KR20140132805A - The cosmetic composition for skin whitening comprising aviprin - Google Patents

Abstract

In the present invention, provided are a cosmetic composition, a pharmaceutical composition and a food composition including aviprin, which is a compound inhibiting tyrosinase and melanin from being activated and produced and has little cell toxicity. The compositions including aviprin, according to the present invention, can be used for inhibiting the activity of tyrosinase and the production of melanin, preventing, improving or curing the disease caused by the overproduction of melanin and whitening skin.

Description

아비프린을 포함하는 미백 화장용 조성물{The cosmetic composition for skin whitening comprising aviprin}[0001] The present invention relates to a cosmetic composition for skin whitening comprising aviprin,

본 발명은 미백 활성 효과가 있는 화장용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 미백 활성을 갖는 아비프린을 함유하는 미백 화장용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a cosmetic composition having a whitening activity effect, and more particularly to a whitening cosmetic composition containing aviprin having whitening activity.

최근 사회가 발달하고 생명공학의 발전과 생활수준의 향상, 평균수명 연장으로 인한 고령화 사회에 진입함에 따라 피부노화지연 및 피부세포부활 등의 생리활성 기능과 효과가 함께 갖춰진 복합 기능성 화장품 개발이 대두되고 있는 실정이다. 현재 기능성 화장품의 개발에는 생리활성을 가지는 원료물질의 개발이 선결과제이며, 검토해야 할 기능성으로는 미백, 항염증, 주름개선, 항노화, 항산화효과 등이 있다. 이러한 효과를 보유한 물질을 한약재 등 다양한 천연물에서 찾으려는 연구가 시도되고 있으며, 최근에 피부 흑화의 생물학적 기전이 상세히 규명됨에 따라 피부에 멜라닌(melanin) 색소가 침착되는 것을 예방하고 완화시켜 기미나 주근깨 등의 생성을 억제함으로써 피부의 미백에 도움을 주는 미백제 개발 연구가 활발히 이루어지고 있다.In recent years, the development of complex functional cosmetics with physiologically active functions and effects such as delayed skin aging and skin cell renewal has been developed as the society develops, advances in biotechnology, improvement of living standards, and average life expectancy In fact. At present, the development of raw materials having physiological activity is a prerequisite for the development of functional cosmetics, and the functionalities to be examined include whitening, anti-inflammation, wrinkle improvement, anti-aging, and antioxidative effects. Studies have been made to find a substance having such an effect in various natural products such as herbal medicines. Recently, as the biological mechanism of skin blackening has been elucidated in detail, melanin pigment deposition on the skin is prevented and mitigated, The development of a whitening agent that helps skin whitening has been actively researched.

피부미백제가 직접적으로 예방하고 완화시키고자 하는 것은 멜라닌으로, 이는 동식물과 미생물계에 널리 존재하는 천연 고분자 색소이며, 페놀류의 효소적, 비효소적 산화 및 중합반응 등의 다단계 과정을 거쳐 피부표피의 기저층에 분포하고, 색소형성세포주(melanocyte) 내의 멜라닌 소체(melanosome)에서 주로 생성된다. 생성된 멜라닌은 자외선의 빛 에너지를 흡수하여 자외선이 진피 내로 투과하면서 발생되는 피부기관의 손상을 방어하는 역할을 하며, 피부 내에 생겨난 유해산소 및 자유 라디칼을 소거시키는 등 외부 유해인자로부터 피부를 보호하는 유용한 역할을 수행한다. 또한, 피부세포 내의 멜라닌 생성량과 분포도에 따라 사람의 피부색이 결정되며, 멜라닌 색소가 적은 사람은 흰색의 피부를 갖게 된다. 하지만 외부의 자극으로 인해 다량의 멜라닌이 부분적인 과색소침착을 일으키면 기미, 주근깨, 염증 후 색소침착, 검버섯뿐만 아니라 피부염, 피부암과 같은 피부질환을 유발하게 된다. 이 같은 질환과 미관상의 문제점을 극복하기 위하여 미백물질의 개발이 활발하게 이루어지고 있는 실정이다.Melanin is a natural polymer pigment that exists widely in animal and plant life. It is a multi-step process such as enzymatic and non-enzymatic oxidation and polymerization of phenols, It is distributed in the basal layer and is mainly produced in the melanosome in the pigmentation cell line (melanocyte). The generated melanin absorbs ultraviolet light energy and protects skin from damage caused by ultraviolet rays penetrating into the dermis. It protects the skin from external harmful factors such as eliminating harmful oxygen and free radicals generated in the skin Perform a useful role. In addition, the skin color of a person is determined according to the amount of melanin production and distribution in the skin cell, and a person with less melanin pigment has a white skin. However, when a large amount of melanin causes partial hyperpigmentation due to external stimuli, it causes skin diseases such as spots, freckles, post-inflammatory pigmentation, black spot as well as dermatitis and skin cancer. In order to overcome these problems and cosmetic problems, the development of whitening substances is being actively carried out.

현재까지 미백제의 개발이 주로 티로시나제(tyrosinase)를 저해하거나 멜라닌 생성량의 감소 등을 통하여 색소형성세포주에 직접적으로 작용하는 기전으로 이루어졌지만 멜라닌 생성에 관여하는 여러 인자들이 밝혀지면서, 생성경로와 이와 관련된 여러 인자들의 작용 억제에도 관심을 두게 되었다. 대표적인 미백제로는 코직산(kojic acid)과 알부틴(arbutin)이 존재하며, 이들은 많이 상용되었으나 세포독성, 돌연변이 유발 등의 부작용 등이 최근 보고되었다. 그러므로 이와 같은 부작용을 유발하지 않으며 안전성과 안정성을 갖춘 피부미백제의 개발이 필요한 실정이다.To date, the development of whitening agents has been mainly due to inhibition of tyrosinase or a decrease in melanin production. However, several factors involved in melanogenesis have been identified, I was also interested in suppressing the action of the factors. Kojic acid and arbutin exist as typical whitening agents, and they are widely used, but cytotoxicity and side effects such as mutagenesis have recently been reported. Therefore, it is necessary to develop a skin whitening agent which does not cause such side effects and has safety and stability.

본 연구팀은 기존 피부미백제들의 문제점을 해결하고, 피부세포주에 대한 안전성이 보장되는 효과적인 미백활성물질을 획득하여 피부에 대한 안전성 및 미백제로써의 활성과 기전을 규명하고자 피부미백제에 대해 연구하였다. 물질의 탐색을 시도한 결과 수질(Hirudinidae)추출물을 선별할 수 있었다. 수질추출물은 미백활성 및 항산화활성과 피부세포주에 대한 무독성을 나타내었다. 수질은 거머리과로 거머리를 석회에 무쳐 햇빛에 말리거나 구운 것으로서 뇌혈관 질환, 고지혈증, 호흡기 질환 등의 치료에 광범위하게 응용되고 있으며, 특히 항응고 작용이 다른 한약재 보다 우수하고, 일반적인 어혈 치료약물에 비해 월등한 효능이 이미 밝혀졌지만 미백과 관련된 연구는 보고되어 있지 않았다. We have studied skin whitening agents to solve the problems of existing skin whitening agents, to obtain effective whitening active substances that are safe for skin cell lines, to clarify skin safety and whitening activity and mechanism. As a result, Hirudinidae extract could be selected. Water extracts showed whitening activity, antioxidant activity and non - toxicity to skin cell lines. The quality of water is leeches and leeches in limes, dried and baked in the sunlight, and it is widely applied to the treatment of cerebrovascular diseases, hyperlipemia, respiratory diseases, etc. Especially, it has superior anticoagulant effect than other medicinal herbs. Although superior efficacy has already been demonstrated, no studies have been reported on whitening.

수질추출물로부터 분리한 화합물은 DPPH 라디칼 소거, 항진균, 혈소판 응집억제, 항결핵 활성 등이 보고되었지만 피부미백활성에 대한 연구는 미비한 실정이다. 따라서, 본 연구팀은 수질추출물로부터 분리한 화합물을 피부미백제로써의 활성과 미백활성 기전규명 및 피부세포주에 대한 안전성 확인을 통해 새로운 피부미백제로써의 가능성을 제시하였다.DPPH radical scavenging, antifungal, platelet aggregation inhibition and antituberculous activity have been reported for compounds isolated from water quality extracts, but studies on skin whitening activity have been lacking. Therefore, the team proposed the possibility of a new skin whitening agent as a skin whitening agent by identifying the compounds isolated from water extracts, identifying the mechanism of whitening activity and confirming the safety of skin cell lines.

본 발명의 목적은 세포독성이 적으며 티로시나제 저해활성, 멜라닌 생성 저해활성을 가지는 새로운 물질을 찾아 신규한 미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a novel whitening cosmetic composition by finding new substances having low cytotoxicity and having tyrosinase inhibitory activity and melanin formation inhibitory activity.

상기 목적을 해결하기 위하여 본 발명은 아비프린을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다.In order to solve the above object, the present invention provides a composition comprising aviprin as an active ingredient.

본 발명의 일구현예로서 아비프린을 유효성분으로 포함하는 티로시나제 저해활성을 가지는 조성물을 제공한다.As one embodiment of the present invention, there is provided a composition having a tyrosinase inhibitory activity comprising aviprin as an active ingredient.

본 발명의 다른 일구현예로서 아비프린을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 생성 저해활성을 가지는 조성물을 제공한다.As another embodiment of the present invention, there is provided a composition having melanin formation inhibitory activity comprising aviprin as an active ingredient.

본 발명의 일구현예로서 아비프린을 유효성분으로 포함하는 미백효과를 가지는 조성물을 제공한다.As one embodiment of the present invention, there is provided a composition having a whitening effect comprising aviprin as an active ingredient.

본 발명의 일구현예로서 아비프린을 유효성분으로 포함하는, 멜라닌 과다 생성으로 인한 질병의 예방, 개선, 치료용 조성물을 제공한다.As an embodiment of the present invention, there is provided a composition for preventing, ameliorating, and treating diseases caused by melanin overgrowth, which comprises aviprin as an active ingredient.

또한, 본 발명의 다른 일구현예로서 항산화활성을 가지는 조성물을 제공한다.In another embodiment of the present invention, there is provided a composition having an antioxidative activity.

본 발명에서 제공하는 조성물에는 일구현예로서 화장료 조성물, 의약 조성물, 식품 조성물, 식품첨가제 조성물이 포함된다.The composition provided in the present invention includes cosmetic compositions, medicinal compositions, food compositions, and food additive compositions in one embodiment.

본 특허출원을 통하여 제공되는 아비프린을 포함하는 화장료 조성물은 티로시나제 저해활성, 멜라닌 생성 저해활성, 항산화활성을 가지며, B16-F10 멜라노마 세포주에 대한 세포독성이 없다. 수질추출물을 포함하는 조성물은 안전한 티로시나제 저해, 멜라닌 생성 저해, 미백효과를 가지는 화장료 조성물, 의약 조성물, 식품 또는 식품첨가제 조성물로 사용될 수 있다.The cosmetic composition containing aviprin provided through this patent application has a tyrosinase inhibitory activity, a melanin formation inhibitory activity, and an antioxidative activity, and has no cytotoxicity against B16-F10 melanoma cell line. The composition containing the water-extract can be used as a cosmetic composition, medicinal composition, food or food additive composition having safe tyrosinase inhibition, inhibition of melanin formation, and whitening effect.

