KR20140101877A

KR20140101877A - Proteolytically cleavable fusion protein comprising a blood coagulation factor

Info

Publication number: KR20140101877A
Application number: KR1020147021080A
Authority: KR
Inventors: 후베르트 메츠너; 토마스 바이머; 슈테판 슐테
Original assignee: 체에스엘 베링 게엠베하
Priority date: 2006-06-14
Filing date: 2007-06-14
Publication date: 2014-08-20

Abstract

본 발명은, 응고 인자가 반감기 향상 폴리펩타이드에 융합되고, 이 둘은 단백질분해적으로 절단가능한 링커 펩타이드에 의해 연결된 치료학적 융합 단백질에 관한 것이다. 이러한 링커의 절단은 반감기 향상 폴리펩타이드에 의해 유발되는 어떠한 활성-저하 입체적 장애로부터 응고 인자를 유리시킴으로써, 응고-관련 검정으로 시험시 높은 몰 비활성을 갖는 융합 단백질이 생성되도록 한다. 또한, 링커가 절단가능하다는 사실은 아미노산 서열 GGGGGGV를 갖는 절단가능하지 않은 링커에 의해 연결된 상응하는 치료학적 융합 단백질과 비교하여 펩타이드 링커의 단백질분해적 절단 후 불활성화율 및/또는 제거율을 향상시킬 수 있다.The present invention relates to a therapeutic fusion protein wherein the coagulation factor is fused to a half-life enhancing polypeptide, both of which are linked by a proteolytically cleavable linker peptide. This cleavage of the linker liberates the coagulation factor from any activity-degrading steric hindrance induced by the half-life enhancing polypeptide, thereby allowing the fusion-associated assay to produce a fusion protein with high molar inactivity in the test. In addition, the fact that the linker is cleavable can improve the inactivation rate and / or the clearance rate after proteolytic cleavage of the peptide linker as compared to the corresponding therapeutic fusion protein linked by the non-cleavable linker with the amino acid sequence GGGGGGV .

Description

혈액 응고 인자를 포함하는 단백질분해적으로 절단가능한 융합 단백질{Proteolytically cleavable fusion protein comprising a blood coagulation factor}Proteolytically cleavable fusion protein comprising a blood coagulation factor

본 발명은 변형되지 않은 모 치료학적 폴리펩타이드와 비교하여 반감기가 증가된 변형된 치료학적 융합 단백질의 분야에 관한 것이다. 본 발명은 상세하게는, 단백질분해적으로 절단가능한 링커 펩타이드에 의해 연결된 반감기 향상 폴리펩타이드(HLEP; half-life enhancing polypeptide)에 융합된 응고 인자에 관한 것이다. 이러한 링커의 절단은 HLEP에 의해 유발된 어떠한 활성-저하 입체 장애(activity-compromising steric hindrance)로부터 치료학적 폴리펩타이드를 유리시킴으로써 응고 인자의 높은 몰 비활성(molar specific activity)을 보유하는 융합 단백질이 생성되도록 한다. 치료학적 융합 단백질이 효소원(zymogen)인 경우에, 상응하는 프로테아제(들)에 노출시 필수적으로 생체내에서 이의 활성화와 동시에 치료학적 폴리펩타이드를 유리시키는 링커가 특히 바람직하다. 본 발명의 다른 측면은, 응고 인자가 활성화되고 펩타이드 링커가 응고-관련 방식으로 단백질분해적으로 절단될 때 제공된 응고 인자의 보다 빠른 불활성화율, 및/또는 응고 인자가 활성화되어 펩타이드 링커가 절단가능한 링커가 없는 상응하는 융합 단백질과 비교하여 응고-관련 방식으로 단백질분해적으로 절단될 때 제공된 응고 인자의 보다 빠른 제거율이다.The present invention relates to the field of modified therapeutic fusion proteins with an increased half-life compared to the unmodified parent therapeutic polypeptide. The present invention relates in particular to a coagulation factor fused to a half-life enhancing polypeptide (HLEP) linked by a proteolytically cleavable linker peptide. Cleavage of this linker frees the therapeutic polypeptide from any activity-compromising steric hindrance induced by HLEP, resulting in a fusion protein with a high molar specific activity of the coagulation factor. do. When the therapeutic fusion protein is a zymogen, a linker that essentially releases the therapeutic polypeptide simultaneously with its activation in vivo upon exposure to the corresponding protease(s) is particularly preferred. Another aspect of the present invention is a linker capable of cleaving a peptide linker due to activation of the coagulation factor, and/or activation of the coagulation factor, and/or of the provided coagulation factor when the coagulation factor is activated and the peptide linker is proteolytically cleaved in a coagulation-related manner. Is the faster removal rate of a given coagulation factor when proteolytically cleaved in a coagulation-related manner compared to the corresponding fusion protein without.

본 발명의 개념은 특히 사람 비타민 K-의존성 폴리펩타이드 인자 IX, 인자 VII 및 인자 VIIa에 의해 입증되나, 개념은 또한 다른 응고 인자에도 적용될 수 있다. 어떠한 반감기-향상 폴리펩타이드(HLEP)도 절단가능한 링커 펩타이드에 의해 치료학적 폴리펩타이드에 연결될 수 있으나, 알부민 또는 면역글로불린 또는 항원 결합 도메인이 없는 Fc 단편과 유사한 이의 유도된 단편이 바람직한 HLEP이다. 본 발명은 또한 절단가능한 개재(intervening) 펩타이드 링커를 암호화하는 올리고뉴클레오타이드에 의해 연결된 사람 혈청 알부민과 같이, HLEP를 암호화하는 cDNA에 유전적으로 융합된 치료학적 폴리펩타이드 및 이의 유도체를 암호화하는 cDNA 서열에 관한 것이다. 이러한 암호화된 유도체는 절단 불가능한 대응물과 비교하여 향상된 반감기 및 증가된 몰 비활성을 나타낸다. 본 발명은 또한 이러한 cDNA 서열을 함유하는 재조합 발현 벡터, 이러한 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 변형되지 않은 야생형 치료학적 폴리펩타이드와 비교가능한 생물학적 활성을 지니나 반감기가 향상되어 있는 재조합 폴리펩타이드 및 유도체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 재조합 단백질 및 이들의 유도체의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 생체내에서 반감기를 증가시키는데 유용한 이러한 변형된 DNA 서열을 포함하는, 사람 유전자 치료요법에서 사용하기 위한 전달 벡터를 포함한다.
The concept of the invention is demonstrated in particular by the human vitamin K-dependent polypeptide factor IX, factor VII and factor VIIa, but the concept can also be applied to other coagulation factors. Any half-life-enhancing polypeptide (HLEP) can be linked to a therapeutic polypeptide by a cleavable linker peptide, but albumin or immunoglobulins or derived fragments thereof similar to Fc fragments without an antigen binding domain are preferred HLEPs. The present invention also relates to a cDNA sequence encoding a therapeutic polypeptide genetically fused to a cDNA encoding HLEP and derivatives thereof, such as human serum albumin linked by an oligonucleotide encoding a cleavable intervening peptide linker. will be. These encoded derivatives exhibit improved half-life and increased molar specific activity compared to their non-cleavable counterparts. The present invention also relates to a recombinant expression vector containing such a cDNA sequence, a host cell transformed with such a recombinant expression vector, a recombinant polypeptide and derivative having a biological activity comparable to that of an unmodified wild-type therapeutic polypeptide but having an improved half-life. It is about. The invention also relates to methods of making such recombinant proteins and derivatives thereof. The invention also includes delivery vectors for use in human gene therapy, comprising such modified DNA sequences useful for increasing half-life in vivo.

몇가지 치료학적 재조합 폴리펩타이드는 사람에 있어 치료학적 및 예방학적 용도로 시판되고 있다. 일반적으로, 환자는 재조합 활성 성분의 특정 작용 방식으로부터 유리할 수 있지만, 단점은 종종 이들의 값비싸고 복잡한 제조 과정으로 인한 이들의 제한된 이용성이다. 이러한 제품의 필요한 투여량 또는 투여 횟수의 감소는 이러한 상황을 개선시킬 수 있다. 감소된 투여 횟수는 환자에 대한 편의성 및 따라서, 치료요법의 허용성을 향상시킨다. 몇가지 해법이 투여 후 증가된 생체내 반감기의 목표를 달성하기 위해 기술되어 왔다. 최근에 제안된 해결은 특히, HLEP에 대한 융합에 의해 현저히 증가될 수 있는 생체내 반감기가 짧은 폴리펩타이드의 경우에 융합 단백질의 형성을 포함한다.Several therapeutic recombinant polypeptides are commercially available for therapeutic and prophylactic use in humans. In general, patients can benefit from certain modes of action of the recombinant active ingredients, but the disadvantage is their limited availability, often due to their expensive and complex manufacturing processes. Reducing the required dosage or frequency of administration of these products can ameliorate this situation. The reduced frequency of administration improves the convenience to the patient and thus the tolerance of the therapy. Several solutions have been described to achieve the goal of increased half-life in vivo after administration. A recently proposed solution involves the formation of fusion proteins, especially in the case of short half-life polypeptides in vivo that can be significantly increased by fusion to HLEP.

발란스(Ballance) 등은 문헌(참조: WO 01/79271)에서 사람 혈청 알부민에 융합된 경우 증가된 생체내 작용성 반감기 및 연장된 저장 수명을 가질 것으로 예측되는 다수의 상이한 치료학적 폴리펩타이드의 융합 폴리펩타이드를 기술하였다. 강력한 융합 파트너의 긴 목록은, 각각의 알부민 융합 단백질이 실제로 생물학적 활성을 보유하고 향상된 특성을 갖는 특정의 이러한 폴리펩타이드 대부분에 대한 시험 데이터로 나타내어지지 않은 상태로 기술되어 있다. 실시예로서 언급된 치료학적 폴리펩타이드의 목록 중에서는 인자 IX 및 FVII/FVIIa 등이 있다. 또한, 알부민 및 FIX 또는 FVII/FVIIa 사이에 펩타이드 링커가 있는 FIX 및 FVII/FVIIa의 융합체도 기술되어 있다. 그러나, 절단가능한 링커 펩타이드의 용도는 제안되어 있지 않다.Balance et al. (WO 01/79271) describes a fusion poly of a number of different therapeutic polypeptides predicted to have an increased functional half-life and extended shelf life in vivo when fused to human serum albumin. The peptide was described. A long list of potent fusion partners has been described, with each albumin fusion protein actually retaining biological activity and not represented by test data for most of these specific polypeptides with enhanced properties. Among the list of therapeutic polypeptides mentioned as examples are factor IX and FVII/FVIIa and the like. In addition, fusions of FIX and FVII/FVIIa with a peptide linker between albumin and FIX or FVII/FVIIa are also described. However, the use of a cleavable linker peptide has not been proposed.

쉐필드(Sheffield) 등은 쥐 FIX, 8개 아미노산의 링커(GPG₄TM), 쥐 알부민 및 22개 아미노산의 펩타이드 태크로 구성된 쥐 인자 IX 알부민 융합 단백질, 및 또한 사람 인자 IX, 7개 아미노산의 링커(G₆V) 및 사람 알부민으로 구성된 사람 인자 IX 알부민 융합 단백질을 발현시켰다[참조: Sheffield W. P. et al. (2004), Br. J. Haematol. 126: 565-573]. 1 단계의, FIX 의존성 응고 검정의 사용시, 쥐 FIX-알부민 융합 단백질(MFUST) 및 사람 FIX-알부민 융합 단백질(HFUS)의 몰 비활성은 융합되지 않은 대응물보다 2배 내지 3배 이상 낮았으며, 효과는 FXIa에 의한 보다 느린 단백질분해 활성화 과정에 적어도 부분적으로 기인하였다. 쉐필드는 FIX와 알부민 사이에 절단가능한 링커를 사용하거나 이를 제안하지 않았다.Sheffield et al. have described murine FIX, a murine factor IX albumin fusion protein consisting of a murine FIX, a linker of 8 amino acids (GPG ₄ TM), a murine albumin and a peptide tag of 22 amino acids, and also a human factor IX, a linker of 7 amino acids ( G ₆ V) and human factor IX albumin fusion protein composed of human albumin were expressed (Sheffield WP et al. (2004), Br. J. Haematol. 126: 565-573]. When using a step 1, FIX dependent coagulation assay, the molar specificities of murine FIX-albumin fusion protein (MFUST) and human FIX-albumin fusion protein (HFUS) were 2 to 3 times lower than that of the unfused counterpart, and the effect Was at least in part due to the slower proteolytic activation process by FXIa. Sheffield did not use or suggest a cleavable linker between FIX and albumin.

몇개의 특허원은 치료학적 폴리펩타이드의 생체내 반감기를 연장시키기 위해 면역글로불린 불변 영역에 대한 치료학적 폴리펩타이드의 융합물을 기술하고 있다. 제WO 2002/04598호, 제WO 2003/059935호, 제WO 2004/081053호, 제WO 2004/101740호 및 제WO 2005/001025호는 치료학적 폴리펩타이드 잔기에 대한 예로서 FIX를 포함한다. 후자의 2개의 특허원은 또한 면역글로불린 불변 영역에 융합된 FVII/FVIIa를 기술하고 있으며, 융합 단백질 동종이량체는 단량체/이량체로 이루어진 융합 단백질과 비교하여 더 낮은 응고 활성을 지님을 밝히고 있다. 또한, 절단가능한 링커 펩타이드의 용도도 제안되어 있지 않다.Several patent applications describe fusions of therapeutic polypeptides to immunoglobulin constant regions to extend the in vivo half-life of therapeutic polypeptides. WO 2002/04598, WO 2003/059935, WO 2004/081053, WO 2004/101740 and WO 2005/001025 include FIX as examples for therapeutic polypeptide residues. The latter two patent applications also describe FVII/FVIIa fused to an immunoglobulin constant region, revealing that the fusion protein homodimer has a lower coagulation activity compared to the fusion protein consisting of monomer/dimer. In addition, the use of a cleavable linker peptide has not been proposed.

제WO 91/09125호에는, 혈액 응고 캐스캐이드(cascade)의 프로테아제에 의해 절단가능한 링커로 연결된 융합 단백질이 기술되어 있으나, 당해 융합 단백질은 섬유소용해 또는 항혈전성 단백질을 포함하는 것에 한정되어 있다.WO 91/09125 describes a fusion protein linked by a linker cleavable by a protease of a blood coagulation cascade, but the fusion protein is limited to those comprising fibrinolytic or antithrombotic proteins. .

제WO 03/068934호에는, 하나 이상의 제1 성분 분자, 하나 이상의 링커 및 하나 이상의 제2 분자로 구성된 키메라 분자가 기술되어 있으며, 여기서, 링커는 제1 및 제2 성분 분자 사이에 인공적으로 존재하는 연결 및 절단 부위를 생성하는 효소 절단 부위를 포함하고, 절단 부위에서 키메라성 분자의 절단시, 성분 분자들 중 하나 이상이 기능적으로 활성화된다. 절단되는 프로테아제는 트롬빈과 같은 응고 인자일 수 있다. 많은 다른 것들 중에서 기술된 성분 분자들은 FIX 및 FVIIa이다. 그러나, 본 발명의 치료학적 융합 단백질은 기술되어 있지 않으며, 절단가능한 링커가 없는 치료학적 단백질과 비교하여 증가된 몰 비활성, 증가된 불활성화 및/또는 제거율과 같은 본 발명의 치료학적 융합 단백질의 개선된 특성에 대해서도 기술되어 있지 않다.
WO 03/068934 describes a chimeric molecule consisting of at least one first component molecule, at least one linker and at least one second molecule, wherein the linker is artificially present between the first and second component molecules. It includes an enzyme cleavage site that creates a linkage and cleavage site, and upon cleavage of the chimeric molecule at the cleavage site, one or more of the component molecules are functionally activated. The protease to be cleaved may be a clotting factor such as thrombin. The component molecules described, among many others, are FIX and FVIIa. However, the therapeutic fusion protein of the present invention is not described, and improvement of the therapeutic fusion protein of the present invention, such as increased molar specific activity, increased inactivation and/or clearance rate compared to a therapeutic protein without a cleavable linker. There is also no description of the properties that have been produced.

발명의 설명Description of the invention

반감기가 긴 응고 인자에 대한 의학적 요구가 크다. 선행 기술에서, 반감기 향상 폴리펩타이드에 대한 응고 인자의 융합물이 이러한 목표를 달성하기 위해 제안되어 왔다. 그러나, 응고 인자가 효소원(예: FIX)의 단백질분해적 절단에 의해 또는 제2 폴리펩타이드에 대한 이미 단백질분해적으로 "예비"-활성화된 인자의 접촉에 의해(예: 조직 인자에 대한 FVIIa 결합) 응고 동안 활성화되면, 이미 FVIIa와 같은 야생형 응고 인자의 경우에서와 같이[참조: Aledort L.M., J Thromb Haemost 2(10): 1700-1708 (2004)], 이것이 혈전성 합병증을 초래할 수 있으므로 현재의 활성화된 응고 인자의 긴 반감기를 유지시키는 것이 더 이상 바람직하지 않으며 심지어, 활성화된 인자가 증가된 반감기를 가지는 경우 보다 더 관련성이 있다. 따라서, 본 발명의 하나의 목적은 보조인자의 활성화 후 또는 이용 이후, 변형되지 않은 응고 인자와 비교가능한 반감기를 갖는 장기간 지속되는 응고 인자를 제공하는 것이다.There is a great medical demand for coagulation factors with a long half-life. In the prior art, fusions of coagulation factors to half-life enhancing polypeptides have been proposed to achieve this goal. However, the coagulation factor is either by proteolytic cleavage of an enzymatic source (eg FIX) or by contact of an already proteolytically "pre-"-activated factor for a second polypeptide (eg FVIIa for tissue factors). Binding), if activated during coagulation, already as in the case of wild-type coagulation factors such as FVIIa [see Aledort LM, J Thromb Haemost 2(10): 1700-1708 (2004)], as this can lead to thrombotic complications. It is no longer desirable to maintain a long half-life of the activated coagulation factor of, and is even more relevant than if the activated factor has an increased half-life. Accordingly, one object of the present invention is to provide a long lasting clotting factor having a half-life comparable to an unmodified clotting factor after activation or use of the cofactor.

선행 기술에 기술되고 또한 실시예 6 및 7에 나타낸 바와 같이 반감기-향상 폴리펩타이드에 대한 응고 인자의 융합물은 일반적으로 융합된 응고 인자의 감소된 몰 비활성을 겪는다. 본 발명의 다른 측면은 절단가능한 링커가 없는 상응하는 치료학적 융합 단백질과 비교하여 증가된 몰 비활성을 나타내는, 반감기가 향상된 응고 인자를 제공하는 것이다.Fusions of coagulation factors to half-life-enhancing polypeptides, as described in the prior art and also shown in Examples 6 and 7, generally undergo a reduced molar specific activity of the fused coagulation factor. Another aspect of the invention is to provide a coagulation factor with improved half-life that exhibits increased molar specific activity compared to the corresponding therapeutic fusion protein without a cleavable linker.

