 크기 = 28; 짧은 입력 서열에 대한 파라미터의 자동 조정 = 0. 상응하는 디폴트 스코어링 파라미터는 다음과 같다: 매치(Match)/미스매치(Mismatch) 스코어 = 1,-2; 갭 코스트(Gap Costs) = 선형.

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ 사이트의 "단백질 블라스트" 프로그램은 단백질 서열들의 비교에 사용된다. 이 프로그램은 blastp 알고리즘을 기반으로 한다. 둘 이상의 단백질 서열의 정렬에 있어서, 디폴트 파라미터를 알고리즘 파라미터로서 사용하였다. 디폴트 일반 파라미터는 다음과 같다: 최대 표적 서열 = 100; 짧은 질문 = "짧은 입력 서열에 대한 파라미터의 자동 조정[Automatically adjust parameters for short input sequences]"; 예상 역치 = 10; 단어 크기 = 3; 짧은 입력 서열에 대한 파라미터의 자동 조정 = 0. 디폴트 스코어링 파라미터는 다음과 같다: 템플릿(Template) = BLOSUM62; 갭 코스트 = 존재함: 11 연장: 1; 조성 조정 = 조건부 조성 스코어 템플릿 조정.

γ-글루타밀시스테인의 생합성 경로를 갖는, 그리고 발효에 의해 배양될 수 있는 모든 원핵 미생물 균주는 원칙적으로 본 발명에 따른 미생물 균주의 생성용의 모균주로서 적합하다. 이러한 미생물은 박테리아 (이전에는 진정세균류(Eubacteria)) 또는 시원균(Archaea)(이전에는 고세균)의 도메인에 속할 수 있다.

이들 유기체는 바람직하게는 박테리아의 계통발생학적 군의 대표이다. 장내세균과(Enterobacteriaceae), 특히 에스케리키아 콜라이 및 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis) 종의 미생물이 특히 바람직하다.

γ-글루타밀시스테인 신테타아제 활성은, 실시예 9에 기술된 바와 같이, 시간이 지남에 따른 γ-글루타밀시스테인 형성량을 기초로 하여 측정된다.

글루타티온 신테타아제 활성은 피루베이트 키나아제 커플링된 효소 테스트를 이용하여 ADP의 형성 속도에 의해 결정되며, 여기서, L-글리신 및 L-γ-글루타밀-L-α-아미노부티레이트가 기질로서 반응한다(문헌[Kim et al., 2003, J. Biochem. Mol. Biol. 36: 326-331]).

바람직하게는 본 발명에 따른 미생물의 생성에 적합한 모균주는 γ-글루타밀시스테인의 생합성 경로를 가지며, 이외에도, 상응하는 모균주와 비교하여 상승된 L-시스테인 생합성 능력을 갖는 원핵 미생물 균주이다. L-시스테인 생합성 능력의 상승은 γ-글루타밀시스테인의 형성에 유리하며, 그 이유는 충분한 양의 L-시스테인을 γ-글루타밀시스테인의 전구체로서 제공하는 것이 γ-글루타밀시스테인의 고도 생성을 한정해서는 안되기 때문이다. 본 발명에 따르면, "L-시스테인 생합성 능력의 상승"은 상응하는 야생형 균주, 모균주 또는 비변형 균주보다 더 많은 L-시스테인 또는 그 유도체인 L-시스틴 및 티아졸리딘을 미생물 균주가 생성하는 능력을 의미하는 것으로 이해된다. 전형적으로 이는 배지 중 L-시스테인, L-시스틴 및/또는 티아졸리딘의 농후화로서 입증된다. 따라서, 당업계의 숙련자에게 공지된, L-시스테인 생합성 능력의 상승은, 관련 미생물 균주의 발효 동안 또는 상기 발효 마지막에, 0.5 g/l의 이상의 "전체 시스테인"(L-시스테인 + L-시스틴 + 티아졸리딘)이 배지 중에서 검출될 수 있을 경우, 존재한다.

L-시스테인 생합성 능력이 상승된 본 발명에 따른 미생물의 생성을 위한 잠재적인 모균주는 예를 들어 미국 특허 공개 제20040038352A1호, 미국 특허 공개 제20090053778호, 유럽 특허 제1528108A1호, 유럽 특허 제2345667A2호 또는 유럽 특허 제2138585호에 개시되어 있다.

게다가, 하기 유전자들 또는 이들 유전자의 변이체(대립 유전자)가 종래 기술로부터 이미 공지되어 있으며, 이는 아미노산인 L-시스테인 및/또는 전구체형의 L-세린 또는 O-아세틸세린을 과다 생산하기 위하여 이들이 사용되게 한다:

- 유럽 특허 제0620853B1호, 유럽 특허 제1496111B1호 및 유럽 특허 제0931833A2호에 개시된 serA 대립 유전자:

이들 serA 대립 유전자는 3-포스포글리세레이트 데히드로게나아제를 코딩하며, 이는 L-세린에 의한 피드백(feedback) 저해를 감소시킨다. 이러한 방식으로, 3-히드록시피루베이트의 형성은 주로 세포의 세린 수준으로부터 분리되며, 이는 L-시스테인으로의 더욱 우수한 질량 유동을 허용한다.

- 국제 특허 공개 제WO9715673호에 기술된 cysE 대립 유전자; 문헌[Nakamori S. et al., 1998, Env. Microbiol 64: 1607-1611] 또는 문헌[Takagi H. et al., FEBS Lett. 452: 323-327]:

이들 cysE 대립 유전자는 세린-O-아세틸트랜스퍼라아제를 코딩하며, 이는 L-시스테인에 의한 피드백 저해를 감소시킨다. 이러한 방식으로, O-아세틸세린 및 L-시스테인의 형성은 주로 세포 중 L-시스테인 수준으로부터 분리된다.

- 유럽 특허 제885962A1호에 기술된 배출 유전자:

유럽 특허 제885962A1호에 기술된 orf306은 소정 기간의 시간에 걸쳐 다회 인용되었다. orf306으로 지칭되거나 orf299, ydeD 및 eamA로도 지칭되는 상기 유전자의 DNA 서열은 현재 등록 번호 NC_004431 또는 NC_007779로 기탁되어 있다. Orf306(orf299, eamA 또는 ydeD)은 배출 시스템을 코딩하는데, 상기 배출 시스템은 항생제 및 다른 독성 물질을 제거하는 데 적합하며, L-시스테인, L-시스틴, N-아세틸세린 및/또는 티아졸리딘 유도체의 과다 생산을 야기한다(문헌[Ohtsu I. et al., 2010, J. Biol. Chem. 285; 17479 - 17489]; 유럽 특허 제885962호 및 유럽 특허 제1233067B1호).

- 독일 특허 제19949579C1호에 기술된 cysB:

cysB 유전자는 시스테인 대사의 중추적 조절자를 코딩하며, 특히 시스테인 생합성을 위하여 술피드를 제공함에 있어서 결정적인 역할을 한다.

또한 본 발명에 따른 미생물 균주는 바람직하게는 상기 유전자 또는 대립 유전자 중 하나 이상을 발현한다. cysE 또는 serA와 또한 orf306으로 기술되는 대립 유전자 중 하나를 이용하는 것이 특히 바람직하다. 이 경우, cysE 및 serA 대립 유전자와 또한 orf306은 본 발명에 따른 미생물 균주에서 개별적으로 또는 조합되어 발현될 수 있다. 본 발명에 따른 미생물 균주는 특히 바람직하게는 실시예에서 본 발명의 것으로서 제시되는 유전자 변형, 특히 표 4에서 본 발명의 것으로서 특성 확인되는 것을 갖는다.

본 발명의 미생물 균주는 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 생성될 수 있다.

γ-글루타밀시스테인 신테타아제(GshA)의 세포 활성은 예를 들어 gshA 유전자 또는 gshA 상동체의 카피수(copy number)를 증가시킴으로써 또는 gshA 유전자 또는 gshA 상동체의 발현을 증가시키는 적합한 프로모터를 사용함으로써 증가될 수 있다.

이. 콜라이의 gshA 유전자는 γ-글루타밀시스테인 신테타아제(GshA) 효소를 코딩한다. gshA 유전자는 서열 번호 1에 의해 특성화된다. GshA 유전자 생성물(GshA)은 서열 번호 2에 의해 특성화된다. 본 발명의 문맥에서, gshA 상동 유전자들은 서열 번호 1의 서열과 관련하여 서열 동일성이 30% 초과이다. gshA 상동체는 특히 바람직하게는 서열 번호 1의 서열과 관련하여 서열 동일성이 70% 초과이다.

GshA 상동체는 서열 번호 2의 서열과 관련하여 서열 동일성이 30% 초과인 단백질이다. GshA 상동체는 특히 바람직하게는 서열 번호 2의 서열과 관련하여 서열 동일성이 70% 초과이다.

미생물에서의 gshA 유전자 또는 gshA 상동체의 카피수의 증가는 당업계의 숙련자에게 공지된 방법을 이용하여 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, gshA 또는 gshA 상동체는 세포당 다수의 카피수를 갖는 플라스미드 벡터(예를 들어 이. 콜라이의 경우 pBR322, pBR 유도체, pBluescript, pUC18, pUC19, pACYC184 및 pACYC184 유도체) 내로 클로닝되고, 미생물 내로 도입될 수 있다. 대안적으로, gshA 유전자 또는 gshA 상동체는 미생물 균주의 염색체 내로 반복적으로 통합될 수 있다. 온건성 박테리오파지, 통합성 플라스미드 또는 상동 재조합을 통한 통합을 이용하는 공지된 시스템이 통합 방법으로서 사용될 수 있다(문헌[Hamilton et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 4617-4622]; 문헌[Datsenko and Wanner, 2000, P.N.A.S. 97: 6640-6645]).