도 1은 아비프린의 분리 및 정제 단계를 나타낸 것이다.
도 2는 아비프린의 HPLC 프로파일을 나타낸 것이다.
도 3은 아비프린의 ESI-Mass 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4는 아비프린(CDCl₃)의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 5는 아비프린(CDCl₃)의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 6은 아비프린의 HMQC 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 7은 아비프린의 ¹H-¹H COSY 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 8은 아비프린의 HMBC 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 9는 아비프린의 구조를 나타낸 것이다.
도 10은 아비프린의 미백 효과를 나타낸 것이다. 도 10(a)는 아비프린의 티로시나제 저해활성을 나타낸 것이다. 저해활성을 측정하기 위하여 다양한 농도의 아비프린을 이용하였고, 1500 units/mL의 티로시나제와 1.5 mM의 티로신을 이용하였다. 측정 용액은 37 ℃에서 15분간 반응시켰다. 반응 후 490 nm에서 마이크로플레이트 리더에 의해 측정되었다. 각각의 수치는 세번 실험한 값의 평균 ± S.D.를 나타낸다. 도 10(b)는 α-MSH(α-melanocyte stimulating hormone)로 자극된 B16-F10 멜라노마 세포에서 아비프린의 멜라닌 함량 감소 효과를 나타낸 것이다. 상기 세포는 24시간 동안 배양되었고, 이후 아비프린으로 처리되었다. 전 처리된 세포 72시간 동안 1 μM의 α-MSH로 멜라닌 생성이 촉진되었다. 그 결과를 대조군과 비교하여 퍼센트로 표시하였고 세번 실험한 값의 평균 ± S.D.로 기록되었다.
도 11은 아비프린의 항산화 효과를 나타낸 것이다. 도 11(a)는 다양한 농도의 아비프린의 DPPH 라디칼 소거능을 보여준다. 에탄올 내의 0.4 mM DPPH 80 ㎕ 용액을 아비프린 20 ㎕와 12시간 동안 천천히 혼합한 후, 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군은 Vit-C 1 mg/mL이다. 상기 데이터는 세번 실험한 후의 평균값(±S.D.)을 나타낸 것이다. 도 11(b)는 다양한 농도의 아비프린의 ABTS 라디칼 소거능을 보여준다. 1.25 mM ABTS와 1 unit/mL 의 퍼옥시다제 및 다양한 농도의 아비프린으로 측정되었다. 상기 물질이 혼합된 혼합용액은 37 ℃에서 15분간 반응되었다. 그후, 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군은 Vit-C 100 ㎍/mL이다. 모든 실험은 3번 실시하였으며, 상기 데이터는 세번 실험 후의 평균값(±S.D.)을 나타낸 것이다.
도 12는 아비프린으로 24시간 동안 처리된 B16-F10 멜라노마 세포주의 세포생존을 나타낸 것이다. 도 12(a)는 MTT 에세이 이후, MTT 환원비율(MTT reduction rate)을 대조군의 생존한 세포와 비교하여 산출하였다. 도 12(b)는 LDH 방출 에세이로부터 얻은 결과를 비히클 처리된 세포(vehicle-treated cells)(100%)로부터 방출된 LDH의 활성으로 정규화하였고, 대조군에 대한 퍼센트로 표현되었다. 도 12(c)는 아비프린으로 처리된 B16-F10 멜라노마 세포주의 형태학적 변화를 나타낸 것이다. 형태학적 변화는 24시간 동안 모니터링 되었다(a: 대조군, b: 50 μM 아비프린, c: 100 μM 아비프린). 위상차 현미경에서 100배율로 사진을 찍었다. 도 12(d)는 아비프린으로 처리된 B16-F10 멜라노마 세포에서 세포사멸(apoptosis)을 관찰한 것이다. B16-F10 멜라노마 세포주를 아비프린에 노출시켰고, 헤케스트(hoechst) 33342 염색법(10 μM) 및 형광 현미경을 이용하여 아폽토시스 소체(apoptotic body)가 형성되지 않음을 보여주었다(배율 400배, a: 대조군, b: 50 μM 아비프린, c: 100 μM 아비프린).
도 13은 48시간 동안 아비프린으로 처리된 B16-F10 멜라노마 세포의 세포 생존성을 나타낸 것이다. 상기 세포는 다양한 농도의 아비프린의 존재 하에서 48시간 동안 배양되었다. 도 13(a)는 MTT 에세이 이후, MTT 환원율을 대조군의 생존한 세포와 비교하여 산출하였다. 도 13(b)는 LDH 방출 에세이로부터 얻은 결과를 비히클 처리된 세포(100%)로부터 방출된 LDH의 활성으로 정규화하였고, 대조군에 대한 퍼센트로 표현되었다. 도 13(c)는 아비프린으로 처리된 B16-F10 멜라노마 세포주에서 형태학적 변화를 나타낸 것이다. 형태학적 변화는 48시간 동안 모니터링 되었다(a: 대조군, b: 50 μM 아비프린, c: 100 μM 아비프린). 위상차 현미경에서 100배율로 사진을 찍었다. 도 13(d)는 아비프린으로 처리된 B16-F10 멜라노마 세포주에서 세포사멸을 관찰한 것이다. B16-F10 멜라노마 세포주를 아비프린에 노출시켰고, 헤케스트 33342 염색법(10 μM) 및 형광 현미경을 이용하여 아폽토시스 소체가 형성되지 않음을 보여주었다(배율 400배, a: 대조군, b: 50 μM 아비프린, c: 100 μM 아비프린).
도 14는 72시간 동안 아비프린으로 처리된 B16-F10 멜라노마 세포주의 세포 생존성을 나타낸 것이다. 상기 세포는 다양한 농도의 아비프린 존재 하에서 72시간 동안 배양되었다. 도 14(a)는 MTT 에세이 이후, MTT 환원율을 대조군의 생존한 세포와 비교하여 산출하였다. 도 14(b)는 LDH 방출 에세이로부터 얻은 결과를 비히클 처리된 세포(100%)로부터 방출된 LDH의 활성으로 정규화하였고, 대조군에 대한 퍼센트로 표현되었다. 도 14(c)는 아비프린으로 처리된 B16-F10 멜라노마 세포주에서 형태학적 변화를 나타낸 것이다. 형태학적 변화는 72시간 동안 모니터링 되었고(a: 대조군, b: 50 μM 아비프린, c: 100 μM 아비프린), 위상차 현미경에서 100배율로 사진을 찍었다. 도 14(d)는 아비프린으로 처리된 B16-F10 멜라노마 세포에서 세포자살을 관찰한 것이다. B16-F10 멜라노마 세포주를 아비프린에 노출시켰고, 헤케스트 33342 염색법(10 μM) 및 형광 현미경을 이용하여 아폽토시스 소체가 형성되지 않음을 보여주었다(배율400배, a: 대조군, b: 50 μM 아비프린, c: 100 μM 아비프린).
도 15는 α-MSH로 유도된 B16-F10 멜라노마 세포주에서 아비프린에 의해 티로시나제의 발현이 저해되는 효과를 나타낸 것이다. 아비프린은 α-MSH로 처리되어 유도된 티로시나제 발현을 저해한다. B16-F10 멜라노마 세포주의 총 세포 용해물(lysate)을 분비한 후 goat polyclonal 티로시나제 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. 상기 세포를 소정의 농도의 아비프린으로 30분간 처리한 후에 α-MSH(1 μM)로 72시간 동안 처리하였다. 내부 대조군으로 β-actin을 측정하였다. Figure 1 shows the separation and purification steps of aviprin.
Figure 2 shows the HPLC profile of aviprin.
Figure 3 shows the ESI-Mass spectrum of avifin.
Fig. 4 shows the ¹ H-NMR spectrum of aviprin (CDCl ₃ ).
5 shows the ¹³ C-NMR spectrum of aviprin (CDCl ₃ ).
Figure 6 shows the HMQC spectrum of avifin.
Figure 7 shows the ¹ H- ¹ H COZY spectrum of aviprin.
Figure 8 shows the HMBC spectrum of avifin.
Figure 9 shows the structure of aviprin.
Fig. 10 shows the whitening effect of aviprin. 10 (a) shows the tyrosinase inhibitory activity of aviprin. Various concentrations of aviprin were used to measure inhibitory activity, and 1500 units / mL tyrosinase and 1.5 mM tyrosine were used. The measurement solution was allowed to react at 37 占 폚 for 15 minutes. It was measured by a microplate reader at 490 nm after the reaction. Each value represents the mean ± SD of the values of the third experiment. FIG. 10 (b) shows the effect of decreasing the melanin content of aviprin in B16-F10 melanoma cells stimulated with α-MSH (α-melanocyte stimulating hormone). The cells were cultured for 24 hours and then treated with avifrin. Melanogenesis was stimulated with 1 μM α-MSH for 72 hours in pretreated cells. The results were expressed as percentage compared to the control and recorded as the mean ± SD of the third experiment.
Fig. 11 shows the antioxidative effect of aviprin. Figure 11 (a) shows the DPPH radical scavenging ability of avifrin at various concentrations. 80 [mu] l of 0.4 mM DPPH in ethanol was slowly mixed with 20 [mu] l of aviprin for 12 hours and then absorbance was measured at 490 nm. The positive control is Vit-C 1 mg / mL. The data represent the mean value (± SD) after the third experiment. Figure 11 (b) shows ABTS radical scavenging ability of avifrin at various concentrations. 1.25 mM ABTS, 1 unit / mL peroxidase and various concentrations of aviprin. The mixed solution in which the substance was mixed was reacted at 37 DEG C for 15 minutes. The absorbance was then measured at 415 nm. The positive control group is Vit-C 100 / / mL. All experiments were conducted in triplicate and the data represent the mean (± SD) after the third experiment.
Figure 12 shows the cell survival of the B16-F10 melanoma cell line treated with aviprin for 24 hours. Figure 12 (a) shows the MTT reduction rate after MTT assay compared to the surviving cells of the control. Figure 12 (b) normalizes the results obtained from the LDH release assay to the activity of LDH released from vehicle-treated cells (100%) and expressed as a percentage of the control. Fig. 12 (c) shows morphological changes of the B16-F10 melanoma cell line treated with avifrin. Morphological changes were monitored for 24 h (a: control, b: 50 μM aviprin, c: 100 μM aviprin). Photographs were taken at 100 magnifications under a phase contrast microscope. FIG. 12 (d) shows apoptosis observed in B16-F10 melanoma cells treated with avifrin. B16-F10 melanoma cell lines were exposed to aviprin, and apoptotic bodies were not formed using hoechst 33342 staining (10 [mu] M) and fluorescence microscopy (magnification 400x, a: Control group, b: 50 μM aviprin, c: 100 μM aviprin).
Figure 13 shows cell viability of B16-F10 melanoma cells treated with avifrin for 48 hours. The cells were incubated for 48 hours in the presence of varying concentrations of aviprin. Figure 13 (a) shows the MTT reduction rate after MTT assay compared to the surviving cells of the control. Figure 13 (b) normalizes the results obtained from the LDH release assay to the activity of LDH released from vehicle treated cells (100%) and expressed as a percentage of the control. Fig. 13 (c) shows morphological changes in the B16-F10 melanoma cell line treated with avifrin. Morphological changes were monitored for 48 hours (a: control, b: 50 μM aviprin, c: 100 μM aviprin). Photographs were taken at 100 magnifications under a phase contrast microscope. Fig. 13 (d) shows cell death in the b16-F10 melanoma cell line treated with avifrin. The B16-F10 melanoma cell line was exposed to aviprin and showed no apoptotic bodies using a Histast 33342 staining method (10 [mu] M) and a fluorescence microscope (magnification: 400X, a: control, b: 50 [ Prin, c: 100 [mu] M aviprin).
14 shows the cell viability of the B16-F10 melanoma cell line treated with avifrin for 72 hours. The cells were incubated for 72 hours in the presence of varying concentrations of aviprin. Figure 14 (a) shows the MTT reduction rate after MTT assay compared with surviving cells in the control. Figure 14 (b) normalizes the results obtained from the LDH release assay to the activity of LDH released from vehicle treated cells (100%) and expressed as a percentage of the control. Fig. 14 (c) shows the morphological changes in the B16-F10 melanoma cell line treated with avifrin. Morphological changes were monitored for 72 hours (a: control, b: 50 μM aviprin, c: 100 μM aviprin) and photographed at 100 magnification under a phase contrast microscope. FIG. 14 (d) shows cell suicide observed in B16-F10 melanoma cells treated with avifrin. The B16-F10 melanoma cell line was exposed to aviprin and showed no apoptotic bodies using a Histast 33342 staining method (10 [mu] M) and a fluorescence microscope (magnification: 400X, a: control, b: 50 [ Prin, c: 100 [mu] M aviprin).
Fig. 15 shows the effect of inhibition of tyrosinase expression by aviprin in the B16-F10 melanoma cell line induced by? -MSH. Aviprin is treated with α-MSH to inhibit the induction of tyrosinase expression. B16-F10 Total cell lysate of Melanoma cell line was secreted and Western blotting was performed using goat polyclonal tyrosinase antibody. The cells were treated with a predetermined concentration of aviprin for 30 minutes and then treated with? -MSH (1 μM) for 72 hours. Β-actin was measured as an internal control.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

상기 목적을 달성하기 위하여 아비프린을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, there is provided a cosmetic composition comprising aviprin as an active ingredient.

