KR20140096222A - 메트포르민을 유효 성분으로 함유하는 염증성 장 질환의 치료 및 예방용 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 메트포르민을 유효성분으로 함유하는 염증성 장 질환의 치료 및 예방용 약학적 조성물로서, 상기 메트포르민이 장 상피세포에서 NF-κB의 활성을 억제할 수 있어 궤장성 대장염, 크론병 등의 염증성 장 질환의 치료 및 예방에 효과적으로 이용할 수 있다.

Description

메트포르민을 유효 성분으로 함유하는 염증성 장 질환의 치료 및 예방용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for treating and preventing inflammatory bowel disease comprising metformin}

본 발명은 메트포르민을 유효성분으로 함유하는 염증성 장 질환의 치료 및 예방용 약학 조성물에 관한 것이다.

크론병 및 궤양성 대장염을 포함하는 염증성 장 질환(IBD, inflammatory bowel disease)은 점막 면역 시스템에서 면역학적 반응의 조절장애로 인해 생기는 만성적인 재발성 소화관 염증으로서, 지금까지 IBD의 병리 현상과 생물학적 치료법의 이해에 대해서는 많은 진전이 있었지만 여전히 IBD의 재발없는 치유는 아직 요원한 실정이다. 또한, 장기간의 IBD는 대장염-유관 대장암(CAC, colitis-associated colon cancer)의 위험을 높이므로 IBD 환자를 위한 더욱 효율적이며 안전한 치료제를 개발하는 것이 절실히 필요한 실정이다.

장상피는 점막 장벽으로서, 방대한 미생물에 의해 제시되는 적대적인 관강 항원으로부터 분리주에 대한 보호를 제공한다. 물리적 장벽 기능에 더하여, 장상피 세포(IEC, intestinal epithelial cells)는 종양괴사인자-α(TNF-α, tumor-necrosis factor-α) 및 인터류킨(IL)-1β를 포함하는 여러 전염증성 사이토카인 또는 리포폴리다당(LPS)과 같은 박테리아 표면 분자에 노출되었을 때 전염증성 유전자 전사를 유도하는 복잡하고 고도로 통합된 연속반응을 활성화한다. 이런 복잡한 연속반응에서 전사인자인 핵 인자-kappaB(NF-κB)의 활성화는 TNF-α, IL-2, IL-6, IL-8, 및 세포내 부착 분자-1(ICAM-1)를 포함해서 조기 염증 반응에 수반되는 각종 유전자를 조절한다. 또한, NF-κB 활성화가 장상피 투과성의 상향조절에 핵심적인 역할을 한다. 이와 같이, 기존의 증거는 IBD에서 NF-κB 신호화의 역할을 뒷받침하며, 이는 IEC에서 NF-κB 활성의 조절이 IBD의 치료 표적이 될 수 있음을 시사한다.

메트포르민(Metformin, 1,1-dimethylbiguanide hydrochloride, 1,1-디메틸바이구아나이드 염산염)은 바이구아나이드 유도체로서, 30년 이상 동안 당뇨병 환자에게 처방되어 왔다. 메트포르민은 항당뇨 효과에 더해서 지질 프로파일 및 인슐린 감수성을 개선함으로써 대사상의 이점을 제공한다. 메트포르민은 최근에 생체 내 및 시험관내 내피 세포에서 NF-κB 신호화의 억제를 통해 죽상경화증에서 항염증 효과를 제공한다는 것이 보고되었다. 흥미롭게도 메트포르민은 제2형 당뇨병 환자에서 대장암의 위험을 감소시키며, 마우스 모델에서는 아족시메탄-유도 직결장 이상함몰점(azoxymethane-induced colorectal aberrant crypt foci)을 억제한다.

다만, 상기와 같은 연구는 메트포르민이 항염 또는 항종양 특성을 지닌다는 것을 암시하지만 장 염증에 대한 메트포르민 효과의 정확한 메커니즘은 아직까지 정의되지 않았다.

