KR20140124403A - 심혈관 질환 및 다른 증상에 대한 파라크린 유전자의 전신 전달 및 조절 발현 - Google Patents

심혈관 질환 및 다른 증상에 대한 파라크린 유전자의 전신 전달 및 조절 발현 Download PDF

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Abstract

대안적인 실시양태에서, 본 발명은 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 파라크린 폴리펩티드-인코딩 핵산 또는 유전자; 또는 세포 내에서 또는 생체내에서 파라크린-인코딩 핵산, 유전자, 전사물 또는 메시지를 발현할 수 있는, 파라크린-인코딩 핵산, 유전자, 전사물 또는 메시지를 그 안에 함유하고 있는 발현 비히클, 벡터, 재조합 바이러스 또는 균등물을 제공하고; 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 파라크린 폴리펩티드-인코딩 핵산, 유전자, 전사물 또는 메시지, 또는 발현 비히클, 벡터, 재조합 바이러스 또는 균등물을 이를 필요로 하는 개체 또는 환자에게 투여 또는 전달함으로써 증가된 파라크린 폴리펩티드 레벨에 반응성인 질병, 감염 또는 증상의 상기 개체 또는 환자를 치료, 개선 또는 보호(예방)하는 것을 포함하여, 생체내에서 증가되거나 지속적인 파라크린 폴리펩티드 레벨에 반응성인 질병, 감염 또는 증상의 상기 개체 또는 환자를 치료, 개선 또는 보호(예방)하는 방법을 제공한다.

Description

심혈관 질환 및 다른 증상에 대한 파라크린 유전자의 전신 전달 및 조절 발현{SYSTEMIC DELIVERY AND REGULATED EXPRESSION OF PARACRINE GENES FOR CARDIOVASCULAR DISEASES AND OTHER CONDITIONS}
연방정부 후원 연구 하에서 이루어진 발명에 대한 권리에 관한 진술
본 발명은 미국 국립보건원 (National Institutes of Health; NIH), DHHS에 의해서 수여된 승인 번호 HL088426에 따른 정부 지원에 의해서 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에서 일부의 권리를 갖는다.
본 발명은 세포 및 분자 생물학 및 의약에 관한 것이다. 본 발명은 조성물 및 시험관내 및 생체외 방법을 제공한다.　 대안적인 실시양태에서, 본 발명은 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 파라크린 폴리펩티드-인코딩 핵산 또는 유전자; 또는 세포 내에서 또는 생체내에서 파라크린-인코딩 핵산, 유전자, 전사물 또는 메시지를 발현할 수 있는, 파라크린-인코딩 핵산, 유전자, 전사물 또는 메시지를 그 안에 함유하고 있는 발현 비히클, 벡터, 재조합 바이러스 또는 균등물을 제공하고; 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 파라크린 폴리펩티드-인코딩 핵산, 유전자, 전사물 또는 메시지, 또는 발현 비히클, 벡터, 재조합 바이러스 또는 균등물을 이를 필요로 하는 개체 또는 환자에게 투여 또는 전달함으로써 증가된 파라크린 폴리펩티드 레벨에 반응성인 질병, 감염 또는 증상의 상기 개체 또는 환자를 치료, 개선 또는 보호 (예방)하는 것을 포함하여, 생체내에서 증가되거나 지속적인 파라크린 폴리펩티드 레벨에 반응성인 질병, 감염 또는 증상의 상기 개체 또는 환자를 치료, 개선 또는 보호 (예방)하는 방법을 제공한다.
최근에, 혈우병 B에서 결핍되는 인간 인자 IX를 인코딩하는 바이러스 벡터의 정맥내 주사는 혈우병 B가 있는 대상체의 혈청 내에서 인자 IX 농도를 외인성 인자 IX 주입에 대한 그들의 필요성을 저하시키는 정도까지 상승시키는 것으로 나타났다. 그러나, 1) 이 단백질은 조절된 발현 하에 있지 않았고, 따라서 혈청 내에서 이식유전자의 레벨을 최적으로 맞출 수 없었으며; 2) 이 시스템은 바람직하지 않거나 예상 밖의 효과의 경우에 이식유전자 발현을 중지시키는 수단을 제공하지 않았고; 3) 유전자 인자 IX는 파라크린 유전자가 아니고, 유익한 심혈관 효과를 갖지 않으며, 따라서 심장 질환을 치료하기 위해서 사용될 수 없었다.
요약
본 발명은 생체내에서 증가된 파라크린 폴리펩티드 레벨에 반응성인 모든 질병, 감염 또는 증상의 개체 또는 환자를 치료, 개선 또는 보호 (예방)하는 방법을 제공한다. 대안적인 실시양태에서, 본 발명은 생체내에서 증가되거나 지속적인 펩티드 또는 파라크린 폴리펩티드 레벨에 반응성인 질병, 감염 또는 증상의 개체 또는 환자를 치료, 개선 또는 보호 (예방)하는 방법에 있어서,
(a) (i) 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 파라크린 폴리펩티드-인코딩 핵산 또는 유전자; 또는 그 안에 파라크린-인코딩 핵산 또는 유전자, 또는 파라크린 폴리펩티드-발현 핵산, 전사물 또는 메시지를 함유하며, 또한 세포에서 또는 생체내에서 파라크린-인코딩 핵산, 유전자, 전사물 또는 메시지를 발현할 수 있는 발현 비히클, 벡터, 재조합 바이러스 또는 균등물을 제공하는 단계; 및
(ii) 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 파라크린 폴리펩티드-인코딩 핵산, 유전자, 전사물 또는 메시지, 또는 발현 비히클, 벡터, 재조합 바이러스 또는 균등물을 이를 필요로 하는 세포 또는 개체 또는 환자에게 투여 또는 전달함으로써, 증가되거나 지속적인 파라크린 폴리펩티드 레벨에 반응성인 질병, 감염 또는 증상의 상기 개체 또는 환자를 치료, 개선 또는 보호(예방)하는 단계를 포함하는 방법;
(b) 상기 방법 (a)에서, 상기 발현 비히클, 벡터, 재조합 바이러스 또는 균등물이 아데노-연관된 바이러스(AAV), 렌티바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터; AAV 혈청형 AAV5, AAV6, AAV8 또는 AAV9; 레수스(rhesus)-유래 AAV, 또는 레수스-유래 AAV AAVrh.10hCLN2; AAV 캡시드 돌연변이체 또는 AAV 하이브리드 혈청형; 장기-친화성 (organ-tropic) AAV, 또는 심장친화성(cardiotropic) AAV, 또는 심장친화성 AAVM41 돌연변이체이거나, 이들을 포함하고, 여기에서, 임의로 상기 AAV는 야생형(wt) AAV에 대해서 비-허용적인 특이적 세포 타입을 표적화하는 효율을 증가시키고 및/또는 목적한 세포 타입만을 감염시키는 효능을 개선시키도록 조작되며,
임의로 상기 하이브리드 AAV는 1) 캡시드전환(transcapsidation), 2) 캡시드 표면에 이중-특이성 항체의 흡착, 3) 모자익 캡시드의 조작 및/또는 4) 키메릭 캡시드의 조작을 포함하는 하나 또는 그 이상의 변형에 의해서 하이브리드 혈청형으로서 재표적화되거나 조작되는 방법;
(c) 상기 방법 (a)에서, 상기 파라크린-인코딩 핵산, 유전자, 전사물 또는 메시지가 조절된 또는 유도성 전사 조절 서열에 작동적으로 연결되는 방법;
(d) 상기 방법 (c)에서, 상기 조절된 또는 유도성 전사 조절 서열이 조절된 또는 유도성 프로모터이며, 여기에서, 임의로 전사 및/또는 번역의 양성(활성화제) 및/또는 음성(억제제) 조절인자 (modulator)가 파라크린 폴리펩티드-인코딩 핵산, 유전자, 전사물 또는 메시지에 작동적으로 연결되는 방법;
(e) 상기 방법 (a) 내지 (d) 중 어느 하나에서, 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 파라크린 폴리펩티드-인코딩 핵산, 유전자, 전사물 또는 메시지, 또는 발현 비히클, 벡터, 재조합 바이러스 또는 균등물을 이를 필요로 하는 개체 또는 환자에게 투여하면 파라크린 단백질의 혈류 또는 일반 순환 내로의 방출 또는 세포 내에서 파라크린 단백질의 증가되거나 지속적인 발현을 제공하며,
여기에서, 임의로 상기 파라크린 단백질의 방출 또는 증가되거나 지속적인 발현은 파라크린 폴리펩티드-인코딩 핵산, 유전자, 전사물 또는 메시지에 작동적으로 연결된 유도성 프로모터의 활성화, 또는 억제제의 탈-억제에 의존하는 방법; 또는
(f) 상기 방법 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에서, 상기 생체내의 증가된 파라크린 폴리펩티드 레벨에 반응성인 질병, 감염 또는 증상이 심장 수축성 기능 장애; 울혈성 심부전(CHF); 심장 섬유증; 심장 근세포 질환, 기능 장애 또는 세포사멸 (apoptosis); 폐고혈압; 심장, 피부, 간, 폐, 근육, 신경, 뇌 또는 신장 질환, 암 또는 기능 장애; 암 또는 종양 형성; 또는 혈우병 또는 혈우병 B인 방법을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법의 대안적인 실시양태에서:
(a) 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 파라크린-인코딩 핵산 또는 유전자; 또는 발현 비히클, 벡터, 재조합 바이러스 또는 균등물은 경구적으로, 근육내(IM) 주사로, 정맥내(IV) 주사로, 피하(SC) 또는 피내 주사로, 수막강내 주사로, 동맥내(IA) 주사로, 관상동맥내 주사로, 흡입으로, 에어로졸로 또는 바이오리스틱(biolistic) 입자 전달 시스템으로, 또는 "유전자 총 (gene gun)", 공기 권총 (air pistol) 또는 헬리오스 (HELIOS™) 유전자 총 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)을 사용하여 이를 필요로 하는 개체 또는 환자에게 투여 또는 전달되거나;
(b) 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 파라크린-인코딩 핵산 또는 유전자; 또는 발현 비히클, 벡터, 재조합 바이러스 또는 균등물은 인코딩된 단백질이 조직 내의 세포로부터 분비되어 혈류 내로 방출될 수 있도록, 혈류에 인접하거나 혈류에 의해서 배출되는 신체 내의 임의의 조직 또는 유체 공간 내로 도입시킴으로써 이를 필요로 하는 개체 또는 환자에게 투여 또는 전달된다.
본 발명의 방법의 대안적인 실시양태에서, 파라크린 폴리펩티드 또는 펩티드는 포유류 강심성 펩티드, 성장 인자, 세렐락신 (Serelaxin), 릴랙신 (Relaxin)-2, 유로코틴 (Urocortin)-2 (UCn-2), 유로코틴-1 (UCn-1), 유로코틴-3 (UCn-3), 뇌 나트륨이뇨 펩티드 (Brain Natriuretic Peptide), 프로스타사이클린 신타제 (Prostacyclin Synthase), 성장 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자-1, 또는 이들의 임의의 조합; 또는 인간 강심성 펩티드, 인간 성장 인자, 세렐락신, 릴랙신-2, 유로코틴-2, 유로코틴-1, 유로코틴-3, 뇌 나트륨이뇨 펩티드, 프로스타사이클린 신타제, 성장 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자-11, 또는 이들의 임의의 조합이거나, 이들을 포함한다.
본 발명의 방법의 대안적인 실시양태에서, 파라크린 폴리펩티드는 유로코틴, 유로코틴-2, 유로코틴-1, 유로코틴-3, 릴랙신-2 또는 뇌 나트륨이뇨 펩티드이며, 상기 질병 또는 증상은 울혈성 심부전 (CHF)이거나; 파라크린 폴리펩티드는 프로스타사이클린 신타제이고, 상기 질병 또는 증상은 폐고혈압이며, 상기 질병 또는 증상이 울혈성 심부전 (CHF)이거나; 상기 파라크린 폴리펩티드는 프로스타사이클린 신타제이고, 상기 질병 또는 상태는 폐고혈압이다.
본 발명의 방법의 대안적인 실시양태에서는,
(a) 개체, 환자 또는 대상체에게 파라크린-발현 핵산 또는 유전자의 발현을 유도하거나, 파라크린-발현 핵산 또는 유전자의 발현을 유도하는 프로모터 (예를 들어, 파라크린-발현 핵산 또는 유전자에 작동적으로 연결되어 있음)를 활성화시키는 자극 또는 시그날을 투여하거나;
(b) 개체, 환자 또는 대상체에게 프로모터, 임의로 파라크린-발현 핵산 또는 유전자-특이적 프로모터 (예를 들어, 파라크린-발현 핵산 또는 유전자에 작동적으로 연결되어 있음)의 활성화제의 합성을 유도하는 자극 또는 시그날을 투여하거나;
(c) 개체, 환자 또는 대상체에게 파라크린-발현 핵산 또는 유전자, 또는 파라크린-발현 핵산 또는 유전자-특이적 프로모터의 천연 또는 합성 활성화제의 합성을 유도하는 자극 또는 시그날을 투여하며, 여기에서, 임의로 상기 천연 활성화제는 내인성 전사 인자이며;
(d) 상기 단계 (c)에서, 상기 합성 활성화제는 내인성 또는 외인성 표적 유전자를 특이적으로 및 선택적으로 개시 (turn on)시키도록 디자인된 아연-핑커 (zinc-finger) DNA 결합 단백질이며, 여기에서, 임의로 상기 내인성 표적은 유전자 파라크린-발현 핵산 또는 유전자, 또는 파라크린-발현 핵산 또는 유전자의 활성화제, 또는 파라크린-발현 핵산 또는 유전자에 작동적으로 연결된 프로모터의 활성화제이며;
(e) 상기 단계 (a) 내지 (c) 중의 어느 하나에서, 상기 자극 또는 시그날은 생물학적, 광선, 화학적 또는 약제학적 자극 또는 시그날을 포함하거나;
(f) 개체, 환자 또는 대상체에게 파라크린-발현 핵산 또는 유전자의 전사-후 활성화제 또는 파라크린-발현 핵산 또는 유전자에 작동적으로 연결된 프로모터의 활성화제의 발현을 자극하거나 유도하는 자극 또는 시그날을 투여하거나;
(g) 개체, 환자 또는 대상체에게 파라크린-발현 핵산 또는 유전자의 전사 억제제 또는 전사-후 억제제를 억제하거나 억제를 유도하는 자극 또는 시그날을 투여한다.
본 발명의 방법의 대안적인 실시양태에서, 파라크린-발현 핵산 또는 유전자의 발현을 유도하거나, 파라크린-발현 핵산 또는 유전자에 작동적으로 연결된 조절된 또는 유도성 프로모터의 발현을 유도하는 화학물질 또는 약물은 경구용 항생제, 독시사이클린 또는 라파마이신이거나; 독시사이클린을 사용하는 tet-조절 시스템이 파라크린-발현 핵산 또는 유전자 또는 그의 균등물의 발현을 유도하기 위해서 사용된다.
본 발명의 방법의 대안적인 실시양태에서, 파라크린-발현 핵산 또는 유전자 또는 발현 비히클, 벡터, 재조합 바이러스 또는 균등물은 액체, 겔, 하이드로겔, 분말 또는 수성 제형으로서 제형화된다.
본 발명의 방법의 대안적인 실시양태에서, 파라크린-발현 핵산 또는 유전자 또는 발현 비히클, 벡터, 재조합 바이러스 또는 균등물, 또는 유로코틴-2 (UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드는 소포 (vesicle), 리포좀, 나노입자 또는 나노지질 (nanolipid) 입자 (NLP) 또는 균등물로서 제형화되거나, 소포, 리포좀, 나노입자 또는 나노지질 입자 (NLP) 또는 균등물을 사용하는 전달을 위해서 제형화된다.
본 발명의 방법의 대안적인 실시양태에서, 파라크린-발현 핵산 또는 유전자 또는 발현 비히클, 벡터, 재조합 바이러스 또는 균등물은 단리되거나 배양된 세포로서 제형화되거나, 이들에 삽입 또는 형질감염되며, 임의로 상기 세포는 포유류 세포, 심장 세포, 또는 인간 세포, 비-인간 영장류 세포, 원숭이 세포, 마우스 세포, 랫트 세포, 기니아 피그 세포, 토끼 세포, 햄스터 세포, 염소 세포, 소 세포, 말 세포, 양 세포, 개 세포 또는 고양이 세포이다.
본 발명의 방법의 대안적인 실시양태에서, 파라크린-발현 핵산 또는 유전자 또는 발현 비히클, 벡터, 재조합 바이러스 또는 균등물, 또는 유로코틴-2 (UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드는 약제학적 또는 멸균 제형으로서 제형화된다.
본 발명의 방법의 대안적인 실시양태에서, 파라크린-발현 핵산 또는 유전자 또는 발현 비히클, 벡터, 재조합 바이러스 또는 균등물, 또는 유로코틴-2 (UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드는 제조 생성물, 인공 장기 또는 이식물을 이용하여, 또는 이들 상에, 또는 이들과 함께 제형화 또는 전달된다.
본 발명의 방법의 대안적인 실시양태에서, 파라크린-발현 핵산 또는 유전자 또는 발현 비히클, 벡터, 재조합 바이러스 또는 균등물은 시험관내 또는 생체외에서 파라크린 폴리펩티드를 발현한다.
본 발명의 대안적인 실시양태에서는 본 발명의 방법을 실시하는 것을 포함하여, 파라크린-반응성 병리학, 감염, 질병, 질환, 또는 증상의 상기 개체 또는 환자를 치료, 개선 또는 보호 (예방)하는 방법이 제공된다.
본 발명의 대안적인 실시양태에서는 본 발명의 방법을 실시하는 것을 포함하여 심장 수축성 기능 장애; 울혈성 심부전 (CHF); 심장 섬유증; 심장 근세포 질환, 기능 장애 또는 세포사멸; 폐고혈압; 심장, 피부, 간, 폐, 근육, 신경, 뇌 또는 신장 질환, 암 또는 기능 장애; 암 또는 종양 형성; 또는 혈우병 또는 혈우병 B를 치료, 개선 또는 보호 (예방)하는 방법이 제공된다.
대안적인 실시양태에서, 본 발명은
(a) 본 발명의 방법을 실시하고, 여기에서, 파라크린 폴리펩티드 또는 펩티드는 유로코틴-2 (UCn-2)를 포함하거나, 이것으로 구성되며;
(b) 유로코틴-2 (UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 유로코틴-2 (UCn-2)를 인코딩하는 핵산, 유전자, 메시지 또는 전사물을 이를 필요로 하는 개체 또는 환자에게 투여하며, 여기에서, 유로코틴-2 (UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드는 단리된, 재조합, 합성 및/또는 펩티드유사 (peptidomimetic) 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 이들의 변이체이며, 이렇게 하여 상기 환자 또는 개체에서 당뇨병 또는 전-당뇨병 (pre-diabetes)을 치료, 개선 또는 보호 (예방)하는 것을 포함하여, 환자 또는 개체에서 당뇨병 또는 전-당뇨병을 치료, 개선 또는 보호 (예방)하는 방법을 제공한다.
대안적인 실시양태에서, 본 발명은
(a) 본 발명의 방법을 실시하고, 여기에서, 파라크린 폴리펩티드 또는 펩티드는 유로코틴-2 (UCn-2)를 포함하거나, 이것으로 구성되며;
(b) 유로코틴-2 (UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 유로코틴-2 (UCn-2)를 인코딩하는 핵산, 유전자, 메시지 또는 전사물을 이를 필요로 하는 개체 또는 환자에게 투여하며, 여기에서, 유로코틴-2 (UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드는 단리된, 재조합, 합성 및/또는 펩티드유사 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 이들의 변이체이며, 이렇게 하여 상기 환자 또는 개체에서 비만을 치료, 개선 또는 보호 (예방)하는 것을 포함하여, 환자 또는 개체에서 비만을 치료, 개선 또는 보호 (예방)하는 방법을 제공한다.
대안적인 실시양태에서, 본 발명은
(a) 본 발명의 방법을 실시하고, 여기에서, 파라크린 폴리펩티드 또는 펩티드는 유로코틴-2 (UCn-2)를 포함하거나, 이것으로 구성되며;
(b) 유로코틴-2 (UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 유로코틴-2 (UCn-2)를 인코딩하는 핵산, 유전자, 메시지 또는 전사물을 이를 필요로 하는 개체 또는 환자에게 투여하며, 여기에서, 유로코틴-2 (UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드는 단리된, 재조합, 합성 및/또는 펩티드유사 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 이들의 변이체이며, 이렇게 하여 상기 환자 또는 개체에서 체중 증가를 억제하거나, 식욕을 억제하거나, 체중 감소를 자극하거나 개시시키는 것을 포함하여, 환자 또는 개체에서 체중 증가를 억제하거나, 식욕을 억제하거나, 체중 감소를 자극하거나 개시시키는 방법을 제공한다.
대안적인 실시양태에서, 유로코틴-2(UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드는 소포, 리포좀, 나노입자 또는 나노지질 입자 (NLP)에서 또는 이들로서 제형화되거나 또는 경구투여용, 근육내 (IM) 주사용, 정맥내 (IV) 주사용, 피하 (SC) 또는 피내 주사용, 척추 강내 주사용, 동맥내 (IA) 주사용, 관상동맥 주사용, 흡입용 또는 에어로졸에 의한 투여용으로 제형화된다.
본 발명의 하나 또는 그 이상의 실시양태의 상세한 내용은 첨부되는 도면 및 이하의 설명에서 기술된다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 이하의 설명 및 도면, 및 특허청구범위로부터 명백할 것이다.
본 명세서에서 인용된 모든 출판물, 특허, 특허출원은 이에 의해 분명하게 모든 목적으로 참고로 포함된다.
도 1은 이하의 실시예 2에 기술된 바와 같이 IGFI를 인코딩하는 AAV5를 포함하는 본 발명의 예시적인 구조물을 설명한다.
도 2A 및 도 2B는 이하의 실시예 2에 기술된 바와 같이, 배양된 신생 랫트 심장 근세포를 본 발명의 예시적인 AAV5.IGFI.tet 구조물로 감염시키고, IGFI를 유도하고, 발현시킨 다음에 측정하는 연구로부터의 데이터를 설명한다.
도 3은 이하의 실시예 2에 기술된 바와 같이, 첨가하고 제거하는 예시적인 AAV5.IGFI-tet 및 독시사이클린에 의한 유전자 전이 후에 배양된 신생 랫트 심장 근세포에서의 IGFI mRNA 발현의 조절된 발현을 그래프로 설명한 것이다.
도 4A는 랫트에서 AAV5.EGFP 유전자 전이시킨 지 3 주일 후에 편측성 전경골근에서의 EGFP 발현을 나타내는 현미경사진을 설명하며; 도 4B는 이하의 실시예 2에 기술된 바와 같이, CHF에서의 골격근 IGFI 발현의 효과를 측정한 초음파 심장검사로부터의 데이터를 요약한 표 4이다.