프로모터의 제어 하에 플라스미드 벡터 내로 gshA 또는 gshA 상동체를 클로닝함으로써 카피수를 증가시키는 것이 바람직하다. gshA 또는 gshA 상동체를 pACYC 유도체, 예컨대 pACYC184-LH(부다페스트 조약에 따라 1995년 8월 18일자로 독일 이노펜스트라쎄 7베 브라운슈바이크 83124 소재의 저먼 콜렉션 오브 마이크로오가니즘즈 앤드 셀 컬쳐즈[German Collection of Microorganisms and Cell Cultures]에 DSM 10172의 번호로 기탁됨) 내에 클로닝함으로써 이. 콜라이에서 카피수를 증가시키는 것이 특히 바람직하다.

카피수의 증가는 바람직하게는 대략 10배의 증가를 의미하는 것으로 이해된다.

gshA 유전자 또는 gshA 상동체는 예를 들어 전 유전자를 커버하는 특정 프라이머를 사용한 폴리머라아제 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR)에 의한 특이적 증폭, 및 플라스미드 DNA 단편들을 이용한 후속적인 라이게이션에 의해 플라스미드 벡터 내에 클로닝된다.

당해 유전자의 천연 프로모터 및/또는 오퍼레이터(operator) 영역은 플라스미드 코딩된 유전자의 발현에 있어서 제어 영역으로서의 역할을 할 수 있다.

gshA 또는 gshA 상동체의 발현률은 또한 다른 프로모터에 의해 증가될 수 있다. 관련 프로모터 시스템, 예컨대 이. 콜라이에서의 gapA 유전자의 항시성(constitutive) GAPDH 프로모터 또는 유도성 lac, tac, trc, 람다(lambda), ara 또는 tet 프로모터가 당업계의 숙련자에게 공지되어 있다(문헌[Markides S.C., 1996, Microbiol. Rev. 60: 512-538]). 이러한 구성물들은 플라스미드 또는 염색체에서 그 자체 공지된 방식으로 사용될 수 있다.

더욱이, 번역 시작 신호, 예컨대 리보좀 결합 부위, 또는 샤인 달가노(Shine Dalgarno) 서열이 각각의 구성물 상에 최적화된 서열로 존재하거나, "코돈 사용"에 따라 희귀한 코돈이 빈번하게 사용되는 코돈과 교환된다는 점에서 세포 GshA 활성의 증가가 달성될 수 있다.

또한 세포 GshA 활성은 돌연변이(개개의 또는 다수의 뉴클레오티드의 치환, 삽입 또는 결실)가 gshA 유전자 또는 gshA 상동체의 리딩 프레임(reading frame) 내에 도입되고 이는 GshA 또는 GshA 상동체의 비활성을 증가시킨다는 점에서 증가될 수 있다. gshA 유전자의 보기 드문 시작 코돈 TTG를 보통의 시작 코돈 ATG와 교환하면 이. 콜라이에서 gshA의 발현이 증가될 뿐만 아니라 GshA의 전체 세포 활성도 증가된다(문헌[Kwak et al., 1998, J. Biochem. Mol. Biol. 31: 254-257]).

단백질 수준에서 알라닌 494를 발린 또는 류신과 교환하는 것(A494V 또는 A494L) 또는 495 위치에서 세린을 트레오닌으로 치환하는 것(S495T)을 포함하는 gshA의 부위 지정 돌연변이(site-directed mutation)도 이. 콜라이에서 세포 GshA 활성을 증가시킨다(문헌[Kwak et al., 1998, J. Biochem. Mol. Biol. 31: 254-257]). 이러한 대립 유전자는 본 발명에 따르면 바람직하게는 gshA 상동체이다.

미생물 균주에서 글루타티온 신테타아제 활성을 감소시키는 방법이 또한 종래 기술로부터 공지되어 있다. 세포 글루타티온 신테타아제 활성은, 예를 들어 돌연변이(개개의 또는 다수의 뉴클레오티드의 치환, 삽입 또는 결실)가 gshB 유전자 또는 gshB 상동체의 리딩 프레임 내로 도입되고 이것이 GshB 또는 GshB 상동체의 비활성을 감소시킨다는 점에서 감소될 수 있다. 이러한 gshB 대립 유전자의 생성 방법은 당업계의 숙련자에게 공지되어 있다. gshB 유전자의 대립 유전자는 예를 들어 출발 재료로서 gshB 야생형 유전자의 DNA를 사용하여 비특이적 또는 지정 돌연변이 유발에 의해 제조될 수 있다. 야생형 효소와 비교하여 GshB 활성이 감소된 GshB 변이체를 코딩하는 그러한 대립 유전자의 예가 예를 들어 문헌[Kato et al., 1988, J. Biol. Chem. 263: 11646-11651]에 기술되어 있다.

gshB 유전자 또는 gshB 유전자의 프로모터 영역 내의 비특이적 돌연변이는 예를 들어 특히 니트로소구아니딘, 에틸메탄술폰산과 같은 화학적 에이전트(agent)에 의해 및/또는 물리적 방법에 의해 및/또는 특정한 조건 하에서 실시되는 PCR 반응에 의해 생성될 수 있다. DNA 단편 내의 특정 위치에 돌연변이를 도입하는 방법은 공지되어 있다. 예를 들어, gshB 유전자 및 그 프로모터 영역을 포함하는 DNA 단편 내의 1개 이상의 염기는 적합한 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 PCR에 의해 교환될 수 있다. 부가적으로, 유전자 합성에 의해 전 gshB 유전자 또는 새로운 gshB 대립 유전자를 제조하는 것이 가능하다.

gshB 대립 유전자는 일반적으로 처음에 시험관 내에서 생성되며, 후속적으로 세포의 염색체 내에 삽입되는데, 이에 의해 원래 존재하는 gshB 야생형 유전자는 대체되고 따라서 gshB 돌연변이 균주가 생성된다. gshB 대립 유전자는 공지된 표준 방법에 의해 gshB 야생형 유전자 대신 숙주 세포의 염색체 내에 삽입될 수 있다. 이는 예를 들어 상동 재조합 기작을 통하여 유전자 내로 염색체 돌연변이를 도입하기 위한, 문헌[Link et al., 1997, J. Bacteriol. 179: 6228-37]에 기술된 방법에 의해 실시될 수 있다. 전 gshB 유전자 또는 이의 일부의 염색체 결실은 예를 들어 문헌[Datsenko and Wanner, 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-5]에 기술된 방법에 따라

레드(red) 레콤비나아제 시스템에 의해 가능하다. 또한 gshB 대립 유전자는 P1 파지에 의한 형질도입 또는 콘쥬게이션(conjugation)을 통하여 gshB 돌연변이를 갖는 균주로부터 gshB 야생형 균주로 이전될 수 있으며, 여기서, 염색체 내의 gshB 야생형 유전자는 상응하는 gshB 대립 유전자에 의해 대체된다.

게다가, 세포의 글루타티온 신테타아제 활성은 또한 발현 조절에 요구되는 적어도 1가지의 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서(enhancer), 리보좀 결합 부위)가 개개의 또는 다수의 뉴클레오티드의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 돌연변이된다는 점에서 감소될 수 있다.

이. 콜라이의 gshB 유전자는 글루타티온 신테타아제 효소를 코딩한다. gshB 유전자는 서열 번호 3의 서열을 특징으로 한다. GshB 유전자 생성물(GshB)은 서열 번호 4의 서열을 특징으로 한다.

본 발명의 문맥에서, gshB 상동 유전자는 서열 번호 3의 서열에 대하여 서열 동일성이 30% 초과이다. 특히 바람직한 것은 서열 번호 3의 서열에 대하여 서열 동일성이 70% 초과인 것이다. GshB 상동체는 서열 번호 4의 서열에 대하여 서열 동일성이 30% 초과인 단백질이다. GshB 상동체는 특히 바람직하게는 서열 번호 4의 서열에 대하여 서열 동일성이 70% 초과이다.

더욱이, 본 발명은 γ-글루타밀시스테인(γGC) 및 이 디펩티드의 유도체인 γ-글루타밀시스틴 및 비스-γ-글루타밀시스틴의 과다 생산 방법에 관한 것이며, 여기서, 본 발명에 따른 미생물 균주는 발효 배지에서 배양되며, 세포는 배지로부터 제거되며, 요망되는 생성물은 배양 배지로부터 정제된다.

본 발명에 따른 방법에 요구되는 미생물은 당업계의 숙련자에게 공지된 통상적인 발효 방법에 의해 생물반응기(발효기)에서 공업적 규모로 배양된다(발효된다).

바람직하게는 발효는 통상적인 생물반응기, 예를 들어, 교반 탱크, 버블 컬럼 발효기 또는 공기 부양 발효기에서 실시된다. 특히 바람직한 것은 교반 탱크 발효기이다. 이 경우, 공업적 규모는 2 l 이상의 발효기 크기를 의미하는 것으로 이해된다. 바람직한 것은 체적이 5 l 초과인 발효기이며, 특히 바람직하게는 발효기는 체적이 50 l 초과이다. γ-글루타밀시스테인 생산용 세포는 호기성 성장 조건 하에 배양되며, 여기서, 발효 동안의 산소 함량은 50% 이하의 포화도로 조정된다. 배양 중 산소 포화도는 가스 공급량 및 교반기 속도를 통하여 자동으로 조절된다.