이에 본 발명자들은 메트포르민이 IEC에서 NF-κB 경로를 억제하며, 장 염증과 대장 종양형성을 완화할 수 있다는 것을 동물 모델 실험을 통하여 최초로 확인하였고, 구체적으로 IEC에서 NF-κB 신호화에 대한 메트포르민의 효과와 덱스트란 술페이트 나트륨(DSS)-유도 급성 대장염에 대한 메트포르민의 효과를 확인했다. 또한, 아족시메탄 및 DSS-유도 CAC 마우스 모델에서 메트포르민의 항종양 효과를 확인하였다.

[선행기술문헌]

[비특허문헌]

(비특허문헌 1) Li SN, Wang X, Zeng QT, et al. Metformin inhibits nuclear factor kappaB activation and decreases serum high-sensitivity C-reactive protein level in experimental atherogenesis of rabbits. HeartVessels. 2009;24:446-453.

(비특허문헌 2) Huang NL, Chiang SH, Hsueh CH, et al. Metformin inhibits TNF-alpha-induced IkappaB kinase phosphorylation, IkappaB-alpha degradation and IL-6 production in endothelial cells through PI3K-dependent AMPK phosphorylation. IntJCardiol. 2009;134:169-175.

따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 염증성 장 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여, 메트포르민을 유효성분으로 함유하는 염증성 장 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.

상기 메트포르민은 하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물로서, 당뇨병 치료, 특히 제2형 당뇨병 치료에 유용하여 현재 널리 사용되고 있는 물질로서, 그 안전성이 충분히 확보되어 있는 물질이고, 본 발명자들은 이러한 메트포르민이 염증성 장 질환(IBD, inflammatory bowel disease)을 효과적으로 예방하고 치료할 수 있다는 것을 최초로 발견하였다.

[화학식 1]

본 발명자들은 메트포르민이 종양괴사인자-α(TNF-α)로 자극된 COLO 205 세포에서 인터루킨(IL)-8 유도를 현격하게 억제함을 실험으로 확인하였으며, 메트포르민에 의한 전처리가 TNF-α에 의해 유도된 IκBα 인산화 및 NF-κB DNA 결합 활성을 약화시켰음을 또한, 실험으로 확인하였다. 급성 뮤린 대장염 모델 실험에서는 메트포르민의 투여가 질병 활성 지수, 대장 길이 및 조직학에 의해서 평가했을 때 덱스트란 술페이트 나트륨(DSS)-유도 대장염의 중증도를 상당히 감소시킴을 확인하였다. 또한, 메트포르민으로 치료된 마우스에서는 DSS-유도 IκB 키나아제(IKK) 활성화도 상당히 감소되었다. 또한, 메트포르민은 아족시메탄과 DSS를 접종한 마우스에서 대장암의 발생을 약화시켰다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 메트포르민이 장 상피세포에서 NF-κB(nuclear factor-κB)의 활성을 억제할 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 조성물은 장 상피세포에서 NF-κB 활성 억제제로 이용될 수도 있다.

또한, 상기 NF-κB의 활성 억제는 IκBα 인산화 및 NF-κB DNA 결합 활성을 약화하여 이루어지는 것일 수 있다.

또한, 상기 NF-κB의 활성 억제에 의해서 인터루킨-8(IL-8) 유전자의 발현이 억제되는 것일 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 조성물은 IL-8 유전자 발현 조절제로도 이용될 수도 있다.

상기 "염증성 장 질환"이라 함은 염증이 매개된 모든 장 질환을 포함하는 의미로서, 구체적으로 궤장성 대장염, 크론병, 셀리악 병, 장관형 베체트 병 또는 허혈성 장염일 수 있다.

