KR20140126207A - SNP Maker for identifying of clubroot resistance in Cabbage and uses thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 배추의 병저항성 연관 SNP 프라이머를 타종인 양배추에의 적용가능성을 검토하고, 양배추 뿌리혹병 저항성을 효율적으로 평가할 수 있는 SNP 분자마커 및 이의 용도를 제공하는 것이다.The present invention examines the possibility of application of the disease resistance-associated SNP primer of cabbage to other cabbages, and provides a SNP molecular marker capable of efficiently evaluating resistance to cabbage root rot and its use.
양배추(Brassica oleracea), 배추(Brassica rapa var. glabra Regel), 유채(Brassica napus) 등 대부분의 배추과 작물은 뿌리혹병으로 인해 큰 피해를 입고 있다. 뿌리혹병(clubroot disease)은 무사마귀병 또는 근류병이라고도 불리는 토양 전염병으로서, 반드시 살아있는 식물체 내에서만 증식이 가능한 절대 기생균의 일종인 플라스모디오포라 브라시케 워론(Plasmodioophora brasicae WORON.)에 의해 발병된다. 토양전염성 기생체인 P. brassicae에 감염된 식물은 잔뿌리가 없어지고 주근에 혹이 생성되어 양분과 수분의 흡수가 억제되어 생육이 저해되며 시드는 증상이 반복되다가 고사한다. P. brassicae는 1878년 러시아에서 Woronin에 의해 처음 기록되었으며 이후 세계 각국에서 뿌리혹병의 기록이 발견되었고(Karling, J. S. 1968. 2nd ed. Hafner, New York. 144 pp.), 한국에는 1920년대에 처음 기록되었다(Ikegami, H., Ito, T., Imuro, Y. and Naiki, T. 1981. In: Chinese Cabbage, ed. by N. S. Talekar and T. D. Griggs, pp. 81-90. Asian Vegetable Research and Development Center, Taiwan.). 현재는 세계적으로 배추과 작물에 발생하는 가장 심각한 병 중 하나이다.Cabbage ( Brassica oleracea ), Chinese cabbage ( Brassica There is rapa . glabra Regel ), Rapeseed ( Brassica napus ) and most of the cabbage and crops are suffering greatly from the root disease. The clubroot disease is caused by Plasmodioophora brasicae WORON. Plasmodioophora brasicae WORON., A kind of absolute parasite that can only multiply in living plants. Plants infected with P. brassicae , a soil infectious parasitic strain, are eliminated from the roots and the hairs are formed in the main roots, inhibiting nutrients and moisture absorption, and inhibiting growth. P. brassicae was recorded for the first time by Woronin in Russia in 1878, and later records of root canal disease were found in many countries around the world (Karling, JS 1968. 2nd ed. Hafner, New York. (Ikegami, H., Ito, T., Imuro, Y. and Naiki, T. 1981. In: Chinese Cabbage, ed. By NS Talekar and TD Griggs, pp. 81-90. , Taiwan.). It is now one of the most serious diseases of cabbage and crops worldwide.
뿌리혹병균은 거의 모든 배추과 작물에 발생하여 기주가 다양할 뿐만 아니라, 병든 조직에 무수히 많은 휴면포자를 형성하고, 이들 포자들은 토양에서 최대 15년 동안 생존할 수 있어 방제하기에 매우 어려운 토양병이다(Mattush, P. 1977. pp. 22-28. University of Wisconsin, Madison, WI, USA.). 뿌리혹병 방제법으로는 토양의 pH를 조절하거나 배추과 작물이 아닌 작물과 윤작을 하는 등의 경종적 방제법이 알려져 있으나 현실적으로는 경제성 때문에 적용하기 어렵고, 길항미생물 등을 이용한 생물적 방제 방법 등이 있으나 아직 그 효과가 낮아 사용하기에 어려운 실정이다. 그리고 합성 살균제를 이용한 뿌리혹병 방제 방법은 비용이 비싸고 방제효과의 기간이 짧을 뿐만 아니라 환경 독성 등의 우려로 사용에 한계가 있다(Cheah, L. H., Veerakone, S. and Kent, G. 2000. Plant Protection 53: 18-21.; Yoshikawa, H. 1983. Jpn. Agr. Res. Quart. 17: 6-11.). 그러므로 오늘날에는 친환경 농업에서도 사용이 가능한 저항성 품종이 뿌리혹병 방제를 위해 요구되고 있다. 또한, 저항성 품종의 육성을 위해서는 병원균의 분리, 휴면포자 농도 측정, 인공접종, 평가 등 많은 시간이 소요되고 비용이 많이 소용되며 환경에 대한 변이가 발생하여 정확한 병저항성 개체를 선발하는데 어려움이 있다.The root germs occur in almost all cabbages and crops, and they are not only diverse but also form numerous dormant spores in diseased tissues. These spores can survive for up to 15 years in the soil, making them very difficult to control Mattush, P. 1977. pp. 22-28, University of Wisconsin, Madison, Wis., USA). It has been known that the control of the pH of the soil or the control of crops such as rotting of crops and crops rather than crops, but it is difficult to apply due to economical reasons and biological control methods using antagonistic microorganisms. It is difficult to use because of low effect. In addition, the use of synthetic disinfectants for controlling root canal disease is costly, has a short period of control effect, and is limited in use due to environmental toxicity concerns (Cheah, LH, Veerakone, S. and Kent, G. 2000. Plant Protection 53: 18-21 .; Yoshikawa, H. 1983. Jpn Agr Res. Quart. 17: 6-11.). Therefore, today, resistant cultivars that can be used in environmentally friendly agriculture are also required for the control of root canal disease. In addition, in order to cultivate resistant cultivars, it takes much time, such as separation of pathogens, measurement of dormant spore concentration, artificial inoculation and evaluation, and it is costly, and it is difficult to select an accurate disease-resistant individual due to variation in environment.
