KR20140134524A

KR20140134524A - Device for detection of tumor cells and detecting method thereof

Info

Publication number: KR20140134524A
Application number: KR1020130054533A
Authority: KR
Inventors: 이성우; 강지윤; 정효일
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2013-05-14
Filing date: 2013-05-14
Publication date: 2014-11-24
Also published as: KR101508974B1

Abstract

According to the present invention, a device and a method to detect tumor cells are allowed to detect tumor cells using the difference in size between tumor and non-tumor cells, where a filter is installed in the inner channel wall of the detection chips included in the detection device; thus the method and the device are not affected by the speed and amount of blood sample which goes through the channel.

Description

종양 세포의 검출장치 및 검출방법{Device for detection of tumor cells and detecting method thereof}BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method for detecting tumor cells,

본 발명은 종양세포를 검출하는 신규한 장치 및 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a novel apparatus and method for detecting tumor cells.

종양 세포는 악성 진행의 초기 단계에서 기원 종양 덩어리로부터 유래된다. 전이는 이러한 세포의 일부가 기원 종양으로부터 해부학적으로 몸의 멀리 떨어져 있는 장소에서 새로운 종양을 형성하기 위해 말초 혈액을 통해 이동할 때 발생할 수 있다. 전이는 고형 종양 환자에서 암 관련 사망의 가장 흔한 원인이다. 혈류 내에서 순환하며 이동중인 종양 세포(Circulating tumor cells: 이하 “CTC”)는 전이의 주된 이유로서, 이러한 종양세포들의 검출은 진단과 암 환자의 임상 관리 모두에 유용한 방법이며 전이가 발생하기 전에 치료 효능을 예측할 수 있게 해준다. 그러나, 순환하는 종양세포는 1억 개의 정상 혈액 세포당 1~5개 내외의 수로 존재하므로 매우 희박해서 검출하기가 어렵다는 문제가 있다. Tumor cells originate from the tumor mass at the initial stage of malignant progression. Metastasis can occur when a portion of these cells travels through peripheral blood to form a new tumor at a location remote from the body anatomically from the origin of the tumor. Metastasis is the most common cause of cancer-related death in solid tumors. Circulating tumor cells (CTCs) circulating in the bloodstream are the main reason for metastasis. Detection of these tumor cells is a useful method for both diagnosis and clinical management of cancer patients. It can predict the efficacy. However, there is a problem that circulating tumor cells are present in a range of about 1 to 5 cells per 100 million normal blood cells, which is very rare and difficult to detect.

상기와 같은 순환하는 종양세포를 검출하기 위한 기술로는 말초 혈액에서 순환하는 종양세포를 감지하고 수량화를 하기 위한 것이 있다. 이 기술은 몇몇 수동 전처리 과정이 요구되는 핵산 기반 검출 기술을 제외하고는 크게 순환하는 종양세포 검출 기술은 항체 기반의 검출기술인 친화력 기반 기술과 물리적 요소에 의해 분리하는 비 친화 기반 기술로 나눌 수 있다. Techniques for detecting such circulating tumor cells include those for detecting and quantifying tumor cells circulating in peripheral blood. Except for nucleic acid-based detection techniques, which require several manual pretreatment procedures, this technique can be broadly divided into affinity-based technologies, which are antibody-based detection technologies, and non-affinity based technologies, which are separated by physical factors.

가장 일반적으로 사용되는 항체 기반 기술은 순환하는 종양세포를 포획하기 위해 내피세포 점착분자(EpCAM) 항체가 도포된 미세 구조물을 사용하는 것이다. 그리고 이와 관련하여 부족한 항체와 종양 세포의 친화력을 높이기 위해 다양한 구조재료와 코팅 방법, 좀더 친화력이 좋은 항체를 찾기 위한 연구가 진행되고 있으나, 이러한 친화력 기반의 검출 방법은 세포와 항체 사이의 접촉이 완벽하지 않다는 문제점이 있다. 이 문제를 해결하기 위하여 항체가 코팅된 구조물의 형상을 변화시키거나, 세포들의 유동을 조절하는 방법, 항체에 의해 포획된 종양 세포를 분석하기 위해 다시 수거하는 장치 등이 개발되었지만, 그 방법이 복잡하고 여전히 포획률이 낮다. 이외에도 친화력을 사용한 또 다른 방법으로 유일하게 FDA에 승인된 종양세포 검출 기술인 항체가 코팅된 자화 비드를 사용한 기술이 있지만, 항체가 코팅된 자화 비드가 종양 세포에 균일하게 점착되기 어렵고, 세포에 붙은 자화 비드가 자석에 잘 반응하지 않는다는 문제점이 있다. 또한 항체 특성 때문에 일부 종양 세포를 검출하지 못하거나 작은 혈액 세포까지 포획이 된다는 단점이 있다.The most commonly used antibody-based technology is the use of microstructures coated with endothelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies to capture circulating tumor cells. In order to increase the affinity between the antibody and the tumor cell, a variety of structural materials, coating methods, and antibodies having better affinity are being investigated. However, There is a problem that it is not. To solve this problem, there has been developed a method of changing the shape of an antibody coated structure, a method of regulating the flow of cells, and a device for collecting the antibody again to analyze the tumor cells captured by the antibody. However, And the capture rate is still low. Another method using affinity is the only FDA-approved technology for detecting tumor cells, antibody-coated magnetized beads. However, magnetically coated bead coated with antibodies hardly uniformly adheres to tumor cells, and magnetization There is a problem that the bead does not react well with the magnet. Also, because of the characteristics of the antibody, some tumor cells can not be detected or even small blood cells are captured.

항체를 쓰지 않는 기법으로는 일반적으로 혈액 세포에 비해 종양 세포의 큰 크기에 따라 필터에 의해 개별적으로 종양 세포를 분리시키는 방법이 있다. 종양 세포들은 유연하기 때문에 필터에 잘 포획되지 않는다. 이를 해결하기 위한 종래기술로는 필터의 형상을 3차원으로 제작한 기술이 있으나, 이러한 필터는 혈액 세포에 의해 잘 막힌다는 문제가 있다. 또한, 이를 해결하기 위하여 필터의 형상을 슬릿 형태로 만든 장치가 개발되었지만, 비슷한 크기의 종양 세포와 혈액 세포 때문에 포획율과 순수도가 낮다는 단점이 있었다. 그리하여 종양 세포의 크기를 증가시키기 위해 세포에 항체가 코팅된 비드를 붙이는 방법, 항체를 사용하지 않고 세포의 전지적인 특성을 이용하는 방법이 개발되었으나, 시스템이 복잡하고 세포의 성질을 변화시킬 수 있다는 한계가 있다. 따라서, 주로 포획되거나 분리된 종양 세포의 계수 이외에만 사용되어 왔다. 또 다른 방법으로 세포의 미세 유동 특성과 미세 구조물을 이용하는 방법이 있는데, 이 방법은 비드나 전기를 이용하지 않아서 간단하지만 혈액과 같은 고밀도 시료에는 바로 사용하지 못하고, 순수도가 낮다는 문제가 있다. Techniques that do not use antibodies generally involve isolating tumor cells individually by a filter according to the large size of the tumor cells as compared to blood cells. Because the tumor cells are flexible, they are not well captured in the filter. In order to solve this problem, there is a technique of forming the shape of the filter three-dimensionally. However, such a filter has a problem that it is blocked by blood cells. In order to solve this problem, a slit-shaped filter has been developed, but tumor cells and blood cells of similar size have a disadvantage of low capture rate and low purity. In order to increase the size of tumor cells, a method of attaching antibody-coated beads to cells and a method of using cell characteristics of cells without using antibodies have been developed. However, . Thus, it has been used primarily only in the counting of captured or isolated tumor cells. Another method is to utilize microfluidic properties and microstructures of cells. This method is simple because it does not use beads or electricity, but it can not be used directly in high density samples such as blood, and has a problem of low pure water.

마지막으로 상기와 같은 종래 기술들을 복합적으로 사용하는 검출 방법이 있지만, 시스템이 매우 복잡하고 순수도가 낮아지거나, 종양 세포들의 손실을 가져온다는 문제가 있다.Finally, although there is a detection method using a combination of the above conventional techniques, there is a problem that the system is very complicated, the pure water is low, or the tumor cells are lost.

대한민국 공개특허공보 제10-2003-0021159호Korean Patent Publication No. 10-2003-0021159

본 발명은 종양세포의 높은 포획효율과 순수도를 갖는 신규한 검출장치 및 검출방법을 제공하고자 한다.The present invention seeks to provide a novel detection apparatus and detection method having high capture efficiency and purity of tumor cells.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 일 실시 예는 종양세포 검출장치로서, 종양세포 검출 칩을 포함하고, 상기 종양세포 검출 칩은 혈액시료가 이동하는 하나 이상의 채널을 포함하며, 상기 채널의 벽면의 적어도 일부가 혈액시료에 포함된 종양세포를 포획하는 필터로 구성된 종양세포 검출장치를 제공한다.In order to accomplish the above object, an embodiment of the present invention is a tumor cell detection apparatus comprising a tumor cell detection chip, wherein the tumor cell detection chip includes at least one channel through which a blood sample moves, Wherein at least a portion of the filter captures the tumor cells contained in the blood sample.

또한 본 발명의 다른 일 실시 예는 종양세포 검출방법으로서, 혈액시료를 채널에 통과시키면서, 혈액시료 내에 포함된 종양세포를 채널 벽면의 필터를 구성하는 필터 유닛들 사이의 간격에 포획하는 단계를 포함하는 종양세포 검출방법을 제공한다. Another embodiment of the present invention is a method for detecting a tumor cell, comprising the step of capturing tumor cells contained in a blood sample at intervals between filter units constituting a filter on a channel wall surface while passing a blood sample through a channel The present invention provides a method for detecting tumor cells.

본 발명에 따른 종양세포 검출장치 및 검출방법은 검출장치에 포함된 검출 칩 내의 채널 측면, 즉 벽면의 적어도 일부가 일정 간격을 두고 배열된 필터 유닛으로 구성된 필터로 이루어짐으로써, 채널을 통과하는 혈액 시료의 유속 및 유량에 영향을 받지 않고 종양세포, 특히 순환하는 종양세포를 그 외 일반세포와 크기의 차이를 이용하여 검출해낼 수 있다. 상기와 같은 검출장치 내에 포함된 검출 칩은 기존의 순환하는 종양세포 분리를 위한 기존의 미세유체 칩보다 간단하다. 또한 높은 포획율과 순수도를 갖는 검출장치 및 검출방법을 제공할 수 있다. 이는 기존에 사용되고 있는 필터 및 유사 포획과 같은 검출 방법보다 검출 효율이 향상된 것이다.The tumor cell detection device and the detection method according to the present invention comprise a filter including a filter unit having at least a portion of a channel side surface, that is, a wall surface, arranged at a predetermined interval in a detection chip included in a detection device, The tumor cells, especially the circulating tumor cells, can be detected using the difference in size with other normal cells without being affected by the flow rate and the flow rate of the cells. The detection chip contained in such a detection device is simpler than conventional microfluidic chips for conventional circulating tumor cell separation. It is also possible to provide a detection device and a detection method having a high capture rate and a pure water level. This is an improvement of the detection efficiency compared with the detection methods such as the filter and the similar trap which are used in the past.

이로써 본 발명에 따른 종양세포의 검출장치 및 검출방법은 의약 분야뿐만 아니라 미세 분석 시스템을 필요로 하는 여러 분야에서 다양하게 활용할 수 있다.Thus, the apparatus and method for detecting tumor cells according to the present invention can be utilized variously in various fields requiring a micro analysis system as well as a medical field.