상기 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

상기 "예방"이란 본 발명에 따른 메트포르민을 유효성분으로 포함하는 조성물에 의해서 염증성 장 질환의 발병을 억제시키거나 발병을 지연하는 모든 행위를 말하며, "치료"란 본 발명에 따른 메트포르민을 유효성분으로 포함하는 조성물에 의해서 염증성 장 질환을 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 따른 메트포르민을 함유하는 염증성 장 질환 예방 또는 치료용 조성물은 그 유효성분을 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 염증성 장 질환의 개선 활성을 나타낼 수 있는 한 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 15 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 이 때, "유효량"이란 그 적용 대상인 포유동물 더욱 바람직하게는 사람에게서, 염증성 장 질환의 예방, 치료 또는 이러한 병리적 증상의 발병 억제와 지연을 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 메트포르민을 함유하는 염증성 장 질환 예방 또는 치료용 조성물은 구체적인 양태에 있어서 약학적 조성물로 이용될 수 있으며, 처방, 적용될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다.

본 발명의 약학적 조성물은 그 유효성분을 포함하는 이외에 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 등을 포함하여 정제, 현탁액, 과립, 에멀젼, 캡슐, 시럽 등의 경구용 제형으로 제조될 수 있고, 또한 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액 등의 비경구형 제형이나 용액, 크림, 연고, 겔, 로션, 패치 등의 국소형 제형 등으로도 제조될 수 있다.

상기 "약학적으로 허용되는"의 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 처방, 적용 대상이 적응 가능한 이상의 독성(충분히 낮은 독성)을 지니지 않는다는 의미이다.

약학적으로 허용되는 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 옥수수 전분이나 감자 전분 등의 전분, 셀룰로오스나 이의 유도체인 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스 또는 에틸셀룰로오스, 맥아, 젤라틴, 탈크, 스테아르산이나 스테아르산 마그네슘 등의 고체 윤활제, 황산 칼슘, 땅콩 기름, 면실유, 참기름, 올리브유 등의 식물성 기름, 프로필렌 글리콜이나 글리세린 등의 폴리올, 알긴산, TWEENS, 라우릴 황산 나트륨, 착색제, 풍미제, 안정화제, 항산화제, 보존제, 물, 식염수, 인산염 완충 용액 등을 들 수 있으며, 이러한 담체는 본 발명의 약학적 조성물의 제형에 따라 적당한 것을 하나 이상 선택하여 사용할 수 있다.

또한, 상기 부형제도 본 발명의 약학적 조성물의 제형에 따라 적합한 것을 선택하여 사용할 수 있는데, 예컨대 본 발명의 약학적 조성물이 수성 현탁제로 제조될 경우에 적합한 부형제로서는 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드로프로필메틸셀룰로오스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈 등의 현탁제나 분산제 등을 들 수 있으며, 주사액으로 제조되는 경우 적합한 부형제로서는 링거액, 등장 염화나트륨 등을 들 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 1일 투여량이 통상 0.001-150 mg/kg 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니된다.

본 발명에 따른 메트포르민을 함유하는 약학 조성물에 의해서 염증성 장 질환, 특히 궤장성 대장염, 크론병 등을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

