KR20140095017A - 계통발생군 1과 계통발생군 2의 인플루엔자 a형 바이러스 및 인플루엔자 b형 바이러스를 중화시킬 수 있는 인간 결합분자 - Google Patents

계통발생군 1과 계통발생군 2의 인플루엔자 a형 바이러스 및 인플루엔자 b형 바이러스를 중화시킬 수 있는 인간 결합분자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 계통발생군 1 및 군 2의 인플루엔자 A형 바이러스뿐만 아니라 인플루엔자 B형 바이러스의 헤마글루티닌의 줄기 영역에서 에피토프에 결합하고, 그리고 인플루엔자 바이러스 등에 대해 광범위한 중화활동을 가지는 인간 모노클로날 항체와 같은 결합분자에 관한 것이다. 본 기재는 결합분자, 그들의 서열을 인코딩하는 핵산분자 그리고 결합분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 결합분자는 계통발생군 1 및 2의 인플루엔자 A형 바이러스 뿐만 아니라 인플루엔자 B형 바이러스의 진단, 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다.

Description

계통발생군 1과 계통발생군 2의 인플루엔자 A형 바이러스 및 인플루엔자 B형 바이러스를 중화시킬 수 있는 인간 결합분자{Human binding molecules capable of neutralizing influenza A viruses of phylogenetic group 1 and phylogenetic group 2 and influenza B viruses}
본 발명은 의약품에 관한 것이다. 본 발명은 특히 둘다의 계통발생군 1과 계통발생군 2의 인플루엔자 A형 바이러스를 중화시킬 수 있는 인간 결합분자에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 계통발생군 1과 계통발생군 2의 인플루엔자 A형 바이러스뿐만아니라 인플루엔자 B형 바이러스를 중화시킬 수 있는 결합분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 계통발생군 1과 2의 인플루엔자 A형 바이러스, 바람직하기는 또한 인플루엔자 B형 바이러스에 의해 야기되는 감염의 진단, 예방 및/또는 치료에 관한 것이다.
인플루엔자 감염 (또한 "인플루엔자" 또는 "독감"이라고도 칭함)은 전세계에서 매년 3백만 내지 5백만 사이의 심각한 질병 및 250,000 내지 500,000 사이의 사망이 발생하는 인간에게 알려진 가장 흔한 질병 중의 하나이다. 인플루엔자는 5-15%의 인구에 영향을 미치는 계절성 전염병으로 급속하게 확산되고 의료 비용과 낮은 생산성에 대한 부담이 광범위하다 (세계 보건 기구 (WHO)).
인간과 동물의 전염성 병리학에 대해 원인이 있는 3가지 유형의 인플루엔자 바이러스 (A형, B형 및 C형)가 있다. A형 및 B형 바이러스는 인간에서 관찰되는 인플루엔자 계절성 전염병과 세계적 전염병에 대해 원인이 있는 시약 (agent)이다.
인플루엔자 A형 바이러스는 바이러스 부착 및 세포 방출을 위해 필요한 표면 당단백질 헤마글루티닌과 뉴라미니다아제 (NA)를 인코딩하는 두 유전자의 항원성 영역에서의 변이에 기초하여 인플루엔자 바이러스의 아형 (subtype)으로 분류될 수 있다. 현재 16개의 HA (H1- H16)아형과 9개의 NA (N1-N9)항원성 변이체가 인플루엔자 A형 바이러스에 알려져 있다. 또한 인플루엔자 바이러스 아형은 계통발생군에 참고로 분류될 수 있다. 계통발생학적 분석 (Fouchier 등, 2005)은 두개의 주요 그룹 (공기, 1981), 그 중에서도 계통발생 1군 (본 명세서에 "군 1"라고도 칭함)의 H1, H2, H5 및 H9 아형 그리고 그중에서도 계통발생 2군 (또는 "군 2")의 H3, H4 및 H7 아형을 포함하는 HA의 세분을 나타내었다. 또한 인플루엔자 A형 아형 (즉, H1N1, H1N2 및 H3N2)의 일부는 인간에서 순환하지만, 16 HA 및 9 NA 아형의 모든 조합은 동물에서, 특히 조류종에서 발견되었다. 인플루엔자 A형에 감염된 동물은 종종 인플루엔자 바이러스의 저장소 역할을 하고 특정 아형은 병리학적 인플루엔자 A형 균주 H5N1와 같은 인간종에 대한 장벽을 통과하는 것으로 나타난다.
인플루엔자 B형 바이러스 균주는 엄밀히 말하면 인간이다. 인플루엔자 B형 바이러스 균주 내에서 HA의 항원변이는 A형 균주에서 관찰된 것보다 약하다. 인플루엔자 B형 바이러스의 2가지 유전적 및 항원적으로 별개의 혈통은 B/Yamagata/16/88 (B/Yamagata라고도 지칭함) 및 B/Victoria/2/87 (B/Victoria) 혈통 (Ferguson 등 2003)에 의해 대표되는 인간에서 순환하고 있다.
인플루엔자 B형 바이러스에 의해 기인하는 질환범위는 일반적으로 인플루엔자 A형 바이러스에 의해 기인하는 것보다 미미하지만, 입원을 필요로 하는 심각한 질병은 여전히 인플루엔자 B형 감염 내에서 종종 관찰된다.
연간 인플루엔자 전염병을 다루는 현재의 접근방식은 매년 예방접종, 바람직하기는 이소성 교차-보호의 발생을 포함한다. 그러나 인간의 순환 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 백신 균주와 순환 인플루엔자 균주를 가장 잘 일치시키기 위해 매년 인플루엔자 백신제제의 적용을 필요로 하는 영구적인 항원 변경이 될 수 있다. 매년 인플루엔자 백신과 함께 예방접종은 인플루엔자를 예방하는 가장 좋은 방법이지만, 오셀 타미비르 (타미플루??)등의 항바이러스 약물은 인플루엔자 감염의 예방 및 치료에 효과적일 수 있다. 그러나 오셀타미비르 등의 항바이러스 약물에 대해 내성을 나타내는 인플루엔자 바이러스 균주의 수는 증가하고 있다.
다른 방법은 다양한 계절성 및 유행성 인플루엔자 바이러스를 중화시키기 위해 항체-기반 예방 또는 치료법의 개발이다. 인플루엔자 바이러스 감염으로부터 보호하는 가장 중화시키는 항체의 주요 표적은 수용체 결합부위를 함유하지만 항체 결합부위 (항원 드리프트)의 아미노산 치환기를 가진 지속적인 유전적 진화를 거치는 바이러스성 HA 단백질의 구형 헤드 (head)(HA1 부분)이다.
최근 광범위하게 (H1 및 H5 인플루엔자 아형을 포함하는) 계통발생군 1의 인플루엔자 A형 바이러스의 헤마글루티닌의 보존 줄기 영역에서 에피토프를 인식하는 교차-중화시키는 항체뿐만 아니라 (H3 및 H7 아형을 포함하는) 계통발생군 2의 인플루엔자 A형 바이러스의 HA 의 줄기 영역에서 매우 보존된 에피토프를 인식하는 교차-중화시키는 항체가 인식되어왔다 (WO2008/028946 참고). 이들 항체의 중화활동은 1군 또는 2군 중 하나의 인플루엔자 바이러스로 제한된다. 또한 이들 항체는 인플루엔자 B형 바이러스에 결합하고 중화시킬 수 없다.
또한 WO 2010/010466은 헤마글루티닌에 결합하고 그리고 (H1 및 H5 아형을 포함하는) 군 1의 인플루엔자 A형 아형과 (H3 및 H7 아형을 포함하는) 군 2의 인플루엔자 A형 아형에 결합하고 중화시킬 수 있는 인간 항체 F16을 기재한다. 항체는 또한 인플루엔자 B형 바이러스로부터 HA를 결합하지 않는다.
또한 US 2009/0092620은 둘다의 H1과 H3 아형의 헤마글루티닌에 그리고 B/Victoria 및 B/Yamagata 군에 속하는 인플루엔자 B형 바이러스의 헤마글루티닌 위에 존재하는 항원적 구조를 인식하는 마우스의 (murine) 항체를 기재한다. 항체는 항체가 HA의 구형 헤드의 에피토프에 결합하는 것을 나타내는 수개의 H3N2 균주의 적혈구응집 활동을 억제한다.
인플루엔자 A형과 인플루엔자 B형 바이러스에 의해 야기되는 호흡 질병의 심각성 관점에서 볼 때, 계절성 전염병의 높은 경제적 영향 및 세계적 전염병에 대한 지속적인 위험이 있기 때문에 인플루엔자 A형과 B형 아형의 예방과 치료를 위한 효과적인 수단에 대한 수요가 계속되고 있다. 그러므로 계통발생군 1과 계통발생군 2 사이의 인플루엔자 A형 바이러스, 바람직하기는 인플루엔자 B형 바이러스를 교차-중화시킬 수 있는 결합분자, 바람직하기는 광범위하게 중화시키는 인간 결합분자에 대한 수요가 있다.
본 발명은 계통발생군 1 (예를 들어 H1 및 H5 아형의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스)으로부터의 인플루엔자 A형 바이러스 균주와 계통발생군 2 (예를 들어 H3 및 H7 아형의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스)로부터의 인플루엔자 A형 바이러스 균주에 특이적으로 결합할 수 있는 결합분자를 제공한다. 실시예에서, 결합분자는 또한 계통발생군 1과 계통발생군 2 모두에서 인플루엔자 A형 바이러스 균주에 대한 중화활동을 가진다. 실시예에서, 결합분자는 또한 B/Yamagata 및/또는 B/Victoria 연결의 인플루엔자 B형 바이러스 균주를 포함하는 인플루엔자 B형 바이러스 균주를 특이적으로 결합할 수 있다. 실시예에서, 결합분자는 인플루엔자 A형 및/또는 B형 바이러스 균주를 생체 내 (in vivo) 중화시킬 수 있다. 실시예에서 결합분자는 인플루엔자 A형과 B형 바이러스의 HA 단백질의 줄기 영역에서 보존된 에피토프에 결합한다. 실시예에서, 결합분자는 적혈구응집 억제 (HI) 활동이 없다.
따라서 본 발명은 계통발생군 1내의 인플루엔자 A형 바이러스 아형과 계통발생군 2 내의 인플루엔자 바이러스 아형 사이에, 뿐만 아니라 인플루엔자 B형 바이러스 아형에서 공유되는 헤마글루티닌 단백질의 줄기 영역의 항원에 결합하는 결합분자를 제공하고, 따라서 군 1과 군 2 사이에 인플루엔자 A형 바이러스 아형과 인플루엔자 B형 바이러스를 교차-반응시키는 결합분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 결합분자의 결합 영역을 최소한 인코딩하는 핵산분자에 관한 것이다.
본 발명의 결합분자 및/또는 핵산분자는 원인이 되는 인플루엔자 아형에 관계없이 인플루엔자 A형 바이러스 및 인플루엔자 B형 바이러스를 위한 보편적인 계통발생적, 진단제 및/또는 치료제로 사용하는 데 적절하다.
본 발명에 따른 결합분자는 항원 드리프트 또는 시프트가 없거나 매우 적은 알려지지 않고 매우 보존된 항원에 결합하는 것으로 예상된다. 특히, 에피토프는 계통발생군 1과 계통발생군 2, 및 인플루엔자 B형 바이러스에 속하는 인플루엔자 바이러스 사이에 공유된다. 이들 항원들을 식별하고 및/또는 특징짓는 본 발명의 결합분자를 사용하는 것이 또한 포함된다.
본 발명은 또한 인플루엔자 바이러스 감염을 가지거나, 이의 발병 위험이 있는 진단, 예방 및/또는 치료에서 본 발명의 인간 결합분자 및/또는 핵산분자의 용도를 제공한다. 또한 본 발명은 이러한 인플루엔자 감염의 진단/검출에서 본 발명의 인간 결합분자 및/또는 핵산분자의 용도와 관련한다.
도 1은 CR9114에 의한 H1, H5, H9, H3, 및 H7 HA의 구조적 변화의 차단을 나타낸다. (A) 다양한 형태-미절단 전구체 (HA0); 중성 pH, 절단된 (HA); 융합 pH, 절단 (융합 pH)-A/New Caledonia/1999 (H1) A/Vietnam/1203/2004 (H5), A/HongKong/1073/1999 (H9), A/Wisconsin/67/2005 (H3), 및 A/Netherlands/219/2003 (H7)의 표면-발현된 rHA에 대한 CR9114의 FACS 결합. 결합은 비치료된 rHA (HA0) 에 결합 백분율로 표시된다. (B) mAb CR9114가 pH 4.9로 절단된 HA가 노출되기 이전에 첨가된 것을 제외하고, 상기 표면-발현된 HA로의 CR9114의 FACS 결합.
도 2는 MAb CR9114가 각각 H1 및 H3 결합을 위해 CR6261과 CR8020과 경쟁하는 것을 나타낸다. 100 nM의 CR6261 또는 CR9114 (패널 A 및 B)로 포화된 고정화된 HA의 A/New Caledonia/20/1999 (H1N1), 또는 바이오레이어 (biolayer) 간섭법으로 측정한 100 nM의 CR8020 또는 CR9114 (패널 C 또는 D)로 포화된 고정화된 HA의 A/Wisconsion/67/2005 (H3N2)에 대한 지시된 mAb 결합의 추가도.