B. rapa에 속하는 배추(B. rapa subsp. pekinensis)의 뿌리혹병 저항성 품종은 European fodder turnip의 저항성 유전자를 도입하여 개발되었다(Yoshikawa, H. 1993. Plants Tea Japan, Ser. A 7: 1-165.; Hirai, M. 2006. Breed. Sci. 56: 223-229.). 그리고 배추 저항성 유전자는 단인자우성 유전을 한다고 알려져 있다(James, R. V. and Williams, P. H. 1980. Phytopathology 70: 776-779.; Kuginuki, Y., Yoshikawa, H. and Hirai, M. 1999. Eur. J. Plant Pathol. 105: 327-332.; Yoshikawa, H. 1993. Plants Tea Japan, Ser. A 7: 1-165.). 이와 달리 양배추(B. oleracea)의 뿌리혹병 저항성 품종은 매우 드물어 단지 몇 품종만이 일본에서 개발되어 사용되고 있다(Baggett, J. R. and Kean, D. 1985. HortScience 20:784-785.). 몇 개의 B. oleracea 저항성 유전자원이 보고된 바 있으나, 이들 저항성은 고전적인 유전 분석 및 분자마커 분석에서 단인자가 아닌 다인자 유전을 한다고 알려져 있다(Figdore, S. S., Ferreira, M. E., Slocum, M. K. and Williams, P. H. 1993. Euphytica 69: 33-44.; Grandclement, C. and Thomas, G. 1996. Theor. Appl. Genet. 93: 86-90.; Landry, B. S., Hubert, N., Crete, R., Chiang, M. S., Lincoln, S. E. and Etoh, T. 1992. Genome 35: 409-420.; Moriguchi, K., Kimizuka-Takagi, C., Ishii, K. and Nomura, K. 1999. Breed. Sci. 49: 257-265.; Nomura, K., Minegishi, Y., Kimizuka-Takagi, C., Fujioka, T., Moriguchi, K., Shishido, R. and Ikehashi, H. 2005. Plant Breed. 124: 371-375.; Rocherieux, J., Glory, P., Giboulot, A., Boury, S., Barbeyron, G., Thomas, G. and Manzanares-Dauleux, M. J. 2004. Theor. Appl. Genet. 108: 1555-1563.; Voorrips, R. E., Jongerius, M. C. and Kanne, H. J. 1997. Theor. Appl. Genet. 94: 75-82.). 하지만 저항성을 약 54%를 설명할 수 있는 QTL 유전자 pb-3과 같은 주요한 유전자가 존재한다고 하였다. 그러나 불행하게도 이들을 검정할 수 있는 특이적인 primer 혹은 RFLP 마커 등은 알려지지 않았다. 이와 같이 뿌리혹병 저항성 양배추는 2개 이상의 유전자가 관여하는 양적 저항성이며 저항성 유전자에 관련된 정보가 아직 부족한 실정이어서 저항성 품종의 개발이 지연되고 있다(Hirai, 2006). 따라서, P. brassicae에 대한 양배추(B. oleracae)의 저항성 연구 및 새로운 저항성 육종 소재를 발굴하기 위한 노력이 필요하다. B. The rapeseed cabbage ( B. rapa subsp . The plant pathogen-resistant varieties of pekinensis were developed by introducing the resistance gene of European fodder turnip (Yoshikawa, H. 1993. Plants Tea Japan, Ser. A 7: 1-165 .; Hirai, M. 2006. Breed Sci. 56: 223-229.). And the cabbage resistance gene is known to have a mono-dominant dominance (James, RV and Williams, PH 1980. Phytopathology 70: 776-779 .; Kuginuki, Y., Yoshikawa, H. and Hirai, M. 1999. Eur. J Plant Pathol 105: 327-332 .; Yoshikawa, H. 1993. Plants Tea Japan, Ser 7: 1-165.). On the other hand, only few varieties of cabbage ( B. oleracea ) have been developed and used in Japan (Baggett, JR and Kean, D. 1985. HortScience 20: 784-785). Several B. oleracea resistant genetic resources have been reported, but these resistances are known to be multifactorial rather than single factor in classical genetic analysis and molecular marker analysis (Figdore, SS, Ferreira, ME, Slocum, MK and Williams, PH 1993. Euphytica 69: 33-44 .; Grandclement, C. and Thomas, G. 1996. Theor. Appl. Genet. 93: 86-90 .; Landry, BS, Hubert, N., Crete, R. , Chiang, MS, Lincoln, SE and Etoh, T. 1992. Genome 35: 409-420 .; Moriguchi, K., Kimizuka-Takagi, C., Ishii, K. and Nomura, K. 1999. Breed Sci. 48: 257-265 .; Nomura, K., Minegishi, Y., Kimizuka-Takagi, C., Fujioka, T., Moriguchi, K., Shishido, R. and Ikehashi, H. 2005. Plant Breed 124: Bibliot, S., Barbeyron, G., Thomas, G. and Manzanares-Dauleux, MJ 2004. Theor., Appl. Genet., 108: 371-375 .; Rocherieux, J., Glory, P., Giboulot, 1555-1563 .; Voorrips, RE, Jongerius, MC and Kanne, HJ 1997. Theor. Appl. Genet. 94: 75-82.). However, a major gene such as the QTL gene pb-3, which can account for about 54% resistance, is present. Unfortunately, no specific primers or RFLP markers were available to test them. As described above, the pathogen-resistant cabbage is a quantitative resistance involving two or more genes, and information on the resistance gene is still lacking, and the development of resistant varieties is delayed (Hirai, 2006). Therefore, this effort to identify resistance research and new materials resistant six kinds of cabbage (B. oleracae) for P. brassicae is required.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명은 배추의 병저항성 연관 SNP 프라이머를 타종인 양배추에의 적용가능성을 검토하고, 양배추 뿌리혹병 저항성을 효율적으로 평가할 수 있는 SNP 분자마커 및 이의 용도를 제공하는 것이다.SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been made in view of the above-mentioned needs, and it is an object of the present invention to provide a method for evaluating the applicability of disease resistance-associated SNP primers of Chinese cabbage to cabbage, and to provide a SNP molecular marker capable of efficiently evaluating resistance to cabbage root disease It is intended to provide use.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 일 측면은 서열번호 1~12로 표시되는 뿌리혹병 저항성 품종을 식별하기 위한 마커에서 선택되는 적어도 하나의 염기서열로 이루어지는 양배추 뿌리혹병 저항성 품종 식별을 위한 마커를 제공한다.In order to solve the above-described problems, one aspect of the present invention provides a marker for identifying a cabbage root-knocker resistance resistant variety comprising at least one base sequence selected from markers for identifying the root- to provide.