도 1은 TNF-α로 자극된 COLO 205에서 IL-8 발현에 대한 메트포르민의 효과를 보여주는 것으로서,
도 1A에 도시된 바와 같이, COLO 205 세포가 pIL-8-루시페라제 전사 리포터로 형질감염시켰다. 24시간 후, 형질감염된 세포를 18시간 동안 명시된 농도로 메트포르민으로 전처리한 다음, 6시간 동안 TNF-α(20 ng/mL)와 조합시켰다. 데이터는 비자극 대조군(n=5)에 대한 루시페라제 활성의 평균 유도 배수 ± SEM으로 표시된다. 비자극 대조군에 대한 β-액틴 리포터 유전자 활성의 평균 유도 배수는 실험 내내 비교적 일정하게 유지되었다. (B) COLO 205 세포를 18시간 동안 명시된 농도로 메트포르민으로 전처리한 다음, 8시간 동안 TNF-α(20 ng/mL)로 자극했다. IL-8 mRNA 발현이 실시간 RT-PCR로 측정되었다. β-액틴에 대해 수준들이 정규화된다. 데이터는 비자극 대조군에 대한 mRNA 전사체 수준의 변화 배수로서 표시된다(평균 ± SEM, n=5). (C) COLO 205 세포를 18시간 동안 메트포르민으로 전처리한 다음, 24시간 동안 TNF-α(20 ng/mL)로 자극했다. IL-8의 분비가 ELISA에 의해 측정되었다(평균 ± SEM, n=5).
* P < 0.05, TNF-α 단독과 비교
Met : 메트포르민
도 2는 TNF-α-자극된 COLO 205 세포에서 NF-κB DNA 결합 활성에 대한 메트포르민의 효과를 보여주는 것으로서,
(A) COLO 205 세포를 18시간 동안 나타낸 농도로 메트포르민으로 전처리한 다음, 1시간 동안 TNF-α(20 ng/mL)로 자극했다. 핵 추출물에서 NF-κB DNA 결합 활성이 EMSA에 의해 평가되었다. 데이터는 3회를 넘는 독립적 실험들을 나타낸다. (B) COLO 205 세포가 2× pNF-κB-루시페라제 전사 리포터로 형질감염되었다. 24시간 후, 형질감염된 세포를 18시간 동안 나타낸 농도로 메트포르민으로 전처리한 다음, 1시간 동안 TNF-α(20 ng/mL)와 조합시켰다. 데이터는 비자극 대조군에 대한 루시페라제 활성의 평균 유도 배수 ± SEM으로 표시된다(n=5). 비자극 대조군에 대한 β-액틴 리포터 유전자 활성의 평균 유도 배수는 실험 내내 비교적 일정하게 유지되었다.
* P < 0.05, TNF-a단독과 비교
Met : 메트포르민
도 3은 TNF-α-자극된 세포에서 메트포르민에 의한 IκBα 인산화의 억제를 보여주는 것으로서,
(A) COLO 205 세포를 18시간 동안 나타낸 농도로 메트포르민으로 전처리한 다음, 1시간 동안 TNF-α(20 ng/mL)로 자극했다. 포스포-IκBα, IκBα 및 액틴에 대한 면역블롯 분석이 수행되었다. 데이터는 3회를 넘는 독립적 실험들을 나타낸다. (B) 포스포-IκBα의 짧은 반감기 때문에 포스포-IκBα를 검출하는 것이 어려우므로 포스포-IκBα의 수준은 상업용 IκBα ELISA를 사용하여 측정되었다. 데이터는 미처리 대조군에 대한 평균 유도 배수 ± SEM으로 표시된다(n=5).
* P < 0.05, 단독과 비교
Met, 메트포르민
도 4는 DSS-유도 급성 뮤린 대장염에서 (A) 근부위 대장 및 (B) 원부위 대장의 조직학적 평가 결과를 보여주는 것으로서,
마우스를 대조군, 덱스트란 술페이트 나트륨(DSS)과 비히클, 또는 DSS와 메트포르민(100 또는 500 mg/kg/day)의 4 그룹으로 나누었다. 조직학적 점수의 총계는 전체 염증과 함몰부 손상의 중증도와 범위로부터 유래되었다(평균 ± SD). DSS-처리된 마우스의 대장은 상피 구조의 완전한 파괴를 나타냈으며, 함몰부 및 상피 완전성의 상실, 점막하 부종 및 모든 층에서 집중적인 염증성 세포 침윤을 동반했다. 메트포르민 치료는 이런 형태학적 손상을 약화시켰다. 결과는 적어도 3회의 개별 시험된 부위들을 나타낸다(배율 ×100).
DSS : 덱스트란 술페이트 나트륨
PBS : 인산염 완충 식염수
Met 100 : 메트포르민 100 mg/kg/day
Met 500 : 메트포르민 500 mg/kg/day
* P < 0.05, 비히클-처리된 마우스와 비교
도 5는 DSS-유도 뮤린 대장염에서 (A) 근부위 대장 상피 및 (B) 원부위 대장 상피에서 시험관내 IκB 키나아제(IKK)에 대한 면역조직화학 염색 결과를 보여주는 것으로서,
조직 견본을 항- 포스포-IKK-α/β로 면역조직화학 염색했다. 포스포-IKK-α/β에 대한 면역반응성 지수, DSS 노출은 대조군 마우스와 비교해서 포스포-포스포-IKK-α/β 염색 점수에서 상당한 증가(화살표)를 가져왔다. 그러나 메트포르민(500 mg/kg/day)의 투여는 대장 샘플에서 포스포-IKK-α/β 염색 정도를 상당히 감소시켰다(평균 ± SD).
DSS : 덱스트란 술페이트 나트륨
PBS : 인산염 완충 식염수
Met 500 : 메트포르민 500 mg/kg/day
* P < 0.05, DSS+비히클과 비교
도 6은 대장염-유관 대장암 마우스 모델에서 메트포르민의 효과를 보여주는 것으로서,
(A) 대장 샘플에서 종양 발생 수(평균 ± SD) 및 (B) CAC 모델에서 메트포르민으로 치료한 경우와 치료하지 않은 경우의 대표적인 대장 샘플이다. 메트포르민의 투여는 AOM/DSS 모델에서 종양 발생 수를 상당히 감소시켰다.
* P < 0.05, AOM+DSS와 비교
AOM : 아족시메탄
DSS : 덱스트란 술페이트 나트륨
Met 500 : 메트포르민 500 mg/kg/day