따라서, 본 발명은Therefore, the present invention

a) 응고 인자, 이의 변이체 또는 유도체,a) coagulation factor, variant or derivative thereof,

b) 변이체 및 유도체를 포함하는 알부민, 변이체 및 유도체를 포함하는 알부민 계열의 폴리펩타이드, 및 변이체 및 유도체를 포함하는 항원 결합 도메인이 없는 면역글로불린으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 반감기 향상 폴리펩타이드, 및b) a half-life enhancing polypeptide selected from the group consisting of albumin including variants and derivatives, albumin family polypeptides including variants and derivatives, and immunoglobulins without antigen binding domains including variants and derivatives, and

c) 상기 응고 인자와 상기 반감기 향상 폴리펩타이드를 결합시키는 펩타이드 링커를 포함하는 치료학적 융합 단백질에 관한 것이며, 여기서, 상기 펩타이드 링커는 응고와 관련되거나 또는 응고 효소에 의해 활성화되는 프로테아제에 의해 절단가능하고, 상기 치료학적 융합 단백질은 아미노산 서열 GGGGGGV를 갖는 절단가능하지 않은 링커에 의해 연결된 각각의 치료학적 융합 단백질과 비교하여,c) relates to a therapeutic fusion protein comprising a peptide linker that binds the coagulation factor and the half-life enhancing polypeptide, wherein the peptide linker is cleavable by a protease associated with coagulation or activated by a coagulation enzyme, and , The therapeutic fusion protein compared to each therapeutic fusion protein linked by a non-cleavable linker having the amino acid sequence GGGGGGV,

i) 하나 이상의 응고-관련 검정에서 증가된 몰 비활성 및/또는i) increased molar specific activity in one or more coagulation-related assays and/or

ii) 펩타이드 링커가 응고-관련 방식으로 단백질분해적으로 절단된 후 활성화된 응고 인자의 증가된 불활성화율 및/또는ii) increased inactivation rate of the activated coagulation factor after the peptide linker is proteolytically cleaved in a coagulation-related manner and/or

iii) 펩타이드 링커가 응고-관련 방식으로 단백질분해적으로 절단된 후 활성화된 응고 인자의 증가된 제거율을 갖는다.iii) The peptide linker has an increased clearance of activated coagulation factors after proteolytic cleavage in a coagulation-related manner.

절단가능한 링커의 결과로서, 펩타이드 링커의 응고-관련 방식으로의 절단 후, 응고 인자는 천연의 융합되지 않은 인자의 작용과 더 밀접하게 유사하며 강력한 혈전촉진 효과를 갖는 활성 인자의 증가된 반감기를 나타내지 않는다.As a result of the cleavable linker, after cleavage of the peptide linker in a coagulation-related manner, the coagulation factor more closely resembles the action of the natural unfused factor and does not exhibit an increased half-life of the active factor with a potent thrombogenic effect. Does not.

본 발명의 의미에서 응고-관련 방식에서의 단백질분해적 절단은 하나 이상의 응고 인자 또는 응고 보조인자의 활성화의 결과로서 발생하는 임의의 단백질분해적 절단이다.Proteolytic cleavage in a coagulation-related mode in the sense of the present invention is any proteolytic cleavage that occurs as a result of the activation of one or more coagulation factors or coagulation cofactors.

본 발명의 의미에서 용어 "펩타이드 링커가 응고-관련 방식으로 단백질분해적으로 절단된 후 활성화된 응고 인자"는, 응고 인자가 링커 펩타이드의 단백질분해적 절단과 동시에 거의 활성화되거나, 또는 응고 인자가 링커 펩타이드의 단백질분해적 절단 이전에 이미 활성화되었음을 의미한다. 활성화는 예를 들면, 응고 인자의 단백질분해적 절단 또는 보조인자에 대한 결합에 의해 발생할 수 있다.In the meaning of the present invention, the term "coagulation factor activated after proteolytic cleavage of the peptide linker is proteolytically cleaved in a coagulation-related manner" means that the coagulation factor is activated almost simultaneously with the proteolytic cleavage of the linker peptide, or the coagulation factor is a linker It means that it has already been activated prior to proteolytic cleavage of the peptide. Activation can occur, for example, by proteolytic cleavage of a coagulation factor or binding to a cofactor.

본 발명의 추가의 측면은A further aspect of the invention

c) 상기 응고 인자와 상기 반감기 향상 폴리펩타이드를 결합시키는 펩타이드 링커를 포함하는 치료학적 융합 단백질을 제공하며, 여기서, 상기 펩타이드 링커는 응고와 관련되거나 또는 응고 효소에 의해 활성화되는 프로테아제에 의해 절단가능하고, 상기 치료학적 융합 단백질은 아미노산 서열 GGGGGGV를 갖는 절단가능하지 않은 링커에 의해 연결된 각각의 치료학적 융합 단백질과 비교하여c) Provides a therapeutic fusion protein comprising a peptide linker that binds the coagulation factor and the half-life enhancing polypeptide, wherein the peptide linker is cleavable by a protease associated with coagulation or activated by a coagulation enzyme, and , The therapeutic fusion protein compared to each therapeutic fusion protein linked by a non-cleavable linker having the amino acid sequence GGGGGGV

ii) 펩타이드 링커가 응고-관련 방식으로 단백질분해적으로 분해된 후 활성화된 응고 인자의 증가된 불활성화율 및/또는ii) increased inactivation rate of the activated coagulation factor after the peptide linker is proteolytically degraded in a coagulation-related manner and/or

iii) 펩타이드 링커가 응고-관련 방식으로 단백질분해적으로 절단된 후 활성화된 응고 인자의 증가된 제거율을 갖고,iii) the peptide linker has an increased removal rate of activated coagulation factors after proteolytic cleavage in a coagulation-related manner,

변형되지 않은 응고 인자의 생체내 회수율과 비교하여 생체내 회수율이 향상된 치료학적 융합 단백질을 제공한다.It provides a therapeutic fusion protein with an improved in vivo recovery rate compared to the in vivo recovery rate of an unmodified coagulation factor.

변형되지 않은 응고 인자와 비교하여 생체내 회수율이 10% 이상, 보다 바람직하게는 25% 이상, 가장 바람직하게는 40% 이상 향상된 치료학적 융합 단백질이 바람직하다.A therapeutic fusion protein with an improved in vivo recovery of at least 10%, more preferably at least 25%, and most preferably at least 40% compared to an unmodified coagulation factor is preferred.

바람직한 응고 인자는 비타민-K 의존성 응고 인자 및 이의 단편 및 변이체이다. FVIIa 및 FIX, 및 이의 단편 및 변이체가 보다 바람직하다.Preferred clotting factors are vitamin-K dependent clotting factors and fragments and variants thereof. More preferred are FVIIa and FIX, and fragments and variants thereof.

바람직한 HLEP는 알부민 및 이의 단편 또는 변이체, 및 단편 및 변이체를 포함하는 면역글로불린이다.Preferred HLEPs are albumin and fragments or variants thereof, and immunoglobulins comprising fragments and variants.

바람직한 양태에서 링커 영역은 투여될 치료학적 폴리펩타이드의 서열 또는 이의 변이체를 포함하며, 이는 발현된 융합 단백질의 신생항원 특성(사람 단백질에 존재하지 않는 치료학적 항원내 펩타이드의 존재에 기인한 신규의 강력한 면역원성 에피토프의 형성)의 위험을 감소시켜야 한다. 또한, 치료학적 단백질이 효소원인 경우(예를 들면, 단백질분해적으로 활성화될 필요가 있는 경우) 펩타이드 링커 절단의 반응속도론은 효소원의 응고-관련 활성화 반응속도론을 보다 밀접하게 반영할 것이다. 따라서, 이러한 바람직한 양태에서, 효소원 및 상응하는 링커는 활성화되고 비교가능한 반응속도론으로 각각 절단된다. 이러한 이유로, 본 발명은 특히 효소원 및 HLEP의 융합 단백질에 관한 것이며, 여기서, 관련된 프로테아제에 의한 링커 절단의 반응속도론은 효소원 활성화의 반응속도론과 비교하여 3배 이상, 및 가장 바람직하게는 2배 이상 더 지연되지 않는다.In a preferred embodiment, the linker region comprises the sequence of the therapeutic polypeptide to be administered or a variant thereof, which is the neoantigenic properties of the expressed fusion protein (a novel potent composition due to the presence of the peptide in the therapeutic antigen not present in the human protein). The risk of the formation of immunogenic epitopes) should be reduced. In addition, if the therapeutic protein is an enzymatic source (eg, if it needs to be activated proteolytically), the kinetics of peptide linker cleavage will more closely reflect the coagulation-related activation kinetics of the enzymatic source. Thus, in this preferred embodiment, the enzyme source and the corresponding linker are activated and cleaved respectively with comparable kinetics. For this reason, the present invention relates in particular to a fusion protein of an enzyme source and HLEP, wherein the kinetics of linker cleavage by the related protease is at least three times, and most preferably, two times as compared to the kinetics of activation of the enzyme source. No more delays.

추가의 양태에서, 링커 펩타이드는 하나 이상의 프로테아제에 대한 절단 부위를 포함한다. 이는 상이한 프로테아제에 의해, 또는 2개 이상의 상이한 절단 부위를 제공하는 링커 펩타이드에 의해 동일한 위치에서 절단될 수 있는 링커 펩타이드에 의해 달성될 수 있다. 이는, 치료학적 융합 단백질이 단백질분해적 절단에 의해 활성화되어 효소 활성을 달성하여야 하는 경우 및 상이한 프로테아제가 이러한 활성화 단계에 기여할 수 있는 경우에 유리한 상황일 수 있다. 이는, 예를 들면, FIX의 활성화시 FXIa에 의해 또는 FVIIa/조직 인자(TF)에 의해 활성화될 수 있는 경우이다.In a further aspect, the linker peptide comprises a cleavage site for one or more proteases. This can be achieved by different proteases, or by linker peptides that can be cleaved at the same position by linker peptides providing two or more different cleavage sites. This can be an advantageous situation when the therapeutic fusion protein is activated by proteolytic cleavage to achieve enzymatic activity, and when different proteases can contribute to this activation step. This is the case, for example, when activation of FIX can be activated by FXIa or by FVIIa/tissue factor (TF).

본 발명의 바람직한 양태는, 치료학적 융합 단백질이며, 여기서, 링커는 프로테아제에 의해 절단되고, 응고 인자를 활성화시킴으로써, 링커의 절단이 응고가 일어나는 부위에서 응고 인자의 활성화와 연결되도록 한다.A preferred embodiment of the present invention is a therapeutic fusion protein, wherein the linker is cleaved by a protease, and by activating a clotting factor, the cleavage of the linker is linked to activation of the clotting factor at the site where coagulation occurs.

본 발명에 따른 다른 바람직한 치료학적 융합 단백질은, 링커가 활성화되는 경우 치료학적 융합 단백질의 일부인 응고 인자에 의해 절단가능함으로써 또한 융합 단백질의 절단이 응고 현상과 연결되는 것을 보증하는 것들이다.Other preferred therapeutic fusion proteins according to the present invention are those that are cleavable by coagulation factors that are part of the therapeutic fusion protein when the linker is activated, thereby ensuring that the cleavage of the fusion protein is linked to the coagulation phenomenon.

본 발명에 따른 다른 바람직한 치료학적 융합 단백질은, 링커가 프로테아제에 의해 절단가능하며, 이 자체는 치료학적 융합 단백질의 일부인 응고 인자의 활성에 의해 직접 또는 간접적으로 활성화됨으로써 융합 단백질의 절단이 응고 현상에 연결되도록 보증하는 것들이다.In another preferred therapeutic fusion protein according to the present invention, the linker is cleavable by a protease, which itself is directly or indirectly activated by the activity of a coagulation factor, which is a part of the therapeutic fusion protein, so that the cleavage of the fusion protein is caused by the coagulation phenomenon. These are things that ensure that it is connected.

바람직한 치료학적 융합 단백질의 하나의 부류는, 링커가 FXIa 및/또는 FVIIa/TF에 의해 절단가능하고 응고 인자가 FIX인 것들이다.One class of preferred therapeutic fusion proteins are those in which the linker is cleavable by FXIa and/or FVIIa/TF and the coagulation factor is FIX.

본 발명의 요지는 특히 HLEP로서 비타민 K-의존성 폴리펩타이드 인자 IX, 절단가능한 링커 및 알부민, 및 이의 상응하는 cDNA 서열에 의해 입증된다. 본 발명은 또한 단백질분해적으로 활성화될 수 있거나 다른 효소원 또는 폴리펩타이드의 활성화와 관련이 있는 임의의 다른 응고 인자를 암호화하는 cDNA 서열에 관한 것이다. 이들 cDNA는 사람 혈청 알부민 또는 기타 HLEP를 암호화하는 cDNA 서열에 유전적으로 융합되고, 절단가능한 개재 펩타이드 링커를 암호화하는 올리고뉴클레오타이드에 의해 연결된다. 발현된 치료학적 융합 단백질은 이의 절단가능하지 않은 대응물과 비교하여 증가된 몰 비활성을 나타낸다. 본 발명은 또한 이러한 융합된 cDNA 서열을 함유하는 재조합 발현 벡터, 이러한 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 변형되지 않은 야생형 치료학적 폴리펩타이드와 거의 유사한 생물학적 활성을 가지지만 생체내 반감기가 향상된 재조합 치료학적 융합 단백질 및 유도체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 재조합 폴리펩타이드 및 이의 유도체의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 생체내 생성물 수준을 증가시키는데 유용한 이러한 변형된 DNA 서열을 포함하는, 사람 유전자 치료요법에서 사용하기 위한 전달 벡터를 포함한다.The subject matter of the present invention is demonstrated by vitamin K-dependent polypeptide factor IX, cleavable linker and albumin, and its corresponding cDNA sequence, in particular as HLEP. The invention also relates to a cDNA sequence encoding any other coagulation factor that can be activated proteolytically or is associated with the activation of another enzyme source or polypeptide. These cDNAs are genetically fused to a cDNA sequence encoding human serum albumin or other HLEP and linked by an oligonucleotide encoding a cleavable intervening peptide linker. The expressed therapeutic fusion protein exhibits increased molar specific activity compared to its non-cleavable counterpart. The present invention also relates to a recombinant expression vector containing such a fused cDNA sequence, a host cell transformed with such a recombinant expression vector, a recombinant treatment having almost similar biological activity to an unmodified wild-type therapeutic polypeptide, but with improved half-life in vivo. Fusion proteins and derivatives. The invention also relates to methods of making such recombinant polypeptides and derivatives thereof. The invention also includes delivery vectors for use in human gene therapy, comprising such modified DNA sequences useful for increasing product levels in vivo.

본 발명에 따른 바람직한 치료학적 융합 단백질은 몰 비활성을 갖는, 특히 절단가능한 링커가 없는 치료학적 융합 단백질과 비교하여 하나 이상의 응고-관련 검정시 25% 이상 증가된 몰 비활성을 갖는 것들이다. 이용가능한 상이한 응고-관련 검정 중 하나 이상에서 몰 비활성이 50% 이상 증가된 치료학적 융합 단백질이 보다 바람직하고, 몰 비활성이 100% 이상 증가된 것들이 보다 더 바람직하다.Preferred therapeutic fusion proteins according to the invention are those having a molar specific activity, in particular those having an increased molar specific activity of at least 25% in one or more coagulation-related assays compared to a therapeutic fusion protein without a cleavable linker. In one or more of the different coagulation-related assays available, therapeutic fusion proteins with an increase of at least 50% molar specific activity are more preferred, and even more preferred are those with an increase of at least 100% molar specificity.

본 발명의 추가의 바람직한 양태는, 응고 인자를 반감기 향상 폴리펩타이드에 연결하는 펩타이드 링커의 절단 후 활성화된 응고 인자의 불활성화율이 절단가능한 링커가 없는 상응하는 치료학적 융합 단백질에서의 활성화된 응고 인자의 불활성화율과 비교하여 10% 이상 증가된 치료학적 융합 단백질이다. 불활성화율이 25% 이상 증가된 치료학적 융합 단백질이 보다 바람직하고, 불활성화율이 50% 이상 증가된 것들이 보다 더 바람직하다.In a further preferred embodiment of the present invention, the rate of inactivation of the activated clotting factor after cleavage of the peptide linker linking the clotting factor to the half-life enhancing polypeptide is of the activated clotting factor in the corresponding therapeutic fusion protein without a cleavable linker. It is a therapeutic fusion protein with an increase of at least 10% compared to the rate of inactivation. A therapeutic fusion protein having an increase in inactivation rate of 25% or more is more preferable, and those having an increase in inactivation rate of 50% or more are even more preferable.

본 발명의 추가의 바람직한 양태는, 응고 인자를 반감기 향상 폴리펩타이드에 연결하는 펩타이드 링커의 절단 후 응고 인자의 제거율이 절단가능한 링커가 없는 상응하는 치료학적 융합 단백질에서의 응고 인자의 제거율과 비교하여 10% 이상 증가된 치료학적 융합 단백질이다. 제거율이 25% 이상 증가된 치료학적 융합 단백질이 보다 바람직하고, 제거율이 50% 이상 증가된 것들이 보다 더 바람직하다.
In a further preferred embodiment of the present invention, the removal rate of the coagulation factor after cleavage of the peptide linker connecting the coagulation factor to the half-life enhancing polypeptide is 10 compared to the removal rate of the coagulation factor in the corresponding therapeutic fusion protein without a cleavable linker. It is a therapeutic fusion protein with an increase of at least %. Therapeutic fusion proteins with an increase in clearance by 25% or more are more preferable, and those with an increase in clearance by 50% or more are even more preferable.

비타민 K-의존성 폴리펩타이드Vitamin K-dependent polypeptide

치료학적 폴리펩타이드의 하나의 그룹으로서 비타민 K-의존성 폴리펩타이드는 비타민 K를 보조인자로서 사용하고 간에서 효소적으로 γ-카복실화되는 폴리펩타이드이다. 이러한 비타민 K-의존성 폴리펩타이드는 예를 들면, 인자 II, VII, IX, X, 단백질 C, 단백질 S, GAS6 및 단백질 Z이다.
As a group of therapeutic polypeptides, vitamin K-dependent polypeptides are polypeptides that use vitamin K as a cofactor and are enzymatically γ-carboxylated in the liver. Such vitamin K-dependent polypeptides are, for example, factors II, VII, IX, X, protein C, protein S, GAS6 and protein Z.

사람 FIXPerson FIX

비타민 K-의존성 폴리펩타이드의 그룹 중 하나의 구성원인 사람 FIX는, 간세포에 의해 혈류내로 415개 아미노산의 불활성 효소원으로서 분비되는, 분자량이 57kDa인 단일쇄 당단백질이다. 이는 폴리펩타이드의 N-말단 Gla-도메인내 위치하는 12개의 γ-카복시-글루탐산 잔기를 함유한다. Gla 잔기들은 생합성을 위해 비타민 K를 필요로 한다. Gla 도메인에 이어, 2개의 상피 성장 인자 도메인, 활성화 펩타이드 및 트립신형 세린 프로테아제 도메인이 존재한다. FIX의 추가의 해독후 변형은 하이드록실화(Asp 64), N-(Asn157 및 Asn167), 및 O-형 글리코실화(Ser53, Ser61 , Thr159, Thr169 및 Thr172), 황산화(Tyr155) 및 인산화(Ser158)를 포함한다. FIX는 하나의 디설파이드 브릿지에 의해 함께 유지되는 2개의 폴리펩타이드 쇄, 즉 N-말단 경쇄(18kDa) 및 C-말단 중쇄(28kDa)를 형성하는 Arg145-Ala146 및 Arg180-Val181에서의 활성화 펩타이드의 단백질분해에 의해 이의 활성 형태, 인자 IXa로 전환된다. 인자 IX의 활성화 절단은 예를 들면, 인자 XIa 또는 인자 Vlla/TF에 의해 시험관내에서 달성될 수 있다. 인자 IX는 사람 혈장 속에서 5 내지 10㎍/ml의 농도로 존재한다. 사람에서 인자 IX의 최종 혈장 반감기는 약 15 내지 18시간인 것으로 밝혀졌다[참고: White GC et al. 1997. Recombinant factor IX. Thromb Haemost. 78: 261-265; Ewenstein BM et al. 2002. Pharmacokinetic analysis of plasma-derived and recombinant FIX concentrates in previously treated patients with moderate or severe hemophilia B. Transfusion 42:190-197].Human FIX, a member of the group of vitamin K-dependent polypeptides, is a single-chain glycoprotein with a molecular weight of 57 kDa, secreted by hepatocytes into the bloodstream as an inactive enzyme source of 415 amino acids. It contains 12 γ-carboxy-glutamic acid residues located in the N-terminal Gla-domain of the polypeptide. Gla residues require vitamin K for biosynthesis. Following the Gla domain, there are two epidermal growth factor domains, an activating peptide and a trypsin-like serine protease domain. Further post-translational modifications of FIX include hydroxylation (Asp 64), N-(Asn157 and Asn167), and O-type glycosylation (Ser53, Ser61, Thr159, Thr169 and Thr172), sulfation (Tyr155) and phosphorylation ( Ser158). FIX is the proteolysis of activating peptides in Arg145-Ala146 and Arg180-Val181 forming two polypeptide chains held together by one disulfide bridge, namely the N-terminal light chain (18kDa) and C-terminal heavy chain (28kDa). To its active form, factor IXa. Activation cleavage of factor IX can be accomplished in vitro by, for example, factor XIa or factor Vlla/TF. Factor IX is present in human plasma at a concentration of 5-10 μg/ml. It has been found that the final plasma half-life of factor IX in humans is about 15 to 18 hours [See: White GC et al. 1997. Recombinant factor IX. Thromb Haemost. 78: 261-265; Ewenstein BM et al. 2002. Pharmacokinetic analysis of plasma-derived and recombinant FIX concentrates in previously treated patients with moderate or severe hemophilia B. Transfusion 42:190-197].