또한, 본 발명의 다른 측면은 양배추의 게놈 DNA를 분리하는 단계; 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호 1~12로 표시되는 뿌리혹병 저항성 품종을 식별하기 위한 마커에서 선택되는 적어도 하나의 염기서열로 이루어지는 양배추 뿌리혹병 저항성 품종 식별을 위한 마커를 이용하여 품종별 특이 부위를 각각 증폭하는 단계; 상기 각 증폭된 품종별 특이 유전자를 전기영동으로 확인한 후 조합된 밴드를 분석하여 뿌리혹병 저항성 품종을 식별하는 단계를 포함하는 양배추 뿌리혹병 저항성 품종의 식별방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is also provided a method for isolating a cabbage, comprising: isolating genomic DNA of cabbage; A genetic DNA template is used as a template, and a marker for identifying a cabbage root-knot disease resistant variety comprising at least one base sequence selected from markers for identifying the root-knot disease-resistant varieties shown in SEQ ID NOs: Respectively; Identifying a specific gene for each of the amplified varieties by electrophoresis, and analyzing the combined bands to identify the varieties resistant to P. tuberculosis.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은 양배추의 게놈 DNA를 분리하는 단계; 게놈 DNA를 주형으로 하여 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 품종별 특이 부위를 각각 증폭하는 단계; 및 상기 각 증폭된 산물을 HRM(High Resolution Melt) 분석을 통해 뿌리혹병 저항성 품종을 식별하는 단계를 포함하는, 양배추 뿌리혹병 저항성 품종의 식별방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is also provided a method for isolating a cabbage, comprising: isolating genomic DNA of cabbage; Amplifying a specific region of each strain using the primer set of claim 1 using the genomic DNA as a template; And identifying each of the amplified products by a High Resolution Melt (HRM) analysis to identify a root-knot disease resistant variety.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 양배추 뿌리혹병 저항성 품종 식별을 위한 마커; 및 핵산 증폭 시약을 포함하는 양배추 뿌리혹병 저항성 품종 식별을 위한 키트를 제공한다.
Yet another aspect of the present invention is a marker for identifying a cabbage root disease resistant variety of the present invention; And a nucleic acid amplification reagent. ≪ Desc / Clms Page number 2 >
이하, 본 발명을 더 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명에 따른 양배추 뿌리혹병 저항성 품종 식별을 위한 마커를 개발하기 위해, 배추에서 개발된 병저항성 유전자 연관 7,645개 SNP 프라이머쌍을 이용하여 양배추에 활용가능성을 평가한 결과, 양배추에 적용가능한 425개 병저항성 유전자 연관 SNP 프라이머쌍(BRP)을 선발하였다. In order to develop a marker for the identification of resistant varieties of cabbage root rot disease according to the present invention, the applicability of 7,645 SNP primer pairs to the cabbage was evaluated by 425 disease-resistant Resistant gene-linked SNP primer pair (BRP) was selected.
배추 유전체 정보를 이용하여 배추에서 개발된 병저항성 유전자 연관 SNP 프라이머쌍 중 HRM(High Resolution Melt) 분석용 145개 SNP 프라이머쌍(BSNP)과 양배추에 적용가능한 425개 SNP 프라이머쌍(BRP), BRP 중 HRM 분석용으로 새롭게 제작된 123개 SNP 프라이머쌍을 뿌리혹병저항성 검정된 50점의 수집자원 중 뿌리혹병저항성 수치가 높았던 VMBL_CV048, VMBL_CV049, VMBL_CV050과 낮았던 VMBL_CV001, VMBL_CV002, VMBL_CV003의 양배추 6개 품종에 평가한 결과, BSNP에서 108개, BRP에서 415개, BRS에서 118개의 프라이머쌍이 양배추에서 증폭 가능한 것으로 나타났다.(BSNP) and 425 SNP primer pairs (BRP), which are applicable to cabbage, and BRPs, which are used in the cabbage, for analysis of HRM (High Resolution Melt) The 123 SNP primer pairs newly constructed for HRM analysis were evaluated for six cultivars of VMBL_CV048, VMBL_CV049, and VMBL_CV050, which were high in the resistance to root apoptosis, and VMBL_CV001, VMBL_CV002, and VMBL_CV003, As a result, 108 primers in BSNP, 415 primers in BRP, and 118 primer pairs in BRS were amplified in cabbage.
배추에서 선발된 프라이머쌍들을 뿌리혹병 저항성이 강한 양배추 3품종과 이병성이 강한 양배추 3품종 등, 6개 양배추 품종에 평가한 결과, 총 6개 배추 SNP 프라이머쌍(BSNP017, BSNP157, BRS6, BRS18, BRS79, BRS114)이 양배추 뿌리혹병 저항성 특이 마커로 확인되었다.
A total of six Chinese cabbage SNP primer pairs (BSNP017, BSNP157, BRS6, BRS18, BRS18, and BRS18) were selected from six cabbage cultivars, including three cabbage varieties with strong resistance to root damage, and three varieties of strong cabbage , BRS114) was identified as a cabbage root disease resistance-specific marker.
본 명세서에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.As used herein, "primer" refers to a single stranded oligonucleotide sequence complementary to a nucleic acid strand to be copied, and may serve as a starting point for synthesis of the primer extension product. The length and sequence of the primer should allow the synthesis of the extension product to begin. The specific length and sequence of the primer will depend on the primer usage conditions such as temperature and ionic strength, as well as the complexity of the desired DNA or RNA target.