도 5는 이하의 실시예 2에 기술된 바와 같이, CHF의 골격근에서 본 발명의 예시적인 AAV5.IGFI.tet의 유전자 전이에 대한 실험적 프로토콜을 설명한다.
도 6은 심장 세포사멸 및 섬유증에 대한 AAV5.IGFI.tet 유전자 전이의 효과를 설명하며; 도 6A는 IGFI 발현의 활성화 (IGF-On)가 감소된 심장 근세포 세포사멸과 연관되었음을 나타내는 TUNEL 염색으로부터의 데이터를 그래프로 설명하고; 도 6B는 감소된 심장 섬유증 및 콜라겐 분획 영역이 감소된 것을 나타내는 IGF-Off 및 IGF-On 랫트로부터의 비경색 심실내 중격의 피크로시리우스 (picrosirius) 적색-염색된 절편을 설명하며; 도 6C는 이하의 실시예 2에 기술된 바와 같이 IGF-Off 및 IGF-On 랫트로부터의 이 데이터를 그래프로 설명한다.
도 7은 이하의 실시예 2에 기술된 바와 같이 마우스에게 정맥내 전달 및 랫트에게 근육내 전달로 본 발명의 예시적인 AAV5 구조물을 투여한 경우에, IGFI의 혈청 레벨을 증가시키는데 있어서 정맥내 투여가 근육내 투여보다 더 우수한 결과를 제공하였음을 그래프로 설명한다.
도 8은 이하의 실시예 2에 기술된 바와 같이 종말점으로 간 및 심장에서의 카피수 및 이식유전자 발현을 사용하여 예시적인 AAV5 및 AAV9 구조물의 정맥내 전달의 상대적 효능을 나타내는 데이터를 그래프로, 및 영상에 의해서 설명한다.
도 9는 이하의 실시예 2에 기술된 바와 같이 본 발명의 방법을 실시한 경우에 바람직하거나 특별한 적응증에 대해 사용하기에 가장 적절한 벡터를 결정 및 시험하기 위한 예시적인 프로토콜을 설명한다.
도 10A, 10B, 10C, 10D, 10E, 및 10F는 이하의 실시예 2에 기술된 바와 같은 본 발명의 예시적인 벡터 구조물을 설명한다.
도 11은 이하의 실시예 3에 기술된 바와 같이, IV AAV8이 파라크린 접근방법을 위한 혈청 유로코틴-2 (UCn-2)의 지속적인 증가된 레벨을 달성하기 위한 최적의 벡터 및 전달 경로임을 나타내는 데이터를 그래프로 설명한다.
도 12A는 예시적인 AAV8.CBA.UCn2 구조물의 IV 투여 후에 간에서 UCn2 mRNA 발현의 시간 과정을 그래프로 설명하며; 도 12B는 이하의 실시예 3에 기술된 바와 같이 AAV8.CBA.UCn2 IV 투여한지 6 주일 후에 LV에서 UCn2 mRNA 발현을 나타내는 데이터를 그래프로 설명하는 것이다.
도 13은 UCn2 유전자 전이가 정상 마우스에서 정맥내 (IV) 전달에 의한 본 발명의 예시적인 AAV8.UCn2 구조물의 전달에 의해서 LV 기능을 증가시켰는지 여부를 결정하는 시험으로부터의 데이터를 그래프로 설명하는 것이다: 도 13A는 UCn2 유전자 전이가 LV 수축 기능을 증가시켰음을 보여주는 데이터를 그래프로 설명하며; 도 13B는 이하의 실시예 3에 기술된 바와 같이 증진된 LV 이완을 시사하는 것으로 -dP/dt가 또한 감소되었음을 나타내는 데이터를 그래프로 설명하는 것이다.
도 14는 쇠약 심장 (failing heart)에 대한 UCn2 전이의 효과를 나타내는 데이터를 설명한 것이다: 도 14A는 연구 프로토콜을 설명하고; 도 14B 및 14C는 이하의 실시예 3에 기술된 바와 같이 쇠약 심장에 대한 UCn2 전이의 효과를 나타내는 데이터를 설명한다.
도 15는 정상 마우스에게 예시적인 AAV8.CBA.UCn2의 IV 전달을 제공하고, 4 주일 후에, UCn2 유전자 전이 그룹으로부터의 LV 샘플이 SERCA2a 단백질 발현의 2-배 증가를 나타내었음을 보여주는 데이터 (도 15A는 그래프로, 도 15B는 면역블럿에 의해서)를 설명하는 것이다.
도 16은 UCn2 유전자 전이 후의 일시적인 Ca2+의 데이터를 나타낸다: 도 16A는 UCn2 유전자 전이가 Ca2+ 감소의 비율을 증가시켰음을 그래프로 설명하며; 도 16B는 이하의 실시예 3에 기술된 바와 같이 시간-대-Ca2+ 일시적 붕괴가 4w 전에 UCn2 유전자 전이를 제공받은 마우스로부터의 심장 근세포에서 단축되었음을 그래프로 설명한다.
도 17은 UCn2가 배양된 신생 랫트 심장 근세포를 저산소 손상으로부터 보호하는 데이터를 나타낸다: 도 17A는 UCn2가 NaN3 처리 24 시간 후에 형태학적 정상증상을 보존하는 것을 설명하며; 도 17B는 이하의 실시예 3에 기술된 바와 같이 UCn2가 NaN3 처리 후에 LDH 방출을 감소시켰음을 그래프로 설명한다.
도 18은 이하의 실시예 3에 기술된 바와 같이, CREB (도 18A) 및 β-카테닌 (도 18B) 둘 다의 포스포릴화가 본 발명의 예시적인 UCn2.CBA.UCn2 구조물의 IV 전달 4w 후에 LV 샘플에서 검출되었음을 그래프로 설명한다.
도 19는 UCn2가 글루코즈 조절에 영향을 미치는 것을 보여주는 데이터를 설명한다: 마우스에게 예시적인 AAV8.CBA.UCn2의 IV 전달을 제공하였다: 도 19A는 공복시 혈당의 작은 감소가 UCn2 그룹에서 나타났음을 설명하며; 도 19B는 이하의 실시예 3에 기술된 바와 같이 UCn2 유전자 전이가 글루코즈 이용을 촉진시키고, 다이어트-유도된 저혈당증으로부터 보호함을 시사하는 결과를 설명한다.
도 20A, 20B, 20C, 20D, 20E, 및 20F는 이하의 실시예 3에 기술된 바와 같은 본 발명의 예시적인 구조물을 설명한다.
다양한 도면에서의 동일한 참조 기호는 동일한 요소를 나타낸다.
본 발명은 개체를 생체내의 증가된 파라크린 레벨에 대해 반응성인 질환, 감염 또는 증상에 대해서 치료, 개선 또는 보호 (예방으로서)하기 위하여 파라크린-인코딩 핵산, 유전자, 전사물 또는 메시지를 투여하는 것을 포함하는 조성물 및 생체내 및 생체외 방법을 제공한다. 대안적인 실시양태에서, 본 발명은 임의의 파라크린 폴리펩티드 또는 펩티드, 예를 들어, 포유류 강심성 펩티드, 세렐락신, 릴랙신-2, 유로코틴-2, 유로코틴-1, 유로코틴-3, 뇌 나트륨이뇨 펩티드, 프로스타사이클린 신타제, 성장 호그롬, 인슐린-유사 성장 인자-1, 또는 이들의 임의의 조합; 또는 인간 강심성 펩티드, 세렐락신, 릴랙신-2, 유로코틴-2, 유로코틴-1, 유로코틴-3, 뇌 나트륨이뇨 펩티드, 프로스타사이클린 신타제, 성장 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자-1, 또는 이들의 임의의 조합의 생체내 또는 동소 (in situ) 전달 및/또는 생체내 발현, 및 조절 발현을 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
대안적인 실시양태에서, 본 발명은 파라크린이 신체 내에서 예를 들어, 심혈관 질환을 치료하는 경우에는 심장, 또는 폐 또는 다른 표적과 같은 것에 대해 유익한 영향을 미칠 수 있는 혈류 또는 일반 순환 내로 파라크린 단백질이 방출되도록 야기하는, 파라크린-인코딩 핵산 또는 유전자, 또는 파라크린-인코딩 핵산 또는 유전자를 포함하는 (그 안에 함유하는) 발현 비히클 (예를 들어, 벡터, 재조합 바이러스 등)의 전달 및 조절 발현을 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
대안적인 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법을 실시하기 위한 것으로 파라크린-인코딩 핵산 또는 유전자의 생체내 발현을 위한 발현 비히클, 벡터, 재조합 바이러스 등을 제공한다. 대안적인 실시양태에서, 파라크린-인코딩 핵산 또는 유전자를 발현하는 발현 비히클, 벡터, 재조합 바이러스 등은 예를 들어, 외래 환자로서, 예를 들어, 사무실 방문 중에 근육내 (IM) 주사로, 정맥내 (IV) 주사로, 피하 (SC) 주사로, 흡입으로, 바이오리스틱 입자 전달 시스템 (예를 들어, 소위 "유전자 총") 으로 전달될 수 있다.
대안적인 실시양태에서, 이러한 "말초" 모드의 전달, 예를 들어, IM 또는 IV 주사한 발현 비히클, 벡터, 재조합 바이러스 등은 유전자 또는 핵산이 장기 (예를 들어, 심장, 폐 또는 신장) 그 자체에서 직접 발현되는 경우에 직면하는 문제를 피할 수 있다. 혈류 또는 일반 순환 내에서 바람직한 파라크린 단백질(들)의 지속적인 분비도 또한, 이하의 표 1에 요약된 바와 같이, 신체 내에서 매우 짧은 반감기를 나타내는 대부분의 단백질에 대해서 특히 문제가 될 수 있는 주입에 의한 단백질 투여의 어려움 및 비용을 피한다.
［표 1］
펩티드 IV 주입 대 유전자 전이
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대안적인 실시양태에서, 본 발명은 맞춤형 치료 및 최적 안전성의 보장을 위해서 쉽고 효율적으로 파라크린-발현 핵산 또는 유전자 발현을 개시 (turn on) 및 중지 (turn off)시킬 수 있는 방법을 제공한다.
대안적인 실시양태에서, 파라크린 단백질, 또는 파라크린-발현 핵산(들) 또는 유전자(들)에 의해서 발현된 단백질은 비록 그들의 작용 부위 또는 부위들로부터 멀리 떨어진 (예를 들어, 해부학적으로 떨어진) 혈액 또는 일반 순환 내로 분비되더라도 조직 또는 장기, 예를 들어, 심장, 혈관, 폐, 신장 또는 다른 표적에 대해 유익하거나 바람직한 효과 (예를 들어, 치료학적 또는 예방적)를 갖는다.
본 발명의 예시적인 실시양태에서는, 유로코틴-2를 인코딩하는 파라크린-발현 핵산 또는 유전자가 사용되지만, 예를 들어, 울혈성 심부전 (CHF) 또는 폐고혈압을 치료하기 위한 유로코틴-1 및 유로코틴-3, 뇌 나트륨이뇨 펩티드 (CHF의 경우), 프로스타사이클린 신타제 (폐고혈압의 경우), 성장 호르몬, 및/또는 인슐린-유사 성장 인자-1, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한 (단, 이들로 제한되지는 않음) 다른 파라크린-발현 핵산 또는 유전자가 본 발명의 방법을 실시하기 위해서 사용될 수 있다.
대안적인 실시양태에서, 본 발명은 심장 또는 폐 질환, 예를 들어, 울혈성 심부전 (CHF) 또는 폐고혈압을 치료하기 위한 파라크린-타입 유전자의 조절 발현을 제공하는 조절 발현 시스템을 위한 적용, 및 조성물 및 방법을 제공한다.
예를 들어, 대안적인 실시양태에서 재조합 바이러스 (예를 들어, 장기간 바이러스 또는 바이러스 벡터), 또는 벡터, 또는 발현 벡터 등은 예를 들어, 의사의 진료실에서, 예를 들어, 외래환자에게, 예를 들어, 체정맥 내로 (예를 들어, IV), 또는 근육내 (IM) 주사로, 흡입으로, 또는 바이오리스틱 입자 전달 시스템 (예를 들어, 소위 "유전자 총")으로 주입될 수 있다. 대안적인 실시양태에서는, 수일 또는 수주일 후에 (예를 들어, 4 주일 후에) 개체, 환자 또는 대상체에게 파라크린-발현 핵산 또는 유전자의 발현을 유도하는 화학물질 또는 약제를 투여하며 (예를 들어, 흡입, 주사 또는 삼킴); 예를 들어, 유전자의 발현을 활성화시킬 경구용 항생제 (예를 들어, 독시사이클린 또는 라파마이신)는 1일 1 회 (또는 더 또는 덜 종종) 투여된다. 대안적인 실시양태에서, 핵산 또는 유전자의 발현의 (예를 들어, 유도성 프로모터에 의한) "활성화" 또는 유도 후에, 파라크린 단백질은 합성되어 대상체의 순환계 내로 (예를 들어, 혈액 내로) 방출되고, 이어서 발현된 파라크린 단백질 또는 단백질들에 따라 개체 또는 환자를 유익하게 하는 (예를 들어, 심장, 신장 또는 폐 기능을 유익하게 하는) 바람직한 생리학적 효과, 예를 들어, 치료학적 또는 예방적 효과를 갖는다.　 의사 또는 대상체가 치료의 중단을 바라는 경우에, 대상체는 간단히 활성화 화학물질 또는 약제, 예를 들어, 항생제의 복용을 중단한다.
본 발명자들은 유로코틴-2를 인코딩하는 AAV 벡터를 사용하고, 정맥내 전달을 사용하여 마우스에게 벡터를 투여하였다. 다음의 결과가 나타났다: 1) 벡터의 정맥내 전달 4-6 주일 후에 이식유전자의 혈청 레벨의 17-배 증가; 2) 심장 수축성 기능 (수축 기능)에 대한 현저한 바람직한 효과; 및 3) 심장 이완 (확장 기능)에 대한 현저한 바람직한 효과.
대안적인 실시양태에서, 본 발명의 적용에는 다음이 포함된다: 중증의 낮은 박출률의 심부전의 치료; 폐고혈압의 치료; 보존된 박출률을 갖는 심부전의 치료; 입원 및 폐고혈압 및 심부전의 치료를 위한 혈관활성 펩티드의 지속적인 정맥내 주입을 필요로 하는 현행 치료법의 대체; 및, 파라크린-타입 유전자의 조절 발현을 사용하여 신체에서 거리를 두고 바람직한 효과를 촉진시킬 수 있는 다른 증상의 치료.
핵산의 생성 및 조작
대안적인 실시양태에서, 본 발명의 방법을 실시하기 위해서 본 발명은 파라크린 폴리펩티드를 인코딩하는 단리, 합성 및/또는 재조합 핵산 또는 유전자를 제공한다. 대안적인 실시양태에서, 본 발명의 방법을 실시하기 위해서 본 발명은 생체내 발현을 위한 발현 비히클, 예를 들어, 벡터 또는 재조합 바이러스 내의 (예를 들어, 그 안에 접목되어 있음) 재조합체 형태로 파라크린-발현 핵산 또는 유전자를 제공한다. 다른 대안적인 실시양태에서, 본 발명은 예를 들어, 원하는 파라크린 유전자의 발현을 억제하는 유전자 또는 메시지 (mRNA)의 발현을 억제할 수 있는 억제성 핵산 (예를 들어, siRNA, 마이크로RNA, 안티센스, 리보자임)을 인코딩하는 단리, 합성 및/또는 재조합 핵산을 제공한다.
대안적인 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 예를 들어, cDNA 라이브러리의 클로닝 및 발현, PCR에 의한 메시지 또는 게놈 DNA의 증폭 등에 의해서 제조, 단리 및/또는 조작된다. DNA, RNA, iRNA, 안티센스 핵산, cDNA, 게놈 DNA, 벡터, 바이러스 또는 이들의 하이브리드를 포함하는, 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 핵산 및 유전자는 다양한 공급원으로부터 단리되고, 유전적으로 조작되고, 증폭되고/되거나 재조합적으로 발현/생성될 수 있다. 이들 핵산으로부터 생성된 재조합 폴리펩티드 (예를 들어, 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 파라크린 키메릭 단백질)는 개별적으로 단리 또는 클로닝되고, 바람직한 활성에 대해서 시험할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 (예를 들어, AAV 구조물 또는 하이브리드), 박테리아, 진균, 포유류, 효모, 곤충 또는 식물 세포 발현 시스템 또는 발현 비히클을 포함한 임의의 재조합 발현 시스템 또는 유전차 요법 전달 비히클이 사용될 수 있다.
대신으로, 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 핵산은 예를 들어, 문헌 (Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859; 미국 특허 제4,458,066호)에 기술된 바와 같이 잘 알려진 화학적 합성 기술에 의해 시험관내에서 합성될 수 있다.
예를 들어, 서브클로닝, 라벨링 프로브 (예를 들어, 클레노우 (Klenow) 폴리머라제를 사용하는 랜덤-프라이머 라벨링, 닉 (nick) 번역, 증폭), 서열결정, 하이브리드화 등과 같은 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 핵산의 조작을 위한 기술은 과학 및 특허 문헌에 잘 기술되어 있다 (참조: 예를 들어, Sambrook, ed., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ND ED.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993)).
본 발명의 방법을 실시하기 위해서 사용된 핵산을 수득 및 조작하는 또 다른 유용한 수단은 게놈 샘플로부터 클로닝하고, 경우에 따라, 예를 들어, 게놈 클론 또는 cDNA 클론으로부터 단리되거나 증폭된 삽입물을 스크리닝 및 재-클로닝하는 것이다. 본 발명의 방법에서 사용된 핵산의 공급원에는 예를 들어, 포유류 인공 염색체 (MACs) (참조: 예를 들어, 미국 특허 제5,721,118; 6,025,155호); 인간 인공 염색체 (참조: 예를 들어, Rosenfeld (1997) Nat. Genet. 15:333-335); 효모 인공 염색체 (YAC); 박테리아 인공 염색체 (BAC); P1 인공 염색체 (참조: 예를 들어, Woon (1998) Genomics 50:306-316); P1-유래 벡터 (PACs) (참조: 예를 들어, Kern (1997) Biotechniques 23:120-124); 코스미드, 재조합 바이러스, 파지 또는 플라스미드에 함유된 게놈 또는 cDNA 라이브러리가 포함된다.
대안적인 실시양태에서, 본 발명의 방법을 실시하기 위해서는 파라크린 융합 단백질 및 이들을 인코딩하는 핵산이 사용된다. 임의의 파라크린 폴리펩티드라도, 예를 들어, 유로코틴-1, 유로코틴-2, 유로코틴-3, 뇌 나트륨 이뇨 펩티드, 프로스타사이클린 신타제, 성장 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자-1 단백질이 본 발명을 실시하기 위해서 사용될 수 있다. 대안적인 실시양태에서, 파라크린 단백질은 폴리펩티드를 심장 근세포 또는 폐 세포와 같은 원하는 세포 타입에 대해서 표적화하기 위한 펩티드와 같은 이종 펩티드 또는 폴리펩티드에 융합될 수 있다.
대안적인 실시양태에서, 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 단백질에 접합 또는 융합된 이종 펩티드 또는 폴리펩티드는 형광 검출, 증가된 안정성 및/또는 단순화된 정제와 같은 바람직한 특징을 제공하는 N-말단 확인 펩티드일 수 있다. 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 펩티드 및 폴리펩티드는 또한, 예를 들어, 더 면역원성인 펩티드를 생산하고, 재조합적으로 합성된 펩티드를 더 쉽게 단리시키고, 항체 및 항체-발현 B 세포를 확인 및 단리시키는 등을 위해서 그에 연결된 하나 또는 그 이상의 추가의 영역을 갖는 융합 단백질로서 발현 및 합성될 수 있다. 검출 및 정제를 용이하게 하는 영역에는 예를 들어, 고정화된 금속 상에서의 정제를 허용하는 폴리히스티딘 트랙트 (tracts) 및 히스티딘-트립토판 모듈 (modules)과 같은 금속 킬레이트화 펩티드, 고정화된 면역글로불린 상에서의 정제를 허용하는 단백질 A 영역, 및 FLAGS 연장/친화성 (extension/affinity) 정제 시스템 (Immunex Corp, Seattle WA)에서 이용된 영역이 포함된다. 정제 영역과 모티프-포함 펩티드 또는 폴리펩티드 사이에 인자 Xa 또는 엔테로키나제 (Invitrogen, San Diego CA)와 같은 분해가능한 링커 서열을 포함시키는 것은 정제를 용이하게 한다. 예를 들어, 발현 벡터는 6 개의 히스티딘 잔기에 연결된 에피토프-인코딩 핵산에 이어서 티오레독신 (thioredoxin) 및 엔테로키나제 분해 부위를 포함할 수 있다 (참조: 예를 들어, Williams (1995) Biochemistry 34:1787-1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12:404-414). 히스티딘 잔기는 검출 및 정제를 용이하게 하는 한편, 엔테로키나제 분해 부위는 융합 단백질의 나머지로부터 에피토프를 정제하기 위한 수단을 제공한다. 융합 단백질을 인코딩하는 벡터에 관한 기술 및 융합 단백질의 적용은 과학 및 특허 문헌에 잘 기술되어 있다 (참조: 예를 들어, Kroll (1993) DNA Cell. Biol., 12:441-53).
본 발명을 실시하기 위해서 사용된 핵산 또는 핵산 서열은 올리고뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 또는 이들 중 임의의 단편, 단일-스트랜드 또는 이중-스트랜드일 수 있고, 센스 또는 안티센스 스트랜드를 나타낼 수 있는 게놈 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA, 펩티드 핵산 (PNA), 또는 천연 또는 합성 기원의 모든 DNA-유사 또는 RNA-유사 물질일 수 있다. 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 화합물은 올리고뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 또는 이들 중 임의의 단편을 포함한 "핵산 또는 "핵산 서열"을 포함하며; 단일-스트랜드 또는 이중-스트랜드일 수 있고, 센스 또는 안티센스 스트랜드일 수 있는 게놈 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA (예를 들어, mRNA, rRNA, tRNA, iRNA), 또는 펩티드 핵산 (PNA), 또는 예를 들어, iRNA, 리보핵단백질 (예를 들어, 이중 스트랜드 iRNA, 예를 들어, iRNP)을 포함한 천연 또는 합성 기원의 모든 DNA-유사 또는 RNA-유사 물질을 포함한다. 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 화합물은 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산, 즉 올리고뉴클레오타이드을 포함한다. 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 화합물에는 합성 골격을 갖는 핵산-유사 구조물이 포함된다 (참조: 예를 들어, Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197; Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692-8698; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156). 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 화합물에는 화학적으로 합성될 수 있는 단일 스트랜드 폴리데옥시뉴클레오타이드 또는 2 개의 상보적 폴리데옥시뉴클레오타이드 스트랜드를 포함한 "올리고뉴클레오타이드"가 포함된다. 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 화합물에는 5' 포스페이트를 갖지 않는 합성 올리고뉴클레오타이드가 포함되며, 따라서 키나제의 존재 하에서 포스페이트와 ATP를 첨가함이 없이 또 다른 올리고뉴클레오타이드에 리게이션 (ligation)될 수 없을 것이다. 합성 올리고뉴클레오타이드는 탈포스포릴화되지 않은 단편에 리게이션될 수 있다.