도 3은 인플루엔자 B형 (B/Florida/04/2006)을 사용한 마우스 치사의 모델에서 예방효능을 나타낸다. A.실험일-하루 전에 15 mg/kg CR9114 또는 대조군 중 하나에 정맥내로 치료하고 이어서 25LD B/Florida/04/2006의 0일에 실험을 한 마우스의 Kaplan-Meier 생존곡선.B. 0일에 비교한 평균 체중 변화 (%). 막대는 평균 95% CI를 나타낸다. 마우스가 연구 동안에 사망하거나/안락사시킨 경우 마지막으로 관찰된 체중을 이후에 실시하였다. C. 중간값 임상점수. 바는 분위범위를 나타낸다. 임상 점수 설명: 0=임상 증상이 없음; 1=처리 동안 거친 코트 (coat), 적은 반응성; 3=처리 동안 거친 코트, 롤업, 힘든 호흡, 적은 반응성; 4= 조작/처리에 대한 거친 코트, 롤업, 힘든 호흡, 비활성 반응.
본 발명에서 사용되는 용어의 정의는 아래와 같다 .
본 명세서에 사용되는 용어 "포함되는 "또는 "포함하는"은 단어 "제한없이"에 따라야하는 것으로 간주된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "결합분자"는 융합, 또는 인간화된 또는 인간 모노클로날 항체를 포함하는 손상되지 않은 면역글로불린, 또는 HA등의 면역글로불린의 결합파트너에 대한 특이적 결합을 위한 손상되지 않은 면역글로불린과 경쟁하는 면역글로불린의 단편을 포함하는 항원-결합 및/또는 가변 도메인을 지칭한다. 구조에 관계없이,항원-결합 단편은 손상되지 않은 면역글로불린에 의해 인식되는 것과 동일한 항원과 결합한다. 항원-결합 단편은 결합분자의 아미노산 서열 중의 적어도 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200 또는 250의 지속적 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "결합분자"는 당 업계에 공지된 모든 면역글로불린 클래스 및 하위클래스를 포함한다. 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 결합분자는 손상되지 않은 항체의 주요 5개 클래스로 구분될 수 있다: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 및 이들 대부분은 또한 하위클래스 (아이소타입)로 구분될 수 있다. 예를 들면 IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4.
항원-결합 단편은 그 중에서도 Fab, F(ab'), F(ab') 2, Fv, dAb, Fd, 상보성결정영역 (CDR)단편, 단일-사슬 항체 (scFv), 이가 단일-사슬 항체, 이중체, 삼중체, 사중체, (폴리)펩티드 등에 특이적 항원 결합을 부여하기에 충분한 면역글로불린의 하나 이상의 단편을 포함하는 항체를 포함하는 (폴리)펩티드를 포함한다. 상기 단편은 합성적으로 제조되거나 효소 또는 손상되지 않은 면역글로불린의 화학적 분해에 의해 제조될 수 있거나 그들은 재조합 DNA 기술에 의해 유전적으로 제조될 수 있다. 제조방법은 당 업계에 잘 공지되어 있고, 예를 들어 항체: A Laboratory Manual, Edited by:E. Harlow and D, Lane (1998), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York이 본 명세서에 참고문헌으로 통합되어 설명된다. 그것의 결합분자 또는 항원-결합 단편은 하나 이상의 결합 부위를 가질수 있다. 하나 이상의 결합 부위가 있는 경우 결합 부위는 서로 동일하거나 다를 것이다.
결합분자는 네이크드 (naked)되거나 비접합된 (unconjugated) 결합분자일수 있지만 또한 면역접합체의 일부일 수 있다. 네이크드되거나 비접합된 결합분자는 접합되지 않고, 작동가능하게 연결되거나 그렇지 않으면 그중에서도 독성 물질, 방사능 물질, 리포솜, 효소와 같은 작동 부분 또는 태그와 물리적으로 또는 기능적으로 관련된 결합분자를 나타내기 위한 것이다. 네이크드된 또는 비접합된 결합분자는 작동 부분 또는 태그의 부착에 의한 것 이외에, 안정화되고, 다량체화되고, 인간화되고 또는 다른 방식으로 조작된 결합분자를 배제하지 않는 것으로 이해된다. 따라서, 모든 번역후 변형된 네이크드된 및 비접합된 결합분자는 변형이 재조합 결합분자-생성 세포에 의해 세포 환경을 조성하는 천연 결합분자에서 제조되고, 초기 결합분자 제조 이후에 인간에 의해 도입되는 경우를 포함하여 본 명세서에 포함된다. 물론 상기 상호작용 중 일부가 생물학적 효과를 발휘하기 위해 필요하기 때문에 용어 네이크드된 또는 비접합된 결합분자는 인체에 투여 후에 작용 세포 및/또는 분자를 가지는 기능적 연관성을 형성하기 위해 결합분자의 능력을 배제하지 않는다. 그러므로 관련된 작용기 또는 태그의 결여는 인 비트로 (in vitro), 생체 내가 아닌 네이크드된 또는 비접합된 결합분자의 정의에 적용된다.
본 명세서에 사용되는 용어 "생물학적 샘플"은 생체 검사 시료 또는 조직 배양, 또는 그로부터 유도된 세포 및 그의 후대와 같은 생물학적 기원, 고체 조직 샘플의 혈액 및 다른 액체 샘플을 포함하여 다양한 샘플 유형을 포함한다. 용어는 또한 단백질 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 특성 성분을 위한 시약, 용해 또는 농축으로 처리하는 획득 후에 어떠한 방식으로든 조작되어온 샘플을 포함한다. 용어는 어느 종에서 얻는 다양항 종류의 임상 샘플을 포함하고, 또한 배양의 세포, 세포 상청액 및 세포 용균액을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "상보성 결정 영역" (CDR)은 상보적인 형상인 항원 결합 부위에 광범위한 범위를 가지는 데 통상적으로 기여하고 항원 위에 인식되는 에피토프에 기여하는 면역글로불린과 같은 결합분자의 가변 영역 내에서 서열을 의미한다. CDR 영역은 자연 형상에서 단백질 위에 존재하거나 어떤 경우에는 예를 들어 SDS에서 용해에 의해 변질된 단백질 위에 존재하면서 단백질 또는 단백질 단편의 선형 에피토프, 불연속 에피토프, 또는 형상적 에피토프에 특이적일수 있다. 에피토프는 또한 단백질의 번역후 변형으로 이루어질 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "결실 (deletion)"은 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 잔기가 각각 종종 자연적으로 발생하는 분자를 참고로 비교했을 때 없는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 변화를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "발현-조절 핵산 서열"은 특히 숙주 생물체에서 작용가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요하고 및/또는 영향을 미치는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 그중에서도 적절한 전사 개시, 종결, 촉진제, 강화제 서열; 억제물질 또는 활성인자 서열; 접합 및 아데닐산중합반응 신호와 같은 효과적 RNA 처리 신호; 세포질의 mRNA를 안정화시키는 서열; 전사 효능 (예를 들면 리보솜 결합 부위)을 증가시키는 서열; 단백질 안정성을 증가시키는 서열과 같은 발현-조절 핵산 서열과 필요한 경우, 단백실 분비를 증가시키는 서열은 선택한 숙주 생물체에서 활성을 나타내는 어느 핵산 서열일 수 있고 숙주 생물체에 상동이거나 이형인 유전자 인코딩 단백질로부터 유도될 수 있다. 발현-조절 서열의 인식 및 이용은 본 분야의 당업자에게 경로이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "기능적 변이체"는 참조 결합분자의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열과 비교할 때 하나 이상의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산에 의해 변형되고 그리고 참조 결합분자를 가지는 결합 파트너, 즉 인플루엔자 바이러스에 결합하기 위해 경쟁할수 있는 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열을 포함하는 결합분자를 지칭한다. 즉, 참조 결합분자의 아미노산 및/또는 뉴클레오티드 서열의 변형은 아미노산 서열은 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 결합분자의 특징을 결합하거나 아모니산 서열을 함유하는 것, 즉 결합분자가 그의 표적을 인식하고 결합하는 것에 상당히 영향을 미치거나 변형하지 않는다. 기능적 변이체는 뉴클레오티드 및 아미노산 치환체, 추가 및 결실을 포함하는 보존적 서열 변형을 가질수 있다. 이들 변형은 부위-유도된 돌연변이 유발과 무작위의 PCR-매개 돌여변이 유발과 같은 본 분야에 알려진 표준 기술에 의해 도입될 수 있고, 자연적뿐만 아니라 비-자연적 뉴클레오티드 및 아미노산을 포함할 수 있다.
보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 구조적 또는 화학적 성질을 가지는 아미노산 잔기로 대체되는 것들을 포함한다. 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 잔기의 군 (family)은 본 분야에 정의되어왔다. 이들 군은 기본 측쇄 (예를 들어 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르산, 글루탐산), 비대전된 극성 측쇄 (예를 들어, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-가지 측쇄 (예를 들어 트레오닌, 발린, 이소우신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어 티로신, 페닐알라닌, 트리토판)을 가지는 아미노산을 포함한다. 당업자에게 상기 사용된 것보다 아미노산 잔기 군의 다른 분류가 이용될 수 있는 것이 명백하다. 또한 변이체는 비-보존적 아미노산 치환, 예를 들어 아미노산을 상이한 구조적 또는 화학적 성질을 가지는 아미노산 잔기로의 대체를 가질 수 있다. 유사한 작은 변이체는 또한 아미노산 결실 또는 삽입, 또는 둘다를 포함할 수 있다. 아미노산 잔기가 면역학적 활동을 제거하지 않고 치환되고 삽입되거나 결실될 수 있는 결정의 지침은 본 분야에 잘 알려진 컴퓨터 프로그램을 사용해 발견될 수 있다.
뉴클레오티드 서열의 돌연변이는 전이 또는 전환 돌연변이와 같은 궤적 (점 돌연변이)에서 만들어진 단일 변형일 수 있고, 또는 선택적으로 다발 뉴클레오티드는 단일 장소에서 삽입, 결실 또는 변경될 수 있다. 또한 하나 이상의 변형은 뉴클레오티드 서열 내에서 어느 수의 궤적에서 만들어질 수 있다. 돌연변이는 본 분야에 알려진 어느 적절한 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "인플루엔자 바이러스 아형"은 헤마글루티닌 (H)와 뉴라미다아제 (N) 바이러스 표면 단백질의 다양한 조합을 특징으로 하는 인플루엔자 A형 바이러스 변이체를 지칭한다. 본 발명에 따르면 인플루엔자 바이러스 아형은 예를 들어 "H1 또는 H3 아형의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스", 또는 "H1 인플루엔자 바이러스" "H3 인플루엔자 바이러스", 또는 예를 들어 "인플루엔자 바이러스 아형 H3N2" 또는 "H3N2"와 같은 H 번호와 N 번호의 조합에 의한 그들의 H번호에 의해 참조될 수 있다.
용어 인플루엔자 바이러스 "아형"은 특히 각각의 아형 내에서 모든 각각의 인플루엔자 바이러스 "균주"를 포함하고, 이것은 통상적으로 돌연변이로부터 기인하고 상이한 병원성 프로파일 (profile)을 나타낸다. 이러한 균주는 또한 바이러스성 아형의 다양한 "분리 (isolate)"로 나타낼 수 있다. 따라서 본 명세서에 사용되는 용어 "균주"와 "분리"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 인간 인플루엔자 바이러스 균주 또는 분리를 위한 현재 명명법은 브래킷 (bracket), 예를 들어 A/Moscow/10/00 (H3N2)에서 주어진 HA 및 NA의 항원적 설명과 함께, 1차 분리, 균주수 및 분리 년수의 지리학적 위치를 포함한다. 비-인간 균주는 또한 명명법의 근원의 숙주를 포함한다.
본 명세서의 결합분자에 관련하여 본 명세서에 사용되는 용어 "중화"는 중화가 이루어지는 메커니즘에 관계없이 복제적으로 표적 세포를 감염시키는 인플루엔자 바이러스를 억제시키는 결합분자를 나타낸다. 그러므로 중화는 예를 들어 세포 표면에 바이러스를 부착하거나 응집하는 것을 억제시켜, 또는 표적 세포 등에 바이러스를 부착한 후에 바이러스성 및 세포성 막의 융합을 억제시켜 얻는다.
본 발명의 결합분자에 관련하여 본 명세서에 사용되는 용어 "교차-중화하는" 또는 "교차-중화"는 인플루엔자 A형 및/또는 B형 바이러스의 상이한 아형을 중화시키기 위한 본 발명의 결합분자의 능력을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 "숙주"는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터 등의 벡터가 도입되어온 유기체 또는 세포를 지칭하기 위한 것이다. 유기체 또는 세포는 전핵 또는 진핵일 수 있다. 바람직하기는, 숙주는 숙주 세포, 에를 들어 배양의 숙수 세포를 분리시킨다. 용어 "숙주 세포"는 세포가 본 발명의 결합분자의 (초과)-발현을 위해 변형되는 것을 단지 의미하고 이들 결합분자를 근본적으로 발현시키고 세포가 발현 등의 불멸화, 증폭, 향상에 의해 결합분자를 초과-발현시키기 위해 변형되는 B-세포를 포함한다. 용어 숙주는 특정한 대상 유기체 또는 세포뿐만 아니라 상기 유기체 또는 세포의 후대를 나타내기 위한 것으로 이해되어야 한다. 특정한 변형이 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후대에 발생할 수 있고, 사실상 이러한 후대는 모체 유개체 또는 세포와 동일하지 않을 수 있지만 본 명세서에 사용되는 용어 "숙주"의 범위 내에서 여전히 포함된다.