탄소원으로서 바람직한 것은 당, 당 알코올, 유기 산 또는 당 함유 식물 가수분해물이다. 본 발명에 따른 방법에 있어서, 특히 바람직한 것은 탄소원으로스 글루코스, 프룩토스, 락토스, 글리세롤 또는 이들 화합물 중 2가지 이상을 포함하는 혼합물을 사용하는 것이다. 탄소원은 바람직하게는 생산 단계 동안 발효기 내의 탄소원의 함량이 10 g/l의를 초과하지 않도록 배양물에 첨가된다. 2 g/l의 최대 농도가 바람직하다.

본 발명에 따른 방법에 있어서, 바람직한 것은 질소원으로서 암모니아, 암모늄염 또는 단백질 가수분해물을 사용하는 것이다. pH 안정화용 보정 수단으로서 암모니아를 사용할 때, 이 질소원은 발효 동안 정기적으로 첨가된다.

인, 염소, 나트륨, 마그네슘, 질소, 칼륨, 칼슘, 철 원소의 염 및 미량의, 즉, μM 단위의 농도의, 몰리브덴, 붕소, 코발트, 망간, 아연 및 니켈 원소의 염이 추가의 배지 보충물로서 첨가될 수 있다.

게다가, 유기 산(예를 들어, 아세테이트, 시트레이트), 아미노산(예를 들어, L-글루탐산, L-시스테인) 및 비타민(예를 들어, B1, B6)이 배지에 첨가될 수 있다. 이 경우 L-글루탐산은 직접적으로 산으로서 또는 그 염들 중 하나의 형태로, 예를 들어 글루탐산칼륨 또는 글루탐산나트륨의 형태로, 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 바람직한 것은 글루탐산칼륨을 사용하는 것이다.

사용되는 복합 영양원은 예를 들어 효모 추출물, 옥수수 침지액, 대두박 또는 맥아 추출물일 수 있다.

중온성(mesophilic) 미생물, 예컨대 이. 콜라이의 인큐베이션 온도는 바람직하게는 15 - 45℃, 특히 바람직하게는 30 - 37℃이다.

본 발명의 발효법의 생산 단계는 먼저 γ-글루타밀시스테인, 비스-γ-글루타밀시스틴 또는 γ-글루타밀시스틴이 배양 브로쓰(broth)에서 검출될 수 있는 시점에서 시작한다. 이 단계는 전형적으로 생산 발효기에 예비배양물을 접종한지 대략 8 내지 12시간 후에 시작된다.

배치식 또는 유가식 공정에서 기재된 방법에 따라 발효된 미생물은, 48시간 이상의 기간의 성장 단계 후 γ-글루타밀시스테인 및 이로부터 유도된 γ-글루타밀시스틴 및 비스-γ-글루타밀시스틴을 발효 배지 내로 고효율로 분비한다.

본 발명의 문맥에서, γ-글루타밀시스테인의 과다 생산은 바람직하게는 미생물 균주가 상응하는 야생형 균주, 모균주 또는 비변형 균주보다 더 많은 γ-글루타밀시스테인 또는 그 유도체인 γ-글루타밀시스틴 및 비스-γ-글루타밀시스틴을 생산하는 능력을 의미하는 것으로 이해된다. 이는 전형적으로 배지 중 γ-글루타밀시스테인, γ-글루타밀시스틴 및/또는 비스-γ-글루타밀시스틴의 농후화로서 입증된다. 따라서, 관련 미생물 균주의 발효의 마지막에 배지 중에서 0.2 g/l의 이상의 "전체 γ-글루타밀시스테인"(γ-글루타밀시스테인 + γ-글루타밀시스틴 + 비스-γ-글루타밀시스틴)의 수율이 검출될 수 있을 경우 γ-글루타밀시스테인의 과다 생산이 존재한다. 바람직하게는 배지 중 "전체 γ-글루타밀시스테인"의 수율은 예를 들어 표 3 및 표 4에 열거된 본 발명의 미생물에 의해 달성될 수 있는 바와 같이, 3 내지 23 g/l의 범위 내이다. 배지 중 10 내지 23 g/l의 범위의 "전체 γ-글루타밀시스테인"의 수율이 경제적인 방법의 확립과 관련하여 특히 바람직하다.

하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하는 역할을 한다:

실시예 1: 이. 콜라이 균주 W3110 ( ATCC27325 )에서의 gshB 유전자의 결실(글루타티온 신테타아제 불활성화)

이. 콜라이에 있어서 글루타티온 신테타아제 효소(GshB)를 코딩하는 gshB 유전자를 다첸코(Datsenko) 및 워너(Wanner)에 의해 개발된 "

레드법"에 따라 이. 콜라이 균주 W3110(ATCC27325)에서 결실시켰다(문헌[Datsenko and Wanner, 2000, P.N.A.S. 97: 6640-6645]). 카나마이신 내성 마커(kanR)를 코딩하는 DNA 단편을 프라이머 gshB-del-for(서열 번호 5) 및 gshB-del-rev(서열 번호 6)를 사용하여 증폭시켰다. 프라이머 gshB-del-for은 gshB 유전자의 5'-말단에 대하여 상동성인 30개의 뉴클레오티드로 이루어진 서열, 및 플라스미드 pKD13(CGSC(Coli Genetic Stock Center) 번호: 7633) 상의 두 FRT 부위(FLP 인식 표적) 중 하나를 코딩하는 DNA 서열에 대하여 상보성인 20개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 코딩한다. 프라이머 gshB-del-rev는 gshB 유전자의 3'-말단에 대하여 상동성인 30개의 뉴클레오티드로 이루어진 서열, 및 플라스미드 pKD13 상의 제2 FRT 부위를 코딩하는 DNA 서열에 대하여 상보성인 20개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 코딩한다. 미국 특허 제5972663A호의 실시예 2에 기술된 바와 같이 이. 콜라이 균주 W3110(ATCC27325)를 전기 천공에 의해 증폭된 PCR 생성물로 형질전환시켰다. 형질전환된 gshB 결함 세포를 50 mg/l의 카나마이신을 함유하는 LB 한천 플레이트 상에서 선발하였다. 마커 유전자(카나마이신 내성, kanR)를 FLP 레콤비나아제 효소에 의해 제거하였는데, 이는 플라스미드 pCP20(CGSC 번호: 7629) 상에서 코딩되었었다. 온도 민감성 "복제 기원"(ori)으로 인하여, 43℃에서 이. 콜라이 세포를 인큐베이션함으로써 형질전환 후 플라스미드 pCP20을 다시 제거할 수 있다. 이러한 방식으로 생성된 이. 콜라이 gshB 결실 균주는 W3110ΔgshhB의 명칭을 지닌다.

실시예 2: 그 자신의 프로모터를 갖는 gshA 유전자의 증폭

이. 콜라이에 있어서 gshA 유전자의 프로모터 서열은 공지되어 있다(문헌[Watanabe et al., 1986, Nucleic Acids Res. 14: 4393-4400]). 이. 콜라이의 gshA 유전자 및 gshA 프로모터(gshA_p)를 코딩하는 DNA 단편을 PCR에 의해 증폭시켰다. gshA 유전자의 프로모터 서열을 코딩하는 DNA 단편을 프라이머 gshA_p-gshA-for(서열 번호 7) 및 gshA_p-gshA-rev(서열 번호 8)를 이용하여 증폭시켰다. 이. 콜라이 균주 W3110(ATCC 27325)의 염색체 DNA는 PCR 반응용 주형으로서의 역할을 하였다. 대략 1.9 kb 크기의 PCR 단편을 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제하고, "퀴아퀵 겔 추출 키트(QIAquick Gel Extraction Kit)"(퀴아젠 게엠베하(Qiagen GmbH), 독일 힐덴)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 아가로스 겔로부터 단리하였다. 그 후, 정제된 PCR 단편을 제한 효소 XbaI로 절단하고, -20℃에서 보관하였다.

실시예 3: gshA 유전자의 증폭 및 돌연변이 유발

A. gshA 유전자의 증폭

이. 콜라이의 gshA 유전자를 PCR에 의해 증폭시켰다. 이. 콜라이 균주 W3110(ATCC 27325)의 염색체 DNA는 PCR 반응용 주형으로서의 역할을 하였다. Taq 폴리머라아제(퀴아젠 게엠베하)를 증폭에 사용하였는데, 이는 PCR 생성물의 각각의 3' 말단에 추가의 아데닌을 부착시킨다. gshA의 증폭 동안에, 적합한 프라이머를 사용하여 보기 드문 시작 코돈 TTG를 시작 코돈 ATG로 대체하였다. 올리고뉴클레오티드 gshA-OE-for(서열 번호 9) 및 gshA-OE-rev(서열 번호 10)는 특정 프라이머로서의 역할을 하였다. 생성된 1.6 kb 크기의 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제하고, "퀴아퀵 겔 추출 키트"(퀴아젠 게엠베하)를 사용하여 아가로스 겔로부터 단리하였다. 증폭시키고 정제한 PCR 생성물을 벡터 pCR2.1-TOPO(라이프 테크놀로지즈, 라이프 테크놀로지즈 게엠베하(Life Technologies, Life Technologies GmbH), 독일 다름스타트)와 라이게이션시키는 것을 제조업자의 지시에 따라(라이프 테크놀로지즈 게엠베하) "PCR^®2.1 TOPO^®을 포함하는 TOPO^® TA 클로닝(Cloning)^® 키트"를 사용하여 "TA" 클로닝에 의해 실시하였다.