혈우병 B는 비-작용성 또는 결손된 인자 IX에 의해 유발되며 혈장으로부터의 인자 IX 농축물 또는 인자 IX의 재조합체 형태를 사용하여 치료한다. 혈우병 B 환자는 흔히 자연발생적인 출혈을 방지하기 위해 인자 IX를 적어도 2주 간격으로 예방적 투여받으므로, 투여된 인자 IX 생성물의 반감기를 증가시킴으로써 투여 사이의 간격을 증가시키는 것이 바람직하다. 혈장 반감기의 향상은 환자에게 큰 잇점을 제공한다. 지금까지 혈장 반감기가 향상된 인자 IX의 약제학적 제제는 시판되고 있지 않고, 또한 생체내 반감기가 연장되고 응고-관련 검정에서 몰 비활성이 거의 변화되지 않은 FIX 변이체를 나타내는 어떠한 데이터도 발표되어 있지 않다. 따라서, 생체내에서 작용성 반감기가 보다 긴 인자 IX의 형태를 개발하기 위한 높은 의학적 요구가 여전히 존재한다.
Hemophilia B is caused by non-acting or defective factor IX and is treated with a factor IX concentrate from plasma or a recombinant form of factor IX. Since hemophilia B patients are often prophylactically administered Factor IX at least two weeks apart to prevent spontaneous bleeding, it is desirable to increase the interval between administrations by increasing the half-life of the administered Factor IX product. Improving the plasma half-life offers great benefits to the patient. To date, no pharmaceutical formulations of factor IX with improved plasma half-life are commercially available, and no data have been published showing FIX variants with prolonged half-life in vivo and little change in molar specific activity in coagulation-related assays. Thus, there is still a high medical need to develop a form of factor IX with a longer functional half-life in vivo.

인자 VII 및 인자 VIIaFactor VII and Factor VIIa

FVII는 406개의 아미노산의 불활성 효소원으로서 혈류내로 간세포에 의해 분비되는, 분자량이 50kDa인 단일쇄 당단백질이다. FVII는 Arg152-Ile153에서 단일 펩타이드 결합의 단백질분해에 의해 이의 활성 형태 인자 VIIa로 전환되어 하나의 이황화물 브릿지에 의해 함께 유지되는 2개의 펩타이드 쇄, N-말단 경쇄(24 kDa) 및 C-말단 중쇄(28 kDa)를 형성한다. 다른 비타민 K-의존성 응고 인자와는 대조적으로, 활성화 펩타이드는 활성화 동안 절단되지 않는다. 인자 VII의 활성화 절단은 시험관내에서 인자 Xa, 인자 IXa, 인자 VIIa, 인자 XIIa, 인자 세븐 활성화 프로테아제[Factor Seven Activating Protease (FSAP)] 및 트롬빈에 의해 달성될 수 있다. 문헌[참조: Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. (1995) 48: 501-505]에는 일부 절단이 또한 중쇄에서 Arg290 및/또는 Arg315에서 발생할 수 있음이 보고되었다. 인자 VII은 혈장 속에 500 ng/ml의 농도로 존재한다. 약 1 % 또는 5 ng/ml의 인자 VII이 활성화된 인자 VIIa로서 존재한다. 인자 VII의 최종 혈장 반감기는 약 4시간이고 인자 VIIa의 반감기는 약 2시간인 것으로 밝혀졌다.FVII is an inactive enzyme source of 406 amino acids, secreted by hepatocytes into the bloodstream, and is a single-chain glycoprotein having a molecular weight of 50 kDa. FVII is converted into its active form factor VIIa by proteolysis of a single peptide bond in Arg152-Ile153 and is held together by one disulfide bridge, two peptide chains, N-terminal light chain (24 kDa) and C-terminal heavy chain. (28 kDa). In contrast to other vitamin K-dependent clotting factors, the activating peptide is not cleaved during activation. Activation cleavage of factor VII can be achieved in vitro by factor Xa, factor IXa, factor VIIa, factor XIIa, Factor Seven Activating Protease (FSAP) and thrombin. See Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. (1995) 48: 501-505] reported that some cleavage may also occur in Arg290 and/or Arg315 in the heavy chain. Factor VII is present in plasma at a concentration of 500 ng/ml. About 1% or 5 ng/ml of factor VII is present as activated factor VIIa. It was found that the final plasma half-life of factor VII is about 4 hours and that of factor VIIa is about 2 hours.

초생리학적(supraphysiological) 농도의 인자 VIIa를 투여함에 의해 인자 VIIIa 및 인자 IXa에 대한 요구를 피하면서 지혈을 달성할 수 있다. 인자 VII에 대한 cDNA의 클로닝(참조: 미국 특허 제4,784,950호)은 활성화된 인자 VII를 약제로서 개발하는 것이 가능하도록 하였다. 인자 VIIa는 1988년에 처음으로 성공적으로 투여되었다. 이후로 인자 VIIa의 적응증의 수는 꾸준히 증가하였으며 이는 출혈을 정지시키기 위한 보편적인 지혈제가 될 수 있는 가능성을 보였다(참조: Erhardtsen, 2002). 그러나, 약 2시간의 인자 VIIa의 짧은 최종 반감기 및 감소된 생체내 회수율은 이의 적용을 제한하고 있다. 따라서, 반감기가 향상되어 있으나, 응고 시작 후 또한 거의 저하되지 않은 몰 비활성, 불활성화 반응속도론 및/또는 제거 반응속도론을 갖는 인자 VIIa의 형태를 개발하기 위한 높은 의학적 요구가 여전히 존재한다.
Hemostasis can be achieved while avoiding the demand for factor VIIIa and factor IXa by administering a supraphysiological concentration of factor VIIa. Cloning of cDNA for Factor VII (see US Pat. No. 4,784,950) made it possible to develop activated Factor VII as a medicament. Factor VIIa was first successfully administered in 1988. Since then, the number of indications for factor VIIa has steadily increased, showing the possibility of becoming a universal hemostatic agent to stop bleeding (Erhardtsen, 2002). However, the short final half-life and reduced in vivo recovery of Factor VIIa of about 2 hours limit its application. Thus, although the half-life is improved, there is still a high medical need to develop a form of factor VIIa that has a molar specific activity, inactivation kinetics and/or elimination kinetics, which is also hardly lowered after the initiation of coagulation.

치료학적 융합 단백질Therapeutic fusion protein

본 발명의 의미에서 "치료학적 융합 단백질"은 사람 또는 동물에게 투여시 예방학적 또는 치료학적 효과를 생성할 수 있는 반감기-향상 폴리펩타이드에 융합된 응고 인자이다. 이러한 치료학적 융합 단백질은 사람 또는 동물에게 정맥내, 근육내, 경구, 국소, 비경구 또는 기타 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 예로서 포함된 치료학적 융합 단백질의 특수 부류는 예를 들면, 알부민 및 면역글로불린과 같은 반감기 향상 폴리펩타이드에 연결된 예를 들면, 비타민 K-의존성 폴리펩타이드와 같은 응고 인자 및 이들의 단편 또는 유도체이다. 표현 "치료학적 융합 단백질"은 "융합 단백질"과 상호교환적으로 사용된다.
"Therapeutic fusion protein" in the meaning of the present invention is a coagulation factor fused to a half-life-enhancing polypeptide that can produce a prophylactic or therapeutic effect when administered to humans or animals. Such therapeutic fusion proteins can be administered to humans or animals by intravenous, intramuscular, oral, topical, parenteral or other routes. For example, a special class of therapeutic fusion proteins included as examples in the present invention include coagulation factors, such as vitamin K-dependent polypeptides, for example linked to half-life enhancing polypeptides such as albumin and immunoglobulins, and Fragments or derivatives thereof. The expression “therapeutic fusion protein” is used interchangeably with “fusion protein”.

반감기 향상 폴리펩타이드(HLEP)Half-life enhancing polypeptide (HLEP)

알부민, 알부민계열 구성원 및 면역글로불린 및 이들의 단편 또는 유도체는 상기에 반감기 향상 폴리펩타이드(HLEP)로서 기술되어 있다. 용어 "사람 혈청 알부민"(HSA) 및 "사람 알부민"(HA)은 본 출원에서 상호교환적으로 사용된다. 용어 "알부민" 및 "혈청 알부민"은 보다 광범위하며 사람 혈청 알부민(및 이의 단편 및 변이체) 및 다른 종으로부터의 알부민(및 이의 단편 및 변이체)를 포함한다.Albumin, albumin family members and immunoglobulins and fragments or derivatives thereof are described above as half-life enhancing polypeptides (HLEP). The terms “human serum albumin” (HSA) and “human albumin” (HA) are used interchangeably in this application. The terms “albumin” and “serum albumin” are broader and include human serum albumin (and fragments and variants thereof) and albumin from other species (and fragments and variants thereof).

본원에 사용된 것으로서, "알부민"은 알부민 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열, 또는 알부민의 하나 이상의 작용 활성(예를 들면, 생물학적 활성)을 갖는 알부민 단편 또는 변이체를 총칭한다. 특히, "알부민"은 사람 알부민 또는 이의 단편, 특히 본원에서 서열번호 1로 나타낸 사람 알부민의 성숙한 형태 또는 이의 다른 척추동물로부터의 알부민 또는 이의 단편, 또는 이들 분자의 유사체 또는 변이체 또는 이의 단편을 말한다.As used herein, “albumin” refers to an albumin polypeptide or amino acid sequence, or an albumin fragment or variant having one or more agonistic activities (eg, biological activity) of albumin. In particular, "albumin" refers to human albumin or a fragment thereof, in particular the mature form of human albumin represented by SEQ ID NO: 1 herein or albumin or fragments thereof from other vertebrates thereof, or analogs or variants or fragments thereof of these molecules.

알부민 융합 단백질의 알부민 부위는 위에서 기술한 바와 같은 완전한 길이의 HA 서열을 포함할 수 있거나, 또는 치료학적 활성을 안정화시키거나 연장시킬 수 있는 하나 이상의 이의 단편을 포함할 수 있다. 이러한 단편은, 길이가 10개 이상의 아미노산일 수 있거나 HA 서열로부터 약 15, 20, 25, 30, 50개 또는 그 이상의 연속된 아미노산을 포함할 수 있거나 또는 HA의 특수 도메인 중 일부 또는 모두를 포함할 수 있다.The albumin portion of the albumin fusion protein may comprise the full length HA sequence as described above, or may comprise one or more fragments thereof capable of stabilizing or prolonging therapeutic activity. Such fragments may be 10 or more amino acids in length, or may comprise about 15, 20, 25, 30, 50 or more contiguous amino acids from the HA sequence, or may comprise some or all of the special domains of HA. I can.

본 발명의 알부민 융합 단백질의 알부민 부위는 천연 또는 인공의 정상 HA의 변이체일 수 있다. 본 발명의 융합 단백질의 치료학적 폴리펩타이드 부위는 또한 본원에 기술된 것으로서 상응하는 치료학적 폴리펩타이드의 변이체일 수 있다. 용어 "변이체"는 보존적 또는 비-보존적이고, 천연 또는 인공적인 삽입, 결실 및 치환을 포함하며, 여기서, 이러한 변화는 치료학적 폴리펩타이드의 치료학적 활성을 부여하는 활성 도메인 또는 활성 부위를 실질적으로 변경시키지 않는다.The albumin moiety of the albumin fusion protein of the present invention may be a variant of natural or artificial normal HA. The therapeutic polypeptide moiety of the fusion protein of the invention may also be a variant of the corresponding therapeutic polypeptide as described herein. The term “variant” includes conservative or non-conservative, natural or artificial insertions, deletions and substitutions, wherein such changes substantially impart the therapeutic activity of the therapeutic polypeptide to the active domain or active site. Do not change.

특히, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 사람 알부민의 천연 다형성 변이체 및 사람 알부민의 단편을 포함할 수 있다. 알부민은 어떠한 척추동물, 특히 어떠한 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 양 또는 돼지로부터 유래할 수 있다. 비-포유동물 알부민은 암닭 및 연어를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 알부민-연결된 폴리펩타이드의 알부민 부위는 치료학적 폴리펩타이드 부위와는 상이한 동물로부터 유래할 수 있다.In particular, the albumin fusion protein of the present invention may include a natural polymorphic variant of human albumin and a fragment of human albumin. Albumin can be derived from any vertebrate, in particular any mammal, for example humans, cattle, sheep or pigs. Non-mammalian albumin includes, but is not limited to, hens and salmon. The albumin moiety of the albumin-linked polypeptide can be from a different animal than the therapeutic polypeptide moiety.

일반적으로 말해서, 알부민 단편 또는 변이체는, 길이가 10개 이상, 바람직하게는 40개 이상, 가장 바람직하게는 70개 이상의 아미노산일 것이다. 알부민 변이체는 알부민의 하나 이상의 전체 도메인 또는 당해 도메인의 단편, 예를 들면, 도메인 1(서열번호 1의 아미노산 1번 내지 194번), 도메인 2(서열번호 1의 아미노산 195번 내지 387번), 도메인 3(서열번호 1의 아미노산 388번 내지 585번), 도메인 1 + 2(서열번호 1의 아미노산 1번 내지 387번), 도메인 2 + 3(서열번호 1의 195번 내지 585번) 또는 도메인 1 + 3(서열번호 1의 아미노산 1번 내지 194번 + 서열번호 1의 아미노산 388번 내지 585번)으로 우선적으로 이루어지거나, 또는 이들을 포함할 수 있다. 각각의 도메인 자체는 2개의 동종 하위도메인(subdomain), 즉 1번 내지 105번, 120번 내지 194번, 195번 내지 291번, 316번 내지 387번, 388번 내지 491번 및 512번 내지 585번과, 잔기 Lys106 내지 Glu119, Glu292 내지 Val315, 및 Glu492 내지 Ala511를 포함하는 유연성 하위도메인간(inter-subdomain) 링커 영역으로 이루어져 있다.Generally speaking, the albumin fragment or variant will be at least 10, preferably at least 40, most preferably at least 70 amino acids in length. Albumin variants include one or more whole domains of albumin or fragments of the domain, for example, domain 1 (amino acids 1 to 194 of SEQ ID NO: 1), domain 2 (amino acids 195 to 387 of SEQ ID NO: 1), domain 3 (amino acids 388 to 585 of SEQ ID NO: 1), domain 1 + 2 (amino acids 1 to 387 of SEQ ID NO: 1), domain 2 + 3 (195 to 585 of SEQ ID NO: 1) or domain 1 + 3 (amino acids 1 to 194 of SEQ ID NO: 1 + amino acids 388 to 585 of SEQ ID NO: 1), or may include these. Each domain itself has two homogeneous subdomains: 1 to 105, 120 to 194, 195 to 291, 316 to 387, 388 to 491 and 512 to 585 And, it consists of a flexible inter-subdomain linker region containing residues Lys106 to Glu119, Glu292 to Val315, and Glu492 to Ala511.

본 발명의 알부민 융합 단백질의 알부민 부위는 HA의 하나 이상의 하위도메인 또는 도메인 또는 이의 보존적 변형을 포함할 수 있다.The albumin portion of the albumin fusion protein of the present invention may comprise one or more subdomains or domains of HA or conservative modifications thereof.

알부민의 모든 단편 및 변이체는, 이들이 융합되지 않은 응고 인자와 비교하여 혈장 속에서 치료학적 융합 단백질의 반감기를 25% 이상 연장시키는 한, 응고 인자의 융합 파트너로서 본 발명에 포함된다.All fragments and variants of albumin are included in the present invention as fusion partners of coagulation factors, so long as they extend the half-life of the therapeutic fusion protein in plasma by at least 25% compared to the coagulation factor to which it is not fused.

알부민 외에, 알부민 계열의 다른 구성원인 알파-페토단백질도 생체내에서 부착된 치료학적 폴리펩타이드의 반감기를 향상시키는데 청구되어 왔다(참조: 제WO 2005/024044호). 혈청 수송 단백질과 진화적으로 관련된 단백질의 알부민 계열은 알부민, 알파-페토단백질(AFP; 참조: Beattie & Dugaiczyk 1982. Gene 20:415-422), 알프만(AFM; 참조: Lichenstein et al. 1994. J. Biol. Chem. 269:18149-18154) 및 비타민 D 결합 단백질(DBP; 참조: Cooke & David 1985. J. Clin. Invest. 76:2420-2424)로 이루어져 있다. 이들의 유전자는 사람, 마우스 및 랫트에서 동일한 염색체 영역에 맵핑하는 구조 및 작용 유사성을 지닌 다중유전자 클러스터를 나타낸다. 알부민 계열 구성원의 구조적 유사성은 HLEP로서의 이들의 유용성을 시사한다. 따라서, 본 발명의 다른 목적은 HLEP로서 이러한 알부민 계열 구성원, 이의 단편 및 변이체를 사용하는 것이다. 용어 "변이체"는, 목적한 작용이 여전히 존재하는 한, 보존성 또는 비-보존성인 삽입, 결실 및 치환을 포함한다.In addition to albumin, another member of the albumin family, alpha-fetoprotein, has also been claimed to improve the half-life of attached therapeutic polypeptides in vivo (see WO 2005/024044). The albumin family of proteins that are evolutionarily related to serum transport proteins are albumin, alpha-fetoprotein (AFP; see: Beattie & Dugaiczyk 1982. Gene 20:415-422), Alpman (AFM; see: Lichenstein et al. 1994. J. Biol. Chem. 269:18149-18154) and vitamin D binding protein (DBP; see Cooke & David 1985. J. Clin. Invest. 76:2420-2424). Their genes represent multigene clusters with structural and functional similarities that map to the same chromosomal region in humans, mice and rats. The structural similarity of albumin family members suggests their usefulness as HLEPs. Accordingly, another object of the present invention is to use such albumin family members, fragments and variants thereof as HLEP. The term “variant” includes insertions, deletions and substitutions that are conservative or non-conservative, as long as the desired action still exists.