본 명세서에 있어서, "미백"은 멜라닌의 생성이 저해됨에 따른 결과로서 이해되는데, 구체적으로는 멜라닌의 생성이 저해됨에 따라 멜라닌의 증가에서 비롯되는 증상이 예방 또는 억제됨에 따른 결과로서 이해된다. 그러한 증상으로서 전술한 바의 기미, 주근깨, 피부노화 등이 예시될 수 있지만, 본 발명의 하기 실시예 및 실험예가 보여주는 바와 같이 본 발명의 피부 미백용 조성물에 포함되는 화합물이 멜라닌의 생성을 저해하는 효과를 보여주는 것이 명백한 이상, 상기 증상은 멜라닌의 증가에서 비롯되는 증상 예방 또는 억제함으로써 피부미백의 결과로 이어지는 모든 증상으로 이해되어야 한다.As used herein, the term "whitening" is understood as a result of inhibition of the production of melanin, specifically as a result of prevention or suppression of symptoms resulting from an increase in melanin as the production of melanin is inhibited. Examples of such symptoms include spots, freckles, skin aging, and the like. However, as shown in the following Examples and Experimental Examples of the present invention, the compound included in the skin whitening composition of the present invention inhibits the production of melanin As long as the effect is evident, the symptoms should be understood as all the symptoms leading to skin whitening by preventing or inhibiting symptoms resulting from an increase in melanin.

본 발명의 발명자는 티로시나제 저해활성, 멜라닌 생성 저해활성을 가지며 세포독성이 적은 물질을 찾기 위하여 물질들을 스크리닝한 결과, 하기 화학식 1의 아비프린이 그러한 활성을 가진다는 것을 알아내었다.The inventors of the present invention have found that avifrone of the following formula (1) has such an activity as a result of screening for substances having a tyrosinase inhibiting activity and a melanin formation inhibiting activity and having low cytotoxicity.

<화학식 1>&Lt; Formula 1 >

상기 아비프린은 수질에서 추출될 수 있다. 수질은 수질과(Hirudinidae)의 환형동물이라는 큰 분류 군에 속하며, 대표적으로 일본의질(Hirudo nipponica Whitman), 마황/관체금선질(Whitmania pigra Whitman) 및 유엽마황/다색질(Whitmania acranulata Whitman)의 건조체를 들 수 있다. The aviprin can be extracted from water. The water quality belongs to the large group of water quality (Hirudinidae) annular animals, and is representative of Japanese quality ( Hirudo nipponica Whitman), Whitmania pigra Whitman and Whitmania acranulata Whitman Dried product.

본 발명의 발명자들은 아비프린의 미백효과를 확인하기 위하여, 미백활성을 갖는 것으로 보고된 알부틴과 티로시나제의 저해활성을 비교하였다. 0.05, 0.01, 0.5, 및 1 mM의 농도로 활성을 측정해 본 결과, 아비프린은 17, 22, 38 및 51%의 저해활성을 보인 반면, 알부틴은 23, 35, 70, 81%의 저해활성을 나타냈었다. 이러한 결과에서 아비프린은 알부틴에 비하여 저해 효과는 약하지만 농도 의존적으로 미백활성을 가진다는 것을 확인하였다.The inventors of the present invention compared the inhibitory activity of arbutin and tyrosinase, which have been reported to have whitening activity, in order to confirm the whitening effect of aviprin. As a result of measuring the activity at concentrations of 0.05, 0.01, 0.5, and 1 mM, abiprin exhibited inhibitory activities of 17, 22, 38 and 51%, while arbutin inhibited 23, 35, 70 and 81% Respectively. From these results, it was confirmed that aviprin had a less inhibitory effect than albutin but had a concentration - dependent whitening activity.

또한, 세포주에 대한 멜라닌 생성억제효과를 확인하기 위하여 멜라노사이트가 생성하는 멜라닌 생성량을 비교하였다. 그 결과, 뮤린 멜라노마 세포주인 B16-F10에서 100 μM로 아비프린을 처리후, 멜라닌 생합성 유도제인 α-MSH를 처리한 결과 34% 가량 멜라닌 생성이 저해되었다. 이러한 멜라닌 생성량 저해정도는 동일 농도로 알부틴을 처리한 대조군에 비하여 약 6% 가량 더 멜라닌 생성을 저해한 것이다(도 10 참조). 이러한, 실험 결과 아비프린은 현재 미백용 화장료 조성물로 사용되고 있는 알부틴에 비하여 우수한 미백활성을 갖음을 확인하였다. In order to confirm melanogenesis inhibitory effect on melanocyte production, melanin production by melanocytes was compared. As a result, treatment with aviprin at 100 μM in the murine melanoma cell line B16-F10, followed by treatment with α-MSH, a melanin biosynthesis inducer, inhibited melanogenesis by about 34%. This degree of inhibition of melanin production inhibited about 6% more melanin formation than the control group treated with the same concentration of arbutin (see FIG. 10). As a result of the experiment, it was confirmed that avifrin had excellent whitening activity as compared with arbutin used as a cosmetic composition for whitening.

아비프린의 B16-F10 멜라노마 세포주에 대한 세포독성을 측정하기 위해, 아비프린을 사용하여 MTT 환원 에세이, LDH 방출 에세이, 세포의 형태학적 변화 관찰, 헤케스트 33342 염색을 실시한 결과, 최고 100 μM의 농도에서도 무처리 대조군과 상응하는 생존율을 가짐으로써 세포독성이 없다는 것을 확인하였다.To determine the cytotoxicity of Avifrin against the B16-F10 melanoma cell line, morphological changes of MTT assay, LDH release assay, cell morphology, and Hestast 33342 staining were performed using aviprin, And that the cells had no cytotoxicity due to the survival rate corresponding to that of the untreated control group.

이와 같은 결과들은 아비프린이 티로시나제 저해활성 및 멜라닌 생성 저해활성이 뛰어나며 항산화활성도 보유하고 있고 B16-F10 멜라노마 세포주에 대한 안전성이 우수하여, 독성으로 인한 유전자 변이, 불안정성 및 피부암 유발 등과 같은 부작용을 가지는 기존의 티로시나제 저해제에 대한 대체가 가능하다는 것을 시사한다. These results demonstrate that avifrin inhibits tyrosinase inhibitory activity and melanin formation inhibitory activity and has antioxidative activity and is safe against B16-F10 melanoma cell line and has side effects such as gene mutation, instability and skin cancer induced by toxicity Suggesting that replacement of existing tyrosinase inhibitors is possible.

따라서, 본 발명은 일구현예로서 아비프린을 유효성분으로 포함하는 티로시나제 저해활성을 가지는 조성물을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a composition having a tyrosinase inhibitory activity comprising, as an effective ingredient, aviprin as an embodiment.

본 발명의 다른 일구현예로서 아비프린을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 생성 저해활성을 가지는 조성물을 제공한다.As another embodiment of the present invention, there is provided a composition having melanin formation inhibitory activity comprising aviprin as an active ingredient.

본 발명의 일구현예로서 미백효과를 가지는 조성물을 제공한다.As one embodiment of the present invention, there is provided a composition having a whitening effect.

본 발명의 다른 일구현예로서 아비프린을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 과다 생성으로 인한 질병의 예방, 개선, 치료용 조성물을 제공한다.As another embodiment of the present invention, there is provided a composition for preventing, ameliorating, and treating diseases caused by melanin excess production comprising aviprin as an active ingredient.

또한, 본 발명의 다른 일구현예로서 항산화활성을 가지는 조성물을 제공한다.In another embodiment of the present invention, there is provided a composition having an antioxidative activity.

본 발명에서 제공하는 조성물에는 일구현예로서 화장료 조성물, 의약 조성물, 식품 조성물, 식품첨가제 조성물이 포함된다.The composition provided in the present invention includes cosmetic compositions, medicinal compositions, food compositions, and food additive compositions in one embodiment.

또한, 아비프린은 아비프린 단독으로 사용될 수 있다. 또한, 상기 아비프린은 수질추출물에 포함된 형태일 수 있다. 또한, 상기 수질추출물은 수질에 수질 중량의 약 1 내지 30배, 필요할 경우 그 이상의 용매를 첨가하여, 약 10 ℃ 내지 100 ℃에서 약 1시간 내지 5일 동안 침지추출, 열탕추출, 환류순환, 압력추출 등의 방법으로 추출한 후, 여과(또는 원심분리 후 여과)하여 제조할 수 있으며, 감압농축, 동결건조 등의 방법을 추가로 사용할 수 있다. 상기 용매는 물, 탄소 수 1 내지 4의 저급알코올, 프로필렌글리콜, 초산에틸, 부틸렌글리콜, 에테르 및 클로로포름으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 혼합 용매인 것일 수 있다.Also, aviprin can be used as aviprin alone. In addition, the aviprin may be a form contained in a water-extract. The water quality extract may be prepared by adding about 1 to 30 times the weight of the water quality to the water quality and adding more solvent if necessary, and performing the immersion extraction for about 1 hour to 5 days at about 10 캜 to 100 캜, Extraction by extraction or the like, followed by filtration (or centrifugal separation and filtration), followed by vacuum concentration, freeze-drying, and the like. The solvent may be one or more mixed solvents selected from the group consisting of water, lower alcohols having 1 to 4 carbon atoms, propylene glycol, ethyl acetate, butylene glycol, ether and chloroform.

아비프린은 액상, 분말, 또는 과립형태일 수 있으며, 이로 제한되지 않는다.Aviprin may be in the form of liquid, powder, or granules, but is not limited thereto.

본 발명의 조성물은 의약용, 식품용, 화장용 등으로 사용가능하며 용도에 맞도록 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들어, 비경구 또는 경구 투여가 가능하며, 투여 방법에 따라 적절한 제형으로 제조된다. 본 발명에 따른 조성물은 제형에 따라 통상의 방법에 의해 제조될 수 있다. The composition of the present invention can be used for medicines, foods, cosmetics, etc., and can be administered by any method to suit the application. For example, parenteral or oral administration is possible, and it is prepared into a suitable formulation depending on the administration method. The composition according to the present invention can be prepared by a conventional method according to the formulation.

아비프린은 멜라닌 생성 저해활성이 있으며, 항산화활성을 가지고 있고, 세포독성이 낮으므로 화장료 조성물에 포함되어 사용이 가능하다. 특히 미백용 화장료 조성물로서 사용될 수 있다. Abibprin has an activity to inhibit melanin formation, has an antioxidative activity and is low in cytotoxicity, so it can be used in a cosmetic composition. And can be used particularly as a cosmetic composition for whitening.

