KR20140108888A

KR20140108888A - 코보페놀 ａ를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물

Info

Publication number: KR20140108888A
Application number: KR1020130022736A
Authority: KR
Inventors: 김영수; 황방연; 한상배
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2013-03-04
Filing date: 2013-03-04
Publication date: 2014-09-15
Also published as: KR101481884B1

Abstract

본 발명은 코보페놀 A를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다. 본 발명의 코보페놀 A 화합물은 멜라닌세포에서 멜라닌의 생합성을 억제함으로써 피부 미백 활성을 나타낸다. 본 발명의 코보페놀 A 화합물은 천연물로부터 추출 분리된 것으로서 인체 부작용이 거의 없고 피부 미백 용도의 화장품 또는 의약으로 개발될 수 있다.

Description

코보페놀 Ａ를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물{Skin Whitening Composition Comprising Kobophenol A As Active Ingredient}

본 발명은 코보페놀 A를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.

멜라닌 색소는 멜라닌형성(melanogenesis)이라고 불리는 과정을 통해 멜라닌세포(melanocyte)의 멜라노좀(melanosome)에서 합성되고 상피의 각질형성세포(keratinocyte)로 분산됨으로써, 피부색을 형성하고 피부를 태양의 자외선광으로부터 보호한다[1]. 멜라닌 생합성에 대한 생화학적 경로는 티로시나아제(tyrosinase)가 촉매하는 2개의 특징적 반응인, L-티로신의 수산화반응과 3,4-디히드록시페닐알라닌(3,4-dihydroxyphenylalanine, dopa)의 산화반응을 통해 시작된다[2]. 생성된 도파퀴논(dopaquinone)은 멜라노좀에서 시스테인(cysteine) 또는 글루타티온(glutathione)과 같은 티올 물질과 쉽게 반응하여 황색/적색 피오멜라닌(pheomelanin)을 생성한다[3]. 티올 물질이 고갈되면, 과량의 도파퀴논은 자발적으로 도파크롬(dopachcrome)으로 변환되고 종국적으로 흑색/갈색 유멜라닌(eumelanin)을 형성한다[3]. 피부색이 멜라닌색소의 혼합에 의해 결정이 되지만, 티로시나아제는 피오멜라닌과 유멜라닌 모두의 생합성에 반드시 필요하다.

피부의 각질형성세포와 섬유아세포로부터 분비되는 파라크린 인자(paracrine factor)는 멜라노사이트에서 멜라닌의 생성에 영향을 미칠 수 있다. 이들 인자들중에서 α-MSH (α-melanocyte stimulating hormone)은 멜라노사이트상의 MC1R (melanocortin type 1 receptor)에 특이적으로 결합하여 아데닐레이트 사이클라아제(adenylate cyclase)를 활성화시킴으로써 cAMP의 세포내 농도를 증가시키고, 이로 인해 곧 티로시나아제(tyrosinase) 발현이 유도된다[4]. 따라서, 파라크린 인자들 간의 균형은 멜라노사이트 활성화의 세밀한 조절을 통해 피부의 색소화를 조정하는데 있어서 매우 중요한 역할을 한다. 그러나, 멜라닌 색소가 비정상적으로 축적되면, 기미(melasma), 주근깨(freckle), 노인성흑자(senile lentigen)과 같은 색소과다침작 질환이 발생하는데, 이러한 질환은 티로시나아제 활성을 억제하는 아르부틴(arbutin) 또는 히드로퀴논(hydroquinone)의 처리에 의해 개선될 수 있다[5].

골담초는 낙엽활엽관목 관화식물로 다간생장형 식물이다. 잎은 기수 1회 우상복엽으로 2쌍씩 붙어 있고 호생하며 엽축 끝은 대개 가시로 되고, 소엽은 4개로서 도란형 또는 타원형이며 두껍고 미요두 또는 원두이며 길이 1 - 3cm로서 표면은 진록색이고 광택이 나며 뒷면은 회록색에 털이 없다. 탁엽은 길이가 4 - 8 mm로 가시로 변한다. 꽃은 5월에 피고 단생하며 길이가 2.5 - 3 m로서 처음에는 황색으로 피어 후에 적황색으로 변하고 아래로 늘어져 핀다. 협과는 길이가 3 - 3.5 cm로서 원주형이고 털이 없으며 9월에 익지만 결실이 드물다. 뿌리는 잔뿌리가 길게 자란다. 한방에서는 골담초 뿌리를 말린 것을 골담초근이라고도 하며, 신체허약으로 인하여 미열이 나고 기침할 때, 백대하, 생리불순이 있을 때, 타박상, 관절염, 퉁통, 요통, 신경통, 고혈압 등에 사용한다. 약리작용으로는 혈압강하작용이 보고되었다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