대체 관점에서, 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 화합물에는 파라크린 폴리펩티드 (예를 들어, 유로코틴-1, 유로코틴-2, 유로코틴-3, 뇌 나트륨 이뇨 펩티드, 프로스타사이클린 신타제, 성장 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자-1 단백질)을 생산하는데 수단되는 유전자 및 DNA의 모든 분절이 포함되며; 이것은 인코딩 부분 (리더 (leader) 및 트레?러 (trailer))에 선행 및 후행하는 부분뿐만 아니라 적용가능한 경우에 개개 인코딩 절편 (엑손) 사이의 개입 서열 (인트론)을 포함할 수 있다. "작동적으로 연결된"은 2 개 또는 그 이상의 핵산 (예를 들어, DNA) 분절 사이의 기능적 관계를 나타낼 수 있다. 대체 관점에서, 이것은 전사된 서열에 대한 전사가능 조절 서열의 기능적 관계를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 프로모터는, 이것이 적절한 숙주 세포 또는 다른 발현 시스템에서 인코딩 서열의 전사를 자극하거나 조절시킨다면, 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 핵산과 같은 인코딩 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 대체 관점에서, 프로모터 전사가능 조절 서열은 이들이 전사된 서열에 대해서 물리적으로 인접할 수 있는 경우에는, 전사된 서열에 작동적으로 연결될 수 있으며, 즉 이들은 시스-작용성일 수 있다. 대체 관점에서, 인핸서 (enhancer)와 같은 전사가능 조절 서열은 인코딩 서열 (그의 전사는 이들을 증진시킴)에 물리적으로 인접하거나 아주 근접하게 위치할 필요는 없다.
대체 관점에서, 본 발명은 핵산의 발현에 영향을 미칠 수 있는, 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어, 이러한 서열과 상화적인 숙주 내의 구조 유전자 또는 전사물 (예를 들어, 파라크린 단백질을 인코딩함)을 포함하는 "발현 카세트"의 용도를 포함한다. 발현 카세트에는 적어도 폴리펩티드 인코딩 서열 또는 억제 서열과 작동적으로 연결된 프로모터; 및, 한가지 관점에서는 다른 서열, 예를 들어, 전사 종결 시그날을 포함할 수 있다. 발현에 영향을 미치는데 필요하거나 도움을 주는 추가의 인자들, 예를 들어, 인핸서가 또한 사용될 수 있다.
대체 관점에서, 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 발현 카세트는 또한 플라스미드, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 재조합체 "네이키드 (naked) DNA" 벡터의 모든 형태 등을 포함한다. 대체 관점에서, 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 "벡터"는 세포를 감염시키거나, 형질감염시키거나, 일시적으로 영구적으로 형질도입시킬 수 있는 핵산을 포함할 수 있다. 대체 관점에서, 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 벡터는 네이키드 핵산, 또는 단백질 또는 지질과 컴플렉스화된 핵산일 수 있다. 대체 관점에서, 본 발명을 실시하기 위해사 사용된 벡터는 바이러스 또는 박테리아 핵산 및/또는 단백질, 및/또는 막 (예를 들어, 세포막, 바이러스 지질 외피 등)을 포함할 수 있다. 대체 관점에서, 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 벡터는 DNA의 단편이 부착될 수 있고, 복제되는 리플리콘 (예를 들어, RNA 리플리콘, 박테리오파지)을 포함할 수 있으나, 이들로 제한되지는 않는다. 따라서, 벡터는 RNA, 자율적 자체-복제성 원형 또는 선형 DNA 또는 RNA (예를 들어, 플라스미드, 바이러스 등)를 포함하나, 이들로 제한되지는 않으며 (참조: 예를 들어, 미국 특허 제5,217,879호), 발현 및 비-발현 플라스미드 둘 다를 포함할 수 있다. 대체 관점에서, 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 벡터는 유사분열 중에 자율적 구조로서 세포에 의해서 안정적으로 복제될 수 있거나, 숙주의 게놈 내에 통합될 수 있다.
대체 관점에서, 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 "프로모터"는 세포, 예를 들어, 심장, 폐, 근육, 신경 또는 뇌 세포와 같은 포유류 세포에서 인코딩 서열의 전사를 구동시킬 수 있는 모든 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명의 구조물에서 사용된 프로모터는 유전자의 잔사의 시기 및/또는 속도를 조절하거나 조절시키는데 포함된 시스-작용성 전사가능 조절 요소 및 조절 서열을 포함한다. 예를 들어, 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 프로모터는 전사 조절에 포함되는 인핸서, 프로모터, 전사 종결인자, 복제 기원, 염색체 통합 서열, 5' 및 3' 비번역 부분, 또는 인트론 서열을 포함한 시스-작용 전사 조절 요소일 수 있다. 이들 시스-작용 서열은 전형적으로 전사를 수행 (개시/중지, 조절, 조절 등)하는 단백질 또는 다른 생체분자와 상호작용한다.
대안적인 실시양태에서, 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 "구성적 프로모터"는 발육 또는 세포 분화의 가장 환경적인 조건 및 증상 하에서 연속적으로 발현을 구동시키는 것들일 수 있다. 대안적인 실시양태에서, 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 "유도성" 또는 "조절가능" 프로모터는 환경적 조건, 투여된 화학적 작용제, 또는 발육 조건의 영향 하에서 본 발명의 핵산의 발현을 지시할 수 있다.
유전자 요법 및 유전자 전달 비히클
대안적인 실시양태에서, 본 발명의 방법은 파라크린-인코딩 핵산 또는 유전자, 또는 파라크린 폴리펩티드-발현 핵산, 전사물 또는 메시지의 페이로드 (payload)를 예를 들어, 유전자 요법 전달 비히클로서 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 세포 또는 세포들에 전달하기 위한 핵산 (예를 들어, 유전자 또는 폴리펩티드 인코딩 핵산) 전달 시스템의 용도를 포함한다.
대안적인 실시양태에서, 본 발명의 방법을 실시하기 위해서 사용된 발현 비히클, 벡터, 재조합 바이러스 또는 균등물은 아데노-연관된 바이러스 (AAV), 렌티바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터; AAV 혈청형 AAV5, AAV6, AAV8 또는 AAV9; 레수스-유래 AAV 또는 레수스-유래 AAV AAVrh.10hCLN2; 장기-친화성 AAV, 또는 심장친화성 AAV, 또는 심장친화성 AAVM41 돌연변이체; 및/또는 AAV 캡시드 돌연변이체 또는 AAV 하이브리드 혈청형이거나, 이들을 포함한다. 대안적인 실시양태에서, AAV는 야생형 (wt) AAV에 대해서 비-허용적인 특이적 세포 타입을 표적화하는 효율을 증가시키고 및/또는 목적한 세포 타입만을 감염시키는 효능을 개선시키도록 조작된다. 대안적인 실시양태에서, 하이브리드 AAV는 1) 캡시드전환, 2) 캡시드 표면에 이중-특이성 항체의 흡착, 3) 모자익 캡시드의 조작, 및/또는 4) 키메릭 캡시드의 조작을 포함하는 하나 또는 그 이상의 변형에 의해서 하이브리드 혈청형으로서 재표적화되거나 조작된다. 야생형 (wt) AAV에 대해서 비-허용적인 특이적 세포 타입을 표적화하는 효율을 증가시키고, 목적한 세포 타입만을 감염시키는 효능을 개선시키기 위해서 아데노-연관된 바이러스 (AAV) 캡시드를 어떻게 조작하는지는 본 기술분야에서 잘 알려져 있다; 참조: 예를 들어, Wu et al., Mol. Ther. 2006 Sep;14(3):316-27. Epub 2006 Jul 7; Choi, et al., Curr. Gene Ther. 2005 Jun;5(3):299-310.
예를 들어, 레수스-유래 AAV AAVrh.10hCLN2 또는 그의 균등물이 사용될 수 있으며, 여기에서 레루스-유래 AAV는 인간의 임의의 기존의 면역력에 의해서도 억제될 수 없다; 참조: 예를 들어, 인간에 대해 증량가능한 용량으로 랫트 및 비-인간 영장류에 대한 AAVrh.10hCLN2의 투여를 지시하는 것은 허용가능한 안전성 프로필을 가지며, CNS에서 상당한 페이로드 발현을 매개함을 교시하는 Sondhi, et al., Hum Gene Ther. Methods. 2012 Oct;23(5):324-35, Epub 2012 Nov 6; Sondhi, et al., Hum Gene Ther. Methods. 2012 Oct 17.
또한, 예를 들어, 심장 유전자 전이를 위해서 특이적으로 디자인된 AAV 벡터 (심장친화성 AAV), 예를 들어, 심근에서 개선된 형질도입 효율 및 특이성을 갖는 AAVM41 돌연변이체가 사용될 수 있다 (참조: 예를 들어, Yang, et al. Virol J. 2013 Feb 11;10(1):50).
아데노-연관된 바이러스 (AAVs)는 영장류의 통상적인 감염제이며, 그래서 건강한 영장류는 AAV-매개된 유전자 전이 치료학적 전략을 억제하는 AAV-특이적 중화 항체 (NAbs) 의 큰 풀을 보유하기 때문에, 본 발명의 방법은 개별화된 치료 디자인을 용이하게 하고, 치료학적 효능을 증진시키기기 위해서 환자 후보자들을 치료 전에 AAV-특이적 NAbs에 대해서 스크리닝하는 것을 포함한다 (참조: 예를 들어, Sun, et al., J. Immunol. Methods. 2013 Jan 31;387(1-2):114-20, Epub 2012 Oct 11).
키트 및 설명서
본 발명은 본 발명의 조성물 및 방법을 포함하며, 그의 사용을 위한 설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 따라서 키트, 세포, 발현 비히클 (예를 들어, 재조합 바이러스, 벡터) 등이 또한 제공될 수 있다.
예를 들어, 대안적인 실시양태에서 본 발명은 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 조성물을 포함하는, 예를 들어, 유로코틴-2 (UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드; 또는 파라크린-인코딩 핵산를 포함하는 키트, (b) 본 발명의 액체 또는 수성 제형, 또는 (c) 본 발명의 소포체, 리포좀, 나노입자 또는 나노지질 입자를 제공한다. 한가지 관점에서, 키트는 본 발명의 임의의 방법, 예를 들어, 혈류 내의 바람직한 파라크린 레벨을 증가시키거나, 세포, 예를 들어, 심장 또는 폐 세포를 보호하거나, 당뇨병 또는 전-당뇨병을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 시험관내 또는 생체외 방법을 실시하기 위한 설명서를 더 포함한다.
제형
대안적인 실시양태에서, 본 발명은 생체내에서 파라크린 레벨을 증가시키는데 사용하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 대안적인 실시양태에서, 이들 조성물은 이들 목적으로서 제형화된 파라크린-인코딩 핵산, 예를 들어, 완충액, 염수액 (saline solution), 분말, 에멀션, 소포체, 리포좀, 나노입자, 나노지질입자 등으로서 제형화된 발현 비히클 또는 파라크린-인코딩 핵산을 포함한다.
대안적인 실시양태에서, 본 발명은 유로코틴-2 (UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 UCn-2-인코딩 핵산을 투여하여 당뇨병 (타입 1 및 타입 2, 또는 성인 발병형 당뇨병을 포함) 또는 전-당뇨병, 또는 비만 또는 과체중을 치료, 개선 또는 예방하거나; 체중 손실을 자극하거나, 식욕 억제제로서 작용하도록 하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 이를 위해 유로코틴-2 (UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 UCn-2-인코딩 핵산의 적절한 제형 및 투약형을 제공한다.
대안적인 실시양태에서, 조성물 (유로코틴-2 (UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 파라크린-인코딩 (예를 들어, UCn-2-인코딩) 핵산의 제형을 포함)은 임의의 방법으로서 제형화될 수 있으며, 원하는 시험관내, 생체내 또는 생체외 조건에 따라서 다양한 농도 및 형태로 적용될 수 있다. 시험관내, 생체내 또는 생체외 제형 및 투여를 위한 기술에 대한 상세한 사항은 과학 및 특허 문헌에 잘 기술되어 있다.
본 발명을 실시하기 위해서 사용된 파라크린-인코딩 핵산 또는 유로코틴-2 (UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드의 제형 및/또는 담체는 본 기술분야에서 잘 알려져 있다. 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 제형 및/또는 담체는 생체내 또는 생체외 적용에 적합한 정제, 환제, 분말, 캅셀제, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제 등과 같은 형태일 수 있다.
대안적인 실시양태에서, 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 파라크린-인코딩 핵산, 또는 유로코틴-2 (UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드는 수성 및/또는 완충제 용액과의 혼합물로, 또는 예를 들어, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 하이드록시프로필메틸셀룰로즈, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 고무 및 아카시아 고무와 같은 현탁화제, 및 천연적으로 존재하는 포스파티드 (예를 들어, 레시틴), 알킬렌 옥사이드와 지방산의 축합 생성물 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트), 에틸렌 옥사이드와 장쇄 지방족 알콜의 축합 생성물 (예를 들어, 헵타데카에틸렌 옥시세탄올), 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨로부터 유도된 부분 에스테르의 축합 생성물 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노-올리에이트), 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유도된 부분 에스테르의 축합 생성물 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노-올리에이트)와 같은 분산제 또는 습윤제를 포함하는 수성 및/또는 완충된 현탁액으로 존재할 수 있다. 수성 현탁액은 또한 에틸 또는 n-프로필 p-하이드록시벤조에이트와 같은 하나 또는 그 이상의 보존제를 함유할 수 있다. 제형은 예를 들어, 적절한 완충제를 사용함으로써 삼투압에 대해서 조정될 수 있다.
본 발명을 실시함에 있어서, 본 발명의 화합물 (예를 들어, 제형)은 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들어, 사용될 수 있으며 물 및 링거 용액, 등장성 염화나트륨을 포함하는 허용되는 비히클 및 용매에 용해된 파라크린-인코딩 핵산 또는 유전자, 또는 유로코틴-2 (UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드의 용액을 포함할 수 있다. 또한, 멸균 고정 오일이 용매 또는 현탁화 매질로서 사용될 수 있다. 이러한 목적으로는 합성 모노- 또는 디글리세라이드, 또는 올레산과 같은 지방산을 포함한 임의의 고정화 오일이 사용될 수 있다. 한가지 실시양태에서, 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 용액 및 제형은 멸균 증상이며, 일반적으로 바람직하지 않은 물질을 함유하지 않도록 제조될 수 있다. 한가지 실시양태에서, 이들 용액 및 제형은 통상적인 잘 알려진 멸균 기술에 의해서 멸균된다.
본 발명을 실시하기 위해서 사용된 용액 및 제형은 pH 조정 및 완충제, 독성 조정제, 예를 들어, 나트륨 아세테이트, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 나트륨 락테이트 등과 같은 생리학적 조건에 가깝게 하는데 필요한 것으로서 보조 성분들을 포함할 수 있다. 이들 제형의 활성제 (예를 들어, 파라크린-인코딩 핵산 또는 유전자)의 농도는 광범하게 변화할 수 있으며, 선택된 생체내 또는 생체외 투여의 특별한 모드 ? 원하는 결과, 예를 들어, 생체내 파라크린 발현의 증가에 따라 유체 용적, 점도 등을 기초로 하여 선택될 수 있다.
본 발명을 실시하기 위해서 사용된 용액 및 제형은 동결건조될 수 있다: 예를 들어, 본 발명은 파라크린-인코딩 핵산 또는 유전자, 또는 유로코틴-2 (UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 안정한 동결건조 제형을 제공한다. 한가지 관점에서, 이 제형은 파라크린-인코딩 핵산 또는 유전자, 또는 유로코틴-2 (UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드, 및 증량제 (bulking agent), 예를 들어, 만니톨, 트레할로즈, 라피노즈, 및 슈크로즈 또는 이들의 혼합물을 포함하는 용액을 동결건조시킴으로써 제조된다. 안정한 동결건조 제형을 제조하는 방법은 약 2.5 ㎎/㎖ 단백질, 약 15 ㎎/㎖ 슈크로즈, 약 19 ㎎/㎖ NaCl, 및 5.5보다 크지만 6.5보다 작은 pH를 갖는 나트륨 시트레이트 완충액을 포함하는 용액을 동결건조시키는 것을 포함할 수 있다 (참조: 예를 들어, 미국 특허출원 제20040028670호).
본 발명의 조성물 및 제형은 리포좀을 사용함으로써 전달될 수 있다 (이하의 설명을 또한 참조한다). 리포좀을 사용함으로써, 특히 리포좀 표면이 표적 세포에 대해서 특이적인 리간드를 갖거나, 다른 식으로는 우선적으로 특이적 조직 또는 장기 타입에 대해서 지시되는 경우에, 생체내 또는 생체외 적용 시에 표적 세포 내로 활성제를 전달하는데 촛점을 맞출 수 있다.
나노입자, 나노지질입자 및 리포좀
본 발명은 또한, 본 발명의 방법을 실시하기 위해서, 예를 들어, 파라크린-인코딩 핵산 또는 유전자, 또는 유로코틴-2 (UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드를 생체내 또는 생체외에서 개체, 환자 또는 포유류 세포에 전달하기 위해서 사용된 화합물 (예를 들어, 파라크린-인코딩 핵산 또는 유전자, 또는 유로코틴-2 (UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드)를 포함하는 나노입자, 나노지질입자, 소포체 및 리포좀 막을 제공한다. 대안적인 실시양태에서, 이들 조성물은 세포 표면 폴리펩티드를 포함한 폴리펩티드와 같은 생물학적 분자를 포함한 특정 분자를 표적화하도록, 예를 들어, 원하는 세포 타입, 예를 들어, 포유류 심장 세포, 신장 세포, 폐 세포, 신경 세포 등을 표적화하기 위해서 디자인된다.
본 발명은 예를 들어, 미국 특허공개 제20070082042호 (Park, et al.)에 기술된 바와 같이, 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 화합물을 포함하는 다층 리포좀을 제공한다. 다층 리포좀은 파라크린-인코딩 핵산 또는 유전자를 포획하도록 약 200 내지 5000 ㎚의 입자 크기로 스쿠알렌, 스테롤, 세라미드, 중성 지질 또는 오일, 지방산 및 레시틴을 포함하는 오일-상 성분들의 혼합물을 사용하여 제조될 수 있다.
리포좀은 활성제 (예를 들어, 파라크린-인코딩 핵산 또는 유전자, 또는 유로코틴-2 (UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드)를 캅셀화시킴으로써 리포좀을 생산하는 방법을 포함하는, 예를 들어, 미국 특허공개 제20070042031호 (Park, et al.)에 기술된 바와 같은 임의의 방법을 사용하여서 제조될 수 있으며, 여기에서 상기 방법은 제1 저장소 내에 수용액을 제공하고; 제2 저장소 내에 유기 지질 용액을 제공한 다음에, 제1 혼합 구역 내에서 수용액을 유기 지질 용액과 혼합시켜 리포좀 용액을 생성시키고 (여기에서, 유기 지질 용액은 수용액과 혼합시켜 실질적으로 순간적으로 활성제를 캅셀화한 리포좀을 생성시킴); 그 후, 즉시 리포좀 용액을 완충 용액과 혼합시켜 희석된 리포좀 용액을 생성시키는 것을 포함한다.
한가지 실시양태에서, 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 리포좀 조성물은 예를 들어, 미국 특허공개 제20070110798호에 기술된 바와 같이, 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 화합물 (예를 들어, 파라크린-인코딩 핵산 또는 유전자)의 원하는 세포 타입에 대한 전달을 표적화하기 위해서 치환된 암모늄 및/또는 다음이온 (polyanion)을 포함한다.
본 발명은 또한, 미국 특허공개 제20070077286호에 기술된 바와 같이, 활성제-함유 나노입자 (예를 들어, 이차 나노입자)의 형태로 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 화합물 (예를 들어, 파라크린-인코딩 핵산 또는 유전자, 또는 유로코틴-2 (UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드)를 포함하는 나노입자를 제공한다. 한가지 실시양태에서, 본 발명은 2가 또는 3가 금속 염과 작용하도록 본 발명의 지방-가용성 활성제 또는 지방-가용화된 수용성 활성제를 포함하는 나노입자를 제공한다.
한가지 실시양태에서는, 예를 들어, 미국 특허공개 제20050136121호에 기술된 바와 같이, 고체 지질 현탁액을 사용하여 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 파라크린-인코딩 핵산 또는 유전자, 또는 유로코틴-2 (UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드를 제형화하고, 생체내 또는 생체외에서 환자, 개체 또는 포유류 세포에게 전달할 수 있다.
전달 비히클
대안적인 실시양태에서, 임의의 전달 비히클이 본 발명의 방법 또는 조성물을 실시하기 위해서, 예를 들어, 생체내 또는 생체외에서 본 발명의 방법을 실시하기 위해 파라크린-인코딩 핵산 또는 유전자, 또는 유로코틴-2 (UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드를 전달하기 위해서 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허공개 제20060083737호에 기술된 바와 같이, 폴리에틸렌이민 유도체와 같은 다양이온, 양이온성 폴리머 및/또는 양이온성 펩티드를 포함하는 전달 비히클이 사용될 수 있다.
한가지 실시양태에서는, 건조된 폴리펩티드-계면활성제 컴플렉스를 사용하여 본 발명의 조성물을 제형화하며, 여기에서 계면활성제는 예를 들어, 미국 특허공개 제20040151766호에 기술된 바와 같이 비-공유 결합을 통해서 핵산과 회합된다.
한가지 실시양태에서, 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 핵산 또는 폴리펩티드는 예를 들어, 미국 특허 제7,413,739호에 기술된 바과 같이, 폴리머성 하이드로겔 또는 수용성 코폴리머로서 세포에 적용될 수 있으며; 예를 들어, 핵산 또는 단백질은 친핵성 부가에 의한 강한 친핵체와 컨쥬게이트된 불포화 결합 또는 컨쥬게이트된 불포화 그룹 사이의 반응을 통해서 중합될 수 있으며, 여기에서 각각의 전구체 성분은 적어도 2 개의 강한 친핵체 또는 적어도 2 개의 컨쥬게이트된 불포화 결합 또는 컨쥬게이트된 불포화 그룹을 포함한다.
한가지 실시양태에서, 핵산 또는 단백질은 예를 들어, 미국 특허 제7,306,783; 6,589,503호에 기술된 바와 같이, 세포막-투과성 펩티드 컨쥬게이트를 갖는 소포체를 사용하여 세포에 적용된다. 한가지 관점에서는, 핵산 그 자체가 세포막-투과성 펩티드에 컨쥬게이트된다. 한가지 실시양태에서, 핵산, 단백질 및/또는 전달 비히클은 매우 염기성이며 폴리-포스포이노시타이드에 결합하는 수송-매개 (transport-mediating) 펩티드를 기술하는 미국 특허 제5,846,743호에 기술된 바와 같이, 수송-매개 펩티드에 컨쥬게이트된다.