서열번호 1 내지 12로 표시되는 염기서열은 본 발명의 바람직한 실시예로서 제시되는 양배추 뿌리혹병 저항성 품종 식별용 마커의 염기서열을 나타낸다. 홀수 서열은 정방향(forward) 프라이머를 나타내며, 짝수 서열은 역방향(reverse) 프라이머를 나타낸다. The nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 12 represents the nucleotide sequence of the marker for identification of the cabbage root-knot disease resistant variety identified as a preferred embodiment of the present invention. The odd sequence represents a forward primer and the even sequence represents a reverse primer.
서열번호 1 내지 12로 표시된 본 발명에 따른 양배추 뿌리혹병 저항성 품종 식별용 마커는 양배추 게놈상의 위치를 결정하지는 않았으나, 배추 병저항성 관련 SNP 마커로부터 제작되었다. The cabbage root rot resistance resistant variety identification markers according to the present invention as shown in SEQ ID NOS: 1 to 12 did not determine the position of the cabbage genome but were made from the cabbage resistance-related SNP markers.
기개발된 배추의 7,654개의 병저항성 연관 SNP 프라이머쌍 중 HRM(High Resolution Melt) 분석용으로 제작된 배추 SNP 프라이머 145쌍(BSNP), 양배추에 적용가능한 425개 SNP 프라이머쌍(BRP), BRP 중 HRM 분석용으로 새롭게 제작된 123개 SNP 프라이머쌍을 양배추 6개 품종에 평가한 결과, BSNP에서 108개, BRP에서 415개, BRS에서 118개의 프라이머쌍이 양배추에서 증폭 가능한 것으로 나타났다.(BSNP), 425 SNP primer pairs (BRP) applicable to cabbage, and HRM among BRPs, which are applicable to HRP (High Resolution Melt) analysis of 7,654 disease resistant SNP primer pairs of the developed Chinese cabbage A total of 123 SNP primer pairs for analysis were evaluated in six varieties of cabbage. As a result, 108 pairs in BSNP, 415 in BRP, and 118 primer pairs in BRS were amplified in cabbage.
이렇게 선발된 프라이머쌍들을 뿌리혹병 저항성이 강한 양배추 VMBL_CV048, VMBL_CV049, VMBL_CV050 3품종과 이병성이 강한 양배추 VMBL_CV001, VMBL_CV002, VMBL_CV003 3품종 등, 6개 양배추 품종에 평가한 결과, 하기 표 1의 총 6개 배추 SNP 프라이머쌍(BSNP017, BSNP157, BRS6, BRS18, BRS79, BRS114)이 양배추 뿌리혹병 저항성 특이 마커로 확인되었다.
The selected pairs of primers were evaluated in six cabbage cultivars such as three kinds of cabbage VMBL_CV048, VMBL_CV049, and VMBL_CV050 having high resistance to root-knot disease and three varieties of cabbage VMBL_CV001, VMBL_CV002, VMBL_CV003 having stronger viability, The SNP primer pair (BSNP017, BSNP157, BRS6, BRS18, BRS79, BRS114) was identified as a cabbage root disease resistance specific marker.
상기 각각의 프라이머는 단독으로 또는 2 이상이 조합하여 양배추 뿌리혹병 저항성 품종을 식별하는 마커로서 사용되며, 상기 프라이머들을 이용하여 얻어지는 PCR 산물의 크기는 152~200bp로 설계되어 있다.
Each of the primers may be used alone or in combination of two or more as a marker for identifying the cabbage root-knot disease resistant variety. The size of the PCR product obtained using the primers is designed to be 152-200 bp.
각 프라이머 또는 이들을 이용한 양배추 뿌리혹병 저항성 품종 식별방법은 다음과 같다.The identification method of each primer or cabbage rootstock disease resistant variety using them is as follows.
양배추 뿌리혹병 저항성 품종을 식별하기 위해 먼저 양배추로부터 게놈 DNA(genomic DNA)를 분리하고, 게놈 DNA를 주형으로 하고 양배추 뿌리혹병 저항성 품종 식별용 마커를 이용하여 품종별 특이 부위를 증폭한다. 증폭된 품종별 특이 유전자를 전기영동으로 확인한 후, 조합된 밴드들의 분석을 통하여 각각의 품종을 식별할 수 있다.In order to identify the pathogens resistant to cabbage root disease, genomic DNA is first isolated from cabbage, and genomic DNA is used as a template to amplify a specific region of each species by using a marker for resistance to varieties of cabbage root disease. After confirming the amplified gene specific genes by electrophoresis, it is possible to identify the individual varieties by analyzing the combined bands.
또한, 양배추 뿌리혹병 저항성 품종을 식별하기 위해 양배추로부터 게놈 DNA를 분리하고, 게놈 DNA를 주형으로 하여 양배추 뿌리혹병 저항성 품종 식별용 마커를 이용하여 품종별 특이 부위를 각각 증폭한다. 각 증폭된 산물을 HRM(High Resolution Melt) 분석을 통해 뿌리혹병 저항성 품종을 식별할 수 있다. Genomic DNA was isolated from cabbage in order to identify the resistant varieties of cabbage root, and genomic DNA was used as a template to amplify the specific regions of the varieties by using the marker for resistance to varieties of cabbage root disease. Each amplified product can be identified by HRM (High Resolution Melt) analysis.
이런 결과에 의해, 본 발명에 따른 양배추 뿌리혹병 저항성 품종 식별용 마커는 양배추 뿌리혹병 저항성 품종을 신속하고 저비용으로, 그리고 효과적으로 식별할 수 있다. As a result, the marker for identifying the cabbage root disease resistant variety according to the present invention can quickly, cheaply, and effectively identify the cabbage root disease resistant varieties.
본 발명의 키트는 본 발명의 양배추 뿌리혹병 저항성 품종 식별용 마커; 및 핵산 증폭 시약을 포함한다. 양배추 뿌리혹병 저항성 품종 식별용 마커는 전술한 바와 같다. 핵산 증폭 시약은 dNTP 혼합물; 내열성 중합효소; 및 PCR 완충액을 포함할 수 있다. 상기 dNTP 혼합물은 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하며, 내열성 중합효소는 Taq DNA 중합효소, Tth DNA 중합효소 등 시판되는 내열성 중합효소를 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다.The kit of the present invention is a marker for identifying a cabbage root disease resistant variety of the present invention; And nucleic acid amplification reagents. The markers for the identification of the cabbage root disease resistant varieties are as described above. The nucleic acid amplification reagent may be a dNTP mixture; Thermostable polymerase; And PCR buffer. The dNTP mixture may include dATP, dCTP, dGTP, dTTP, and the heat-resistant polymerase may be a commercially available heat-resistant polymerase such as Taq DNA polymerase or Tth DNA polymerase. In addition, the kit of the present invention may further include a user's manual describing optimal reaction performing conditions.