본 발명의 화장료 조성물은 총 중량에 대하여 아비프린을 0.001 내지 90중량%, 바람직하게는 0.01 내지 70중량%를 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 화장료는 아비프린 외에 비타민, 펩티드, 다당, 지질 등을 더 포함할 수 있으며, 그 외 통상 화장료에 배합되는 유지성분, 보습제, 계면활성제, 안료, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화방지제, 식물추출물, pH 조정제, 알코올, 향료, 정제수 등을 포함할 수 있으며, 이로 제한되지 않는다.The cosmetic composition of the present invention may contain 0.001 to 90% by weight, preferably 0.01 to 70% by weight, of aviprin relative to the total weight. In addition, the cosmetic composition of the present invention may further contain vitamins, peptides, polysaccharides, lipids and the like in addition to aviprin. In addition, the cosmetic composition of the present invention may further contain a preservative component, a moisturizer, a surfactant, a pigment, an ultraviolet absorber, , Plant extracts, pH adjusters, alcohols, fragrances, purified water, and the like.

본 발명의 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 오일, 왁스, 파우더, 스프레이, 비누, 클렌징, 팩, 파운데이션, 메이컵베이스 및 모발화장료로 구성된 군으로부터 선택된 제형일 수 있으며, 이로 제한되지 않는다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 맛사지 크림, 에센스, 아이크림, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 및 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.The cosmetic composition of the present invention may be in the form of a solution, suspension, emulsion, paste, gel, cream, lotion, oil, wax, powder, spray, soap, cleansing, pack, , But is not limited to. More specifically, it can be manufactured in the form of a flexible lotion, a nutritional lotion, a nutritional cream, a massage cream, an essence, an eye cream, a hair tonic, a shampoo, a rinse, a cleansing cream, a cleansing foam, a cleansing water, a pack, a spray and a powder .

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is a paste, cream or gel, an animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracant, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide may be used as the carrier component .

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.In the case where the formulation of the present invention is a powder or a spray, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used as a carrier component. Especially, in the case of a spray, a mixture of chlorofluorohydrocarbons, propane / Propane, &lt; / RTI &gt; butane or dimethyl ether.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.When the formulation of the present invention is a solution or an emulsion, a solvent, a dissolving agent or an emulsifying agent is used as a carrier component, and examples thereof include water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, , 3-butylglycol, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or sorbitan fatty acid esters.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.In the case where the formulation of the present invention is a suspension, a carrier such as water, a liquid diluent such as ethanol or propylene glycol, a suspending agent such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, Cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tracant, etc. may be used.

본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
When the formulation of the present invention is a surfactant-containing cleansing, the carrier component may include aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivative, methyltaurate, sarcosinate, fatty acid amide ether Alkylamido betaine, aliphatic alcohol, fatty acid glyceride, fatty acid diethanolamide, vegetable oil, lanolin derivative, or ethoxylated glycerol fatty acid ester.

또한, 아비프린은 티로시나제 과다 활성, 멜라닌 과다 생성으로 인한 질병의 예방 및 치료용 의약 조성물, 멜라닌 생성 저해용 의약 조성물 또는 항산화용 의약 조성물에 포함될 수 있다. In addition, aviprin can be included in a medicinal composition for prevention and treatment of hyperactivity of tyrosinase, diseases caused by excessive production of melanin, a pharmaceutical composition for inhibiting melanin production or a pharmaceutical composition for antioxidation.

멜라닌 과다 생성으로 인한 질병으로는 홍반, 색소침착, 피부의 흑화 현상, 피부노화, 피부암 유발, 멜라닌 전구물질들에 의한 독성으로 세포사멸 등을 들 수 있으며, 이로 제한되지 않는다. 아비프린은 이를 위하여 전신투여(예를 들어 경구 투여) 및 국소투여(예를 들어 피부도포) 방법을 각각 또는 동시에 사용할 수 있다.Diseases caused by melanin overgrowth include, but are not limited to, erythema, pigmentation, skin blackening, skin aging, skin cancer induction, and cell death due to toxicity by melanin precursors. Abiprin can be used for this purpose, either by systemic administration (for example oral administration) and topical administration (for example, by skin application), respectively, or simultaneously.

본 발명에 있어서, 아비프린은 조성물 전량 중, 0.0005 내지 30중량%, 바람직하게는 0.01 내지 10중량% 포함될 수 있으나, 목적에 따라 얼마든지 조절이 가능하다. 본 발명의 조성물의 최적 투여량은 연령, 개인차, 증상 등에 따라 적절히 결정되지만, 사람에게 투여하는 경우의 투여량은 통상 0.01 내지 100 mg/kg, 바람직하게는 0.1 내지 10 mg/kg이며, 이 양을 1일 1회 또는 수 회 나누어 투여할 수 있다.In the present invention, abiprin may be contained in an amount of 0.0005 to 30% by weight, preferably 0.01 to 10% by weight, based on the total amount of the composition. The optimal dose of the composition of the present invention is appropriately determined according to age, individual differences, symptoms and the like, but the dose when administered to a human is usually 0.01 to 100 mg / kg, preferably 0.1 to 10 mg / kg, May be administered once or several times a day.

본 발명의 조성물은 고형제, 용액제, 유제, 분산제, 미셀, 리포좀, 연고제 등의 형태로 사용될 수 있고, 경구 또는 비경구로 적용하기에 적합한 유기 또는 무기 담체 또는 부형제가 함께 포함될 수 있다. 본 발명의 조성물은, 예를 들면 정제, 산제, 펠렛제, 캡슐제, 환제, 좌약제, 용액제, 유제, 현탁제, 액제, 젤리, 주사제 및 사용하기에 적합한 임의의 기타 형태에 대해 일반적으로 비독성인 제약상 허용되는 담체와 함께 혼합될 수 있다. 사용 가능한 담체에는 고체상, 반고체상 또는 액체상의 포도당, 유당, 아라비아 고무, 젤라틴, 만니톨, 전분 페이스트, 삼규산 마그네슘염, 활석, 옥수수 전분, 각질 (角質), 콜로이드 성 실리카, 감자 전분, 우레아, 쇄 길이가 중간 정도인 트리글리세리드, 덱스트란 및 제제의 제조에 사용하기에 적합한 기타 담체가 포함된다. 또한, 보조제, 안정화제, 증점제, 착색제 및 향료제가 사용될 수 있다.The composition of the present invention can be used in the form of solid, solution, emulsion, dispersant, micelle, liposome, ointment and the like, and organic or inorganic carrier or excipient suitable for oral or parenteral application may be included. The composition of the present invention may be administered orally or parenterally, for example, in the form of tablets, powders, pellets, capsules, pills, suppositories, solutions, emulsions, suspensions, solutions, jellies, Can be mixed with a non-toxic pharmaceutically acceptable carrier. Usable carriers include solid, semi-solid or liquid glucose, lactose, gum arabic, gelatin, mannitol, starch paste, magnesium trisilicate, talc, corn starch, keratin, colloidal silica, potato starch, urea, Triglycerides, dextran, and other carriers suitable for use in the preparation of formulations. Adjuvants, stabilizers, thickeners, coloring agents and perfumes can also be used.

또한, 본 발명은 아비프린을 유효성분으로 함유하는 티로시나제 활성 저해, 멜라닌 생성 저해, 항산화를 위한 식품 조성물 또는 식품첨가물 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 멜라닌 과다 생성으로 인한 질병의 예방 및 개선용 식품 조성물 또는 식품첨가물 조성물을 제공한다. 본 발명의 아비프린을 포함하는 식품 조성물 또는 식품첨가물 조성물은 단독으로 또는 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. The present invention also provides a food composition or food additive composition for inhibiting tyrosinase activity, inhibiting melanin formation, and antioxidation, which comprises aviprin as an active ingredient. The present invention also provides a food composition or a food additive composition for preventing or ameliorating diseases caused by excessive melanin production. The food composition or food additive composition comprising aviprin of the present invention can be suitably used alone or in combination with other food or food ingredients according to conventional methods. The amount of the active ingredient to be mixed can be suitably determined according to the intended use.

일반적으로, 아비프린은 식품 또는 음료제조 시에 원료에 대하여 각각 0.0001 내지 30중량%, 바람직하게는 0.1 내지 10중량%의 양으로 첨가될 수 있으나, 첨가되는 양은 목적에 따라 얼마든지 조절이 가능하다. 상기 식품의 종류에 특별한 제한은 없으며, 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디 류, 스낵 류, 과자 류, 피자, 라면, 기타 면 류, 껌 류, 아이스크림 류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있다.
In general, aviprin can be added in an amount of 0.0001 to 30% by weight, preferably 0.1 to 10% by weight, based on the raw material in the production of food or beverage, but the added amount can be controlled as much as desired . There is no particular limitation on the kind of the food. Examples of the food include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, dairy products including ice cream, Drinks, tea, drinks, alcoholic beverages, and vitamin complexes.

이하, 본 발명을 실시 예에 의하여 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.

실시예 1. 실험재료 준비Example 1. Preparation of experimental material

1.1. 실험용 시료 준비 1.1. Preparation of experimental sample

본 실험에서 사용된 수질수출물은 경남 산청군 지리산대한당영농조합법인으로부터 제공받아 실험에 사용하였다. 멜라닌 생성 세포주 배양을 위해 필요한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS) 및 penicillin, streptomycin은 Gibco-BRL (Grand Island, NY, USA)로부터 구입하였으며 미백활성평가를 위해 사용된 티로시나제, 티로신(tyrosine), 알부틴(arbutin), α-MSH와 세포독성평가를 위해 사용된 3-[4,5-dime-thylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT), dimethyl sulfoxide (DMSO)는 Sigma chemical CO. (St. Louis, MO, USA)으로 부터, LDH (lactate dehydrogenase) release assay kit는 Wako Pure chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan)으로부터 구입하였다. 그 외의 연구에 사용된 여러 가지 용매 및 시약은 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다.The water quality exports used in this experiment were supplied to the experiment by the Korean Confectionery Association of Jiri, Sancheong - gun, Gyeongsangnam - do. Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS) and penicillin and streptomycin were purchased from Gibco-BRL (Grand Island, NY, USA) for typhinase- tyrosine, arbutin, α-MSH and 3- [4,5-dime-thylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT), dimethyl sulfoxide DMSO) was purchased from Sigma chemical CO. (St. Louis, MO, USA), the LDH (lactate dehydrogenase) release assay kit was purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan). All of the various solvents and reagents used in the other studies were of grade 1 or higher.

1.2. 세포주 배양 및 처리1.2. Cell culture and treatment

아비프린의 미백제로써의 활성과 피부세포주에 대한 안전성을 평가하기 위해 한국세포주은행(KCLB, Seoul)으로부터 마우스 유래 흑색종 세포주 B16-F10을 분양받아 본 실험에 사용하였다. 세포배양을 위해 DMEM에 10% FBS(fetal bovine serum) 및 100 units/mL의 penicillin, 100 ㎍/mL의 streptomycin, 3.5 mg/mL의 NaHCO₃을 첨가하여 사용하였다. 95%의 습도가 유지되는 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터 (MCO-18-AIC, SANYO, Osaka, Japan)에서 배양하였으며, 멜라닌의 생성을 유도하기 위해 1 μM의 α-MSH(α-Melanocyte stimulating hormone, α-MSH)를 처리하였다.The mouse-derived melanoma cell line B16-F10 was purchased from Korean Cell Line Bank (KCLB, Seoul) to evaluate the activity of avifrin as a whitening agent and safety against skin cell lines. For cell culture, 10% FBS (fetal bovine serum), 100 units / mL penicillin, 100 ㎍ / mL streptomycin and 3.5 mg / mL NaHCO ₃ were added to DMEM. The cells were cultured in a 5% CO ₂ incubator (MCO-18-AIC, SANYO, Osaka, Japan) maintained at a humidity of 95%. To induce the production of melanin, 1 μM α-MSH (α-Melanocyte stimulating hormone, alpha-MSH).

1.3. 통계 처리 방법1.3. Statistical processing method

모든 자료는 SPSS-PC+ 통계 package를 사용하여 처리하였다. 각 항목에 따라 백분율과 평균치 ± 표준편차(SD)를 구하고, 각 농도별 DPPH, ABTS 라디칼 소거능의 차이와 티로시나제 저해활성, 세포생존율, 멜라닌 함량 비교는 one way ANOVA법으로 분산분석을 하였으며, 유의성 검정은 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test로 실시하였다.
All data were processed using the SPSS-PC + statistical package. The percentages and the mean ± SD (SD) were calculated for each item. The differences in DPPH and ABTS radical scavenging ability, tyrosinase inhibitory activity, cell viability, and melanin content were analyzed by one way ANOVA method. Was performed at Duncan's multiple range test at p <0.05.