도 1의 (a)는 미세 필터 유닛을 배열시킨 설계 도면, (b)는 검출 칩 내에서의 세포의 유동 궤적, (c)는 실제 제작한 PDMS 미세 검출 칩을 나타낸 도이다.
도 2는 실제 종양세포(Tumor cell, MCF-7)가 필터에 포획되는 모습(a)과 혈액세포(Blood cell, Jurkat)가 필터를 통과하는 모습(b)을 관찰한 현미경 사진을 나타낸 도이다.
도 3은 다양한 구조의 채널과 필터를 전기 회로로 나타낸 모식도이다.
도 4(a)는 필터의 구조적 변화에 대한 각 필터에서 속도와 유량 비, 도 4(b) 채널의 구조적 변화에 대한 각 필터에서 시료의 유속과 유량 비를 나타낸 것이다. 여기서, 유량 비는 각 필터 유량에 대한 주 채널의 유량이다.
도 5는 본 발명의 일 실시 예에 따른 (a)단일 필터 및 (b)다중 필터에 포획된 세포들의 사진이다.
도 6은 (a) 필터 유닛 사이 간격(Filter size) 및 유량(Flow rate)에 따른 종양세포(MCF-7)와 혈액세포(Jurkat)의 포획율, (b) 유량(Flow rate)에 따른 포획된 종양 세포의 순수도, (c) 필터 유닛들의 폭(D)과 길이(G)의 변화에 대한 종양 세포들의 포획 효율, (d) 채널의 폭(W)과 길이(L)의 변화에 대한 종양 세포들의 포획 효율을 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 필터 유닛의 종양세포 검출항체로 표면처리 유무(w/EpCAM, w/o EpCAM)에 따른 종양세포와 혈액세포의 (a)포획효율 및 (b)순수도를 필터 유닛 사이의 간격 크기(Filter size) 별로 비교하여 나타낸 것이다.
도 8은 (a) 단일 필터에서의 포획된 세포 수, (b) 다중 필터에서의 포획된 세포 수, (c) 단일 필터(single filter) 및 다중 필터(multi filter)에서의 포획효율 및 (d) 순수도를 나타낸 도이다.
도 9는 단일 필터(a, b)와 다중 필터(c, d)를 사용한 경우의 세포 포획모습을 나타낸 것으로, 이중 (a) 및 (c)는 일반 혈액을, (b) 및 (d)는 적혈구를 제외한 혈액을 시료로 사용한 것이다.
도 10은 단일 필터와 다중 필터를 사용한 경우의 (a)세포 포획율과 (b)순수도를 나타낸 것이다.
도 11은 필터 구조의 수치를 최적화하기 위하여 필터 구조의 수치에 대한 종양세포의 포획효율을 비교하여 나타낸 도이다.Fig. 1 (a) is a schematic view showing the arrangement of fine filter units, Fig. 2 (b) is a flow trace of cells in the detection chip, and Fig. 2 (c) is a diagram showing a PDMS microdetection chip actually produced.
FIG. 2 is a microscope photograph showing an actual tumor cell (Tumor cell, MCF-7) captured by a filter and a blood cell (Blood cell, Jurkat) passing through a filter (b) .
3 is a schematic diagram showing an electric circuit of a channel and a filter of various structures.
Fig. 4 (a) shows the velocity and flow ratio in each filter for the structural change of the filter, and Fig. 4 (b) shows the flow rate and flow rate of the sample in each filter for the structural change of the channel. Here, the flow ratio is the flow rate of the main channel to each filter flow rate.
Figure 5 is a photograph of cells captured in (a) a single filter and (b) multiple filters according to one embodiment of the present invention.
FIG. 6 is a graph showing the capture rate of tumor cells (MCF-7) and blood cells (Jurkat) according to the filter size and flow rate between filter units, (b) (C) the capture efficiency of the tumor cells with respect to changes in the width (D) and length (G) of the filter units, (d) the change in the width (W) and length Lt; RTI ID = 0.0 > tumor cells. &Lt; / RTI >
FIG. 7 shows the (a) capture efficiency and (b) purity of tumor cells and blood cells according to presence or absence of surface treatment (w / EpCAM, w / o EpCAM) (Filter Size).
Fig. 8 is a graph showing the relationship between (a) the number of captured cells in a single filter, (b) the number of captured cells in the multiple filters, (c) the capture efficiency in a single filter and a multi- ) &Lt; / RTI >
FIG. 9 shows a state of cell capture when a single filter (a, b) and a multiple filter (c, d) are used, wherein (a) and (c) The blood was used as a sample except red blood cells.
10 shows (a) cell capture rate and (b) purity when a single filter and multiple filters are used.
11 is a graph comparing the capture efficiency of tumor cells with respect to the numerical value of the filter structure to optimize the numerical value of the filter structure.

본 명세서에서 "순환하는 종양세포(Circulating Tumor Cells; CTC)"라 함은, 혈류 내에서 이동중인 종양 세포를 의미하는 것으로서, 혈류의 위치 및 종양의 종류를 불문하는 최광의의 개념이다.
The term " circulating tumor cells (CTC) "as used herein means a tumor cell that is moving in the bloodstream, and is a concept of the best regardless of the location of blood flow and the type of tumor.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명의 일 실시 예는, In one embodiment of the present invention,

종양세포 검출 칩을 포함하고,A tumor cell detection chip,

상기 종양세포 검출 칩은 혈액시료가 이동하는 하나 이상의 채널을 포함하며, Wherein the tumor cell detection chip comprises one or more channels through which a blood sample travels,

상기 채널의 벽면의 적어도 일부가 혈액시료에 포함된 종양세포를 포획하는 필터로 구성된 종양세포 검출장치를 제공한다. And at least a part of a wall surface of the channel captures tumor cells contained in a blood sample.

본 발명의 일 실시 예로서 상기 필터는 일정 간격을 두고 배열된 필터 유닛들로 구성되고, 각 필터 유닛 사이의 간격에 종양세포가 포획된다.In one embodiment of the present invention, the filter is composed of filter units arranged at regular intervals, and tumor cells are captured at intervals between the filter units.

본 발명의 일 실시 예로서 상기 검출 칩은 채널로 혈액시료를 공급하는 시료 투입구 및 채널 밖으로 혈액시료를 배출시키는 시료 배출구를 더 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 실시 예는 종양세포로서 혈액 내를 순환하는 종양세포(Circulating tumor cells: CTC)를 대상으로 한다.In an embodiment of the present invention, the detection chip may further include a sample inlet for supplying a blood sample to the channel and a sample outlet for discharging a blood sample out of the channel. In addition, one embodiment of the present invention is directed to tumor cells (Circulating Tumor Cells (CTC) circulating in the blood.

본 발명의 일 실시 예에 따른 상기 검출 장치는 기존의 항체를 사용하여 종양세포를 검출하는 장치의 경우 종양세포의 포획율이 낮다는 문제점을 극복하기 위하여, 혈액 내의 종양세포와 일반 혈액세포, 즉 비종양 세포와의 크기와 유연성의 차이를 이용하여 물리적으로 검출한다. 이로써 항체의 사용을 배제하면서도 높은 포획율을 제공할 수 있다.In order to overcome the problem that the capture rate of tumor cells is low in the case of a device for detecting tumor cells using an existing antibody, the detection device according to an embodiment of the present invention can be applied to tumor cells in blood and general blood cells, Physically detect using size and flexibility differences with non-tumor cells. This can provide a high capture rate while eliminating the use of antibodies.

기존의 항체를 사용하지 않은 방법 중 미세간격을 갖는 필터를 사용하는 방법은 종양 세포의 유연성과 직접적인 유체 유동 때문에 종양세포의 크기가 그 외 일반 혈액세포의 크기보다 더 큼에도 불구하고 미세간격을 갖는 필터 밖으로 잘 빠져나가고, 크기가 작은 혈액 세포까지 검출이 되므로 포획율과 그 순수도가 높지 않다는 단점이 있었다. 또한, 종양 세포와 크기가 비슷한 일부 혈액 세포들이 오히려 이러한 미세 간격 구조물에 더 잘 포획된다는 문제가 있었다. 구체적으로, 필터를 이용한 방법에서 종양 세포가 포획되는 원리는 세포 크기에 기반을 두고 있는데, 혈액 세포 중 저켓(Jurkat)은 약 20% 정도, 백혈구는 80%까지 세포 크기가 종양 세포와 비슷하다. 그래서 기존의 필터가 설치된 칩은 순수도가 많이 낮았다. 즉 필터 유닛 사이의 간격을 작게 하면 종양 세포의 포획 효율은 좋아지지만 순수도는 낮아진다. 반대로 필터 유닛 사이의 간격을 크게 하면 순수도는 좋아지지만 포획 효율은 급속히 떨어졌다. 또한 유동 방향으로 설치된 필터의 구조는 유량에 영향을 많이 받아 포획된 세포들이 다시 탈출하게 되는 경향이 있었다. 더욱이 종양 세포는 세포막이 불안정해서 잘 변형되므로 좁은 필터 사이에 잘 들어가기 때문에, 높은 유속이 발생하면 필터를 탈출하게 된다. Among the non-antibody-based methods, the use of a filter with fine spacing has been shown to be beneficial because of the flexibility of the tumor cells and due to the direct fluid flow, the size of tumor cells is larger than the size of other normal blood cells, It has a disadvantage in that the capture rate and the purity thereof are not high since the blood cell is easily extracted from the filter and even small blood cells are detected. In addition, some blood cells that are similar in size to tumor cells are more likely to be trapped in these micro-spacing structures. Specifically, the principle of the capture of tumor cells in the filter-based method is based on the cell size. The cell size of the blood cells is about 20% for Jurkat and 80% for white blood cells. So the chip with the existing filter installed was much lower in pure water. That is, if the interval between the filter units is made smaller, the efficiency of capturing tumor cells is improved but the purity is lowered. On the contrary, when the interval between the filter units is increased, the pure water is improved, but the trapping efficiency is rapidly decreased. Also, the structure of the filter installed in the flow direction was influenced by the flow rate, and the captured cells tended to escape again. Moreover, because tumor cells are well deformed due to unstable cell membranes, they enter well between narrow filters, so that if a high flow rate occurs, the filter will escape.

이에, 본 발명은 일 실시 예로서 필터를 검출 칩 채널의 측면, 즉 벽면에 설치함으로써 장치를 단순화시키면서도 상기와 같은 문제점을 극복하고 순수도를 효과적으로 향상시킬 수 있다. 즉, 종양세포의 세포막은 매우 불안정하기 때문에 필터에 포획된 세포들은 직접적인 유동에 의해 필터의 벽으로부터 떨어지는데, 본 발명의 검출장치는 혈액시료 내 종양세포의 직접적인 강한 유동을 피하기 위해 채널의 벽면의 전부 또는 일부에 필터를 설치한 구조를 가짐으로써 채널의 벽면에 위치한 필터에 포획된 세포는 유동에 의한 전단력(shear force)을 많이 받지 않으면서 잘 포획된다. 그리고 일반적인 혈액세포는 종양 세포보다 세포막이 작아 필터에 포획되지 않고, 크기가 큰 혈액세포는 종양세포처럼 유연하지 않으므로 변형이 종양 세포보다 잘 되지 않아 좁은 필터를 구성하는 필터 유닛들 사이의 간격에 들어가기가 힘들다. 따라서 전단 유동에 의해 채널 밖으로 배출된다.Accordingly, the present invention can simplify the device by installing the filter on the side of the detection chip channel, that is, on the wall surface, and overcome the above-described problems and effectively improve the pure water. That is, since the cell membrane of the tumor cell is very unstable, the cells trapped in the filter are separated from the wall of the filter by the direct flow. The detection apparatus of the present invention is characterized in that all of the wall surfaces of the channel Or a structure in which a filter is installed in a part, cells captured by the filter located on the wall surface of the channel are well trapped without being subjected to shear force due to flow. In addition, normal blood cells are smaller than the tumor cells and are not captured by the filter. The larger blood cells are not as flexible as the tumor cells, so that the deformation is not better than the tumor cells, and thus the gap between the filter units constituting the narrow filter It is difficult. Therefore, it is discharged out of the channel by the shear flow.