이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않고, 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

<실시예>

실험예 : 본 발명에 따른 실험 재료와 실험 방법은 다음과 같다.

(1) 세포 배양 및 처리

사람 대장암 셀라인 COLO 205[10222; 한국 셀라인 은행(KCLB), 대한민국 서울]를 사용하여 15 내지 30회 계대 배양하였고, 세포를 성장시켰다.

메트포르민을 인산염-완충 식염수(PBS)에 용해했다. 세포를 다양한 농도의 메트포르민(0-500 mM) (Sigma, St. Louis, MO) 또는 PBS로 처리하고, TNF-α(10 ng/mL)로 자극하였다.

(2) 형질감염 및 리포터 분석

세포를 루시페라제 플러스 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용해서 1.5 ㎍ 플라스미드 DNA로 형질감염시켰다. 형질감염 후, 세포를 5% 이산화탄소 인큐베이터에 넣어 37 ℃에서 24 시간 동안 성장시킨 다음 수거하였고, 총 세포 추출물을 제조하였다. 정해진 프로토콜(Tropix, Bedford, MA)에 따라 루시페라제 활성을 측정하였고, 루시페라제 활성을 β-갈락토시다아제 발현에 대해 정규화했다.

(3) 실시간 RT-PCR 및 ELISA

실시간 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 전체 세포성 RNA 1 ㎍을 Trizol(GIBCO, Gaithersburg, MD)을 사용해서 COLO 205로부터 분리하고, SYBR 그린 PCR Master Mix와 ABI 프리즘 7000 서열 검출 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA)사용해서 역전사하여 증폭했다. 사람 IL-8 및 β-액틴에 대한 특이적 프라이머를 사용했다. 증폭은 3회 중복 수행했고, β-액틴 수준에 대해 데이터를 정규화했다. 상업용 ELISA 키트(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 사용해서 사람 IL-8과 포스포-IκBα의 양을 측정했다.

(4) 전기영동 이동도 이동 분석

COLO 205 세포를 수거하고, 핵 추출물을 분리했다. Bradford 분석(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용해서 추출물 중의 단백질 농도를 측정했다. 상업적으로 입수가능한 키트(Promega, Madison, WI)를 가지고 전기영동 이동도 이동 분석(EMSA)을 수행했다.

핵 추출물 5 ㎍을 컨센서스 NF-κB 결합 부위에 해당하는γ³²P-표지된 올리고뉴클레오티드 프로브(5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3')와 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션했다. 5% 비변성 폴리아크릴아미드 겔 위에서 결합된 DNA와 자유 DNA를 분리했다.