실시예 2. 아비프린의 수득Example 2. Obtaining aviprin

2.1. 수질추출물로부터 아비프린의 분리 및 정제2.1. Isolation and purification of aviprin from water quality extracts

수질 1.2 kg을 water 3 L를 가하여 열수 추출한 후, 이 추출액을 40℃에서 회전감압농축기(EYELA N-1000, Tokyo, Japan)를 이용하여 수질 물 추출물을 얻었으며, 이를 극성과 비극성 용매 조건에 따라 분리하기 위해 물 1 L을 부가한 후, 헥산(hexane)을 이용하여 헥산층과 물층으로 나누고, 물층은 다시 디에틸 에테르(diethyl ether)를 부가하여 분배 추출하였다. 디에틸 에테르 층에서 티로시나제 저해활성을 확인한 후, CHCl₃:MeOH (50:1 ~ 1:1) 전개용매를 이용하여 silica-gel flash column (Ø6.5X40 cm) 크로마토그래피를 실시하고 각 분획(fraction)을 silica-gel TLC를 수행하여 모니터링 하였으며, bioassay를 통해 티로시나제 저해활성을 평가하였다. 그 결과를 바탕으로 강력한 활성을 나타내는 CHCl₃:MeOH = 20:1 fraction을 high performance liquid chromatography (HPLC)를 실시하여 최종적으로 활성성분을 분리하였다(도 1 참조). 분리한 물질이 단일물질인지 확인하기 위해 HPLC를 실시하여 15% acetonitrile로 이동상을 ODS column (Ø4.6×150 mm)에 흘려주었을 때, 약 85분경에 활성물질의 피크(peak)를 확인하였고 분리된 물질이 단일물질임을 알 수 있었으며, 이를 아비프린(aviprin)이라 명명하였다(도 2 참조). 1.2 kg of water was extracted by hot water extraction with 3 L of water. The extract was extracted with water using a rotary evaporator (EYELA N-1000, Tokyo, Japan) at 40 ° C, To separate, 1 L of water was added, and then the hexane layer and the water layer were separated by using hexane. The water layer was further extracted with diethyl ether. After confirming tyrosinase inhibitory activity in the diethyl ether layer, chromatography on silica-gel flash column (Ø 6.5 × 40 cm) was carried out using CHCl ₃ : MeOH (50: 1 to 1: 1) ) Was monitored by silica-gel TLC and the tyrosinase inhibitory activity was assessed by bioassay. Based on the results, high performance liquid chromatography (HPLC) of CHCl ₃ : MeOH = 20: 1 fraction showing strong activity finally separated active components (see FIG. 1). When the mobile phase was eluted with 15% acetonitrile in an ODS column (Ø4.6 × 150 mm) by HPLC to confirm that the separated substance was a single substance, the peak of the active substance was observed at about 85 minutes, , And it was named aviprin (see FIG. 2).

2.2. 아비프린의 물리, 화학적 특성2.2. Physicochemical properties of aviprin

아비프린의 분자량과 분자식을 확인하기 위해 ESI-Mass spectrum을 positive mode에서 측정한 결과, 도 3과 같이 [M+Na]⁺가 m/z 327.1에서 관찰되어 분자량이 304임을 알 수 있었고, 분자식이 C₁₆H₁₆O₆로 결정되었다. As a result of measuring the ESI-Mass spectrum in positive mode to confirm the molecular weight and molecular formula of aviprin, [M + Na] ⁺ was observed at m / z 327.1 as shown in FIG. 3, C ₁₆ H ₁₆ O ₆ .

2.3.2.3. 아비프린의 구조결정Structure determination of aviprin

아비프린의 구조결정을 위해 ¹H-NMR spectrum을 측정한 결과, 도 4와 같이 8.43 ~ 6.28 ppm 사이에 4개의 methine proton, 7.78 ppm 부근에 oxymethine proton, 4.38 ~ 4.79 ppm 부근에 두 개의 oxygenated methylene proton, 1.23 ~ 1.29 ppm 사이에서 2개의 methyl proton이 관찰되었다. 또한 도 5과 같이 ¹³C-NMR 스펙트럼(spectrum)을 측정한 결과, 163.3 ppm에서 한 개의 carbonyl carbon, 141.7 ~ 94.6 ppm 사이에서 4개의 methine carbon, 146.8 ppm 부근에 oxymethine carbon, 150.8 ~ 159.8 ppm 사이에서 3개의 oxygenated carbon, 75.8 ppm에서 methylene carbon, 24.8 ~ 27.2 ppm 사이에 2개의 methyl carbon이 관찰되었으며, ¹H-NMR spectrum과 개연성이 있다는 것을 확인할 수 있었다. Quarternary carbon의 존재유무와 H와 C의 연결고리를 알기위해 HMQC spectrum (도 6)을 측정하여 해석한 결과, 모든 proton-bearing carbon (¹ J _C-H)을 규명할 수 있었고, 모든 assign을 통해 Table 1의 ¹H-¹³C NMR chart를 완성할 수 있었으며, 4개의 olefinic methine, 2개의 methyl, 2개의 methylene과 ester를 확인함으로써 본 구조는 furano-coumarin계 화합물로 예측할 수 있었다.As a result of the ¹ H-NMR spectrum measurement for the structure determination of aviprin, four methine proton between 8.43 and 6.28 ppm, oxymethine proton near 7.78 ppm and two oxygenated methylene proton near 4.38 to 4.79 ppm , And two methyl protons were observed between 1.23 and 1.29 ppm. As shown in FIG. 5, ¹³ C-NMR spectrum was measured. As a result, one carbonyl carbon at 163.3 ppm, four methine carbon at 141.7 to 94.6 ppm, oxymethine carbon at about 146.8 ppm, and oxygen at 150.8 to 159.8 ppm 3 methylene carbon was observed between three oxygenated carbon, 75.8 ppm and methylene carbon between 24.8 and 27.2 ppm, and it was confirmed that there was a probability of ¹ H-NMR spectrum. As a result of analyzing and analyzing the HMQC spectrum (Fig. 6) for the existence of quarternary carbon and the linkage of H and C, all proton-bearing carbon ( ¹ J _CH ) ¹ H- ¹³ C NMR chart of the structure was confirmed. By confirming four olefinic methines, two methyls, two methylenes and esters, the structure could be predicted as a furano-coumarin compound.

아비프린의 부분구조를 규명하기 위해 ¹H-¹H COSY spectrum (도 7 참조)을 통해 ¹H-¹H 간의 cross peak를 확인한 결과, H-2과 H-3, H-7과 H-8, H-12과 H-13 사이의 COSY 연결을 통해 furan과 coumarin, isoprenyl기를 포함하는 3개의 부분구조를 규명할 수 있었다. 또한 3개의 부분구조 간의 연결고리를 확인하기 위해 HMBC spectrum (도 8 참조)을 측정하여 해석한 결과, H-2 (δ_H 6.28)으로부터 C-1 (δ_C 163.3), C-4 (δ_C 108.3)에, H-3 (δ_H 8.43)으로부터 C-1 (δ_C 163.3)과 C-11 (δ_C 153.9)에, H-10 (δ_H 7.19)으로부터 C-4 (δ_C 108.3), C-6 (δ_C 115.4), C-9 (δ_C 159.8), C-11 (δ_C 153.9)에 대한 long-range coupling을 통해 coumarin moiety를 assign할 수 있었고, H-7 (δ_H 7.22)으로부터 C-6 (δ_C 115.4), C-9 (δ_C 159.8)에, H-8 (δ_H 7.78)으로부터 C-6 (δ_C 115.4), C-9 (δ_C 159.8)에 대한 long-range coupling을 통해 furan moiety를 assign함과 동시에 coumarin과 연결고리를 확인함에 따라 furano-coumarin moiety를 결정할 수 있었다. H-13 (δ_H 3.81)으로부터 C-15 (δ_C 27.2), C-16 (δ_C 24.8)에, H-15 (δ_H 27.2)으로부터 C-13 (δ_C 78.1), C-14 (δ_C 72.7), C-16 (δ_C 24.8)에, H-16 (δ_H 1.23)으로부터 C-13 (δ_C 78.1), C-14 (δ_C 72.7), C-15 (δ_C 27.2)에 대한 long-range coupling을 통해 isoprenyl 부분구조를 결정할 수 있었다. 또한, furano-coumarin과 isoprenyl기의 연결고리를 확인한 결과, H-3 (δ_H 8.43)과 H-12 (δ_H 4.38, 4.79)으로부터 C-5 (δ_C 150.8)에 대한 long-range coupling을 통해 isoprenyl기가 furano-coumarin moiety에 결합된 구조임을 확인할 수 있었다(표 1 참조). To identify a partial structure of the AVI printer ¹ H- ¹ H COSY spectrum (see Fig. 7) ¹ H- ¹ results confirm the cross peak between H, H-2 and H-3, H-7 and H-8 through , We could identify three partial structures including furan, coumarin and isoprenyl groups through the COZY link between H-12 and H-13. In addition, _C-1 (δ C 163.3) from the HMBC spectrum (Fig. 8 refer), the measured _{analysis, H-2 (δ H 6.28} ) in order to check the link between the three part structure, _C-4 (δ C _C-4 (δ C 108.3) from the _C-1 (δ C 163.3) and _C-11 (δ C 153.9) _{to, H-10 (δ H 7.19} ) _{from, H-3 (δ H 8.43} ) to 108.3) _{C-6 (δ C 115.4)} , C-9 (δ C 159.8), C-11 for (δ _C 153.9) we were able to assign the coumarin moiety via long-range coupling, H-7 (δ H 7.22) from the _{C-6 (δ C 115.4)} , C-9 (δ C 159.8) _{to, H-8 (δ H 7.78} ) C-6 (δ C 115.4), long- for the _C-9 (δ C 159.8) from range coupling to assign furan moiety and identify coumarin and its linkage to determine the furano-coumarin moiety. H-13 C-15 (δ C 27.2), C-16 (δ C 24.8), H-15 C-13 (δ C 78.1), C-14 from (δ _H 27.2) in from (δ _H 3.81) ( _{δ C 72.7), C-16} (δ C 24.8) _{to, H-16 (δ H 1.23} ) from the _{C-13 (δ C 78.1)} , C-14 (δ C 72.7), C-15 (δ C 27.2) The isoprenyl partial structure was determined by long-range coupling to In addition, long-range coupling from C-5 (δ _C 150.8) to H-3 (δ _H 8.43) and H-12 (δ _H 4.38, 4.79) was confirmed by the linkage between furano-coumarin and isoprenyl group Showed that the isoprenyl group was bound to the furano-coumarin moiety (see Table 1).

따라서 ¹H-¹H COSY spectrum에 의하여 규명된 세 개의 부분구조를 HMBC spectrum을 통해 연결할 수 있었고, 여러 문헌조사를 통해 기존화합물인 furano-coumarin계 화합물인 아비프린이라는 것을 알 수 있었다(표 1 및 도 9 참조). Therefore, the three partial structures identified by the ¹ H- ¹ H COZY spectrum were able to be connected through the HMBC spectrum, and it was found through the literature that the compound was a furano-coumarin compound, abiprin (Table 1 and 9).