본 발명의 일 실시 예로서 종양세포 검출장치에 포함되는 검출 칩의 재료는 제한되지 않으나, PDMS(polydimethylsiloxane), 슬라이드 글라스 등을 사용할 수 있다. 또한 제조방법은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 시료가 이동하는 채널 및 필터를 형성할 수 있는 공정이라면 모두 사용될 수 있으며, 예를 들면 식각 공정으로 제조할 수 있다(도 1의 (a)참조). 이 칩에는 각각 1개의 시료 투입구와 시료배출구 및 하나 이상의 채널, 구체적으로 4~40개, 4~28개 또는 4~20개의 채널이 포함될 수 있다. 칩의 채널 높이는 20~70μm 또는 30~50μm일 수 있다.As one embodiment of the present invention, the material of the detection chip included in the tumor cell detection device is not limited, but PDMS (polydimethylsiloxane), a slide glass, or the like can be used. In addition, the production method can be used as long as it is a process capable of forming a channel and a filter in which a sample commonly used in the art can be moved, and can be manufactured, for example, by an etching process (see FIG. The chip may include one sample inlet, one sample outlet and one or more channels, specifically 4 to 40, 4 to 28, or 4 to 20 channels. The channel height of the chip may be 20 to 70 占 퐉 or 30 to 50 占 퐉.

본 발명의 일 실시 예인 도 1을 예로 들면, 도 1의 (a) 는 사각형 형태의 칩과 시료 투입구(Inlet) 및 시료 배출구(Outlet)를 나타낸 것이다. 그리고 칩의 입구에 주입된 혈액 시료에 포함된 종양세포(Tumor cell) 및 혈액세포(Blood cell)들은 일정 유량에 의해 채널 속으로 흐른다(도 1의 (b)참조). 이때 W는 시료가 이동하는 채널의 폭, D는 필터를 구성하는 필터 유닛(Filter Unit)의 폭, G는 필터 유닛 한 개의 가로방향 길이, F는 필터 유닛 사이의 간격을 의미한다. 채널을 따라 흘러다니는 세포들은 채널의 벽면에 있는 필터 쪽으로 움직이며, 채널 속의 세포들은 모두 필터 쪽으로 흘러 가게 된다. 이때 세포들이 필터를 구성하는 필터 유닛들(각 채널 벽면에 배열된 벽돌모양의 유닛) 사이의 간격(F)보다 작으면 그대로 채널로 빠져나간다. 그러나 세포들이 필터 유닛들 사이의 간격보다 더 크면 필터, 즉 필터 유닛 사이의 간격에 포획된다. 포획된 세포들은 모양이 변해서 필터에 고정되고, 그렇지 않은 세포들은 계속 흐르는 전단 유체에 의해 다시 채널로 빠져나간다. 세포들에 의해 막힌 필터에서는 유동이 점점 줄어들거나 없어진다. 그러면 세포들은 다음에 있는 필터로 이동하게 된다. 또한, 큰 종양 세포에 의해 한 필터 유닛 사이의 간격이 막히면 작은 혈액 세포들은 다른 필터 유닛 사이로 이동하게 된다. 도 2는 실제 종양세포(Tumor cell, MCF-7)가 필터에 포획되는 모습(a)과 혈액세포(Blood cell, Jurkat)가 필터를 통과하는 모습(b)을 관찰한 현미경 사진을 나타낸 것으로, 종양세포의 경우 모두 필터유닛 사이의 간격에 포획되어 있는 반면 혈액 세포는 필터유닛 사이의 간격보다 크기가 작아서 필터에 포획되지 않고 통과함을 확인할 수 있다. 1, which is an embodiment of the present invention, FIG. 1 (a) shows a rectangular chip, a sample inlet, and a sample outlet. Tumor cells and blood cells contained in a blood sample injected into the entrance of the chip flow into the channel at a constant flow rate (see FIG. 1 (b)). In this case, W represents the width of the channel through which the sample moves, D represents the width of the filter unit constituting the filter, G represents one transverse length of the filter unit, and F represents the interval between the filter units. The cells flowing along the channel move toward the filter on the wall surface of the channel, and all the cells in the channel flow toward the filter. At this time, if the cells are smaller than the interval (F) between the filter units (brick-like units arranged on each channel wall surface) constituting the filter, they exit to the channel as they are. However, if the cells are larger than the spacing between the filter units, they are trapped in the spacing between the filters, i.e. filter units. The captured cells change shape and are fixed on the filter, and the cells that are not so pass through the channel again by the shear fluid that continues to flow. In a filter blocked by cells, the flow gradually decreases or disappears. The cells then move to the next filter. Further, when the gap between the filter units is blocked by the large tumor cells, the small blood cells move between the different filter units. FIG. 2 is a microscope photograph showing an actual tumor cell (Tumor cell, MCF-7) captured by a filter and a blood cell (Blood cell, Jurkat) passing through a filter (b) In the case of tumor cells, all of the blood cells are trapped in the space between the filter units, while the blood cells are smaller than the interval between the filter units, so that they can pass without being caught by the filter.

이들 필터 유닛들은 채널의 벽면에 있고, 각 필터 유닛의 길이, 폭, 유닛들 사이의 간격과 필터가 설치된 채널의 길이, 폭은 다양하게 변화시킬 수 있다. 또한 검출 칩 내의 필터는 단일 또는 다중 필터일 수 있다. 단일 필터는 검출 칩의 각 면에 한 개의 채널, 즉 채널이 한 겹으로 칩의 각 면에 설치되고 그 채널의 벽면에 필터가 설치된 것이다. 다중 필터는 검출 칩의 각 면에 복수 개의 채널, 즉 채널이 칩의 각 면에 병렬로 여러 겹 설치되고 그 채널의 각 벽면에 필터가 설치된 것이다. 이때 다중 필터의 필터 유닛은 일반적인 암 전이 환자의 종양 세포 수에 대응하는 개수로 설치될 수 있다. These filter units are on the wall surface of the channel, and the length and width of each filter unit, the distance between the units, and the length and width of the channel in which the filter is installed can be variously changed. The filters in the detection chip may also be single or multiple filters. The single filter has one channel on each side of the detection chip, that is, one side of the channel is provided on each side of the chip, and a filter is installed on the wall surface of the channel. The multiple filter has a plurality of channels, that is, channels on each side of the detection chip, in multiple layers in parallel on each side of the chip, and a filter is installed on each wall surface of the channel. At this time, the filter unit of the multiple filters can be installed in a number corresponding to the number of tumor cells in a general cancer metastasis patient.

본 발명의 일 실시 예로서, 본 발명의 검출장치는 하기와 같이 채널과 각 필터 유닛의 길이, 폭, 간격 등을 조절하여 포획율을 향상시킬 수 있다.As an embodiment of the present invention, the detection device of the present invention can improve the trapping rate by adjusting the length, width, interval, etc. of the channel and each filter unit as described below.

본 발명의 검출장치는 채널의 폭이 클수록, 길이가 작을수록 채널과 필터의 유량비가 감소하여 혈액시료 내의 세포들이 필터 쪽으로 더 잘 흐를 수 있으므로 종양 세포의 포획율이 증가할 수 있다. 이에 본 발명의 일 실시 예로서 상기 채널의 길이(L)는 6~18mm, 구체적으로 12mm, 채널의 폭(W)은 100~300μm, 구체적으로 300 μm일 수 있다.In the detection apparatus of the present invention, the larger the channel width and the smaller the length, the smaller the flow rate of the channel and the filter, and the cells in the blood sample flow more toward the filter, so that the capture rate of the tumor cells may increase. In one embodiment of the present invention, the length L of the channel may be 6 to 18 mm, specifically 12 mm, and the width W of the channel may be 100 to 300 μm, specifically 300 μm.

또한, 본 발명의 검출장치는 필터를 구성하는 필터 유닛 사이의 간격 크기(G)와 필터 유닛의 폭(D)이 클수록 종양세포들이 더 잘 포획된다. 이에 필터의 포획율을 향상시키는 관점에서 본 발명의 일 실시 예로서 상기 필터 유닛의 폭(D)은 25~100μm, 구체적으로 40~60 μm, 보다 구체적으로 50μm, 필터 유닛 사이의 간격(F)은 8~16μm, 구체적으로 10~14μm, 보다 구체적으로 12μm일 수 있다. 필터 유닛 사이의 간격이 12μm보다 크면 세포들이 필터 사이를 빠져나가서 포획율이 떨어지기 시작하며, 예를 들어 약 16μm인 경우에는 대부분의 세포들이 빠져나가서 거의 포획되지 않는다. 또한, 상기 필터 유닛의 길이(G)는 50~300μm, 구체적으로 200μm일 수 있다. Further, in the detection apparatus of the present invention, the larger the gap size G between the filter units constituting the filter and the larger the width D of the filter unit, the better the tumor cells are captured. In order to improve the trapping rate of the filter, the width D of the filter unit is preferably 25 to 100 袖 m, specifically 40 to 60 袖 m, more specifically 50 袖 m, May be 8 to 16 占 퐉, specifically 10 to 14 占 퐉, more specifically 12 占 퐉. If the distance between the filter units is larger than 12 탆, the cells pass through the filters and the capturing rate begins to decrease. For example, in the case of about 16 탆, most of the cells escape and are hardly trapped. The length (G) of the filter unit may be 50 to 300 mu m, specifically 200 mu m.

본 발명은 다른 일 실시 예로서 상기 혈액시료의 유량을 조절함으로써 포획된 세포들 중 종양세포의 순수도를 증가시킬 수 있으며, 유량에 따라 세포의 활성화도 달라진다. 이에 상기 혈액시료의 유량은 0.5~1.5mL/hr, 구체적으로 0.8~1.2mL/hr, 보다 구체적으로 1.0mL/hr일 수 있다. 유량이 0.5mL/hr 미만인 경우는 대부분의 세포들이 채널의 바닥이나 벽에 점착될 수 있으며, 1.5mL/hr 초과인 경우에는 세포들이 파괴될 수 있다.According to another embodiment of the present invention, the flow rate of the blood sample may be controlled to increase the purity of the tumor cells among the captured cells, and the activation of the cells may vary depending on the flow rate. The flow rate of the blood sample may be 0.5-1.5 mL / hr, specifically 0.8-1.2 mL / hr, more specifically 1.0 mL / hr. If the flow rate is less than 0.5 mL / hr, most of the cells may adhere to the bottom or wall of the channel, and if the flow rate exceeds 1.5 mL / hr, the cells may be destroyed.

한편, 본 발명은 또 다른 일 실시 예로서 상기 검출장치의 필터를 종양세포 검출항체로 표면 처리할 수 있다. 이때 종양세포 검출항체는 예를 들어 Hur2 및 바이오피닐레이트 마우스 안티-휴먼 안티-EpCAM(Biotinylated mouse anti-human anti-EpCAM)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있으며, 구체적으로 바이오피닐레이트 마우스 안티-휴먼 안티-EpCAM을 사용할 수 있다. 그리고 상기 항체는 필터를 구성하는 필터 유닛들이 서로 마주보는 면에 표면 처리될 수 있다. 표면처리는 표면 침전방법에 의해 코팅됨으로써 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.On the other hand, as another embodiment of the present invention, the filter of the detection device can be surface-treated with a tumor cell detection antibody. At this time, the tumor cell detection antibody may be one or more selected from the group consisting of, for example, Hur2 and biotinylated mouse anti-human anti-EpCAM, - Human Anti-EpCAM can be used. And the antibody can be surface-treated on the surfaces of the filter units constituting the filter facing each other. The surface treatment may be performed by coating by a surface precipitation method, but is not limited thereto.