[1] Slominski A, Tobin DJ, Shibahara S, Wortsman J. Melanin pigmentation in mammalian skin and its hormonal regulation. Physiol Rev 2004; 84; 1155-1228. [2] Hearing VJ, Tsukamoto K. Enzymatic control of pigmentation in mammals. FASEB J 1991; 5: 2902-2909. [3] Le Pape E, Wakamatsu K, Ito S, Wolber R, Hearing VJ. Regulation of eumelanin/pheomelanin synthesis and visible pigmentation in melanocytes by ligands of the melanocortin 1 receptor. Pigment Cell Melanoma Res 2008; 21: 477-486. [4] Busca R, Ballotti R. Cyclic AMP: a key messenger in the regulation of skin pigmentation. Pigment Cell Res 2000; 13: 60-69. [5] Solano F, Briganti S, Picardo M, Ghanem G. Hypopigmenting agents: an updated review on biological, chemical and clinical aspects. Pigment Cell Res 2006; 19: 550-571.

본 발명자들은 천연 식물로부터 멜라닌 생성 억제 작용을 통해 미백활성을 갖는 미백 물질을 발굴하기 위해 연구 노력한 결과, 골담초로부터 분리한 코보페놀 A가 α-MSH, forskolin 또는 IBMX 등으로 자극된 멜라닌 세포에서 멜라닌의 생성을 효과적으로 억제한다는 사실을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 코보페놀 A를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 코보페놀 A (kobophenol A)를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

본 발명의 피부 미백용 조성물의 유효성분은 상기 화학식 1로 표시되는 구조를 갖는 코보페놀 A 화합물이다. 본 발명의 코보페놀 A 화합물은 멜라닌세포에서 멜라닌의 생합성을 유의적으로 감소시켜 피부 미백활성을 갖는다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 코보페놀 A 화합물은 골담초(Caragana sinica) 추출물로부터 분리된 것이다. 다만, 본 발명에서 화학식 1로 표시되는 코보페놀 A 화합물은 식물의 추출물로부터 분리된 것 뿐만 아니라 화학적으로 합성된 화합물도 동등한 피부 미백 활성을 갖는다는 것은 당업자에게 자명하다.

본 발명에서 골담초 추출물은 천연물로부터 추출물을 추출하는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건 하에서 통상적인 용매를 사용하여 분리할 수 있다. 본 발명에서 골담초 추출물은 골담초 식물의 모든 부분으로부터 얻은 추출물을 의미하며, 바람직하게는 잎, 줄기 또는 뿌리의 추출물이며, 가장 바람직하게는 뿌리의 추출물이다.

본 발명에서 골담초 추출물을 추출하기 위한 추출 용매로는 추출공정에서 일반적으로 사용할 수 있는 용매를 사용할 수 있으며, 둘 이상의 서로 다른 용매를 순차적으로 사용하여 추출할 수도 있다. 바람직하게는, 본 발명의 추출용매는 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올), 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄(CH₂Cl₂), 클로로포름, 헥산(Hexane) 및 1,3-부틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용할 수 있다.

본 발명에서 골담초 추출물은 상기 용매에 의한 추출한 추출물을 추가적으로 더욱 정제하여 분리한 분획물도 포함하는 의미이다. 상기 추가적 분리는 바람직하게는 컬럼 크로마토그래피를 행하여 수행하며, 보다 바람직하게는 액체 컬럼 크로마토그래피를 이용한 크기배제(size-exclusion) 크로마토그래피, 이온교환(ion-exchange) 크로마토그래피, 분배 크로마토그래피, 친화(affinity) 크로마토그래피 또는 이들 크로마토그래피의 조합을 이용하여 분리 정제할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명 조성물에서 상기 코보페놀 A는 0.05 - 30 중량％의 함량으로 포함되며, 보다 바람직하게는 0.05 - 20 중량％의 함량, 보다 더 바람직하게는 0.05 - 10 중량％의 함량으로 포함된다.