본 발명에 의하면 배추의 유전체 정보에서 얻은 SNP 프라이머쌍을 양배추에 적용하여 양배추 뿌리혹병 저항성 특이 마커를 개발하였다. 본 발명에서 제공되는 SNP 프라이머쌍은 양배추 뿌리혹 저항성 품종들을 효율적으로 평가함으로써 양배추 뿌리혹병 저항성 육종 및 뿌리혹병 저항성 품종 판별에 유용하게 이용될 수 있다.According to the present invention, a SNP primer pair obtained from the genome information of Chinese cabbage was applied to cabbage to develop cabbage root-knocker resistance specific marker. The SNP primer pair provided in the present invention can be usefully used in the cabbage root-knot disease resistance breeding and the root-knot disease resistance breeding by efficiently evaluating the cabbage root-knot resistance cultivars.
도 1은 배추 BSNP 프라이머쌍 145개, BRP 프라이머쌍 425개, BRS 프라이머쌍 123개 등, 총 693개 배추 SNP 프라이머쌍을 이용하여 양배추에 적용한 PCR 증폭 결과의 전기영동 사진이다.
도 2는 배추 병저항성 SNP 프라이머쌍 중에서 HRM 분석용으로 제작된 SNP 프라이머쌍 중 선발된 양배추 뿌리혹병 저항성 특이 마커 BSNP017 및 BSNP157을 이용하여 양배추 뿌리혹병 저항성 3품종과 이병성 3품종을 HRM 분석을 한 결과이다.
도 3은 BRS 프라이머쌍 118개 중에서 선발된 4개의 양배추 뿌리혹병 저항성 특이 마커 BRS6, BRS18, BRS79, BRS114을 이용하여 양배추 뿌리혹병 저항성 3품종과 이병성 3품종을 HRM 분석한 결과이다. Fig. 1 is an electrophoresis image of a PCR amplification result applied to a cabbage using a total of 693 Chinese cabbage SNP primer pairs including 145 Chinese BSNP primer pairs, 425 BRP primer pairs, and 123 BRS primer pairs.
FIG. 2 shows HRM analysis of three cabbage root-knot disease resistance varieties and three Lee Byeongseong varieties using cabbage root-knot disease resistance specific markers BSNP017 and BSNP157 among SNP primer pairs prepared for HRM analysis among Chinese cabbage resistant SNP primer pairs to be.
FIG. 3 shows HRM analysis of three cabbage root-knot disease resistance varieties and three Lee Byeongseong variety varieties using four BRS6, BRS18, BRS79, and BRS114 resistant BRS6, BRS18, BRS79 and BRS114 selected from 118 BRS primer pairs.
실시예 1: 양배추로부터 게놈 DNA 추출Example 1: Extraction of genomic DNA from cabbage
(1) 식물재료(1) plant material
농촌진흥청 국립원예특작과학원에서 선발된 양배추 53점 중 하기 표 2의 6점의 수집자원들을 본 실험에서 사용하였다. 실험에 사용된 양배추 수집자원들은 2009년도 농촌진흥청 국립원예특작과학원에서 뿌리혹병저항성 검정을 실시하였으며, 뿌리혹병저항성 검정된 50점의 수집자원 중 뿌리혹병저항성 수치가 높았던 3점(VMBL_CV048, VMBL_CV049, VMBL_CV050)과 낮았던 3점(VMBL_CV001, VMBL_CV002, VMBL_CV003)들을 양배추 뿌리혹병저항성 연관 마커 검정을 위해 선발하였다.
Of the 53 cabbages selected from the National Institute of Horticultural Science, Rural Development Administration, 6 collected resources of the following Table 2 were used in this experiment. Cabbage collection resources used in the experiment were evaluated by the National Institute of Horticultural Science, National Rural Development Administration in 2009. Three points (VMBL_CV048, VMBL_CV049, VMBL_CV049, ) And three low points (VMBL_CV001, VMBL_CV002, VMBL_CV003) were selected for the evaluation of cabbage root disease resistance association markers.
(2) DNA 추출(2) DNA extraction
양배추 품종 별로 5립의 종자를 파종하여 온실에서 20일을 재배한 어린잎을 Qiagen DNA extraction Kit를 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출한 양배추 DNA는 NanoDrop ND-1000(NanoDrop Technologies Inc.)를 이용하여 상대적 순도와 농도를 확인하였고, 최종 DNA 농도는 20ng/로 만들었다.
Five leaves were sown in each cabbage cultivar and the young leaves grown in the greenhouse for 20 days were extracted with Qiagen DNA extraction kit. The extracted cabbage DNA was checked for relative purity and concentration using NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies Inc.), and the final DNA concentration was 20 ng / ml.
실시예 2: SNP 프라이머의 선발 및 디자인 Example 2: Selection and design of SNP primers
배추에서 개발된 병저항성 연관 SNP 프라이머쌍의 타종에 활용성을 분석하기위해 데이터베이스에 등록된 양배추의 뉴클레오티드 서열을 대상으로 7,645개 배추 SNP 프라이머쌍의 서열을 매핑(mapping)하여 배추에서 개발된 SNP 프라이머쌍의 양배추에 적용하였을 때 PCR이 가능한지 여부를 분석하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
In order to analyze the utility of the resistance-associated SNP primer pair developed in Chinese cabbage, a sequence of 7,645 Chinese cabbage SNP primer pairs was mapped to the nucleotide sequence of the cabbage registered in the database, and SNP primers When applied to pair of cabbage, it was analyzed whether PCR was possible. The results are shown in Table 3 below.