필터 유닛 사이의 간격(F)이 12 μm 이하인 경우에는 필터 유닛을 항체로 표면 처리하는데 따른 포획율 증가 효과가 나타나지 않지만, 필터 유닛 사이의 간격(F)이 종양세포보다 클 경우, 예를 들면 12 μm 초과인 경우에는 필터 유닛들 사이에서 항체가 세포들을 점착하기 때문에 항체로 표면 처리하지 않은 경우보다 포획율이 향상된다. 이에 상기와 같이 필터를 항체로 표면 처리하는 경우의 필터 유닛 사이의 간격(F)은 12~16 μm 일 수 있다. 다만 이 경우 종양세포 외의 세포들도 함께 포획되기 쉬어 순수도는 감소할 수 있다.In the case where the interval F between the filter units is 12 μm or less, there is no effect of increasing the trapping rate due to the surface treatment of the filter unit with the antibody. However, if the interval F between the filter units is larger than the tumor cells, μm, the capture rate is improved compared to the case where the antibody is not surface-treated with the antibody because the antibody adheres to the cells between the filter units. Thus, when the filter is surface-treated with an antibody, the interval F between the filter units may be 12 to 16 μm. However, in this case, cells outside the tumor cells can be trapped together, and the purity can be reduced.

일반적으로 혈액 1ml에 들어있는 세포들은 대략 백혈구가 10⁶ 개, 적혈구가 10⁹ 인데, 본 발명의 검출장치에 이러한 혈액이 그대로 들어있는 시료를 공급할 경우에는 실제 검출 칩 내의 유량은 다소 감소하게 된다. 이는 혈액세포가 검출 칩에서 유동할 때 수많은 적혈구들의 흐름에 의해 쉽게 부서지기 때문이다. 이에 본 발명은 일 실시 예로서 채널을 통과하는 혈액시료에서 적혈구를 제거하여 사용할 수 있다.In general, the cells contained in 1 ml of blood have approximately 10 ⁶ white blood cells and 10 ⁹ red blood cells. When a sample containing such blood is supplied to the detection apparatus of the present invention, the flow rate in the actual detection chip is somewhat reduced. This is because blood cells are easily broken by the flow of many red blood cells when they flow in the detection chip. Therefore, the present invention can be used by removing red blood cells from a blood sample passing through a channel.

한편, 본 발명은 다른 일 실시 예로서 종양세포의 검출방법을 제공한다. 상기 검출방법은 혈액시료를 채널에 통과시키면서, 혈액시료 내에 포함된 종양세포를 채널 벽면의 필터를 구성하는 필터 유닛들 사이의 간격에 포획하는 단계를 포함한다. 또한 일 실시 예로서 상기 혈액시료 내에 포함된 비종양 세포 및 포획되지 않은 종양세포가 채널 밖으로 빠져나가는 단계를 더 포함할 수 있다. In another aspect, the present invention provides a method for detecting tumor cells. The detection method includes capturing the tumor cells contained in the blood sample at intervals between filter units constituting the filter on the channel wall surface while passing the blood sample through the channel. In one embodiment, the non-tumor cells and the non-captured tumor cells contained in the blood sample may be passed out of the channel.

상기 방법은 앞서 기술한 바와 같이 종양세포와 백혈구, 적혈구, 림프구 등과 같은 일반 혈액세포와의 세포크기, 세포막 유연성의 차이에 의해 필터로 분리하여 검출하는 방법이다.As described above, the above method is a method of separating and detecting by a filter the difference in cell size and cell membrane flexibility between tumor cells and general blood cells such as leukocytes, red blood cells, lymphocytes and the like.

이때 상기 종양세포 검출방법은 앞서 기술한 본 발명에 따른 종양세포의 검출장치를 이용하여 수행할 수 있다. 또한, 상기 종양세포 검출방법은 필터 유닛들 사이의 간격에 포획된 세포들을 형광항체와 결합시켜 포획된 세포들이 종양세포인지 여부를 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다.
Herein, the method for detecting tumor cells can be performed using the apparatus for detecting tumor cells according to the present invention described above. In addition, the method for detecting a tumor cell may further include binding cells captured at intervals between filter units with a fluorescent antibody to confirm whether the captured cells are tumor cells.

이하, 본 발명을 하기의 실시 예 및 시험 예를 통하여 설명한다. 실시 예 및 시험 예는 본 발명을 보다 상세히 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 하기의 실시예의 범위로 제한되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described with reference to the following examples and test examples. The examples and the test examples are for illustrating the present invention in more detail, and the scope of the present invention is not limited to the range of the following examples.

또한, 이 기술분야의 통상의 지식을 가진 자이면 누구나 이 발명의 기술 사상의 범주를 이탈하지 않고 첨부한 특허청구범위 내에서 다양한 변형 및 모방이 가능함은 명백한 사실이다.
It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made in the present invention without departing from the scope of the invention.

[실시 예 1 및 2] 검출 칩의 제조[Examples 1 and 2] Preparation of detection chip

하기 시험예 1~8을 수행하기 위하여, 본 발명의 일 실시 예로서 종양세포 검출장치에 포함되는 검출 칩을 당 업계에서 통상적으로 사용되는 식각 공정으로 제조하였다(도 1의 (a)). 이때 검출 칩은 채널이 칩의 네 개의 각 면에 1 개씩 설치된 단일 필터방식(실시 예 1)과 채널이 칩의 네 개의 각 면에 5 개씩 병렬로 설치된 다중 필터 방식(실시 예 2)으로 나누어 각각 제조하였다. In order to carry out the following Test Examples 1 to 8, a detection chip included in a tumor cell detection apparatus as an embodiment of the present invention was produced by an etching process commonly used in the art (Fig. 1 (a)). At this time, the detection chip is divided into a single filter system (Example 1) in which channels are arranged on each of four sides of a chip (Example 1) and a multiple filter system in which channels are arranged in parallel on each of four sides of a chip .

먼저 웨이퍼 몰드에 사용된 형광저항체는 SU-8 2050(해외제조사: 마이크로텍, 한국판매회사: K1솔루션)이고, 검출 칩은 PDMS (polydimethylsiloxane)와 슬라이드 글라스로 제작되었다. 상기 실시 예 1 및 2의 칩에는 각각 시료 투입구와 시료배출구가 1개씩 설치되었다. 그리고 필터가 설치된 채널 높이는 40μm, 채널의 길이(L)는 각각 6, 12 또는 18mm이며, 폭(W)은 100, 200 또는 300μm, 채널의 벽면에 위치하는 각 필터 유닛의 길이(G)는 100, 200 또는 300μm, 각 필터 유닛의 폭(D)은 25, 50 또는 100μm, 각 필터 유닛 사이의 간격(F)은 8~16μm로 다양하게 제조되었다. 그리고 단일 필터방식(실시 예 1)에는 총 360개, 다중 필터 방식(실시 예 2)에는 총 1050 개의 필터들을 설치하였다.
First, the fluorescent resistor used in the wafer mold was SU-8 2050 (overseas manufacturer: Microtek, Korea sales company: K1 solution), and the detection chip was made of PDMS (polydimethylsiloxane) and slide glass. Each of the chips of Examples 1 and 2 was provided with one sample inlet and one sample outlet. The length L of each of the filter units located on the wall surface of the channel is 100, 200 or 300 μm, and the length L of the filter unit is 40 μm. , 200 or 300 mu m, the width D of each filter unit is 25, 50 or 100 mu m, and the interval F between the filter units is 8 to 16 mu m. A total of 360 filters are installed in the single filter system (Embodiment 1), and a total of 1050 filters are installed in the multi filter system (Embodiment 2).

[실시 예 3] 칩의 전기회로 모의 실험[Embodiment 3] Simulation of electric circuit of chip

본 실시예에서는 이미 많이 통용되고 있는 유체유동과 전기회로 사이의 유사성을 기초로 하여, 미세 필터를 통한 흐름을 등가 전기회로에 의해 표현하고(도 3), 채널들과 필터들 사이의 유동 저항 비율을 각각 살펴보았다. In this embodiment, the flow through the fine filter is represented by an equivalent electric circuit (FIG. 3), and the flow resistance ratio between the channels and the filters Respectively.

먼저, 각 필터 유닛의 길이(G)는 100, 200, 300 μm, 각 필터 유닛 사이의 간격(F)은 12μm, 필터 유닛의 폭(D)은 25, 50, 100 μm였다. 그리고 이 필터가 설치된 채널의 길이(L)는 각각 6, 12, 18mm, 폭(W)은 100, 200, 300μm, 채널의 높이는 40μm로 설계하였다. 단일 필터 칩은 360개, 다중 필터 칩은 1050 개의 필터들을 설계하였다. 단일 필터 칩은 채널이 네 개의 면에 1 개씩, 다중 필터 칩은 칩의 네 개의 면에 5개씩 설치되도록 설계하였다. 세포들에 의해 필터가 막혔을 때, 이 필터의 저항값은 변한다. 그래서 유체는 다음 필터로 흐른다. 이 모의 실험에서 각 저항값은 필터와 채널의 치수 비율이며 실제 칩에서 필터 유닛 사이의 간격과 비례한다. 이에 따라 각 필터에 흐르는 전류의 값은 유량, 전압은 압력으로 대치하였다. 즉, 실제 유입된 유량 1mL/hr을 1mA로 치환하여 모의 실험을 하였다. 이 모의실험에서 필터의 개수는 실제 칩의 1/10이다.First, the lengths G of the respective filter units were 100, 200 and 300 μm, the interval F between the respective filter units was 12 μm, and the widths D of the filter units were 25, 50 and 100 μm. The length (L) of the channel in which the filter is installed is 6, 12 and 18 mm, the width (W) is 100, 200 and 300 μm, and the channel height is 40 μm. We designed 360 single filter chips and 1050 multi filter chips. The single filter chip is designed so that one channel is provided on each of four sides, and the multiple filter chip is installed on each of the four sides of the chip. When the filter is clogged by cells, the resistance value of this filter changes. So the fluid flows to the next filter. In this simulation, each resistance value is the ratio of the dimensions of the filter to the channel, and is proportional to the spacing between the filter units in the actual chip. Accordingly, the values of the current flowing through each filter were replaced by the flow rate and the voltage by the pressure. In other words, simulation was performed by replacing the actual flow rate 1 mL / hr with 1 mA. In this simulation, the number of filters is one tenth of the actual chip.