한가지 실시양태에서는, 전기-투과화 (electro-permeabilization)가 예를 들어, 미국 특허 제7,109,034; 6,261,815; 5,874,268에 기술된 바와 같이, 예를 들어, 임의의 전기천공 시스템을 사용하여, 세포에 대한 파라크린-인코딩 핵산 또는 유전자를 전달하는 일차 또는 보조 수단으로서 사용된다.
제조 생성물, 이식물 및 인공 장기
본 발명은 또한, 본 발명의 세포 (예를 들어, 본 발명의 방법을 실시하기 위해서 파라크린 단백질, 또는 유로코틴-2 (UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드를 발현하도록 변형된 세포)를 포함하는 제조 생성물, 및 예를 들어, 본 발명의 방법을 실시하기 위해서 파라크린 단백질을 발현하도록 변형된 세포를 포함하는 이식물 및 인공 장기, 생물반응기 (bioreactor) 시스템, 세포 배양 시스템, 플레이트, 접시, 튜브, 병 및 플라스크를 포함하는, 본 발명의 방법에 의해서 제조된 세포의 용도를 제공한다. 임의의 이식물, 인공 장기, 생물반응기 시스템, 세포 배양 시스템, 세포 배양 플레이트, 접시 (예를 들어, 페트리 접시), 세포 배양 튜브 및/또는 세포 배양 플라스크 (예를 들어, 롤러 병)라도 본 발명을 실시하기 위해서 사용될 수 있다.
대안적인 실시양태에서, 본 발명은 예를 들어, USPN 7,388,042; 7,381,418; 7,379,765; 7,361,332; 7,351,423; 6,886,568; 5,270,192; 및 미국 특허출원공개 제20040127987; 20080119909 (귀의 이식물을 기술함); 20080118549 (눈의 이식물을 기술함); 20080020015 (생물활성 창상 드레싱을 기술함); 20070254005 (심장 판막 생체-인공기관 (bio-prostheses), 혈관 이식편, 메니스커스 (meniscus) 이식물을 기술함); 20070059335; 20060128015호 (간 이식물을 기술함)에 기술된 바와 같은 이식물을 포함한, 본 발명의 방법을 실시하기 위해서 파라크린 단백질을 발현하도록 변형된 세포를 포함하는 생물반응기, 이식물, 스텐트, 인공 장기 또는 유사한 장치를 제공한다.
생체내에서 세포의 이식
대안적인 실시양태에서, 본 발명의 방법은 또한 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 파라크린-인코딩 핵산 또는 유전자를 포함하거나 발현하는 세포, 예를 들어, 심장, 폐 또는 신장 세포를 이식 또는 생착시키는 것을 포함하며; 한가지 관점에서, 본 발명의 방법은 생체외 또는 생체내에서 혈관, 조직 또는 기관 내에 파라크린-인코딩 핵산 또는 유전자 (또는 이들을 발현하는 세포), 또는 유로코틴-2 (UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드를 이식 또는 생착시키거나, 이를 필요로 하는 개체에서 재-프로그래밍된 분화 세포를 이식 또는 생착시키는 것을 포함한다.
세포는 공지된 임의의 기술 또는 프로토콜을 사용하여서 개체로부터 분리하여, 본 발명의 조성물 및/또는 방법을 사용하여 치료하고, 조직, 장기 또는 개체 내로 재삽입 (예를 들어, 주입 또는 생착)될 수 있다. 예를 들어, 탈분화 재-프로그래밍된 세포, 또는 재-프로그래밍된 분화 세포를 예를 들어, 미국 특허 제7,442,389호에 기술된 바와 같이 미립구를 사용하여 재-이식 (예를 들어, 주입 또는 생착)시킬 수 있으며; 예를 들어, 한가지 관점에서 세포 담체는 혼합 및 전달 시스템 내에 전부하 (preloading)된 둥글고 매끄러운 폴리메틸메타크릴레이트 미립자를 포함하는 증량제 및 이들 세포를 포함하는 자가유래 담체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 미국 특허출원공개 제20050027070호에 기술된 바와 같이 생체적합성 교차결합 매트릭스 내에서 이를 필요로 하는 조직, 장기 및/또는 개체에게 재투여된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 세포 (예를 들어, 본 발명의 방법을 실시함으로써 제조된 세포)는 예를 들어, cAMP-무력성 (incompetent) AC가 일급 아미노 또는 티올 그룹과 같은 다수의 친핵성 그룹을 함유하도록 변형된 폴리에틸렌 글리콜에 컨쥬게이트될 수 있는 프로토콜을 기술한 미국 특허 제6,969,400호에 기술된 바와 같이, 예를 들어, 합성 이식물의 표면 상의 생체적합성 비면역원성 코팅 내에서 이를 필요로 하는 조직, 장기 및/또는 개체에게 재투여 (예를 들어, 주입 또는 생착)되거나, 상기의 코팅에 의해서 보호된다.
한가지 실시양태에서, 본 발명의 세포 (예를 들어, 본 발명의 방법을 실시함으로써 제조된 세포)는 예를 들어, 미국 특허 제7,442,390; 5,733,542호에 기술된 바와 같은 이식 방법을 사용하여 이를 필요로 하는 조직, 장기 및/또는 개체에게 재투여 (예를 들어, 주입 또는 생착)된다.
폴리펩티드, 핵산 및/또는 세포를 조직 또는 장기 (예를 들어, 폐, 신장, 심장)에 전달하는 임의의 방법이 사용될 수 있으며, 이들 프로토콜은 예를 들어, 심장에 대한 제자리에서의 폴리펩티드, 핵산 및/또는 세포의 관상동맥내 (IC), 정맥내 (IV) 및/또는 국소 전달 (심근 주사)을 사용하는 것을 기술한 미국 특허 제(USPN)7,514,401호에 기술된 바와 같이 본 기술분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, 대안적인 실시양태에서 폐 내로 및 혈류 내로의 에어로졸 약물 입자, 유전자 요법, 연속 주입, 반복 주사 및/또는 지속 방출 폴리머가 폴리펩티드, 핵산 및/또는 세포를 조직 또는 장기 (예를 들어, 폐, 신장, 심장)에 전달하기 위해서 사용될 수 있다. 대안적인 실시양태에서, 핵산 및/또는 세포는 카테터를 통해서 관상 동맥내로, 또는 제한된 개흉술에 의해서 좌심방 또는 심실 심근 내로 직접 주사함으로써 제공될 수 있거나; 심장 카테터삽입 중에 통과된 카테터에 의해 심근 내로 전달되거나; 심장 주위의 공간 내로 전달될 수 있다.
대안적인 실시양태에서, 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 핵산 또는 단백질, 또는 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 핵산을 포함하는 벡터 (예를 들어, AAV, 또는 아데노바이러스 유전자 요법 벡터), 또는 본 발명의 소포체, 리포좀, 나노입자 또는 나노지질 입자 (NLP) 등, 예를 들어, 아미노산 서열 CRPPR (SEQ ID NO:1), 아미노산 서열 CARPAR (SEQ ID NO:2) 또는 그의 펩티드유사체, 또는 아미노산 서열 CPKRPR (SEQ ID NO:3) 또는 그의 펩티드유사체를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드는 예를 들어, USPN 7,501,486에 기술된 바와 같이 조직 또는 장기 (예를 들어, 폐, 신장, 심장)에 전달된다.,
본 발명을 실시하기 위해서 사용된 조성물은 다른 치료학적 작용제, 예를 들어, 혈관형성제, 항-혈전제, 항염증제, 면역억제제, 항-부정맥제, 종양 괴사 인자 억제제, 엔도텔린 억제제, 안지오텐신-전환 효소 억제제, 칼슘 길항제, 항생제, 항바이러스제 및 바이러스 벡터와 함께 사용될 수 있다.
본 발명을 실시하기 위해서 사용된 조성물은 다양한 심장병 및 심혈관 질환 중 어느 하나, 예를 들어, 심장병 및 심혈관 질환, 예를 들어, 관상동맥 질환 (CAD); 아테롬성 동맥경화증; 혈전증; 재발협착증; 결절성 다발성 동맥염, 처그-스트라우스 (Churg-Strass) 증후군, 타카야수 동맥염 (Takayasu's arteritis), 가와시카병 (Kawasaki Disease) 및 리케차 맥관염과 같은 자가면역 및 바이러스성 맥관염을 포함하는 맥관염; 아테롬성 동맥경화성 정맥류; 심근 비대; 선천성 심장 질환 (CHD); 허혈성 심장 질환 및 협심증; 획득된 심장 판막/심장 내막 질환; 심근염을 포함하는 원발성 심근 질환; 부정맥; 및 이식 거부반응; 울혈성, 비대성 및 제한성 심근질환과 같은 대사성 심근 질환 및 심근성 근질환, 및/또는 심장 이식을 개선시키거나 치료하기 위해서 사용될 수 있다. 대안적인 실시양태에서, 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 조성물, 예를 들어, 유로코틴-2 (UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드는 환자 또는 개체에서 당뇨병 또는 전-당뇨병을 치료, 개선 또는 보호 (예방)하거나; 환자 또는 개체에서 체중 증가를 억제하거나, 식욕을 억제하거나, 체중 감소를 자극 또는 개시시키거나; 환자 또는 개체에서 당뇨병을 치료, 개선 또는 보호 (예방)하기 위해서 사용된다.
본 발명은 이하의 실시예를 참조하여 더 기술될 것이지만, 본 발명은 이러한 실시예들로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
실시예
실시예 1: 유로코틴-2를 인코딩하는 AAV9의 정맥내 전달은 정상적인 마우스에서 심장 기능을 증가시킨다
본 실시예는 예시적인 실시양태의 유효성을 입증하며; AAV9/유로코틴-2 (또는 AAV9/UCn2)의 정맥내 전달은 혈청 UCn2 및 LV 수축 기능의 지속적인 증가를 제공하였으며, 이것은 본 예시적 실시양태의 심부전의 치료에 대한 유효성을 시사한다.
본 연구에서, 본 발명자들은 심부전을 갖는 동물 및 환자에서 변화 무쌍한 유익한 효과를 갖는 코티코트로핀-방출 인자 패밀리 내의 혈관활성 펩티드인 유로코틴-2 (UCn-2)를 인코딩하는 2 개의 아데노-연관된 바이러스 (AAV) 혈청형 (AAV5 및 AAV9)의 상대적 효능을 개발 및 시험하였다. AAV5.Ucn-2 및 AAV9.Ucn-2 (5x1011 게놈 카피, gc)는 정맥내 주사 (IV)에 의해서 전달되었다. 유전자 이식한 지 4 주일 (wks) 후에, AAV DNA (qPCR)는 간 (AAV5.UCn2: 2,601,839 카피/μg AAV9.UCn2: 30,121,663 카피/μg) 및 심장 (AAV5: 87,635 gc/μg; AAV9: 300,529 카피/μg)에서 상승되었으며; mRNA는 내인성 UCn2와 비교하여 유사하게 상승되었다 (AAV5.Ucn-2: 68±xx-배; AAV9.Ucn-2: 8,575).
좌심실 샘플은 단지 AAV9.UCn2에 의해서만 Ucn2 mRNA 증가를 나타내었으며, 이것은 내인성 mRNA에 비해 28 배 상승되었다. 혈장 Ucn-2는 증가하였다 (AAV5.UCn2: 이전의 2.7 ng/㎖로부터 3.6 ng/㎖로, p<0.0001; AAV9.UCn2. 마지막으로, 증가된 혈청 UCn2 레벨과 LV 수축 기능의 증가는 연관되었다.
실시예 2: 심혈관 질환의 치료를 위한 유전자 전이
본 실시예는 용이하며 안전하게 적용될 수 이는 방식으로 심장에서 고수율 이식유전자 발현을 수득하는데의 본 발명의 예시적 실시양태의 유효성을 입증한다.
대안적인 실시양태에서, 본 발명은 파라크린-타입 이식유전자를 인코딩하는 발현 비히클, 예를 들어, 벡터를 사용하는 방법을 제공한다. 이 실시양태에서, 이식유전자는 원위 부위로부터 순환계로 방출된 후에 심장 효과를 갖는 호르몬으로서 작용한다. 대안적인 실시양태에서, 이 접근방법은 고수율 심장 유전자 전이를 수득하는 것의 문제점을 우회할 수 있고, 환자가 진료소 방문 중에 전신 주사에 의해서 치료될 수 있게 한다.
본 발명자들은 다수의 AAV 혈청형 벡터 및 전달 방법을 검사하였으며, 파라크린 유전자 전이의 개념 입증 연구를 성공적으로 완료하였다. 중증의 확장된 CHF를 갖는 랫트에게 테트라사이클린 조절 하에서 인슐린-유사 성장 인자 I (IGFI)를 인코딩하는 아데노-연관된 바이러스 5 (AAV5) 벡터의 골격근 전달을 수행하였다. 이것은 랫트의 물 공급 시에 독시사이클린을 첨가하여 IGFI 발현의 활성화를 가능하게 하였다. 이 시스템은 IGFI의 혈청 레벨의 지속적인 증가 및 쇠약 심장의 개선된 기능을 제공하였다.
대안적인 실시양태에서는, a) IGFI 유전자 전이를 사용하여 수축 기능을 증가시키고; b) AAV 벡터 및 프로모터를 정맥내 전달을 위해서 사용하여 최소의 표적을 벗어난 영향 (off-target effect)과 함께 최대의 이식유전자 발현을 제공하고; c) 조절된 이식유전자 발현을 사용하여 혈청 이식유전자 레벨의 미세-조정 (fine-tuning)을 가능하게 하고, 필요에 따라 발현을 개시 및 중단시키도록 허용하고; d) 예를 들어, CHF의 랫트 모델에서 파라크린-발현 유전자의 유전자 전이를 사용하고; e) AAV의 유효 용량을 사용하고, 예를 들어, 정상 돼지에서 종말점으로서 혈청 파라크린 (예를 들어, IGFI)을 사용하여 벡터의 정맥내 전달 후에 이식유전자 발현의 활성화제를 사용한다.
대안적인 실시양태에서, 선택적 펩티드의 조절된 발현을 갖는 AAV 벡터의 IV 주사는 파라크린-매개된 작용을 통해서 쇠약 심장에 대한 유리한 효과를 갖는다.
벡터 선택. 대안적인 실시양태에서는, 아데노바이러스보다 탁월한 장기간 이식유전자 발현을 할 수 있는 한편, 렌티바이러스 벡터와 연관된 삽입 돌연변이 유발에 대한 가능성을 피하는 아데노-연관된 바이러스 (AAV) 벡터가 사용된다. 인자 IX, 에리트로포이에틴 및 α1-항트립신의 지속적인 혈청 증가가 AAV 벡터를 단일 주사한 지 수년 후에 개 및 비인간 영장류에서 입증되었으며1-4, 본 발명자들은 본 발명자들의 실험실에서 랫트에게 AAV5.IGFI-tet의 근육내 주사 후에 IGFI의 지속적인 (>1년) 혈청 증가를 확인하였다5. 비록 최근의 임상실험들은 일부의 AAV 혈청형이 면역 반응을 유발하는 것을 확인하였지만6,7, 더 새로운 세대의 AAV 벡터는 영장류에서의 전임상 연구에서 유사한 문제를 갖는 것으로 보이지 않는다.
AAV 혈청형: 대안적인 실시양태에서는 AAV 혈청형 AAV2가 사용되지만, 일부의 실시양태에서는 "슈도타입 (pseudotyped)" AAV 벡터가 바람직하다. AAV5, AAV6, AAV8 및 AAV9를 포함한 이들 AAV 혈청형들은 AAV2의 캡시드 및 이들의 특정한 명명법을 부여하는 독특한 복제 성분들을 포함하는 하이브리드 구조물이다. 대안적인 실시양태에서는 AAV6, AAV8 및 AAV9의 정맥내 전달이 사용되며; 이들은 심장, 간, 골격근 및 다른 곳에서의 실질적인 분포 및 이식유전자 발현을 나타낸다.
본 발명자들은 IV 대 IM AAV5.IGFI.tet 유전자 전이시킨지 3 개월 후의 유리 IGFI 혈청 레벨의 데이터를 그래프로 나타낸 도 7에 설명된 바와 같이, IGFI의 혈청 레벨을 증가시키는데 근육내 AAV5보다 정맥내 AAV5가 더 우수함을 확인하였다: 마우스 (각 그룹당 n=3)에서의 정맥내 전달은 독시사이클린 (On)으로 IGFI 발현을 활성화시킨 후에 혈청 IGFI의 2-배 증가를 제공하였으며; 랫트 (각 그룹당 n=9)에서의 근육내 전달은 IGFI 발현을 활성화시킨 지 5 주일 후에 혈청 IGFI의 >1.3-배 증가를 제공하였다. 막대 위의 P 값: 그룹 내 비교 (t-검정, 2 테일 (tails)). 혈청 IGFI의 변화는 AAV5.IGFI.tet의 정맥내 전달 후에 더 컸다 (p<0.001).
정맥내로 제공된 경우에, AAV9는 도 8에 설명된 것으로서 종말점으로 간 및 심장에서의 카피수 및 이식유전자 발현을 사용하여 예시적인 AAV5 및 AAV9 구조물의 정맥내 전달의 상대적 효능을 나타내는 데이터를 그래프로 및 이미지로 설명하는 도 8에서 설명된 바와 같이, 간 및 심장에서의 이식유전자 발현의 관점에서 AAV5보다 탁월하였다.
대안적인 실시양태에서, AAV9와 마찬가지로 AAV8은 일반화된 발현을 제공하지만, 간-특이적 프로모터와 함께 본 발명자들이 이용하도록 제안한 특성으로서 다른 기관보다 간에서 더 큰 비율을 제공한다.
대안적인 실시양태에서는, 자체-상보적 AAV 벡터 (scAAV)가 사용되며; 이들은 이들의 단일 스트랜드 (ssAAV) 유사체보다 더 큰 이식유전자 발현을 제공할 수 있다8. ssAAV 벡터 (삽입물 용량 4.7 kb)를 사용한 이식유전자 발현은 상보적 DNA 스트랜드가 합성될 때까지 4-6w 지연된다. 벡터 내의 상보적 DNA 스트랜드에 대해서 인코딩함으로써, scAAV (삽입물 용량 3.3 kb)는 2w 내에 이식유전자 발현이 가능하게 하며, 그의 ssAAV 유사체에 비해서 더 큰 이식유전자 발현을 제공한다8.
단지 하나의 조절 발현 벡터 (AAV8.TBG.IGFI.tet)만이 scAAV 구성을 할 수 있으며, 도 10에 설명된 바와 같이 다른 것은 너무 크다. 그러나, 이 벡터가 돼지 연구를 위해서 선택된다면, ssAAV가 필요한 대량을 제조하기 위한 더 우수한 수율을 제공하도록 사용될 수 있다. scAAV 유사체가 탁월한 발현을 이용하고, 용량 필요성을 감소시킬 수 있고, 임상 실험에서 안전성을 개선시킴으로써 인간에게 사용하기 위해서 사용될 수 있다.
［표 2］
테트라사이클린 대 라파마이신 조절
Figure pct00002

프로모터 대 표적 조직. 대안적인 실시양태에서, AAV 벡터 내에서의 이식유전자 발현을 위해서 선택된 프로모터는 일부의 조직-의존성을 갖는다. 대안적인 실시양태에서, 본 발명을 실시하기 위해서 사용된 프로모터에는 다음이 포함된다: 닭 β-액틴 (CBA); 갑상선 호르몬-결합 글로불린 (TBG, 간-특이적); 및 라우스 육종 바이러스 (Rous Sarcoma Virus; RSV) 프로모터. 이에 관해서, CMV는 골격 및 심장 근육에서 탁월한 프로모터인 것으로 일관되게 나타났다. 최근의 연구들은 CMV 프로모터가 결국 이식유전자 발현을 차단하는 간에서의 메틸화에 민감함을 시사한다. 간 발현의 상실은 이식유전자의 혈청 레벨을 감소시킬 것이며, 따라서 본 발명자들은 CMV 프로모터를 사용하도록 선택하지 않았으며, 대신에 메틸화에 덜 민감하며 유사하게 튼튼한 프로모터를 선택한다: 도 10에 설명된 바와 같은 닭 β-액틴 (CBA); 갑상선 호르몬-결합 글로불린 (TBG, 간-특이적); 및 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터.
조절된 발현. 대안적인 실시양태에서, AAV-매개된 유전자 전이에 의해서 부여된 장기간 발현을 사용하여, 만일 예기치 않은 부작용이 나타난다면, 이식유전자 발현은 발현을 차단하도록 조절된다. 조절된 발현은 또한 지속적인 전달이 아니라 간헐적인 전달을 가능하게 할 것이다. 대안적인 실시양태에서, 이 시스템은 활성화제가 이식유전자 발현을 중단 또는 개시시키도록 구성될 수 있다. 거의 지속적인 이식유전자 발현이 필요한 경우에는 "Off" 시스템이 바람직하다 (예를 들어, 이식유전자 발현이 바람직하지 않은 경우에만, 예를 들어, 부작용의 경우에만, 경구용 활성화제를 복용한다). 대안적인 실시양태에서, 간헐적 이식유전자 발현이 필요한 경우에는, "On" 시스템이 바람직하다 (예를 들어, 이식유전자 발현이 바람직한 경우에만 경구용 활성화제를 복용한다).
이들 대안적인 실시양태는 엄밀하게 조절할 수 있게 하며, 치료된 특정의 질환에 대해서 맞춤화되는 경우에는, 최소량의 활성화제를 복용하는 수단을 제공한다. 대안적인 실시양태에서, 조절된 발현 시스템, 예를 들어, 엑디손, 타목시펜, 테트라사이클린, 라파마이신이 사용되며9-12; 큰 크기의 엑디손 시스템은 조절 제한으로 인하여 임상적 유전자 이식을 위해서 개발하는데 어려울 수 있는 2-벡터 전략이 필요할 수 있다. 타목시펜 시스템은 다루기 힘든 것은 아니지만, 테트라사이클린 시스템보다 덜 허용되는 활성화제를 필요로 한다 (타목시펜 대 독시사이클린). 대안적인 실시양태에서는, 이용가능한 옵션 중의 단지 두 가지 (테트라사이클린 및 라파마이신 조절)만이 적합할 수 있으며, 이들이 큰 동물 모델에서 시험한 유일한 시스템이다3,4. 이들 시스템은 둘 다 유사한 특징 (상기, 표 2)를 가지며: 목적한 유전자는 활성화 약물 (테트라사이클린 또는 라파마아신 유사체)에 의해서 유도될 수 있는 조작된 전사 인자에 의해서 조절된다.