본 명세서에 정의되는 결합분자를 적용할 경우, 용어 "인간"은 인간으로부터 직접 유도되거나 인간 생식세포계열 서열에 근거하는 분자를 나타낸다. 결합분자가 인간 서열로부터 유도되거나 근거하고 이후에 변형되는 경우, 여전히 본 명세서에 걸쳐 사용되는 인간으로 고려된다. 즉 결합분자가 적용된 경우 용어 인간은 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열로부터 유도되는 가변 또는 불변영역을 가지거나 인간 또는 어떠한 형태에서 변형된 인간 림프구에서 발생하는 가변 또는 불변 영역에 근거하는 결합분자를 포함하기 위한 것이다. 그러므로 인간 결합분자는 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않은 아미노산 잔기를 포함하고, 치환 및/또는 결실 (예를 들어 무작위로 도입된 돌연변이 또는 인 비트로 부위-특이적 돌연변이 또는 인 비보 신체 돌연변이). 본 명세서의 "기재로 하는"은 핵산 서열이 주형으로부터, 에러가 발생하기 쉬운 PCR 바업에 의해 작은 돌연변이와함께 정확히 복제될 수 있거나, 주형과 정확히 일치하거나 작은 변형과 함께 합성적으로 제조될 수 있다.
용어 "추가"로도 알려진 용어 "삽입"은 모체 서열과 비교했을 때 각각 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 잔기의 첨가를 야기시키는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 변화를 나타낸다.
본 명세서에 사용되는 결합분자에 적용할 경우 용어 "분리"는 다른 단백질 또는 폴리펩티드가 실질적으로 없고, 특히 상이한 항원적 특이사항을 가지는 다른 결합분자가 없고, 또한 실질적으로 다른 세포 재료 및/또는 화학물질이 없는 결합분자를 지칭한다. 예를 들어 결합분자가 재조합적으로 제조되면, 바람직하기는 배양 배지 성분이 실질적으로 없고, 결합분자가 화학적 합성에 의해 제조되면, 바람직하기는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없고, 즉 단백질의 합성에 관여하는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질로부터 분리된다. 본 명세서에 정의되는 결합분자를 인코딩하는 핵산분자를 적용할 때 용어 "분리된"은 결합분자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 다른 뉴클레오티드 서열, 특히 다른 결합 파트너를 결합시키는 결합분자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 없는 핵산분자를 나타내기 위한 것이다. 또한, 용어 "분리된"은 자연 숙주, 예를 들어 자연적으로 연관된 리보솜, 폴리메라아제, 또는 게놈 서열 내에서 자연적으로 원래의 핵산분자를 수반하는 다른 세포 성분으로부터 실질적으로 분리되는 핵산분자를 나타낸다. 또한 cDNA와 같은 "분리된" 핵산분자는 재조합 기술에 의해 제조될 때 다른 세포 재료, 또는 세포 배지가 실질적으로 없거나 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "모노크로날 항체"는 단일 특이성의 항체 분자의 제제를 의미한다. 모노클로날 항체는 특정 에피토프에 대한 단일 결합특이성 및 친화성을 나타낸다. 따라서 용어 "인간 모노클로날 항체"는 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열로부터 유도되거나 기반으로 하는 또는 완전히 합성 서열로부터 유도되는 가변 영역 및 불변영역을 가지는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 나타낸다. 모노클로날 항체의 제조 방법은 결합 특이성과 관련이 없다.
목적으로서 적용되는 본 명세서의 용어 "자연적으로 발생하는"은 물체 또는 화합물이 자연에서 발견될 수 있는 사실을 나타낸다. 예를 들어 자연 근원으로부터 분리될 수 있고 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 유기체에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 자연적으로 발생하고 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "핵산분자"는 뉴클레오티드의 폴리머형태를 나타내고 RNA, cDNA, 게놈 DNA의 둘다의 배열, 및 합성형태 및 상기의 혼합된 중합체를 포함한다. 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 디옥시뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드의 어느 유형의 변형된 형태를 나타낸다. 용어는 또한 DNA의 단일- 및 이중-가닥 형태를 포함한다. 또한 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 연결을 자연적으로 발생시키고 및/또는 비-자연적으로 발생시켜서 자연적으로 발생시키거나 그리고 변형된 뉴클레오티드를 함께 결합시키는 것 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 핵산분자는 당업자에게 쉽게 인지될 것이기 때문에 화학적으로 또는 생화힉적으로 변형될 수 있거나 비-자연적 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 유사체와 함께 자연적으로 발생하는 하나 이상의 라벨, 메틸화, 치환, 비대전된 연결기 (메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포라미데이트, 카바메이트 등)등의 인터뉴클레오티드 변형, 대전된 연결기 (예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 펜던트 (pendent) 부분 (예를 들어 폴리펩티드), 삽입제 (예를 들어 아크리딘, 소랄렌 등), 킬레이터, 알킬레이터, 및 변형된 연결기 (예를 들어 알파 아노머 핵산 등)을 포함한다. 상기 용어는 또한 단일-가닥, 이중-가닥, 부분적으로 이중적인, 삼중적인 커브형 (hairpinned), 원형의 및 자물쇠 배열을 포함하여, 어느 위상적인 배열을 포함하기 위한 것이다.
또한 수소결합 및 다른 화학적 상호작용을 통하여 지정된 서열에 결합시키는 능력 하에서 폴리뉴클레오티드를 모방하는 합성 분자가 포함된다. 상기 분자는 분야에 공지되어 있고 예를 들어 펩티드 연결기가 분자 구조에서 인산 연결기를 치환시키는 것들을 포함한다. 다른 명시가 없다면 핵산 서열에 대한 참조가 보충되어 포함된다. 그러므로 특정 서열을 가지는 핵산분자에 대한 참조는 그것의 상보적 서열을 가지는 상보적 가닥을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 상보적 가닥은 또한 예를 들어 역-배열 치료, 교잡 프로브 및 PCR 프라이머에 유용하다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 통상적으로 물리적으로 연결되고 서로 기능적 관계에 있는 두개 이상의 핵산 서열 요소를 나타낸다. 예를 들어 코딩 서열이 프로모터의 "통제 하에" 있는 것으로 이해되어야 하는 경우에 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현을 개시하거나 조절할 수 있는 경우 프로모터가 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.
"약제학적으로 허용가능한 부형제"는 동의가능하거나 편리한 복용 형태를 제조하기 위한 약물, 시약, 또는 결합분자와 같은 활성 분자와 결합되는 어느 비활성 물질을 의미한다. "약제학적으로 허용가능한 부형제"는 사용된 투여량과 농도에서 복용인에게 비-독성이고 약물, 시약 또는 결합분자를 포함하는다른 성분의 형태와 상용하는 부형제이다. 약제학적으로 허용가능한 부형제는 본 분야에 광범위하게 적용되고 알려져 있다.
결합분자, 예를 들어 항체, 및 그것의 결합 파트너, 예를 들어 항원의 상호작용과 관련하는 본 명세서의 용어 "특이적으로 결합하는"은 상호작용이 특이적 구조, 예를 들어 결합 파트너 위에서 항원적 결정요인 또는 에피토프의 존재에 의존적임을 의미한다. 즉, 항체는 결합 파트너가 다른 분자 또는 유기체의 혼합물에서 존재할 때 조차 결합 파트너를 우선적으로 결합하거나 인지한다. 결합은 공유 또는 비-공유 상호작용 또는 둘다의 조합에 의해 조정될 수 있다. 즉, 용어 "특이적 결합"은 항원적 결정요인 또는 에피토프에 면역특이적으로 결합하고 다른 항원적 결정요인 또는 에피토프에 면역특이적으로 결합하지 않는 것을 의미한다. 항원에 면역특이적으로 결합하는 결합분자는 본 분야에 알려진 방사선면역측정법 (RIA) , 효소-결합 면역분석법 (ELISA), BIACORE, 또는 다른 분석법에 의해 측정되는 것과 같이 낮은 친화성을 가지는 펩티드 또는 폴리펩티드에 결합할 수 있다. 항원에 면역특이적으로 결합하는 결합분자 또는 그의 단편은 동일한 에피토프를 운반하면서 관련된 항원과 교차-반응할 수 있다. 바람직하기는, 항원에 면역특이적으로 결합하는 결합분자 또는 그의 단편은 다른 항원과 교차-반응하지 않는다.
본 명세서의 "치환"은 각각 다른 아미노산 또는 뉴클레오티드에 의해 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드의 교체를 의미한다.
용어 "치료학적으로 효과적인 양"은 인플루엔자 B형 바이러스를 가지는 감염에서 기인하는 상태를 예방, 개선 및/또는 치료하는 데 효과적인 것으로 본 명세서에 정의된 결합분자의 양을 나타낸다. 본 명세서에 사용된 개선은 가시적이거나 검출할 수 있는 질병 증상, 바이러스혈증, 또는 인플루엔자 감염의 어느 다른 측정가능한 징후의 감소를 나타낼 수 있다.
용어 "치료"는 질병 진행상황을 치료하거나 중단하거나 적어도 지체시키기 위한 치료학적 치료뿐만 아니라 예방적 또는 보존적 방법을 나타낸다. 치료가 필요한 사람들은 인플루엔자 바이러스를 가지는 감염으로부터 기인하는 조건으로 이미 손상이 된 사람들 뿐만 아니라 인플루엔자 바이러스 감염이 예방되는 것들을 포함한다. 인플루엔자 바이러스 감염으로부터 부분적으로 또는 전체적으로 회복되는 대상은 또한 치료를 필요로 할 수 있다. 예방은 인플루엔자 바이러스의 확산을 억제시키거나 감소시키거나 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 하나 이상의 증상의 진행, 발달 또는 진행을 억제시키거나 감소시키는 것을 포함한다.
용어 "벡터"는 두번째 핵산분자가 복제되고, 어떤 경우에는 발현되는 숙주로 도입하기 위해 삽입될 수 있는 핵산분자를 나타낸다. 즉, 벡터는 핵산분자를 연결된 곳에 이동시킬 수 있다. 클로닝뿐만 아니라 발현 벡터는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "벡터"에 의해 보완된다. 벡터는 플라스미드, 코스미드, 박테리아 인공 염색체 (BAC) 및 이스트 인공 염색체 (YAC) 및 살균바이러스 또는 식물 또는 (인간을 포함하여) 동물 바이러스로부터 유도되는 벡터로 제한되지는 않지만 이들을 포함한다. 벡터는 제안된 숙주에 의해 인식되는 복제 및 숙주에 의해 인지되는 벡터, 프로모터 및 다른 조절 영역의 근원을 포함한다. 두번째 핵산분자를 함유하는 벡터가 변형, 형질주입, 또는 바이러스성 도입 메커니즘의 용도를 제조함에 의해 세포로 도입된다. 특정한 벡터는 도입된 숙주에서 자가복제를 할 수 있다 (예를 들면 복제의 박테리아 근원을 가지는 벡터가 박테리아에서 복제할 수 있다). 다른 벡터는 숙주로 도입된 후에 숙주의 게놈으로 통합될 수 있고 그에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다.
본 발명의 첫번째 양태에서 본 발명은 계통발생군 1의 인플루엔자 A형 바이러스 아형과 계통발생군 2의 인플루엔자 A형 바이러스 아형의 헤마글루티닌에 특이하게 결합할 수 있는 결합분자를 포함한다. 실시예에서, 결합분자는 계통발생군 1과 계통발생군 2 둘다의 인플루엔자 A형 바이러스 아형을 중화시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 결합분자는 그들이 인플루엔자 A형 바이러스 균주과 군 2 인플루엔자 A형 바이러스 균주를 교차-중화시킬 수 있다는 점에서 독특하다. 실시예에서, 결합분자는 하나 이상의, 바람직하기는 두개 이상의, 바람직하기는 세개 이상의, 바람직하긴느 네개 이상의, 더욱 더 바람직하기는 다섯개 이상의 H1, H2, H5, H6, H8, H9 및 H11 아형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 군 1 인플루엔자 A형 바이러스 아형 그리고 하나 이상의, 바람직하기는 두개 이상의, 바람직하기는 세개 이상의 H3, H4, H7, 및 H10 아형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 군 2 인플루엔자 A형 바이러스 아형을 중화시킬 수 있다. 실시예에서, 결합분자는 인플루엔자 B형 바이러스 아형의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 결합분자는 인플루엔자 B형 바이러스를 중화시킬 수 있다. 실시예에서, 결합분자는 인플루엔자 A형 및/또는 B형 바이러스를 인 비보 중화시킬 수 있다. 인플루엔자 A형 및 B형 바이러스 균주는 인간 및 비-인간 인플루엔자 바이러스 균주 (즉 비-인간 동물, 예를 들어 조류로부터 얻음)일 수 있다.
바람직하기는, 결합분자는 인간 결합분자이다. 바람직한 실시예에서, 결합분자는 인간 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.
실시예에서, 결합분자는 VH1-69 생식세포계열 유전자로부터 유도된다. 따라서, 결합분자는 동일한 VH1-69 생식세포계열 인코딩 구조를 사용한다.
실시예에서, 결합분자, 바람직하기는 항체, 및 HA의 결합 상호작용은 중쇄 가변 서열에 의해 독점적으로 매개된다.