모의 실험 결과는 도 4(a) 및 (b)에 나타나 있다. 도 4(a)의 그래프 첫 번째 단은 필터 유닛의 폭(D)과 길이(G)가 변화했을 때 각 필터 유닛의 순서(filter order)마다 발생하는 유속(velocity, 전류)를 보여준다. 유속은 첫 번째와 마지막 필터 유닛에서 20~25 mm/sec로 가장 높았고, 최저 유속은 중간에 위치한 필터 유닛들에서 나왔다. 이 결과에서 필터의 유속은 필터 유닛의 폭과 길이에 크게 영향을 받지 않음을 알 수 있다. 두 번째 단은 각 필터 유닛 사이 채널에서의 유속에 대한 결과이다. 처음과 끝 그리고 중간에서 유속은 최고가 되고, 중간으로 갈수록 유속은 떨어졌으나, 필터 유닛의 폭과 필터 유닛 길이는 유속에 큰 영향을 주지 않았다. 마지막 단은 각 필터 유닛에 대한 채널의 유량 비(Flow rate ratio of channel/filter)를 보여준다. 중간으로 갈수록 유량 비의 차이가 커졌고, 필터 유닛의 폭이 클수록, 그리고 필터 유닛의 길이가 작을수록 유량 비는 감소하였다. 이때 세포들이 필터 쪽으로 더 잘 흐른다는 것을 알 수 있다. 도 4(b)의 그래프는 채널의 변화에 따른 결과값을 보여주는 것으로, 도 4(a)의 그래프에서의 결과와 유사하다. 이들 결과를 종합해보면 채널 폭(W)은 클수록 길이(L)는 작을수록 채널과 필터 유닛 사이의 유량 비가 감소하여 세포들을 잘 포획한다는 것을 알 수 있다.
Simulation results are shown in Figs. 4 (a) and 4 (b). The first stage of the graph of FIG. 4 (a) shows the flow velocity (velocity, current) generated for each filter unit order when the width D and the length G of the filter unit are changed. The flow rate was highest at 20 to 25 mm / sec in the first and last filter unit, and the lowest flow rate was in the middle of the filter units. It can be seen from this result that the flow rate of the filter is not greatly affected by the width and length of the filter unit. The second stage is the result of the flow rate in the channel between each filter unit. At the beginning, the end and the middle, the flow rate was the highest, and the flow rate was decreased toward the middle, but the filter unit width and the filter unit length did not influence the flow rate. The last stage shows the flow rate ratio of the channel / filter for each filter unit. The difference between the flow ratios increased in the middle, the flow ratio decreased as the width of the filter unit increased and as the length of the filter unit decreased. At this point, we can see that the cells flow better towards the filter. The graph of Fig. 4 (b) shows the result according to the change of the channel, and is similar to the result of the graph of Fig. 4 (a). These results indicate that the larger the channel width (W) is, the smaller the length (L) is, and the smaller the flow ratio between the channel and the filter unit is, the better the cells are captured.

[실시 예 4]순환하는 종양세포의 검출 준비 및 확인방법[Example 4] Preparation and identification of circulating tumor cells

본 발명의 일 실시 예로서 하기에 기술되는 실제로 순환하는 종양세포를 검출하는 실험(시험 예 1~9)을 실시함에 있어서 하기와 같은 준비과정을 실시하였다. 그리고 검출 칩의 필터에 포획된 종양세포의 확인을 위하여는 하기와 같은 면역-형광 염색 과정을 실시하였다.
As an example of the present invention, the following preparation procedure was carried out in the experiments (Test Examples 1 to 9) for detecting actually circulating tumor cells described below. In order to identify the tumor cells trapped in the filter of the detection chip, the following immuno-fluorescence staining procedure was performed.

세포 배양과 혈액시료 준비Cell culture and blood sample preparation

인간 유방암 세포(MCF-7)주와 혈액 세포주(Jurkat clone E6-1)를 37℃의 온도와 5% CO₂ 그리고 습한 조건에서 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% 페니실린을 추가한 1.5mL 글루타민이 함유된 RPMI(Rosewell Park Memorial Institue) 배양배지에서 배양하였다. 이때 인간 유방암 세포주(MCF-7)와 혈액 세포주(Jurkat clone E6-1)는 한국세포주은행에서 획득하였으며, 세포배양배지(RPMI)는 인비트로젠(Invitrogen)으로부터 구매하였다.Human breast cancer cell line (MCF-7) and blood cell line (Jurkat clone E6-1) were inoculated at 37 ° C in 5% CO ₂ and humidified with 1.5% fetal bovine serum and 1% penicillin And cultured in RPMI (Rosewell Park Memorial Institue) culture medium containing glutamine. At this time, human breast cancer cell line (MCF-7) and blood cell line (Jurkat clone E6-1) were obtained from Korean cell line bank and cell culture medium (RPMI) was purchased from Invitrogen.

그 다음 상기 세포들을 혈구 계산기를 사용하여 계수하였다. 그리고 이를 앞서 사용한 배지와 동일한 배지인 RPMI 배양배지와 PBS(phosphate buffer solution)로 다중 희석하였다. 세포 활성도는 트리판블루(TrypanBlue; ABD Bio-Quest Co.) 시약을 통해 확인하였다. 이 테스트는 살아있는 세포 내의 에스터라아제(esterase)의 활성화와 죽은 세포의 세포막 원형질의 무결성에 기초를 두고 있다. 상기 시료들은 항응고제(EDTA)가 들어있는 진공채혈 관에 수집하였고, 24시간 안에 처리하였다.
The cells were then counted using a hemocytometer. Then, the RPMI medium and the PBS ( phosphate buffer solution . Cell activity was determined by trypan blue (ABD Bio-Quest Co.) reagent. This test is based on the activation of esterases in living cells and the integrity of cell membrane protoplasm of dead cells. The samples were collected in a vacuum blood collection tube containing anticoagulant (EDTA) and treated within 24 hours.

순환하는 종양세포의 확인을 위한 면역-형광 염색Immuno-fluorescent staining for identification of circulating tumor cells

검출 칩에 포획된 세포들을 칩 안에서 1mL/hr 유량 속의 PBS에 희석된 4% PFA (paraformaldehyde)에 15분 동안 고정하였다. 그 다음 세포들은 1X PBS에 세척하고, 세포 내 염색을 위해 PBS에 희석이 된 0.2% Triton X-100에 30분 동안 노출하였다. 일부 포획된 혈액(Jurkat) 세포들이나 림프구들을 확인하기 위해 형광항체(anti-CD45-FITC; 50㎕ / 1mL PBS)를 24시간 동안 칩에 흘렸으며, 초과된 항체를 제거하기 위해 PBS로 세척하였다. 또한 종양 세포의 확인을 위해서 형광항체(anti-Cytokeratin-PE; 50㎕ / 1mL PBS)를 24시간 동안 칩에 흘렸으며, PBS로 세척하였다. Cells captured on the detection chip were fixed in 4% PFA (paraformaldehyde) diluted in PBS at a flow rate of 1 mL / hr for 15 min. The cells were then washed in 1X PBS and exposed to 0.2% Triton X-100 diluted in PBS for 30 minutes for intracellular staining. Fluorescent antibodies (anti-CD45-FITC; 50 μl / 1 mL PBS) were spiked on the chip for 24 h to identify some captured Jurkat cells or lymphocytes and washed with PBS to remove excess antibodies. In order to identify tumor cells, a fluorescent antibody (anti-Cytokeratin-PE; 50 μl / 1 mL PBS) was spilled on the chip for 24 hours and washed with PBS.

이때 항체들로서 anti-Cytokeratin-PE(CAM 5.2, conjugated to phycoerythrin(PE)), anti-CD45-FITC(CD45 conjugated to FITC)은 BD 바이오사이언스(BD Biosciences)으로부터 구매하였다.Anti-Cytokeratin-PE (CAM 5.2), conjugated to phycoerythrin (PE) and anti-CD45-FITC were purchased from BD Biosciences.

마지막으로, 세포 핵의 확인을 위해 1mL DAPI(6-diamidino-2-phenylindole)(4㎕ / 1mL 증류수) 용액을 5분 동안 칩에 흘렸으며, PBS로 세척하였다. 이후 칩은 형광의 고정을 위해 모든 유동관이 제거되고, 건조를 막기 위해 칩을 유체가 든 용기 위에 장착하고, 이를 4℃의 어두운 냉장고에 보관하였다. 이때 형광 세포핵 염색시약(6-diamidino-2-phenylindole, (DAPI))은 BD 바이오사이언스(BD Biosciences)으로부터 구매하였다.
Finally, 1 mL of 6-diamidino-2-phenylindole (4 μl / 1 mL distilled water) solution was spilled on the chip for 5 minutes and washed with PBS to confirm the nucleus of the cells. Afterwards, all the flow tubes were removed to fix the fluorescence, and the chip was mounted on a container with fluid to prevent drying, and it was stored in a dark refrigerator at 4 ° C. At this time, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) was purchased from BD Biosciences.

[시험 예 1]단일 필터와 다중 필터의 비교[Test Example 1] Comparison between a single filter and multiple filters

실시 예 4에서 준비한 혈액시료를 실시 예 1 및 2의 검출 칩의 시료 투입구에 공급하여 세포들을 채널 벽면의 필터로 이동시켰다. 이때 혈액시료에는 종양세포(MCF-7) 10⁴개, 혈액세포(Jurkat) 10⁶개가 포함되었고, 유량은 1 m/hr였다. 채널의 폭(W)은 300μm, 길이(L)는 18 mm, 필터 유닛 사이의 간격(F)은 12μm, 필터 유닛의 폭(D)은 50μm, 필터 유닛의 길이(G)는 200 μm였다.The blood sample prepared in Example 4 was supplied to the sample inlet of the detection chip of Examples 1 and 2 to move the cells to the filter on the channel walls. Blood samples contained 10 ⁴ tumor cells (MCF-7) and 10 ⁶ blood cells (Jurkat), and the flow rate was 1 m / hr. The width W of the channel was 300 mu m, the length L was 18 mm, the interval F between the filter units was 12 mu m, the width D of the filter unit was 50 mu m and the length G of the filter unit was 200 mu m.

그 결과, 단일 필터(실시 예 1, 도 5의 (a))과 다중 필터(실시 예 2, 도 5의 (b))에서 모두 각 필터 유닛 사이의 간격마다 세포들이 각각 1개씩 포함되어 있는 것으로 보아, 단일 필터 및 다중 필터 모두 세포들의 포획율이 우수함을 알 수 있다.
As a result, in the single filter (Example 1, Fig. 5A) and the multiple filters (Example 2 and Fig. 5B), one cell was included for each interval between filter units It can be seen that the capture rate of the cells is excellent in both the single filter and the multiple filters.

[시험 예 2]유량과 필터 유닛 사이의 간격크기에 따른 포획율 비교[Test Example 2] Comparison of the capture rate according to the flow amount and the gap between the filter units

실시 예 4에서 준비한 혈액시료를 실시 예 1 및 2의 검출 칩의 시료 투입구에 공급하여 세포들을 채널 벽면의 필터로 이동시켰다. 이때 혈액시료에는 종양세포(MCF-7) 10⁶개, 혈액세포(Jurkat) 10⁶개가 포함되었고, 채널의 폭(W)은 300μm, 길이(L)는 18 mm, 필터 유닛의 폭(D)은 50 μm, 필터 유닛의 길이(G)는 200 μm였다. 필터 유닛 사이의 간격(F)은 각각 8~16 μm이며, 유량은 각각 0.5, 1, 1.5 m/hr였다. The blood sample prepared in Example 4 was supplied to the sample inlet of the detection chip of Examples 1 and 2 to move the cells to the filter on the channel walls. The blood sample is of tumor cells (MCF-7) 10 ⁶ dogs, blood cells (Jurkat) 10 was included ^six, a width (W) of the channel is 300μm, the length (L) is 18 mm, the width (D) of the filter unit And the length (G) of the filter unit was 200 μm. The spacing (F) between the filter units was 8 to 16 μm and the flow rates were 0.5, 1 and 1.5 m / hr, respectively.