라이게이션 혼합물로 "DH5α^TM-T1R 이. 콜라이 세포"(라이프 테크놀로지즈)를 형질전환시키고, 이들 세포를 번식시키고, 플라스미드 단리 후, 플라스미드의 DNA 서열을 서열결정에 의해 확인하였다. 요망되는 서열을 갖는 생성된 구성물은 pCR2.1-gshA의 명칭을 지닌다.

B. gshA 유전자의 돌연변이 유발

gshA의 재클로닝을 위하여, gshA 유전자 내의 2개의 간섭 제한효소 부위 EcoRI 및 BglII를 처음에 지정 돌연변이 유발에 의해 제거하였다. 돌연변이 유발 반응을 제조업자의 지시에 따라 "진테일러(GeneTailor)^TM 부위 지정 돌연변이 유발 시스템"(라이프 테크놀로지즈 게엠베하)을 사용하여 실시하였다. 제1 돌연변이 유발에 있어서, 플라스미드 pCR2.1-gshA가 주형으로서의 역할을 하였다. 돌연변이 유발용 프라이머 gshA-EcoRImut-for(서열 번호 11) 및 gshA-EcoRImut-rev(서열 번호 12)를 사용하여 gshA 유전자 내의 EcoRI 절단 부위를 제거하였다. gshA 유전자 내의 EcoRI 절단 부위에서 돌연변이 유발을 행한 후에, 돌연변이 유발 반응물의 일부분으로 라이프 테크놀로지로부터의 "DH5α^TM-T1R 이. 콜라이 세포"를 다시 형질전환시키고, 이들 세포를 번식시켰다. 플라스미드 제조 후, 단리된 플라스미드의 DNA 서열을 서열결정에 의해 확인하였다. gshA 유전자 내의 EcoRI 절단 부위가 없는 올바른 DNA 서열을 갖는 생성된 구성물은 pCR2.1-gshA_mut1의 명칭을 지닌다.

pCR2.1-gshA_mut1의 gshA 유전자 내의 BglII 절단 부위를 제거하는 유사한 절차를 실시하였으며, 단지, 돌연변이 유발용 프라이머 gshA-BglIImut-for(서열 번호 13) 및 gshA-BglIImut-rev(서열 번호 14)를 돌연변이 유발 반응에 사용하였다.

제2 돌연변이 유발 반응물의 일부분으로 "DH5α^TM-T1R 이. 콜라이 세포"(라이프 테크놀로지로부터)를 다시 형질전환시키고, 이들 세포를 번식시키고, 다시 한 번 플라스미드의 제조 후, 단리된 플라스미드의 DNA 서열을 서열결정에 의해 확인하였다. gshA 유전자 내의 EcoRI 및 Bg1II 절단 부위가 없는 올바른 DNA 서열을 갖는 생성된 구성물은 pCR2.1-gshA_mut2의 명칭을 지닌다.

실시예 4: tufB 프로모터( _p tufB )를 코딩하는 DNA 단편의 증폭

gshA 유전자의 효과적인 전사(과다 발현)를 위하여, tRNA-tufB 오페론의 활성화 영역을 사용하였다(문헌[Lee et al., 1981, Cell 25: 251-258]). 이. 콜라이에서의 이 오페론은 구조 유전자인 thrU , tyrU , glyT 및 thrT을 코딩하며, 또한 "단백질 사슬 연장 인자 EF-Tu"(TufB) 단백질을 코딩한다. 요망되는 프로모터 서열을 올리고뉴클레오티드 tufB_p-for(서열 번호 15) 및 tufB_p-rev(서열 번호 16)를 이용하여 증폭시켰다. 이. 콜라이 균주 W3110(ATCC27325)의 게놈 DNA가 다시 주형으로서의 역할을 하였다. 수득된 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제하고, "퀴아퀵 겔 추출 키트"(퀴아젠 게엠베하)를 사용하여 아가로스 겔로부터 단리하였다. 그 후, 정제된 PCR 단편을 제한 효소 XbaI로 절단하고, -20℃에서 보관하였다.

실시예 5: gshA 과다 발현용 플라스미드( gshA 플라스미드)의 구성

플라스미드 pACYC184-LH를 본 발명에 따른 플라스미드의 구성용의 베이스(base) 플라스미드로 사용하였다. 플라스미드 pACYC184-LH의 제한효소 및 기능 지도가 도 1에 예시되어 있다. XbaI 인식 서열 외에도, 플라스미드 pACYC184-LH는 하기 제한효소 부위를 갖는 폴리링커 영역을 또한 코딩한다:

NotI - NcoI - ScaI- NsiI- MluI - PacI - NotI

A. 그 자신의 프로모터를 갖는 gshA 유전자의 클로닝

처음에, 실시예 2에서 설명한, XbaI로 절단한, 그리고 그 자신의 프로모터 및 보기 드문 시작 코돈 TTG를 갖는 gshA 유전자를 코딩하는 PCR 생성물을 pACYC184-LH의 XbaI 절단 부위 내에 클로닝하였다. 라이게이션 혼합물로 "DH5α^TM-T1R 이. 콜라이 세포"(라이프 테크놀로지로부터)를 형질전환시키고, 이들 세포를 번식시키고, 단리된 플라스미드의 DNA 서열을 서열결정에 의해 확인하였다. 생성된 구성물은 pgshA_p-gshA^TTG의 명칭을 지닌다(도 2 참조).

B. tufB 프로모터의 클로닝

실시예 4에서 설명한, XbaI로 절단된, 그리고 tufB 프로모터(tufB_p)를 코딩하는 PCR 생성물을 pACYC184-LH의 XbaI 절단 부위 내에 또한 클로닝하였다. 라이게이션 혼합물로 "DH5α^TM-T1R 이. 콜라이 세포"(라이프 테크놀로지로부터)를 형질전환시키고, 이들 세포를 번식시키고, 단리된 플라스미드의 DNA 서열을 서열결정에 의해 확인하였다. 생성된 구성물은 pACYC184-tufB_p의 명칭을 지닌다.

C. tufB 프로모터의 최적화

플라스미드 pACYC184-tufB_p는 총 3회의 최적화(돌연변이 유발)를 위한 주형으로서의 역할을 하였는데, 이는 천연 tufB 프로모터의 DNA 서열에서 행하였다. "진테일러^TM 부위 지정 돌연변이 유발 시스템"(라이프 테크놀로지즈 게엠베하)에 의해, tufB 프로모터의 리보좀 결합 부위(RBS), -10 영역 및 -35 영역을 최적화하여서 이들이 궁극적으로 이들 원핵 프로모터 요소의 상응하는 콘센서스(consensus) 서열을 코딩하도록 하였다(표 1 참조).

플라스미드 pACYC184-tufB_p 상의 tufB 프로모터의 부위 지정 돌연변이 유발에 의한 RBS의 최적화에 있어서, 돌연변이 유발 프라이머 tufB_p-RBS_opt-for(서열 번호 17) 및 tufB_p-RBS_opt-rev(서열 번호 18)를 사용하였다. "진테일러^TM 부위 지정 돌연변이 유발 시스템"(라이프 테크놀로지즈)을 이용하여 tufB 프로모터의 RBS에서 돌연변이 유발 반응을 행한 후, 돌연변이 유발 반응물의 일부분으로 "DH5α^TM-T1R 이. 콜라이 세포"(라이프 테크놀로지로부터)를 형질전환시키고, 이들 세포를 번식시키고, 플라스미드의 제조 후, 단리된 플라스미드의 DNA 서열을 서열결정에 의해 확인하였다. 올바른 DNA 서열 및 최적화된 RBS 서열을 갖는 생성된 구성물은 pACYC184-tufB_p-RBS_opt의 명칭을 지닌다.

pACYC184-tufB_p-RBS_opt를 기반으로 한 -10 영역의 최적화(돌연변이 유발)를 위하여, 유사한 공정을 사용하였으며, 단지 프라이머 tufB_p-10_opt-for(서열 번호 19) 및 tufB_p-10_opt-rev(서열 번호 20)를 상기 돌연변이 유발에 사용하였다. 최적화된 RBS 및 -10 영역을 갖도록 형성되어 서열결정에 의해 확인된 플라스미드는 pACYC184-tufB_p(RBS-10)_opt로 명명된다.

플라스미드 pACYC184-tufB_p(RBS-10)_opt는 다시 -35 영역의 돌연변이 유발용 주형으로서의 역할을 하였는데, 이는 프라이머 tufB_p-35_opt-for(서열 번호 21) 및 tufB_p-35_opt-rev(서열 번호 22)를 이용하여 실시하였다. 최적화된 RBS, -10 영역 및 -35 영역을 갖도록 형성되어 서열결정에 의해 확인된 플라스미드는 ptufB_p로 명명된다. 생성된 플라스미드 ptufB_p의 제한효소 및 기능적 지도가 표 3에 예시되어 있다.

D. ptufB _p 내의 최적화된 tufB 프로모터 뒤의 최적화된 시작 코돈을 갖는 gshA 유전자의 클로닝

실시예 3에 설명한, 시작 코돈 ATG를 갖는 돌연변이 유발된 gshA 유전자를 효소 EcoRI 및 Bg1II를 이용한 제한효소 절단에 의해 플라스미드 pCR2.1-gshA_mut2로부터 제거하고, EcoRI 및 Bg1II로 절단한 벡터 ptufB_p 내에 재클로닝하였다. 생성된 구성물 ptufB_p-gshA^ATG(도 4 참조)로 "DH5α^TM-T1R 이. 콜라이 세포"(라이프 테크놀로지로부터)를 형질전환시키고, 이들 세포를 번식시키고, 단리된 플라스미드의 DNA 서열을 서열결정에 의해 확인하였다.