테트라사이클린-조절된 발현. 대안적인 실시양태에서, 본 발명은 유전자 이식의 세팅에서 테트라사이클린-조절된 발현을 사용한다:
a) 이식유전자의 기본 발현 ("leak"). 본 발명자들이 제안하고, 최근의 연구에서 사용된 것 (rtTA2S-M2)과 같은 더 새로운 rtTA 변이체는 이전의 rtTA 구조물과는 달리 기본 활성이 없이도13 튼튼한 테트라사이클린-의존적 발현을 제공한다.
b) 환자 내성 및 표적을 벗어난 영향에 대한 테트라사이클린의 만성적 사용.
ㆍ tet-조절 시스템이 광범하게 연구되었으며11; 시험관내 연구는 독시사이클린 -자극된 이식유전자 발현이 0.001 ng/㎖에서 시작하고, 0.1 ㎍/㎖에서 최대에 도달하여, 제1 세대 시스템에 비해서 EC50의 10-배 감소가 있음을 나타내었다13. 인간에서, 200 ㎎ 독시사이클린의 단일 경구 용량은 24 시간째에 최대 발현에 필요한 것보다 15-배 더 큰 1.5 ㎍/㎖의 평균 혈장 및 조직 농도를 제공한다14. 10-20 ㎎의 독시사이클린의 단일 1일 용량이 인간 대상체에서 이식유전자 발현의 완전한 활성에 충분할 수 있다15. 200 ㎎/d의 용량은 여드름 및 만성 감염에 대해 만성적으로 경구용 독시사이클린을 사용하는 환자에 의해서 잘 허용된다14,16.
ㆍ ORACEA® (독시사이클린 40 ㎎, 경구로 1일 1 회)는 빨간 코를 치료하기 위한 연속 사용에 관해 FDA에 의해서 승인되었다16. 감염을 치료하는데 필요한 200 ㎎ 용량보다 80% 더 적은 이 용량은 빨간 코를 치료하는 항염증 효과를 제공하지만, 항미생물 효과를 갖지 않으며, 항생제-내성 유기체의 발생을 초래하지 않는다 (11 년의 임상 데이터). 각각의 캅셀은 40 ㎎이 무수 독시사이클린을 30 ㎎은 즉시-방출형으로, 10 ㎎은 지연-방출 비드로서 함유한다. 테트라사이클린에 대한 알레르기가 있는 대상체는 감광성을 증가시켰으며, 임신 또는 수유 중인 여성, 또는 9 세 미만의 소아 (치아의 변색, 가능한 감소된 장골 성장)는 독시사이클린을 사용하지 않아야 한다. 5 년의 임상적 사용에서, 대부분의 통상적인 부작용은 경미한 위장 장애였다16.
ㆍ 테트라사이클린은 매트릭스 메탈로프로테이나제 발현 및 활성을 약화시킬 수 있으며, 심근 경색 (MI) 후의 처음 몇일 이내에 투여되는 경우에는 좌심실 (LV) 리모델링에 대해 영향을 미친다17. 그러나, 제안된 전임상 연구에서, LV 챔버 확장 및 반흔 형성이 그룹들 간에 안정하고 동등한 경우에, 독시사이클린은 MI의 5 주일 후에 투여된다. 본 발명자들은 이전에, 독시사이클린이 제안된 쥐 MI-유도된 CHF 모델에서 LV 리모델링, TIMP, 또는 MMP 발현에 영향을 미치지 않는다고 입증하였다.18 임상 세팅에서, 테트라사이클린은 MI의 급성기에서는 사용되지 않을 것이다.
c) rtTA 시스템의 성분에 대한 면역 반응. tet-조절인자에 대한 면역 반응은 비-인간 영장류에서 AAV4.tet 및 AAV5.tet 유전자 전이 (망막-내)를 사용한 장기간 연구 (여기에서, 이들은 2,5 년의 연구 기간 동안에 지속적인 테트라사이클린-의존적 이식유전자 발현을 나타내었음)에서 확인되지 않았다3,15. 본 발명자들은 높은 레벨의 rtTA를 발현하는 마우스 심장에서18,19, 또는 rtTA2S-M2 조절 요소를 사용한 IGFI의 AAV5-매개된 조절 발현 후의 마우스 및 랫트에서5 염증을 확인하지 못하였다. 망막내 또는 혈관 전달과는 달리 비인간 영장류에서 AAV.tet의 근육내 전달은 전사활성화제 융합 단백질의 세균성 및 바이러스성 성분에 대한 면역 반응 때문에 조절된 발현의 약화를 유도한다20. tet-조절인자에 대한 면역 반응이 측정될 수 있고, 동시에 박테리아 또는 바이러스 단백질을 포함하지 않고 면역 반응의 자극과 연관되지 않는 라파마이신-조절 시스템이 측정될 수 있다7 (참조: tet- 및 라파마이신 조절 강도 및 제한에 대한 표 2).
라파마이신-조절된 발현. 대안적인 실시양태에서, 박테리아 스트렙토마이세스 하이드로스코피쿠스(bacterium Streptomyces hygroscopicus)의 생성물인 마크롤리드 시롤리무스(라파마이신)이 사용되며, 이는 초기에 항진균제로서 개발되었지만 항증식성 및 면역억제 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 최근에, 이는 a) 기관 이식 거부를 예방하기 위해(2 mg P.O. (per os, 경구적으로), 1일 1회, 평균 혈청 수준 12± 6ng/ml 제공); b) 항증식성 효과에 기인하여 혈관형성술 후 재협착을 감소시키는 약물-방출 스텐트에 임상적으로 사용된다. 라파마이신은 마우스의 수명을 증가시키고, 노화의 악영향을 미리 막는 것으로 나타나고21, 다형태 교아종의 치료에서 보조제로서 사용된다22. 라파마이신은 세포질 FK-결합 단백질 12(FKBP12)에 결합하고, 라파마이신(mTOR) 시그날화 경로의 포유동물 표적을 억제한다. 세린/트레오닌 단백질 키나제인 mTOR은 세포 성장 및 증식에 영향을 미치고, 세포 생존을 촉진시킨다. 유전자 치료에 대한 라파마이신의 유용성은 라파마이신-조절된 발현 시스템에서 이용되는 특성인 이의 이합체화 속성에 있다. 이 시스템에서, 조작된 전사 인자의 DNA-결합 및 활성화 도메인은 융합 단백질로서 개별적으로 발현되고, 이는 교차 결합되고, 이에 의해 2가 "이합체화" 약물, 이러한 경우 라파마이신 또는 라파마이신 동족체의 첨가로 활성화된다12. 발현은 용량-의존적이고 가역적이며, 활성화제의 나노몰(nanomolar) 농도에 의해 유발된다12. 라파마이신 시스템은 바이러스 또는 박테리아 단백질을 전혀 함유하지 않고, 따라서 면역 반응을 자극하는 것 같지 않다. 마카쿠에서, AAV1 인코딩 에리트로포이에틴의 근육내 주사는 에리트로포이에틴 레벨의 감소 없고 조절 요소에 대한 면역 반응 없이 6년 이하 Rap-조절된 발현(26 별도 유도 사이클)을 제공한다4. 면역억제는 라파마이신의 잠재적 단점이다. 그러나, 이 문제는 이식유전자 발현을 라파마이신만큼 효과적으로 활성화시키고, 최소 면역 억제를 나타내고 mTOR를 억제하지 않는 경구용 라파마이신 동족체(AP22594)를 사용함으로써 회피할 수 있다4. 추가로, 더욱이, 활성화제로서, 매일 투여보다는 주간 투여가 효과적이고, 추가로 표적 부재 영향을 감소시킨다. 경구 투여된 AP22594의 용량-반응 관계 및 마카쿠에 효과적으로 사용된 경구 용량(0.45 mg, 1주일에 1회)으로부터 개시하는 이의 최대 용량-간격은 돼지에서 측정할 수 있다4.
인슐린-유사 성장 인자 I ( IGFI )
IGFI의 선택. 성장 호르몬(GH)은 IGFI의 활성화를 통해 이의 효과 중 대부분을 나타낸다. IGFI는 Akt를 통해 이의 효과 중 대부분을 나타낸다. GH로부터 IGFI 내지 Akt를 통한 시그날화의 수렴 때문에, GH 또는 Akt에 대한 IGFI의 선택은 방어되어야 한다. 증가된 GH 발현은 IGFI를 선택함으로써 회피되는 유해 작용인 혈당 및 혈압을 증가시키는 것으로 예측될 것이다. 증가된 Akt의 발현은 세포사멸을 감소시키지만, Akt에 의해 제공되지 않는 기타 잠재적으로 유리한 효과, 예를 들어, 증가된 혈관형성을 갖는 것으로 기대될 것이다. 따라서, 본 발명자들은 당해 초기 임상전 CHF 연구에 IGFI 유전자 전이를 선택하고, 최근에는 IGFI 유전자 전이가 랫트의 심부전 기능을 개선시킨다는 것을 밝혀냈다5(참조: 도 1 내지 8 및 표 4 & 5).
IGFI 시그날화. 초기에 소마토메딘으로서 공지된 IGF는 GH의 동화작용 및 세포 분열 촉진 활성의 다수를 조정하는 펩티드 부류이다. 인슐린과 구조적 및 대사적 유사성을 갖는 2개의 소마토메딘은 1978년에 인간 혈장으로부터 분리되었고, IGFI 및 IGFII로 지칭되었다. IGFI(소마토메딘 C)는 후속적으로 GH를 순환시킴으로써 조절되는 IGF인 것으로 나타났다. IGFI는 3개의 디설파이드 브릿지와 분자량 7.6 kD를 갖는 단일 사슬로 70개의 아미노산을 갖는다. 초기에 단지 간에 의해 생성되는 것으로 생각되었지만, 이는 장, 뇌, 신장, 폐 및 심장을 포함하는 다수의 조직에 의해 생산되는 것으로 밝혀졌다. 랫트에서 IGFI 유전자의 간-특이적 결실이 정상 성장 및 발달을 변경하지 않고, 이는 심장을 포함하는 기타 조직에서 널리 발현되는 IGFI가 파라크린 방식(paracrine manner)으로 국소 조직 방출을 통해 성장 및 발달을 조절한다는 것을 나타낸다.
IGFI는 리간드를 포함하는 단백질(IGFI, IGFII, 인슐린), 6개의 공지된 결합 단백질(IGFBP 1-6), 및 IGFI를 포함하는 세포 표면 수용체 및 인슐린 수용체에 속한다24. IGFI는 아미노 말단 시그날 펩티드, A, B, C 및 D 도메인 및 가변 카복실 말단 E 펩티드를 포함하는 프리-프로 펩티드로서 해석된다. 가변 E 펩티드의 아미노산 조성만 상이한 인간의 프로-IGFI의 3개의 공지된 이소형(프로-IGFIa, 프로-IGFIb 및 프로-IGFIc)가 존재한다. IGF 결합 단백질(IGFBP)은 담체 단백질로서 작용하고, 퇴화를 억제함으로써 IGF의 반감기를 연장시킨다24. 거의 모든(98%) IGFI는 IGFBP-3에 주로(80%) 결합된 증상으로 순환한다24.
IGFI 및 IGFII는 간을 제외한 모든 조직에서 IGFI 수용체에 대해 높은 결합 친화성을 나타낸다. IGF 수용체는 인슐린 수용체와 60% 상동성을 공유하고, 티로신 키나제 도메인을 포함한다. IGFI의 수용체 결합은 티로신 잔기의 자가포스포릴화를 유도한다. 이는, PI3 키나제/Akt 및 미토켄 활성화 단백질 키나제(MAPK) 경로 및 기타를 포함하는 다수의 시그날화 케스케이드를 활성화시키는 인슐린 수용체 기질을 포함하는 기질의 포스포릴화를 생성하는 수용체를 활성화시키고, 이들 중 다수는 유리한 심혈관 작용을 갖는다(참조: 이하 단락 및 표 3).
증가된 IGFI의 효과. 증가된 혈청 IGFI는 혈청 인슐린 레벨을 저하시키고, 인슐린 감수성을 높이고, 지질 프로파일을 개선시킨다24. 그러나, IGFI 단백질의 주입은 저혈압 및 저혈당을 유발할 수 있다25. 인슐린 활성에 대항하는 GH는 혈청 글루코스 레벨을 증가시킨다. 심장에 글루코스 흡수를 증가시키는 IGFI의 능력은 IGFI 투여 후의 LV 기능의 허혈 후 회복에 있어서 중요한 역할을 할 수 있다. IGFI는 근혈류를 증가시키고, 수용체 의존성 및 비의존성 효과 및 일산화탄소 생산을 통해 혈관확장 활성을 갖는다26. 인간에서 고용량 정맥내 IGFI 주입의 조합된 대사 및 혈관확장 효과는 현기증과 홍조를 일으킬 수 있고 - 저용량은 심장 성능을 향상시키고, 혈압 또는 혈청 글루코스에 영향을 미치지 않고, 증상과 관련되지 않는다25 ,27.
IGFI 수용체 활성화는 유전자 발현의 조절, 근형성의 자극, 세포 주기 진행, 면역 조절 및 스테로이드 생성을 포함하는 다수의 세포 반응에 관여한다. 심장에서는, IGFI 및 IGFI 수용체/PI3K/Akt 시그날화 경로는 심장 근세포 기능, 성장 및 생존에 대해 유리한 효과를 갖는다. 또한, IGF는 혈관신생 효과를 나타내고28, 통상의 심장 수축 기능25 ,29,30 및 심부전27 ,29,30-33을 증가시키고, 세포사멸을 억제한다34 ,35,38. 이러한 특성은 IGFI가 CHF 치료에 매력적이도록 한다(표 3).
［표 3］
IGFI: 유리한 심혈관 효과
Figure pct00003

심장 질환 치료에 있어서 IGFI 단백질(표 3)
전임상 연구. 심장 질환 모델에게 재조합 인간 IGFI 또는 GH 단백질의 투여 효과가 연구되고 있다. IGFI는 분리된 랫트 심장 및 흰족제비 유두근에서 양성 변력성이고; GH는 동일 조직에서 변력 효과를 갖지 않는다29. IGFI의 유사한 변력 효과는 페이싱 유도된 심부전 개의 분리된 유두근에서 발견되었다30. 4주 동안 정상 랫트에게 투여된 IGFI는 심장 기능을 증가시키고, 동심원상 LV 비대를 유도했다31. 2주 동안 함께 투여된 IGFI 및 GH는 정상 랫트에서 증가된 LV dP/dt 및 LV 비대와 관련되었다3 6. 랫트에서 심근허혈 및 재관류 전에 IGFI의 투여는 크레아틴 키나제 방출을 저하시키고, 세포사멸을 감소시켰다34. MI 후 4주 동안 투여된 조합된 IGFI 및 GH32 또는 IGFI 단독33은 랫트에서 LV 기능을 증가시켰다. MI 후 4주 동안 랫트에게 투여된 GH는 LV 수축 기능을 증가시키고37, 심장 섬유증, 심근 세포사멸을 감소시키고, 생존률을 증가시킨다38. 돼지에 있어서, CHF의 페이싱 모델에서, GH는 혈청 IGFI를 증가시키고, LV 기능을 증가시키고, LV 벽 응력을 감소시킨다39.
임상 연구. 거대한 플라세보-대조 연구의 부족이 존재하지만, GH 또는 IGFI 단백질의 임상 사용은 상당한 주목을 받았다. IGFI 주입의 급성 혈행동태 효과는 CHF 환자의 맹검 플라세보 조절된 크로스오버 연구에서 검토한다(n=8). IGFI의 4시간 주입은 심박출량을 증가시키고, 혈관 내성을 감소시키고, 우심방 및 ?지 압력을 감소시킨다27. IGFI 단백질의 만성 투여는 CHF 환자에서 평가되지 않는다. CHF 환자에게 GH 단백질의 사용은 불확실한 결과를 초래한다. 총 14명의 CHF 환자에서 2개의 작은 조절되지 않은 연구 및 비맹검 연구는 3개월 GH 단백질 요법이 혈청 IGFI, LV 기능 및 임상 증상을 증가시킨다고 보고한다40 ,41. CHF 환자에게 3개월 이하 동안 제공된 GH(단백질)의 랜덤화 플라세보 조절된 시험은 LV 기능 또는 임상 연구42 , 43를 변경하지 않았다. GH 단백질 요법의 가장 최근 문헌 검토는 허혈성 및 특발성 임상 CHF에서 유효성의 증거가 아마도 펩티드 투여 동태에 기인하여 부족하다고 결론을 짓는다44. 따라서, 대안적인 실시양태에서, 본 발명의 유전자 전이 방법은 지속된 IGFI 발현을 제공함으로써 IGFI 단백질 요법보다 우수할 수 있다.
증가된 심장 IGFI 또는 GH의 발현. 랫트에서 인간 IGFI의 심장-지시된 발현은 심근 IGFI 생산에서 이의 부수적인 증가와 함께, 혈청 IGFI 레벨을 거의 2배로 한다. 이러한 랫트들은 심근세포 비대와 함께 심장 무게를 증가시키지만, 심근세포 용적의 증가는 없다35 ,45. MI 후, 감소된 심근세포 세포사멸 및 증가된 Akt의 포스포릴화가 발견되었다35. IGFI의 심장 지시된 발현은 텔로머라제 활성, 텔로머 단축 및 DNA 손상의 감소와 함께 연령-관련 세포노화를 감쇠시킨다. 이러한 랫트는 연령 대 연령 일치된 이식유전자 음성 동배체의 22개월에 증가된 Akt 활성화 및 증가된 LV 기능을 나타낸다46. 심근증 배경(이종교배 패러다임)에서 심장 IGFI의 공-발현은 심장 세포사멸, LV 리모델링 및 LV 기능장해를 방지하는 것으로 나타난다47. 그러나, CHF가 결코 존재하지 않았기 때문에, 이 전략은 현재 제안의 중심적 테마인 접근법인 기존 CHF의 치료와 동등하지 않다.
GH 유전자 전이가 MI 후 LV 리모델링에 영향을 미치지는지를 결정하기 위해, 관상동맥 폐색시 랫트 심근에 아데노바이러스 인코딩 GH(Ad.GH)를 직접 주사했다48. 주사는 위태롭게 된 심근 및 생존 심근 사이의 경계 지대에서 수행했다. MI 및 유전자 전이 6주 후에, 유리한 효과는 경색 영역에서 LV 말단-확장기 치수, LV dP/dt 및 벽 두께에서 나타났다. 동일한 과학자들은 후속적으로 관상동맥 폐색 3주 후에 랫트의 경색 경계 영역에 주입된 Ad.GH이 주입 3주 후에 LV dP/dt를 증가시키고, LV 확장 및 벽 약화를 감소시킨다는 것을 밝혀냈다49. MI 동안 또는 MI 3주 후에 GH 유전자 전이는 LV 리모델링에 대한 유리한 효과를 갖는 것으로 나타났다.
아데노바이러스 인코딩 IGFI(Ad.IGFI)를 랫트에게 관상동맥 폐색 직전에 위태롭게 된 관류 상에 주입시킨 경우, 주로 감소된 세포사멸의 결과인 것으로 간주되는 효과인 경색 정도는 50% 감소되었다50. 본 연구는 MI 후 LV 리모델링에 대한 IGFI 유전자 전이 효과를 해결하지 않았다. IGFI의 아데노바이러스 매개된 유전자 전이는 시험관내에서 저산소 유도된 근 세포사멸을 감소시키는 것으로 나타났고, 또한 랫트 허혈 재관류 모델에서, 이식유전자가 지역적 파라크린 효과와 일치하여 허혈 영역의 단지 약 15%로 발현되었지만, 아데노바이러스 인코딩 IGFI의 사전 주사는 경색 크기를 약 50%(p<0.003) 감소시켰다. 세계적으로 심부전에서 IGFI를 발현하는 효과는 검토되지 않았다.
잠재적 IGFI 유해 효과
생존. GH/IGFI 시스템의 파괴는 정상 심장 기능을 갖는 랫트에서 수명을 감소시키지 않고 증가시키는 것으로 나타난다51. 그러나, 본 발명자들은 현저하게 증가된 단기 사망율을 예시하는 심각한 CHF의 환경에서 IGFI 발현을 증가시킬 것을 제안한다. 데이터는, IGF 억제가 CHF에서 수명을 증가시킨다는 것을 시사하지 않는다. 반대로, 인간에서 증가된 혈청 IGFI는 CHF 발생율 및 사망율을 감소시킨다52 ,53. 역학적 연구는 저혈청 IGFI를 갖는 인간들이 허혈성 심장 질환을 발병시킬 위험이 높다는 것을 나타내었다. 프라밍검 연구(Framingham study)에서, 혈청 IGFI에 대한 평균치 이상의 개체가 평균치 이하의 개체와 비교하여 50% 감소된 CHF 발생율을 가졌다52 ,53. 최근의 보고서는 CHF에서 수명을 연장하는 안지오텐신 전환 효소 억제제(ACEI)가 IGFI 시그날화를 증가시킨다는 것을 나타낸다54. 본 데이터는 IGFI 유전자 전이가 랫트 심부전 기능을 증가시킨다는 것을 나타내고, 본 발명자들은 생존 이익이 존재하는지를 결정할 것을 제안한다.
암. 임상역학적 연구는 혈청 IGFI 레벨의 증가(>2-배 향상) 및 전립선 및 폐경전 유방암의 상관관계를 보고하지만55, 이 상관관계가 원인이라는 징후는 없다. 전립선 암 발생율은 나이에 따라 증가하지만, 혈청 IGFI 농도가 감소한다는 것은 주목할 만하다55. 암 환자에서, 증가된 혈청 IGFI는 종양에서 유래할 수 있다. 실제로, 랫트의 전립선 상피내에서 IGFI의 발현 증가는 혈청 IGFI 농도를 상승시키고, 전립선 종양 형성을 유도할 수 있다56. 증가된 혈청 IGFI 농도는 또한 암 환자의 영양 증상의 변화에 기인할 수 있다. IGFI가 혈관형성 및 감소된 세포사멸을 통해 종양 성장을 증가시킬 수 있다고 추측할 수 있다. IGFIb의 심장-지시된 발현은, 부수적인 혈청 IGFI의 지속적 상승과 함께, 전립선암 또는 유방암과 관련되지 않고, 혈청 IGFI 및 GH의 조합된 증가는 말단 비대증 환자에서 전립선암, 유방암 또는 폐암 발생율을 증가시키지 않는다54. 암의 발생 및 진행에 있어서 IGFI의 역할은 이론적이다. IGFI 발현을 증가시키는 치료법은 IGFI의 혈청 농도를 제한해야 하고, 또한 경우에 따라 발현을 정지시킬 수단을 제공해야 하는 것이 현명한 것으로 간주된다. 본 발명자들은 혈청 중의 IGFI 농도를 증가시키고, 이에 의해 유리한 심혈관 작용을 갖는 조절된 발현 벡터의 유전자 전이를 사용하여 이러한 목적을 달성할 것을 제안한다.