검출결과로부터 유량과 필터 유닛 사이의 간격(Filter size)에 대한 세포의 포획 효율을 분석하여 도 6의 (a)에 나타내었다. 혈액 세포에 비해 크기가 큰 종양 세포들이 필터 유닛에 더 잘 포획되었고, 혈액 세포들은 필터에 잘 포획되지 않았다. 이 실험에서 유량은 세포 포획에 큰 영향을 주지 못하였다. 그러나 유량이 0.5mL/hr 보다 작을 때에는 대부분의 세포들이 채널의 바닥이나 벽에 점착되었으며, 1.5mL/hr 보다 클 경우에는 세포들이 파괴되었다. 즉 세포의 활성화는 유량의 영향을 받았다. 이 실험에서 종양 세포들은 필터 유닛 사이의 간격이 12μm 보다 작은 필터에서 포획율이 85%로 높게 나타났으나, 12μm 보다 큰 필터에서는 세포들이 필터 사이를 빠져나가서 포획율이 떨어졌다. 그리고 혈액 세포는 필터 유닛 사이의 간격이 작은 필터에서도 대부분 통과하여 포획되지 않았다. 그리하여 필터 유닛 사이의 간격이 16μm인 필터에서는 대부분 세포들이 빠져나가서 거의 포획되지 않았다. 그래서 필터 유닛 사이의 간격이 16μm인 필터에서는 종양세포와 혈액세포들의 포획율이 비슷하였다.
From the detection result, the capture efficiency of the cells with respect to the flow rate and the filter size between the filter units is analyzed and shown in FIG. 6 (a). Tumor cells larger than blood cells were better captured in the filter unit, and blood cells were not well captured in the filter. In this experiment, flow rate did not have a large effect on cell capture. However, when the flow rate was less than 0.5 mL / hr, most of the cells adhered to the bottom or wall of the channel, and when the flow rate was more than 1.5 mL / hr, the cells were destroyed. In other words, cell activation was affected by flow rate. In this experiment, tumor cells showed a high capture rate of 85% in filters with a filter unit spacing of less than 12 μm, but in the case of filters larger than 12 μm, the cells passed through the filter and the capture rate dropped. And the blood cells did not pass through most of the filters even though the gap between the filter units was small. Thus, in a filter having a gap of 16 μm between filter units, most of the cells escaped and were hardly trapped. Thus, the capture rate of tumor cells and blood cells was similar in a filter with a gap of 16 μm between filter units.

[시험 예 3]유량에 따른 종양세포의 순수도 비교[Test Example 3] Purity comparison of tumor cells by flow rate

실시 예 4에서 준비한 혈액시료를 실시 예 1 및 2의 검출 칩의 시료 투입구에 공급하여 세포들을 채널 벽면의 필터로 이동시켰다. 이때 혈액시료에는 종양세포(MCF-7) 10⁶개, 혈액세포(Jurkat) 10⁶개가 포함되었고, 채널의 폭(W)은 300μm, 길이(L)는 18 mm, 필터 유닛의 폭(D)은 50 μm, 필터 유닛의 길이(G)는 200μm, 필터 유닛 사이의 간격(F)은 12μm였다. 유량은 각각 0.5, 1, 1.5 mL/hr였다. The blood sample prepared in Example 4 was supplied to the sample inlet of the detection chip of Examples 1 and 2 to move the cells to the filter on the channel walls. The blood sample is of tumor cells (MCF-7) 10 ⁶ dogs, blood cells (Jurkat) 10 was included ^six, a width (W) of the channel is 300μm, the length (L) is 18 mm, the width (D) of the filter unit The length (G) of the filter unit was 200 mu m, and the interval (F) between the filter units was 12 mu m. The flow rates were 0.5, 1, and 1.5 mL / hr, respectively.

도 6의 (b)는 유량(Flow rate)에 대한 종양 세포의 순수도를 나타낸 것으로, 유량이 0.5, 1, 1.5 mL/hr일 때 모두 종양 세포의 순수도가 90% 이상 모두 높았다. 그리고 유량이 증가할수록 순수도는 증가하였다.
Figure 6 (b) shows the purity of the tumor cells relative to the flow rate. When the flow rates were 0.5, 1, and 1.5 ml / hr, the purity of the tumor cells was more than 90%. As the flow rate increased, the purity increased.

[시험 예 4]필터 유닛의 폭, 길이에 따른 종양세포의 포획효율 비교[Test Example 4] Comparison of capturing efficiency of tumor cells according to the width and length of the filter unit

실시 예 4에서 준비한 혈액 세포 시료를 실시 예 1 및 2의 검출 칩의 시료 투입구에 공급하여 세포들을 채널 벽면의 필터로 이동시켰다. 이때 혈액시료에는 종양세포(MCF-7) 10³개, 혈액세포(Jurkat) 10⁶개가 포함되었고, 유량은 1.0mL/hr였다. 그리고 채널의 폭(W)은 300μm, 길이(L)는 18mm, 필터 유닛 사이의 간격(F)은 12μm, 필터 유닛의 폭(D)은 25, 50, 100μm, 필터 유닛의 길이(G)는 100, 200, 300μm였다.The blood cell samples prepared in Example 4 were supplied to the sample input ports of the detection chips of Examples 1 and 2 to move the cells to the filter on the channel walls. Blood samples contained 10 ³ tumor cells (MCF-7), 10 ⁶ blood cells (Jurkat), and the flow rate was 1.0 mL / hr. The width W of the channel is 300 μm, the length L is 18 mm, the interval F between the filter units is 12 μm, the width D of the filter unit is 25, 50 and 100 μm, 100, 200, and 300 占 퐉.

도 6의 (c)는 각 필터 유닛의 폭과 길이에 따른 종양세포의 포획효율을 분석하여 나타낸 것으로, 각 필터 유닛의 폭과 길이가 클수록 종양 세포들은 더 잘 포획되었다. 따라서 필터 유닛 사이의 간격, 필터 유닛의 폭과 길이는 각각 12μm, 50μm, 200μm 일 때 가장 포획효율이 우수하였다.
FIG. 6 (c) shows analysis of the capture efficiency of tumor cells according to the width and length of each filter unit. The larger the width and length of each filter unit, the better the tumor cells were captured. Therefore, the trapping efficiency was the best when the interval between the filter units, the width and the length of the filter unit were 12 μm, 50 μm, and 200 μm, respectively.

[시험 예 5]채널의 폭과 길이에 따른 종양세포의 포획효율 비교[Test Example 5] Comparison of capturing efficiency of tumor cells according to channel width and length

실시 예 4에서 준비한 혈액시료를 실시 예 1 및 2의 검출 칩의 시료 투입구에 공급하여 세포들을 채널 벽면의 필터로 이동시켰다. 이때 혈액시료에는 종양세포(MCF-7) 10³개, 혈액세포(Jurkat) 10⁶개가 포함되었고, 유량은 1.0ml/hr였다. 그리고 채널의 폭(W)은 각각 100, 200, 300 μm, 길이(L)는 6, 12, 18 mm, 필터 유닛 사이의 간격은 12μm, 필터 유닛의 폭(D)은 50μm, 필터 유닛의 길이(G)는 200 μm였다.The blood sample prepared in Example 4 was supplied to the sample inlet of the detection chip of Examples 1 and 2 to move the cells to the filter on the channel walls. Blood samples contained 10 ³ tumor cells (MCF-7), 10 ⁶ blood cells (Jurkat), and the flow rate was 1.0 ml / hr. The width W of the channel is 100, 200 and 300 μm, the length L is 6, 12 and 18 mm, the interval between the filter units is 12 μm, the width D of the filter unit is 50 μm, (G) was 200 mu m.

도 6의 (d)는 상기 채널의 폭과 길이의 변화에 따른 종양세포의 포획효율을 분석하여 나타낸 것으로, 채널의 폭(W)이 넓을수록 종양 세포들은 더 잘 포획되었다. 그러나 채널의 길이에 대한 포획율은 전기 시뮬레이션 결과와 비교할 때 잘 맞지 않았다. 결과적으로 채널의 폭과 길이가 각각 300μm, 12mm일 때 가장 포획효율이 우수하였다.
FIG. 6 (d) shows the capture efficiency of the tumor cells according to the change of the width and the length of the channel. The wider the channel width W, the better the tumor cells were captured. However, the capture rate for the length of the channel did not fit well with the electrical simulation results. As a result, the trapping efficiency was the best when the channel width and length were 300 μm and 12 mm, respectively.

[시험 예 6]필터의 종양세포 검출항체로 표면처리 유무에 따른 포획효율 비교[Test Example 6] Comparison of trapping efficiency with the presence or absence of the surface treatment of the filter cell tumor antibody

본 발명의 일 실시 예로서 검출 칩의 필터에 종양세포 검출항체로 표면 처리할 경우의 포획효율을 표면 처리하지 않은 경우와 비교하는 실험을 실시하였다. 구체적으로, 종양세포 검출항체는 종양 세포들에 반응하고 필터에 있는 세포들을 고정시키는 역할을 하므로, 크기가 큰 종양 세포가 변형과 더불어 항체에 의해 어떤 영향을 받는지 알아보았다. 또한, 일부 큰 혈액 세포는 채널 벽면의 필터와 전단유동의 환경에서 어떻게 반응하는지 알아보았다.As an embodiment of the present invention, an experiment was conducted to compare the capture efficiency when the surface of a filter of a detection chip with a tumor cell detection antibody was not treated with a surface treatment. Specifically, the tumor cell detection antibody reacts with tumor cells and fixes the cells in the filter. Therefore, we examined how large tumor cells are affected by the antibody as well as the deformation. We also investigated how some large blood cells respond to the channel wall filter and shear flow environment.

먼저, 실시 예 1 및 2의 검출 칩의 필터에 종양세포 검출 항체(Biotinylated mouse anti-human anti-EpCAM, 이하 EpCAM; R&D Systems)를 필터 면에 코팅하였다. First, the filter surface of the detection chips of Examples 1 and 2 was coated with a biotinylated mouse anti-human anti-EpCAM (hereinafter referred to as EpCAM; R & D Systems).

구체적으로, 에탄올 용매에 트리에톡시실란(APTS)을 첨가하여 1%(v/v)의 용액을 제조하고 이를 슬라이드 글라스에 30분 동안 SAM(Self-Assembled Monolayers)코팅하였다. 그 다음, 증류수로 이를 30분 동안 세척하고 60℃의 오븐에서 건조시켰다. 그리고 나서 글루타알데하이드(glutaraldehyde)를 증류수에 첨가하여 1%(v/v)의 용액을 제조하여, 이를 사용하여 상기 SAM 코팅된 슬라이드 글라스에 다시 30분 동안 글루타알데하이드 단백질 코팅을 진행하였다. 그 다음, 1% PBS(Phosphate Buffered Saline) 용액으로 30분 동안 세척하였다. 그리고 종양항체(EpCAM) 20μL을 500μL의 1% PBS 용액에 혼합하고 이를 1시간 동안 상기 슬라이드글라스에 코팅하였다. 그 다음 1% PBS 용액으로 1시간 동안 세척하고, 1% BSA(Bovine serum albumin) 용액으로 1시간 동안 코팅한 후, 다시 1% PBS 용액으로 1시간 동안 세척하였다.Specifically, 1% (v / v) solution was prepared by adding triethoxysilane (APTS) to an ethanol solvent and self-assembled monolayers (SAM) were coated on a slide glass for 30 minutes. It was then washed with distilled water for 30 minutes and dried in an oven at 60 ° C. Glutaraldehyde was then added to distilled water to make a 1% (v / v) solution, which was used to conduct the glutaraldehyde protein coating onto the SAM coated slide glass for another 30 minutes. Then, it was washed with 1% PBS (Phosphate Buffered Saline) solution for 30 minutes. Then, 20 μL of tumor antibody (EpCAM) was mixed with 500 μL of a 1% PBS solution and coated on the slide glass for 1 hour. Then, the cells were washed with 1% PBS solution for 1 hour, coated with 1% BSA (Bovine serum albumin) solution for 1 hour, and then washed with 1% PBS solution for 1 hour.

그 다음, 실시 예 4에서 준비한 혈액시료를 실시 예 1 및 2의 검출 칩의 시료 투입구에 공급하여 세포들을 채널 벽면의 필터로 이동시켰다. 이때 혈액시료에는 종양세포(MCF-7) 10⁴개, 혈액세포(Jurkat) 10⁶개가 포함되었고, 유량은 1.0mL/hr였다. 그리고 채널의 폭(W)은 300μm, 길이(L)는 18mm, 필터 유닛 사이의 간격(F, filter size)는 8~16μm, 필터 유닛의 폭(D)은 50μm, 필터 유닛의 길이(G)는 200μm였다.Then, the blood sample prepared in Example 4 was supplied to the sample inlet of the detection chip of Examples 1 and 2 to move the cells to the filter on the channel wall surface. Blood samples contained 10 ⁴ tumor cells (MCF-7) and 10 ⁶ blood cells (Jurkat), and the flow rate was 1.0 mL / hr. The width W of the channel is 300 mu m, the length L is 18 mm, the interval F between the filter units is 8 to 16 mu m, the width D of the filter unit is 50 mu m, Was 200 mu m.