실시예 6. serA 및/또는 cysE 대립 유전자 및 또한 orf306(= orf299 , ydeD 또는 eamA )에 의한 gshA 발현 플라스미드 ptufB _p - gshA ^ATG 의 연장

γ-글루타밀시스테인에 대한 증가된 L-시스테인 생합성의 영향을 조사하기 위하여, 플라스미드 ptufB_p-gshA^ATG를 serA 및/또는 cysE 대립 유전자 및 또한 orf306(= orf299, eamA 또는 ydeD)에 의해 연장시켰다.

A. serA 대립 유전자에 의한 플라스미드 ptufB _p - gshA ^ATG 의 연장

특정 serA 대립 유전자에 의해 플라스미드 ptufB_p-gshA^ATG를 연장시키기 위하여, 처음에 serA 유전자를 PCR을 통하여 그 자신의 프로모터로 증폭시켰다. 이. 콜라이 균주 W3110(ATCC 27325)의 염색체 DNA가 PCR 반응용 주형으로서의 역할을 하였다. 올리고뉴클레오티드 serA-NcoI-for(서열 번호 23) 및 serA-SacI-rev(서열 번호 24)를 PCR 반응에 사용하였다.

그 후, 그 자신의 프로모터를 포함하는 증폭된 serA 유전자를 효소 NcoI 및 SacI로 절단하고, 아가로스 겔 상에서의 정제 후, NcoI 및 SacI로 절단한 ptufB_p-gshA^ATG 벡터 내에 라이게이션시켰다.

상기 라이게이션 혼합물로 "DH5α^TM-T1R 이. 콜라이 세포"(라이프 테크놀로지로부터)를 형질전환시키고, 이들 세포를 번식시키고, 단리된 플라스미드의 DNA 서열을 서열결정에 의해 확인하였다. 천연 프로모터의 제어 하에 serA를 이용한 이러한 클로닝에서 생긴 gshA 플라스미드를 ptufB_p-gshA^ATG-serA로 명명하였다. L-세린에 대하여 피드백 내성을 갖는 SerA 변이체를 코딩하는 다양한 serA 대립 유전자의 생성을 위하여, pFL209 대신 플라스미드 ptufB_p-gshA^ATG-serA가 코돈 349 및/또는 372의 변화를 위한 주형으로서의 역할을 한다는 것을 제외하고는 유럽 특허 제1496111B1호의 실시예 2에서와 같은 절차를 실시하였다. 상이한 serA 대립 유전자들을 이용한 돌연변이 유발에서 생긴 gshA 플라스미드를 ptufB_p-gshA^ATG-serA...로 명명하였으며, 여기서 ...은 각각의 serA 대립 유전자의 수에 상응한다(예를 들어 ptufB_p-gshA^ATG-serA2040에 대하여 도 5 참조).

B. cysE 대립 유전자에 의한 플라스미드 ptufB _p - gshA ^ATG 의 연장

특정 cysE 대립 유전자에 의한 플라스미드 ptufB_p-gshA^ATG의 연장을 위하여 국제 특허 공개 제WO9715673호의 실시예 6(표 7)에 개시된 pACYC184/cysE ... 플라스미드들 중 하나를 처음에 NsiI 및 NcoI로 절단하였다. 천연 cysE 프로모터의 제어 하에 특정 cysE 대립 유전자를 코딩하는 각각의 대략 1.0 kb 크기의 단편을 아가로스 겔 상에서 정제하고, 후속적으로, NsiI 및 NcoI로 선형화한 벡터 ptufB_p-gshA^ATG 내에 라이게이션시켰다. 상이한 cysE 대립 유전자들을 이용한 이 클로닝에서 생긴 gshA 플라스미드를 ptufB_p-gshA^ATG-cysE...으로 명명하였으며, 여기서, ...은 각각의 cysE 대립 유전자의 수에 상응한다(예를 들어 ptufB_p-gshA^ATG-cysE14에 대하여 도 6 참조).

C. cysE 대립 유전자에 의한 플라스미드 ptufB _p - gshA ^ATG - serA ...의 연장

특정 cysE 대립 유전자에 의한 플라스미드 ptufB_p-gshA^ATG-serA...의 연장을 위하여, 국제 특허 공개 제WO9715673호의 실시예 6(표 7)에 개시된 플라스미드 pACYC184/cysE... 중 하나를 처음에 SacI 및 NsiI로 절단하였다. 대략 1.0 kb 크기의 단편을 아가로스 겔 상에서 정제하고, 후속적으로, SacI 및 NsiI로 선형화한 벡터 ptufB_p-gshA^ATG-serA... 내에 라이게이션시켰다. 상이한 cysE 및 serA 대립 유전자를 이용한 이러한 클로닝에서 생긴 gshA 플라스미드를 ptufB_p-gshA^ATG-cysE... -serA...로 명명하였으며, 여기서, ...은 각각의 cysE 또는 serA 대립 유전자의 수에 상응한다(예를 들어 ptufB_p-gshA^ATG-cysE14-serA2040에 대하여 도 7 참조).

D. orf306 에 의한 플라스미드 ptufB _p - gshA ^ATG - serA ..., ptufB _p - gshA ^ATG -cysE... 및 ptufB _p - gshA ^ATG - cysE ...- serA ...의 연장

orf306에 의한 상응하는 플라스미드 ptufB_p-gshA^ATG, ptufB_p-gshA^ATG-serA..., ptufB_p-gshA^ATG-cysE... 및 ptufB_p-gshA^ATG-cysE...-serA...의 연장을 위하여, 유럽 특허 제885962B1호의 실시예 2에 개시된 플라스미드 pACYC184/cysEIV-GAPDH-ORF306을 처음에 NsiI 및 PacI로 절단하였다. O-아세틸세린 / 시스테인 엑스포터(exporter)(EamA, YdeD)를 코딩하는 대략 1.2 kb 크기의 단편을 아가로스 겔 상에서 정제하고, 후속적으로, NsiI 및 PacI로 선형화한 벡터 ptufB_p- ptufB_p-gshA^ATG-serA..., gshA^ATG-cysE,,, 또는 ptufB_p-gshA^ATG-cysE...-serA,,, 중 하나 내에 라이게이션시켰다. GAPDH 프로모터의 제어 하에 orf306을 이용한 이러한 클로닝에서 생긴 gshA 플라스미드를 ptufB_p-gshA^ATG-serA...-orf306, ptufB_p-gshA^ATG-cysE...-orf306 및 ptufB_p-gshA^ATG-cysE...SerA...-orf306으로 명명하였으며, 여기서, ...는 각각의 cysE 또는 serA 대립 유전자의 수에 상응한다(예를 들어, ptufB_p-gshA^ATG-serA2040-orf306에 대하여 도 8을 참조하고, ptufB_p-gshA^ATG-cysE14-orf306에 대하여 도 9를 참조하고, ptufB_p-gshA^ATG-cysE14-serA2040-orf306에 대하여 도 10을 참조).

실시예 7: 이. 콜라이 균주 W3110 ( ATCC 27325) 및 W3110 Δ gshhB 의 형질전환

전기천공에 의해 gshA 발현 플라스미드 pgshA_p-gshA^TTG, ptufB_p-gshA^ATG, ptufB_p-gshA^ATG-serA2040, ptufB_p-gshA^ATG-cysE14, ptufB_p-gshA^ATG-cysE14-serA2040, ptufB_p-gshA^ATG-serA2040-orf306, ptufB_p-gshA^ATG-cysE14-orf306 및 ptufB_p-gshA^ATG-cysE14-serA2040-orf306, 및 음성 대조구로서 플라스미드 pACYC184-LH로 이. 콜라이 균주 W3110(ATCC27325) 및 W3110ΔgshhB를 형질전환시켰으며, 이는 이미 실시예 1에 설명한 바와 같았다. 플라스미드를 지닌 세포의 선발을 15 mg/l의 테트라사이클린을 포함하는 LB 한천 플레이트에서 실시하였다.

실시예 8: γ- 글루타밀시스테인 및 그 유도체의 분석

"전체 γ-글루타밀시스테인"이라는 용어는 γ-글루타밀시스테인, 및 이로부터 형성된 산화 생성물인 비스-γ-글루타밀시스틴 및 γ-글루타밀시스틴을 포함하는데, 이는 발효 동안 형성되어 배양 상청액 중에 축적된다. "전체 γ-글루타밀시스테인"의 농도를 HPLC 분석에 의해 결정하였다.

A. 샘플의 전처리

발효기용 샘플을 측정하기 위하여, 처음에 미생물을 원심 분리 단계 및 발효 브로쓰의 후속적인 살균 여과에 의해 제거하였다. "전체 γ-글루타밀시스테인 농도"의 정확한 측정을 위하여, 측정할 샘플 중 γ-글루타밀시스테인 유도체를 실온(22℃)에서 1시간 동안 몰 과량의 디이토트레이톨(DTT)로 환원시켰다. DTT의 환원 효과는 단지 중성 내지 알칼리 pH에서 완전히 나타나기 때문에, 필요할 경우 샘플의 pH를 진한 수산화칼륨 수용액(KOH)으로 7.0 초과의 pH로 미리 조정하였다.