연구의 신규성. 이러한 연구는 임상적 CHF를 위한 IGFI 유전자 전이의 개발에 초점을 맞춘다. IGFI(또는 GH) 유전자 전이는 임상적 CHF에 사용되지 않았다. CHF에서 GH/IGFI 단백질의 임의의 이중-맹검 플라세보-조절된 임상 시험도, 아마 유전자 전이에 의해 해결될 수 있는 문제인 GH/IGFI 단백질의 비교적 짧은 생물학적 반감기에 기인하여, 성공하지 못했다. 비록 GH 및 IGFI 심장 유전자 전이가 동물 연구에서 경색 크기를 감소시키기 위해 관상동맥 폐색 전에 사용되었지만, 어떠한 이전 연구도 CHF 자체를 위해 IGFI 유전자 전이를 시험하지 않았다. 또한, 장기간 전신 전달 및 조절된 발현 벡터를 사용하는 제안된 파라크린 접근법은 신규하고, 다양한 심혈관 질환을 치료하기 위한 기타 파라크린계 펩티드에 적용할 수 있다.
요약. 심각한 CHF의 치료에 있어서 펩티드 투여의 예측가능한 이점에 대한 전임상 및 임상 연구의 제한, 및 IGFI의 파라크린계 유전자 전이의 이론적인 구속 때문에, 본 발명자들은 연속적 또는 만성 간헐적 정맥내 펩티드 주입의 장해 및 결점을 회피하도록 설계된 본 발명자들의 실험실(참조: 예비 데이터)에서 연구를 착수했다.
기타 유익한 펩티드. IGFI의 사용이 강제적이지만, 본 발명의 파라크린 유전자 치료법이 또한 유익한 심혈관 작용을 갖는 임의의 순환성 펩티드에 적합하다는 것이 강조되어야 한다. 예를 들어, 유로코틴-2는 심장 및 맥관구조에서 견고하게 발현되는 코르티코트로핀-방출 인자 타입 2 수용체를 통해 작용하는 코르티코트로핀-방출 인자 계열 중에서 최근 발견된 혈관작동성 펩티드이다. 유로코틴-2 펩티드의 주입은 심부전을 갖는 동물 및 환자에 있어서 변화무쌍한 유익한 효과를 갖는다57. BNP는 유사한 방식으로 전달될 수 있는, 임상적 CHF 치료를 위한 또 다른 생물학적으로 유효한 펩티드이다. 추가로, 폐 고혈압에서, 프로스타사이클린 동족체는 폐 고혈압을 치료하는데 유효할 수 있지만, 전류제(에포프로스테놀 및 트레포스티닐)는 일정한 전신 주입을 필요로 하고, 치료 자체는 높은 유병률과 관련된다58. 대안적인 실시양태에서, 본 발명의 방법은 폐 고혈압의 파라크린-타입 유전자 치료법으로서 프로스타사이클린 신타제를 인코딩하는 조절된 발현 벡터를 제공한다. 실제로, 연장된 또는 만성의 간헐적 정맥내 주입을 필요로 하는 임의의 현재 펩티드 치료약은 그 자체를 이러한 호르몬-유사 유전자 전이 접근법에 제공한다.
임상 연구에서 AAV & 면역 반응. AAV 벡터의 근육내 또는 정맥내 전달후 장기간 이식유전자 발현은 법칙이 아니라 설치류에서 예외가 되고 있다. 그러나, 환자에서의 연구는 이식유전자 및 때때로 AAV 벡터 자체에 대한 면역 반응에 기인하여 제한된 발현에 의해 고민되어 왔다6. 2가지 결론이 이들 및 기타 연구에서 나온다. 1) 근육내(정맥내와 비교하여) AAV 전달은 일반적으로 이식유전자 및 AAV 캡시드에 대한 증가된 면역 반응을 유발하고; 2) 이들의 상대적 면역 관용에 기인하여, 설치류에서의 성공은 인간에서의 성공을 항상 예측하지 않는다. 설치류 및 돼지의 연구는 염두에 두고서 인간에서 설계될 수 있다.
인간 대상체에서 기존의 중화 항체와 연관되는 가능성이 가장 낮은 AAV 혈청형(AAV8 및 AAV9)이 선택될 수 있다59. 예를 들어, AAV8은 항-AAV 중화 항체의 최저 유병률과 연관되어 있다(AAV1의 경우 19% vs 59% 및 AAV2의 경우 50%). 더욱이, AAV8/9 항체를 갖는 소수의 인간 대상체 중에서, 이들 대상체의 75 내지 90%는 낮은 역가를 보유하여 AAV8 및 AAV9를 예상된 면역 반응에 대해 현재의 최적 선택으로 되게 한다59. 인간 혈청은 AAVrh.32.dd 등과 같은 레수스-유래 AAV 벡터에 대해 무혈청반응을 보유하고60, 이는, AAVrh.32.33을 갖는 임상전 및 임상 경험이 제한되더라도, AAV8 및 AAV9가 부적합함을 입증하는 경우에 대체 벡터를 제공한다.
AAV 벡터의 근육내 주사는, 이들이 거대 동물에서 면역 반응을 자극할 수 있기 때문에, 회피할 수 있다.
2개의 종-특이적 IGFI 단백질이 사용될 수 있다: 랫트 및 돼지. 랫트 및 돼지 둘 다의 IGFI가 사용될 수 있다. 종-특이적 IGFI의 사용은 이식유전자에 대한 면역 반응을 감소시킬 것이다. 임상 시험은 인간 IGFI를 인코딩하는 최적 벡터로 수행할 수 있다.
AAV8 및 AAV9의 정맥내 수송은, 이의 단순성 때문에 및 가능한 낮은 AAV 용량에서 치료 이식유전자의 최고 혈청 레벨을 달성할 가능성이 있기 때문에 매력적이다. 이들 AAV 벡터에 대한 혈청유병률은 돼지 및, 인간을 포함하는 영장류에서 중요하지만, 설치류에서 중요한 요인은 아니었다. 본 발명자들의 벤더로부터 돼지의 예비 샘플링은 시험된 9마리 돼지중 7마리에서 AAV8 및 AAV9 항체의 증거를 나타내지 않는다.
대안적인 실시양태에서, 본 발명의 이식유전자의 발현은, 예를 들어, 이러한 전략이 당해 이식유전자의 치료학적 혈청 레벨을 제공하는 경우, 단일 기관으로 제한된다. 예를 들어, 본 발명의 예시적 벡터는 간세포-특이적 프로모터(TBG, 인간 갑상선 호르몬-결합 글로불린)를 갖는 AAV8이다.
IGFI를 사용한 파라크린 기반 유전자 전이
본 발명자들은 이들 개념 실증 연구를 위해 IGFI를 선택했지만, 대안적인 실시양태에서 본 발명은 본원에 개력된 임의의 후보 유전자의 용도를 포함하고, 임의의 이들 유전자는 의도된 효과에 효과적일 것이다. 예를 들어, 본 발명은, 임의의 파라크린 폴리펩티드, 예를 들어, 포유류 강심성 펩티드, 세렐락신, 릴랙신-2, 유로코틴-2, 유로코틴-1, 유로코틴-3, 뇌 나트륨이뇨 펩티드, 프로스타사이클린 신타제, 성장 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자-1, 또는 이들의 임의의 조합; 또는 인간 유로코틴-2, 유로코틴-1, 유로코틴-3, 뇌 나트륨이뇨 펩티드, 프로스타사이클린 신타제, 성장 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자-11 또는 이들의 임의의 조합을 효과적으로 수송하는 방법 및 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 테트라사이클린 반응 요소(TRE)의 조절하에 있는 랫트 IGF1(타입 1)을 인코딩하는 예시적 AAV5 벡터를 조작했다: 도 1은 IGF1을 인코딩하는 AAV5를 포함하는 본 발명의 예시적 작제물을 나타내고; 이러한 예시적 AAV5 벡터는 IGFI의 조절된 발현을 제공한다: ITR, 역방향 말단 반복체, TRE, 테트라사이클린 반응 요소; IGFIAU1, 인슐린-유사 성장 인자-1; SVaP, SV40 바이러스 게놈(쌍방향)으로부터의 폴리A; rtTA2sM2, 역방향 테트라사이클린 조절된 전사활성화제; CMV, 인간 사이토메갈로바이러스 초기 유전자 프로모터. 전체 삽입 크기, 2823 bp가 scAAV5 벡터(용량 3.3kb)에 맞는다.
인코딩 서열은 IGFI의 세포외 분비를 보장하기 위해 시그날 펩티드를 포함한다. 본 발명자들은 배양된 심장 근세포에 유전자 전이 실험에서 이 벡터(AAV5.IGFI.tet)를 사용했다. 도 2A는 배양된 신생 랫트 심장 근세포를 AAV5.IGFI.tet(10,000 gc/세포, 2d)로 감염시킨 연구로부터의 데이터를 나타내고; 제시된 겔은 IGFI 발현이 독시사이클린(+Dox)(2㎍/ml, 3d)에 의해 유도되지만 독시사이클린(-Dox)의 부재하에 발생하지 않음을 나타낸다. IGFI는 면역블롯팅에 의해 항-AU1 항체에 의해 배지 중에서 검출되었다. 도 2B는 동일한 실험에서 심장 근세포를 Akt 용해 완충액(10분, 4℃)에 용해시키고 원심분리(12,000×g, 10분)한 데이터를 나타내고; 전체 Akt 및 포스포-Akt는 항-Akt 및 항-포스포-T308-Akt 항체 의해 검출되었다. IGFI 발현은 AKT 활성화와 연관되어 있다. 감염 후, 이식유전자 발현은 독시사이클린으로 활성화할 때까지(도 2A) 검출할 수 없었다("누출" 없음).
본 발명의 벡터(도 1)는 보다 최근의 rtTA 변이체(rtTA2s-M2)를 함유하고, 이는, 이전 rtTA 작제물과 달리, 견고한 dox-의존성 발현 및 낮거나 부재하는 기초 활성을 제공한다13.
배양된 심장 근세포에서 조절된 IGFI 발현
배양된 신생 랫트 심장 근세포는 AAV5.IGFI-tet로 유전자 전이를 수행했다(104gc/세포, 2일). 도 3에 그래프로 설명한 바와 같이, 후속적으로, 독시사이클린(2㎍/ml)을 배지에 첨가하고, IGFI mRNA 발현은 실시간 RT-PCR을 사용하여 정량화했다. IGFI mRNA의 발현은 30분 이내에 1.5배 증가했고(비자극된 것과 비교하여(vs)), 24시간까지 14배의 상승 피크에 도달했다. 48시간에서, IGFI mRNA는 다소 낮았고(10배), 이는 독시사이클린 분해를 반영한다. 분기점 IGFI 발현에 이르기까지, 독시사이클린은 4회의 순차 PBS 세척을 사용하여 제거했다("오프-세척", 도 3 참조). IGFI mRNA는 독시사이클린 중지후에 급속하게 감소했다.
AAV5 . IGFI . tet 의 골격근 전달은 심부전의 기능을 개선한다.
골격근 유전자 전이. 본 발명자들은 AAV5.IGFI.tet의 간접 관동맥내 전달 후에 쥐 심부전에서 초기에 연구를 수행하여(도 1), 심장-표적화 전달 후에 심부전의 기능에서 실질적 개선을 밝혀냈다. 그러나, 파라크린-기반 전이의 효율을 입증하기 위한 개념 입증 연구는 벡터의 골격근 전달을 필요로 할 것이다. 이들 중요한 연구를 위해, 본 발명자들은 랫트의 전경골근에서 AAV5.IGFI.tet의 근육내 전달을 사용했다5. AAV5는 골격근에서 IM 주사후에 이의 공지된 고도 발현 레벨 때문에 선택되었다. 모든 예에서, 본 발명자들은 배지에서 IGFI 발현(세포 배양 실험), 및 심장(쥐 CHF 모델) 및 혈청(IM 주사후 랫트 모델, IV 주사후 마우스)에서 장기간 IGFI 발현, 및 심부전의 기능에서 상응하는 개선을 밝혀냈다5.
랫트 연구에서, 본 발명자들은 먼저 도 4A에 제시된 바와 같이 장기간 이식유전자 발현을 제공하기 위해 AAV5.EGFP의 골격근 주사의 가능성을 검사했고: 이는 랫트에서 AAV5.EGFP 유전자 전이 3주 후에 단독 전경골근에서 EGFP 발현을 나타내는 현미경사진을 나타낸다. 동일한 동물로부터 대측 주사하지 않은 전경골근은 EGFP의 발현을 나타내지 않는다. 도 4B는 표 4이고, 이는 CHF에서 골격근 IGFI 발현의 효과를 측정하는 심초음파그래프로부터의 데이터를 요약한 것이다.
CHF 의 MI 모델 및 실험 프로토콜
MI는, 대규모 관벽성 경색 및 LV 기능의 심각한 장해를 생성하는, 근위 좌측 관동맥 폐색에 의해 랫트에서 유도했다. MI 1주 후, 손상된 LV 기능을 갖는 랫트는 전경골근에서 AAV5.IGFI.tet의 2×1012 게놈 카피(gc)를 제공했다. 4주 후(MI 5주 후), 35% 미만의 LV 방출율(EF)를 갖는 랫트를 2개 그룹으로 랜덤으로 할당하고; 하나의 그룹은 IGFI 발현(IGF-On; n=10)을 활성화하기 위해 음료수 중의 독시사이클릭을 제공했고, 다른 그룹은 독시사이클린(IGF-Off; n=9)을 제공하지 않았다. MI 10주 후(IGFI 발현의 활성화 5주 후), LV 크기 및 기능은 심초음파그래프 및 혈행동태 연구에 의해 평가했고; 도 5는 CHF에서 AAV5.IGFI.tet 골격근 유전자 전이를 위한 실험 프로토콜을 나타낸다.
결과. IGF-On 랫트는 증가된 LV 방출율(p=0.02) 및 감소된 LV 종기-수축 치수(p=0.03)를 나타냈다(표 4, 도 4B 참조). 추가로, 도부타민 주입 동안 압력 발달의 비율(LV +dP/dt)에 의해 평가한 LV 수축 기능은 IGFI 발현의 개시후에 증가했다(p=0.001)(표 5, 다음 페이지). 또한, 심박출량(p=0.007) 및 발작 작업(p=0.003)의 바람직한 변화가 관찰되었다(표 5). 혈청 IGFI는 이식유전자 활성화 5주 후에 증가했다(IGF-Off: 164±24ng/ml; IGF-On: 218±11ng/ml; p=0.008; n-9 각 그룹). 이들 데이터는 AAV5.IGFI.tet의 골격근 주사는 테트라사이클린-활성화된 발현을 가능하게 하고 혈청 IGFI 수준을 증가시키고 심부전의 기능을 개선하는 것을 나타낸다5. 대안적인 실시양태에서, 보다 낮은 면역원성 AAV 벡터가 사용될 수 있고, 이들은 근육내 주사보다는 정맥내 사용되어, 면역 반응의 자극을 회피할 수 있고, 2개의 조절된 발현 시스템을 시험할 수 있다.
［표 5］
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심장 세포사멸 및 섬유증(도 6)
도 6은 심장 세포사멸 및 섬유증에 대한 AAV5.IGFI-tet 유전자 전이의 효과를 나타낸다. 도 6A는, IGFI 발현의 활성화(IGF-On)이 감소된 심장 근세포 세포사멸(p<0.0001; 2방식 ANOVA)과 연관되었음을 나타내는, TUNEL 염색으로부터의 데이터를 그래프로 설명하고, 이는 원격 영역보다 경계에서 더욱 감소했다. 도 6B는, 감소된 심장 섬유증을 나타내는 IGF-Off 및 IGF-On 랫트로부터 비경색 심실 중격의 피크로시리우스 적색-염색된 절편을 나타내고, 콜라겐 분획 영역은 감소되었고(p=0.048); 도 6C는 IGF-Off 및 IGF-On 랫트로부터 이러한 데이터를 그래프로 설명한다.
AAV5.IGFI.tet의 정맥내 vs 근육내 전달. 예비 연구에서, 본 발명자들은 정맥내 유전자 전이가 순환 IGFI 레벨을 증가시킬 수 있는지를 측정했다. AAV5.IGFI.tet(마우스당 5×105, 꼬리 정맥)의 정맥내 전달 1주 후, 마우스를 2개 그룹 중의 하나에 랜덤으로 할당했다: 하나의 그룹은 IGFI 발현(IGF-On)을 활성화시키기 위해 음료수 중의 독시사이클린을 제공했고, 다른 그룹은 독시사이클린(IGF-Off)을 제공하지 않았다. 대부분의 순환 IGFI는 IGFI 결합 단백질(IGFPB)에 높은 친화성으로 결합하고 생물학적으로 불활성이기 때문에, 본 발명자들은 유리 혈청 IGFI를 측정했고, 생물활성 IGFI 형태는 IGFI 발현의 활성화 3개월 후에 IGF-Off 마우스보다 IGF-On 마우스에서 2배 높았다(도 7, 다음 페이지). 센션 2.2.1.2에 개략된 근육내 AAV5.IGFI.tet(랫트당 2×1012 gc) 유전자 전이 전략을 사용하여, 본 발명자들은 IGFI 발현의 활성화 5주 후에 IGF-Off 그룹보다 IGF-On 그룹에서 유리 혈청 IGFI의 1.3배 증가를 밝혀냈다(도 7). 이들 데이터는 AAV5.IGFI.tet의 정맥내 전달이 혈청 IGFI 농도에 대하여 근육내 전달보다 더욱 효과적임을 시사한다.
더욱이, 정맥내 전략은 면역 반응의 유발을 회피할 가능성이 있고, 이는 AAV의 근육내 전달 후에 관찰되었다6. 이들 실험은 본 발명자들의 연구를 위한 극히 중요한 데이터를 제공한다.
정맥내 전달: AAV5 vs AAV9
이어서, 본 발명자들은, 도 8에 제시된 바와 같이, 종점으로서 간 및 심장에서의 카피 수 및 이식유전자 발현을 사용하여 AAV5 vs AAV9의 정맥내 전달의 상대적 효과를 측정했다. 본 발명자들은 자가-상보성(sc) AAV 벡터를 사용하여, 조기 발현 vs 단일 사슬(ss) AAV 벡터를 가능하게 했다. 마우스는 정맥내 scAAV5.CMV.EGFP 또는 scAAV9.CMV.EGFP(5×1011 gc)를 제공했고, 21일 후에 살해했다. 두 벡터에서 공통 서열에 대해 지시된 PCR 프라이머를 사용하여 간 및 심장에서 AAV DNA 카피 수를 비교했다. 간에서, AAV9(vs AAV5)는 AAV DNA 카피 수 및 EGFP 발현 둘 다에서 3배 증가를 제공했고; 심장에서는 AAV DNA 카피의 5배 증가 및 EGFP 발현의 8배 증가가 관찰되었다. 이들 데이터는, 정맥내 AAV5와 비교하여, AAV9가 이식유전자의 보다 높은 혈청 레벨을 제공할 수 있음을 나타낸다.
방법
도 10은 본 발명의 예시적 벡터 및 벡터 설계를 나타낸다. 예비 연구 및 생물학적 특징으로부터 선택된 3개 벡터의 정맥내 전달을 사용하여, 광범위하게 분포 및 발현된 AAV8 및 AAV9(도 10A), 및 간-특이적 프로모터를 갖는 AAV8(도 10B)의 우열을 측정할 수 있다. 유효성에 대한 기준은 전달 6주(w) 후에 IGFI의 혈청 레벨일 수 있다. 최적 AAV 벡터를 사용하여 2개의 조절된 발현 벡터(Tet 및 Rap)를 생성하고, 이는 도 10C 내지 10F에 제시된 바와 같이 랫트에서 정맥내 전달 후에 비교할 수 있다. 유효성에 대한 기준은 IGFI의 혈청 레벨일 수 있고, 이때는 이식유전자 발현의 활성화 16주 후(전달 20주 후)에 검사했다.
도 10A 및 10B. 후속 연구를 위한 최고의 AAV 혈청형을 결정하기 위해 랫트에서 초기 연구를 위한 AAV 벡터. 이들 벡터는 CBA(AAV8 & AAV9) 또는 TBG(AAV8)에 의해 유도된 랫트 IGFI(비조절됨)를 인코딩하는다. 혈청 IGFI 레벨 및 발현 기간에 기반한 이들중 최고를 사용하여 후속 연구를 수행함으로써 최적 조절 시스템을 결정할 수 있다.
도 10C 내지 10F. 최적 조절된 발현 시스템을 측정하기 위해 랫트에서의 연구를 위한 후보 벡터. 초기 연구(상기)로부터 최고 AAV 벡터를 사용하여, 2개의 조절된 발현 벡터를 생성하고 시험했다: 테트라사이클린-조절을 갖는 하나의 벡터 및 라파마이신-조절을 갖는 다른 벡터. 이들 벡터는 RSV(AAV8 & AAV9) 또는 TBG(AAV8)에 의해 유도된 랫트 IGFI의 조절된 발현을 인코딩하는다. CBA 프로모터는 라파마이신-조절 벡터를 위해서는 너무 커서, RSV가 대신에 사용된다. 이들 2개의 조절 발현 시스템 중의 보다 양호한 것은 정상 돼지에서 후속 연구를 위한 최적 벡터의 생성을 위해 선택하고, 돼지 IGFI의 조절된 발현을 인코딩하는다. ITF, 역방향 말단 반복체; TRE, 테트라사이클린 반응 요소; IGFI, 인슐린-유사 성장 인자-1; SvpA, SV40 바이러스 게놈의 폴리A(쌍방향); rtTA2sM2, 역방향 테트라사이클린 조절된 전사활성화제; SV40en, 시미안 바이러스 40 인핸서; TBG Prom, 갑상선 호르몬-결합 글로불린 프로모터; RSV Prom, 라우스 육종 바이러스 프로모터; FRB-p6, FRAP의 일부, 전사 인자 NF-kB(p65)의 아단위와 조합된 라파마이신 상호작용 단백질; IRE, 내부 전사 재도입 부위; ZF, 아연 핑거 HD1 DNA 결합 도메인; FKBP, FK506 결합 단백질; pA, 최소 폴리아데닐화 세그먼트; ZBD, 아연 핑거 HD DNA 결합 도메인(8 카피).
본 발명자들은, 이러한 반응이 개, 돼지, 인간 및 기타 영장류에서 중요하지만, AAV에 대한 면역 반응이 랫트에서 중요한 역할을 담당하는 것을 예상하지 않는다. 면역 반응은 신중하게 평가되어야 한다. AAV 생물분포(예를 들어, 모든 벡터에서 공통 서열을 증폭시키는 프라이머를 사용한 qPCR 사용) 및 독성(예를 들어, 조직역학 분석 사용)을 정량화할 수 있다.
그룹 크기. 성공을 위한 주요한 기준은 IGFI의 혈청 레벨일 수 있고, 이는 20%의 변동 계수를 갖는다. 그룹 사이의 혈청 IGFI에서 30%의 차이를 검출하기 위해, 0.05의 α 오차 및 0.10의 β 오차의 추정은 n=10의 그룹 크기를 필요로 할 것이다.
실시예 3: 유로코틴 -2를 인코딩하는 AAV8 의 전달은 심장 기능을 증가시킨다.