<표 1> 아비프린의 <Table 1> ^1One H 및 H and ¹³¹³ C NMR의 이동C NMR shift

실시예 3. 아비프린의 세포독성 확인Example 3. Cytotoxicity of aviprin

3.1. MTT 법을 통한 세포독성 확인3.1. Cytotoxicity through MTT assay

아비프린이 B16-F10 세포주 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT 환원 에세이로 세포생존율을 측정하였다. B16-F10 세포주를 96-well plate에 3×10⁴ cells/mL의 농도로 각 well에 100 μL씩 분주하여 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양한 후, 아비프린을 각각 5, 10, 50, 100 μM의 최종농도가 되도록 세포주에 처리하고 대조군의 경우 1% DMSO가 되도록 처리한 후 각각 24, 48, 72시간 동안 배양하였다. 그 후 PBS 완충액에 녹인 MTT (5 mg/mL) 용액을 10 μL씩 첨가하고 30분 동안 반응시켜 formazan 형성을 확인하고, 배지를 완전히 제거 후 100 μL의 DMSO를 첨가하여 ELISA reader (Model 680, Bio Rad, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 아비프린을 처리하지 않고 배양시킨 대조군 세포의 생존율을 100%로 하였을 때의 상대적인 세포생존율을 구하였다.To determine the effect of aviprin on B16-F10 cell proliferation, cell viability was measured by MTT reduction assay. B16-F10 cells were plated in 96-well plates at a concentration of 3 × 10 ⁴ cells / mL in each well. After incubation for 24 hours at 37 ° C in a 5% CO ₂ incubator, 10, 50, and 100 μM, and the cells were treated with 1% DMSO for 24, 48, and 72 hours, respectively. Then, 10 μL of MTT (5 mg / mL) dissolved in PBS buffer was added, and formazan formation was confirmed by reacting for 30 minutes. After removing the medium completely, 100 μL of DMSO was added to the ELISA reader (Model 680, Bio Rad, USA) at 540 nm. Relative cell viability was determined when the survival rate of control cells cultured without treatment with aviprin was 100%.

3.2. LDH 방출법을 통한 세포 독성 확인3.2. Identification of cytotoxicity by LDH release method

B16-F10 세포주에 대한 아비프린의 세포독성을 확인하기 위해 LDH 방출 어세이를 실시하였다. B16-F10 세포주를 96-well plate에 3X10⁴ cells/mL의 농도로 100 μL씩 분주하여 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양한 후, MTT 환원 에세이와 동일한 조건으로 24, 48, 72시간 동안 배양하였다. 배양액의 상층액 부분을 새로운 96-well plate에 50 μL씩 분주하고, LDH 반응액을 50 μL씩 첨가하여 상온에서 정치시킨 후, 20분간 반응을 시켰다. 색의 변화로 반응이 완료되는 것을 확인한 후 정지액(stop solution)을 100 μL씩 첨가하여 반응을 중지시키고 ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하여 LDH의 방출량을 측정하였다. 세포 내 LDH를 측정하기 위해서 배양액을 제거한 후, 0.5% Triton X-100용액을 50 μL씩 첨가하여 10분 동안 shaking하여 세포막을 제거하고 LDH 반응액을 50 μL씩 첨가하여 반응시킨 후 정지액을 넣은 뒤, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. LDH에 대한 세포독성의 백분율은 배양액과 세포 내에서 유리된 총 LDH에 대한 배양액으로부터 유리된 LDH의 값을 무처리 대조군 값에 대한 백분율로 계산하였다.An LDH release assay was performed to determine the cytotoxicity of aviprin to the B16-F10 cell line. B16-F10 cells were plated in 96-well plates at a concentration of ³ × 10 ⁴ cells / mL in a 100 μL aliquot. The cells were cultured in a 5% CO ₂ incubator at 37 ° C. for 24 hours. And cultured for 72 hours. 50 μL of the supernatant was dispensed into a new 96-well plate, and 50 μL of the LDH reaction solution was added. The mixture was allowed to stand at room temperature, and then reacted for 20 minutes. After confirming that the reaction was completed by changing the color, the reaction was stopped by adding 100 μL of stop solution and the absorbance at 540 nm was measured with an ELISA reader to measure the amount of LDH released. To measure intracellular LDH, remove 50 μl of 0.5% Triton X-100 solution, shake for 10 minutes, remove the cell membrane, add 50 μL of LDH reaction solution, add stop solution Then, the absorbance was measured at 540 nm. The percentage of cytotoxicity to LDH was calculated as the percentage of untreated control values for LDH released from the culture medium for total LDH released in culture and cells.

3.3. 형태 변화 측정을 통한 세포 독성 확인3.3. Determination of cytotoxicity through measurement of morphological change

아비프린에 의한 색소형성세포주의 수지상 돌기 변화와 세포사멸에 대한 영향을 확인하기 위하여 inverted microscope를 이용하여 B16-F10 세포주의 형태학적 변화를 관찰하였다. B16-F10 세포주를 6-well plate에 3X10⁴ cells/mL의 농도가 되도록 2 mL씩 첨가한 후 24시간 동안 배양하고, 아비프린을 각각 50, 100 μM의 최종농도가 되도록 처리하고, 대조군의 경우 1% DMSO가 되도록 처리한 후 24, 48, 72시간 동안 배양하여 관찰하였다. 위상차 현미경(Nikon, Tokyo, Japan)를 이용하여 형태학적 특징을 100 배율로 사진 촬영하였다.The morphological changes of B16-F10 cell line were observed using an inverted microscope in order to confirm the effect of avifrin on the dendritic processes and cell death of pigmented cell lines. B16-F10 cells were added to a 6-well plate at a concentration of ³ × 10 ⁴ cells / mL, followed by incubation for 24 hours. Abibprin was treated to a final concentration of 50 μM and 100 μM, respectively. 1% DMSO, and cultured for 24, 48, and 72 hours. Morphological features were photographed at 100 magnification using a phase contrast microscope (Nikon, Tokyo, Japan).

3.4. 헤케스트 염색을 통한 세포 독성 확인3.4. Cytotoxicity through Hecest staining

아비프린의 B16-F10 세포주에 대한 아폽토시스 유무를 확인하기 위해 헤케스트 33342 염색을 실시하였다. 아폽토시스의 형태학적 특징 중의 하나인 핵의 변화를 관찰하기 위해서 핵 내 DNA에 특이적으로 결합하는 형광염색제인 헤케스트 33342를 사용하여 핵을 염색하고 형광현미경으로 관찰하였다. 세포를 6-well plate에 3X10⁴ cells/mL로 24시간 동안 배양하여 아비프린을 각각 50, 100 μM 농도로 처리하고 대조군의 경우 1% DMSO가 되도록 처리하여 24, 48, 72시간 동안 배양한 후, PBS 완충액으로 2회 세척하고 10% 포르말린(formalin)으로 고정한 후, 헤케스트 33342 (10 μM)으로 염색하여 형광 현미경 하에서 400 배율로 핵을 관찰하였다.In order to confirm the presence or absence of apoptosis in the B16-F10 cell line of avifrin, Hecest 33342 staining was performed. To observe changes in nuclei, one of the morphological characteristics of apoptosis, nuclei were stained with fluorescence microscope using HEKEST 33342, a fluorescent dye specifically binding to nuclei. Cells were cultured in a 6-well plate at 3 × 10 ⁴ cells / mL for 24 h, and then treated with avifrin at a concentration of 50 μM and 100 μM, respectively. For the control group, the cells were treated with 1% DMSO for 24, 48, , Washed twice with PBS buffer, fixed with 10% formalin, stained with Hessta 33342 (10 μM), and examined under a fluorescence microscope at 400 × magnification.

3.5. 아비프린의 세포 독성 결과3.5. Cytotoxic results of aviprin

피부에 직접 닿는 화장품 원료로서의 안전성을 확인하기 위해 아비프린의 세포독성 평가를 24, 48, 72시간의 time course로 배양을 실시하였다. 색소형성 세포주인 B16-F10의 세포생장에 대해 아비프린이 영향을 미치는지 알아보기 위하여 MTT 환원 에세이와 LDH 방출 에세이, 현미경 관찰, 헤케스트 염색을 실시하여 세포독성을 측정하였다. 아비프린을 각각 5, 10, 50, 100 μM의 최종농도가 되도록 처리한 후 24시간 동안 배양하여 MTT 환원 에세이를 실시한 결과, 대조군을 100%로 하였을 때 아비프린 처리군과 무처리 대조군의 세포생존율의 차이가 없음을 알 수 있었고(도 12a 참조), 동일한 농도 하에서 세포막 손상에 영향을 미치는지 확인하기 위해 세포질 성분인 LDH 방출량을 측정하였다. 그 결과, 무처리 대조군의 LDH 방출량이 20%일 때, 각 농도별로 21, 22, 22, 25%로 대조군과 차이가 없음을 확인할 수 있었다(도 12b 참조). 세포는 외부 환경에 민감하게 자극을 받으면 상해를 입는 것과 동시에 세포사가 유도되어 형태학적인 변화를 나타나게 된다. 따라서 아비프린이 세포의 형태학적인 변화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 위상차 현미경을 이용하여 B16-F10 세포주의 형태학적 변화를 관찰하였다. 세포가 사멸하게 되면 세포독성으로 인하여 전체적인 세포의 수가 줄어들 뿐만 아니라 돌기가 거의 소멸된 양상을 보이며 세포의 형태학적인 큰 변화가 유도되는데 무처리 대조군과 아비프린을 50, 100 μM로 최종처리 된 군에서 동일한 세포의 형태를 관찰할 수 있었다(도 12c 참조). 또한, B16-F10 세포주에서 핵 내 DNA에 특이적으로 결합하는 형광염색제인 헤케스트 33342를 사용하여 핵을 염색하고 형광현미경으로 관찰하였다. 세포가 손상을 받게 되면 아폽토시스 소체가 핵 주변에 나타나 아폽토시스가 유도됨을 확인할 수 있는데 아비프린을 처리한 결과 아무런 영향을 미치지 않고 타원형의 온전한 핵 모양을 나타내었다(도 12d 참조). In order to confirm the safety of cosmetic raw materials directly exposed to the skin, the cytotoxicity evaluation of aviprin was performed in a time course of 24, 48 and 72 hours. To investigate the effect of aviprin on cell growth of the pigmented cell line B16-F10, cytotoxicity was measured by MTT reduction assay, LDH release assay, microscopic observation, and Hecest staining. As a result of MTT reduction assay, avifrin was treated to a final concentration of 5, 10, 50 and 100 μM, respectively, and cultured for 24 hours. As a result, cell viability of the avifin- (See FIG. 12A), and the amount of LDH released as a cytoplasmic component was measured in order to confirm whether or not it affected cell membrane damage under the same concentration. As a result, it was confirmed that when the LDH release amount of the untreated control group was 20%, 21, 22, 22 and 25% of the respective concentrations were not different from the control group (see FIG. 12B). When cells are sensitized to the external environment, they are injured and induce cell death, resulting in morphological changes. Therefore, morphological changes of B16-F10 cell line were observed using a phase contrast microscope to investigate the effect of aviprin on morphological changes of cells. When cells are killed, the number of whole cells is reduced due to cytotoxicity, and the protrusions almost disappear, leading to a large morphological change of cells. Untreated control group and aviprin were treated with 50, 100 μM The same cell morphology could be observed (see Fig. 12C). In addition, nuclei were stained and observed with a fluorescence microscope using Hector 33342, a fluorescent dye that specifically binds to DNA in the nucleus in the B16-F10 cell line. When the cells were damaged, apoptotic bodies appeared around the nucleus and apoptosis was induced. As a result of treatment with aviprin, the nuclei showed an oval shape without any effect (see FIG. 12D).

48시간(도 13 참조)과 72시간(도 14 참조)동안 아비프린을 처리하여 배양한 결과에서도 동일한 결과를 나타낸다는 것을 확인함으로써 아비프린은 색소형성세포주에 대한 독성을 나타내지 않는 안전한 물질임을 입증하였고, 세포사로 인해 나타나는 미백활성이 아님을 규명할 수 있었다.
Confirming that the same results are obtained also in the results obtained by culturing and treating avifrin during 48 hours (see FIG. 13) and 72 hours (see FIG. 14), proving that aviprin is a safe substance showing no toxicity to pigmentation cell lines , But not whitening activity due to cell death.