실시예에서, 결합분자는 SEQ ID 번호: 133 또는 SEQ ID 번호: 139의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, SEQ ID 번호: 134, SEQ ID 번호:140 또는 SEQ ID 번호: 151의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 그리고 SEQ ID 번호: 135, SEQ ID 번호: 141, SEQ ID 번호: 145, SEQ ID 번호: 152, SEQ ID 번호: 161, 및 SEQ ID 번호: 162로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 본 발명의 결합분자의 CDR 영역은 표 7에 나타난다. CDR 영역은 Sequences of Proteins of Immunological Interest에서 기재된 것과 같이 Kabat 등 (1991)에 따른다. 수용체 결합과 막융합 공정은 HA 당단백질에 의해 매개된다. 인플루엔자 바이러스 A형의 HA는 표적 세포에 바이러스 부착을 담당하는 수용체 결합 부위를 함유하는 두가지 구조적으로 별개의 영역, 즉 구형 헤드 영역을 포함하고 세포의 바이러스성 덮개 (envelope)와 엔도조말 막 사이의 막융합에 필요한 융합 펩티드를 함유하면서 HA, 및 줄기 영역의 적혈구응집 활동에 포함된다. HA 단백질은 각 모노머가 전구체 (HA0)의 단백질분해 절단에 의해 감염시 제조되는 결합된 글리코폴리펩티드, HA1 및 HA2의 두가지 이황화물로 이루어지는 삼량체이다. 절단은 막 융합을 위한 HA를 준비하도록 요구되기 때문에 바이러스 전염성에 필요하고 형태적 변화를 허용한다. 준비된 분자의 활성은 엔도솜에서 pH5와 pH6 사이의 낮은 pH에서 발생하고 HA 구조물에서 광범위한 범위가 필요하다. 막 융합 공정에서 그것의 참여를 위한 HA의 프라이밍 및 활성에서 각 단계는 억제에 대한 다른 표적, 예를 들어 모노클로날 항체를 제시한다. 실시예에서, 결합분자는 막 융합과 관련된 HA의 pH-유도 형태학적 변화를 차단할 수 있다.
본 발명의 결합분자는 HA 단백질의 HA0, HA1 및/또는 HA2 서브유닛에 특이적으로 결합할 수 있다. HA 단백질의 HA0, HA1 및/또는 HA2 서브유닛 위에 선형 또는 구조적 및/또는 형태적 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. HA 분자는 사용전 바이러스로부터 정제되거나 재조합 생산되고 선택적으로 분리될 수 있다. 대안적으로, HA는 세포 표면 위에 발현될 수 있다. 실시예에서 본 발명의 결합분자는 HA의 줄기 영역에 에티토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 실시예에서 결합분자는 HA의 융합전 형태에 접근가능한 에피토프에 결합한다.
본 발명의 결합분자는 가시적이고, 살아있는 및/또는 전염성이거나 또는 비활성의/감쇠된 형태인 인플루엔자 바이러스에 특이적으로 결합할 수 있다. 비활성/감쇠 바이러스, 예를 들어 인플루엔자 바이러스를 위한 방법은 본 분야에 잘 알려져 있고 포르말린, β-프로피오락톤 (BPL), 메르티올레이트, 및/또는 자외선을 사용한 치료에 제한되지 않지만 이들을 포함한다.
본 발명의 결합분자는 또한 인플루엔자 A형 및/또는 B형 아형으로부터 유도된 하나 이상의 단백질 및/또는 (폴리)펩티드의 제제 같은 하나 이상의 인플루엔자 바이러스의 단편에, 인플루엔자 A형 및/또는 B형 바이러스의 하나 이상의 재조합적으로 제조된 단백질 및/또는 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있다. 다양한 인플루엔자 A형 및 B형 균주의 단백질의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열이 GenBank-데이터베이스, NCBI 인플루엔자 바이러스 서열 데이터베이스, 인플루엔자 서열 데이터베이스 (ISD), EMBL-데이터베이스 및/또는 다른 데이터베이스에서 발견할 수 있다. 각 데이터베이스에서 이러한 서열을 발견하는 것은 당업자의 능력 내에 있다.
또 다른 실시예에서 본 발명의 결합분자는 상기 단백질 및/또는 폴리펩티드의 단편에 특이적으로 결합할 수 있고, 여기서 적어도 단편은 본 발명의 결합분자에 의해 인지되는 에피토프를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 "에피토프"는 검출할 수 있는 항원-결합분자 복합체를 형성하기 위해 충분한 높은 친화성을 가지는 본 발명의 결합분자를 결합시킬 수 있는 부분이다.
본 발명의 결합분자는 HA (본 명세서에 가용성 HA (sHA)라고도 칭함)의 세포외 부분에 특이적으로 결합할 수 있거나 또는 없다.
본 발명의 결합분자는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체와 같은 손상되지 않은 면역글로불린 분자일 수 있거나 결합분자는 인플루엔자 바이러스 균주 또는 그의 단편에 대한 특이적 항원 결합을 제공하기에 충분한 면역글로불린의 단편을 적어도 함유하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역, Fab, F(ab), F(ab')2, Fv, dAb, Fd, 상보성 결정영역 (CDR) 단편, 단일-사슬 항체 (scFv), 이가 단일-사슬 항체, 단일-사슬 파지 항체, 이항체, 삼항체, 사항체, 및 (폴리)펩티드에 제한되지는 않지만 이들을 포함할 수 있는 그의 항원-결합 단편이다. 바람직한 실시예에서 본 발명의 결합분자는 인간 모노클로날 항체, 및/또는 항원 결합 단편이다. 또한 결합분자는 나노 바디, 알파바디, 아피바디, FN3-도메인 발판 및 Adnectins, Anticalins, Darpin 등의 (인간) 반복 단백질을 근거로 하는 다른 발판, 또는 에피토프 결합 서열을 포함하는 다른 발판일 수 있다.
본 발명의 결합분자는 비분리된 또는 분리된 형태에서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 결합분자는 단독으로 또는 본 발명의 하나 이상의 결합분자 (또는 그의 변이체 또는 단편)를 포함하는 혼합물에서, 및/또는 인플루엔자에 결합하는 다른 결합분자와 함께 사용될 수 있고 인플루엔자 바이러스 억제 효과를 가진다. 즉, 결합분자는 조합하여, 예를 들어 본 발명의 두가지 이상의 결합분자, 그의 변이체 또는 단편을 포함하는 약제학적 조성물로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 다르지만 상보성 활성을 가지는 결합분자는 단일 치료에 결합될 수 있어 원하는 계통발생의, 치료학의 또는 진단의 효과를 얻을 수 있지만, 선택적으로 동일한 활성을 가지는 결합분자는 단일 치료에서 결합될 수 있어 원하는 계통발생의, 치료학의 또는 진단의 효과를 얻는다. 선택적으로, 혼합물은 하나 이상의 다른 치료제를 더 포함한다. 바람직하기는, 예를 들어 M2 억제제 (예를 들어, 아만티딘, 리만타딘) 및/또는 뉴라미니다제 억제제 (예를 들어, 자나미비르, 오셀타미비르)와 같은 치료제는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료에 유용하다.
통상적으로, 본 발명에 따른 결합분자는 그의 결합 파트너, 즉 0.2X10-4M, 1.0X10-5M, 1.0X10-6M, 1.0X10-7M보다 낮은, 바람직하기는 1.0X10-8M보다 낮은, 더욱 바람직하기는 1.0X10-9M, 더욱 바람직하기는 1.0X10-10M보다 낮은, 더욱 더 바람직하기는 1.0X10-11M보다 낮은, 특히 1.0X10-12M보다 낮은 친화성 상수 (Kd-값)을 가지는 (H1N1과 같은) 인플루엔자 A형 바이러스 군 1 및 (H3N2와 같은) 인플루엔자 A형 바이러스 군 2, 및/또는 인플루엔자 B형 바이러스, 및/또는 그의 단편에 결합할 수 있다. 예를 들어 IgM 이소타입에 대한 친화성 결합은 약 1.0X10-7M 이상의 결합 친화성을 나타낸다. 예를 들어 친화성 상수는 표면 플라즈몬 공명을 사용하여, 예를 들어 BIACORE 시스템 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden)을 사용하여 측정할 수 있다.
본 발명의 결합분자는 중화활동을 나타낸다. 예를 들어 중화활동은 본 명세서에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다. 중화활동을 측정하는 대체 분석은 예를 들어 WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance, Geneva: World Health Organisation, 2005, version 2002.5에 기재된다.
통상적으로 본 발명에 따른 결합분자는 실시예 6에서 기재된 대로 인 비트로 바이러스 중화 분석 (NVA)에서 측정된 대로 50μg/ml 미만, 바람직하기는 20 μg/ml 미만의 중화활동, 더 바람직하기는 10 μg/ml 미만의, 더욱 더 바람직하기는 5 μg/ml 미만의 중화활동을 가진다. 본 발명에 따른 결합분자는 예를 들어 샘플 또는 현탁액과 같은 가용성 형태에서 인플루엔자 바이러스 또는 그의 단편에 결합할 수 있거나 담체 또는 기질, 예를 들어 마이크로티터 플레이트, 막 및 BEAD 등에 결합되거나 부착된 인플루엔자 바이러스 또는 단편에 결합할 수 있다. 담체 또는 기질은 유리, 가소제 (예를 들어 폴리스티렌), 폴리자당, 나일론, 니트로셀룰로오스, 또는 테플론 등으로 제조될 수 있다. 이러한 지지체의 표면은 고체 또는 다공성 및 어느 편리한 형태일 수 있다. 더욱, 결합분자는 정제/분리된 또는 비-정제된/비-분리된 형태에서 인플루엔자 바이러스에 결합할 수 있다.
상기와 같이, 본 발명은 상기 결합분자가 계통발생군 1의 인플루엔자 A형 바이러스와 계통발생군2의 인플루엔자 A형 바이러스에 대한 중화활동을 가지는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질에서 에피토프를 인지하고 결합할 수 있는 분리된 인간 결합분자에 관한 것이다. 그러므로 본 발명에 따르면, 본 발명의 결합분자는 두가지 계통발생군에 속하는 인플루엔자 바이러스 아형을 교차-중화시키는 것을 나타내었다. 본 명세서에 기재되어온 것을 근거로 하여 당업자는 항체가 다른 아형으로부터 HA 단백질을 교차-반응시키는 지 여부를 결정할 수 있고 또한 인 비트로 및/또는 인 비보에서 다른 아형의 인플루엔자 바이러스를 중화시키는지 여부를 결정할 수 있다.
실시예에서 본 발명에 따른 결합분자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
a) SEQ ID 번호:133의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:134의 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:135의 중쇄 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
b) SEQ ID 번호:139의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:140의 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:141의 중쇄 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
c) SEQ ID 번호:139의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:134의 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:145의 중쇄 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
d) SEQ ID 번호:139의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:151의 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:152의 중쇄 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
e) SEQ ID 번호:139의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:134의 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:152의 중쇄 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
f) SEQ ID 번호:139의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:151의 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:161의 중쇄 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
g) SEQ ID 번호:139의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:151의 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:162의 중쇄 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
h) SEQ ID 번호:139의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:134의 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:141의 중쇄 CDR3 영역을 포함하는 결합분자.
바람직한 실시예에서, 결합분자는 SEQ ID 번호:139의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:134의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:145 또는 SEQ ID 번호:152의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 영역을 포함한다.
또 다른 실시에에서 본 발명에 따른 인간 결합분자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
a) SEQ ID 번호:133의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:134의 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:135의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID 번호:136의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:137의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:138의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR3을 가지는 결합분자,
b) SEQ ID 번호:139의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:140의 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:141의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID 번호:142의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:143의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:144의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR3을 가지는 결합분자,
c) SEQ ID 번호:139의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:134의 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:145의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID 번호:146의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:174의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:147의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR3을 가지는 결합분자,
d) SEQ ID 번호:139의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:134의 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:145의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID 번호:148의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:149의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:150의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR3을 가지는 결합분자,
e) SEQ ID 번호:139의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:151의 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:152의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID 번호:153의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:154의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:150의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR3을 가지는 결합분자,
f) SEQ ID 번호:139의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:134의 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:152의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID 번호:149의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:149의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:150의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR3을 가지는 결합분자,
g) SEQ ID 번호:139의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:134의 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:152의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID 번호:156의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:157의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:158의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR3을 가지는 결합분자,
h) SEQ ID 번호:139의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:134의 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:152의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID 번호:156의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:157의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:158의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR3을 가지는 결합분자,
i) SEQ ID 번호:139의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:151의 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:161의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID 번호:142의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:143의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:144의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR3을 가지는 결합분자,
j) SEQ ID 번호:139의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:151의 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:162의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID 번호:163의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:164의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:165의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR3을 가지는 결합분자,
k) SEQ ID 번호:139의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:134의 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:152의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID 번호:166의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:167의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:168의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR3을 가지는 결합분자,
l) SEQ ID 번호:139의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:134의 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:152의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID 번호:169의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:149의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:150의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR3을 가지는 결합분자,
m) SEQ ID 번호:139의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:134의 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:141의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID 번호:163의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:169의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:170의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR3을 가지는 결합분자,
n) SEQ ID 번호:139의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:134의 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:152의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID 번호:171의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:164의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:172의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR3을 가지는 결합분자,
o) SEQ ID 번호:139의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:134의 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:145의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID 번호:142의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:143의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:173의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR3을 가지는 결합분자, 및
p) SEQ ID 번호:139의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:134의 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:152의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID 번호:142의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:143의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:144의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR3을 가지는 결합분자.