(5) 면역블롯 분석

COLO 205 세포를 얼음 냉각한 PBS로 세척하고, 0.5 mL 세포용해 버퍼(150 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 7.5, 0.1 Triton X-100, 1 mM PMSF, 및 10 ㎍/mL 아프로티닌)에서 용해했다. Bradford 분석(Bio-Rad)에 의해 용해물 중 단백질 농도를 결정했다. 레인 당 단백질 20 ㎍을 10% 폴리아크릴아미드 미니겔 위에서 크기 분류해서 마이크로셀룰로오스 멤브레인에 옮겼다. 항-IκBα(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), 포스포-IκBα(Cell Signaling, Beverly, MA) 및 항-β-액틴(Santa Cruz Biotechnology)을 1차 항체로 사용하여 NF-κB 신호화와 관련된 특정 단백질을 검출했다. 퍼옥시다아제-콘쥬게이트 항-마우스 IgG를 2차 항체로 사용했다. 증강된 화학발광 시스템(Amersham Life Science, Buckinghamshire, England)을 사용해서 결합된 항체를 시각화한 다음, Kodak X-OMAT 필름에 노출시켰다.

(6) DSS-유도 급성 뮤린 대장염의 유도 및 메트포르민을 사용한 치료

특정 병원균이 없는 마우스(C57BL/6NCrljBgi 수컷 마우스, 6-7주)를 Orient(대한민국 성남)에서 구입했다. 마우스는 원하는 연령(7-8주)과 체중(20-22 g)에 도달할 때까지 자유롭게 물과 표준 설치류 사료에 접근할 수 있게 하였으며, 모든 동물 과정은 서울대학교 병원의 실험동물 관리사용 위원회에 의해 승인되었다.

DSS(MP biochemical, Irvine, CA)를 사용해서 급성 대장염을 유도했다. 마우스를 칭량한 후 각 그룹에 5마리씩 무작위 배정했다. 음성 대조군에 배정된 마우스에는 여과된 물만 제공했다. DSS를 음용수에 용해해서 5일 동안 투여했다. 메트포르민(즉, 100 mg/kg/day과 500 mg/kg/day)을 PBS에 용해해서 DSS 투여 2일 전부터 시작해서 경구위관법으로 매일 1회 투여했다. 질병 활성 지수(DAI)를 평가하기 위해 본 발명자들은 체중, 대변 농도 및 혈변이나 항문 주변 혈액의 존재를 매일 평가했하고, 물과 음식의 소비도 기록했다.

(7) 육안 분석 및 조직학적 분석

육안 분석 및 조직학적 분석을 수행했다. 8일째에 마우스를 이소플루란을 흡입시켜 안락사시키고, 마우스가 죽은 후 큰창자부터 항문까지 전체 대장을 추출한 다음 세로로 갈라 열었으며, 대장 길이와 전체적인 외관을 평가했다. 제거한 조직을 파라핀에 포매된 10% 완충 포르말린에 넣어 고정하고, 헤마톡실린-에오신으로 염색했다. 그룹 배정을 전혀 알지 못하는 상태에서 조직학의 정량적 평가를 수행했다.

(8) 마우스에서 대장염-유관 대장암의 유도

CAC 유도를 수행했다. 7-8주된 수컷 마우스를 사용하였으며, 체중에 따라서 각 그룹에 5마리의 마우스를 무작위 배정했다. 제 0일에 마우스에게 AOM(12 mg/kg)을 1회 복강내 주사하였고, 7일 후, 2% DSS를 5일 동안 음용수를 통해 투여하고, 이어서 16일 동안 자유롭게 물을 소비하도록 했다. 이 사이클을 3회 반복하였다. 비히클 또는 메트포르민(1일당 500 mg/kg)을 사용한 치료를 8일째에 시작해서 경구위관법에 의해 매일 1회 수행했다. 마지막 2% DSS 투여 후 10일 뒤에 마우스를 안락사시켰다.