실시예 4. 아비프린의 항산화 활성 측정Example 4. Measurement of antioxidative activity of aviprin

4.1. DPPH 라디칼 소거능 측정4.1. Measurement of DPPH radical scavenging ability

아비프린의 DPPH 라디칼 소거능(RSA)을 알아보기 위해 Thitilerdecha 등의 방법을 실험에 맞게 변형하여 사용하였다. 시료(아비프린 0.05, 0.1, 0.5, 1 mM) 20 μL에 0.2 mM DPPH 용액 80 μL를 첨가하여 10초 동안 섞은 후 실온에서 12시간 방치한 후 490 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 양성 대조군으로는 Vitamin-C (1 mg/mL)를 사용하였다. To investigate the DPPH radical scavenging activity (RSA) of aviprin, Thitlerdecha et al. 80 μL of 0.2 mM DPPH solution was added to 20 μL of the sample (avifrin 0.05, 0.1, 0.5, 1 mM), mixed for 10 seconds, left at room temperature for 12 hours, and absorbance was measured at 490 nm. As a positive control, C (1 mg / mL) was used.

4.2.4.2. ABTS 라디칼 소거능 측정Measurement of ABTS radical scavenging ability

ABTS 라디칼을 이용하여 아비프린의 항산화활성을 측정하였다. 96-well plate에 아비프린 (0.05, 0.1, 0.5, 1 mM) 100 μL를 첨가한 후 0.1 M의 phosphate buffer (pH 5.0) 100 μL와 10 mM의 H₂O₂ 20 μL을 가하여 37 ℃에서 5분간 예비반응 시켰다. 예비반응 된 혼합물에 1.25 mM의 ABTS 30 μL와 5 Unit/mL 페록시다제를 30 μL 첨가하여 37 ℃에서 10분간 반응 시킨 후, 415 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 양성 대조군으로는 Vitamin-C (100 μg/mL)를 사용하여 분석하였다.Antioxidative activity of aviprin was measured using ABTS radical. 100 μL of avidin (0.05, 0.1, 0.5, 1 mM) was added to a 96-well plate, and then 100 μL of 0.1 M phosphate buffer (pH 5.0) and 20 μL of 10 mM H ₂ O ₂ were added thereto. Minute preliminary reaction. 30 μL of 1.25 mM ABTS and 30 μL of 5 Unit / mL peroxidase were added to the pre-reacted mixture and incubated at 37 ° C for 10 minutes. Absorbance was measured at 415 nm. Vitamin-C (100 μg / mL).

4.3. 아비프린의 항산화 효과4.3. Antioxidant effect of aviprin

H₂O₂를 비롯한 다양한 활성산소종은 세포 외 기작의 주요 조절인자로써, 특히 자외선 조사로 인해 피부 내 생성된 활성산소종은 색소형성세포주를 자극시켜 멜라닌 생성기작을 촉진시킨다. 이처럼 세포 외의 멜라닌 생합성의 자극요소인 활성산소종을 제거함으로써 효과적인 미백활성을 나타낼 수 있다. 그러므로 가장 안정한 라디칼인 DPPH 라디칼을 이용하여 in vitro에서 아비프린의 환원력을 측정하여 항산화활성을 확인하고자 하였다. 아비프린을 각각의 농도인 0.05, 0.01, 0.5, 1 mM로 활성을 측정한 결과, 6, 1, 53, 73%의 농도 의존적인 라디칼 소거능을 보였고(도 11a 참조), 이미 보고되어진 항산화 활성연구에서 아비프린의 DPPH 라디칼 소거활성과 일치하는 결과임을 확인할 수 있었다. 수용성, 지용성 항산화제 모두 적용이 가능하고, 실험법이 비교적 간단하며 감도가 좋은 장점을 가지는 ABTS 라디칼 소거능을 DPPH 에세이와 같은 농도 설정을 통해 항산화효과를 평가하였다. 그 결과(도 11b 참조), 1, 3, 8, 36%의 농도 의존적인 라디칼 소거능으로 아비프린은 항산화활성을 가짐으로서 활성산소를 소거하여 멜라닌 생성 촉진 저해와 피부노화 방지 가능성을 유추할 수 있었다. 이는 즉, 아비프린이 자외선에 의해 생성된 피부 속 자유 라디칼을 소거시켜 피부노화를 방지시킬 뿐만 아니라, 색소형성세포주에 대한 자극을 저해시킴으로써 1차적인 멜라닌 생성 유도를 억제시킬 수 있다는 사실을 확인하였다.
Various active oxygen species such as H ₂ O ₂ are the main regulators of extracellular mechanisms. In particular, reactive oxygen species generated in the skin due to ultraviolet irradiation stimulate pigmentation cell lines to promote melanogenesis. Thus, it is possible to exhibit an effective whitening activity by removing active oxygen species which is a stimulating factor of extracellular melanin biosynthesis. Therefore, we tried to determine the antioxidant activity by measuring the abiplin reducing power in vitro using the most stable radical, DPPH radical. The activity of avifrin was measured at the concentrations of 0.05, 0.01, 0.5, and 1 mM at concentrations of 6, 1, 53, and 73%, respectively (FIG. 11A) , Which is consistent with the DPPH radical scavenging activity of aviprin. The antioxidative effect of ABTS radical scavenging ability, which is applicable to both water soluble and lipid soluble antioxidants, and which has a relatively simple and sensitive method, was evaluated by the same concentration setting as the DPPH test. As a result (see FIG. 11B), aviprin was found to have antioxidative activity by concentration-dependent radical scavenging ability of 1, 3, 8, and 36%, so that active oxygen was abolished to suggest inhibition of melanogenesis promotion and prevention of skin aging . That is, it was confirmed that avifrin cleaves free radicals in the skin caused by ultraviolet rays to prevent skin aging, and inhibits stimulation of pigmentation cell lines, thereby inhibiting primary melanogenesis induction .

실시예 5. 아비프린의 미백 활성 확인Example 5. Confirmation of whitening activity of aviprin

5.1. 티로시나제 활성 측정5.1. Tyrosinase activity measurement

멜라닌 색소생성의 중요한 단계를 촉매하는 효소인 티로시나제 활성에 대한 아비프린의 저해효과를 조사하기 위해 기존의 피부미백제인 알부틴과 아비프린을 0.05, 0.1, 0.5, 1 mM 의 농도에 따른 활성을 비교하였다. 96-well plate의 각 well에 100 μL의 시료와 0.05 M sodium phosphate buffer (pH 6.8) 140 μL, 1500 units/mL mushroom 티로시나제 20 μL, 1.5 mM tyrosine 40 μL을 순서대로 첨가한 후 37℃에서 15분 동안 반응시킨 다음 ELISA reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 양성 대조군으로는 아비프린과 동일한 농도의 알부틴을 사용하였다. In order to investigate the inhibitory effect of aviprin on tyrosinase activity, an enzyme that catalyzes an important step of melanin pigment production, arbutin and aviprin, which are skin whitening agents, were compared with each other at concentrations of 0.05, 0.1, 0.5 and 1 mM . To each well of a 96-well plate was added 100 μL of each sample, 140 μL of 0.05 M sodium phosphate buffer (pH 6.8), 20 μL of 1500 units / mL mushroom tyrosinase and 40 μL of 1.5 mM tyrosine, The absorbance was measured at 490 nm using an ELISA reader. Arbutin, the same concentration as that of aviprin, was used as a positive control.

5.2. 멜라닌 생성량 측정5.2. Melanin production measurement

B16-F10 세포주에 대한 아비프린의 멜라닌 생성 억제효과를 평가하기 위하여 세포주를 6-well plate에 3X10⁴ cells/mL이 되도록 2 mL씩 첨가한 후 24시간 동안 배양하였다. 다음, 아비프린을 각각 5, 10, 50, 100 μM의 최종농도가 되도록 처리하고 대조군은 1% DMSO가 되도록 처리하고 30분 동안 배양한 후, 멜라닌 생성 유도제인 1 mM의 α-MSH를 처리하고 72시간 동안 배양하여, 세포 내 멜라닌의 생성량을 측정하였다. 배양한 세포를 0.25% Trypsin-EDTA 용액을 처리하여 세포를 수확한 후 원심분리(5000 rpm, 4℃)를 5분간 실시한 뒤, cell pellet에 1 N NaOH (10% DMSO)를 넣고, 80℃에서 10분간 세포와 세포 내 멜라닌 색소를 녹여 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. To evaluate the inhibitory effect of aviprin on melanin production in B16-F10 cell line, 2 mL of the cell line was added to a 6-well plate at 3 × 10 ⁴ cells / mL, and then cultured for 24 hours. Next, aviprin was treated to give final concentrations of 5, 10, 50 and 100 μM, respectively. The control group was treated with 1% DMSO and incubated for 30 min. Then, 1 mM of α-MSH And cultured for 72 hours to measure the amount of intracellular melanin produced. Cells were harvested by treatment with 0.25% trypsin-EDTA solution and centrifuged (5000 rpm, 4 ° C) for 5 minutes. 1 N NaOH (10% DMSO) was added to the cell pellet, Cells and intracellular melanin pigments were dissolved for 10 minutes and absorbance was measured at 415 nm.

5.3. 웨스턴 블랏을 통한 멜라닌 합성 확인5.3. Confirmation of melanin synthesis by Western blotting

α-MSH가 유도하는 멜라닌 생합성에 대한 아비프린의 영향을 알아보고자 웨스턴 블랏 분석을 실시하였다. B16-F10 세포주를 DMEM 배지를 사용하여 6-well plate에 5X10⁴ cells/mL의 농도로 현탁하고 24시간 배양한 후, 아비프린 5, 10, 50, 100 μM의 농도로 처리하여 30분 동안 배양한 뒤, 무처리 대조군을 제외한 모든 군에 α-MSH (1 μM)를 처리하여 72시간 배양하였다. 배양된 세포의 배양액을 제거하고 PBS로 2회 세척 후, 0.25% trypsin-EDTA 용액을 처리하여 세포를 떼어내어 micro tube (Eppendorf AG, Hambufg, Germany)로 옮겨 원심분리(5,000 rpm, 4℃, 5분)를 실시하였다. 원심분리 후 상층액은 제거하고 cell pellet은 브래드포드 에세이 (Hercules, CA, USA)로 단백질 정량하고, 동일량의 단백질을 10% SDS PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel)상에서 전기영동으로 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질은 PVDF membrane (Bio-Rad)으로 옮긴 후, 실온에서 1시간 동안 blocking buffer [5% skim milk in PBS (phosphate buffer saline)]에서 교반하여 blocking 시켰다. Blocking 시킨 membrane은 TPBS (0.05% Tween 20 in PBS)로 10분씩 2회 세척하고 1차 antibody: goat polyclonal 티로시나제 (1:500, Santa Cruze Biotechnology, INC); mouse monoclonal anti-β-액틴 (1:1000, Sigma)를 blocking buffer에 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응시킨 membrane은 PBS로 2회 세척하고 1:500으로 희석한 2차 antibody: anti-goat immunoglobulin antibody (Amersham Pharmacia Biotech, Tokyo, Japan); anti-mouse immunoglobulin antibody (Amersham Pharmacia Biotech, Tokyo, Japan)을 넣고 실온에서 2시간 반응시킨 후, 반응된 단백질을 Amersham Pharmacia ECL system (Pierce, MI, USA)으로 확인하였다. Western blot analysis was performed to determine the effect of aviprin on α-MSH-induced melanin biosynthesis. B16-F10 cells were suspended in a 6-well plate at a concentration of ⁵ × 10 ⁴ cells / mL using DMEM medium, cultured for 24 hours, treated with avifrin 5, 10, 50, 100 μM and incubated for 30 minutes After that, α-MSH (1 μM) was added to all but the untreated control group and cultured for 72 hours. The cells were washed twice with PBS and incubated in a microtube (Eppendorf AG, Hambufg, Germany) with a 0.25% trypsin-EDTA solution and centrifuged at 5,000 rpm, Min). After centrifugation, the supernatant was removed, and the cell pellet was quantitated with Bradford assay (Hercules, CA, USA) and proteins were separated by electrophoresis on 10% SDS PAGE (SDS PAGE) . The separated proteins were transferred to a PVDF membrane (Bio-Rad) and blocked with blocking buffer (5% skim milk in phosphate buffered saline) for 1 hour at room temperature. Blocked membranes were washed twice with TPBS (0.05% Tween 20 in PBS) for 10 min each time, followed by primary antibody: goat polyclonal tyrosinase (1: 500, Santa Cruze Biotechnology, INC); mouse monoclonal anti-β-actin (1: 1000, Sigma) was diluted in blocking buffer and reacted at room temperature for 1 hour. The reacted membrane was washed twice with PBS and incubated with a secondary antibody: anti-goat immunoglobulin antibody (Amersham Pharmacia Biotech, Tokyo, Japan) diluted 1: 500. (Amersham Pharmacia Biotech, Tokyo, Japan) and incubated at room temperature for 2 hours. The reacted proteins were identified by Amersham Pharmacia ECL system (Pierce, MI, USA).