또 다른 실시예에서 본 발명에 따른 결합분자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
a) SEQ ID 번호:139의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:134의 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:145의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID 번호:146의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:174의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:147의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR3을 가지는 결합분자,
b) SEQ ID 번호:139의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:134의 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:152의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID 번호:171의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:164의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:172의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR3을 가지는 결합분자,
c) SEQ ID 번호:139의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:134의 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:145의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID 번호:142의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:143의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:173의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR3을 가지는 결합분자,
d) SEQ ID 번호:139의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:134의 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:152의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID 번호:142의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호:143의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:144의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 CDR3을 가지는 결합분자,
또 다른 실시예에서 본 발명에 따른 결합분자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
a) SEQ ID 번호:2의 중쇄 가변영역을 포함하는 결합분자,
b) SEQ ID 번호:6의 중쇄 가변영역을 포함하는 결합분자,
c) SEQ ID 번호:10의 중쇄 가변영역을 포함하는 결합분자,
d) SEQ ID 번호:14의 중쇄 가변영역을 포함하는 결합분자,
e) SEQ ID 번호:18의 중쇄 가변영역을 포함하는 결합분자,
f) SEQ ID 번호:22의 중쇄 가변영역을 포함하는 결합분자,
g) SEQ ID 번호:26의 중쇄 가변영역을 포함하는 결합분자,
h) SEQ ID 번호:30의 중쇄 가변영역을 포함하는 결합분자,
i) SEQ ID 번호:34의 중쇄 가변영역을 포함하는 결합분자,
j) SEQ ID 번호:38의 중쇄 가변영역을 포함하는 결합분자,
k) SEQ ID 번호:42의 중쇄 가변영역을 포함하는 결합분자,
l) SEQ ID 번호:46의 중쇄 가변영역을 포함하는 결합분자,
m) SEQ ID 번호:50의 중쇄 가변영역을 포함하는 결합분자,
n) SEQ ID 번호:54의 중쇄 가변영역을 포함하는 결합분자,
o) SEQ ID 번호:58의 중쇄 가변영역을 포함하는 결합분자, 및
p) SEQ ID 번호:62의 중쇄 가변영역을 포함하는 결합분자.
실시예에서 본 발명에 따른 결합분자는 SEQ ID 번호: 10DML 중쇄 가변영역을 포함하는 결합분자, SEI ID 번호: 54의 중쇄 가변영역을 포함하는 결합분자, SEQ ID 번호: 58의 중쇄 가변영역을 포함하는 결합분자, 및 SEQ ID 번호: 62DML 중쇄 가변영역을 포함하는 결합분자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 실시에에서 본 발명에 따른 결합분자는 SEQ ID 번호:4, SEQ ID 번호:8, SEQ ID 번호:12, SEQ ID 번호:16, SEQ ID 번호:20, SEQ ID 번호:24, SEQ ID 번호:28, SEQ ID 번호:32, SEQ ID 번호:36, SEQ ID 번호:40, SEQ ID 번호:44, SEQ ID 번호:48, SEQ ID 번호:52, SEQ ID 번호:56, SEQ ID 번호:60, SEQ ID 번호:64로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함한다.
그러나 또 다른 실시예에서 결합분자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
a) SEQ ID 번호: 2의 중쇄 가변영역 및 SEQ ID 번호: 4의 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합분자,
b) SEQ ID 번호: 6의 중쇄 가변영역 및 SEQ ID 번호: 8의 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합분자,
c) SEQ ID 번호: 10의 중쇄 가변영역 및 SEQ ID 번호: 12의 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합분자,
d) SEQ ID 번호: 14의 중쇄 가변영역 및 SEQ ID 번호: 16의 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합분자,
e) SEQ ID 번호: 18의 중쇄 가변영역 및 SEQ ID 번호: 20의 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합분자,
f) SEQ ID 번호: 22의 중쇄 가변영역 및 SEQ ID 번호: 24의 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합분자,
g) SEQ ID 번호: 26의 중쇄 가변영역 및 SEQ ID 번호: 28의 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합분자,
h) SEQ ID 번호: 30의 중쇄 가변영역 및 SEQ ID 번호: 32의 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합분자,
i) SEQ ID 번호: 34의 중쇄 가변영역 및 SEQ ID 번호: 36의 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합분자,
j) SEQ ID 번호: 38의 중쇄 가변영역 및 SEQ ID 번호: 40의 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합분자,
k) SEQ ID 번호: 42의 중쇄 가변영역 및 SEQ ID 번호: 44의 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합분자,
l) SEQ ID 번호: 46의 중쇄 가변영역 및 SEQ ID 번호: 48의 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합분자,
m) SEQ ID 번호: 50의 중쇄 가변영역 및 SEQ ID 번호: 52의 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합분자,
n) SEQ ID 번호: 54의 중쇄 가변영역 및 SEQ ID 번호: 56의 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합분자,
o) SEQ ID 번호: 68의 중쇄 가변영역 및 SEQ ID 번호: 60의 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합분자,
p) SEQ ID 번호: 62의 중쇄 가변영역 및 SEQ ID 번호: 64의 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합분자,
실시예에서, 본 발명에 따른 인간 결합분자는: SEQ ID 번호: 10의 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID 번호:12의 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합분자: SEQ ID 번호:54의 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID 번호: 56의 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합분자, SEQ ID 번호: 58의 중쇄 가변 영역과 SEQ ID 번호: 60의 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합분자, 및 SEQ ID 번호:62의 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID 번호:64의 가변 영역을 포함하는 결합분자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시예에서 본 발명에 따른 결합분자는 약제로서의 용도, 및 바람직하기는 인플루엔자 A형 및/또는 B형 바이러스에 의해 야기되는 인플루엔자 감염의 진단적, 치료적 및/또는 예방적 치료에서의 용도를 위한 것이다. 바람직하기는 인플루엔자 감염을 야기하고 본 발명의 결합분자를 사용하여 치료될 수 있는 인플루엔자 바이러스는 계통발생군 1 및/또는 2의 인플루엔자 A형 바이러스, 및/또는 인플루엔자 B형 바이러스이다. 또한 본 발명은 본 발명에 따른 하나 이상의 결합분자, 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이다.
그러나 또 다른 실시예에서 본 발명은 인플루엔자 바이러스 감염의 진단, 예방, 및/또는 치료를 위한 약제 제제에서 있어서 본 발명에 따른 결합분자의 용도에 관한 것이다. 이러한 감염은 소량의 개체에서 발생할 수 있지만 계절적 전염병, 또는 더 심각하게는 수백만의 개인이 위험에 처한 세계적 전염병으로 전세계적으로 퍼질 수 있다. 본 발명은 계절적 전염병뿐만 아니라 잠재적 전염병을 야기시키는 인플루엔자 균주의 감염을 중화시킬 수 있다. 중요하게는 본 발명의 결합분자는 H1, H2, H5, H6, H8, H9 및 H11 아형을 둘러싸는 계통발생군 1 및 아형 H3, H4, H7 및 H10 아형뿐만 아니라 인플루엔자 B형 아형을 둘러싸는 계통발생군2 둘다의 다양한 인플루엔자 아형을 교차-중화시킬 수 있다는 것이 기재하기 때문에 보호 및 치료는 다양한 인플루엔자 아형과 관련하여 본 발명의 결합분자를 예측할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 명세서에 정의된 결합분자의 기능적 변이체를 포함한다. 변이체가 "모체" 또는 "참조" 결합분자를 가지는 인플루엔자 바이러스 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하기 위해 경쟁할 수 있는 경우 분자는 본 발명에 따른 결합분자의 기능적 변이체인 것으로 간주된다. 즉, 분자는 기능적 변이체가 인플루엔자 바이러스 또는 그의 단편의 동일하거나 중첩된 에피토프에 여전히 결합할 수 있는 경우 본 발명에 따른 결합분자의 기능적 변이체로 간주된다. 이 출원을 위하여 "모체" 및 "참조"는 참조 또는 모체 분자의 정보를 의미하는 동의어로서 사용될 수 있거나 물리적 분자 그 자체는 변이를 위해 기본을 형성할 수 있다. 기능적 변이체는 Fc 수용체 또는 효과 기능과 관련된 다른 영역의 변형을 포함하고, 및/또는 모체 결합분자에서 발견되지 않은 예를 들어 인 비트로 또는 인 비보 변형, 화학적 및/또는 생화학적인 것을 함유하는 주요 구조적 서열에서 실질적으로 유사한 유도체를 제한하지는 않지만 포함한다. 이러한 변형은 그중에서도 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 아세틸화, 아크릴화, 공유결합, 지질 또는 지질 유도체, 가교-결합, 이인산 결합 형성, 글리코실화, 히드록실화, 메틸화, 산화, 페길화, 단백질 분해 공정, 인산화 등의 공유결합을 포함한다. 선택적으로, 기능적 변이체는 모체 결합분자의 아미노산 서열과 비교했을 때 하나 이상의 아미노산의 치환, 삽입, 결실 또는 그의 조합을 함유하는 아미노산 서열을 포함하는 본 발명에서 정의된 바와 같은 결합분자일 수 있다. 더욱 기능적 변이체는 어느 하나 또는 둘다의 아미노 또는 카르복실 말단에서 아미노산 서열의 절단을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 기능적 변이체는 모체 결합분자와 비교했을 때 동일하거나 다른, 더 크거나 더 작은 결합 친화성을 가지지만 여전히 인플루엔자 바이러스 또는 그의 단편에 결합할 수 있다. 예를 들어 본 발명에 따른 기능적 변이체는 모체 결합분자와 비교했을 때 인플루엔자 바이러스 또는 그의 단편에 대한 결합 친화성을 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 바람직하기는 프레임워크 영역, 초가변영역, 특히 CDR3 영역을 제한하지는 않지만 이들을 포함하는 가변 영역의 아미노산 서열은 변형된다. 통상적으로 3개의 CDR, 및 더욱 보존된 영역, 소위 프레임워크 영역 (FRs)을 포함하면서 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 3가지 초가변영역을 포함한다. 초가변영역은 CDR로부터의 아미노산 잔기 및 초가변 고리로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 범위 내에 있도록 의도하는 기능적 변이체는 본 명세서에 정의된 바와 같이 모체 결합분자와의 약 50% 내지 약 99% 이상, 바람직하기는 약 60% 내지 약 99% 이상, 더욱 바람직하기는 약 70% 내지 약 99% 이상, 더욱 더 바람직하기는 약 80% 이상 내지 약 99% 이상, 가장 바람직하기는 약 90% 이상 내지 약 99% 이상, 특히 약 95% 내지 약 99% 이상, 및 특히 약 97% 내지 약 99%의 아미노산 서열 동일성 및/또는 상동성을 가진다. 당업자에게 잘 알려진 그중에서도 Gap 또는 Bestfit와 같은 컴퓨터 알고리즘은 비교될 아미노산 서열을 최적화하여 배열하기 위해 그리고 유사하거나 동일한 아미노산 잔기를 정의하는데 사용될 수 있다. 기능적 변이체는 에러 발생이 쉬운 PCR, 올리고뉴클레오티드-특이적 돌연변이생성, 부위-특이적 돌연변이생성 및 중쇄 및/또는 경쇄 셔플링에 제한되지는 않지만 이들을 포함하는 분야에 공지된 통상적인 분자 생물학적 방법에 의한 모체 결합분자 또는 그의 부분을 교체함에 의해 얻을 수 있다. 실시예에서 본 발명의 기능적 변이체는 군 1 및 군 2의 인플루엔자 A형 바이러스, 및/또는 인플루엔자 B형 바이러스에 대한 중화활동을 가진다. 중화활동은 모체 결합분자와 비교할 때 동일하거나, 더 높거나 낮을 수 있다. 이후로 용어 (인간) 결합분자가 사용된 경우 또한 (인간) 결합분자의 기능적 변이체를 둘러싼다. 변이 결합분자가 중화활동을 가지는 경우를 증명하기 위한 분석은 공지에 잘 알려져 있다 (Animal Influenza Diagnosis and Surveillance, Geneva: World Health Organisation, 2005 version 2002.5에 관한 WHO 매뉴얼 참조).
그러나 추가의 양태에서 본 발명은 면역접합, 즉 본 명세서에 정의된 바와 같은 하나 이상의 결합분자를 포함하고 또한 그 중에서도 검출할 수 있는 부분/시약과 같은 하나 이상의 태그를 포함하는 분자를 포함한다. 또한 본 발명에서 고려된 것은 본 발명에 따른 면역접합의 혼합물 또는 본 발명에 따른 하나 이상의 면역접합체의 혼합물 및 치료제 또는 또 다른 결합분자 또는 면역접합체 등의 또 다른 분자이다. 추가의 실시예에서, 본 발명의 면역접합체는 하나 이상의 태그를 포함할 수 있다. 이들 태그는 서로 동일하거나 구별될 수 있고 결합분자에 대해 비-공유적으로 결합되고/접합될 수 있다. 태그(들)은 또한 공유 결합을 통하여 인간 결합분자에 직접적으로 결합되고/접합될 수 있다. 대안적으로 태그는 하나 이상의 연결 화합물에 의하여 결합분자에 결합되고/접합될 수 있다. 결합분자에 대한 접합하는 태그를 위한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명의 면역접합의 태그는 치료제가 될 수 있지만 또한 검출할 수 있는 부분/시약일 수 있다. 치료 및/또는 예방에 적절한 태그는 독성물질 또는 그의 기능적 부분, 항생물질, 효소, 식균작용 또는 면역 자극을 향상시킬 수 있는 다른 결합분자일 수 있다. 검출제를 포함하는 면역접합은 예를 들어 대상이 인플루엔자 바이러스로 감염되었는지를 평가하기 위해 또는 예를 들어 주어진 최적 치료계획의 효능을 측정하기 위한 임상 실험 절차의 부분으로서 인플루엔자 바이러스 감염의 개발 또는 진행을 점검하기 위해 진단적으로 사용될 수 있다. 그러나, 또한 다른 검출 및/또는 분석적 및/또는 진단적 목적을 위해 사용될 수 있다. 검출할 수 있는 부분/시약은 효소, 인공기관 그룹, 형광성 재료, 발광 재료, 생물발광 재료, 방사능 재료, 양전자 방출 금속, 및 비-방사성 상자성 금속 철을 제한하지는 않지만 이들을 포함한다. 검출 및/또는 분석적 및/또는 진단적 목적을 위해 결합분자를 식별하기 위해 사용되는 태그는 그중에서도 (조직) 샘플의 면역조직화학염색, 흐름 혈구계산 검출, 스캐닝 레이저 혈구계산 검출, 형광 면역분석, 효소-결합 면역흡착제 분석 (ELISAs), 방사면역분석 (RIAs), 생물학적 정량 (예를 들어 식균작용 분석), 웨스턴 블로팅 적용 등과 같은 특이적 검출/분석/진단 기술 및/또는 방법에 의존한다. 본 분야에 알려진 검출/분석/진단 기술 및/또는 방법을 위한 적절한 라벨은 당업자의 손길이 닿는 곳에 있다.