(9) 면역조직화학 염색

면역조직화학 분석을 수행했다. 슬라이드를 Tris/EDTA 버퍼(pH 9.0)에 담가서 클로킹을 제거한 챔버에 넣어 125 ℃에서 3분간 가열한 다음, 10-20분 동안 냉각시켰다. 3% 과산화수소를 첨가한 후, 10분 동안 인큐베이션하였다. Tris-완충 식염수(TBS) Tween-20(pH 7.6)으로 세척한 후, 자동면역염색장치(Autostainer 2D, Lab Vision Co., Fremont, CA, USA)에서 1시간 동안 슬라이드를 토끼 다중클론성 항-포스포-IKK-α/β 항체(Cell signaling Technology)로 염색했다. 염색된 슬라이드를 TBS Tween-20으로 3번 세척하고, 2차 항체와 함께 30분 동안 인큐베이션했다. 슬라이드를 20분 동안 스트렙토아비딘과 반응시킨 후, 5분간 반응물을 3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드에 의해 시각화하고, 슬라이드를 Meyer의 헤마톡실린으로 대조 염색했다. 각 슬라이드를 포스포-IKK-α/β 면역조직화학에 대해서 0 내지 4+ 스케일로 면역반응 강도로서 평가했다.

(10) 통계 분석

Bonferroni 보정한 변량 분석에 의해서 그룹간 차이를 분석했다. 0.05 미만의 P 값이 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

실험 결과

(1) 메트포르민의 COLO 205 세포에서 TNF-α-유도 IL-8 발현 억제

먼저 TNF-α-유도 IL-8 유전자 발현에 대한 메트포르민의 효과를 평가했다. 도 1A에 나타난 바와 같이, TNF-α-유도 IL-8 루시페라제 활성은 용량 의존적 방식으로 메트포르민 전처리에 의해서 약화됨을 알 수 있다. 실시간 PCR은 메트포르민에 반응하여 IL-8 발현이 상당히 감소되었음을 알 수 있다(도 1B). IL-8 방출도 메트포르민에 의해 상당히 억제되었다(도 1C).

(2) 메트포르민의 TNF-α-자극된 COLO 205 세포에서 NF-κB 전사 활성 억제

전사인자 NF-κB가 IEC에서 IL-8 유전자 발현을 우세하게 조절하기 때문에 전기영동 이동도 이동 분석(EMSA)을 수행하여 메트포르민이 TNF-α-유도 NF-κB 활성을 억제하는지 평가하였다. 도 2A에 나타난 바와 같이, 메트포르민 전처리는 용량 의존적 방식으로 NF-κB DNA 결합 활성을 감소시켰다. 또한, 리포터 유전자 분석을 수행 결과에서도 TNF-α-유도 NF-B 루시페라제 활성은 메트포르민 전처리에 의해서 상당히 감소되었음을 확인하였다(도 2B).

(3) 메트포르민의 COLO 205 세포에서 NF-κB 신호화 억제

면역블롯 분석을 수행하여 IEC에서 NF-κB 신호화에 대한 메트포르민의 효과를 평가한 결과, 하기 도 3A에 나타난 바와 같이, 메트포르민 전처리는 용량 의존적 방식으로 TNF-α-유도 IκBα 인산화/분해를 억제하였다. 이 결과를 확인하기 위해서 포스포-IκBα 방출을 상업용 IκBα ELISA 키트에 의해서도 평가하였으며, 그 결과 포스포-IκBα 방출은 메트포르민에 의해서 상당히 억제되었다(도 3B).

(4) 메트포르민의 DSS에 의해 유도된 대장염의 중증도 완화

메트포르민의 생체내 항염증 활성을 평가하기 위해서 DSS-유도 뮤린 대장염 모델을 대상으로 평가를 수행하였다. 하기 [표 1]에 나타난 바와 같이, 5일 동안 DSS를 투여해서 심한 대장염을 유도하였으며, 반면에 메트포르민의 경구 투여는 체중 감소, DAI 및 대장 길이에 의해 평가했을 때 대장염의 중증도를 상당히 약화시켰다.

구분	체중변화 (제 0일에 대한 %)	대장 길이 (cm)	질병 활성 지수
대조군	99.0 ± 2.5	±	-
DSS + PBS	87.0 ± 7.7*	6.8 ± 1.0*	2.9 ± 1.1*
DSS + Met (100 qd)	92.0 ± 2.8	7.8 ± 0.2+	1.3 ± 0.3+
DSS + Met (500 qd)	97.5 ± 5.7+	7.9 ± 0.1+	0.6 ± 0.5+

상기 [표 1]은 메트포르민으로 치료된 경우와 치료되지 않은 경우 DSS-유도 급성 뮤린 대장염에 관한 임상 지수들로서, 퍼센트는 제 0일과 비교하여 제 7일째의 체중 변화를 나타낸 것이다. 데이터는 5마리 마우스의 평균 ± SD이다.