본 실시예는 본 발명의 대체 양태에서 파라크린 이식유전자가 호르몬으로 작용하고 원위 부위로부터 순환으로 방출된 후에 심장 효과를 갖는다는 것을 입증한다. 이러한 예시적 접근법은 고수율 심장 유전자 전이를 달성하는 문제를 회피할 수 있고, 병원 방문 동안 전시 주사에 의해 환자를 치료할 수 있게 한다. 추가로, 이러한 예시적 접근법은 치료학적 펩티드의 정맥내(IV) 전달에 대한 요구를 배제할 수 있고, 이에 의해 반복된 및 장기간 입원, 높은 유병률 및 막대한 경제적 비용을 회피할 수 있다. 대안적인 실시양태에서, 이들 목표를 달성하는 가장 적합한 벡터는 아데노-연관 바이러스 타입 8(AAV8)이고, 이는 설치류, 돼지 및 영장류에서 정맥내 전달 후에 장기간 및 광범위한 발현을 제공한다.
대체 방법의 실시양태에서, 유로코틴-2, 최근 발견된 코르티코트로핀 방출 인자 계열 혈관작용 펩티드는 치료학적 이식유전자로서 사용된다. 유로코틴-2는 코르티코트로핀-방출 인자 타입 2 수용체를 통해 작용하고, 이는 심장 및 혈관에서 확실하게 발현된다. 울혈성 심부전을 갖는 동물 및 환자에서의 연구는 하중과 독립적인 증가된 수축 기능을 포함하는 유로코틴-2 펩티드 주입의 바람직한 혈행동태 효과를 나타내고, 이는 직접 심장 효과를 나타낸다. 본 발명자들은 닭 β-액틴 프로모터를 사용한 AAV8의 정맥내 전달이 UCn2의 지속된 고도 혈청 레벨을 제공하고 마우스 심부전의 기능을 증가시키는 것을 확립했다.
본 발명의 이러한 국면을 실시하기 위한 최선의 구체적 실시양태를 선택하기 위해, 마우스 및 돼지에서의 연구를 수행할 수 있다: 예를 들면, a) 조절된 이식유전자 발현을 측정하여 혈장 이식유전자 레벨의 미세 조정을 가능하게 하고 필요에 따라 발현의 개시 및 중단을 가능하게 하기 위해 및 b) 당해 기술분야에서 허용되는 동물 모델, CHF의 마우스 모델에서 이러한 예시적 파라크린-기반 접근법을 사용하여 유로코틴-2 유전자 전이의 안전성, 효능 및 작용 메카니즘을 측정하기 위해. 또한, 정상 돼지의 사용을 결정할 수 있다: a) 혈청 UCn2를 증가시키는데 필요한 최소 유효 벡터 용량; b) 벡터 및 이식유전자의 생물분포; 및 c) 독성.
IV 펩티드 주입에 대한 본 발명의 파라크린 유전자 전이 방법의 잠재적 잇점은 표 1에 제시되어 있다(상기). 대안적인 실시양태에서, 본 발명의 방법의 실시는 감염의 회피를 가능하게 하고, 반복된 및 연장된 입원을 감소시켜 비용을 감소시킨다. 대안적인 실시양태에서, 전신 벡터 전달은 임의의 제공된 AAV 용량에 대한 최고 발현 레벨을 제공함으로써 파라크린 유전자 전이의 잇점이다. 이러한 접근법의 잠재적 안전성 및 유효성은 혈우병 B를 갖는 환자에서 초기 유전자 치료 임상 시험으로 최근 입증되었고2, 소정 연구는 유전자 치료에서 희망을 회복시켰다. 대안적인 실시양태에서, 본 발명의 파라크린 유전자 전이 방법은 유리한 심혈관 효과와 함께 임의의 순환 펩티드에 적합할 수 있다.
대안적인 실시양태에서, AAV는 아데노바이러스보다 긴 이식유전자 발현을 가능하게 하고 레트로바이러스와 연관된 삽입 돌연변이유발을 회피하기 위해 사용된다. 영속적 이식유전자 발현은 AAV 벡터의 단일 주사 수년 후에 대형 동물에서 나타났다6 -10. 본 발명자들은 이를 마우스11 및 랫트에서 확인했다. 최근의 임상 시험은 일부 AAV 혈청형이 IM 주사 후에 면역 반응을 유발하는 것을 밝혀냈지만12 ,13, 보다 새로운 세대의 AAV 벡터(AAV5, 6, 8 및 9)는 영장류에서 유사한 문제를 갖지 않는다14. IV AAV 전달은 혈청 이식유전자 레벨에 대한 IM보다 우수하고, AAV9 및 AAV8은 AAV5보다 우수하다15(및 비공개된 데이터). 더욱이, 기존의 항-AAV8 항체는 AAV1 및 AAV2(50 내지 59%)를 포함하는 기타 AAV 혈청형만큼 인간(19%)에서 우세하지는 않다16. 도 11에 그래프로 설명된 본 발명자들의 데이터는 IV AAV8이 파라크린 접근법에 대한 지속 증가된 레벨의 혈청 UCn2를 달성하기 위한 최적 벡터 및 전달 경로임을 나타낸다. 도 11은 AAV9.CMV.UCn2(9.CMV), AAV9.CBA.UCn2(9.CBA) vs AAV8.CBA.UCn2(8.CBA)의 IV 전달로부터의 데이터를 나타내고; 당해 데이터는 모든 벡터가 혈청 UCn2 6w에서 이후의 실질적 증가와 연관되었음을 나타냈다. 바(bar) 내의 숫자는 각 그룹에 대한 샘플 크기를 나타내고, ANOVA로부터의 p 값. ITR, 역방향 말단 반복체; SVpA, SV40 바이러스 게놈으로부터의 폴리A; UCn2, 유로코틴-2; CBA, 닭 β-액틴 프로모터; CMV 인핸서, 인간 사이토메갈로바이러스 인핸서.
횡문근에서의 이의 견고성에도 불구하고, CMV 프로모터는 간에서 메틸화 및 불활성화에 감수성이고17, 본 발명자들의 데이터는 메틸화에 덜 감수성인 프로모터가 우수하다는 것을 나타낸다. 실제로, CMV는 IV 벡터 전달 후에 UCn2의 지속된 2배 증가를 제공했지만, 닭 β-액틴(CBA) 프로모터의 사용은 도 11에 제시된 바와 같이 혈청 UCn2에서 15.7배 증가를 제공했다. 간세포 특이적 갑상선 호르몬-결합 글로불린(TBG) 프로모터를 또한 사용할 수 있다.
대안적인 실시양태에서, 본 발명의 작제물 및 방법은 조절된 발현, 예를 들어, 발현의 차단을 가능하게 한다. AAV 유전자 전이에 의해 제공된 장기간 발현의 가능성 때문에, 발현을 차단하는 능력은 유해 효과가 발달하는 경우에 바람직하다. 조절된 발현은 또한 일정한 이식유전자 전달보다 단속적 전달의 가요성을 가능하게 한다. 대안적인 실시양태에서, 본 발명의 작제물 및 방법은, 예를 들어, 엑디손, 타목시펜, 테트라사이클린, 라파마이신 등의 조절된 발현 시스템을 사용한다18 -21. 엑디손 시스템의 크기는 2개 벡터 전략을 필요로 하고, 타목시펜은 독성을 갖는 문제를 나타낸다. 테트라사이클린 및 라파마이신 조절 시스템(표 2)은 거대 동물 모델에서 시험되었다9 ,10,22-26.
［표 2］
테트라사이클린 vs 라파마이신 조절
Figure pct00005

대안적인 실시양태에서, 본 발명의 작제물 및 방법은 tet-조절 시스템을 사용하고, 이는 광범위하게 연구되어 왔다27. 이전 rtTA 작제물과 달리, 본 발명의 rtTA 변이체(예: rtTA2s-M2)는 무기초 활성(즉, "누출" 없음")11 ,26,28,29,30 및 테트라사이클린에 대한 10배 높은 감수성(0.1㎍/ml에서 최대 이식유전자 발현 활성화)30과 함께 견고한 tet-의존성 발현을 제공한다. 10 내지 20mg의 독시사이클린의 단일 1일 용량은 인간 대상체에서 이식유전자 발현의 완전한 활성화에 충분할 수 있다26 ,31. 200mg/d의 용량은 여드름 및 만성 감염에 대해 경구 독시사이클린을 만성적으로 사용하는 환자에 의해 허용된다31 ,32. 테트라사이클린은 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP) 활성을 감쇠시킬 수 있고, MI 후의 최초 수일 내에 투여되는 경우에 LV 리모델링에 영향을 미칠 수 있다24. 본 발명자들은, 독시사이클린을 MI 5주 후에 제공되는 경우, 독시사이클린이 제안된 쥐 MI-유도된 CHF 모델에서 LV 리모델링, TIMP 또는 MMP 발현에 영향을 미치지 않음을 이미 밝혀냈다25. 임상 현장에서, 테트라사이클린은 MI의 급성기에 사용되지 않을 것이다.
rtTA 시스템의 구성요소에 대한 면역 반응, 잠재적 문제는, 테트라사이클린-의존성 이식유전자 발현을 당해 연구 동안 2.5년 동안 지속하는 경우, 비-인간 영장류9에서 AAV4.tet 및 AAV5.tet 유전자 전이(망막)의 연구에서 동정되지 않았다. 본 발명자들은 높은 레벨의 rtTA을 발현하는 마우스 심장25 ,28,29에서 또는 rtTA2s-M2 조절 요소를 사용한 IGFI의 AAV5-매개된 조절된 발현 후의 마우스11에서 염증을 제시하지 않는다. 비인간 영장류에서 AAV.tet의 IM 전달은, 망막내 또는 혈관 전달과는 달리, 전사활성화제 융합 단백질의 박테리아 및 바이러스 성분에 대한 면역 반응 때문에 조절된 발현의 감쇠를 유도한다33. 박테리아 또는 바이러스 단백질을 보유하지 않고 면역 반응의 도발과 연관이 없는 tet-조절제 및 라파마이신-조절 시스템에 대한 면역 반응을 동시에 시험할 수 있다10. tet- 및 라파마이신 조절의 강도 및 제한에 대한 표 2 참조.
라파마이신 조절 시스템에서, 이식유전자 발현은 라파마이신 또는 라파마이신 동족체의 나노몰 농도에 의해 유발되고, 이는 용량-의존성이고 가역적이다21. 라파마이신을 임상적으로 사용하여, 면역 반응을 억제하고, 마우스에서 노화의 유해 효과를 미연에 방지하고23, 라파마이신(mTOR) 시그날화 경로의 포유동물 표적을 차단함으로써 교아종 다형태를 억제한다35. 이식유전자 발현을 라파마이신만큼 효과적으로 활성화시키는 경구 라파마이신 동족체 AP22594는 최소 면역 억제를 나타내고, mROR을 억제하지 않는다10 ,35-37. 돼지는, 경구 투여된 AP22594의 용량-반응 관계, 및 마카크에서 효과적으로 사용된 용량과 유사한 경구 용량(0.45 mg/kg, 1주 1회)으로 개시하는 이의 필요 투약 간격을 결정하기 위해 사용된다10.
대안적인 실시양태에서, 본 발명의 작제물 및 방법은 UCn1, UCn2 및 UCn3(38-40 아미노산(aa))를 포함하는 유로코틴-2를 생체내에서 발현하고, 이는 코르티코트로핀-방출 인자(CRF) 부류에 속한다. 이들 펩티드는 코르티코트로핀-방출 인자 수용체 1 및 2(CRF1, CRF2)를 자극할 수 있다. UCn1은 CRFR1 및 CRFR2에 결합하지만, UCn2 및 UCn3은 독점적으로 CRFR2에 결합하고38 -41, 이는 심근세포, 혈관계, 소화관, 뇌 및 골격근에서 발현된다42 ,43,44. UCn1은 LPS-유도된 염증에서 발견되고 조직 투과성에 연루되지만45 ,46, 다양한 UCn2의 효과는 CRFR2에 대한 이의 친화성에 부분적으로 기인하여 바람직한 생물학적 효과와 연관되었다. UCn2의 효과는 완전히 cAMP-의존성은 아니다. 예를 들어, UCn2 결합 후에 CRFR2 탈감작은 β-아레스틴의 전좌에 의해 PI3K/Akt 시그날화를 유도한다. 또한, 증가된 ERK1/2 시그날화는 G 단백질 β 및 γ 아단위의 해리를 통해 발생한다47 ,48. 이들 cAMP-의존성 사상은 감소된 심장 근세포 세포사멸에 기여한다. 임상전 및 임상 CHF에서 UCn2의 펩티드 주입은 LV 기능에 대한 바람직한 효과 및 교감신경부신 축의 감소된 활성화를 나타냈다49 -51.
하기 표 3에 수록된 바와 같이, 다수의 유리한 효과 중에서, 본 발명의 방법 및 조성물을 사용한 UCn2 주입은 직접 심장 효과를 나타내는 하중 조건과 독립적인 수축 기능을 증가시킬 수 있다52. 근육수축(inotropic) 효과를 위한 메카니즘은 정의되지 않았다. 최근의 연구는 Ca2 + 취급53, 작용 전위 기간54, 허혈성-재관류 상해55-57, 및 레닌-알도스테론 시스템49에 대한 유리한 효과를 시사한다. UCn2 주입의 안전성 및 유효성은 DHF의 거대 동물 모델58 ,59에서 및 CHF를 갖는 정상 인간 대상체 및 환자50 ,51에서 확인되었다. 최근의 사설은 클라스 3 및 4 CHF에서 이의 사용을 촉진한다6 0.
［표 3］
유리한 심혈관 효과
Figure pct00006

UCn2의 혈장 반감기는 15분이기 때문에51, 만성 주입이 요구된다. 대조적으로, 대안적인 실시양태에서, 본 발명의 크라크린-기반 UCn2 유전자 전이는 상기 표 1에서 서술된 바와 같이 만성 펩티드 주입과 연관된 장애를 회피할 수 있다. 제안된 2개 종에서 종-특이적 UCn2만을 발현시킴으로써, 이식유전자에 대한 면역 반응이 폐지될 수 있다.
파라크린-기반 유전자 전이의 개념 입증. 본 발명자들은 인슐린-유사 성장 인자-1(AAV5.IGFI)를 인코딩하는 AAV5의 IM 주사에 의한 파라크린 유전자 전이가 랫트 부전의 기능을 개선시키는 것을 증명했다11. 본 발명자들은 또한 UCn2를 인코딩하는 AAV8의 IV 수송이 혈청 UCn2의 지속된 높은 레벨을 제공할 뿐만 아니라(>15배 증가), 정상 및 심부전의 기능을 증가시킴을 밝혀냈다.
AAV 벡터 및 프로모터의 선택. IV AAV8 또는 AAV9는 다른 AAV 혈청형보다 높은 레벨의 이식유전자 발현을 제공할 수 있고, 일반적으로 가장 견고한 CMV 또는 CBA 프로모터가 최적일 수 있음이 이전 공개된 연구로부터 명백하다. 따라서, 본 발명자들은, 벡터가 도 11에 제시된 바와 같이 혈청 UCn2를 가장 효과적으로 증가시킬 수 있음을 측정하기 위해 CMV 또는 CBA에 의해 유도된 쥐 UCn2를 인코딩하는 AAV8 및 2개의 AAV9 벡터를 조작했다. 상업적으로 입수가능한 UCn2-특이적 ELISA를 사용했다. AAV9.CMV는 UCn2를 2.3배 상승시켰고, 이는, 다른 2개 벡터보다 낮지만, 치료학적 반응에 충분할 수 있다. 그러나, AAV8.CBA는 혈청 UCn2에서 15.7배 증가와 연관되었다(AAV8.CBA.UCn2: 109±7 ng/ml, n=9; 대조군: 7±1 ng/ml). 혈청 UCn2의 이러한 높은 레벨은 AAV8 용량의 저하를 가능하게 할 것이다. AAV9.CMV와 비교하여 AAV8.CBA 및 AAV9.CBA의 우수성은 CBA의 상대적 견고성 또는 간에서 메틸화 및 불활성화에 대한 CMV의 감수성을 반영할 수 있다17. 따라서, 본 발명자들은 추가의 연구를 위해 AAV8.CBA를 선택했다.
정맥내 전달 후에 AAV8 . CBA . UCn2 분포 및 발현. 대안적인 실시양태에서, 본 발명의 작제물 및 방법은 파라크린-기반 유전자 전이 전략 UCn2에 의해 생체내에서 발현하고, UCn2의 혈청 레벨을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 대안적인 실시양태는 UCn2 발현이 심장 자체에 존재하는 것을 필요로 하지 않는데, 이는 순환 UCn2의 효과, 및 이식유전자의 치료 효과를 제공하는 심장 및 혈관에 대한 이의 효과, 심장 근세포 자체에서 UCn2 발현을 필요로 하지 않는 효과이기 때문이다.
UCn2 의 간 발현. AAV8.CBA.UCn2(5×1011 gc; 도 11 참조)의 IV 전달 6주 후에 기록한 혈청 UCn2에서 15.7배 증가는 도 12에 제시된 바와 같이 간에서 UCn2 mRNA 발현의 시간-의존성 증가와 연관되고, 전달 4 내지 6주 후에 안정증상을 유지했고, 이는 혈청 UCn2에서 안정한 상승과 상관되었다. 도 12A는 AAV8.CBA.UCn2(5×1011 gc, IV) 후의 간에서 UCn2 mRNA 발현의 시간 경과를 그래프로 설명한다. 간 UCn2 발현(각각의 바는 2개 마우스로부터 평균 값임)은 전달 4 내지 6주 후에 안정증상에 도달했고, 이는 혈청 UCn2로 관찰된 상정증상과 상관되었다(데이터는 제시하지 않음). 도 12B는 AAV8.CBA.UCn2(5×1011 gc, IV) 6주(w) 후에 LV에서 UCn2 mRNA 발현을 나타내는 데이터를 그래프로 설명한다. 유사한 높은 레벨의 UCn2 mRNA는 골격근 샘플에서 관찰되었다(데이터는 제시하지 않음).
UCn2 의 심장 발현. UCn2의 심장 발현이 본 발명의 파라크린-기반 유전자 치료의 유리한 효과에 요구되지 않지만, 본 발명자들은 AAV8.CBA.UCn2의 IV 전달 6주 후에 LV 샘플에서 UCn2 mRNA 발현의 실질적 증가를 기록했다(도 12B 참조). 대안적인 실시양태에서, 예를 들어, AAV8 DNA 및 UCn2 mRNA를 포함하는 AAV8을 포함하는 본 발명의 작제물은 골격근, 폐, 뇌, 신장, 비장, 소장, 골수를 포함하는 임의의 기관 또는 기타 기관에 전달되고/되거나 상기에서 발현될 수 있다.
정상 마우스에서 UCn2 유전자 전이. UCn2 유전자 전이가 LV 기능을 증가시켰는지를 측정하기 위해, 본 발명자들은 정상 마우스에서 정맥내(IV) 전달에 의해 AAV8.UCn2(5×1011 gc) 또는 염수(대조군)을 전달했다. UCn2 유전자 전이 5주 후에, 마우스는 압력 발생을 측정하기 위해 밀러 카테터(1.4F)가 LV 챔버에 배치된 침략적 절차를 수행했다. 데이터 수집 및 분석은 그룹 속성으로 블라인딩했다. UCn2 유전자 전이는 LV 수축 기능(LV +dP/dt)를 증가시켰고(도 13A, 좌측); -dP/dt는 또한 감소되었으며, 이는 향상된 LV 이완을 나타낸다(도 13B, 우측 패널). LV 질량, 조직학 또는 LV 구조 또는 기능에 대한 악영향은 검출되지 않았다. 도 3은 AAV8.CBA.UCn2의 IV 전달 6주 후에 정상 마우스(염수 주사된 대조군 마우스에 대하여)에서 LV 기능을 그래프로 설명한다. 도 3A: LV +dp/dt; 도 3B. LV -dP/dt. 값은 평균 ± SE를 나타낸다. 바 중의 수는 그룹 크기를 나타낸다. UCn2 유전자 전이는 수축 기능 및 심장 확장 둘 다를 증가시켰다.
CHF 를 갖는 마우스에서 UCn2 유전자 전이. 본 발명자들은 마우스에서 심각한 CHF를 유도하기 위해 근위 좌측 관상동맥 폐색, 본 발명자들이 광범위하게 사용하고 임상 허혈-기반 CHF의 양태를 모방하는 모델을 사용했다25. 프로토콜(도 12A)에 제시된 바와 같이, 관상동맥 폐색 3주 후에, 본 발명자들은 심각한 LV 기능 장애 및 심실 확장을 확인하기 위해 심장초음파를 수행했다. 이어서, 본 발명자들은 AAV8.CBA.UCn2(마우스당 5×1011 gc) 또는 동일 용적의 염수의 IV 수송을 제공하기 위해 등록자로 랜덤 할당했다. 랜덤화 5주 후에, 마우스는 반복 심장초음파 및 LV 압력 발생 및 쇠퇴 및 이들의 제1 유도체, LV +dP/dt의 측정을 수행했다. 데이터 및 분석은 그룹 속성으로 블라인딩했다. UCn2 유전자 전이의 시간에 존재하는 현저한 LV 기능 장애에도 불구하고, LV 면적 변화율(FAC%), 배출율 대용물은 증가했다(도 14B). UCn2 유전자 전이는 또한 LV 수축(LV +dP/dt) 및 확장(LV -dP/dt) 기능을 증가시켰다(도 14C). 피크 LV +dP/dt는 정상에 근접한 값으로 증가했고, 이는 제안된 전략이 CHF에 대한 신규 치료로서의 개발에 잇점이 있음을 확인한다. 도 14B 및 14C는 심부전에 대한 UCn2 전이의 효과를 나타내는 데이터를 제시하고; 도 14A: MI 및 CHF의 발생 3주 후에 마우스는 IV AAV8.UCn2 또는 염수를 제공했고; 유전자 전이 5주 후(MI 8주 후)에 LV 기능을 평가했고(블라인드 연구); 도 14B. UCn2 유전자 전이는 LV 면적 변화율(%FAC)를 증가시켰고; 도 14C. UCn2 유전자 전이는 LV 피크 +dP/dt 및 피크 -dP/dt를 증가시켰고, 이는 심부전의 수축 및 확장기 LV 기능의 현저한 잇점을 나타낸다.
UCn2 유전자 전이: 심장 Ca 2 + 취급에 대한 영향
C2.5.1. UCn2 유전자 전이는 SERCA2a의 발현을 변경시킨다. AAV8.CBA.UCn2 유전자 전이(5×1011 gc, IV)는 유전자 전이 4주 후에 마우스로부터 수득한 LV 샘플에서 SERCA2a mRNA 및 단백질의 증가된 발현과 연관되었다(도 15). 이들 변화는 근필라멘트에 대한 Ca2 + 이용성을 촉진하고 이에 의해 수축 및 확장 기능 둘 다를 증가시킬 것으로 예상할 수 있고, 이는 본 발명자들이 UCn2 유전자 전이 후에 정상 및 심부전에서 관찰했기 때문이며(도 13 및 14), UCn2 유전자 전이가 LV 기능을 증가시키는 타당한 메카니즘을 제공한다. UCn2 펩티드의 유사한 효과는 단리된 심장 근세포에서 기재되었다53.