알부민 계열 구성원은 완전한 길이의 각각의 단백질 AFP, AFM 및 DBP를 포함할 수 있거나, 또는 치료학적 활성을 안정화시키거나 연장시킬 수 있는 이의 하나 이상의 단편을 포함할 수 있다. 이러한 단편은, 길이가 10개 이상인 아미노산일 수 있거나 또는 각각의 단백질 서열의 약 15, 20, 25, 30, 50개 이상의 연속된 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 HLEP 단편이 융합되지 않은 응고 인자와 비교하여 25% 이상의 반감기 연장을 제공하는 한, 각각의 단백질의 특정 도메인의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. 본 발명의 치료학적 융합 단백질의 알부민 계열 구성원은 AFP, AFM 및 DBP의 천연 다형성 변이체를 포함할 수 있다.Albumin family members may comprise the full length of each of the proteins AFP, AFM and DBP, or may comprise one or more fragments thereof capable of stabilizing or prolonging therapeutic activity. Such fragments may be 10 or more amino acids in length, or may comprise about 15, 20, 25, 30, 50 or more contiguous amino acids of each protein sequence, or the HLEP fragment with an unfused coagulation factor It may include some or all of the specific domains of each protein, as long as it provides a half-life extension of at least 25% by comparison. Albumin family members of the therapeutic fusion proteins of the present invention may include natural polymorphic variants of AFP, AFM and DBP.

IgG 및 IgG-단편은, HLEP 단편이 융합되지 않은 응고 인자와 비교하여 25% 이상의 반감기 연장을 제공하는 한, HLEP로서 사용될 수 있다. 치료학적 폴리펩타이드 부위는 융합 단백질의 높은 몰 비활성을 허용하는 절단가능한 링커를 통해 IgG 또는 IgG 단편에 연결된다. 인자 VII/VIIa 및 인자 IX IgG 융합 분자에 대한 예는 전문이 본원에 참조로 인용된 제WO 2005/001025호에서 발견된다. 이는 예를 들면 2개의 인자 VII(인자 VIIa) 분자 및 2개의 Fc 분자로 이루어진 동종이량체 및 하나의 FVII(FVIIa) 분자 및 2개의 Fc 분자로 이루어진 단량체/이량체 하이브리드를 기술하고 있으며, 단량체/이량체는 동종이량체보다 약 4배 이상 높은 응고 활성을 나타낸다. 예를 들면, FXIa, FXa 또는 FIXa와 같은 응고 캐스캐이드의 프로테아제에 의한 절단시 FVII(FVIIa) 분자를 유리시키는 본 발명의 링커 서열은 작제물의 응고 활성 및 특히 동종이량체의 응고 활성을 단량체/이량체와 유사한 활성 수준으로 또는 보다 더 높게 상승시킬 수 있다. 절단가능한 링커를 갖는 FIX-Fc 융합 단백질은 서열번호 93에 예시적으로 나타낸다. 표 3a 및 3b에 나타낸 것들과 같은 절단가능한 링커를 이 경우에 적용시킬 수 있다.IgG and IgG-fragments can be used as HLEP as long as the HLEP fragment provides a half-life extension of at least 25% compared to an unfused coagulation factor. The therapeutic polypeptide moiety is linked to the IgG or IgG fragment through a cleavable linker that allows high molar specific activity of the fusion protein. Examples for Factor VII/VIIa and Factor IX IgG fusion molecules are found in WO 2005/001025, which is incorporated herein by reference in its entirety. It describes, for example, a homodimer consisting of two Factor VII (factor VIIa) molecules and two Fc molecules and a monomer/dimer hybrid consisting of one FVII (FVIIa) molecule and two Fc molecules, and monomer/dimer hybridization. The dimer exhibits about 4 times higher coagulation activity than the homodimer. For example, the linker sequence of the present invention that releases the FVII (FVIIa) molecule upon cleavage of the coagulation cascade such as FXIa, FXa or FIXa by a protease, the coagulation activity of the construct and in particular the coagulation activity of / Can be raised to a level of activity similar to that of a dimer or higher. The FIX-Fc fusion protein with a cleavable linker is exemplarily shown in SEQ ID NO: 93. Cleavable linkers such as those shown in Tables 3a and 3b can be applied in this case.

본 발명은 상세하게는 HLEP의 N- 또는 C-말단에 응고 인자 또는 이의 단편 또는 변이체를 연결시킴으로써 절단가능한 개재 펩타이드 링커가 치료학적 폴리펩타이드 및 HLEP 사이에 도입되도록 함으로써 형성된 융합 단백질이 HLEP에 연결되지 않은 응고 인자와 비교하여 생체내 반감기가 증가되어 있고 융합 단백질이 이용가능한 상이한 응고-관련 검정 중 하나 이상에서 절단가능하지 않은 링커를 갖는 상응하는 융합 단백질과 비교하여 25% 이상 높은 몰 비활성을 갖는 융합 단백질에 관한 것이다.The present invention is specifically directed to the introduction of a cleavable intervening peptide linker between the therapeutic polypeptide and the HLEP by linking a coagulation factor or a fragment or variant thereof to the N- or C-terminus of HLEP so that the formed fusion protein is not linked to HLEP. A fusion with an increased in vivo half-life compared to a non-coagulation factor and a molar specific activity greater than 25% compared to a corresponding fusion protein with a linker that is not cleavable in one or more of the different coagulation-related assays for which the fusion protein is available. It's about protein.

본원에서 사용된 것으로서 "응고 인자"는 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 폰 빌레브란트(von Willebrand) 인자, 인자 V, 인자 X, 인자 Xl, 인자 XII, 인자 XIII, 인자 II 인자 II(프로트롬빈), 단백질 C, 단백질 S, GAS6 또는 단백질 Z, 및 이들의 활성화 형태를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 유용한 치료학적 폴리펩타이드는 야생형 폴리펩타이드일 수 있거나 돌연변이를 함유할 수 있다. 글리코실화 또는 다른 해독 후 변형의 정도 및 위치는 선택된 숙주 세포 및 숙주 세포 환경의 특성에 따라 변할 수 있다. 특정 아미노산 서열을 언급하는 경우, 이러한 서열의 해독후 변형은 본원에 포함된다.As used herein, "coagulation factor" refers to factor IX, factor VII, factor VIII, von Willebrand factor, factor V, factor X, factor Xl, factor XII, factor XIII, factor II factor II (prothrombin) , Protein C, protein S, GAS6 or protein Z, and their activated forms. In addition, useful therapeutic polypeptides may be wild-type polypeptides or may contain mutations. The extent and location of glycosylation or other post-translational modifications can vary depending on the nature of the host cell selected and the host cell environment. When referring to a specific amino acid sequence, post-translational modifications of such sequence are included herein.

상기 정의내 "응고 인자"는 특정의 천연 다형성을 포함하는 천연의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이는 또한 약간 변형된 아미노산 서열, 예를 들면, 폴리펩타이드가 각각의 치료학적 폴리펩타이드의 활성을 실질적으로 유지하는 한, 말단 아미노산 결실 또는 부가를 포함하는 변형된 N-말단 또는 C-말단을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 포함된 변이체는 야생형 서열과는 하나 이상의 아미노산 잔기에 있어 상이하다. 이러한 차이점의 예는 하나 이상의 아미노산 잔기(예를 들면, 바람직하게는 1 내지 30개의 아미노산 잔기)에 의해 N- 및/또는 C-말단의 절두(trunction), 또는 N- 및/또는 C-말단에서 하나 이상의 여분의 잔기의 부가, 및 연속된 아미노산 치환, 즉, 유사한 특성을 갖는 아미노산, 예를 들면, (1) 작은 아미노산, (2) 산성 아미노산, (3) 극성 아미노산, (4) 염기성 아미노산, (5) 소수성 아미노산 및 (6) 방향족 아미노산의 그룹내에서 수행된 치환을 포함할 수 있다. 이러한 보존적 치환의 예는 하기 표에 나타낸다.“Coagulation factor” within the above definition includes polypeptides having a natural amino acid sequence, including certain natural polymorphisms. It may also be of a slightly modified amino acid sequence, e.g., a poly with a modified N-terminus or C-terminus, including terminal amino acid deletions or additions, as long as the polypeptide substantially retains the activity of the respective therapeutic polypeptide. Contains peptides. Included variants differ from the wild-type sequence in one or more amino acid residues. Examples of such differences are the trunction of the N- and/or C-terminus by one or more amino acid residues (e.g., preferably 1 to 30 amino acid residues), or at the N- and/or C-terminus. The addition of one or more extra residues, and consecutive amino acid substitutions, i.e. amino acids with similar properties, such as (1) small amino acids, (2) acidic amino acids, (3) polar amino acids, (4) basic amino acids, Substitutions made within the group of (5) hydrophobic amino acids and (6) aromatic amino acids. Examples of such conservative substitutions are shown in the table below.

[표 1][Table 1]

최종 반감기 또는 β-반감기로서 일반적으로 측정된, 본 발명의 융합 단백질의 생체내 반감기는 융합되지 않은 폴리펩타이드의 생체내 반감기보다 일반적으로 약 25% 이상, 바람직하게는 약 50% 이상, 보다 바람직하게는 100% 이상 더 높다.The in vivo half-life of the fusion protein of the present invention, generally measured as the final half-life or β-half-life, is generally at least about 25%, preferably at least about 50%, more preferably than the in vivo half-life of the unfused polypeptide. Is more than 100% higher.

본 발명의 융합 단백질은 절단가능한 링커가 없는 상응하는 융합 단백질과 비교하여 25% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 100% 이상 증가된 몰 비활성을 갖는다.The fusion proteins of the invention have an increased molar specificity of at least 25%, preferably at least 50%, more preferably at least 100% compared to the corresponding fusion protein without a cleavable linker.

이와 관련하여, 몰 비활성(또는 본원에서 특히 고려하는 것으로서 응고-관련 몰 비활성)은 목적한 치료학적 폴리펩타이드 또는 치료학적 융합 단백질의 몰(또는 예를 들면, 나노몰)당 발현된 활성으로 정의된다. 몰 비활성의 계산은 연구된 폴리펩타이드의 광학 밀도 또는 상이한 분자량에 의해 영향받지 않는 상이한 작제물의 활성의 직접적인 비교를 가능하게 한다. 몰 비활성은 FIX 및 FIX-HSA 융합 단백질에 대해 하기 표 2에 예시된 바와 같이 계산할 수 있다.In this regard, molar specific activity (or coagulation-related molar specific activity as specifically contemplated herein) is defined as the activity expressed per mole (or, for example, nanomolar) of the therapeutic polypeptide or therapeutic fusion protein of interest. . Calculation of the molar specific activity allows a direct comparison of the activities of different constructs that are not affected by the optical density or different molecular weights of the studied polypeptides. Molar specificity can be calculated as illustrated in Table 2 below for the FIX and FIX-HSA fusion proteins.

[표 2][Table 2]

응고-관련 몰 비활성을 측정하기 위하여, 응고 과정과 관련된 효소 또는 보조인자 활성을 측정하는 어떠한 검정도 사용할 수 있다.To determine coagulation-related molar specific activity, any assay that measures enzyme or cofactor activity associated with the coagulation process can be used.

따라서, 본 발명의 의미에서 "응고-관련 검정"은 응고 과정에서 관련있는 효소적 활성 또는 보조인자 활성을 측정하거나 또는 내인성 또는 외인성 응고 캐스캐이드가 활성화되는지를 측정할 수 있는 임의의 검정이다. 따라서, "응고-관련" 검정은 aPTT, PT 또는 트롬빈 생성 검정과 같은 직접적인 응고 검정일 수 있다. 그러나, 예를 들어 특정 응고 인자에 적용된 비색 검정(chromogenic assay)과 같은 다른 검정도 또한 포함된다. 이러한 검정 또는 상응하는 시약의 예는 Pathromtin^® SL (aPTT 검정, 제조원: Dade Behring) 또는 Thromborel^® S (프로트롬빈 시간 검정, 제조원: Dade Behring) 및 상응하는 응고 인자 결여 혈장(제조원: Dade Behring), 예를 들면, 응고 인자 결여 혈장을 사용하는 트롬빈 생성 검정 키트(제조원: Technoclone, Thrombinoscope), 바이오펜 인자 IX와 같은 비색 검정(제조원: Hyphen BioMed), Staclot^® FVIIa-rTF(제조원: Roche Diagnostics GmbH), Coatest^® 인자 VIII:C/4 (제조원: Chromogenix) 등이 있다.Thus, a “coagulation-related assay” in the sense of the present invention is any assay capable of measuring the enzymatic activity or cofactor activity involved in the coagulation process or whether an endogenous or exogenous coagulation cascade is activated. Thus, the “coagulation-related” assay can be a direct coagulation assay such as an aPTT, PT or thrombin generation assay. However, other assays are also included, such as, for example, a chromogenic assay applied to a specific coagulation factor. Examples of such assays or corresponding reagents include Pathromtin ^® SL (aPTT assay, Dade Behring) or Thromborel ^® S (prothrombin time assay, Dade Behring) and corresponding clotting factor-deficient plasma (Dade Behring), e.g. For example, a thrombin generation assay kit (manufactured by Technoclone, Thrombinoscope) using plasma without clotting factor, a colorimetric assay such as biopen factor IX (manufactured by Hyphen BioMed), Staclot ^® FVIIa-rTF (manufactured by Roche Diagnostics GmbH), Coatest ^® Factor VIII:C/4 (manufactured by Chromogenix).

본 발명의 목적상, 상기 검정 중 어느 하나 또는 동등한 응고-관련 검정에서의 증가는 몰 비활성에 있어서의 증가를 나타내는 것으로 고려된다. 예를 들어, 25% 증가는 상기 중 어느 것 또는 동등한 검정에서 25% 증가를 말한다.For the purposes of the present invention, an increase in either of the above assays or an equivalent coagulation-related assay is considered to indicate an increase in molar specificity. For example, a 25% increase refers to a 25% increase in any of the above or equivalent assays.

치료학적 융합 단백질이 본 발명의 범위내에 속하는지를 측정하기 위해, 이들 단백질의 몰 비활성을 비교하는 표준물은, 각각의 응고 인자 및 각각의 HLEP가 아미노산 서열 GGGGGGV를 갖는 절단가능하지 않은 링커로 연결된 작제물이다.To determine if a therapeutic fusion protein falls within the scope of the present invention, a standard comparing the molar specific activity of these proteins is a method in which each coagulation factor and each HLEP are linked by a non-cleavable linker having the amino acid sequence GGGGGGV. It's a sacrifice.

FIX의 경우에, aPTT 검정은 흔히 응고 활성을 측정하는데 사용된다. 이러한 응고 검정(aPTT 검정)은 실시예 5에 보다 상세히 기술되어 있다. 그러나, 다른 응고-관련 검정 또는 검정 원리를 적용하여 FIX에 대한 몰 비활성을 측정할 수 있다.In the case of FIX, the aPTT assay is often used to measure coagulation activity. This coagulation assay (aPTT assay) is described in more detail in Example 5. However, other coagulation-related assays or assay principles can be applied to determine the molar specificity for FIX.

재조합 치료학적 폴리펩타이드 약물은 일반적으로 고가이며 모든 나라가 이러한 약물을 기초로 한 고가의 치료요법을 제공할 수 있는 것은 아니다. 이러한 약물의 생체내 회수를 증가시키는 것은 이들 생성물을 저가로 사용할 수 있게 하며 후속적으로 보다 많은 환자가 이로부터 이익을 얻도록 한다. 본 발명의 융합 단백질의 경우에, 증가된 생체내 회수율은 또한 바람직한 장점일 수 있다. 본 발명의 의미에서 "생체내 회수율"은 생성물의 투여 직후 혈액 또는 혈장에서 발견되는 생성물의 양을 의미한다. 따라서, 일반적으로 생체내 회수의 검출을 위해 생성물의 투여 후 수분(예를 들면, 5분 또는 15분)내에 혈장 성분을 측정한다.Recombinant therapeutic polypeptide drugs are generally expensive and not all countries are able to offer expensive therapies based on these drugs. Increasing the in vivo recovery of these drugs makes these products available inexpensively and subsequently allows more patients to benefit from them. In the case of the fusion proteins of the present invention, increased in vivo recovery may also be a desirable advantage. "In vivo recovery rate" in the sense of the present invention means the amount of a product found in blood or plasma immediately after administration of the product. Therefore, plasma components are generally measured within minutes (eg, 5 minutes or 15 minutes) after administration of the product for detection of recovery in vivo.

비록 활성화되지 않은 응고 인자에 대한 생체내 회수율이 높고 반감기가 긴 것이 바람직하다고 해도, 혈전촉진 위험을 피하기 위하여 이의 활성화 또는 이의 보조-인자의 활성화후 응고 인자의 반감기를 제한하는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 응고 과정이 개시된 후, 활성 응고 인자의 반감기는 다시 감소될 수 있다. 이는 응고-관련 방식에 있어서 불활성화를 향상시키거나 또는 응고 인자를 제거함에 의해 달성할 수 있다.Although it is desirable to have a high in vivo recovery rate for an inactivated clotting factor and a long half-life, it may be advantageous to limit the half-life of the clotting factor after its activation or its co-factor activation in order to avoid the risk of thrombosis. Thus, after the coagulation process is initiated, the half-life of the active coagulation factor can be reduced again. This can be achieved by enhancing inactivation in a coagulation-related manner or by removing coagulation factors.

본 발명에 따른 불활성화는 예를 들면, 응고 인자 또는 상응하는 응고 인자의 억제제의 복합체 형성에 의해 또는 예를 들면, FVIII 및 FV의 경우에 공지된 추가의 단백질분해 절단에 의해 유발될 수 있는 치료학적 폴리펩타이드의 활성의 감소를 의미한다.Inactivation according to the invention can be caused, for example, by complex formation of coagulation factors or inhibitors of the corresponding coagulation factors or by further proteolytic cleavage known, for example in the case of FVIII and FV. Refers to a decrease in the activity of a biological polypeptide.

활성화된 치료학적 융합 단백질의 불활성화율은 활성이 예를 들면, 억제제와의 반응 또는 단백질분해적 불활성화에 의해 감소되는 비율로 정의된다. 불활성화율은, 이러한 응고 인자의 억제제의 생리학적 양의 존재하에, 활성화된 응고 인자의 몰 비활성을 시간에 걸쳐 추적하여 측정될 수 있다. 또는, 불활성화율은 활성화된 생성물을 동물에 투여한 후 활성 및 항원 검정을 사용하여 적절한 시간 간격으로 혈장 샘플을 시험함으로써 측정할 수 있다.The rate of inactivation of an activated therapeutic fusion protein is defined as the rate at which the activity is reduced, for example by reaction with an inhibitor or by proteolytic inactivation. The rate of inactivation can be determined by tracking the molar specific activity of the activated clotting factor over time in the presence of a physiological amount of an inhibitor of this clotting factor. Alternatively, the rate of inactivation can be determined by administering the activated product to the animal and then testing the plasma sample at appropriate time intervals using an activity and antigen assay.

치료학적 융합 단백질의 경우 이들 단백질이 본 발명의 범위에 속하는지에 대한 측정이 요구되는 경우에, 이들 치료학적 단백질의 불활성화율을 비교하는 표준물은, 각각의 응고 인자 및 각각의 HLEP가 아미노산 서열 GGGGGGV를 갖는 절단가능하지 않은 링커에 의해 연결된 작제물이다.In the case of therapeutic fusion proteins, when it is desired to determine whether these proteins fall within the scope of the present invention, the standard for comparing the inactivation rates of these therapeutic proteins is the amino acid sequence GGGGGGV for each coagulation factor and each HLEP. It is a construct linked by a non-cleavable linker having

활성화된 치료학적 융합 단백질의 제거율은 사람 또는 동물의 순환계로부터 폴리펩타이드가 제거되는 비율로 정의된다. 제거율은 정맥내 투여 후 활성화된 치료학적 융합 단백질의 약력학을 측정함으로써 측정할 수 있다. 항원 검정을 사용하여, 순환계로부터 직접적인 제거에 의한 제거를 측정할 수 있다. 또한 활성 검정을 사용하여, 특이적 제거 및 불활성화율을 측정할 수 있다.The removal rate of an activated therapeutic fusion protein is defined as the rate at which a polypeptide is removed from the human or animal circulatory system. The clearance rate can be measured by measuring the pharmacodynamics of the activated therapeutic fusion protein after intravenous administration. Antigen assays can be used to measure clearance by direct clearance from the circulation. In addition, activity assays can be used to determine specific clearance and inactivation rates.