DSS : 덱스트란 술페이트 나트륨

PBS : 인산염 완충 식염수

Met 100 qd : 메트포르민 100 mg/kg/day

Met 500 qd : 메트포르민 500 mg/kg/day

^* : 대조군과 비교해서 P<0.05

⁺ : DSS + PBS 그룹과 비교해서 P<0.05

또한, 조직병리학을 수행하여 근부위 대장과 원부위 대장에서 결장염의 중증도를 평가하였다. PBS 대조군에 DSS를 투여한 결과 염증성 세포 침윤, 함몰부 손상 및 점막 궤양과 같은 현저한 조직학적 변화가 유도되었다. 그러나, 메트포르민 치료는 선상 구조에 대한 조직학적 손상 및 염증성 세포의 침윤을 상당히 감소시켰다. 통계적으로 유의한 차이가 원부위 대장에서 달성되었다(도 4).

(5) 메트포르민의 마우스 대장상피에서 IκB 키나아제 활성의 약화

생체내 실험에서 메트포르민이 NF-κB 신호화를 억제함으로써 항염증 효과를 발현하는 것을 확인하였는 바, DSS 대장염 모델에서의 시험관내 결과를 확인하기 위해서 IκB 키나아제(IKK) 활성에 대한 메트포르민의 효과를 조사하였다. IKK 활성을 실험하기 위해서 마우스 대장 조직에 대해 면역조직화학법을 수행하였다. 하기 도 5A 및 5B에 나타난 바와 같이, 대장상피에서 IKK 활성의 DSS-유도 발현이 있었으며, 메트포르민 치료는 대장 점막에서 IKK 활성을 상당히 약화시켰다.

(6) 메트포르민의 뮤린 모델에서 대장염-유관 대장 종양형성 억제

급성 뮤린 대장염 모델의 결과에서, 메트포르민이 항염증 활성을 통해서 종양형성을 억제할 할 수 있을 것이라는 판단 하에, AOM 및 DSS의 반복적 투여에 의해 유도된 CAC 뮤린 모델을 대상으로 생체 내 실험을 수행하였다. AOM/DSS로 처리된 모든 마우스에서 종양 형성이 확인되었으며, 이러한 종양들은 선종 또는 선암종으로 조직학적으로 확인되었고, 종양들은 원부위 대장에 우세하게 위치되었다. 치료되지 않은 대조군과 비교해서 메트포르민으로 치료된 그룹에서는 종양의 수가 상당히 감소함을 확인하였다(도 6).

이와 같이 본 발명의 조성물에 유효성분으로 함유되어 있는 메트포르민은 장 상피세포에서 NF-κB 활성을 억제하고, 동물(마우스)에서 DSS 유도 급성 뮤린 대장염 및 대장염 유관 종양형성을 완화함을 알 수 있는 바, 본 발명에 따른 메트포르민을 함유하는 약학적 조성물은 염증성 장 질환의 효과적인 치료제가 될 수 있다.

Claims (5)

1. 메트포르민을 유효성분으로 함유하는 염증성 장 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 메트포르민이 장 상피세포에서 NF-κB(nuclear factor-κB)의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 염증성 장 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
3. 제2항에 있어서,
   상기 NF-κB의 활성 억제는 IκBα 인산화 및 NF-κB DNA 결합 활성을 약화하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 염증성 장 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
4. 제2항에 있어서,
   상기 NF-κB의 활성 억제에 의해서 인터루킨-8(IL-8) 유전자의 발현이 억제되는 것을 특징으로 하는 염증성 장 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   상기 염증성 장 질환은 궤장성 대장염, 크론병, 셀리악 병, 장관형 베체트 병 또는 허혈성 장염인 것을 특징으로 하는 염증성 장 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.

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