(B. nigra ) Black mustard
(B. nigra )
상기 표 3의 PCR success marker는 현재 활용 가능한 template(GSS, ESTs, mRNA) 서열에 한 쌍의 primer가 시퀀싱으로 확인 가능한 사이즈인 50~1500bp 간격으로 100% 일치(match)를 보이는 마커를 말한다. 단, 동일한 프라이머가 여러 template에 binding 되는 경우, 이들 모두를 PCR 성공으로 인정한다. 이를 통해 template 서열 간의 redundancy가 존재함을 알 수 있다.
The PCR success marker in Table 3 refers to a marker in which a pair of primers in a currently available template (GSS, ESTs, mRNA) sequence shows a 100% match at an interval of 50 to 1500 bp, which is a size that can be confirmed by sequencing. However, if the same primer is bound to several templates, all of them are recognized as successful PCR. This shows redundancy between the template sequences.
기개발된 배추 7,645개 병저항성 연관 SNP 프라이머쌍 중 High Resolution Melt(BSNP) 분석용으로 제작된 배추 SNP 프라이머 145쌍(BSNP)을 선발하였다.145 pairs of Chinese cabbage SNP primers (BSNP) were selected for the analysis of High Resolution Melt (BSNP) among 7,645 diseased SNP primer pairs.
또한, NCBI dbSNP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)의 양배추 게놈을 reference로 설정하고, CLC Genomics Workbench 프로그램을 이용하여 7,645개 배추 SNP 프라이머 서열을 각각 paired-end(forward/reverse) 방식의 alignment을 수행하였다. 이들의 PCR product size는 50 ~ 1,500 bp로 제한하여 양배추 유전체 염기서열과 정확히 하나의 alignment가 되는 경우를 활용가능성이 있는 SNP 프라이머로 설정하여 배추 7,645개 SNP 프라이머쌍 중 425개의 양배추 적용가능한 배추 SNP 프라이머쌍(BRP)을 선발하였다. In addition, the cabbage genome of NCBI dbSNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/) was set as a reference, and 7,645 Chinese cabbage SNP primer sequences were paired-and-labeled using the CLC Genomics Workbench program, end (forward / reverse) alignment was performed. These PCR product sizes were restricted to 50 ~ 1,500 bp, and SNP primers that could be used for exactly one alignment with the cabbage genome sequence were set as the SNP primers, and 425 cabbage-applicable cabbage SNP primers among 7,645 SNP primer pairs Pair (BRP) were selected.
또한, 선발된 425개의 양배추 적용가능한 배추 SNP 프라이머쌍의 염기서열 정보를 이용하여 HRM 분석용으로 이용가능한 새로운 123개의 양배추 적용가능한 배추 SNP 프라이머쌍(BRS)를 제작하였다. In addition, 123 new cabbage - applicable cabbage SNP primer pairs (BRS) were constructed which can be used for HRM analysis, using the nucleotide sequence information of the selected 425 cabbage - applied pairs of Chinese cabbage SNP primers.
이들 선발된 배추 BSNP 프라이머쌍 145개, 생물정보 분석을 통해 얻어진 배추 7,645개 프라이머쌍 중 양배추에 적용가능한 SNP 프라이머쌍인 BRP 프라이머쌍 425개, 상기 BRP 중 BSNP 용으로 새롭게 제작된 배추 SNP 프라이머쌍인 BRS 프라이머쌍 123개 등, 총 693개 배추 SNP 프라이머쌍을 양배추 2품종 VMBL_CV001, VMBL_CV002를 이용하여 PCR 증폭이 가능한지를 검정하였다. These selected 145 pairs of Chinese cabbage BSNP primers, 425 pairs of BRP primers, which is a pair of SNP primers applicable to cabbage among 7,645 Chinese cabbage pairs obtained through bioinformation analysis, and a pair of Chinese cabbage SNP primers A total of 693 Chinese cabbage SNP primer pairs, including 123 BRS primer pairs, were tested for the possibility of PCR amplification using two cabbage varieties VMBL_CV001 and VMBL_CV002.
PCR 반응을 위해서 주형(template DNA) 20ng(1㎕), 0.5μM의 forward 및 reverse 프라이머(1㎕), 2×GoTaqGreen Master Mix(Promega, USA) 10㎕를 사용하여 3차 증류수(8㎕)를 포함하여, 총 volume 20㎕의 PCR 반응 혼합물을 만들었다. For the PCR reaction, 10 μl of template DNA (1 μl), 0.5 μM forward and reverse primers (1 μl) and 2 μ GoTaq Green Master Mix (Promega, USA) A total volume of 20 [mu] l of PCR reaction mixture was made.
BSNP SNP 프라이머의 PCR 증폭 조건은 95℃에서 10분, 95℃에서 10초, 60℃에서 10초, 72℃에서 15초를 진행한 후, 95℃ 10초의 과정부터 앞의 과정을 40회 반복하고, 95℃에서 10초를 진행한 후, melt curve 65℃에서 95℃까지 매 10초마다 0.2℃씩 증가시켰다. PCR amplification conditions of the BSNP SNP primer were 95 ° C for 10 minutes, 95 ° C for 10 seconds, 60 ° C for 10 seconds, 72 ° C for 15 seconds, 95 ° C for 10 seconds, and the above procedure was repeated 40 times , Followed by 10 seconds at 95 ° C, and then the melt curve was increased from 65 ° C to 95 ° C by 0.2 ° C every 10 seconds.
또한, BRP와 BRS 프라이머의 PCR 증폭 조건은 98℃에서 2분, 98℃에서 2초, 57℃ (각 프라이머쌍의 Annealing 조건에 따라 53℃, 55℃, 62℃, 65℃ 등)에서 15초, 그리고, melt curve 65℃에서 95℃까지 매 10초마다 0.2℃씩 증가시켰다. 98℃ 2초의 과정부터 앞의 과정을 39회 반복하였다. The PCR amplification conditions of BRP and BRS primers were 2 minutes at 98 ° C, 2 seconds at 98 ° C, 15 seconds at 57 ° C (53 ° C, 55 ° C, 62 ° C and 65 ° C depending on the annealing conditions of each primer pair) , And the melt curve was increased from 65 캜 to 95 캜 every 0.2 캜 every 10 seconds. The above procedure was repeated 39 times from 98 ° C for 2 seconds.