본 발명의 피부 미백용 조성물은 화장품학적 조성물의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 화장품학적 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 로션, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림, 로션, 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품학적 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분과 담체 성분 이외에, 화장품학적 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 멜라닌 색소 과다침착 질환의 치료 또는 예방 용도의 약제학적 조성물의 형태로 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "멜라닌 색소의 과다침착(hyperpigmentation)"은 피부 또는 손발톱의 특정 부위에서 멜라닌의 과도한 증가에 의해 다른 부위에 비해 검게 또는 어둡게 되는 것을 의미한다. 상기 멜라닌 색소 과다침착 질환은 기미, 주근깨, 노인성 색소반, 또는 일광흑색증(solar lentigines) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 이러한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.0001-100 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우, 피부에 국소적으로 도포, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물이 멜라닌 색소 과다 침착 질환을 치료 또는 예방을 위해 적용되는 점을 감안하면, 피부에 국소적으로 도포되어 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 약제학적 조성물은 피부외용 제형을 갖는다. 피부외용 제형은 특별히 한정되지 않으며 바람직하게는 파우더, 젤, 연고, 크림, 로션, 액제 또는 에어로졸 제형이다.

도 1은 골담초 뿌리로부터 코보페놀 A를 분리하는 과정을 보여준다.
도 2는 코보페놀 A의 HPLC-DAD 크로마토그램이다. HPLC 분석은 1.0 ml/min의 유속에서 혼합용매 시스템 MeCN-H₂O (20:80 to 30:70,0-30 min, hold for 20 min, 30:70 to 40:60, 50-60 min)를 사용하여 워터 시스템(2996 광다이오드 어레이 검출기를 갖는 515 펌프) 및 YMC J'sphere ODS-H80 컬럼(4 μm, 150 x 4.6 mm I.D.) 상에서 수행하였다.
도 3은 코보페놀 A의 ¹H-NMR 스펙트럼(500 MHz,acetone-d ₆)이다.
도 4는 코보페놀 A의 ¹³C-NMR스펙트럼(125 MHz,acetone-d ₆)이다.
도 5는 코보페놀 A의 ESI-MS 스펙트럼이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 방법

실시예 1: 코보페놀(Kobophenol) A의 분리정제

음건한 골담초 뿌리 5.8kg을 세절하여 실온에서 메탄올(MeOH) 18 L로 2회 반복 추출하고 이를 감압 농축하여 메탄올 추출물 350g을 얻었다. 메탄올 추출물를 용매 분획법으로 CH₂Cl₂및 EtOAc층으로 각각 분획하였다. EtOAc 분획에 대하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(CH₂Cl₂:MeOH gradient)를 시행하여 5개의 분획으로 나누고, CSE-4 분획에 대하여 RP-18(ODS) 컬럼 크로마토그래피(H₂O : MeOH gradient)를 실시하여 5개의 분획으로 나누었다. CSE-44 분획에 대하여 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피(H₂O:MeOH gradient)를 시행하여 화합물 1(compound 1)(13g)을 분리하였다(도 1 참조). 화합물 1은 YMC J＇sphere ODS-H80 컬럼으로 MeCN-H₂O의 용매조건에서 HPLC한 결과 16.1 분에서 머무름 시간(retention time)을 나타내었다(도 2 참조).

실시예 2: 멜라닌 측정방법

1. 마우스 멜라노마 B16 세포

마우스 멜라노마 B16 세포를 96-웰 배양 플레이트에 2.5 x 10³세포/웰로 분주하여, 5％ CO₂가 공급되는 37℃ 배양기에서 24시간 배양하였다. 24 시간 뒤, 각 웰의 배지를 제거하고 새로운 10％ FBS(fetal bovine serum)을 함유한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)으로 갈아준 뒤, 계열 희석된 코보페놀 A와 α-MSH ( α-melanocyte stimulating hormone, 100 nM), forskolin(10 μM) 또는 IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine, 100 μM)을 각각 처리하였다. 72 시간 후, 배지로 방출된 멜라닌의 양을 마이크로플레이트 리더를 이용하여 405 nm에서의 흡광도를 측정하였고, 생존하고 있는 세포수는 MTT 시약을 가한 후 590 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 단위세포당 멜라닌 생성률은 흡광도(450nm)/흡광도(590nm)의 산출기준을 사용하였다. 실험결과는 2회 이상 반복하였다.