또한 본 발명의 인간 결합분자 또는 면역접합체는 고체 지지체에 결합할 수 있고, 이것은 인 비트로 인플루엔자 바이러스 또는 그의 단편의 면역분석 또는 정제에 특히 유용하다. 이러한 고체 지지체는 다공성 또는 비다공성, 평면 또는 비평면일 수 있다. 본 발명의 결합분자는 정제를 촉진하기 위해 펩티드와 같은 마커 서열에 융합될 수 있다. 예로서 헥사-히스티딘 태그, 헤마글루티닌 태그, myc 태그 또는 플래그 태그를 제한하지는 않지만 이들을 포함한다. 대안적으로 항체는 두번째 항체에 접합되어 항체 이형접합체를 형성할 수 있다. 또 다른 양태에서 본 발명의 결합분자는 하나 이상의 항원에 접합되고/결합될 수 있다. 바람직하기는 이들 항원은 결합분자-항원 접합이 투여되는 대상의 면역 체계에 의해 인식되는 항원이다. 항원은 동일할 수 있지만 또한 서로 다를 수 있다. 항원과 결합분자를 결합시키는 접합방법은 분야에 잘 알려져 있고 교차-결합제의 사용에 제한되지는 않지만 이들을 포함한다. 본 발명의 결합분자는 인플루엔자 바이러스 HA에 결합할 것이고 결합분자에 결합한 항원은 접합체 위에 강력한 T-세포 공격을 개시할 것이고, 이것은 결과적으로 인플루엔자 바이러스의 붕괴를 야기시킨다.
예를 들어 연결기를 통해 직접적으로 또는 간접적으로 접합에 의해 화학적으로 면역접합을 제조하는 단계 후에, 면역접합체는 본 발명의 결합분자 및 적절한 태그를 포함하는 융합 단백질로서 제조될 수 있다. 융합 단백질은 예를 들어 적절한 태그를 인코딩시키고 이후에 핵산분자를 발현시키는 핵산 성분을 가지는 프레임에서 결합분자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산분자를 구성함에 의해 재조합하여 분야에 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 적어도 결합분자, 기능적 변이체 또는 면역접합체를 인코딩하는 핵산분자를 제공하는 것이다. 상기 핵산분자는 클로닝 목적, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 친화도 성숙의 과정에서 매개체로서 사용될 수 있다. 바람직한 실시예에서 핵산분자는 분리되거나 정제된다.
당업자는 이들 핵산분자의 기능적 변이체가 또한 본 발명의 일부이도록 하는 것을 인지할 것이다. 기능적 변이체는 표준 유전자 코드를 사용하여 직접적으로 번역될 수 있어 모체 핵산분자로부터 번역되는 것과 동일한 아미노산 서열을 제공하기 위한 핵산 서열이다.
바람직하게는 핵산분자는 상기 기재된 바와 같은 CDR 영역을 포함하는 결합분자를 인코딩한다. 또한 실시에에서 핵산분자는 본 발명의 결합분자의 2, 3, 4, 5, 또는 심지어 모든 6 CDR 영역을 포함하는 결합분자를 인코딩한다.
또 다른 실시예에서 핵산분자는 상기 기재된 바와 같은 가변 중쇄 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 결합분자를 인코딩한다. 또 다른 실시예에서 핵산분자는 상기 기재된 바와 같은 가변 경쇄 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 결합분자를 인코딩한다. 본 발명의 결합분자의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열이 아래에 주어진다.
본 발명의 또 다른 양태에서 벡터, 즉 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산분자를 포함하는 핵산 구조를 제공하는 것이다. 벡터는 그중에서도 F,R1, RP1, Col, pBR322, TOL, Ti 등의 플라스미드; cosmid; lambda, lambdoid, M13, Mu, P1, P22, Qß, T-even, T-odd, T2, T4, T7 등과 같은 파지; 식물 바이러스로부터 유도될 수 있다. 벡터는 본 발명의 결합분자의 클로닝 및/또는 발현을 위해 사용될 수 있고 심지어 유전자 치료목적을 위해 사용될 수 있다. 하나 이상의 발현-조절 핵산분자에 작용가능하게 결합된 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산분자를 포함하는 벡터는 본 발명에 의해 포함된다. 벡터 선택은 재조합 과정 및 사용된 숙주에 의존한다. 숙주 세포에서 벡터의 도입은 그중에서도 인산칼슘 형질주입, 바이러스 감염, DEAE-덱스트란 매개 형질주입, 리포펙타민 형질주입 또는 전기천공법에 의해 영향을 받을 수 있다. 벡터는 자동적으로 복제할 수 있거나 그들이 통합된 염색체와 함께 복제할 수 있다. 바람직하기는 벡터는 하나 이상의 선택 마커를 함유한다. 마커의 선별은 본 발명에서 본 분야의 당업자에게 잘 알려져 있기 때문에 본 발명에 대해 중요하지 않더라도 선택된 숙주 세포에 의존한다. 그들은 Herpes simplex virus (HSV-TK)로부터의 카나마이신, 네오마이신, 퓨로마이신, 히그로마이신, 제오신, 티미딘 키나아제 유전자, 마우스 (dhfr)로부터 디히드로플레이트 환원효소 유전자들을 제한하지는 않지만 이들을 포함한다. 인간 결합분자를 분리시키기 위해 사용될 수 있는 하나 이상의 핵산분자 인코딩 단백질 또는 펩티드와 작용가능하게 연결된 상기 기재된 바와 같은 인간 결합분자를 인코딩하는 하나 이상의 핵산분자를 포함하는 벡터는 또한 본 발명에 의해 포함된다. 이들 단백질 또는 펩티드는 글루타티온-S-전이효소, 말토오스 결합 단백질, 금속-결합 폴리히스티딘, 녹색의 형광 단백질, 루시퍼라아제 및 베타-갈락토시다아제들을 제한하지는 않지만 이들을 포함한다.
상기 언급된 벡터의 하나 이상의 카피 (copy)를 함유하는 숙주는 본 발명의 추가 대상이다. 바람직하기는 숙주는 숙주 세포이다. 숙주 세포는 포유류, 식물, 곤충, 균류 또는 박테리아 근원 (origin)의 세포를 제한하지는 않지만 이들을 포함한다. 박테리아 세포는 대장균, 및 슈도모나스 속과 같은 속 대장균속의 수개의 종과 같은 그램-양성의 박테리아 또는 그램-음성의 박테리아로부터의 세포를 제한하지는 않지만 이들을 포한하다. 균류 세포 군에서 효모세포가 사용된다. 효모에서의 발현은 그중에서도 피치아 파스토리스, 사카로마이세스 세레비지애 및 한세눌라 폴리모르파와 같은 효모 균주를 사용해 얻을 수 있다. 또한 Drosophila 및 Sf9로부터의 세포와 같은 곤충 세포는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 또한 숙주 세포는 그중에서도 삼림 식물과 같은 농작물로부터의 세포, 또는 곡물 식물, 약용 식물과 같은 식품 및 원자재를 제공하는 식물로부터의 세포, 또는 장식품으로부터의 세포, 또는 꽃 뿌리 작물로부터의 세포와 같은 식물 세포일 수 있다. 변형된 (유전자 변형된) 식물 또는 식물 세포는 알려진 방법, 예를 들어 아그로박테리움-매개 유전자 변형, 잎 판 (disc)의 변형, 폴리에틸렌 글리콜-유도 DNA 변형에 의한 원형질체 변형, 전기천공법, 초음파분해, 미세주입 또는 볼리스틱 (bolistic) 유전자 변형에 의해 제조된다. 추가적으로 적절한 발현 체계는 바큐로바이러스 체계일 수 있다. Chinese Hamser Ovary (CHO)세포, COS 세포, BHK 세포, NSO 세포 또는 Bowes 흑색종 세포와 같은 포유류 세포를 이용한 발현 시스템은 본 발명에서 바람직하다. 포유류 세포는 포류유 근원의 천연 분자와 가장 유사한 번역후 변형된 발현된 단백질을 제공한다. 본 발명은 인간에게 투여되어야 하는 분자를 다루기 때문에 완전한 인간 발현체계가 특히 바람직하다. 그러므로 더욱 더 바람직하기는 숙주 세포는 인간 세포이다. 인간 세포의 예는 그중에서도 HeLa, 911, AT1080, A549, 293 및 HEK93T 세포이다. 바람직한 실시예에서 인간 생산자 세포는 발현가능한 포맷에 있는 아데노바이러스 E1 영역을 인코딩하는 핵산 서열의 적어도 기능적 부분을 포함한다. 더욱 더 바람직한 실시예에서 상기 숙주 세포는 인간 망막으부터 유도되고 그리고 European Collection of Cell Cultrues (ECACC), CAMR, Salibury, Wiltshire SP4 OJG, Great Britain on 29 February 1996 under number 96022940에 놓이고 그리고 상품 PER.C6?? (PER.C6은 크루셀 홀란드 비.브이.의 등록된 상표) 하에서 출시된 911 세포 또는 세포계와 같은 아데노바이러스 E1 서열을 포함하는 핵산을 불멸화시킨다. 본 출원의 목적을 위해 "PER.C6 세포"는 세포는 번호 96022940 또는 조상, 패시지 (passage) 상류 또는 하류뿐만 아니라 증착된 세포의 조상으로부터의 후손, 진행중인 어느 유도체 하에서 증착된 세포를 지칭한다. 숙주 세포의 재조합 단백질의 제조는 본 분야에 알려진 방법에 따라 수행될 수 있다. 관심 단백질을 위한 제조 플랫폼으로서 상품 PER.C6??하에 출시된 세포의 용도는 그 전체가 참고문헌으로 본 명세서에 통합되어 WO00/63403에 기재되었다.
또 다른 실시예에서, 또한 본 발명의 결합분자는 그중에서도 토끼, 염소 또는 소와 같은 유전자변형의, 비-인간, 포유동물에서 제조될 수 있고, 그리고 예를 들어 우유로 분비될 수 있다.
또 다른 대안적인 실시예에서 본 발명에 따른 결합분자는 예를 들어 인간 면역글로불린 유전자를 발현시키는 유전자변형의 마우스 또는 토끼와 같은 유전자변형의 비-인간 포유동물에 의해 생성될 수 있다. 바람직하기는 유전자변형의 비-인간 포유동물은 상기 기재된 바와 같은 인간 결합분자의 모두 또는 일부를 인코딩하는 인간 중쇄 이식유전자 및 인간 경쇄 이식유전자를 포함하는 게놈을 가진다. 유전자변형의 비-인간 포유동물은 인플루엔자 바이러스 또는 그의 단편의 정제되거나 강화된 제조로 면역될 수 있다. 비-인간 포유동물을 면역시키기 위한 프로토콜은 분야에 잘 확립되어 있다. Using Antibodies:참고 A Laboratory Manual, Edited by: E. Harlow, D. Lane (1998), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York and Current Protocols in Immunology, Edited by: J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober (2001), John Wiley & Sons Inc., New York은 참고문헌으로 본 명세서에 통한된 기재다. 면역 프로토콜은 프로인드 완전 보조제 및 프로인드 불완전 보조제와 같은 보조제를 포함하거나 포함하지 않고 다수의 면역을 종종 포함하지만, 또한 네이키드 DNA 면역을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 인간 결합분자는 유전자변형 동물로부터 유도되는 B-세포, 플라즈마 및/또는 기억 세포에 의해 제조된다. 또 다른 실시예에서 인간 결합분자는 하이브로도마에 의해 제조되고, 이것은 상기-기재된 유전자변형 비-인간 푸유동물로부터 불명화 세포에서 얻어진 B-세포의 융합에 의해 제조된다. 상기 기재된 유전자변형 비-인간 포유동물로부터 얻을 수 있는 B-세포, 플라즈마 세포 및 하이브리도마 및 상기 기재된 유전자변형 비-인간 포유동물, B-세포, 플라즈마 및/또는 기억 세포 및 하이브리도마로부터 얻을 수 있는 인간 결합분자는 또한 본 발명의 일부이다.
추가의 양태에서 본 발명은 본 발명에 따른 적어도 결합분자, 바람직하기는 인간 모노클로날 항체, 본 발명에 따른 적어도 그의 기능적 변이체, 적어도 면역접합체 및/또는 그의 조합을 포함하는 조성물을 제공한다. 또한 조성물은 그중에서도 알부민 또는 폴리에틸렌 글리콜, 또는 염과 같은 안정화 분자를 포함한다. 바람직하기는 사용된 염은 결합분자의 요구된 생물학적 활성을 보유하는 염이고 그리고 원치 않는 독성 효과를 부여하지 않는다. 필요하다면 본 발명의 인간 결합분자는 산 또는 결합분자를 비활성화시킬수 있는 다른 천연 또는 비-천연 조건의 작용으로부터 그들을 보호하기 위해 재료안 또는 위에 코팅될 수 있다.