치료학적 융합 단백질의 경우, 이들 단백질이 본 발명의 범위에 속하는지를 측정하는 것이 요구되는 경우, 이들 단백질의 제거율을 비교하는 표준물은, 각각의 응고 인자 및 각각의 HLEP가 아미노산 서열 GGGGGGV를 갖는 절단가능하지 않은 링커에 의해 연결된 작제물이다.In the case of therapeutic fusion proteins, when it is desired to determine whether these proteins fall within the scope of the present invention, a standard comparing the clearance of these proteins is a cleavage in which each coagulation factor and each HLEP have the amino acid sequence GGGGGGV. It is a construct linked by a linker that is not possible.

본 발명에 있어서, 치료학적 폴리펩타이드 잔기는 절단가능한 펩타이드 링커에 의해 HLEP 잔기에 커플링된다. 당해 링커는 비-면역원성이어야 하며 프로테아제에 의한 절단을 허용하기에 충분하도록 유연성이어야 한다. 링커의 절단은, 융합 단백질이 효소원인 경우, 융합 단백질내 치료학적 폴리펩타이드의 활성화와 같이 비교가능하게 신속히 진행되어야 한다.In the present invention, the therapeutic polypeptide moiety is coupled to the HLEP moiety by a cleavable peptide linker. This linker must be non-immunogenic and must be flexible enough to allow cleavage by the protease. The cleavage of the linker should proceed relatively quickly, such as activation of the therapeutic polypeptide in the fusion protein, if the fusion protein is the enzyme source.

절단가능한 링커는 바람직하게는The cleavable linker is preferably

a) 치료학적 폴리펩타이드의 활성화 동안 단백질분해적으로 절단되는 단백질분해 절단 부위를 함유하는 경우 투여될 치료학적 폴리펩타이드 자체,a) the therapeutic polypeptide itself to be administered if it contains a proteolytic cleavage site that is proteolytically cleaved during activation of the therapeutic polypeptide,

b) 상기 치료학적 폴리펩타이드의 기질 폴리펩타이드, 또는b) a substrate polypeptide of the therapeutic polypeptide, or

c) 상기 치료학적 폴리펩타이드의 직접적인 또는 간접적인 관련에 의해 활성화되거나 또는 형성되는 프로테아제에 의해 절단된 기질 폴리펩타이드c) a substrate polypeptide cleaved by a protease that is activated or formed by direct or indirect involvement of the therapeutic polypeptide.

로부터 유래한 서열을 포함한다.It includes a sequence derived from.

보다 바람직한 양태에서 링커 영역은 적용될 치료학적 폴리펩타이드의 서열을 포함하며, 이는 발현된 융합 단백질의 신생항원 특성의 위험을 감소시켜야 한다. 또한, 치료학적 단백질이 효소원인 경우(예를 들면, 단백질분해적으로 활성화될 필요가 있는 경우) 펩타이드 링커 절단의 반응속도론은 효소원의 응고-관련 활성화 반응속도론을 보다 밀접하게 반영할 것이다.In a more preferred embodiment the linker region comprises the sequence of the therapeutic polypeptide to be applied, which should reduce the risk of neoantigenic properties of the expressed fusion protein. In addition, if the therapeutic protein is an enzymatic source (eg, if it needs to be activated proteolytically), the kinetics of peptide linker cleavage will more closely reflect the coagulation-related activation kinetics of the enzymatic source.

바람직한 양태에서, 치료학적 폴리펩타이드는 FIX 효소원이며 HLEP는 알부민이다. 이러한 경우, 링커 서열은 FIX의 활성화 영역의 서열로부터, FX 또는 FVII와 같은 FIX의 특정 기질의 절단 영역으로부터 또는 활성화시 FIXa가 포함되는 프로테아제에 의해 절단된 임의의 기질 폴리펩타이드의 절단 영역으로부터도 유래한다.In a preferred embodiment, the therapeutic polypeptide is a FIX enzyme source and HLEP is albumin. In this case, the linker sequence is derived from the sequence of the activation region of FIX, from the cleavage region of a specific substrate of FIX such as FX or FVII, or from the cleavage region of any substrate polypeptide cleaved by a protease containing FIXa upon activation. do.

매우 바람직한 양태에서, 링커 펩타이드는 FIX 자체로부터 유래한다. 다른 바람직한 양태에서, 링커 펩타이드는 FX 또는 FVII로부터 유래한다. 다른 바람직한 양태에서, 링커 서열은 FIX의 2개의 생리학적으로 관련된 활성인자인, FXIa 또는 FVIIa/TF에 의해 절단될 수 있는 2개의 절단 서열을 포함한다.In a very preferred embodiment, the linker peptide is derived from FIX itself. In another preferred embodiment, the linker peptide is derived from FX or FVII. In another preferred embodiment, the linker sequence comprises two cleavable sequences capable of being cleaved by two physiologically related activators of FIX, FXIa or FVIIa/TF.

치료학적 폴리펩타이드, 절단가능한 링커 및 HLEP의 예시적인 조합은 표 3a 및 3b에 열거한 작제물을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.Exemplary combinations of therapeutic polypeptides, cleavable linkers and HLEPs include, but are not limited to, the constructs listed in Tables 3a and 3b.

[표 3a][Table 3a]

FIX 활성화 펩타이드의 N-말단 영역으로부터 유래한 링커의 경우에, 천연 다형성 T148-A148에 따라서 서열은 또한 당해 위치에서 T 대신 A를 함유할 수 있다.In the case of a linker derived from the N-terminal region of the FIX activating peptide, the sequence according to the natural polymorphism T148-A148 may also contain A instead of T at this position.

[표 3b][Table 3b]

기술된 링커의 변이체 및 단편은 또한, 링커가 표 3a 또는 3b의 링커를 절단하는 프로테아제 또는 프로테아제들에 의해, 또는 위에서 정의한 프로테아제들의 유형에 의해 여전히 분해될 수 있는 한, 본 발명에 포함된다. 용어 "변이체"는 보존적 또는 비-보존적인 삽입, 결실 및 치환을 포함한다.Variants and fragments of the described linker are also included in the present invention, so long as the linker can still be degraded by a protease or proteases that cleave the linker in Tables 3a or 3b, or by the types of proteases defined above. The term “variant” includes conservative or non-conservative insertions, deletions and substitutions.

위에서 기술된 절단 서열 및 이들의 변이체의 다른 조합도 본 발명에 포함될 것이다.Other combinations of the cleavage sequences described above and variants thereof will also be included in the present invention.

다른 양태에서, 펩타이드 링커의 해독 후 변형 패턴을 변화시키는 아미노산 치환도 포함된다. 이들은 예를 들면, 글리코실화되거나, 황산화되거나 또는 인산화되는 아미노산의 치환일 수 있다.In other embodiments, amino acid substitutions that change the pattern of modification after translation of the peptide linker are also included. These can be, for example, substitutions of amino acids that are glycosylated, sulfated or phosphorylated.

본 발명의 다른 양태에서, 치료학적 폴리펩타이드 및 HLEP 잔기 사이의 펩타이드 링커는 해독후 변형의 부가를 위한 컨센서스(consensus) 부위를 함유한다. 바람직하게는 이러한 변형은 글리코실화 부위로 이루어진다. 보다 바람직하게, 이러한 변형은 구조 Asn - X - Ser/Thr(여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산을 나타낸다)의 하나 이상의 N-글리코실화 부위로 이루어진다. 보다 더 바람직하게는 이러한 N-글리코실화 부위는 펩타이드 링커의 아미노 및/또는 카복시 말단에 근접하게 삽입됨으로써 이들은 서열에서 발생될 수 있는 강력한 신생에피토프를 은폐할 수 있으며, 여기서, 치료학적 폴리펩타이드 잔기는 펩타이드 링커내로 이동되거나 펩타이드 링커는 알부민 잔기 서열내로 이동된다.
In another aspect of the invention, the peptide linker between the therapeutic polypeptide and the HLEP moiety contains a consensus site for the addition of post-translational modifications. Preferably this modification consists of a glycosylation site. More preferably, this modification consists of one or more N-glycosylation sites of the structure Asn-X-Ser/Thr, where X represents any amino acid except proline. Even more preferably, these N-glycosylation sites are inserted close to the amino and/or carboxy termini of the peptide linker so that they can conceal potent neoepitopes that may occur in the sequence, wherein the therapeutic polypeptide moiety is Either the peptide linker is moved or the peptide linker is moved into the albumin residue sequence.

도 1은 약 1:500의 FXIa 대 융합 단백질의 몰 비에서 37℃에서 FXIa에 의한 FIX-알부민 융합 단백질의 시험관내 활성화를 도시한다. 절단가능하지 않은 링커를 갖는 하나의 융합 단백질(1478/797) 및 절단가능한 링커를 갖는 2개의 융합 단백질(1088/797 및 1089/797)을 사용하였다. 샘플을 환원조건하에서의 SDS-PAGE 후 쿠마시 블루(Coomassie blue) 염색에 의해 분석하였다.
도 2는 활성화되지 않은 융합 단백질과 비교하여 절단가능한 링커가 존재 및 부재하는 활성화된 재조합 FIX 및 FIX-알부민 융합 단백질의 약력학을 도시한다.
도 3은 AT에 의한 활성화된 재조합 FIX 또는 FIX-알부민 융합 단백질의 불활성화를 도시한다. 잔류 FIX 활성은 120분 후 활성화되지 않은 부분적 트롬보플라스틴 시간 검정을 사용하여 측정한다.
[실시예]
실시예 1: FIX 및 FIX-알부민 융합 단백질을 암호화하는 cDNA의 생성
인자 IX 암호화 서열을 사람 간 cDNA 라이브러리(제조원: ProQuest, Invitrogen)로부터 프라이머 We1403 및 We1404(서열번호 5 및 6)를 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 프라이머 We1405 및 We1406(서열번호 7 및 8)을 사용한 2차 PCR 후 수득되는 단편을 pCR4TOPO(제조원: Invitrogen)내로 클로닝하였다. 이들로부터 FIX cDNA를 EcoRI 단편으로서 pIRESpuro3(제조원: BD Biosciences)(여기서, 내부 XhoI 부위는 앞서 결실시켰다)의 EcoRI 부위내로 이동시켰다. 수득되는 플라스미드를 pFIX-496로 명명하였으며 이는 인자 IX 야생형을 위한 발현 벡터였다.
알부민 융합 작제물을 생성시키기 위해 FIX cDNA를 PCR에 의해 종결 코돈을 결실시키고 XhoI 부위가 대신 도입된 프라이머 We2610 및 We2611(서열번호 9 및 10)을 사용하여 재증폭시켰다. 수득되는 FIX 단편을 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI 및 XhoI로 분해하고 EcoRI/BamH1 분해된 pIRESpuro3내로 후술되는 바와 같은 하나의 XhoI/BamH1 분해된 링커 단편과 함께 연결시켰다.
내부 절단 부위가 없는 2개의 상이한 글라이신/세린 링커 단편을 생성시켰다: 올리고뉴클레오타이드 We2148 및 We2150(서열번호 11 및 12)을 표준 PCR 조건하에서 등몰 농도(10 pmol)로 어닐링시키고, 충전하고 94℃에서의 2분의 초기 변성에 이은 94℃에서 15초의 변성의 7개 주기, 55℃에서의 15초의 어닐링 및 72℃에서 15초의 연장의 PCR 프로토콜을 사용하여 증폭시키고 72℃에서 5분의 연장 단계로 완결시켰다. 동일한 과정을 올리고뉴클레오타이드 We2156 및 We2157(서열번호 13 및 14)을 사용하여 수행하였다. 수득되는 링커 단편을 제한 엔도뉴클레아제 XhoI 및 BamH1으로 분해하여 위에서 기술한 연결 반응에 개별적으로 사용하였다. 따라서, 수득되는 플라스미드는 FIX에 대한 암호화 서열 및 글라이신/세린 링커의 C-말단 연장부를 함유하였다.
FIX의 활성화 부위로부터 유래한 2개의 상이한 절단 링커 단편을 생성시켰다: FIX 경쇄/활성화 펩타이드 경계 영역의 활성화 절단 부위를 함유하는 올리고뉴클레오타이드 We2335 및 We2336(서열번호 15 및 16)을 위에서 기술한 바와 같이 어닐링하고, 충전하고, 증폭시켰다. 수득되는 링커 단편을 제한 엔도뉴클레아제 XhoI 및 BamH1으로 분해하고 위에서 기술한 연결 반응에 사용하였다. 따라서, 수득되는 플라스미드는 FIX에 대한 암호화 서열 및 절단가능한 FIX 서열(서열 2의 아미노산 136 내지 154번)의 C-말단 연장부를 함유하였다. 올리고뉴클레오타이드 We2636 및 We2637(서열번호 17 및 18)을 사용하는 시판되는 돌연변이유발 키트(QuickChange XL Site Directed Mutagenesis Kit, 제조원: Stratagene)를 사용한 후속적인 부위 지시된 돌연변이유발 반응시 XhoI 부위가 결실되었다.
FIX로부터 유래한 제2의 절단가능한 링커 단편을 생성시키기 위해, 동일한 과정을 링커 작제용 올리고뉴클레오타이드 We2337 및 We2338(서열번호 19 및 20)을 사용하여 수행하였다. 수득되는 링커 단편을 제한 엔도뉴클레아제 XhoI 및 BamH1으로 분해하고 위에서 기술한 연결 반응에 사용하였다. 수득되는 플라스미드는 이제 FIX에 대한 암호화 서열 및 FIX 활성화 펩타이드/중쇄 경계 영역(서열번호 2의 아미노산 173번 내지 186번)의 활성화 절단 부위로부터 유래한 절단가능한 FIX 서열의 C-말단 연장부를 함유하였다. 올리고뉴클레오타이드 We2638 및 We 2639(서열번호 21 및 22)를 위에서 기술한 바와 같이 XhoI 부위의 결실에 사용하였다.
다음 클로닝 단계에서, 상기 생성된 플라스미드를 BamH1으로 분해하고 성숙한 사람 알부민의 cDNA를 함유하는 BamH1 단편을 삽입하였다. 당해 단편은, 표준 조건하에서 프라이머 We1862 및 We1902(서열번호 23 및 24)를 사용하여 알부민 cDNA 서열상에서 PCR로 생성시켰다.
절단가능하지 않은 글라이신/세린 링커를 갖는 최종 플라스미드를 pFIX-980(서열번호 30) 및 pFIX-986(서열번호 31)으로 각각 명명하였다. FIX 서열로부터 유래한 절단가능한 링커를 갖는 최종 플라스미드는 각각 pFIX-1088(서열번호 40) 및 pFIX-1089(서열번호 49)로 명명하였다. 이들의 링커 서열 및 C-말단 FIX 및 N-말단 알부민 서열은 하기에 요약한다. 링커내 단백질분해성 절단 부위는 화살표로 나타내며, FIX 유래한 링커 서열은 밑줄쳐져 있다.

CHO 세포내에서의 발현을 위해, FIX 알부민 융합 단백질에 대한 암호화 서열을 벡터 pIRESneo3 (제조원: BD Biosciences) 또는 pcDNA3.1(제조원: Invitrogen)내로 각각 이동시켰다.
FIX를 발현하는 세포에서 프로펩타이드를 많은 양으로 효율적으로 프로세싱하기 위해서는, 푸린의 공동발현이 요구된다(참조: Wasley LC et al. 1993. PACE/Furin can process the vitamin K-dependent pro-factor IX precursor within the secretory pathway. J. Biol. Chem. 268:8458-8465). 푸린은 간 cDNA 라이브러리(제조원: Ambion)로부터 프라이머 We1791 및 We1792(서열번호 25 및 26)를 사용하여 증폭시켰다. 프라이머 We1808 및 We1809(서열번호 27 및 28)를 사용하는 2차 PCR로 푸린 단편을 수득하였으며, 여기서, 카복시말단 막관통 도메인(TM)은 결실되어 있고 종결 코돈이 도입되어 있으며; 당해 단편을 pCR4TOPO(제조원: Invitrogen)내로 클로닝시켰다. 이들로부터 푸린ΔTM cDNA를 EcoRI/NotI 단편으로서 pIRESpuro3 (제조원: BD Biosciences)(여기서, 내부 XhoI 부위는 이미 결실시켰다)내로 이동시켰다. 수득되는 플라스미드는 pFu-797로 명명하였다. 당해 플라스미드를 모든 FIX 작제물과 함께 1:5(pFu-797:pFIX-xxx) 몰비로 공동형질감염시켰다. pFu-797에 의해 암호화된 분비된 푸린의 아미노산 서열은 서열번호 29로 제공된다.
실시예 2: FIX 및 FIX-알부민 융합 단백질의 형질감염 및 발현
플라스미드를 이.콜라이(E. coli) TOP10(제조원: Invitrogen)내에서 성장시키고 표준 프로토콜(제조원: Qiagen)을 사용하여 정제하였다. HEK-293 세포를 리포펙타민 2000 시약(제조원: Invitrogen)을 사용하여 형질감염시키고 무혈청 배지(제조원: Invitrogen 293 Express) 속에서 50 ng/ml의 비타민 K 및 4 ㎍/ml 푸로마이신의 존재하에 성장시켰다. 형질감염된 세포 집단을 T-플라스크를 통해 롤러 병 또는 소규모 발효기내로 스프레딩(spreading)시키고 이로부터 정제를 위해 상청액을 수거하였다. 또는, CHO K1 또는 DG44 세포(제조원: Invitrogen)를 리포펙타민 2000 시약(제조원: Invitrogen)을 사용하여 형질감염시키고 무혈청 배지(제조원: Invitrogen CD-CHO) 속에서 50 ng/ml의 비타민 K 및 500-750 ng/ml의 제네티신의 존재하에 성장시켰다. 고 발현 클론을 선택하고 T-플라스크를 통해 롤러 병 또는 소규모 발효기내로 스프레딩시키고 이로부터 정제를 위해 상청액을 수거하였다.
실시예 3: FIX 및 FIX-알부민 융합 단백질의 정제
FIX 또는 FIX 알부민 융합 단백질을 함유하는 세포 배양 수거물을 50 mM 트리스xHCl/100 mM NaCl 완충액(pH 8.0)으로 미리 평형화시킨 Q-세파로즈 FF 컬럼 상에 적용시켰다. 이어서, 컬럼을 200 mM NaCl을 함유하는 평형 완충액으로 세척하였다. 결합된 FIX 또는 FIX 융합 단백질의 용출을 기준으로서 50 mM 트리스xHCl/200 mM NaCl 완충액 pH 8.0을 사용하여 염 구배로 달성하였다. 용출물을 하이드록실아파타이트 수지상에서 컬럼 크로마토그래피로 추가로 정제하였다. 이를 위하여, Q-세파로즈 FF 컬럼의 용출물을 50 mM 트리스xHCl/100 mM NaCl 완충액(pH 7.2)으로 평형화시킨 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 상에 로딩하였다. 컬럼을 동일한 완충액으로 세척하고 FIX 또는 FIX-HSA를 pH 7.2에서 인산칼륨 구배를 사용하여 용출시켰다. 용출물을 투석하여 염 농도를 감소시키고 생화학적 분석 및 약력학적 매개변수의 측정을 위해 사용하였다. FIX 항원 및 활성을 실시예 5에 기술한 바와 같이 측정하였다.
실시예 4: FIX 및 FIX-알부민 융합 단백질의 다른 정제 과정
실시예 3에 기술된 바와 같이, FIX 및 FIX-알부민 융합 단백질을 함유하는 세포 배양 수거물을 Q-세파로즈 FF상에서 크로마토그래피로 정제하였다. Q-세파로즈 용출물을 추가로 헤파린-프락토겔 컬럼상에서 크로마토그래피로 정제하였다. 이를 위하여, 헤파린-프락토겔 컬럼을 50 mM 트리스 x HCl, 50 mM NaCl pH 8.0 완충액(EP)을 사용하여 평형화하고, Q-세파로즈 FF 용출물을 적용시키고 컬럼을 75 mM NaCl을 함유하는 평형 완충액으로 세척하였다. FIX 또는 FIX 알부민 융합 단백질 각각을 300 mM NaCl로 조절된 EP를 사용하여 용출시켰다. 헤파린-프락토겔 용출물을 또한 실시예 3에 기술된 바와 같이 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 컬럼상에서 크로마토그래피로 정제하였다. 정제된 FIX 각각 FIX 알부민 융합 단백질 농축물을 실시예 5에 따라 FIX 활성 및 항원 측정에 적용시키고 시험관내 및 생체내 시험에 의해 추가로 특성화하였다.
실시예 5: FIX 활성 및 항원의 측정
FIX 활성은 시판되는 aPTT 시약(파트롬틴 SL 및 FIX 고갈된 혈장, 제조원: Dade Behring)을 사용하여 응고(clotting) 또는 응고(coagulation) 활성(FIX:C)으로서 측정하였다. WHO 국제 FIX 농축물 표준(96/854)에 대해 보정된 내부 부표준물을 참조로 사용하였다. FIX 항원(FIX:Ag)을 ELISA에 의해 당해 분야의 숙련가에게 공지된 표준 프로토콜에 따라 측정하였다. 요약하면, 미세역가 플레이트를 포획 항체(FIX ELISA 1:200에 대한 쌍을 이룬 항체, 제조원: Cedarlane, 그러나 적절한 항체의 다른 공급원을 또한 적용할 수 있다)의 웰당 100 ㎕와 함께 밤새 주위 온도에서 항온처리하였다. 플레이트를 세척 완충액 B(Sigma P3563)로 3회 세척한 후, 각각의 웰을 200 ㎕의 차단 완충액 C(Sigma P3688)와 함께 1시간 동안 주위 온도에서 항온처리하였다. 완충액 B를 사용한 추가의 3회 세척 단계 후에, 완충액 B 중 시험 샘플의 일련 희석물 및 완충액 B 중 부표준물(SHP)의 일련의 희석물(웰당 용적: 100 ㎕)을 2시간 동안 주위 온도에서 항온처리하였다. 완충액 B를 사용한 3회의 세척 단계 후에, 완충액 B중 100 ㎕의 검출 항체(FIX ELISA에 대해 쌍을 이룬 항체, 표지된 퍼옥시다제, 제조원: Cedarlane)의 1:200 희석물을 각각의 웰에 가하고 추가로 2시간 동안 주위 온도에서 항온처리하였다. 완충액 B를 사용한 3회 세척 단계 후, 웰당 100 ㎕의 기질 용액(TMB, 제조원: Dade Behring, OUVF)을 가하고 30분 동안 주위 온도에서 암실에서 항온처리하였다. 100 ㎕의 희석되지 않은 정지 용액(제조원: Dade Behring, OSFA)을 첨가하여 450 nm 파장에서 적합한 마이크로플레이트 판독기에서의 판독을 위한 샘플을 제조하였다. 이후에, 참조로서 표준 사람 혈장을 사용한 표준 곡선을 사용하여 시험 샘플의 농도를 계산하였다.
실시예 6: 세포 배양 상청액 중의 상이한 FIX -알부민 융합 단백질의 FIX -활성/ FIX -항원 비의 비교
상이한 링커 펩타이드를 함유한 FIX-알부민 융합 단백질을 암호화하는 DNA 작제물로 형질감염된 HEK 세포의 세포 배양 상청액을 실시예 5에서 기술한 FIX 활성 및 항원 시험에 적용시켰다. FIX:C 대 FIX:Ag의 비를 계산하였으며, 이는 상이한 작제물의 몰 비활성에 정비례하는 척도를 나타낸다.
표 4에 나타낸 결과는, FIX-HSA 분자내로의 절단가능한 링커의 도입시 활성/항원 비가 증가함을 나타낸다. 이는 또한, 절단가능한 링커 펩타이드는 명백히 증가된 활성/항원 비를 제공하기 위하여 2개 아미노산 이상의 길이를 가져야 함을 나타낸다.
[표 4]