5.4. 아비프린의 미백효과 확인5.4. Check the whitening effect of aviflin

본 연구에서는 아비프린의 멜라닌 생합성 촉매효소인 티로시나제 저해활성을 조사하기 위해 기존의 피부미백제인 알부틴과 각 농도에 따른 티로시나제의 저해활성을 비교하였다. 알부틴과 아비프린을 각각 0.05, 0.01, 0.5, 1 mM의 농도로 활성을 측정해본 결과, 아비프린은 17, 22, 38, 51%의 티로시나제 저해 효과를 나타내었으며, 알부틴은 23, 35, 70, 81%의 저해 효과를 나타내었다. 이 결과로부터 아비프린이 알부틴 보다는 약하지만 농도 의존적인 티로시나제 저해활성을 통해 미백활성을 가진다는 것을 확인할 수 있었다(도 10a 참조). 또한, 세포주에 대한 멜라닌 생성억제효과를 확인하기 위해 색소형성세포주가 생성하는 멜라닌 생성량을 비교하였다. 뮤린 멜라노마 세포주인 B16-F10에 아비프린을 5, 10, 50, 100 μM의 최종농도가 되도록 처리한 후, 멜라닌 생합성 유도제인 α-MSH 1 μM을 처리하고 72시간 배양하여 멜라닌의 생성을 유도한 후, 세포 내 멜라닌 생성량을 측정하였다. 무처리 대조군의 세포 내 멜라닌 생성량을 100%로 보았을 때, α-MSH 1 mM 처리군의 멜라닌 생성량은 159%로 아비프린의 최고 농도인 100 μM의 농도에서 α-MSH 단독처리군보다 34%를 더 저해하였다. 이것은 아비프린이 양성 대조군인 알부틴의 동일 농도 처리군보다 약 6% 가량 멜라닌 생성을 더 저해한 것으로서(도 10b 참조), 세포주 내에서 arbutin 보다 조금 더 높은 미백활성을 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다. 이것을 통해 아비프린은 세포 내 티로시나제의 활성을 저해시킬 뿐만 아니라 다른 기작에 영향을 미쳐 멜라닌 생합성을 저해하여 효과적인 색소생성의 감소를 유도했다는 것을 알 수 있었다.In this study, we compared the inhibitory activity of arbutin, a conventional skin whitening agent, and tyrosinase according to each concentration, in order to investigate tyrosinase inhibitory activity, a melanin biosynthesis catalytic enzyme of aviprin. Abitrin was found to inhibit tyrosinase 17, 22, 38, and 51%, and arbutin 23, 35, 70, and 70% in the concentrations of 0.05, 0.01, 81% inhibition effect. From these results, it was confirmed that aviprin has a whitening activity through tyrosinase inhibitory activity which is weaker than that of arbutin but dose-dependent (see FIG. 10A). In order to confirm melanin production inhibitory effect on the cell line, the amount of melanin produced by the pigment forming cell line was compared. After treatment with aviprin to a final concentration of 5, 10, 50, and 100 μM in murine melanoma cell line B16-F10, α-MSH 1 μM, a melanin biosynthesis inducer, was treated and cultured for 72 hours to induce melanin production After that, the amount of melanin production in the cells was measured. When the intracellular melanin production in the untreated control group was taken as 100%, the melanin production of the α-MSH 1 mM-treated group was 159%, which was 34% higher than the α-MSH-treated group at the highest concentration of aviprin at 100 μM . This indicated that aviprin inhibited melanin production by about 6% (see Fig. 10b) more than arbutin in the cell line than the same concentration of arbutin, which is a positive control group. This shows that aviprin not only inhibits the activity of intracellular tyrosinase but also affects other mechanisms and inhibits melanin biosynthesis, leading to an effective reduction of pigment production.

5.5. 세포주에서의 아비프린의 미백활성기전5.5. Mechanism of whitening activity of aviprin in cell lines

멜라닌의 생합성에 관여하는 중요한 효소에는 티로시나제, TRP-1 및 TRP-2가 있으며, 그 중에서도 멜라닌 생합성의 초기단계에 작용하는 멜라닌 생성효소인 티로시나제의 단백질 발현이 아비프린에 의해 영향을 받는지 확인하기 위해 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. The major enzymes involved in the biosynthesis of melanin are tyrosinase, TRP-1 and TRP-2. Among them, in order to confirm whether protein expression of tyrosinase, which is an early stage of melanin biosynthesis, Western blot analysis was performed.

B16-F10 세포주에 아비프린을 처리한 후 세포 내 단백질 발현량을 측정한 결과, 아비프린을 5, 10, 50, 100 μM로 최종 처리하였을 때 α-MSH가 유도하는 티로시나제의 발현량을 농도 의존적으로 크게 감소시켜(도 15 참조), 미백활성효과를 나타낸다는 것을 확인할 수 있다. 이는 아비프린이 티로시나제 단백질의 효소적 활성을 저해시킬 뿐만 아니라, 발현까지 억제한다는 것을 시사하는 결과이다. 즉, 아비프린이 티로시나제의 발현자체를 억제하거나 발현 된 티로시나제 분해의 촉진을 통해 티로시나제 단백질 생성을 감소시켰지만 티로시나제의 발현 자체를 억제하였는지의 여부는 mRNA 수준의 분석을 통해서 확인할 수 있는 것이므로, 본 실험을 통해서는 아비프린이 melanogenic enzyme (티로시나제)의 생성을 저해 혹은 생성된 효소를 빠르게 분해시킴으로서 효과적으로 멜라닌의 생성을 억제한다는 것을 규명하였다. The amount of α-MSH-induced tyrosinase expression was determined by concentration-dependent expression of aviprin in the final treatment of aviprin at 5, 10, 50, and 100 μM after treatment with aviprin in the B16-F10 cell line. (See Fig. 15), indicating that the whitening activity effect is exhibited. This suggests that abiprin inhibits not only the enzymatic activity of tyrosinase protein but also the expression thereof. That is, it was confirmed that the abipline suppressed the expression of tyrosinase itself or decreased the production of tyrosinase protein by promoting the expression of tyrosinase, but the inhibition of the expression of tyrosinase itself could be confirmed by analyzing the level of mRNA. Through this study, we found that aviprin inhibits the production of melanogenic enzyme (tyrosinase) or inhibits the production of melanin effectively by rapidly degrading the produced enzyme.

따라서, 분리된 아비프린은 피부의 노화와 색소형성 피부세포주에 대한 멜라닌의 생성을 자극시키는 활성산소종을 효과적으로 환원시켜 멜라닌 생성의 1차적인 억제를 도모하였고, 티로시나제의 발현을 저해시키거나 혹은 분해시킴과 동시에 이미 발현된 티로시나제의 효소적 활성을 저해시킨다는 것을 확인할 수 있었다. 그러므로 아비프린은 멜라닌 생성 전 단계와 멜라닌 생성 단계를 모두 제어하고, 자체세포독성을 나타내지 않는 피부세포주에 대한 안전성이 보장되는 매우 효과적인 미백물질이며, 미백 기능성 화장품 소재로서의 활용 가능성이 높을 것으로 사료된다.Thus, the isolated aviprin effectively inhibited the active oxygen species that stimulate skin aging and melanin production in pigmented skin cell lines, thereby primarily suppressing melanin production, inhibiting the expression of tyrosinase, or degrading And simultaneously inhibited the enzymatic activity of the tyrosinase already expressed. Thus, aviprin is a highly effective whitening substance that controls both the pre-melanin production stage and the melanin production stage, and is safe for skin cell lines that do not exhibit self-cytotoxicity, and is highly likely to be used as a whitening functional cosmetic material.

본 발명에 의한 아비프린를 함유하는 미백 화장료 조성물은 티로시나제 활성 억제율이 우수하며, 멜라닌 합성을 효과적으로 억제한다. 그뿐 아니라 세포독성활성이 매우 낮아, 피부 미백 및 기미, 주근깨 제거 및 개선을 위한 화장료 조성물로 유용하게 활용될 수 있다. The whitening cosmetic composition containing aviprin according to the present invention has an excellent inhibitory effect on tyrosinase activity and effectively inhibits melanin synthesis. In addition, its cytotoxic activity is very low, and it can be usefully used as a cosmetic composition for skin whitening, spots, freckle removal and improvement.

Claims (12)

아비프린(aviprin)을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물.A cosmetic composition comprising aviprin as an active ingredient. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 미백용인 화장료 조성물.The cosmetic composition according to claim 1, wherein the cosmetic composition is whitening-resistant. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 항산화활성을 갖는 화장료 조성물.The cosmetic composition according to claim 1, wherein the cosmetic composition has an antioxidative activity. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 오일, 왁스, 파우더, 스프레이, 비누, 클렌징, 팩, 파운데이션, 메이컵베이스 및 모발화장료로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조되는 화장료 조성물.4. A composition according to any one of claims 1 to 3 as a solution, suspension, emulsion, paste, gel, cream, lotion, oil, wax, powder, spray, soap, cleansing, pack, foundation, A cosmetic composition, a cosmetic composition, and a cosmetic composition. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아비프린은 수질에서 수득된 것인 화장료 조성물.4. The cosmetic composition according to any one of claims 1 to 3, wherein the aviprin is obtained in a water quality. 아비프린을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 생성저해용 의약 조성물.A pharmaceutical composition for inhibiting melanin formation comprising aviprin as an active ingredient. 아비프린을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 과다 생성으로 인한 질병의 예방 또는 치료용 의약 조성물.A pharmaceutical composition for preventing or treating diseases caused by melanin overproduction comprising aviprin as an active ingredient. 제6항 또는 제7항에 있어서, 정제, 산제, 펠렛제, 캡슐제, 환제, 좌약제, 용액제, 유제, 현탁제, 액제, 젤리, 주사제로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조되는 의약 조성물.The pharmaceutical composition according to claim 6 or 7, which is prepared from a formulation selected from the group consisting of tablets, powders, pellets, capsules, pills, suppositories, solutions, emulsions, suspensions, solutions, jellies, . 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 아비프린은 수질에서 수득된 것인 의약 조성물.The pharmaceutical composition according to claim 6 or 7, wherein the aviprin is obtained in water quality. 아비프린을 포함하는 멜라닌 생성 저해용 식품 조성물 또는 식품첨가제 조성물.A food composition or food additive composition for inhibiting melanin formation comprising aviprin. 아비프린을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 과다 생성으로 인한 질병의 예방 또는 개선용 식품 조성물 또는 식품첨가제 조성물.A food composition or a food additive composition for preventing or ameliorating a disease caused by melanin overproduction comprising aviprin as an active ingredient. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 아비프린은 수질에서 수득된 것인 식품 조성물 또는 식품첨가제 조성물.12. The food composition or food additive composition according to claim 10 or 11, wherein the aviprin is obtained in water quality.

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