그러나 추가의 양태에서 본 발명은 본 발명에서 정의된 바와 같은 적어도 핵산을 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 염 (상기 기재된 바와 같은 NaCl 또는 염), 세제 (SDS 등) 및/또는 다른 적절한 조성물을 함유하는 수용액과 같은 수용액을 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 적어도 본 발명의 인간 모노클로날 항체와 같은 결합분자 (또는 그의 기능적 단편 또는 변이체), 적어도 본 발명에 따른 면역접합체, 적어도 본 발명에 따른 조성물, 또는 그의 조합을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 부형제는 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 하나 이상의 다른 치료제를 추가로 포함할 수 있다. 적절한 시약은 또한 당업자에게 잘 알려져 있다.
바람직한 실시예에서 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 하나 이상의 추가의 결합분자를 포함할 수 있고, 즉 약제학적 조성물은 결합분자의 칵테일 (cocktail) 또는 혼합물일 수 있다. 약제학적 조성물은 본 발명에 따른 두개 이상의 결합분자, 또는 본 발명에 따른 하나 이상의 결합분자 및 HA 단백질에 대해 또는 M2와 같은 인플루엔자 바이러스에 존재하는 다른 항원 구조체에 대해 특이한 또 다른 항체와 같은 하나 이상의 추가의 인플루엔자 바이러스 결합 및/또는 중화 분자를 포함할 수 있다. 또 다른 실시예에서 추가적인 결합분자는 동시적으로 별도의 또는 순차적인 투여를 위해 제조될 수 있다.
실시예에서 약제학적 조성물은 인플루엔자 A형 바이러스 및/또는 인플루엔자 B형 바이러스에 대한 중화활동을 가지는 두개 이상의 결합분자를 포함시킬 수 있다. 실시예에서 결합분자는 조합하여 사용될 경우 상승 중화활동을 나타낸다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "상승"은 조합하여 사용될 경우의 결합분자의 결합효과가 개별적으로 사용될 경우의 그들의 추가적인 효과보다 크다는 것을 의미한다. 상승작용에 의해 작용하는 결합분자는 인플루엔자 바이러스의 동일하거나 다른 단편 위에 다른 구조에 결합할 수 있다. 연산 에너지의 방법은 조합 인덱스에 의한다. 조합 인덱스 (CI)의 개념은 Chou 및 Talalay (1984)에 의해 기재될 것이다. 조성물은 예를 들어 중화활동을 가지는 하나의 결합분자 및 하나의 비-중화 결합분자를 포함한다. 비-중화 및 중화 결합분자는 또한 인플루엔자 바이러스를 중화하는 데 있어 상승작용에 의해 작용한다.
실시예에서 약제학적 조성물은 본 발명에 따른 하나 이상의 결합분자 및 결합분자를 중화시키는 하나 이상의 추가의 인플루엔자 바이러스를 포함한다. 약제학적 조성물의 결합분자는 바람직하기는 다른 아형의 인플루엔자 바이러스와 반응할 수 있다. 결합분자는 높은 친화성을 가져야 하고 광범위한 특이성을 가져야 한다. 바람직하기는 두개의 결합분자는 그들이 각각 다른 아형의 인플루엔자 바이러스를 중화시키는 점에서 교차-중화 분자이다. 또한 바람직하기는 가능한 한 많은 다른 인플루엔자 바이러스 아형의 각가의 균주를 중화시킨다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 하나 이상의 다른 치료적, 예방적 및/또는 진단적 시약을 더욱 포함한다. 바람직하기는 약제학적 조성물은 하나 이상의 다른 예방적 및/또는 치료적 시약을 포함한다. 바람직하기는 상기 추가의 치료적 및/또는 예방적 시약은 인플루엔자 바이러스 감염 및/또는 상기 감염으로부터 기인하는 상태를 방지하고 및/또는 치료할 수 있다. 치료적 및/또는 예방적 시약은 항-바이러스제를 제한하지는 않지만 이들을 포함한다. 상기 시약은 결합분자, 소분자, 유기 또는 무기 화합물, 효소, 폴리뉴클레오티드 서열, 항-바이러스 펩티드 등일 수 있다. 인플루엔자 바이러스로 감염된 환자를 치료하기 위해 현재 사용되는 다른 시약은 M2 억제제 (아마티딘, 리마타딘 등) 및/또는 뉴라미니다제 억제제 (자나미비르, 오셀타미비르 등)이다. 이들은 본 발명의 결합분자와 조합하여 사용될 수 있다. 본 명세서의 "조합하여"는 임의의 순서로 별도의 제제로서, 또는 단일의 결합된 제제로서, 또는 별도의 제제로서 순차적 투여 계획에 따르는 것을 의미한다. 실험 단계에 있는 감염으로부터 발생하는 인플루엔자 바이러스 및/또는 상태와의 감염을 방지하고 및/또는 치료할 수 있는 시약은 본 발명에서 다른 치료적 및/또는 예방제로서 사용될 수 있다.
본 발명의 결합분자 또는 약제학적 조성물은 인간에게 사용하기 전에 적절한 동물 모델 시스템에서 시험될 수 있다. 동물 모델 시스템은 마우스, 흰담비 (ferret) 및 원숭이를 제한하지는 않지만 이들을 포함한다.
통상적으로 약제학적 조성물은 제조 및 저장의 조건 하에서 살균적이고 안정적이어야 한다. 본 발며의 결합분자, 면역접합체, 핵산분자 또는 조성물은 이동전 또는 이동할 때 적절한 약제학적으로 허용가능한 부형제에서 재구성 (reconstruction)을 위해 분말 형태일 수 있다. 살균적으로 주입가능한 용액의 제조를 위한 살균 분말의 경우, 바람직한 제조방법은 이전에 살균-여과된 용액으로부터 어느 추가의 바람직한 성분에 더하여 활성 성분의 분말을 얻는 진공 건조 및 냉동-건조 (동결건조)이다.
선택적으로 본 발명의 결합분자, 면역접합체, 핵산분자 또는 조성물은 용액에 있을 수 있고 적절한 약제학적으로 허용가능한 부형제는 단위 투여의 주입가능한 형태를 제공하기 위해 전달의 이전 또는 전달할때 첨가되고 및/또는 혼합될 수 있다. 바람직하기는 본 명세서에 사용되는 약제학적으로 허용가능한 부형제는 약물의 높은 농도에 적합하고, 적절한 유동성을 유지할 수 있고 필요하다면 흡수를 지연시킬 수 있다.
약제학적 조성물의 최적 투여 경로의 선택은 조성물 내에서 활성 분자의 물리화학적 성질 및 긴급 임상 상황의 및 원하는 치료효과에 대한 활성 분자의 플라즈마 농도의 관계를 포함하는 수개의 요인에 의해 영향을 받을 것이다. 예를 들어 필요하다면 본 발명의 결합분자는 이식, 경피성 패치제 (patch), 및 미립캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 조절형 방출 제제와 같은 즉시 방출에 대해 그들을 보호할 수 있는 담체로 제조될 수 있다. 생분해성, 생체적합성 중합체는 그중에서도 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리유산 등일 수 있다. 또한 인간 결합분자의 불활성을 방지하는 재료 또는 화합물로 결합분자를 코팅하거나, 또는 결합분자를 함께-투여하는 것이 필수적이다. 예를 들어 결합분자는 적절한 담체, 예를 들어 리포솜 또는 희석액에서 대상에게 투여될 수 있다.
투여 경로는 두가지 주요 범주인, 경구 및 비경구 투여로 구분될 수 있다. 바람직한 투여 경로는 정맥내 또는 흡입에 의한다.
경구 투여는 그중에서도 정제 (tablet), 트로치 (troche), 로젠지 (lozenge), 수성 및 오일 현탁액, 분산형 분말 또는 과립, 유제, 경질 캡슐, 연질 젤라틴 캡슐, 시럽 또는 약, 알약, 당제, 액체, 겔, 또는 슬러리로서 제조될 수 있다. 이들 제제는 약한 희석액, 과립제 및 붕해제, 결합제, 윤활제, 방부제, 착색제, 풍미제 또는 감미제, 식물성 기름 또는 광물성 기름, 습윤제, 및 경화제를 제한하지는 않지만 이들을 포함하는 약제학적으로 부형제를 함유한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 비경구 투여를 위해 제조될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 그중에서도 수용성 또는 비-수용성 등장성 살균 비-독성 주입 또는 융합액 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 용액 또는 현탁액은 1,3-부탄디올, 링거액, Hank's 용액, 등장성 염화나트륨 용액, 기름, 지방산, 국소마취제, 방부제, 완충액, 점도 또는 용해성 증가제, 수용성 산화방지제, 유용성 산화방지제 및 금속 킬레이트제 등을 사용한 투여량 및 농도에서 수취인에게 비-독성인 시약을 포함할 수 있다.
추가의 양태에서 본 발명의 인간 모노클로날 항체 (그의 기능적 단편 및 변이체), 면역접합체, 조성물, 또는 약제학적 조성물 등의이 결합분자는 약제로서 사용될 수 있다. 그러므로 본 발명의 결합분자, 면역접합체, 조성물, 또는 약제학적 조성물을 사용하는 인플루엔자 바이러스 감염의 진단, 치료 및/또는 방지방법은 본 발명의 또 다른 부분이다. 상기-언급된 분자는 그중에서도 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10 및/또는 H11 아형 중의 HA를 포함하는 인플루엔자 감염에 의해 야기되는 인플루엔자 바이러스 감염의 진단, 예방, 치료 또는 그의 조합으로 사용될 수 있다. 실시예에서 상기-언급된 분자는 또한 인플루엔자 B형 바이러스에 의해 야기되는 인플루엔자 바이러스 감염의 진단, 예방, 치료 또는 그의 조합으로 사용될 수 있다. 그들은 인플루엔자 바이러스 감염으로부터 고통받는 아직 치료받지 않은 환자 및 인플루엔자 바이러스 감염을 앓거나 치료된 환자의 치료에 적합하다.
상기-언급된 분자 또는 조성물은 진단, 예방 및/또는 치료에 유용한 다른 분자와 접합하여 사용될 수 있다. 그들은 인 비트로, 엑스 비보 또는 인 비보로 사용될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 인간 모노클로날 항체 (또는 그의 기능적 변이체), 면역접합체, 조성물 또는 약제학적 조성물 등의 결합분자는 인플루엔자 바이러스 (이용가능한 경우)에 대한 백신으로 함께-투여될 수 있다. 선택적으로 백신은 또한 본 발명의 분자의 투여 전후에 투여될 수 있다. 백신 대신에 항-바이러스제는 또한 본 발명의 결합분자와 접합하여 사용될 수 있다. 적절한 항-바이러스제는 상기 언급된 것이다.
분자는 치료적으로 또는 진단적으로 효과적인 양으로 본 발명의 조성물 및 약제학적 조성물에서 통상적으로 제조된다. 선택적으로 그들은 별도로 제조되고 그리고 투여될 수 있다. 예를 들어 항-바이러스제와 같은 다른 분자는 본 발명의 결합분자가 정맥내로 적용될 수 있으면서 전신에 적용될 수 있다.
치료는 인플루엔자 감염에 걸리기 쉬운 환자 그룹을 대상으로 할 수 있다. 상기 환자 그룹은 예를 들어 노인들 (≥50세, ≥60세, 및 바람직하기는 65세), 젊은이들 (≤5세, ≤1세), 입원 환자 및 항바이러스 화합물로 치료를 받았지만 부적절한 항바이러스 반응을 나타낸 이미 감염된 환자들을 제한하지는 않지만 이들을 포함한다.
투여 계획은 최적의 바람직한 반응 (치료 반응 등)을 제공하기 위해 조절될 수 있다. 적절한 투여 범위는 예를 들어 0.01-100 mg/kg 체중, 바람직하기는 0.1-50 mg/kg 체중, 바람직하기는 0.01-15 mg/kg 체중일 수 있다. 또한 예를 들어 단일 약이 투여될 수 있고, 수개의 분할 투여는 시간에 따라 투여될 수 있거나 투여는 긴급의 치료상황에 의해 나타내는 바와 같이 비례적으로 감소되거나 증가할 수 있다. 본 발명에 따른 분자 및 조성물은 바람직하기는 살균적이다. 이들 분자 및 조성물을 살균하는 방법은 본 분야에 잘 알려져 있다. 진단, 예방 및/또는 치료에 유용한 다른 분자는 본 발명의 결합분자를 위해 제안되는 유사한 투여 계획에서 투여될 수 있다. 다른 분자가 별도로 투여되는 경우 그들은 본 발명의 하나 이상의 인간 결합분자 또는 약제학적 조성물의 투여 전 (예를 들어, 2분, 5분, 10분, 15분, 30분, 45분, 60분, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간, 20시간, 22시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 7일, 2주, 4주 또는 6주 전), 수반하거나 또는 이후에 (예를 들어 2분, 5분, 10분, 15분, 30분, 45분, 60분, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간, 20시간, 22시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 7일, 2주, 4주 또는 6주 후)에 환자에게 투여될 수 있다. 정확한 투여 계획은 통상적으로 인간 환자에게 임상 시험동안에 분류된다.