항체를 필터를 구성하는 필터 유닛들이 서로 마주보는 면에 코팅하였으므로 필터 유닛 사이의 간격이 종양 세포보다 클 경우 세포 크기에 의한 물리적인 포획보다 유사 친화력으로 포획될 것이라 예상하였으나, 도 7의 (a)로부터 항체(EpCAM)가 코팅된 필터 유닛 사이의 간격이 증가할 때, 종양 세포들의 포획 효율은 감소함을 알 수 있다. 반면, 필터 유닛 사이의 간격이 큰 필터에서는 종양 세포의 포획 효율은 항체가 코팅되었을 때(w/ EpCAM) 더 높게 나타났다. 즉, 세포와 필터 사이에서 항체가 세포들을 점착하기 때문에 필터 유닛 사이의 간격이 넓은 필터(14, 16μm)에서는 포획효율이 높았다. 이로부터 12μm 보다 필터 유닛 사이의 간격이 작은 필터에서는 항체의 효과가 없다는 것을 알 수 있었다. 혈액 세포의 경우에는 일부 세포들이 항체와 반응하여 포획되었으나 전반적으로 포획 효율은 낮았으며, 필터 유닛 사이의 간격이 큰 필터에서는 작은 혈액 세포는 거의 검출되지 않았다. 그리고 순수도는 혈액 세포들의 일부가 항체에 반응하여 항체가 없을 때가 더 높았다(도 7의 (b)). Since the antibody was coated on the facing surfaces of the filter units constituting the filter, if the interval between the filter units was larger than that of the tumor cells, it would be expected to be trapped with a similar affinity rather than physical capturing by the cell size. The capture efficiency of the tumor cells decreases as the distance between the antibody (EpCAM) coated filter units increases. On the other hand, the capture efficiency of the tumor cells in the filter with a large gap between the filter units was higher when the antibody was coated (w / EpCAM). In other words, because the antibody adheres the cells between the cells, the capture efficiency is high in the filter (14, 16 μm) with a large gap between the filter units. From this, it can be seen that there is no effect of the antibody in a filter having a smaller interval between filter units than 12 μm. In the case of blood cells, some cells were captured by reacting with antibodies, but overall capture efficiency was low. In a filter with a large gap between filter units, little blood cells were detected. Pure water also showed that some of the blood cells responded to the antibody and the antibody was absent (Fig. 7 (b)).

따라서 필터 유닛 사이의 간격이 12μm 보다 작은 필터에서는 종양세포 검출항체로 표면 처리되어 있지 않은 검출 칩이 세포 크기와 미세 유동만을 이용해서 종양 세포들을 잘 포획할 수 있어 높은 포획효율과 순수도를 갖고, 12μm 보다 큰 필터에서는 종양세포 검출항체로 표면 처리된 검출 칩이 항체의 유사 친화력으로 인해 포획효율이 더 높음을 알 수 있다.
Therefore, in a filter having a gap between filter units of less than 12 μm, a detection chip which is not surface-treated with a tumor cell detection antibody can capture tumor cells well using only the cell size and fine flow, In the case of a filter larger than 12 μm, the detection chip surface-treated with the tumor cell detection antibody shows higher capture efficiency due to the affinity of the antibody.

[시험 예 7]단일 필터와 다중 필터의 포획 효율비교[Test Example 7] Capture efficiency comparison between a single filter and multiple filters

본 발명의 일 실시 예에 따른 단일 필터와 다중 필터의 포획 효율을 비교하기 위한 실험을 하기와 같이 실시하였다.Experiments for comparing the trapping efficiencies of a single filter and a multiple filter according to an embodiment of the present invention were performed as follows.

먼저, 실시 예 4에서 준비한 혈액시료 1mL(종양 세포 3 ~ 10³개, 혈액세포 10⁶개)를 실시 예 1 및 2의 검출 칩의 시료 투입구에 공급하여 세포들을 채널 벽면의 필터로 이동시켰다. 이때 유량은 1 mL/hr, 채널의 폭(W)과 길이(L)는 각각 300μm, 18mm, 필터 유닛 사이의 간격(F)과 필터 유닛의 폭(D), 길이(G)는 각각 12μm, 50μm, 200μm였다. 단일 필터(실시 예 1)는 최적화된 구조의 초기 실험용 미세 유체 칩이며, 다중 필터(실시 예 2)는 실제 암 전이 환자의 시료 수에 맞게 필터를 증가 배치한 모델이다. First, the Example 4 Blood samples 1mL (tumor cells 3-10 ^3, Blood Cells 10 ⁶⁾ prepared in Example 1 and was supplied to the sample inlet of a detection chip of the second mobile cells as a filter of the channel wall. The width (W) and the length (L) of the channel are 300 μm and 18 mm, the interval F between the filter units, the width D of the filter unit and the length G are 12 μm, 50 μm, and 200 μm, respectively. The single filter (Example 1) is an initial experimental microfluidic chip with an optimized structure, and the multiple filter (Example 2) is a model in which the filter is arranged in an increasing number of samples in accordance with the number of samples of actual cancer transplant patients.

단일 필터와 다중 필터에서 종양 세포의 포획 효과를 도 8에 나타내었다. 도 8의 (a)는 단일 필터 칩에서 종양 세포의 수를 3에서 300개로 희석하였을 때 포획 효율을 나타낸 것으로, 종양 세포의 포획된 수는 희석 비율에 비례하여 증가되었다. 그러나 혈액세포(Jurkat cell)는 일정하게 포획되었다. 도 8의 (b)는 다중 필터 칩에서 희석된 종양 세포의 포획 효율을 보여준다. 실제 전이 암 환자의 시료 수만큼 증가된 종양 세포의 희석에서도 포획 효율은 비례하였다. 다중 필터 칩에서는 필터의 수가 3배 가까이 증가하였지만 혈액세포의 포획 효율은 낮았다. 도 8의 (c)는 일정한 비율로 희박하게 희석된 종양 세포의 포획 효율을 보여준다. 이 그래프에서 포획 효율은 희석된 종양 세포의 수에 비례하여 증가하였다. 또 단일 필터와 다중 필터에 관계없이 증가하였다. 그리하여 종양 세포의 포획 효율은 100%에 가까웠다. 도 8의 (d)는 종양 세포 포획의 순수도를 보여준다. 이 실험에서 혈액 세포인 저켓은 항상 10 ~ 20개 정도 포획되었다. 그래서 희석된 종양 세포가 10⁰ 일 때 순수도는 낮지만 10¹, 10², 10³으로 올라갈수록 순수도는 100%에 가깝다. 이로써 실제 전이 암 환자의 시료 수준에서 종양 세포의 높은 순수도를 얻을 수 있었다.
The capture effect of tumor cells in a single filter and multiple filters is shown in Fig. Figure 8 (a) shows the capture efficiency when the number of tumor cells was diluted from 3 to 300 in a single filter chip, and the number of captured tumor cells was increased in proportion to the dilution ratio. However, blood cells (Jurkat cells) were constantly captured. FIG. 8 (b) shows the capture efficiency of diluted tumor cells in the multiple filter chip. The efficiency of capture was also proportional to the dilution of tumor cells that were increased by the number of samples of actual metastatic cancer patients. The number of filters in the multifilter chip increased by three times, but the capture efficiency of blood cells was low. Figure 8 (c) shows the capture efficiency of lean diluted tumor cells at a constant rate. In this graph, capture efficiency increased in proportion to the number of diluted tumor cells. Also, it increased regardless of single filter and multiple filter. Thus, the capture efficiency of tumor cells was close to 100%. Figure 8 (d) shows the purity of tumor cell capture. In this experiment, 10 ~ 20 blood cells were always trapped. Thus, when diluted tumor cells are at 10 ⁰ , the degree of pureness is low, but the higher the degree of ascending to 10 ¹ , 10 ² , and 10 ³ , the closer to 100% pureness. This resulted in high purity of tumor cells at the sample level of actual metastatic cancer patients.

[시험 예 8]실제 혈액을 이용한 종양세포 검출실험[Test Example 8] Detection of tumor cells using actual blood

실제 인간의 혈액을 시료로 하여 종양세포를 검출하는 실험을 하기와 같이 우리는 실시하였다. We conducted experiments to detect tumor cells using human blood as a sample as follows.

먼저, IRB(임상시험심사위원회) 인증된 규약 아래 연세대학교의 세브란스 병원의 허가를 획득한 후 종양이 없는 건강한 기증자(37세의 남성)로부터 채취한 혈액에 상기 실시예 4에서 준비한 종양세포를 첨가하여, 실제 혈액시료를 제조하였다. 그 다음 항응고제(EDTA)가 들어있는 진공채혈 관에 수집하였고, 24시간 안에 처리하였다. 혈액 시료들은 세포 침전을 막기 위해 진동판 위에 4℃로 보관하였다. First, the tumor cells prepared in Example 4 were added to the blood collected from a healthy donor (male, 37 years old) without a tumor after obtaining permission from Severance Hospital of Yonsei University under the approved protocol of the IRB To prepare an actual blood sample. Then they were collected in a vacuum blood collection tube containing anticoagulant (EDTA) and treated within 24 hours. Blood samples were stored at 4 ° C on a diaphragm to prevent cell precipitation.

하기의 각 실험에 쓰인 혈액의 양은 1 mL 였으며, 추출한 혈액을 그대로 사용한 경우와 적혈구를 분리한 혈장을 사용한 경우로 나누어 실험을 실시하였다. 일반적으로 혈액 1mL에 들어있는 세포들은 대략 백혈구가 10⁶ 개, 적혈구가 10⁹이며, 본 실험에서는 이 혈액 1mL에 종양 세포를 단일 필터가 설치된 검출 칩(실시 예 1)에는 300개, 다중 필터가 설치된 검출 칩(실시 예 2)에는 1000개의 종양세포를 첨가하였다. 본 실험에 사용한 칩에 주입한 유량은 1mL/hr이었으나 실질적으로는 0.75mL/hr로 줄어들었는데, 이는 혈액세포가 미세 칩에서 유동할 때 수많은 적혈구들의 흐름에 의해 쉽게 부서지기 때문이다. 또한, 채널의 폭(W)과 길이(L)는 각각 300μm, 18mm, 필터 유닛 사이의 간격(F)과 필터 유닛의 폭(D), 길이(G)는 각각 12μm, 50μm, 200μm였다.The amount of blood used in each of the following experiments was 1 mL. Experiments were conducted by dividing the extracted blood into plasma and using plasma separated from the red blood cells. In general, the cells contained in 1 mL of blood have approximately 10 ⁶ white blood cells and 10 ⁹ red blood cells. In this experiment, 300 mL of the tumor cells in 1 mL of the detection chip (Example 1) 1000 tumor cells were added to the detection chip installed (Example 2). The flow rate injected into the chip used in this experiment was 1 mL / hr, but actually decreased to 0.75 mL / hr because the blood cells were easily broken by the flow of red blood cells when flowing in the microchip. The width W and the length L of the channel were 300 μm and 18 mm and the interval F between the filter units and the width D and length G of the filter unit were 12 μm, 50 μm and 200 μm, respectively.

도 9는 혈액에서 종양 세포를 포획한 사진이다. 도 9의 (a) 및 (b)는 단일 필터가 설치된 검출 칩(실시 예 1)에서 세포를 포획한 것이고, 도 9의 (c) 및 (d)는 다중 필터가 설치된 검출 칩(실시 예 2)에서 세포를 포획한 것이다. 흰 원은 세포를 포획한 필터의 모습을 표시한 것이다.9 is a photograph capturing tumor cells in the blood. 9 (a) and 9 (b) show cells capturing in a detection chip (Example 1) equipped with a single filter, and FIGS. 9 (c) and 9 ). &Lt; / RTI > The white circles represent the appearance of the filter that captured the cells.