B. HPLC 분석

탈염수를 이용한 상응하는 희석물의 제조 후, 20℃에서 시너지(Synergi) 4 ㎛ 히드로(Hydro)-RP 250 x 4.6 mm 컬럼(페노메넥스 리미티드(Phenomenex Ltd.), 독일 아샤펜부르크)을 이용하여 HPLC 분석을 실시하였다. 0.5% (v/v) 인산(A) 및 아세토니트릴(B)을 용출제로 사용하였다.

하기 HPLC 방법을 세포 무함유 환원 물질 혼합물로부터의 γ-글루타밀시스테인의 분리에 사용하였다.

● 유량 = 0.5 ml/min

● 다이오드 어레이 검출기(diode array detector; DAD)를 이용한 200 nm에서의 검출

● 분리를 100% A에서 등용매적으로 수행하였다.

각각의 실행 후, 컬럼을 100% B를 이용하여 헹굼 단계에 의해 세정하였다.

γ-글루타밀시스테인의 체류 시간의 측정 및 측정할 샘플 중 최종 농도의 측정을 위하여, 시그마 알드리치 게엠베하(Sigma Aldrich GmbH; 독일 스타인하임)로부터의 환원된 γ-글루타밀시스테인을 기준 물질로 사용하였다. "전체 γ-글루타밀시스테인"의 농도를 크로마토그램에서의 피크 면적으로부터 계산하였다(도 11 참조).

실시예 9: γ- 글루타밀시스테인 신테타아제 활성의 측정

γ-글루타밀시스테인 신테타아제 효소 활성의 측정을 위하여, 15 g/l의 글루코스, 5 mg/l의 비타민 B₁ 및 15 mg/l의 테트라사이클린이 보충된 30 ml의 SM1 배지(12 g/l의 K₂HPO₄, 3 g/l의 KH₂PO₄, 5 g/l의 (NH₄)₂SO₄, 0.3 g/l의 MgSO₄ x 7 H₂O, 0.015 g/l의 CaCl₂ x 2 H₂O, 0.002 g/l의 FeSO₄ x 7 H₂O, 1 g/l의 Na₃시트레이트 x 2 H₂O, 0.1 g/l의 NaCl; 1 ml/l의 미량 원소 용액으로서 0.15 g/l의 Na₂MoO₄ x 2H₂O, 2.5 g/l의 H₃BO₃, 0.7 g/l의 CoCl₂ x 6 H₂O, 0.25 g/l의 CuSO₄ x 5 H₂O, 1.6 g/l의 MnCl₂ x 4 H₂O, 0.3 g/l의 ZnSO₄ x 7 H₂O로 이루어진 것)에, 표 2에 열거된 균주의 하룻밤 배양물 2 ml를 접종하였다. 0.025의 600 nm에서의 초기 광학 밀도(OD₆₀₀)를 기반으로 하여, 30 ml의 전 배치를 30℃ 및 135 rpm에서 추가로 16시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 후속적으로 원심분리에 의해 수확하고, 세척하고 2 ml의 완충액(100 mM 트리스-HCl, pH 8.2)에 재현탁시켰다. 세포를 124 106 kPa의 압력에서 프렌치 프레스(French Press)(스펙트로닉 인스트루먼츠, 인크.(Spectronic Instruments, Inc.), 미국 뉴욕주 로체스터)에 의해 파괴하였다. Thw 조 추출물을 30 000 g에서의 원심분리에 의해 청징시키고, 시간이 지남에 따른 γ-글루타밀시스테인의 형성량을 기반으로 하여 γ-글루타밀시스테인 신테타아제 활성을 측정하였다. γ-글루타밀시스테인 형성량 분석 밑에 있는 반응 혼합물은 하기로 이루어진다:

100 mM 트리스-HCl, pH 8.2; 10 mM 글루탐산칼륨; 10 mM L-시스테인; 20 mM MgCl₂; 150 mM KCl; 20 mM ATP 및 0.25 내지 4 mg/ml의 조 추출 단백질. L-시스테인 및 글루탐산칼륨으로부터의 γ-글루타밀시스테인의 ATP 의존성 형성을 조 추출 단백질의 첨가에 의해 개시하였다. 반응 혼합물의 분취물(20 ㎕ 내지 50 ㎕)을 2시간 이상의 기간에 걸쳐 제거하였다. 그 후, γ-글루타밀시스테인 신테타아제 활성을 상기 샘플(분취물)에서 70℃에서 5분 동안 불활성화시키고, 형성된 γ-글루타밀시스테인의 함량을 HPLC로 측정하였다(실시예 8 참조). γ-글루타밀시스테인 신테타아제 활성의 단위는 25℃에서 분당 1 ㎛ol의 γ-글루타밀시스테인을 형성하는 효소의 양에 상응한다.

실시예 10: γ- 글루타밀시스테인 생성(발효)

A. 예비배양 1(진탕 플라스크):

시케인(chicane)을 갖는 1 l의 엘렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크 내의, 15 mg/l의 테트라사이클린을 포함하는 100 ml의 LB 배지에, 표 3 및 표 4에 열거된 한천 배양으로부터의 이. 콜라이 균주를 접종하고, 이를 32℃ 및 130 rpm에서 진탕기에서 7시간 동안 인큐베이션하였다.

B. 예비배양 2 (예비발효기):

대략 0.01의 광학 밀도(600 nm에서 측정)가 시작시에 발효기에 존재하도록, 타입 식스포즈(type Sixfors)(인포르스 아게(Infors AG, 스위스 보트밍겐)의 발효 배지를 채운 발효기에 각각의 예비배양물 1의 일부분을 사용하여 접종하였다. 이용한 발효기는 전체 체적이 1 l이고, 초기 작동 부피가 0.7 l였다.

발효 배지는 하기 구성 성분을 포함하였다: 3 g/l의 (NH₄)₂SO₄, 1.7 g/l의 KH₂PO₄, 0.25 g/l의 NaCl, 0.6 g/l의 MgSO₄ x 7 H₂O, 0.03 g/l의 CaCl₂ x 2 H₂O, 0.15 g/l의 FeSO₄ x 7 H₂O, 1 g/l의 Na₃시트레이트 x 2 H₂O, 5 g/l의 건조 옥수수 침지액(Cornsteep Dry; CSD) 및 3 ml/l의 미량 원소 용액(2.5 g/l의 H₃BO₃, 0.7 g/l의 CoCl₂ x 6 H₂O, 0.25 g/l의 CuSO₄ x 5 H₂O, 1.6 g/l의 MnCl₂ x 4 H₂O, 0.3 g/l의 ZnSO₄ x 7 H₂O, 0.15 g/l의 Na₂MoO₄ x 2 H₂O로 이루어짐). 이 기본 배지의 살균 후, 하기 구성 성분을 살균 조건 하에 첨가하였다: 40 g/l의 글루코스, 0.018 g/l의 비타민 B1, 0.09 g/l의 비타민 B6 및 15 mg/l의 테트라사이클린.

발효기 내의 pH를 25% NH₄OH 용액의 첨가에 의해 7.0으로 조정하였다. 발효 동안, 25% NH₄OH를 이용한 자동 보정에 의해 pH를 7.0의 값으로 유지하였다. 배양물들을 시작시에 400 rpm에서 교반하고, 분당 체적당 0.7의 체적(vvm)의 가스 유량으로 살균 필터를 통하여 살균 압축 공기로 플러싱하였다(flushed). 이들 초기 조건 하에서, 접종 전에 산소 탐침자를 100% 포화도로 정확히 조정하였다. 발효 동안의 표적 O₂ 포화도 값을 50%로 설정하였다. 상기 표적 O₂ 포화도 값 아래로 강하시에, O₂ 포화도를 표적 값으로 복구시키기 위하여 조절 캐스케이드를 개시하였다. 이 경우, 가스 공급량을 처음에 계속하여 증가시키고(최대 1.4 vvm 이하로), 교반기 속도를 1200 rpm의 최대치 이하로 계속하여 증가시켰다.

30 내지 40의 광학 밀도가 달성될 때까지(600 nm에서 측정) 32℃의 온도에서 발효를 실시하였다. 이는 대략 17시간 후 일반적으로 그러하였다.

C. 주(main) 배양(주 발효기):

사르토리우스 스테딤 게엠베하(Sartorius Stedim GmbH)(독일 괴팅겐)로부터의 타입 바이오스탯(BIOSTAT) B-DCU의 발효기에서 발효를 실시하였다. 총 체적이 2 l인 배양 용기를 1 l의 초기 작동 체적에서 사용하였다.

발효 배지는 하기 구성 성분을 포함한다: 3 g/l의 (NH₄)₂SO₄, 1.7 g/l의 KH₂PO₄, 0.25 g/l의 NaCl, 0.6 g/l의 MgSO₄ x 7 H₂O, 0.03 g/l의 CaCl₂ x 2 H₂O, 0.15 g/l의 FeSO₄ x 7 H₂O, 1 g/l의 Na₃시트레이트 x 2 H₂O, 15 g/l의 건조 옥수수 침지액(CSD) 및 3 ml/l의 미량 원소 용액(2.5 g/l의 H₃BO₃, 0.7 g/l의 CoCl₂ x 6 H₂O, 0.25 g/l의 CuSO₄ x 5 H₂O, 1.6 g/l의 MnCl₂ x 4 H₂O, 0.3 g/l의 ZnSO₄ x 7 H₂O, 0.15 g/l의 Na₂MoO₄ x 2 H₂O로 이루어짐). 이 기본 배지의 살균 후, 하기 구성 성분을 살균 조건 하에 첨가하였다: 10 g/l의 글루코스, 0.018 g/l의 비타민 B1, 0.09 g/l의 비타민 B6 및 15 mg/l의 테트라사이클린.