2. HEMn-MP 세포

Moderately pigmented (MP) neonatal foreskin에서 분리된 HEM(human epidermal melanocyte)를 60 mm 배양 플레이트에 7 x 10⁵세포/웰로 분주하여, 5％ CO₂가 공급되는 37℃ 배양기에서 24시간 배양하였다. 24시간 뒤, 각 웰의 배지를 제거하고 HMGS (human melanocyte growth supplement, GIBCOS-002-5)가 함유된 새로운 배지 254(GIBCOM-254-500)으로 갈아준 뒤, 계열 희석된 코보페놀 A와 α-MSH(100 nM)을 각각 처리하였다. 8일 후, 살아있는 세포수와 멜라닌 양을 측정하였다. 세포수는 트립판 블루(trypan blue)로 염색한 후 현미경하에서 살아있는 숫자를 산정하였다. 포집한 세포에 0.85 N KOH-10％ 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 용액을 200 ㎕ 첨가한 뒤 60℃에서 20분간 가열하여 멜라닌을 용해한 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 단위세포당 멜라닌 생성률은 흡광도(450 nm)/살아있는 세포 숫자의 산출기준을 사용하였다. 실험결과는 2회 이상 반복하였다.

3. Melan-a 세포

마우스의 정상 멜라닌 세포인 melan-a 세포를 60 mm 배양 플레이트에 2 x 10⁵세포/웰로 분주하여 10％ FBS와 200 nM phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA)가 포함된 RPMI 1640 배지(10.4 mg/㎖ RPMI 1640, 10 mM HEPES, 24 mM sodiumbicarbonate, 100 U/㎖ penicillin G sodium, 100 ug/㎖ streptomycin sulfate, pH 7.0-7.2)에 희석한 후 24 시간 배양하였다. 새로운 배지로 교체 후, 계열 희석된 코보페놀 A와 α-MSH(100 nM)을 각각 처리하였다. 4-5일 후, 살아있는 세포수와 멜라닌양을 측정하였다. 세포수는 트립판 블루로 염색한 후 현미경하에서 살아있는 숫자를 산정하였다. 포집한 세포에 0.85N KOH-10％ 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 용액을 200 ㎕ 첨가한 뒤 60℃에서 20분간 가열하여 멜라닌을 용해한 후 405 nm에서 흡광도 측정하였다. 단위세포당 멜라닌 생성율은 흡광도(450 nm)/살아있는 세포 숫자의 산출기준을 사용하였다. 실험결과는 2회 이상 반복하였다.

실시예 3: 세포 생존률 실험(MTT 분석)

마우스 멜라노마 B16 세포를 96-웰 배양 플레이트에 2.5 x 10³세포/웰로 분주하여, 5％ CO₂가 공급되는 37℃ 배양기에서 24시간 배양하였다. 24시간 뒤, 각 웰의 배지를 제거하고 새로운 10％ FBS를 함유한 DMEM 배지로 갈아준 뒤, 계열 희석된 4-코보페놀 A와 α-MSH(100 nM)을 각각 처리하였다. 72시간 후, 새로운 10％ FBS가 포함된 DMEM으로 갈아준 뒤, 2 시간 동안 안정화 시켰다. 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)를 웰당 100 μg/㎖의 농도로 처리하여 5％ CO₂가 공급되는 37℃ 배양기에서 2시간 동안 반응시키고, 상징액을 제거한 후 이어 50％ 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide)를 웰당 200 ㎕ 첨가하여 포르마잔(formazan) 침전물을 용해시키고, 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 590 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