실시예 7: 랫트 또는 토끼에서 몰 비활성, 최종 생체내 반감기 및 생체내 회수율과 관련하여 FIX 및 FIX -알부민 융합 단백질의 비교
정제된 재조합 야생형 FIX(rFIX 496/797) 및 FIX-알부민 융합 단백질(rFIX 980/797, rFIX 986/797, rFIX-1088/797 및 rFIX 1089/797)을 위에서 기술한 바와 같은 응고 검정에서 FIX 활성에 대해 시험하였다. 동시에, 280 및 320 nm에서 광학 밀도의 차이를 단백질 농도에 대한 척도로 측정하였다(OD280-320). OD280-320당 활성의 비를 계산하고, 몰 광학 밀도를 기준으로 하여 몰 비활성을 계산하였다. 다음 표 5에 결과를 요약한다.
[표 5]

표 5에 요약된 결과를 고려할 때, 본 발명에 따라 생성된 2개의 작제물이 절단가능하지 않은 링커를 갖는 융합 단백질과 비교하여 매우 높게 증가된 몰 비활성을 나타낸다는 것은 놀라운 것이다. 또한, 이들 작제물의 몰 비활성은 야생형 rFIX와 비교하여 단지 약간 감소되었다.
인자 XIa(FXIa)에 의한 단백질분해 절단 반응의 시험관내 시험은, 예를 들면, 작제물 번호 1088/797 또는 1089/797과 같은 절단가능한 링커를 함유하는 FIX-알부민 융합 단백질이 활성화되고 동시에 링커가 절단됨으로써 알부민 잔기가 방출됨을 입증하였다(도 1). 절단가능하지 않은 링커를 갖는 융합 단백질은 알부민 잔기의 상응하는 방출을 나타내지 않았다.
조직 인자의 존재하에서 절단 프로테아제로서 FVIIa의 경우에, 절단가능한 링커를 함유하는 FIX-알부민 융합 단백질 1088/797 또는 1089/797는 또한 FIX 활성화 펩타이드의 방출과 동시에 알부민 잔기의 방출을 나타내었다(데이터는 나타내지 않음).
응고 몰 비활성의 측정 외에도, 위에서 기술한 폴리펩타이드 번호 496/797, 980/797, 986/797, 1088/797 및 1089/797을 마취시킨 CD/루이스 랫트(물질당 6마리 랫트) 및/또는 토끼(물질당 4마리의 토끼)에게 체중 kg당 50IU의 투여량으로 정맥내 투여하였다. 혈액 샘플을 시험 물질 투여 전 및 시험 물질의 투여 후 5분째에 시작하여 적절한 간격으로 수거하였다. 이어서, FIX 항원 함량을 사람 인자 IX에 대해 특이적인 ELISA 검정으로 정량화하였다(상기 참조). 각 그룹의 평균값을 사용하여 5분 후 생체내 회수율을 계산하였다. 각각의 단백질에 대한 반감기를 식 t_1/2 = ln2/k(여기서, k는 FIX:Ag 수준을 로그 스케일로 플롯팅하고 시간을 선형 스케일로 플롯팅할 때 얻어지는 회귀선의 기울기이다)에 따라 제거(최종 반감기)의 베타 단계의 시점을 사용하여 계산하였다.
계산된 생체내 반감기를 표 6에 요약한다. 랫트 및 토끼에서 FIX-알부민 융합 단백질의 생체내 반감기는 조직내(inhouse) 제조된 융합되지 않은 야생형 재조합 FIX와 비교하거나 또는 시판되는 재조합 FIX 제품 BeneFIX^®와 비교하여 현저히 증가한 것으로 밝혀졌다. BeneFIX^®와 비교하여 알부민 융합 단백질의 생체내 반감기는 사용된 동물 종 또는 작제물에 따라 약 200 내지 400%로 증가하였다(표 6).
생체내 회수율을 평가하기 위해, 정맥내 투여후(t = 5분) 최대 농도에서 혈장 mL당 측정된 FIX 항원 수준을 kg당 적용된 제품의 양과 관련시켰다. 또는, 주입한지 5분 후에 측정된 항원 수준(IU/mL)을 100% 회수율로 예측된 이론적 제품 수준(kg당 40mL의 추정된 혈장 용적으로 나눈 kg당 적용된 제품)과 관련시켜 퍼센트를 계산하였다. FIX-알부민 융합 단백질의 생체내 회수율(IVR)은 rFIX (496/797) 또는 BeneFIX^®의 시험관내 회수율보다 현저히 더 높았다(표 7).
[표 6]

[표 7]

실시예 8: 절단가능한 링커(1088/797 및 980/797)의 존재/ 부재하는 FIX 알부민 융합 단백질의 시험관내 활성화 및 랫트에서의 약력학의 측정
FIX-알부민 융합 단백질 및 재조합 FIX를 시판되는 인자 XIa(제조원: Kordia)를 사용하여 시험관내에서 활성화시켰다. 요약하면, 등몰량의 FIX 또는 FIX-알부민 융합 단백질(3.0 x 10^-6 mol/L)을 37℃에서 pH 6.8로 완충된 FXIa(1.9 x 10^-8 mol/L) 및 CaCl₂ (1.5 mmol/L)의 존재하에 용액속에서 활성화시켰다. SDS-PAGE에 의해 밝혀진 것으로서 완전한 활성화 후, FXIa의 양을 기준으로 5x 몰 과량의 C1-억제제(제조원: Berinert P)를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 샘플을, 약력학 시험이 개시될 때까지 -70℃이하로 동결 저장하였다.
활성화된 FIX 및 FIX-알부민 융합 단백질의 약력학적 조사를 실시예 7에 기술된 바와 같이 랫트에서 수행하고 결과를 비-활성화된 융합 단백질을 포함하는 약력학적 결과와 비교하였다. 활성화된 융합 단백질은 비-활성화된 분자와 비교하여 반감기 및 AUC를 현저히 감소시킨 것으로 입증되었다(도 2). 활성화시, 절단가능한 링커(1088/797)를 가진 FIX-융합 단백질은 활성화된 재조합 FIX(BeneFIX)와 매우 유사한 약력학적 작용을 나타낸 반면, 절단가능하지 않은 링커(980/797)를 갖는 활성화된 융합 단백질은 절단가능한 링커를 갖는 활성화된 융합 단백질 1088/797과 비교하여 보다 높은 초기 및 최종 반감기를 초래하였다. 따라서, 당해 결과는, 절단가능한 링커가 활성화후 응고 인자의 제거를 증가시킴으로써, 반감기가 연장된 활성화된 잠재적인 혈전형성 융합 단백질의 축적을 방지함을 명백히 입증한다.
실시예 9: 항트롬빈 III(AT)에 의한 활성화된 응고 인자의 불활성화율과 관련하여 절단가능한 링커를 갖는/갖지 않는 FIX-알부민 융합 단백질의 비교
절단가능한 링커를 갖는 FIX 융합 단백질(1088/797) 및 절단가능한 링커를 갖지 않는 FIX 융합 단백질(980/797)을 실시예 8에 기술한 바와 같이 FXIa와 함께 항온처리하여 활성화시켰다. 활성화된 인자를 AT와 함께 120분 동안 항온처리하고 잔류 FIXa 활성을 활성화없이 수동 FIX 응고 검정 방법(naPTT, 하기 참조)을 사용하여 슈니트거(Schnitger) 및 그로쓰(Gross)에 따라 측정하였다. 대조군 샘플로서, 활성화된 FIX-알부민 융합 단백질을 동량의 AT의 존재하에, 항온처리하지 않고 사용하였다.
FIX 활성을 FIX 결여 혈장(제조원: Dade Behring)을 사용한 비-활성화된 부분적 트롬보플라스틴 시간 검정(naPTT)에 의해 측정하였다. 샘플을 His, Gly, 슈크로즈 및 트윈 80을 함유하는 pH 6.8의 완충액 속에서 예비희석시켰다. 전체 측정을 슈니트거 및 그로쓰에 따라 응고측정기(coagulometer)를 사용하여 수행하였다. 0.1 ml의 FIX 결여 혈장, 0.1 ml의 샘플 및 0.1 ml의 0.1% 인지질(제조원: Rhone-Poulenc-Nattermann, 1% HSA가 보충된 이미다졸 완충액 중에 1:3 예비희석됨)의 혼합물을 37℃에서 2분 동안 항온처리하였다. 응고 반응을 0.1 ml의 0.025 mol/l CaCl₂ 용액을 가하여 개시시키고 응고 시간을 측정하였다.
도 3은 상응하는 불활성화 시험의 결과를 나타낸다. 절단가능한 링커를 갖는 융합 단백질(1088/797)의 경우에, 210초에서 540초(2.57배)로 응고 시간이 증가한 것은, 196초에서 411초(2.10배)로의 증가만을 나타낸 절단가능하지 않은 링커를 갖는 융합 단백질(980/797)과 비교하여 AT에 의한 FIXa 활성의 가속화된 불활성화 과정을 입증하였다. 아마도, 절단가능하지 않은 링커를 갖는 융합 단백질의 경우에는 알부민 잔기가 AT 의존성 불활성화 과정에 입체적으로 영향을 미치는 반면, 절단가능한 링커를 갖는 융합 단백질의 경우에는 알부민 잔기가 절단 제거되어 AT에 의한 가속화된 불활성화를 초래할 것이다.1 depicts in vitro activation of FIX-albumin fusion protein by FXIa at 37° C. at a molar ratio of FXIa to fusion protein of about 1:500. One fusion protein with a non-cleavable linker (1478/797) and two fusion proteins with a cleavable linker (1088/797 and 1089/797) were used. Samples were analyzed by Coomassie blue staining after SDS-PAGE under reducing conditions.
Figure 2 shows the pharmacodynamics of activated recombinant FIX and FIX-albumin fusion proteins with and without a cleavable linker compared to an unactivated fusion protein.
3 shows the inactivation of activated recombinant FIX or FIX-albumin fusion proteins by AT. Residual FIX activity is determined using the unactivated partial thromboplastin time assay after 120 minutes.
[ Example ]
Example 1: Generation of cDNA encoding FIX and FIX-albumin fusion proteins
The factor IX coding sequence was amplified by PCR from a human liver cDNA library (manufactured by ProQuest, Invitrogen) using primers We1403 and We1404 (SEQ ID NOs: 5 and 6). Fragments obtained after secondary PCR using primers We1405 and We1406 (SEQ ID NOs: 7 and 8) were cloned into pCR4TOPO (manufactured by Invitrogen). From these, FIX cDNA was transferred as an EcoRI fragment into the EcoRI site of pIRESpuro3 (manufactured by BD Biosciences) (where the internal XhoI site was previously deleted). The resulting plasmid was named pFIX-496 and it was an expression vector for factor IX wild type.
In order to generate albumin fusion constructs, FIX cDNA was re-amplified using primers We2610 and We2611 (SEQ ID NOs: 9 and 10) in which the stop codon was deleted by PCR and the XhoI site was introduced instead. The resulting FIX fragment was digested with restriction endonucleases EcoRI and XhoI and ligated into EcoRI/BamH1 digested pIRESpuro3 with one XhoI/BamH1 digested linker fragment as described below.
Two different glycine/serine linker fragments were generated without internal cleavage sites: oligonucleotides We2148 and We2150 (SEQ ID NOs: 11 and 12) were annealed to equimolar concentrations (10 pmol) under standard PCR conditions, charged and at 94°C. Amplification using PCR protocol of 7 cycles of 15 sec denaturation at 94°C followed by 2 min initial denaturation, 15 sec annealing at 55°C and extension of 15 sec at 72°C, complete with 5 min extension steps at 72°C. Made it. The same procedure was carried out using the oligonucleotides We2156 and We2157 (SEQ ID NOs: 13 and 14). The resulting linker fragment was digested with restriction endonucleases XhoI and BamH1 and used individually in the ligation reaction described above. Thus, the resulting plasmid contained the coding sequence for FIX and the C-terminal extension of the glycine/serine linker.
Two different cleavage linker fragments derived from the activation site of FIX were generated: the oligonucleotides We2335 and We2336 (SEQ ID NOs: 15 and 16) containing the activated cleavage site of the FIX light chain/activated peptide boundary region were annealed as described above. , Charged and amplified. The resulting linker fragment was digested with restriction endonucleases XhoI and BamH1 and used in the ligation reaction described above. Thus, the resulting plasmid contained the coding sequence for FIX and the C-terminal extension of the cleavable FIX sequence (amino acids 136 to 154 of SEQ ID NO: 2). The XhoI site was deleted in the subsequent site-directed mutagenesis reaction using a commercially available mutagenesis kit (QuickChange XL Site Directed Mutagenesis Kit, manufacturer: Stratagene) using oligonucleotides We2636 and We2637 (SEQ ID NOs: 17 and 18).
In order to generate a second cleavable linker fragment derived from FIX, the same procedure was performed using the oligonucleotides We2337 and We2338 (SEQ ID NOs: 19 and 20) for linker construction. The resulting linker fragment was digested with restriction endonucleases XhoI and BamH1 and used in the ligation reaction described above. The resulting plasmid now contained the coding sequence for FIX and the C-terminal extension of the cleavable FIX sequence derived from the activating cleavage site of the FIX activating peptide/heavy chain boundary region (amino acids 173 to 186 of SEQ ID NO: 2). Oligonucleotides We2638 and We 2639 (SEQ ID NOs: 21 and 22) were used for deletion of the XhoI site as described above.
In the next cloning step, the generated plasmid was digested with BamH1 and a BamH1 fragment containing the cDNA of mature human albumin was inserted. This fragment was generated by PCR on the albumin cDNA sequence using primers We1862 and We1902 (SEQ ID NOs: 23 and 24) under standard conditions.
Final plasmids with non-cleavable glycine/serine linkers were named pFIX-980 (SEQ ID NO: 30) and pFIX-986 (SEQ ID NO: 31), respectively. Final plasmids having a cleavable linker derived from the FIX sequence were named pFIX-1088 (SEQ ID NO: 40) and pFIX-1089 (SEQ ID NO: 49), respectively. Their linker sequences and C-terminal FIX and N-terminal albumin sequences are summarized below. The proteolytic cleavage site in the linker is indicated by an arrow, and the linker sequence derived from FIX is underlined.