100 ml의 예비배양물 2를 발효 용기로 옮겨서 균주 배양물에 접종하였다. 시작시에 발효기 내의 pH를 25% NH₄OH 용액의 첨가에 의해 7.0으로 조정하고, 25% NH₄OH를 이용한 자동 보정에 의해 이 값으로 유지하였다. 배양물들을 시작시에 400 rpm에서 교반하고, 2 vvm의 가스 유량으로 살균 필터를 통하여 살균 압축 공기로 플러싱하였다. 이들 초기 조건 하에서, 접종 전에 산소 탐침자를 100% 포화도로 정확히 조정하였다. 발효 동안의 표적 O₂ 포화도 값을 50%로 설정하였다. 상기 표적 O₂ 포화도 값 아래로 강하시에, O₂ 포화도를 표적 값으로 복구시키기 위하여 조절 캐스케이드를 개시하였다. 이 경우, 가스 공급량을 처음에 계속하여 증가시키고(최대 5 vvm 이하로), 교반기 속도를 1500 rpm의 최대치 이하로 계속하여 증가시켰다.

발효를 32℃의 온도에서 실시하였다. 발효기 내의 글루코스 함량이 초기 10 g/l로부터 대략 2 g/l까지 감소하면 곧, 60% 글루코스 용액을 계속하여 첨가하였다. 발효기 내의 글루코스 농도가 이 시점으로부터 계속 2 g/l를 초과하지 않도록 공급 속도를 조정하였다. 글루코스 측정을 와이에스아이(YSI)(미국 오하이오주 옐로우 스프링즈)로부터의 글루코스 분석기를 사용하여 실시하였다.

5시간의 발효 시간 후, 황원을 살균 1.5 M (NH₄)₂SO₄ 원액(황산암모늄)의 형태로 시간당 8-17 mmol/l의 속도(평균 = 시간당 11 mmol/l)로 공급하였다.

16시간의 발효 시간 후, 살균 2.3 M 글루탐산칼륨 원액의 형태의 추가의 글루타메이트를 시간당 7.4 mmol/l의 속도로 균주 배양물에 첨가하였다.

발효 기간은 72시간이었다. DTT에 의한 환원 후, 샘플을 24시간, 48시간 및 72시간에 취하였으며, 배양 상청액 중 "전체 γ-글루타밀시스테인"의 비율을 HPLC 분석에 의해 결정하였다.

본 발명에 따른 미생물 균주는 γ-글루타밀시스테인 및 그 유도체인 비스-γ-글루타밀시스틴 및 γ-글루타밀시스틴을 과다 생산할 수 있고, 배양 배지에서의 이들 화합물의 세포외 축적을 가능하게 한다.

저먼 콜렉션 오브 마이크로오가니즘즈 앤드 셀 컬쳐즈[DSM - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)