증폭결과를 확인하기 위하여 PCR product들은 1.0% agarose gel에서 전기영동을 수행하였다. 그 결과를 도 1 및 표 4에 나타내었다. 도 1은 배추 BSNP 프라이머쌍 145개, BRP 프라이머쌍 425개, BRS 프라이머쌍 123개 등, 총 693개 배추 SNP 프라이머쌍을 이용하여 양배추에 적용한 PCR 증폭 결과의 전기영동 사진이다.
To confirm amplification results, PCR products were electrophoresed on 1.0% agarose gel. The results are shown in Fig. 1 and Table 4. Fig. 1 is an electrophoresis image of a PCR amplification result applied to a cabbage using a total of 693 Chinese cabbage SNP primer pairs including 145 Chinese BSNP primer pairs, 425 BRP primer pairs, and 123 BRS primer pairs.
상기 표 4에서 알 수 있듯이, 배추 유전체 정보를 이용하여 배추에서 개발된 병저항성 유전자 연관 SNP 프라이머쌍 중 HRM(High Resolution Melt) 분석용 145개 SNP 프라이머쌍(BSNP)과 양배추에 적용가능한 425개 SNP 프라이머쌍(BRP), BRP 중 HRM 분석용으로 새롭게 제작된 123개 SNP 프라이머쌍을 양배추 6개 품종에 평가한 결과, BSNP에서 108개, BRP에서 415개, BRS에서 118개의 프라이머쌍이 양배추에서 증폭 가능한 것으로 나타났다.
As can be seen from Table 4, 145 SNP primer pairs (BSNP) for analysis of HRM (High Resolution Melt) among the disease resistance gene-related SNP primer pairs developed in Chinese cabbage using Chinese cabbage genome information and 425 SNPs applicable to cabbage As a result of evaluating 123 pairs of SNP primers newly developed for HRM analysis of primer pair (BRP) and BRP, six pairs of cabbage were evaluated. 108 pairs of BSNP, 415 of BRP and 118 pairs of BRS were amplified in cabbage Respectively.
기개발된 배추 SNP 프라이머쌍 중 양배추에 PCR 증폭 가능한 배추 BSNP 프라이머쌍 98개를 HRM 분석한 결과, 양배추 뿌리혹병 저항성 특이 마커 2개 선발하였다. 이때, 양배추에 PCR 증폭 가능한 배추 BSNP 108개 중 10개 SNP 프라이머쌍은 PCR 증폭결과, multi-band로 확인되어 HRM 분석에서 제외하였다.As a result of HRM analysis of 98 pairs of PCR amplifiable Chinese cabbage BSNP primers in cabbage, two specimens of cabbage root - knot disease resistance - specific markers were selected. At this time, 10 pairs of SNP primers among 108 PCR-amplifiable Chinese cabbage BSNPs were confirmed as multi-band PCR results and excluded from the HRM analysis.
또한, 새롭게 제작된 BRS 프라이머쌍을 이용하여 HRM 분석을 한 결과, 양배추 뿌리혹병 저항성 특이 후보 마커 BRS6, BRS18, BRS79. BRS114 4개를 추가로 선발하였다. 이때, BRS 프라이머쌍은 생물정보 분석결과로 얻어진 양배추에 적용가능한 배추 425개 SNP 프라이머쌍 중 BSNP 용으로 새롭게 제작된 SNP 프라이머쌍 118개를 말한다.
As a result of HRM analysis using newly constructed pairs of BRS primers, BRS6, BRS18, and BRS79, which are specific candidates for resistance to cabbage root disease. Four additional BRS114 were selected. At this time, BRS primer pairs are 118 pairs of SNP primers newly made for BSNP among 425 Chinese cabbage SNP primer pairs applicable to cabbage obtained from bioinformation analysis.
실시예 3: 마커의 특이성 검정Example 3: Marker specificity assay
선발된 2개의 양배추 뿌리혹병 저항성 특이 마커를 이용하여 뿌리혹병 저항성 수치가 높았던 3점(VMBL_CV048, VMBL_CV049, VMBL_CV050)과 낮았던 3점(VMBL_CV001, VMBL_CV002, VMBL_CV003)의 HRM 분석결과를 표 5 및 도 2에 나타내었다. 도 2는 배추 병저항성 SNP 프라이머쌍 중에서 HRM 분석용으로 제작된 SNP 프라이머쌍 중 선발된 양배추 뿌리혹병 저항성 특이 마커 BSNP017 및 BSNP157을 이용하여 양배추 뿌리혹병 저항성 3품종과 이병성 3품종을 HRM 분석을 한 결과이다.
The results of HRM analysis of three points (VMBL_CV048, VMBL_CV049, and VMBL_CV050) and three low points (VMBL_CV001, VMBL_CV002, and VMBL_CV003), which had high values of resistance to root canal disease using the selected two cabbage root disease resistance resistance markers, are shown in Tables 5 and 2 Respectively. FIG. 2 shows HRM analysis of three cabbage root-knot disease resistance varieties and three Lee Byeongseong varieties using cabbage root-knot disease resistance specific markers BSNP017 and BSNP157 among SNP primer pairs prepared for HRM analysis among Chinese cabbage resistant SNP primer pairs to be.
상기 표 5 및 도 2에 의하면, BSNP017 및 BSNP157 프라이머쌍을 이용하여 양배추 뿌리혹병 저항성 3품종과 이병성 3품종을 HRM 분석을 한 결과, 특이적인 반응만 일어나며 비특이적인 반응이 일어나지 않아, BSNP017 및 BSNP157 마커가 양배추 뿌리혹병 저항성에 특이한 마커임을 알 수 있다.
As shown in Table 5 and FIG. 2, HRM analysis of three cabbage root-knot disease resistance varieties and three Lee Byeongseong varieties using the BSNP017 and BSNP157 primer pairs revealed that only specific reactions occurred and nonspecific reactions did not occur. Thus, BSNP017 and BSNP157 markers Is a marker specific to cabbage root disease resistance.