도 15는, 정상 마우스가 AAV8.CBA.UCn2(5×1011 gc) 또는 염수(CON)의 IV 전달을 제공받은 데이터(도 15A, 그래프에 의해, 도 15B, 면역블롯팅에 의해)를 제시하고; 4주 후에 UCn2 유전자 전이 그룹으로부터 LV 샘플은 SERCA2a 단백질 발현의 2배 증가를 나타냈다. 면역블롯팅 시그날은 Tnl 함량으로 정규화했다. 바 중의 수는 그룹 크기를 나타낸다. SERCA2a 발현의 이들 변화는 근필라멘트에서 Ca2 + 이용성을 촉진시켜 LV 수축 및 확장 기능을 증가시키는 것으로 예상될 것이다.
UCn2 유전자 전이 및 Ca 2 + 트랜지언트. 심장 근세포(CM)는 AAV8.CBA.UCn2(5×1011 gc, IV) 4주 후의 마우스로부터 단리했다. IV 염수를 제공한 마우스는 대조군으로 사용했다. 측정 동안, UCn2 마우스로부터의 심장 근세포는 생체내에서 혈청 UCn2 레벨을 모방하기 위해 24 nM UCn2 펩티드와 함께 배양했다. UCn2 유전자 전이를 제공한 마우스로부터의 심장 근세포는 도 16(UCn2 유전자 전이 후의 Ca2 + 트랜지언트)에 제시된 바와 같이 감소된 t1/2를 갖는 변경된 Ca2 + 트랜지언트를 나타냈고: 도 16A는 UCn2 유전자 전이가 Ca2 + 감소의 비율을 감소시켰음을 그래프로 설명하고; 도 16B는 시간 대 Ca2 + 일시적 감쇠가 4주전에 UCN2 유전자 전이를 제공한 마우스로부터 심장 근세포에서 단축되었음을 그래프로 설명한다. 실험은 3호 반복했다. 바는 평균±SE를 나타내고; 바 중의 수는 심장 근세포의 수를 나타내고; 바 위의 수는 p 값을 나타낸다.
UCn2 는 심장보호성이다. 저산소 손상에 대한 UCn2의 효과를 시험하기 위해, 본 발명자들은 배양된 신생 랫트 심장 근세포를 나트륨 아지드(NaN3)로 처리했고, 이는 사이토크롬 옥시다제 중의 헤메 보조인자와 비가역적으로 결합하고 미토콘드리아 호흡을 억제하여, 저산소증-유도된 세포독성을 모방한다. UCn2 처리는 도 17에 제시된 바와 같이 형태학적으로 반영된 손상으로부터 감소된 LDH 방출에 의해 심장 근세포를 보호했다. UCn2는 또한 저산소증-재산소화 손상으로부터 단리된 심장 근세포를 보호한다(p<0.001; 데이터는 도시하지 않음). 도 17은 UCn2가 저산소성 손상으로부터 배양된 신생 랫트 심장 근세포를 보호하는 것을 나타내고; 도 17A는 UCn2(60 nM)이 NaN3(10mM) 처리 24시간 후에 형태학적 정상을 보존하고; 도 17B는 UCn2가 NaN3 처리 후에 LDH 방출을 감소시켰음을 그래프로 설명한다(p<0.001).
CREB 및 β- 카테닌에 대한 효과. LV 샘플은 AAV8.CBA.UCn2(5×1011 gc, IV) 4주 후에 마우스로부터 수득했다. IV 염수를 제공한 마우스는 대조군으로 사용했다. UCn2 유전자 전이를 제공한 마우스로부터의 LV 샘플은 CREB의 증가된 포스포릴화를 나타냈다(3배 증가, p<0.01, 도 18A). CREB는 심장에서 CRE-매개된 유전자 발현을 가능하게 하는 전사 인자이다. 또한, UCn2 유전자 전이는 LV β-카테닌 포스포릴화의 2배 증가와 연관되었다(p<0.0001, 도 18B). 증가된 β-카테닌 포스포릴화는 심장 근세포의 개재된 디스크에서 β-카테닌 축적을 감소시키고, 이에 의해 심장 강성 및 확장 기능 장애를 감소시킨다. 이는 UCn2 유전자 전이가 정상 및 심부전에서 LV 이완을 증가시키는 본 발명자들의 관찰에 기여할 수 있다. 도 18은 CREB(도 18A) 및 β-카테닌(도 18B) 둘 다의 포스포릴화가 UCn2.CBA.UCn2의 IV 전달 4주 후에 LV 샘플에서 검출되었음을 그래프로 설명한다. 대조군 마우스는 IV 염수를 제공했다.
UCn2 유전자 전이의 비-심장 효과. AAV8.CBA.UCn2(5×1011 gc)의 IV 전달은 글루코스 대사-항-당뇨병 효과에 대한 바람직한 효과를 갖는다. 예를 들어, UCn2 유전자 전이를 제공한 마우스는 고지방 식이(HFD), 임상전 연구에 사용된 타입 2 당뇨병의 모델에 의해 유도된 고혈당에 내성이 있다(도 19A). 감소된 글루코스 레벨은 HFD-제공 마우스의 글루코스 내성 시험에서 관찰된 바와 같이 증가된 글루코스 이용에 기인한다(도 19B). 도 19는 UCn2가 글루코스 조절에 영향을 미침을 나타내는 데이터를 제시한다. 마우스는 AAV8.CBA.UCn2(5×1011 gc, n=8) 또는 염수(n=8), 및 3주 동안의 표준식을 제공했다. 공복 혈당의 약간의 감소는 UCn2 그룹에서 관찰되었다. 이어서, 마우스는 8주 동안 고지방 식이(HFD)를 제공했다. 고혈당증은 예상된 바와 같이 대조군에서 관찰되었지만, UCn2 마우스는 정상 혈당 레벨을 유지했다. 도 19B. 마우스는 AAV8.CBA.UCn2(5×1011 gc, n=8) 또는 염수(n=8) 및 2개월 동안의 HFD의 IV 전달을 제공했고, 글루코스 내성 시험을 수행했다. 절식 마우스는 글루코스(2 mg/체중 g, IP)를 제공했고, 글루코스 레벨을 측정했다. 결과는 UCn2 유전자 전이가 글루코스 이용을 촉진시키고 식이-유도된 고혈당증으로부터 보호하는 것을 나타낸다.
도 20은 본 발명의 예시적 작제물을 제시한다: 약어: ITR, 역방향 말단 반복체; TRE, 테트라사이클린 반응 요소; SVpA, SV40 바이러스 게놈(쌍방향)으로부터의 폴리A; rtTA2SM2, 역방향 테트라사이클린 조절된 전사활성화제; SV40en, 시미안 바이러스 40 인핸서; TBG Prom, 갑상선 호르몬-결합 글로불린 프로모터; RSV Prom, 라우스 육종 바이러스 프로모터; FRB-p6, FRAP의 일부, 전사 인자 NF-kB(p65)의 아단위와 조합된 라파마이신 상호작용 단백질; IRE, 내부 전사 재도입 부위; ZF, 아연 핑거 HD1 DNA 결합 도메인; FKBP, FK506 결합 단백질; pA, 최소 폴리아데닐화 세그먼트; ZBD, 아연 핑거 HD DNA 결합 도메인(8 카피).
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본 발명의 다수의 실시양태가 기술되었다. 그럼에도 불구하고, 다양한 변형이 본 발명의 취지 및 범위로부터 벗어나지 않고 수행될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 기타 실시양태는 다음 특허청구범위의 범위내이다.

Claims (18)

  1. 생체내에서 증가되거나 지속적인 펩티드 또는 파라크린 폴리펩티드 레벨에 반응성인 질병, 감염 또는 증상의 개체 또는 환자를 치료, 개선 또는 보호 (예방)하는 방법에 있어서,
    (a) (i) 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 파라크린 폴리펩티드-인코딩 핵산 또는 유전자; 또는 그 안에 파라크린-인코딩 핵산 또는 유전자, 또는 파라크린 폴리펩티드-발현 핵산, 전사물 또는 메시지를 함유하며, 또한 세포에서 또는 생체내에서 파라크린-인코딩 핵산, 유전자, 전사물 또는 메시지를 발현할 수 있는 발현 비히클, 벡터, 재조합 바이러스 또는 균등물을 제공하는 단계; 및
    (ii) 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 파라크린 폴리펩티드-인코딩 핵산, 유전자, 전사물 또는 메시지, 또는 발현 비히클, 벡터, 재조합 바이러스 또는 균등물을 이를 필요로 하는 세포 또는 개체 또는 환자에게 투여 또는 전달함으로써, 증가되거나 지속적인 파라크린 폴리펩티드 레벨에 반응성인 질병, 감염 또는 증상의 상기 개체 또는 환자를 치료, 개선 또는 보호(예방)하는 단계를 포함하는 방법;
    (b) 상기 방법 (a)에서, 상기 발현 비히클, 벡터, 재조합 바이러스 또는 균등물이 아데노-연관된 바이러스(AAV), 렌티바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터; AAV 혈청형 AAV5, AAV6, AAV8 또는 AAV9; 레수스(rhesus)-유래 AAV, 또는 레수스-유래 AAV AAVrh.10hCLN2; AAV 캡시드 돌연변이체 또는 AAV 하이브리드 혈청형; 장기-친화성 (organ-tropic) AAV, 또는 심장친화성(cardiotropic) AAV, 또는 심장친화성 AAVM41 돌연변이체이거나, 이들을 포함하고, 여기에서, 임의로 상기 AAV는 야생형(wt) AAV에 대해서 비-허용적인 특이적 세포 타입을 표적화하는 효율을 증가시키고 및/또는 목적한 세포 타입만을 감염시키는 효능을 개선시키도록 조작되며,
    임의로, 상기 하이브리드 AAV는 1) 캡시드전환(transcapsidation), 2) 캡시드 표면에 이중-특이성 항체의 흡착, 3) 모자익 캡시드의 조작 및/또는 4) 키메릭 캡시드의 조작을 포함하는 하나 또는 그 이상의 변형에 의해서 하이브리드 혈청형으로서 재표적화되거나 조작되는 방법;
    (c) 상기 방법 (a)에서, 상기 파라크린-인코딩 핵산, 유전자, 전사물 또는 메시지가 조절된 또는 유도성 전사 조절 서열에 작동적으로 연결되는 방법;
    (d) 상기 방법 (c)에서, 상기 조절된 또는 유도성 전사 조절 서열이 조절된 또는 유도성 프로모터이며, 여기에서, 임의로 전사 및/또는 번역의 양성(활성화제) 및/또는 음성(억제제) 조절인자 (modulator)가 파라크린 폴리펩티드-인코딩 핵산, 유전자, 전사물 또는 메시지에 작동적으로 연결되는 방법;
    (e) 상기 방법 (a) 내지 (d) 중 어느 하나에서, 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 파라크린 폴리펩티드-인코딩 핵산, 유전자, 전사물 또는 메시지, 또는 발현 비히클, 벡터, 재조합 바이러스 또는 균등물을 이를 필요로 하는 개체 또는 환자에게 투여하면 파라크린 단백질의 혈류 또는 일반 순환 내로의 방출 또는 세포 내에서 파라크린 단백질의 증가되거나 지속적인 발현을 제공하며,
    여기에서, 임의로 상기 파라크린 단백질의 방출 또는 증가되거나 지속적인 발현은 파라크린 폴리펩티드-인코딩 핵산, 유전자, 전사물 또는 메시지에 작동적으로 연결된 유도성 프로모터의 활성화, 또는 억제제의 탈-억제에 의존하는 방법; 또는
    (f) 상기 단계 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에서, 상기 생체내의 증가된 파라크린 폴리펩티드 레벨에 반응성인 질병, 감염 또는 증상이 심장 수축성 기능 장애; 울혈성 심부전(CHF); 심장 섬유증; 심장 근세포 질환, 기능 장애 또는 세포사멸 (apoptosis); 폐고혈압; 심장, 피부, 간, 폐, 근육, 신경, 뇌 또는 신장 질환, 암 또는 기능 장애; 암 또는 종양 형성; 또는 혈우병 또는 혈우병 B인 방법을 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 파라크린-인코딩 핵산 또는 유전자; 또는 발현 비히클, 벡터, 재조합 바이러스 또는 균등물은 경구적으로, 근육내(IM) 주사로, 정맥내(IV) 주사로, 피하(SC) 또는 피내 주사로, 수막강내 주사로, 동맥내(IA) 주사로, 관상동맥내 주사로, 흡입으로, 에어로졸로 또는 바이오리스틱(biolistic) 입자 전달 시스템으로, 또는 "유전자 총(gene gun)", 공기 권총(air pistol) 또는 헬리오스(HELIOS™) 유전자 총(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)을 사용하여 이를 필요로 하는 개체 또는 환자에게 투여 또는 전달되거나;
    (b) 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 파라크린-인코딩 핵산 또는 유전자; 또는 발현 비히클, 벡터, 재조합 바이러스 또는 균등물은 인코딩된 단백질이 조직 내의 세포로부터 분비되어 혈류 내로 방출될 수 있도록, 혈류에 인접하거나 혈류에 의해서 배출되는 신체 내의 임의의 조직 또는 유체 공간 내로 도입시킴으로써 이를 필요로 하는 개체 또는 환자에게 투여 또는 전달되는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 파라크린 폴리펩티드 또는 펩티드가 포유류 강심성 펩티드, 성장 인자, 세렐락신(Serelaxin), 릴랙신(Relaxin)-2, 유로코틴(Urocortin)-2(UCn-2), 유로코틴-1(UCn-1), 유로코틴-3(UCn-3), 뇌 나트륨이뇨 펩티드(Brain Natriuretic Peptide), 프로스타사이클린 신타제(Prostacyclin Synthase), 성장 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자-1, 또는 이들의 임의의 조합; 또는 인간 강심성 펩티드, 인간 성장 인자, 세렐락신, 릴랙신-2, 유로코틴-2, 유로코틴-1, 유로코틴-3, 뇌 나트륨이뇨 펩티드, 프로스타사이클린 신타제, 성장 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자-11, 또는 이들의 임의의 조합이거나, 이들을 포함하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 파라크린 폴리펩티드가 유로코틴, 유로코틴-2, 유로코틴-1, 유로코틴-3, 릴랙신-2 또는 뇌 나트륨이뇨 펩티드이며, 상기 질병 또는 증상이 울혈성 심부전(CHF)이거나; 파라크린 폴리펩티드가 프로스타사이클린 신타제이고, 상기 질병 또는 증상이 폐고혈압인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서,
    (a) 개체, 환자 또는 대상체에게 파라크린-발현 핵산 또는 유전자의 발현을 유도하거나, 파라크린-발현 핵산 또는 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(예를 들어, 파라크린-발현 핵산 또는 유전자에 작동적으로 연결되어 있음)를 유도하거나 활성화시키는 자극 또는 시그날을 투여하거나;
    (b) 개체, 환자 또는 대상체에게 프로모터, 임의로 파라크린-발현 핵산 또는 유전자-특이적 프로모터(예를 들어, 파라크린-발현 핵산 또는 유전자에 작동적으로 연결되어 있음)의 활성화제의 합성을 유도하는 자극 또는 시그날을 투여하거나;
    (c) 개체, 환자 또는 대상체에게 파라크린-발현 핵산 또는 유전자, 또는 파라크린-발현 핵산 또는 유전자-특이적 프로모터의 천연 또는 합성 활성화제의 합성을 유도하는 자극 또는 시그날을 투여하며, 여기에서, 임의로 상기 천연 활성화제는 내인성 전사 인자이며;
    (d) 상기 단계 (c)에서, 상기 합성 활성화제는 내인성 또는 외인성 표적 유전자를 특이적으로 및 선택적으로 개시(turn on)시키도록 디자인된 아연-핑거 (zinc-finger) DNA 결합 단백질이며, 여기에서, 임의로 상기 내인성 표적은 유전자 파라크린-발현 핵산 또는 유전자, 또는 파라크린-발현 핵산 또는 유전자의 활성화제, 또는 파라크린-발현 핵산 또는 유전자에 작동적으로 연결된 프로모터의 활성화제이고;
    (e) 상기 단계 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에서, 상기 자극 또는 시그날은 생물학적, 광선, 화학적 또는 약제학적 자극 또는 시그날을 포함하고;
    (f) 개체, 환자 또는 대상체에게 파라크린-발현 핵산 또는 유전자의 전사-후 활성화제 또는 파라크린-발현 핵산 또는 유전자에 작동적으로 연결된 프로모터의 활성화제의 발현을 자극하거나 유도하는 자극 또는 시그날을 투여하거나;
    (g) 개체, 환자 또는 대상체에게 파라크린-발현 핵산 또는 유전자의 전사 억제제 또는 전사-후 억제제를 억제하거나 억제를 유도하는 자극 또는 시그날을 투여하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 파라크린-발현 핵산 또는 유전자의 발현을 유도하거나, 파라크린-발현 핵산 또는 유전자에 작동적으로 연결된 조절된 또는 유도성 프로모터의 발현을 유도하는 화학물질 또는 약물은 경구용 항생제, 독시사이클린 또는 라파마이신이거나; 독시사이클린을 사용하는 tet-조절 시스템이 파라크린-발현 핵산 또는 유전자 또는 그의 균등물의 발현을 유도하기 위해서 사용되는 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 파라크린-발현 핵산 또는 유전자 또는 발현 비히클, 벡터, 재조합 바이러스 또는 균등물이 액체, 겔, 하이드로겔, 분말 또는 수성 또는 염수 (saline) 제형으로서 제형화되는 방법.
  8. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 파라크린-발현 핵산 또는 유전자 또는 발현 비히클, 벡터, 재조합 바이러스 또는 균등물이 소포(vesicle), 리포좀, 나노입자 또는 나노지질(nanolipid) 입자(NLP)로서 제형화되는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 파라크린-발현 핵산 또는 유전자 또는 발현 비히클, 벡터, 재조합 바이러스 또는 균등물이 단리되거나 배양된 세포로서 제형화되며, 임의로 상기 세포가 포유류 세포, 심장 세포, 또는 인간 세포, 비-인간 영장류 세포, 원숭이 세포, 마우스 세포, 랫트 세포, 기니아 피그 세포, 토끼 세포, 햄스터 세포, 염소 세포, 소 세포, 말 세포, 양 세포, 개 세포 또는 고양이 세포인 방법.
  10. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 파라크린-발현 핵산 또는 유전자 또는 발현 비히클, 벡터, 재조합 바이러스 또는 균등물이 약제 또는 멸균제로서 제형화되는 방법.
  11. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 파라크린-발현 핵산 또는 유전자 또는 발현 비히클, 벡터, 재조합 바이러스 또는 균등물이 제조 생성물, 인공 장기 또는 이식물을 이용하여, 또는 이들 상에, 또는 이들과 함께 제형화 또는 전달되는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 파라크린-발현 핵산 또는 유전자 또는 발현 비히클, 벡터, 재조합 바이러스 또는 균등물이 시험관내 또는 생체외에서 파라크린 폴리펩티드를 발현하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 따르는 방법을 실시하는 것을 포함하여, 파라크린-반응성 병리학, 감염, 질병, 질환, 또는 증상의 개체 또는 환자를 치료, 개선 또는 보호(예방)하는 방법.
  14. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 따르는 방법을 실시하는 것을 포함하여, 심장 수축성 기능 장애; 울혈성 심부전(CHF); 심장 섬유증; 심장 근세포 질환, 기능 장애 또는 세포사멸; 폐고혈압; 심장, 피부, 간, 폐, 근육, 신경, 뇌 또는 신장 질환, 암 또는 기능 장애; 암 또는 종양 형성; 또는 혈우병 또는 혈우병 B를 치료, 개선 또는 보호(예방)하는 방법.
  15. (a) 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 따르는 방법을 실시하고, 여기에서, 파라크린 폴리펩티드 또는 펩티드는 유로코틴-2(UCn-2)를 포함하거나, 이것으로 구성되며;
    (b) 유로코틴-2(UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 유로코틴-2(UCn-2)를 인코딩하는 핵산, 유전자, 메시지 또는 전사물을 이를 필요로 하는 개체 또는 환자에게 투여하고, 여기에서, 상기 유로코틴-2 (UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드는 단리된, 재조합, 합성 및/또는 펩티드유사(peptidomimetic) 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 이들의 변이체이며, 이렇게 하여 상기 환자 또는 개체에서 당뇨병 또는 전-당뇨병 (pre-diabetes)을 치료, 개선 또는 보호(예방)하는 것을 포함하여, 환자 또는 개체에서 당뇨병 또는 전-당뇨병의 치료, 개선 또는 보호(예방) 방법.
  16. (a) 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 따르는 방법을 실시하고, 여기에서, 파라크린 폴리펩티드 또는 펩티드는 유로코틴-2 (UCn-2)를 포함하거나, 이것으로 구성되며;
    (b) 유로코틴-2 (UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 유로코틴-2(UCn-2)를 인코딩하는 핵산, 유전자, 메시지 또는 전사물을 이를 필요로 하는 개체 또는 환자에게 투여하고, 여기에서, 유로코틴-2(UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드는 단리된, 재조합, 합성 및/또는 펩티드유사 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 이들의 변이체이며, 이렇게 하여 환자 또는 개체에서 비만을 치료, 개선 또는 보호(예방)하는 것을 포함하는, 환자 또는 개체에서 비만의 치료, 개선 또는 보호(예방) 방법.
  17. (a) 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 따르는 방법을 실시하고, 여기에서, 파라크린 폴리펩티드 또는 펩티드는 유로코틴-2(UCn-2)를 포함하거나, 이것으로 구성되며;
    (b) 유로코틴-2(UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 유로코틴-2(UCn-2)를 인코딩하는 핵산, 유전자, 메시지 또는 전사물을 이를 필요로 하는 개체 또는 환자에게 투여하고, 여기에서, 임의로 유로코틴-2 (UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드는 단리된, 재조합, 합성 및/또는 펩티드유사 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 이들의 변이체이며, 이렇게 하여 환자 또는 개체에서 체중 증가를 억제하거나, 식욕을 억제하거나, 체중 감소를 자극하거나 개시시키는 것을 포함하여, 환자 또는 개체에서 체중 증가를 억제하거나, 식욕을 억제하거나, 체중 감소를 자극하거나 개시시키는 방법.
  18. 제15항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 유로코틴-2(UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드가 소포, 리포좀, 나노입자 또는 나노지질 입자(NLP)에 또는 이들로서 제형화되거나, 또는 경구 투여, 근육내(IM) 주사, 정맥내(IV) 주사, 피하(SC) 또는 피내 주사, 수막강내 주사, 동맥내(IA) 주사, 관상동맥내 주사, 흡입 또는 에어로졸에 의한 투여용으로서 제형화되는 방법.
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