실험 결과

실시예 4: 코보페놀 A의 구조규명

¹H-NMR 스펙트럼에서는 δ_H 7.34[2H, d, J=8.5Hz, H-2(6)a]과 6.88[2H, d, J=8.5Hz, H-3(5)a], δ_H 6.19[2H, d, J=8.5Hz, H-2(6)b]과 6.49[2H, d, J=8.5Hz, H-3(5)b], δ_H6.40[2H, d, J=8.5Hz, H-2(6)c]과 6.59[2H, d, J=8.5Hz, H-3(5)c], δ_H 7.07[2H, d, J=8.5Hz, H-2(6)d]과 6.76[2H, d, J=8.5Hz, H-3(5)d]에서 4개의 AA'XX' 타입에서 기인하는 양성자 시그널을 관찰하였고, 방향족(aromatic) 영역에서는 δ_H 6.51(1H, br d, J=1.9Hz, H-12b)과 5.95(1H, br d, J=1.9Hz, H-14b), δ_H 5.99(1H, br d, J=2.0Hz, H-12c), 6.40(1H, br d, J=2.0Hz, H-14c), δ_H 6.01 (2H, brs, H-10a, 14a), 6.02(1H, br d, J=1.8Hz, H-14a), δ_H 5.80(2H, br d, J=1.9Hz, H-10d, 14d), 6.08(1H, t, J=1.9Hz, H-12d)에서 총 8개의 양성자 시그널을 관찰하였고, 각각의 커플링 상수(coupling constant)로 두 개의 AX 타입과 두 개의 AB₂타입의 구조를 가진 화합물로 추정하였다. 지방족(Aliphatic) 영역에서는 δ_H 5.51(1H, s, H-7a)과 4.31(1H, s, H-8a), δ_H 4.89(1H, d, J=3.2Hz, H-7b)과 3.45(1H, d, J=3.1Hz, H-8b), δ_H 5.01(1H, d, J=3.9Hz, H-7c)과 3.22(1H, dd, J=5.2, 4.6Hz, H-8c), δ_H5.11 (1H, d, J=10.2, Hz, H-7d)과 3.09(1H, dd, J=10.2, 5.2Hz, H-8d)에서 총 8개의 지방족 양성자(aliphatic proton)가 관찰되었다(도 3 참조). ¹³C-NMR 스펙트럼에서는 총 56개의 탄소를 확인하였으며, 지방족(aromatic) 영역의 δ_C 156.0-161.8에서 12개의 산화된 지방족(oxygenated aromatic) 탄소, δ_C 126.6-128.6 및 115.2-116.3에서 4개의 AA'XX' 타입 지방족에서 기인하는 메틴(methine) 탄소, δ_C 84.8-93.3에서 4개의 산화된 메틴 탄소, δ_C 52.1-62.0에서 4개의 메틴 탄소를 확인하였다(도 4 참조). 이상의 기기분석 결과와 ESI-MS 스펙트럼에서는 포지티브 모드(positive mode)에서는 m/z 925에서 [M+H]⁺이온피크를, 네가티브 모드(negative mode)에서는 m/z 923에서 [M-H]^-이온피크를 확인하여(도 5 참조), 본 화합물은 분자식이 C₅₆H₄₄O₁₃인 코보페놀 A로 구조를 동정하였다.

실시예 5: 코보페놀 A의 미백효과

α-MSH가 멜라닌세포의 MC1R(melanocortin 1 receptor)에 결합을 하게 되면, MC1R에 결합되어 있던 G 단백질인 Gα_s 서브유닛에서 GDP가 GTP 형태로 활성화 된다. 단계적으로 Gα_s서브유닛은 β와 γ 서브유닛과 분리되어 세포막에 존재하는 아데닐레이트 사이클레이즈(andenylate cyclase)를 활성화 시킨다. 아데닐레이트 사이클레이즈에 의해서 ATP가 cAMP로 전환되어 멜라닌세포내의 cAMP 농도가 증가하게 된다. 멜라닌세포내 cAMP 증가는 티로시나아제(tyrosinase)의 생성을 매개하는 전사인자인 MITF의 발현을 유도하고, 궁극적으로 멜라닌 생합성을 증가시킨다. PDE (Phosphodiesterase)는 cAMP를 분해하여 AMP로 만들어 세포 내 cAMP 농도를 감소시킨다. Forskolin은 아데닐레이트 사이클레이즈 활성화제이며, IBMX는 PDE 저해제로써 세포 내 cAMP를 증가시킨다. 세포 내 cAMP 농도를 증가시키는 α-MSH, forskolin 또는 IBMX로 자극한 멜라닌세포의 멜라닌 생성에 대한 코보페놀 A의 미백효과를 측정하였다. B16 세포에서 α-MSH만 단독으로 처리하였을 때 생성된 멜라닌의 양은 배지만 가한 그룹과 비교하여 7배 가량 증가하였다. 코보페놀 A의 멜라닌 생성에 대한 영향은 α-MSH 단독 처리한 그룹과 비교하여 대조군(control)％로 나타내었다. α-MSH와 코보페놀 A (농도 0.6μM)를 함께 처리하였을 때 89％, 1.3μM에서 65％, 2.5μM에서 44％, 5μM에서 26％, 10μM에서 7％로 멜라닌 생성을 농도 의존적으로 억제 하였고, IC₅₀값은 2.2μM이었다(표 1 참조). 아래 표 1은 α-MSH-활성화된 B16 세포내에서 코보페놀 A가 멜라닌 생성에 미치는 영향을 측정한 결과이다.