For expression in CHO cells, the coding sequence for the FIX albumin fusion protein was transferred into the vector pIRESneo3 (manufactured by BD Biosciences) or pcDNA3.1 (manufactured by Invitrogen), respectively.
In order to efficiently process a large amount of propeptide in FIX-expressing cells, co-expression of purine is required (see Wasley LC et al. 1993. PACE/Furin can process the vitamin K-dependent pro-factor IX precursor). within the secretory pathway.J. Biol. Chem. 268:8458-8465). Purine was amplified using primers We1791 and We1792 (SEQ ID NOs: 25 and 26) from a liver cDNA library (manufactured by Ambion). Purine fragments were obtained by secondary PCR using primers We1808 and We1809 (SEQ ID NOs: 27 and 28), wherein the carboxy terminal transmembrane domain (TM) is deleted and a stop codon is introduced; This fragment was cloned into pCR4TOPO (manufactured by Invitrogen). From these, PurineΔTM cDNA was transferred as an EcoRI/NotI fragment into pIRESpuro3 (manufactured by BD Biosciences) (where the internal XhoI site has already been deleted). The resulting plasmid was named pFu-797. This plasmid was cotransfected with all FIX constructs at a molar ratio of 1:5 (pFu-797:pFIX-xxx). The amino acid sequence of the secreted purine encoded by pFu-797 is provided as SEQ ID NO: 29.
Example 2: Transfection and expression of FIX and FIX-albumin fusion proteins
Plasmids were grown in E. coli TOP10 (manufactured by Invitrogen) and purified using a standard protocol (manufactured by Qiagen). HEK-293 cells were transfected with Lipofectamine 2000 reagent (manufactured by Invitrogen) and in the presence of 50 ng/ml vitamin K and 4 µg/ml puromycin in a serum-free medium (manufactured by Invitrogen 293 Express). Grew. The transfected cell population was spread through a T-flask into a roller bottle or small fermentor and the supernatant was collected for purification from it. Alternatively, CHO K1 or DG44 cells (manufactured by Invitrogen) were transfected with Lipofectamine 2000 reagent (manufactured by Invitrogen), and 50 ng/ml of vitamin K and in a serum-free medium (manufactured by Invitrogen CD-CHO). It was grown in the presence of 500-750 ng/ml geneticin. High expressing clones were selected and spread through T-flasks into roller bottles or small fermentors from which the supernatant was collected for purification.
Example 3: Purification of FIX and FIX-albumin fusion proteins
Cell culture harvests containing FIX or FIX albumin fusion proteins were applied onto a Q-Sepharose FF column previously equilibrated with 50 mM TrisxHCl/100 mM NaCl buffer (pH 8.0). The column was then washed with an equilibration buffer containing 200 mM NaCl. The elution of bound FIX or FIX fusion protein was achieved with a salt gradient using 50 mM TrisxHCl/200 mM NaCl buffer pH 8.0 as a reference. The eluate was further purified by column chromatography on hydroxylapatite resin. To this end, the eluate from the Q-Sepharose FF column was loaded onto hydroxyapatite chromatography equilibrated with 50 mM TrisxHCl/100 mM NaCl buffer (pH 7.2). The column was washed with the same buffer and FIX or FIX-HSA was eluted using a potassium phosphate gradient at pH 7.2. The eluate was dialyzed to reduce the salt concentration and used for biochemical analysis and measurement of pharmacodynamic parameters. FIX antigen and activity were measured as described in Example 5.
Example 4: Other purification procedures of FIX and FIX-albumin fusion proteins
As described in Example 3, cell culture harvests containing FIX and FIX-albumin fusion proteins were purified by chromatography on Q-Sepharose FF. The Q-Sepharose eluate was further purified by chromatography on a heparin-fructogel column. To this end, the heparin-fractogel column was equilibrated using 50 mM Tris x HCl, 50 mM NaCl pH 8.0 buffer (EP), and the Q-Sepharose FF eluate was applied and the column was equilibrated containing 75 mM NaCl. Washed with buffer. Each of the FIX or FIX albumin fusion proteins was eluted using EP adjusted with 300 mM NaCl. The heparin-fructogel eluate was also purified by chromatography on a hydroxylapatite chromatography column as described in Example 3. Purified FIX Each FIX albumin fusion protein concentrate was subjected to FIX activity and antigen determination according to Example 5 and further characterized by in vitro and in vivo tests.
Example 5: Measurement of FIX activity and antigen
FIX activity was measured as clotting or coagulation activity (FIX:C) using commercially available aPTT reagents (Pathromtin SL and FIX depleted plasma, manufacturer: Dade Behring). The internal substandard calibrated against the WHO International FIX Concentrate Standard (96/854) was used as a reference. The FIX antigen (FIX:Ag) was measured by ELISA according to standard protocols known to those skilled in the art. In summary, microtiter plates were incubated overnight at ambient temperature with 100 μl per well of capture antibody (paired antibody to FIX ELISA 1:200, manufacturer: Cedarlane, but other sources of suitable antibodies may also be applied). Processed. After washing the plate three times with Wash Buffer B (Sigma P3563), each well was incubated with 200 μl of blocking buffer C (Sigma P3688) for 1 hour at ambient temperature. After an additional 3 wash steps with buffer B, serial dilutions of the test sample in buffer B and a serial dilution of substandard (SHP) in buffer B (volume per well: 100 μl) were added at ambient temperature for 2 hours. Incubated. After three washing steps with buffer B, a 1:200 dilution of detection antibody (antibody paired for FIX ELISA, labeled peroxidase, manufacturer: Cedarlane) in buffer B was added to each well. Incubate at ambient temperature for an additional 2 hours. After three washing steps with buffer B, 100 μl of a substrate solution (TMB, manufacturer: Dade Behring, OUVF) per well was added and incubated in the dark at ambient temperature for 30 minutes. Samples for reading in a suitable microplate reader at 450 nm wavelength were prepared by adding 100 μl of undiluted stop solution (manufactured by Dade Behring, OSFA). Thereafter, the concentration of the test sample was calculated using a standard curve using standard human plasma as a reference.
Example 6: Comparison of FIX -activity/ FIX -antigen ratio of different FIX -albumin fusion proteins in cell culture supernatant
Cell culture supernatants of HEK cells transfected with DNA constructs encoding FIX-albumin fusion proteins containing different linker peptides were subjected to the FIX activity and antigen tests described in Example 5. The ratio of FIX:C to FIX:Ag was calculated, which represents a measure that is directly proportional to the molar specificity of the different constructs.
The results shown in Table 4 indicate that the activity/antigen ratio increases upon introduction of a cleavable linker into the FIX-HSA molecule. This also indicates that the cleavable linker peptide must have a length of at least 2 amino acids to provide an apparently increased activity/antigen ratio.
[Table 4]

Example 7: Comparison of FIX and FIX -albumin fusion proteins with respect to molar specific activity, final in vivo half-life and in vivo recovery in rat or rabbit
Purified recombinant wild-type FIX (rFIX 496/797) and FIX-albumin fusion proteins (rFIX 980/797, rFIX 986/797, rFIX-1088/797 and rFIX 1089/797) FIX activity in a coagulation assay as described above. Was tested for. At the same time, the difference in optical density at 280 and 320 nm was measured as a measure for protein concentration (OD280-320). The ratio of activity per OD280-320 was calculated, and the molar specific activity was calculated based on the molar optical density. The results are summarized in Table 5 below.
[Table 5]

Considering the results summarized in Table 5, it is surprising that the two constructs produced according to the invention exhibit a very high increased molar specific activity compared to a fusion protein with a non-cleavable linker. In addition, the molar specificity of these constructs was only slightly reduced compared to wild-type rFIX.
In vitro testing of the proteolytic cleavage reaction by factor XIa (FXIa), for example, a FIX-albumin fusion protein containing a cleavable linker such as construct number 1088/797 or 1089/797 is activated and at the same time the linker is activated. It was demonstrated that the albumin residue was released by cleavage (FIG. 1 ). Fusion proteins with non-cleavable linkers did not show corresponding release of albumin residues.
In the case of FVIIa as a cleavable protease in the presence of a tissue factor, the FIX-albumin fusion protein 1088/797 or 1089/797 containing a cleavable linker also showed the release of the albumin residue simultaneously with the release of the FIX activating peptide (data show: Not shown).
In addition to the determination of coagulation molar specificity, CD/Lewis rats (6 rats per substance) and/or rabbits anesthetized with polypeptide numbers 496/797, 980/797, 986/797, 1088/797 and 1089/797 described above. (4 rabbits per substance) was administered intravenously at a dose of 50 IU per kg body weight. Blood samples were collected at appropriate intervals starting before administration of the test substance and 5 minutes after administration of the test substance. The FIX antigen content was then quantified by an ELISA assay specific for human factor IX (see above). The in vivo recovery rate was calculated after 5 minutes using the average value of each group. The half-life for each protein is _{removed according to the equation t 1/2} = ln2/k (where k is the slope of the regression line obtained when plotting FIX:Ag levels on a log scale and time on a linear scale). It was calculated using the time point of the beta phase of (final half-life).
The calculated in vivo half-life is summarized in Table 6. Vivo half-life of FIX- albumin fusion protein in rats and rabbits have been found to be significantly increased as compared to the recombinant FIX product BeneFIX ^® compared to the wild-type recombinant FIX that is free of fusion to the prepared tissue (inhouse) or commercially available. As compared to BeneFIX ^® in vivo half-life of the albumin fusion protein was increased by about 200 to 400%, depending on the animal species or construct used (Table 6).
To assess the in vivo recovery rate, the FIX antigen level measured per mL of plasma at the maximum concentration after intravenous administration (t = 5 min) was related to the amount of product applied per kg. Alternatively, the percentage was calculated by relating the antigen level (IU/mL) measured 5 minutes after injection to the predicted theoretical product level (product applied per kg divided by the estimated plasma volume of 40 mL per kg) predicted at 100% recovery. FIX- albumin in vivo recovery (IVR) of the fusion protein was significantly higher than the in vitro recovery of rFIX (496/797) or BeneFIX ^® (Table 7).
[Table 6]

[Table 7]

Example 8: presence/absence of cleavable linkers (1088/797 and 980/797) In vitro activation of FIX albumin fusion proteins and in rats Measurement of pharmacodynamics
The FIX-albumin fusion protein and recombinant FIX were activated in vitro using a commercially available factor XIa (manufactured by Kordia). In summary, equimolar amounts of FIX or FIX-albumin fusion protein (3.0 x 10 ^-6 mol/L) were buffered at 37° C. to pH 6.8 and FXIa (1.9 x 10 ^-8 mol/L) and CaCl ₂ (1.5 mmol/ Activated in solution in the presence of L). After complete activation as revealed by SDS-PAGE, the reaction was stopped by adding a 5x molar excess of C1-inhibitor (manufactured by Berinert P) based on the amount of FXIa. Samples were stored frozen at -70° C. or lower until pharmacodynamic testing was initiated.
Pharmacokinetic investigations of activated FIX and FIX-albumin fusion proteins were performed in rats as described in Example 7 and the results were compared with pharmacokinetic results comprising non-activated fusion proteins. It was demonstrated that the activated fusion protein significantly reduced half-life and AUC compared to non-activated molecules (FIG. 2 ). Upon activation, the FIX-fusion protein with a cleavable linker (1088/797) showed a very similar pharmacokinetic action to the activated recombinant FIX (BeneFIX), while activated fusion with a non-cleavable linker (980/797). The protein resulted in higher initial and final half-life compared to activated fusion protein 1088/797 with a cleavable linker. Thus, these results clearly demonstrate that the cleavable linker increases the elimination of coagulation factors after activation, thereby preventing the accumulation of activated potential thrombogenic fusion proteins with prolonged half-life.
Example 9: Comparison of FIX-albumin fusion proteins with/without cleavable linkers with respect to the rate of inactivation of activated coagulation factors by antithrombin III (AT)
The FIX fusion protein with a cleavable linker (1088/797) and the FIX fusion protein without a cleavable linker (980/797) were activated by incubation with FXIa as described in Example 8. Activated factors were incubated with AT for 120 minutes and residual FIXa activity was measured according to Schnitger and Gross using the passive FIX coagulation assay method (naPTT, see below) without activation. As a control sample, the activated FIX-albumin fusion protein was used in the presence of the same amount of AT, without incubation.
FIX activity was measured by non-activated partial thromboplastin time assay (naPTT) using FIX-deficient plasma (manufactured by Dade Behring). Samples were prediluted in a buffer solution of pH 6.8 containing His, Gly, sucrose and Tween 80. The overall measurement was carried out using a coagulometer according to Schnittger and Groth. A mixture of 0.1 ml of FIX-deficient plasma, 0.1 ml of sample and 0.1 ml of 0.1% phospholipid (manufactured by Rhone-Poulenc-Nattermann, prediluted 1:3 in imidazole buffer supplemented with 1% HSA) at 37° C. Incubated for 2 minutes. The coagulation reaction was initiated by adding 0.1 ml of 0.025 mol/l CaCl ₂ solution, and the coagulation time was measured.
3 shows the results of the corresponding inactivation test. In the case of a fusion protein with a cleavable linker (1088/797), an increase in coagulation time from 210 seconds to 540 seconds (2.57 fold) showed only an increase from 196 seconds to 411 seconds (2.10 fold) with a non-cleavable linker. The accelerated inactivation process of FIXa activity by AT was demonstrated compared to the fusion protein (980/797) with Probably, in the case of a fusion protein having a non-cleavable linker, the albumin residue sterically affects the AT-dependent inactivation process, whereas in the case of a fusion protein having a cleavable linker, the albumin residue is cleaved off and accelerated by AT. Will lead to inactivation.

<110> CSL Behring GmbH <120> Proteolytically cleavable fusion protein comprising a blood coagulation factor <130> 2006_M004_A115 <150> EP 06012262.9 <151> 2006-06-14 <150> US 60/819,620 <151> 2006-07-11 <160> 112 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 585 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val 565 570 575 Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 580 585 <210> 2 <211> 415 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg 1 5 10 15 Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe 20 25 30 Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly 35 40 45 Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp 50 55 60 Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys 65 70 75 80 Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu 85 90 95 Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr 100 105 110 Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val 115 120 125 Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr 130 135 140 Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu 145 150 155 160 Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn 165 170 175 Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe 180 185 190 Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly 195 200 205 Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu 210 215 220 Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu 225 230 235 240 Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His 245 250 255 His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu 260 265 270 Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile 275 280 285 Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser 290 295 300 Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala 305 310 315 320 Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys 325 330 335 Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly 340 345 350 Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro 355 360 365 His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser 370 375 380 Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys 385 390 395 400 Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr 405 410 415 <210> 3 <211> 1386 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atgcagcgcg tgaacatgat catggcagaa tcaccaggcc tcatcaccat ctgcctttta 60 ggatatctac tcagtgctga atgtacagtt tttcttgatc atgaaaacgc caacaaaatt 120 ctgaatcggc caaagaggta taattcaggt aaattggaag agtttgttca agggaacctt 180 gagagagaat gtatggaaga aaagtgtagt tttgaagaag cacgagaagt ttttgaaaac 240 actgaaagaa caactgaatt ttggaagcag tatgttgatg gagatcagtg tgagtccaat 300 ccatgtttaa atggcggcag ttgcaaggat gacattaatt cctatgaatg ttggtgtccc 360 tttggatttg aaggaaagaa ctgtgaatta gatgtaacat gtaacattaa gaatggcaga 420 tgcgagcagt tttgtaaaaa tagtgctgat aacaaggtgg tttgctcctg tactgaggga 480 tatcgacttg cagaaaacca gaagtcctgt gaaccagcag tgccatttcc atgtggaaga 540 gtttctgttt cacaaacttc taagctcacc cgtgctgaga ctgtttttcc tgatgtggac 600 tatgtaaatt ctactgaagc tgaaaccatt ttggataaca tcactcaaag cacccaatca 660 tttaatgact tcactcgggt tgttggtgga gaagatgcca aaccaggtca attcccttgg 720 caggttgttt tgaatggtaa agttgatgca ttctgtggag gctctatcgt taatgaaaaa 780 tggattgtaa ctgctgccca ctgtgttgaa actggtgtta aaattacagt tgtcgcaggt 840 gaacataata ttgaggagac agaacataca gagcaaaagc gaaatgtgat tcgaattatt 900 cctcaccaca actacaatgc agctattaat aagtacaacc atgacattgc ccttctggaa 960 ctggacgaac ccttagtgct aaacagctac gttacaccta tttgcattgc tgacaaggaa 1020 tacacgaaca tcttcctcaa atttggatct ggctatgtaa gtggctgggg aagagtcttc 1080 cacaaaggga gatcagcttt agttcttcag taccttagag ttccacttgt tgaccgagcc 1140 acatgtcttc gatctacaaa gttcaccatc tataacaaca tgttctgtgc tggcttccat 1200 gaaggaggta gagattcatg tcaaggagat agtgggggac cccatgttac tgaagtggaa 1260 gggaccagtt tcttaactgg aattattagc tggggtgaag agtgtgcaat gaaaggcaaa 1320 tatggaatat ataccaaggt atcccggtat gtcaactgga ttaaggaaaa aacaaagctc 1380 acttaa 1386 <210> 4 <211> 1830 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt 60 gtgtttcgtc gagatgcaca caagagtgag gttgctcatc ggtttaaaga tttgggagaa 120 gaaaatttca 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780 tggattgtaa ctgctgccca ctgtgttgaa actggtgtta aaattacagt tgtcgcaggt 840 gaacataata ttgaggagac agaacataca gagcaaaagc gaaatgtgat tcgaattatt 900 cctcaccaca actacaatgc agctattaat aagtacaacc atgacattgc ccttctggaa 960 ctggacgaac ccttagtgct aaacagctac gttacaccta tttgcattgc tgacaaggaa 1020 tacacgaaca tcttcctcaa atttggatct ggctatgtaa gtggctgggg aagagtcttc 1080 cacaaaggga gatcagcttt agttcttcag taccttagag ttccacttgt tgaccgagcc 1140 acatgtcttc gatctacaaa gttcaccatc tataacaaca tgttctgtgc tggcttccat 1200 gaaggaggta gagattcatg tcaaggagat agtgggggac cccatgttac tgaagtggaa 1260 gggaccagtt tcttaactgg aattattagc tggggtgaag agtgtgcaat gaaaggcaaa 1320 tatggaatat ataccaaggt atcccggtat gtcaactgga ttaaggaaaa aacaaagctc 1380 acttaa 1386 <210> 4 <211> 1830 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt 60 gtgtttcgtc gagatgcaca caagagtgag gttgctcatc ggtttaaaga tttgggagaa 120 gaaaatttca aagccttggt gttgattgcc tttgctcagt atcttcagca gtgtccattt 180 gaagatcatg taaaattagt gaatgaagta actgaatttg caaaaacatg tgttgctgat 240 gagtcagctg aaaattgtga caaatcactt catacccttt ttggagacaa attatgcaca 300 gttgcaactc ttcgtgaaac ctatggtgaa atggctgact gctgtgcaaa acaagaacct 360 gagagaaatg aatgcttctt gcaacacaaa gatgacaacc caaacctccc ccgattggtg 420 agaccagagg ttgatgtgat gtgcactgct tttcatgaca atgaagagac atttttgaaa 480 aaatacttat atgaaattgc cagaagacat ccttactttt atgccccgga actccttttc 540 tttgctaaaa ggtataaagc tgcttttaca gaatgttgcc aagctgctga taaagctgcc 600 tgcctgttgc caaagctcga tgaacttcgg gatgaaggga aggcttcgtc tgccaaacag 660 agactcaagt gtgccagtct ccaaaaattt ggagaaagag ctttcaaagc atgggcagta 720 gctcgcctga gccagagatt tcccaaagct gagtttgcag aagtttccaa gttagtgaca 780 gatcttacca aagtccacac ggaatgctgc catggagatc tgcttgaatg tgctgatgac 840 agggcggacc ttgccaagta tatctgtgaa aatcaagatt cgatctccag taaactgaag 900 gaatgctgtg aaaaacctct gttggaaaaa tcccactgca ttgccgaagt ggaaaatgat 960 gagatgcctg ctgacttgcc ttcattagct gctgattttg ttgaaagtaa ggatgtttgc 1020 aaaaactatg ctgaggcaaa 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Leu Thr Arg Thr Glu Ala Val Phe Pro 1 5 10 15 Asp Val Asp <210> 46 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 46 Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Gly Glu Ala Val Phe Pro 1 5 10 15 Asp Val Asp <210> 47 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 47 Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp 1 5 10 <210> 48 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 48 Gln Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp 1 5 10 <210> 49 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 49 Gln Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Gly Ser 1 5 10 15 <210> 50 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 50 Gln Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg Thr Val Gly Gly Glu Asp 1 5 10 <210> 51 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 51 Gln Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg Leu Val Gly Gly Glu Asp 1 5 10 <210> 52 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 52 Gln Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg Gly Val Gly Gly Glu Asp 1 5 10 <210> 53 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 53 Gln Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Asn Gly 1 5 10 15 Ser <210> 54 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 54 Gln Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Asn 1 5 10 15 <210> 55 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 55 Arg Ile Val Gly Gly Gln Glu 1 5 <210> 56 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 56 Arg Leu Val Gly Gly Gln Glu 1 5 <210> 57 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 57 Arg Thr Val Gly Gly Gln Glu 1 5 <210> 58 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 58 Arg Val Val Gly Gly Gln Glu 1 5 <210> 59 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 59 Arg Ala Val Gly Gly Gln Glu 1 5 <210> 60 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 60 Arg Gly Val Gly Gly Gln Glu 1 5 <210> 61 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 61 Pro Glu Arg Gly Asp Asn Asn Leu Thr Arg Ile Val Gly Gly Gln Glu 1 5 10 15 <210> 62 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 62 Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro 1 5 10 15 Asp Val Asp <210> 63 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 63 Gln Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Asn 1 5 10 15 <210> 64 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 64 Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro 1 5 10 15 Asp Val Asp <210> 65 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 65 Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val 1 5 10 15 <210> 66 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 66 Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp 1 5 10 15 <210> 67 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 67 Asp Asn Ser Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His 1 5 10 15 Pro Lys Thr <210> 68 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 68 Leu Ser Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser 1 5 10 15 Arg His Pro Ser 20 <210> 69 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 69 Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg 1 5 10 15 His Tyr Phe Ile Ala 20 <210> 70 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 70 Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln 1 5 10 15 <210> 71 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 71 Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp 1 5 10 15 Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp Ser 20 <210> 72 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 72 Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys 1 5 10 15 Lys His Pro Lys Thr Trp Val His Tyr Ala Ala Glu Glu Glu Asp 20 25 30 <210> 73 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 73 Leu Ser Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser 1 5 10 15 Arg His Pro Ser Thr Arg Gln Lys Gln Phe Asn Ala 20 25 <210> 74 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 74 Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg 1 5 10 15 His Tyr Phe Ile Ala Ala 20 <210> 75 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 75 Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln 1 5 10 15 Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr 20 25 30 <210> 76 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 76 Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys 1 5 10 15 Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala 20 <210> 77 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 77 Asp Asn Ser Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His 1 5 10 15 Pro <210> 78 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 78 Leu Ser Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser 1 5 10 15 Arg His Pro Ser 20 <210> 79 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 79 Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro 1 5 10 15 Asp Val Thr Gln Pro Glu Arg Gly Asp Asn Asn Leu Thr Arg Ile Val 20 25 30 Gly Gly Gln Glu 35 <210> 80 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 80 Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Asn Asn Leu Thr 1 5 10 15 Arg Ile Val Gly Gly Gln Glu 20 <210> 81 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 81 Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Thr Gln Pro Glu Arg Gly Asp 1 5 10 15 Asn Asn Leu Thr Arg Ile Val Gly Gly Gln Glu 20 25 <210> 82 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 82 Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Glu Arg Gly Asp Asn Asn Leu Thr Arg 1 5 10 15 Ile Val Gly Gly Gln Glu 20 <210> 83 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 83 Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro 1 5 10 15 Asp Val Asp Tyr Val Asn Asn Leu Thr Arg Ile Val Gly Gly Gln Glu 20 25 30 <210> 84 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 84 Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro 1 5 10 15 Asp Val Asp Asn Asn Leu Thr Arg Ile Val Gly Gly Gln Glu 20 25 30 <210> 85 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 85 Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro 1 5 10 15 Asp Val Asp Asn Asn Leu Thr Arg Ile Val Gly Gly Gln Glu 20 25 30 <210> 86 <211> 52 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 86 Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro 1 5 10 15 Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn 20 25 30 Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg Val Val Gly 35 40 45 Gly Glu Asp Ala 50 <210> 87 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 87 Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro 1 5 10 15 Asp Val Gln Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp 20 25 30 <210> 88 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 88 Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro 1 5 10 15 Asp Val Asp Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp 20 25 30 <210> 89 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 89 Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro 1 5 10 15 Asp Val Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val 20 25 30 <210> 90 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 90 Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro 1 5 10 15 Asp Val Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Leu Val Gly Gly Lys Val 20 25 30 <210> 91 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 91 Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro 1 5 10 15 Asp Val Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Thr Val Gly Gly Lys Val 20 25 30 <210> 92 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 92 Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro 1 5 10 15 Asp Val Asp <210> 93 <211> 666 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 93 Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg 1 5 10 15 Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe 20 25 30 Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly 35 40 45 Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp 50 55 60 Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys 65 70 75 80 Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu 85 90 95 Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr 100 105 110 Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val 115 120 125 Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr 130 135 140 Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu 145 150 155 160 Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn 165 170 175 Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe 180 185 190 Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly 195 200 205 Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu 210 215 220 Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu 225 230 235 240 Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His 245 250 255 His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu 260 265 270 Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile 275 280 285 Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser 290 295 300 Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala 305 310 315 320 Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys 325 330 335 Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly 340 345 350 Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro 355 360 365 His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser 370 375 380 Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys 385 390 395 400 Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr Ser 405 410 415 Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp 420 425 430 Val Asp Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 435 440 445 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 450 455 460 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 465 470 475 480 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 485 490 495 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 500 505 510 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 515 520 525 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 530 535 540 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 545 550 555 560 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 565 570 575 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 580 585 590 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 595 600 605 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 610 615 620 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 625 630 635 640 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 645 650 655 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 660 665 <210> 94 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 94 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Val 1 5 <210> 95 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 95 Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro 1 5 10 15 Asp Val Asp Gly Ser Gly Gly Ser 20 <210> 96 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 96 Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro 1 5 10 15 Asp Val <210> 97 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 97 Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val 1 5 10 15 <210> 98 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 98 Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val 1 5 10 <210> 99 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 99 Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro 1 5 10 15 <210> 100 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 100 Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe 1 5 10 15 <210> 101 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 101 Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe 1 5 10 <210> 102 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 102 Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe 1 5 10 <210> 103 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 103 Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr 1 5 10 <210> 104 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 104 Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr 1 5 10 <210> 105 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 105 Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr 1 5 <210> 106 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 106 Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp 1 5 10 15 Gly Ser <210> 107 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 107 Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Gly Ser 1 5 10 15 <210> 108 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 108 Gln Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu 1 5 10 <210> 109 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 109 Pro Glu Arg Gly Asp Asn Asn Leu Thr Arg Ile Val Gly Gly Gln Glu 1 5 10 15 Gly Ser <210> 110 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 110 Pro Glu Arg Gly Asp Asn Asn Leu Thr Arg Ile Val Gly Gly Gln 1 5 10 15 <210> 111 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 111 Asp Asn Asn Leu Thr Arg Ile Val Gly Gly Gln 1 5 10 <210> 112 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 112 Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly 1 5 10