또한, 이 중 도 9의 (a) 및 (c)는 순수 혈액에서 종양세포를 검출한 것으로, 붉은(짙은 색) 유동은 적혈구이며, 투명한 부분(옅은 색)은 혈장이다. 그리고 포획된 종양 세포들은 많은 적혈구의 유동에도 잘 포획되어 있다. 그리고 백혈구는 필터를 통과하거나 전단 유동에 의해 필터를 지나갔다. 도 9의 (b) 및 (d)는 적혈구를 제외한 혈액에서 종양 세포를 검출한 것으로서 적혈구의 붉은 유동은 없었다.9 (a) and 9 (c) show the detection of tumor cells in pure blood. Red (dark color) flow is erythrocytes and transparent part (light color) is plasma. And the captured tumor cells are well captured in the flow of many red blood cells. And leukocytes pass through the filter or through the filter by shear flow. Figures 9 (b) and 9 (d) show tumor cells in the blood except red blood cells, and there was no red blood cell red flow.

도 10의 (a)는 혈액에서 종양세포의 포획 효율을 나타낸 것으로, 본 실제 혈액을 이용한 실험에서는 다중 필터보다 단일 필터에서 포획 효율이 높았다. 그 이유는 혈액 세포의 영향으로 생각된다. 그리고 적혈구를 제외했을 때 포획 효율이 높은 것으로 보아, 적혈구가 종양 세포의 포획에 영향을 준다는 것을 알 수 있다. 그러나 백혈구의 효과는 알 수가 없었다. 다만 백혈구의 면역 작용이 종양 세포에 영향을 줄 수도 있다. 도 10의 (b)는 종양세포 포획의 순수도를 나타낸 것으로, 단일 필터와 다중 필터가 설치된 검출 칩 모두 높은 순수도를 나타내었으며, 적혈구의 유무에 관계없이 순수도는 높게 나타났다.
FIG. 10 (a) shows the capture efficiency of tumor cells in the blood. In the experiment using the actual blood, the capture efficiency of the single filter was higher than that of the multiplex filter. The reason is thought to be the influence of blood cells. And it can be seen that the red blood cells have an effect on the capture of the tumor cells because the capture efficiency is high when the red blood cells are excluded. However, the effect of leukocyte was unknown. However, the immune function of white blood cells may affect tumor cells. FIG. 10 (b) shows the purity of tumor cell capture, and both a single filter and a detection chip equipped with a multi-filter showed high pure water and high pure water regardless of presence or absence of red blood cells.

[시험 예 9]필터 및 채널 조건에 따른 종양세포 포획효율 분석[Test Example 9] Analysis of tumor cell capture efficiency by filter and channel conditions

실시 예 4에서 준비한 혈액시료를 실시 예 1 및 2의 검출 칩의 시료 투입구에 공급하여 세포들을 채널 벽면의 필터로 이동시켰다. 이때 혈액시료에는 종양세포(MCF-7) 10⁴개, 혈액세포(Jurkat) 10⁶개가 포함되었고, 필터 유닛 사이의 간격(F), 폭(D), 그리고 채널의 폭(W)을 각각 변화시켜 그에 따른 종양세포의 포획효율을 비교하였다. 이때 채널의 길이(L)는 12mm, 필터 유닛의 길이(G)는 200μm, 유량은 각각 1 mL/hr였다. The blood sample prepared in Example 4 was supplied to the sample inlet of the detection chip of Examples 1 and 2 to move the cells to the filter on the channel walls. At this time, blood samples contained 10 ⁴ tumor cells (MCF-7) and 10 ⁶ blood cells (Jurkat), and the interval (F), width (D) and channel width And the efficiency of capturing tumor cells was compared. At this time, the length (L) of the channel was 12 mm, the length (G) of the filter unit was 200 μm, and the flow rate was 1 mL / hr.

먼저, 필터 유닛의 폭(D)을 50 μm, 채널의 폭(W)을 300 μm로 고정하고 필터 유닛 사이의 간격(F, Filter Gap)을 각각 8, 10, 12, 14 및 16 μm로 하여 종양세포(MCF-7) 및 혈액세포(Jurkat)의 포획효율을 분석하였다. 그 결과 도 11의 (a)에 나타난 바와 같이 필터 유닛 사이의 간격(F)이 12μm일 때 혈액세포의 포획효율이 낮으면서도 종양세포의 포획효율이 높게 나타났다.First, the width D of the filter unit was set to 50 μm, the width W of the channel was set to 300 μm, and the intervals between the filter units (F and Filter Gap) were set to 8, 10, 12, The capture efficiency of tumor cells (MCF-7) and blood cells (Jurkat) was analyzed. As a result, as shown in FIG. 11 (a), when the interval F between the filter units was 12 μm, the capture efficiency of tumor cells was high while the capture efficiency of blood cells was low.

그 다음, 필터 유닛 사이의 간격(F)을 12 μm, 채널의 폭(W)을 300 μm로 고정하고 필터 유닛의 폭(D, Filter Width)을 각각 20, 50 및 100 μm로 하여 종양세포(MCF-7) 및 혈액세포(Jurkat)의 포획효율을 분석하였다. 그 결과 도 11의 (b)에 나타난 바와 같이 필터 유닛의 폭(D)이 50μm일 때 종양세포의 포획효율이 가장 높게 나타났다.Then, the interval (F) between the filter units was fixed to 12 μm, the channel width (W) to 300 μm, the filter unit width (D, Filter Width) to 20, MCF-7) and blood cells (Jurkat). As a result, as shown in Fig. 11 (b), when the width D of the filter unit was 50 m, the capture efficiency of tumor cells was the highest.

마지막으로 필터 유닛의 폭(D)을 50μm, 필터 유닛 사이의 간격(F)을 12μm로 고정하고 채널의 폭(W, Channel Width)을 100, 200, 300μm로 하여 종양세포(MCF-7) 및 혈액세포(Jurkat)의 포획효율을 분석하였다. 그 결과 도 11의 (c)에 나타난 바와 같이 채널의 폭(W)이 300μm일 때 종양세포의 포획효율이 가장 높게 나타났다.Finally, the width (D) of the filter unit was fixed to 50 μm, the interval (F) between the filter units was fixed to 12 μm, the tumor cells (MCF-7) and The capture efficiency of blood cells (Jurkat) was analyzed. As a result, as shown in FIG. 11 (c), the capture efficiency of the tumor cells was the highest when the channel width (W) was 300 μm.

Claims

종양세포 검출 칩을 포함하고,
상기 종양세포 검출 칩은 혈액시료가 이동하는 하나 이상의 채널을 포함하며,
상기 채널의 벽면의 적어도 일부가 혈액시료에 포함된 종양세포를 포획하는 필터로 구성된 종양세포 검출장치.A tumor cell detection chip,
Wherein the tumor cell detection chip comprises at least one channel through which a blood sample travels,
Wherein at least a part of the wall surface of the channel is comprised of a filter capturing tumor cells contained in a blood sample.

제1항에 있어서, 상기 필터는 일정 간격을 두고 배열된 필터 유닛들로 구성되고, 각 필터 유닛 사이의 간격에 종양세포가 포획되는 것인 종양세포 검출장치.2. The tumor cell detection apparatus according to claim 1, wherein the filter is constituted by filter units arranged at regular intervals, and tumor cells are captured in an interval between the filter units.

제1항에 있어서, 상기 검출 칩은 채널로 혈액시료를 공급하는 시료 투입구 및 채널 밖으로 혈액시료를 배출시키는 시료 배출구를 더 포함하는 종양세포 검출장치.The apparatus of claim 1, wherein the detection chip further comprises a sample inlet for supplying a blood sample to the channel and a sample outlet for discharging a blood sample out of the channel.

제1항에 있어서, 상기 종양세포는 혈액 내를 순환하는 종양세포(Circulating tumor cells: CTC)인 종양세포 검출장치.The tumor cell detecting apparatus according to claim 1, wherein the tumor cell is circulating tumor cells (CTC) circulating in the blood.

제1항에 있어서, 상기 채널의 길이는 6mm 이상 18mm 이하이고, 폭은 100μm 이상 300μm 이하인 종양세포 검출장치.The tumor cell detecting device according to claim 1, wherein the channel has a length of 6 mm or more and 18 mm or less and a width of 100 m or more and 300 m or less.

제2항에 있어서, 상기 하나의 필터 유닛의 길이는 50μm 이상 300 μm 이하, 폭은 25μm 이상 100 μm 이하인 종양세포 검출장치.3. The tumor cell detecting apparatus according to claim 2, wherein the length of the one filter unit is 50 mu m or more and 300 mu m or less and the width is 25 mu m or more and 100 mu m or less.

제2항에 있어서, 상기 각 필터 유닛 사이의 간격이 8μm 이상 16μm 이하인 종양세포 검출장치.The tumor cell detecting device according to claim 2, wherein the interval between the filter units is 8 탆 or more and 16 탆 or less.

제2항에 있어서, 상기 각 필터 유닛의 사이의 간격이 12μm 이상 16μm 이하인 필터는 각 필터 유닛이 종양세포 검출항체로 표면 처리된 것인 종양세포 검출장치.The tumor cell detecting apparatus according to claim 2, wherein each filter unit is surface-treated with a tumor cell detection antibody, the filter having a gap between 12 占 퐉 and 16 占 퐉 between the filter units.

제1항에 있어서, 상기 채널을 이동하는 혈액시료는 적혈구가 제거된 것인 종양세포 검출장치.The apparatus for detecting tumor cells according to claim 1, wherein the blood sample moving through the channel has erythrocytes removed.

혈액시료를 채널에 통과시키면서, 혈액시료 내에 포함된 종양세포를 채널 벽면의 필터를 구성하는 필터 유닛들 사이의 간격에 포획하는 단계를 포함하는 종양세포 검출방법.Capturing the tumor cells contained in the blood sample at intervals between filter units constituting the filter on the channel wall while passing the blood sample through the channel.

제10항에 있어서, 상기 종양세포 검출방법은 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 장치를 이용한 것인 종양세포 검출방법.11. The method according to claim 10, wherein the tumor cell detection method uses the apparatus according to any one of claims 1 to 9.

제10항에 있어서, 상기 혈액시료의 유량은 0.5mL/hr 내지 1.5mL/hr인 종양세포 검출방법.The method according to claim 10, wherein the flow rate of the blood sample is 0.5 mL / hr to 1.5 mL / hr.

제10항에 있어서, 상기 종양세포 검출방법은 혈액시료 내에 포함된 포획되지 않은 비종양 세포 및 종양세포가 채널 밖으로 빠져나가는 단계를 더 포함하는 종양세포 검출방법.11. The method of claim 10, wherein the tumor cell detection method further comprises a step of allowing the unencapsulated non-tumor cells and the tumor cells contained in the blood sample to escape out of the channel.

제13항에 있어서 상기 비종양 세포는 적혈구, 백혈구 및 림프구 중 1종 이상인 종양세포 검출방법.14. The method of claim 13, wherein the non-tumor cells are at least one of red blood cells, white blood cells, and lymphocytes.

제10항에 있어서, 상기 종양세포 검출방법은 필터 유닛들 사이의 간격에 포획된 세포들을 형광항체와 결합시켜 포획된 세포들이 종양세포인지 여부를 확인하는 단계를 더 포함하는 종양세포 검출방법.11. The method of claim 10, wherein the method further comprises binding cells captured at intervals between filter units with a fluorescent antibody to determine whether the captured cells are tumor cells.