실험군	시료농도	단위세포당 멜라닌 생성율 (Control％)	p-value
α-MSH 단독(100 nM)	-	100.00 ± 0.00	-
α-MSH(100 nM) + 코보페놀 A	0.6 μM	89.25 ± 1.12	0.2716
	1.3 μM	65.34 ± 5.55	0.1096
	2.5 μM	43.99 ± 5.79	0.0383 *
	5 μM	25.71 ± 11.38	0.0281 *
	10 μM	6.68 ± 7.22	0.0082 **

표 1에서 데이터는 2회 독립 실험의 평균±SE으로 표시하였다. Student's t-test*P < 0.05 또는 **P < 0.01 vs. α-MSH 단독 처리군.

HEMn-MP 세포에서 α-MSH만 단독으로 처리하였을 때 생성된 멜라닌의 양은 배지만 가한 그룹과 비교하여 2배 가량 증가하였다. 코보페놀 A의 멜라닌 생성에 대한 영향은 α-MSH 단독 처리한 그룹과 비교하여 대조군(control)％로 나타내었다. α-MSH와 코보페놀 A (농도 1.3μM)를 처리하였을 때 93％, 2.5μM에서 55％, 5μM에서 0％로 멜라닌 생성을 농도 의존적으로 억제하였고, IC₅₀값은 2.7μM이었다(표 2 참조). 아래 표 2는 α-MSH-활성화된 HEMn-MP 세포내에서 코보페놀 A가 멜라닌 생성에 미치는 영향을 측정한 결과이다.

실험군	시료농도	단위세포당 멜라닌 생성율 (Control％)	p-value
α-MSH 단독(100 nM)	-	100.00 ± 0.00	-
α-MSH(100 nM) + 코보페놀 A	1.3 μM	93.12 ± 0.99	0.0110 *
	2.5 μM	55.04 ± 8.58	0.0371 *
	5 μM	0.00 ± 4.39	0.0017 **

표 2에서 데이터는 2회 독립 실험의 평균±SE으로 표시하였다. Student's t-test*P < 0.05 또는 **P < 0.01 vs. α-MSH 단독 처리군.

Melan-a 세포에서 α-MSH만 단독으로 처리하였을 때 생성된 멜라닌의 양은 배지만 가한 그룹과 비교하여 4배 가량 증가하였다. 코보페놀 A의 멜라닌 생성에 대한 영향은 α-MSH 단독 처리한 그룹과 비교하여 대조군(control)％로 나타내었다. α-MSH와 코보페놀 A(농도 1.3μM)를 처리하였을 때 73％, 2.5μM에서 43％, 5μM에서 21％로 멜라닌 생성을 농도의존적으로 억제 하였고, IC₅₀값은 2.2μM이었다(표 3 참조). 아래 표 3은 α-MSH-활성화된 melan-a 세포내에서 코보페놀 A가 멜라닌 생성에 미치는 영향을 측정한 결과이다.

실험군	시료농도	단위세포당 멜라닌 생성율 (Control％)	p-value
α-MSH 단독(100 nM)	-	100.00 ± 0.00	-
α-MSH (100 nM) + 코보페놀 A	1.3 μM	73.08 ± 1.46	0.3661
	2.5 μM	43.06 ± 5.30	0.1265
	5 μM	20.55 ± 0.04	0.0488 *

표 3에서 데이터는 2회 독립 실험의 평균±SE으로 표시하였다. Student's t-test*P < 0.05 vs. α-MSH 단독 처리군.

B16 세포에서 forskolin만 단독으로 처리하였을 때 생성된 멜라닌의 양은 배지만 가한 그룹과 비교하여 10배 가량 증가하였다. 코보페놀 A의 멜라닌 생성에 대한 영향은 forskolin 단독 처리한 그룹과 비교하여 대조군(control)％로 나타내었다. Forskolin과 코보페놀 A(농도 0.6μM)를 처리하였을 때 84％, 1.3μM에서 69％, 2.5μM에서 44％, 5μM에서 17％, 10μM에서 7％로 멜라닌 생성을 농도 의존적으로 억제하였고, IC₅₀값은 2.2μM이었다(표 4 참조). 아래 표 4는 forskolin-활성화된 B16 세포내에서 코보페놀 A가 멜라닌 생성에 미치는 영향을 측정한 결과이다.