Claims

a) 응고 인자,
b) 알부민, 알부민 계열의 폴리펩타이드, 및 항원 결합 도메인이 없는 면역글로불린으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 반감기 향상 폴리펩타이드, 및
c) 상기 응고 인자와 상기 반감기 향상 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단을 결합시키는 펩타이드 링커로서, 응고에 관여하거나 응고 효소에 의해 활성화되는 프로테아제에 의해 절단가능하고, 상기 응고 인자와 상기 반감기 향상 폴리펩타이드 사이에 도입되는 상기 펩타이드 링커
를 포함하는 치료학적 융합 단백질로서, 아미노산 서열 GGGGGGV를 갖는 절단가능하지 않은 링커에 의해 연결된 각각의 치료학적 융합 단백질과 비교하여 하나 이상의 응고-관련 검정에서 증가된 몰 비활성(molar specific activity)을 가짐을 특징으로 하는 치료학적 융합 단백질.a) coagulation factor,
b) a half-life enhancing polypeptide selected from the group consisting of albumin, an albumin-based polypeptide, and an immunoglobulin lacking an antigen-binding domain, and
c) a peptide linker which binds the N-terminal or C-terminal of the half-life enhancing polypeptide with the coagulation factor, wherein the peptide linker is capable of cleaving by a protease involved in coagulation or activated by a coagulation enzyme, The peptide linker introduced between the polypeptides
Wherein the therapeutic fusion protein has increased molar specific activity in one or more coagulation-related assays compared to each therapeutic fusion protein linked by a non-cleavable linker having the amino acid sequence GGGGGGV Characterized by a therapeutic fusion protein.

a) 응고 인자,
b) 알부민, 알부민 계열의 폴리펩타이드, 및 항원 결합 도메인이 없는 면역글로불린으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 반감기 향상 폴리펩타이드, 및
c) 상기 응고 인자와 상기 반감기 향상 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단을 결합시키는 펩타이드 링커로서, 응고에 관여하거나 응고 효소에 의해 활성화되는 프로테아제에 의해 절단가능하고, 상기 응고 인자와 상기 반감기 향상 폴리펩타이드 사이에 도입되는 상기 펩타이드 링커
를 포함하는 치료학적 융합 단백질로서, 아미노산 서열 GGGGGGV를 갖는 절단가능하지 않은 링커에 의해 연결된 각각의 치료학적 융합 단백질과 비교하여 펩타이드 링커가 응고-관련 방식으로 단백질분해적으로 절단된 후 활성화된 응고 인자의 증가된 불활성화율을 가짐을 특징으로 하는 치료학적 융합 단백질.a) coagulation factor,
b) a half-life enhancing polypeptide selected from the group consisting of albumin, an albumin-based polypeptide, and an immunoglobulin lacking an antigen-binding domain, and
c) a peptide linker which binds the N-terminal or C-terminal of the half-life enhancing polypeptide with the coagulation factor, wherein the peptide linker is capable of cleaving by a protease involved in coagulation or activated by a coagulation enzyme, The peptide linker introduced between the polypeptides
, Wherein the peptide linker is proteolytically cleaved in a coagulation-related manner and then activated coagulation factor (s), as compared to the respective therapeutic fusion protein linked by a non-cleavable linker having the amino acid sequence GGGGGGV &Lt; / RTI > of the fusion protein.

a) 응고 인자,
b) 알부민, 알부민 계열의 폴리펩타이드, 및 항원 결합 도메인이 없는 면역글로불린으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 반감기 향상 폴리펩타이드, 및
c) 상기 응고 인자와 상기 반감기 향상 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단을 결합시키는 펩타이드 링커로서, 응고에 관여하거나 응고 효소에 의해 활성화되는 프로테아제에 의해 절단가능하고, 상기 응고 인자와 상기 반감기 향상 폴리펩타이드 사이에 도입되는 상기 펩타이드 링커
를 포함하는 치료학적 융합 단백질로서, 아미노산 서열 GGGGGGV를 갖는 절단가능하지 않은 링커에 의해 연결된 각각의 치료학적 융합 단백질과 비교하여 펩타이드 링커가 응고-관련 방식으로 단백질분해적으로 절단된 후 활성화된 응고 인자의 증가된 제거율을 가짐을 특징으로 하는 치료학적 융합 단백질.a) coagulation factor,
b) a half-life enhancing polypeptide selected from the group consisting of albumin, an albumin-based polypeptide, and an immunoglobulin lacking an antigen-binding domain, and
c) a peptide linker which binds the N-terminal or C-terminal of the half-life enhancing polypeptide with the coagulation factor, wherein the peptide linker is capable of cleaving by a protease involved in coagulation or activated by a coagulation enzyme, The peptide linker introduced between the polypeptides
, Wherein the peptide linker is proteolytically cleaved in a coagulation-related manner and then activated coagulation factor (s), as compared to the respective therapeutic fusion protein linked by a non-cleavable linker having the amino acid sequence GGGGGGV &Lt; / RTI > of the fusion protein.

제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질이 반감기 향상 폴리펩타이드에 융합되지 않은 각각의 응고 인자의 생체내 회수율과 비교하여 보다 높은 생체내 회수율을 갖는, 치료학적 융합 단백질.4. The therapeutic fusion protein of any one of claims 1 to 3 wherein the fusion protein has a higher in vivo recovery compared to the in vivo recovery of each coagulation factor that is not fused to the half-life enhancing polypeptide.

제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질이 반감기 향상 폴리펩타이드에 융합되지 않은 각각의 응고 인자의 혈장내 반감기와 비교하여 증가된 혈장내 반감기를 갖는, 치료학적 융합 단백질.4. The therapeutic fusion protein according to any one of claims 1 to 3, wherein the fusion protein has an increased plasma half-life compared to the plasma half-life of each coagulation factor that is not fused to the half-life enhancing polypeptide.

제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 응고 인자가 비타민-K 의존성 응고 인자인, 치료학적 융합 단백질.4. The therapeutic fusion protein according to any one of claims 1 to 3, wherein the coagulation factor is a vitamin K-dependent coagulation factor.

제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 응고 인자가 FVIIa 또는 FIX인, 치료학적 융합 단백질.4. The therapeutic fusion protein according to any one of claims 1 to 3, wherein the coagulation factor is FVIIa or FIX.

제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 반감기 향상 폴리펩타이드가 항원 결합 도메인이 없는 면역글로불린인, 치료학적 융합 단백질.4. The therapeutic fusion protein according to any one of claims 1 to 3, wherein the half-life enhancing polypeptide is an immunoglobulin free of an antigen binding domain.

제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 링커가 FXIa 및/또는 FVIIa/TF(조직 인자; Tissue Factor)에 의해 절단가능한, 치료학적 융합 단백질.4. The therapeutic fusion protein according to any one of claims 1 to 3, wherein the linker is cleavable by FXIa and / or FVIIa / TF (Tissue Factor).

제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 치료학적 융합 단백질의 응고-관련 몰 비활성이 이용가능한 상이한 응고-관련 검정 중 하나 이상에서 아미노산 서열 GGGGGGV를 갖는 절단가능하지 않은 링커에 의해 연결된 치료학적 융합 단백질과 비교하여 25% 이상 증가된, 치료학적 융합 단백질.4. The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the coagulation-related molar inactivity of the therapeutic fusion protein is linked by a non-cleavable linker having the amino acid sequence GGGGGGV in one or more of the different coagulation- Therapeutic fusion protein increased by over 25% compared to therapeutic fusion protein.

제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 응고 인자를 상기 반감기 향상 폴리펩타이드에 연결시키는 펩타이드 링커의 절단 후 상기 응고 인자의 불활성화율이 아미노산 서열 GGGGGGV를 갖는 절단가능하지 않은 링커에 의해 연결된 상응하는 치료학적 융합물에서의 응고 인자의 불활성화율과 비교하여 10% 이상 증가된, 치료학적 융합 단백질.4. The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the inactivation rate of the clotting factor after cleavage of the peptide linker that links the clotting factor to the half-life enhancing polypeptide is greater than that of the non-cleavable linker with the amino acid sequence GGGGGGV Wherein the therapeutic fusion protein is increased by at least 10% as compared to the inactivation rate of the coagulation factor in the corresponding corresponding therapeutic fusion.

제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 응고 인자를 상기 반감기 향상 폴리펩타이드에 연결시키는 펩타이드 링커의 절단 후 상기 응고 인자의 제거율이 아미노산 서열 GGGGGGV를 갖는 절단가능하지 않은 링커에 의해 연결된 상응하는 치료학적 융합 단백질에서의 응고 인자의 제거율과 비교하여 10% 이상 증가된, 치료학적 융합 단백질.4. The method of any one of claims 1 to 3 wherein the removal rate of the coagulation factor after cleavage of the peptide linker that links the coagulation factor to the half-life enhancing polypeptide is linked by a non-cleavable linker having the amino acid sequence GGGGGGV Wherein the therapeutic fusion protein is increased by at least 10% as compared to the removal rate of the coagulation factor in the corresponding therapeutic fusion protein.

제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 링커가 응고 인자를 활성화시키는 프로테아제 또는 프로테아제들에 의해 절단가능한, 치료학적 융합 단백질.4. The therapeutic fusion protein according to any one of claims 1 to 3, wherein the linker is cleavable by proteases or proteases which activate clotting factors.

제13항에 있어서, 상기 프로테아제 또는 프로테아제들에 의한 링커 절단의 반응속도론이 상기 응고 인자 활성화의 반응속도론과 비교하여 3배 이상 지연되지 않는, 치료학적 융합 단백질.14. The therapeutic fusion protein of claim 13, wherein the kinase kinetics of linker cleavage by the protease or proteases is no more than three times slower than the kinetics of the coagulation factor activation.

제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 링커가 상기 응고 인자의 포함시 활성화되는 프로테아제 또는 프로테아제들에 의해 절단가능한, 치료학적 융합 단백질.4. The therapeutic fusion protein according to any one of claims 1 to 3, wherein the linker is cleavable by proteases or proteases which are activated upon incorporation of the coagulation factor.

제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 링커가 FXIa 및/또는 FVIIa/TF(조직 인자; Tissue Factor)에 의해 절단가능하고 상기 응고 인자가 FIX인, 치료학적 융합 단백질.4. The therapeutic fusion protein according to any one of claims 1 to 3, wherein the linker is cleavable by FXIa and / or FVIIa / TF (Tissue Factor) and the coagulation factor is FIX.

제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 링커가 FXa 및/또는 FVIIa/TF(조직 인자; Tissue Factor)에 의해 절단가능하고 상기 응고 인자가 FVIIa인, 치료학적 융합 단백질.4. The therapeutic fusion protein according to any one of claims 1 to 3, wherein the linker is cleavable by FXa and / or FVIIa / TF (Tissue Factor) and the coagulation factor is FVIIa.

제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 링커가 서열번호 36 내지 54, 서열번호 61 내지 92 및 서열번호 95 내지 112로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 치료학적 융합 단백질.4. The therapeutic fusion protein according to any one of claims 1 to 3, wherein the linker comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 36 to 54, SEQ ID NOs: 61 to 92 and SEQ ID NOs: .

제1항에 따른 치료학적 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.A polynucleotide encoding the therapeutic fusion protein of claim 1.

제19항에 따른 핵산을 포함하는 플라스미드 또는 벡터.A plasmid or vector comprising the nucleic acid according to claim 19.

제20항에 있어서, 발현 벡터인 플라스미드 또는 벡터.21. The plasmid or vector of claim 20, which is an expression vector.

제21항에 있어서, 상기 벡터가 사람 유전자 치료요법에 사용하기 위한 전달 벡터인, 플라스미드 또는 벡터.22. The plasmid or vector of claim 21, wherein said vector is a transfer vector for use in human gene therapy regimens.

제19항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 함유하는 플라스미드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포.20. A host cell comprising a polynucleotide according to claim 19 or a plasmid or vector containing the polynucleotide.

제23항에 따른 숙주 세포를 치료학적 융합 단백질이 발현되는 조건하에 배양함을 포함하여, 제1항에 따른 치료학적 융합 단백질을 제조하는 방법.24. A method for producing a therapeutic fusion protein according to claim 1, comprising culturing the host cell according to claim 23 under conditions in which the therapeutic fusion protein is expressed.

제24항에 있어서, 상기 숙주 세포 또는 상기 배양 배지로부터 치료학적 융합 단백질을 회수함을 추가로 포함하는 방법.25. The method of claim 24, further comprising recovering the therapeutic fusion protein from the host cell or the culture medium.

제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따른 치료학적 융합 단백질, 제19항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 제20항 내지 제22항 중의 어느 한 항에 따른 플라스미드 또는 벡터를 포함하는, 혈액 응고 장애를 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물.A therapeutic fusion protein according to any one of claims 1 to 3, a polynucleotide according to claim 19 or a plasmid or vector according to any one of claims 20 to 22, &Lt; / RTI >

제26항에 있어서, 상기 혈액 응고 장애가 혈우병 B인, 약제학적 조성물.27. The pharmaceutical composition according to claim 26, wherein the blood coagulation disorder is hemophilia B.

제26항에 있어서, 상기 혈액 응고 장애가 FVII 및/또는 FVIIa 결핍증인, 약제학적 조성물.27. The pharmaceutical composition of claim 26, wherein said coagulation disorder is FVII and / or FVIIa deficiency.

제26항에 있어서, 상기 혈액 응고 장애가 혈우병 A인, 약제학적 조성물.27. The pharmaceutical composition according to claim 26, wherein the blood coagulation disorder is hemophilia A.

제26항에 있어서, 상기 치료가 사람 유전자 치료요법을 포함하는, 약제학적 조성물.27. The pharmaceutical composition of claim 26, wherein said treatment comprises human gene therapy.