DSM10172

19950818

SEQUENCE LISTING <110> Consortium of the electrochemical industry - Wacker Chemie AG Thoen, Dr. Marcel Schloesser, Dr. Thomas <120> Microorganism and method for overproduction of gamma-glutamylcysteine and derivatives of this dipeptide by fermentation <130> Co11216 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1557 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(1557) <223> gshA <400> 1 ttgatcccgg acgtatcaca ggcgctggcc tggctggaaa aacatcctca ggcgttaaag 60 gggatacagc gtgggctgga gcgcgaaact ttgcgtgtta atgctgatgg cacactggca 120 acaacaggtc atcctgaagc attaggttcc gcactgacgc acaaatggat tactaccgat 180 tttgcggaag cattgctgga attcattaca ccagtggatg gtgatattga acatatgctg 240 acctttatgc gcgatctgca tcgttatacg gcgcgcaata tgggcgatga gcggatgtgg 300 ccgttaagta tgccatgcta catcgcagaa ggtcaggaca tcgaactggc acagtacggc 360 acttctaaca ccggacgctt taaaacgctg tatcgtgaag ggctgaaaaa tcgctacggc 420 gcgctgatgc aaaccatttc cggcgtgcac tacaatttct ctttgccaat ggcattctgg 480 caagcgaagt gcggtgatat ctcgggcgct 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ctatgattga tactggtatt 1380 ggcggaacag gcaaagcatt tgcagaagcc taccgtaatc tgctgcgtga agagccgctg 1440 gaaattctgc gcgaagagga ttttgtagcc gagcgcgagg cgtctgaacg ccgtcagcag 1500 gaaatggaag ccgctgatac cgaaccgttt gcggtgtggc tggaaaaaca cgcctga 1557 <210> 2 <211> 518 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(518) <223> GshA <400> 2 Met Ile Pro Asp Val Ser Gln Ala Leu Ala Trp Leu Glu Lys His Pro 1 5 10 15 Gln Ala Leu Lys Gly Ile Gln Arg Gly Leu Glu Arg Glu Thr Leu Arg 20 25 30 Val Asn Ala Asp Gly Thr Leu Ala Thr Thr Gly His Pro Glu Ala Leu 35 40 45 Gly Ser Ala Leu Thr His Lys Trp Ile Thr Thr Asp Phe Ala Glu Ala 50 55 60 Leu Leu Glu Phe Ile Thr Pro Val Asp Gly Asp Ile Glu His Met Leu 65 70 75 80 Thr Phe Met Arg Asp Leu His Arg Tyr Thr Ala Arg Asn Met Gly Asp 85 90 95 Glu Arg Met Trp Pro Leu Ser Met Pro Cys Tyr Ile Ala Glu Gly Gln 100 105 110 Asp Ile Glu Leu Ala Gln Tyr Gly Thr Ser Asn Thr Gly Arg Phe Lys 115 120 125 Thr Leu Tyr Arg Glu Gly Leu Lys Asn Arg Tyr Gly Ala Leu Met Gln 130 135 140 Thr Ile Ser Gly Val His Tyr Asn Phe Ser Leu Pro Met Ala Phe Trp 145 150 155 160 Gln Ala Lys Cys Gly Asp Ile Ser Gly Ala Asp Ala Lys Glu Lys Ile 165 170 175 Ser Ala Gly Tyr Phe Arg Val Ile Arg Asn Tyr Tyr Arg Phe Gly Trp 180 185 190 Val Ile Pro Tyr Leu Phe Gly Ala Ser Pro Ala Ile Cys Ser Ser Phe 195 200 205 Leu Gln Gly Lys Pro Thr Ser Leu Pro Phe Glu Lys Thr Glu Cys Gly 210 215 220 Met Tyr Tyr Leu Pro Tyr Ala Thr Ser Leu Arg Leu Ser Asp Leu Gly 225 230 235 240 Tyr Thr Asn Lys Ser Gln Ser Asn Leu Gly Ile Thr Phe Asn Asp Leu 245 250 255 Tyr Glu Tyr Val Ala Gly Leu Lys Gln Ala Ile Lys Thr Pro Ser Glu 260 265 270 Glu Tyr Ala Lys Ile Gly Ile Glu Lys Asp Gly Lys Arg Leu Gln Ile 275 280 285 Asn Ser Asn Val Leu Gln Ile Glu Asn Glu Leu Tyr Ala Pro Ile Arg 290 295 300 Pro Lys Arg Val Thr Arg Ser Gly Glu Ser Pro Ser Asp Ala Leu Leu 305 310 315 320 Arg Gly Gly Ile Glu Tyr Ile Glu Val Arg Ser Leu Asp Ile Asn Pro 325 330 335 Phe Ser Pro Ile Gly Val Asp Glu Gln Gln Val Arg Phe Leu Asp Leu 340 345 350 Phe Met Val Trp Cys Ala Leu Ala Asp Ala Pro Glu Met Ser Ser Ser 355 360 365 Glu Leu Ala Cys Thr Arg Val Asn Trp Asn Arg Val Ile Leu Glu Gly 370 375 380 Arg Lys Pro Gly Leu Thr Leu Gly Ile Gly Cys Glu Thr Ala Gln Phe 385 390 395 400 Pro Leu Pro Gln Val Gly Lys Asp Leu Phe Arg Asp Leu Lys Arg Val 405 410 415 Ala Gln Thr Leu Asp Ser Ile Asn Gly Gly Glu Ala Tyr Gln Lys Val 420 425 430 Cys Asp Glu Leu Val Ala Cys Phe Asp Asn Pro Asp Leu Thr Phe Ser 435 440 445 Ala Arg Ile Leu Arg Ser Met Ile Asp Thr Gly Ile Gly Gly Thr Gly 450 455 460 Lys Ala Phe Ala Glu Ala Tyr Arg Asn Leu Leu Arg Glu Glu Pro Leu 465 470 475 480 Glu Ile Leu Arg Glu Glu Asp Phe Val Ala Glu Arg Glu Ala Ser Glu 485 490 495 Arg Arg Gln Gln Glu Met Glu Ala Ala Asp Thr Glu Pro Phe Ala Val 500 505 510 Trp Leu Glu Lys His Ala 515 <210> 3 <211> 951 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(951) <223> gshB <400> 3 atgatcaagc tcggcatcgt gatggacccc atcgcaaaca tcaacatcaa gaaagattcc 60 agttttgcta tgttgctgga agcacagcgt cgtggttacg aacttcacta tatggagatg 120 ggcgatctgt atctgatcaa tggtgaagcc cgcgcccata cccgcacgct gaacgtgaag 180 cagaactacg aagagtggtt ttcgttcgtc ggtgaacagg atctgccgct ggccgatctc 240 gatgtgatcc tgatgcgtaa agacccgccg tttgataccg agtttatcta cgcgacctat 300 attctggaac gtgccgaaga gaaagggacg ctgatcgtta acaagccgca gagcctgcgc 360 gactgtaacg agaaactgtt taccgcctgg ttctctgact taacgccaga aacgctggtt 420 acgcgcaata aagcgcagct aaaagcgttc tgggagaaac acagcgacat cattcttaag 480 ccgctggacg gtatgggcgg cgcgtcgatt ttccgcgtga aagaaggcga tccaaacctc 540 ggcgtgattg ccgaaaccct gactgagcat ggcactcgct actgcatggc gcaaaattac 600 ctgccagcca ttaaagatgg cgacaaacgc gtgctggtgg tggatggcga gccggtaccg 660 tactgcctgg cgcgtattcc gcaggggggc gaaacccgtg gcaatctggc tgccggtggt 720 cgcggtgaac ctcgtccgct gacggaaagt gactggaaaa tcgcccgtca gatcgggccg 780 acgctgaaag aaaaagggct gatttttgtt ggtctggata tcatcggcga ccgtctgact 840 gaaattaacg tcaccagccc aacctgtatt cgtgagattg aagcagagtt tccggtgtcg 900 atcaccggaa tgttaatgga tgccatcgaa gcacgtttac agcagcagta a 951 <210> 4 <211> 316 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(316) <223> GshB <400> 4 Met Ile Lys Leu Gly Ile Val Met Asp Pro Ile Ala Asn Ile Asn Ile 1 5 10 15 Lys Lys Asp Ser Ser Phe Ala Met Leu Leu Glu Ala Gln Arg Arg Gly 20 25 30 Tyr Glu Leu His Tyr Met Glu Met Gly Asp Leu Tyr Leu Ile Asn Gly 35 40 45 Glu Ala Arg Ala His Thr Arg Thr Leu Asn Val Lys Gln Asn Tyr Glu 50 55 60 Glu Trp Phe Ser Phe Val Gly Glu Gln Asp Leu Pro Leu Ala Asp Leu 65 70 75 80 Asp Val Ile Leu Met Arg Lys Asp Pro Pro Phe Asp Thr Glu Phe Ile 85 90 95 Tyr Ala Thr Tyr Ile Leu Glu Arg Ala Glu Glu Lys Gly Thr Leu Ile 100 105 110 Val Asn Lys Pro Gln Ser Leu Arg Asp Cys Asn Glu Lys Leu Phe Thr 115 120 125 Ala Trp Phe Ser Asp Leu Thr Pro Glu Thr Leu Val Thr Arg Asn Lys 130 135 140 Ala Gln Leu Lys Ala Phe Trp Glu Lys His Ser Asp Ile Ile Leu Lys 145 150 155 160 Pro Leu Asp Gly Met Gly Gly Ala Ser Ile Phe Arg Val Lys Glu Gly 165 170 175 Asp Pro Asn Leu Gly Val Ile Ala Glu Thr Leu Thr Glu His Gly Thr 180 185 190 Arg Tyr Cys Met Ala Gln Asn Tyr Leu Pro Ala Ile Lys Asp Gly Asp 195 200 205 Lys Arg Val Leu Val Val Asp Gly Glu Pro Val Pro Tyr Cys Leu Ala 210 215 220 Arg Ile Pro Gln Gly Gly Glu Thr Arg Gly Asn Leu Ala Ala Gly Gly 225 230 235 240 Arg Gly Glu Pro Arg Pro Leu Thr Glu Ser Asp Trp Lys Ile Ala Arg 245 250 255 Gln Ile Gly Pro Thr Leu Lys Glu Lys Gly Leu Ile Phe Val Gly Leu 260 265 270 Asp Ile Ile Gly Asp Arg Leu Thr Glu Ile Asn Val Thr Ser Pro Thr 275 280 285 Cys Ile Arg Glu Ile Glu Ala Glu Phe Pro Val Ser Ile Thr Gly Met 290 295 300 Leu Met Asp Ala Ile Glu Ala Arg Leu Gln Gln Gln 305 310 315 <210> 5 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonukleotid: gshB-del-for <400> 5 atgatcaagc tcggcatcgt gatggacccc atcgcaaaca tcaacatcaa gtgtaggctg 60 gagctgcttc 70 <210> 6 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonukleotid: gshB-del-rev <400> 6 ttactgctgc tgtaaacgtg cttcgatggc atccattaac attccggtga ccgtcgacct 60 gcagttcgaa 70 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonukleotid: gshAp-gshA-for <400> 7 agtctctaga acgttatcct tgggcgtttc 30 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonukleotid: gshAp-gshA-rev <400> 8 agcttctaga ttgtaggcct gcacatatgg tc 32 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonukleotid: gshA-OE-for <400> 9 cccgaattca tgatcccgga cgtatcaca 29 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonukleotid: gshA-OE-rev <400> 10 aaaagatctt caggcgtgtt tttccagcc 29 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonukleotid: gshA-EcoRImut-for <400> 11 tcaccatcca ctggtgtaat aaattccagc aa 32 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonukleotid: gshA-EcoRImut-rev <400> 12 attacaccag tggatggtga tattgaacat 30 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonukleotid: gshA-BglIImut-for <400> 13 cgtttcagat cgcggaacag gtctttaccc ac 32 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonukleotid: gshA-BglIImut-rev <400> 14 ctgttccgcg atctgaaacg cgtcgcgcaa 30 <210> 15 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonukleotid: tufBp-for <400> 15 agtctctaga caatgatgtt gaaaaagtgt g 31 <210> 16 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oliginukleotid: tufBp-rev <400> 16 agcttctaga agatcttacg gcgaattcca agtagcgcgc attctatgg 49 <210> 17 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonukleotid: tufBp-RBSopt-for <400> 17 gaagatctta cggcgaattc ctcctgcgcg cattct 36 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonukleotid: tufBp-RBSopt-rev <400> 18 gaattcgccg taagatcttc tagatttcag 30 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonukleotid: tufBp-10opt-for <400> 19 gaattcctcc tgcgcgcatt atatggagac at 32 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonukleotid: tufBp-10opt-rev <400> 20 aatgcgcgca ggaggaattc gccgtaagat 30 <210> 21 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonukleotid: tufBp-35opt-for <400> 21 atatggagac atgcgagttc tgtcaactaa aaaa 34 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonukleotid: tufBp-35opt-rev <400> 22 gaactcgcat gtctccatat aatgcgcgca 30 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonukleotid: serA-NcoI-for <400> 23 agtcccatgg cgcagatgaa atcaacg 27 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonukleotid: serA-SacI-rev <400> 24 tcaggagctc ttagtacagc agacgggcgc 30

Claims

모균주(parent strain)로부터 제조될 수 있는, γ-글루타밀시스테인, 비스-γ-글루타밀시스틴 및 γ-글루타밀시스틴을 과다 생산할 수 있는 원핵 미생물 균주로서, 상기 균주는 모균주와 비교하여 감소된 세포 글루타티온 신테타아제 활성을 가지며, 유사하게 감소된 세포 글루타티온 신테타아제 활성을 갖는 균주에서보다 더 크게 증가된 세포 γ-글루타밀시스테인 신테타아제 활성을 갖는 것인, 미생물 균주.
제1항에 있어서, 본 발명에 따른 균주에서의 글루타티온 신테타아제 활성은 상기 활성이 상응하는 야생형 균주의 글루타티온 신테타아제 활성의 50% 이하이도록 감소된 것인 미생물 균주.
제1항 또는 제2항에 있어서, 세포 γ-글루타밀시스테인 신테타아제 활성은 유사하게 감소된 세포 글루타티온 신테타아제 활성을 갖는 균주에서보다 대략 5배 이상 더 높은 것인 미생물 균주.
제1항 또는 제2항에 있어서, 모균주는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis) 종의 구성원인 미생물 균주.
제1항 또는 제2항에 있어서, 모균주는 γ-글루타밀시스테인의 생합성 경로, 및 상응하는 모균주와 비교하여 상승된 L-시스테인 생합성 능력을 갖는 미생물 균주인 미생물 균주.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상승된 γ-글루타밀시스테인 신테타아제 활성은 gshA 유전자 또는 gshA 상동체의 카피수(copy number)의 증가에 의해 또는 gshA의 발현을 증가시키는 프로모터의 사용에 의해 달성되는 것인 미생물 균주.
제1항 또는 제2항에 있어서, gshA 또는 gshA 상동체의 카피수가 프로모터의 제어 하에 플라스미드 벡터 내로의 클로닝에 의해 증가되는 것인 미생물 균주.
제1항 또는 제2항에 있어서, GshA가, 494 위치의 아미노산 알라닌이 발린 또는 류신으로 교환되거나(A494V 또는 A494L) 또는 495 위치의 아미노산 세린이 트레오닌으로 교환된(S495T) 단백질 서열을 갖는 것인 미생물 균주.
제1항 또는 제2항에 있어서, gshA 유전자의 천연 시작 코돈 TTG가 ATG로 대체된 것인 미생물 균주.
제1항 또는 제2항에 따른 미생물 균주를 발효 배지에서 배양하고, 세포를 배지로부터 제거하고, 요망되는 생성물을 배양 배지로부터 정제하는, γ-글루타밀시스테인(γGC) 및 이 디펩티드의 유도체, γ-글루타밀시스틴 및 비스-γ-글루타밀시스틴의 과다 생산 방법.