실험군	시료농도	단위세포당 멜라닌 생성율 (Control％)	p-value
Forskolin 단독(10 μM)	-	100.00 ± 0.00	-
Forskolin (10 μM) + 코보페놀 A	0.6 μM	83.98 ± 10.79	0.1423
	1.3 μM	68.69 ± 3.60	0.0478 *
	2.5 μM	43.67 ± 2.87	0.0162 *
	5 μM	17.01 ± 0.93	0.0070 **
	10 μM	6.55 ± 4.65	0.0076 **

표 4에서 데이터는 2회 독립 실험의 평균±SE으로 표시하였다. Student's t-test*P < 0.05 또는 **P < 0.01 vs. forskolin 단독 처리군.

B16 세포에서 IBMX만 단독으로 처리하였을 때 생성된 멜라닌의 양은 배지만 가한 그룹과 비교하여 9배 가량 증가하였다. 코보페놀 A의 멜라닌 생성에 대한 영향은 IBMX 단독 처리한 그룹과 비교하여 대조군(control)％로 나타내었다. IBMX와 코보페놀 A(농도 0.6μM)를 처리하였을 때 87％, 1.3μM에서 67％, 2.5μM에서 38％, 5μM에서 16％, 10μM에서 6％로 멜라닌 생성을 농도 의존적으로 억제하였고, IC₅₀값은 2.0μM이었다(표 5 참조). 아래 표 5는 IBMX-활성화된 B16 세포내에서 코보페놀 A가 멜라닌 생성에 미치는 영향을 측정한 결과이다.

실험군	시료농도	단위세포당 멜라닌 생성율 (Control％)	p-value
IBMX 단독(100 μM)	-	100.00 ± 0.00	-
IBMX(100 μM) + 코보페놀 A	0.6 μM	86.77 ± 3.39	0.6331
	1.3 μM	66.55 ± 7.14	0.0803
	2.5 μM	37.85 ± 1.39	0.0384 *
	5 μM	17.54 ± 11.50	0.0362 *
	10 μM	5.54 ± 1.30	0.0140 *

상기 표 5에서 데이터는 2회 독립 실험의 평균±SE으로 표시하였다. Student's t-tes:*P < 0.05 vs. IBMX 단독 처리군.

실시예 6: 코보페놀 A의 세포 생존율에 대한 영향

B16 세포에 대한 코보페놀 A의 세포 생존율에 대한 영향은 표 6에 나타내었다. 코보페놀 A의 농도 0.6 - 2.5 μM에서는 세포독성을 나타내지 않았다. 그러나 코보페놀 A는 농도 5 μM에서는 11％, 10 μM에서는 21％의 세포 독성을 나타내었다. 아래 표 6은 코보페놀 A가 B16 세포의 생존율에 미치는 영향을 평가한 결과이다.

실험군	시료농도	세포생존율 (Control％)	p-value
α-MSH 단독(100 nM)	-	100.00 ± 0.00	-
α-MSH(100 nM) + 코보페놀 A	0.6 μM	101.95 ± 2.25	0.7713
	1.3 μM	97.87 ± 2.47	0.4003
	2.5 μM	99.86 ± 0.23	0.8478
	5 μM	89.23 ± 0.54	0.0307 *
	10 μM	78.58 ± 0.22	0.0085 *

상기 표 6에서 데이터는 2회 독립 실험의 평균±SE으로 표시하였다. Student's t-tes:*P < 0.05 vs. α-MSH 단독 첨가군.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 코보페놀 A(kobophenol A)을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물.
[화학식 1]
제 1 항에 있어서, 상기 코보페놀 A는 0.05 - 30 중량％의 함량으로 포함되는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 코보페놀 A는 골담초(Caragana sinica) 추출물로부터 분리된 것임을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 화장품학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 화장품학적 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 또는 스프레이 형태의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 멜라닌 색소 과다 침착 질환은 기미, 주근깨, 노인성 색소반, 또는 일광흑색증(solar lentigines)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 조성물은 파우더, 젤, 연고, 크림, 로션, 액제 또는 에어로졸 제형의 피부외용 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.