또한, 선발된 4개의 양배추 뿌리혹병 저항성 특이 후보 마커 BRS6, BRS18, BRS79. BRS114를 이용하여 뿌리혹병저항성 수치가 높았던 3점(VMBL_CV048, VMBL_CV049, VMBL_CV050)과 낮았던 3점(VMBL_CV001, VMBL_CV002, VMBL_CV003)의 HRM 분석결과를 표 6 및 도 3에 나타내었다. 도 3은 생물정보 분석결과로 얻어진 양배추에 적용가능한 배추 425개 SNP 프라이머쌍 중 BSNP 용으로 새롭게 제작된 SNP 프라이머쌍인 BRS 프라이머쌍 118개 중에서 선발된 4개의 양배추 뿌리혹병 저항성 특이 마커 BRS6, BRS18, BRS79, BRS114을 이용하여 양배추 뿌리혹병 저항성 3품종과 이병성 3품종을 HRM 분석을 한 결과이다.
In addition, four selected cabbage pathogen resistance - specific candidate markers BRS6, BRS18, BRS79. The results of HRM analysis of three points (VMBL_CV048, VMBL_CV049, VMBL_CV050) and three low points (VMBL_CV001, VMBL_CV002, VMBL_CV003), which had high values of resistance to root canal disease using BRS114, are shown in Table 6 and FIG. FIG. 3 is a graph showing the results of bioinformation analysis of four cabbage root-knot disease resistance-specific markers BRS6, BRS18, and BRS18 selected from 118 pairs of BRS primers, which are SNP primer pairs newly made for BSNP among 425 Chinese cabbage SNP primers applicable to cabbage. BRS79 and BRS114 were used for HRM analysis of 3 varieties of cabbage root disease and 3 varieties of Lee Byeongseong.
상기 표 6 및 도 3에 의하면, BRS6, BRS18, BRS79. BRS114 프라이머쌍을 이용하여 양배추 뿌리혹병 저항성 3품종과 이병성 3품종을 HRM 분석을 한 결과, 특이적인 반응만 일어나며 비특이적인 반응이 일어나지 않아, BRS6, BRS18, BRS79. BRS114 마커가 양배추 뿌리혹병 저항성에 특이한 마커임을 알 수 있다.According to Table 6 and FIG. 3, BRS6, BRS18, BRS79. BRS114, BRS114, and BRS114 were detected by HRM analysis of three varieties of cabbage rootstock disease and three varieties of Lee, Byeongseong using only the BRS114 primer pair, and no specific reaction occurred. The BRS114 marker is a unique marker for the resistance to cabbage root disease.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> SNP Maker for identifying of clubroot resistance in Cabbage and uses thereof <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BSNP017 forward primer <400> 1 cggaaaccct aatcaaccac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BSNP017 reverse primer <400> 2 agggtgactg ctccgattat 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BSNP157 forward primer <400> 3 ccatatccga agagccaaag 20 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BSNP157 reverse primer <400> 4 ggagaacatt ttactcaaga gatga 25 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRS6 forward primer <400> 5 tcaactctct gtgtgtgcct g 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRS6 reverse primer <400> 6 caaagcggaa gctcaagaac 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRS18 forward primer <400> 7 gtggcacttg tgtttgctgt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRS18 reverse primer <400> 8 ggccccatag agtgattctg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRS79 forward primer <400> 9 ccatggactg aaagaggcat 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRS79 reverse primer <400> 10 cctctccgat ccaatcttca 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRS114 forward primer <400> 11 tcagcttccc gttttctgag 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRS114 reverse primer <400> 12 gggtttggtt agggacgttt 20 <110> REPUBLIC OF KOREA (MANAGEMENT: RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> SNP Maker for identifying the clubroot resistance in Cabbage and uses thereof <160> 12 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BSNP017 forward primer <400> 1 cggaaaccct aatcaaccac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > BSNP017 reverse primer <400> 2 agggtgactg ctccgattat 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BSNP157 forward primer <400> 3 ccatatccga agagccaaag 20 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > BSNP157 reverse primer <400> 4 ggagaacatt ttactcaaga gatga 25 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRS6 forward primer <400> 5 tcaactctct gtgtgtgcct g 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRS6 reverse primer <400> 6 caaagcggaa gctcaagaac 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRS18 forward primer <400> 7 gtggcacttg tgtttgctgt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRS18 reverse primer <400> 8 ggccccatag agtgattctg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRS79 forward primer <400> 9 ccatggactg aaagaggcat 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRS79 reverse primer <400> 10 cctctccgat ccaatcttca 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRS114 forward primer <400> 11 tcagcttccc gttttctgag 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRS114 reverse primer <400> 12 gggtttggtt agggacgttt 20
Claims (4)
게놈 DNA를 주형으로 하여 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 품종별 특이 부위를 각각 증폭하는 단계; 및
상기 각 증폭된 품종별 특이 유전자를 전기영동으로 확인한 후 조합된 밴드를 분석하여 뿌리혹병 저항성 품종을 식별하는 단계를 포함하는, 양배추 뿌리혹병 저항성 품종의 식별방법.Isolating the genomic DNA of the cabbage;
Amplifying a specific region of each strain using the primer set of claim 1 using the genomic DNA as a template; And
Identifying the specific gene for each amplified strain by electrophoresis, and analyzing the combined band to identify the rootstock disease resistant strain.
게놈 DNA를 주형으로 하여 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 품종별 특이 부위를 각각 증폭하는 단계; 및
상기 각 증폭된 산물을 HRM(High Resolution Melt) 분석을 통해 뿌리혹병 저항성 품종을 식별하는 단계를 포함하는, 양배추 뿌리혹병 저항성 품종의 식별방법.Isolating the genomic DNA of the cabbage;
Amplifying a specific region of each strain using the primer set of claim 1 using the genomic DNA as a template; And
Identifying each of the amplified products by a High Resolution Melt (HRM) analysis to identify the root-knot disease resistant variety.
Priority Applications (1)
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