인간 결합분자를 포함하는 인간 결합분자 및 약제학적 조성물은 투여된 항체로의 수취인의 면역 반응이 모노클로날 마우스 (murine), 키메라 또는 인간화된 결합분자의 투여에 의해 발생된 것보다 실질적으로 더 적기 때문에 인 비보 치료제로서 인간에게 투여될 경우 특히 유용하고, 종종 바람직하다.
또 다른 양태에서 본 발명은 인플루엔자 바이러스 감염, 특히 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10 및/또는 H11 아형 및/또는 인플루엔자 B형 바이러스 중의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 의해 야기되는 인플루엔자 바이러스 감염의 진단, 예방, 치료, 또는 그의 조합을 위한 약제의 제제에서 본 발명에 따른 인간 모노클로날 항체 (그의 기능적 단편 및 변이체), 면역접합체, 핵산분자, 조성물 또는 약제학적 조성물과 같은 결합분자의 용도에 관련한다.
또한 적어도 중화 인간 모노클로날 항체 (그의 기능적 단편 및 변이체)와 같은 결합분자, 적어도 면역접합체, 적어도 핵산분자, 적어도 조성물, 적어도 약제학적 조성물, 적어도 벡터, 적어도 본 발명에 따른 숙주 또는 그의 조합을 포함하는 키트는 또한 본 발명의 일부이다. 선택적으로 본 발명의 키트의 상기-기재된 성분은 나타낸 조건의 진단, 예방 및/또는 치료를 위해 적절한 컨테이너에 포장되고 그리고 표지된다. 상기-언급된 조성물은 수용성, 바람직하기는 살균성 용액 또는 재구성을 위한 동결건조, 바람직하기는 살균, 제제로서 단위에서 또는 다중-투여 컨테이너에서 저장될 수 있다. 컨테이너는 유리 또는 가소제와 같은 다양한 재료로부터 형성될 수 있고 그리고 살균적 접근 포트 (예를 들어 컨테이너는 피하주사기 주입바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 가지는 정맥내 용액 백 (bag) 또는 바이얼일 수 있다)를 가질 수 있다. 키트는 약제학적으로 허용가능한 완충액을 포함하는 더 많은 컨테이너를 더욱 포함할 수 있다. 하나 이상의 적절한 숙주, 바람직하기는 하나 이상의 다른 치료제, 예방제 또는 진단젱 대해 다른 완충액, 희석액, 필터, 바늘, 주사기, 배양 배지를 포함하는 상업적으로 바람직한 다른 재료 및 사용자 관점을 더 포함한다. 키트와 관련된 것은 이러한 치료학적, 예방적 또는 진단적 제품의 용도와 관련한 표지, 용도, 투여, 제조, 투여, 사용금지 및/또는 경고에 대한 정보를 함유하는 치료학적, 예방적 또는 진단적 제품의 사업적 패키지가 관습적으로 포함된 지침일 수 있다.
본 발명에 따른 결합분자는 또한 유리하기는 인플루엔자 바이러스의 인 비보 검출방법에서 진단제로서 사용될 수 있다. 그러므로 발명은 인플루엔자 바이러스 계통발생군 1 또는 군 2, 또는 샘플에서 인플루엔자 B형 아형 인플루엔자 바이러스의 검출 방법에 또한 관련되고, 여기서 방법은 (a) 샘플을 본 발명에 따른 결합분자 (그의 기능적 단편 또는 변이체)의 진단적으로 효과적인 양 또는 면역접합체와 접촉시키는 단계, 및 (b) 결합분자 또는 면역접합체가 샘플의 분자에 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 샘플은 혈액, 혈청, 스툴 (stool), 가래, 비인두 흡입, 기관지 세척, 소변, 조직 또는 (잠재적으로) 감염된 대상으로부터의 다른 생물학적 재료, 또는 물, 음료 등과 같은 비-생물학적 샘플을 제한하지는 않지만 이들을 포함하는 생물학적 샘플일 수 있다. (잠재적으로) 감염되는 대상은 인간 대상일 수 있지만, 또한 인플루엔자 바이러스의 담체로 추정되는 동물은 본 발명의 인간 결합분자 또는 면역접합체를 사용하는 바이러스의 존재 하에 시험될 수 있다. 샘플은 첫번째로 조작되어 검출방법을 더욱 적절하게 할 수 있다. 조작은 바이러스가 단백질, (폴리)펩티드 또는 다른 항원 단편과 같은 항원 성분으로 분해될 수 있는 방식으로 바이러스를 함유하고 및/또는 함유하는 것으로 추정되는 샘플을 치료하는 것을 의미한다. 바람직하기는 본 발명의 인간 결합분자 또는 면역접합체는 인간 결합분자와 샘플에 존재할 수 있는 바이러스 또는 그의 항원 성분 사이의 면역접합 복합체의 형성을 허용하는 조건 하에서 샘플이 접촉된다. 샘플에서 바이러스의 존재를 나타내는 경우 면역접합 복합체의 형성은 이후에 적절한 방법에 의해 검출되고 측정된다. 이러한 방법은 그중에서도 방사선-면역분석 (RIA), ELISA, 면역형광법, 면역조직화학, FACS, BIACORE 및 특수단백질 검출검사와 같은 이형 및 동형 결합 면역분석을 포함한다.
환자의 혈청 및 혈액 및 혈액-유도 제품의 바람직한 분석 기술, 특히 대규모의 임상 스크리닝은 ELISA 및 특수단백질 검출검사이다. ELISA가 특히 바람직하다. 이들 분석에서 시약으로서 사용하기 위해 본 발명의 결합분자 또는 면역접합체는 마이크로티터 웰 (well)의 내부 표면에 편리하게 결합된다. 본 발명의 결합분자 또는 면역접합체는 마이크로티터 웰에 직접 결합될 수 있다. 그러나 본 발명의 결합분자 또는 면역접합체의 웰에 대한 최대 결합은 본 발명의 결합분자 또는 면역접합체를 첨가하기 전에 웰을 폴리라이신으로 전-처리함에 의해 달성될 수 있다. 또한 본 발명의 결합분자 또는 면역접합체는 공지의 방법에 의해 웰에 공유결합할 수 있다. 통상적으로, 결합분자 또는 면역접합체는 양이 더 많을 뿐만 아니라 더 적게 사용될 수 있더라도 0.01 내지 100 μg/ml의 농도로 사용된다. 이후에 샘플은 본 발명의 결합분자 또는 면역접합체로 코팅된 웰에 부착된다.
또한 본 발명의 결합분자는 인플루엔자 바이러스의 특이적 결합구조를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 결합구조는 단백질 및/또는 폴리펩티드에 대한 에피토프일 수 있다. 그들은 선형일 수 있지만, 또한 구조적 및/또는 형태학적일 수 있다. 하나의 실시예에서 결합구조는 PEPSCAN 분석 (그중에서도 1996년 Slootstra 등, WO 84/03564, 재93/09872 참조)에 의해 분석될 수 있다. 선택적으로 인플루엔자 바이러스의 단백질로부터의 펩티드를 포함하는 임의의 펩티드 라이브러리는 본 발명의 결합분자에 결합할 수 있는 펩티드를 위해 선별될 수 있다.
또한 본 발명은 다음의 실시예 및 도에서 설명된다. 실시예는 어느 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하려는 목적이 아니다.
실시예
실시예 1 말초 혈액 단핵세포로부터 추출된 RNA를 사용한 scFv 파지 디스플레이 라이브러리의 구조
말초 혈액을 EDTA 항-응고 샘플관에서 정맥파열에 의해 정상적인 건강한 공여자로부터 수집하였다. scFv 파지 디스플레이 라이브러리를 WO 2008/028946에 기재된 바와 같이 획득하였고, 이것은 본 명세서에 참고문헌으로 통합된다. RNA는 준비된 말초혈액 단핵세포 및 cDNA로부터 분리시킨다. 2차 라운드 (round) PCR 증폭법을 표 1 및 2에 나타낸 프라이머 세트를 사용하여 적용시켜 각각의 공여자 목록으로부터 면역글로불린 VH 및 VL 영역을 분리한다.
표 1에 언급된 프라이머 세트를 이용한 각각의 cDNA위의 첫번째 라운드 증폭은 각각의 VH, Vkappa 및 Vlambda 영역을 위해 약 650 염기쌍의 7,6 및 9 제품을 얻었다. IgM VH영역 증폭의 경우 OCM 지속적인 프라이머는 OH7로 OH1과 조합하여 사용하였다. 1차 라운드 증폭에 대한 열적 주기 프로그램은: 2분 96 ℃ (변성 단계), 30 주기의 30초 96℃/ 30초 60℃/60초 72℃, 10분 72℃ 최종 신장 및 6 냉동이였다. 제품을 겔-추출 칼럼 (Macherey Nagel)을 이용한 1% 아가로스 겔 위에 놓고 분리시키고 50 μl 5 mM Tris-HCl pH8.0을 용출시켰다. 10%의 1차 라운드 제품 (3 내지 5 μl)을 표 2에 언급된 프라이머를 사용하여 2차 라운드 증폭시켰다. 이들 프라이머는 각각의 VL 및 VH 영역을 파지 디스플레이 벡터 PDV-C06으로 직접적 클로닝시킬 수 있는 제한 부위로 연장하였다. 2차째 라운드 증폭을 위한 PCR 프로그램은: 2분 96℃ (변성 단계), 30 주기의 30초/96℃/30초60℃/60초72℃, 10분 72℃ 최종 신장 및 6℃ 냉동과 같다. 2차 라운드 제품 (~350 염기쌍)을 면역글로불린 유전자 제품에서 발견된 J 단편의 자연적 발생에 따라 첫번째로 풀링시켰고 (pooled), 이것은 각각의 VH, Vkappa 및 Vlambda 가변영역 (표 3 및 4 참조)에 대해 7,6 및 9 풀을 일으킨다. 면역 라이브러리에서 면역글로불린 서열의 정규환된 분포를 얻기 위해 6 Vkappa 및 9 Vlambda 빛 경쇄 풀을 표 3에 언급된 퍼센트에 따라 혼합하였다. 단일의 최종 VL 풀 (3 μg)을 다음: Macherey Nagel 겔-추출 칼럼을 사용하여 1% 아가로오스 겔 (~350 염기쌍)위에 놓고 분리ㅣ시키고 그리고 0 μl PDV-C06 벡터 (50 ng/μl), 7 μl VL 주입 (10 ng/μl), 5 μl 10X 결찰 완충액 (NEB), 2.5 T4 DNA 리가아제 (400U/μl) (NEB), 25.5 μl 초순수 (벡터의 주입비율은 1:2였다)과 같은 Sa1I-NotI cut PDB-C06 벡터 (~5000 염기쌍)에 결찰된 Sa1I 및 NotI 제한효소로 밤새 분해시켰다. 결찰을 16℃의 욕조에서 밤새 수행하였다. 이후에 부피는 물로 2배가 되었고, 페놀-클로로폼-이소아밀알콜 (75:24:1)로 추출하였고 이어서 클로로폼 (Merck) 추출하고 그리고 -20에서 2시간동안 1 μl Pellet Paint (Novogen), 10 μl 나트륨 아세테이트 (3M pH 5.0) 및 100 μl 이소프로판올로 침전시켰다. 얻은 샘플을 이후에 4℃에서 30분동안 20.000xg에서 원심분리하였다. 얻은 침전물을 70% 에탄올로 세척하고 그리고 상온에서 20.000xg에서 10분동안 원심분리하였다. 에탄올을 진공 흡인에 의해 제거시키고 펠렛을 몇분동안 공기 건조시키고 이후에 10 mM Tris-HCl을 함유하는 50 μl의 완충액에서 용해시키고, pH 8.0.2 μl 결찰 혼합물을 1.7 kV, 200 Ohm, 25 μF (시간 상수 ~4,5 msec)에서 Genepulser II 장치 (Biorad) 세트를 사용하여 냉각된 0.1 cm 전기천공법 큐벳 (Biorad)에서 40 μl TG-1 전기-능력 세포 (Agilent)의 변형을 위해 사용하였다. 펄스 직후에, 박테리아를 37℃에서 5% (w/v) 글루코오스 (Sigma)를 함유하는 1000 μl SOC 배지 (Invitrogen)을 사용하여 큐벳으로부터 플러시하였고 15 ml 둥근 하부의 배양관으로 이동시켰다. 또 다른 500 μl의 SOC/글루코오스를 큐벳으로부터 잔류 박테리아를 플러시하기 위해 사용하였고 배양관으로 첨가하였다. 박테리아를 220 rpm에서 쉐이커 인큐베이터에서 37℃에서 정확히 1시간동안 배양시켜 회수하였다. 변형된 박테리아를 50 μg/ml 암피실린 및 5% (w/v) 글루코오스 (Sigma)로 보충된 150 ml 2TY 배양액 (16 g/μl bacto/-트립톤, 10 g/μl bacto-효모 추출, 5 g/l NaCl, 15 g/l 배양액, pH 7.0)을 함유하는 큰 240 mmm 정사각형 페트리접시 (NUNC)에 놓았다. 1 내지 1000 희석액을 동일한 배지를 함유하는 15 cm 페트리접시 위에 계산하기 위해 놓았다. 변형 방법을 연속으로 10번 반복하였고 그리고 각각의 완전한 변형을 각각의 정사각형 페트리접시 위에 놓고 그리고 37℃ 배양 스토브에서 밤새 성장시켰다. 통상적으로 약 1x107 cfu (페트리접시당 1x106 )을 상기 프로토콜을 사용하여 얻었다. 중간 VL 경쇄 라이브러리를 박테리아를 플레이트당 10 ml 2TY 배지로 부드럽게 제거함에 의해 플레이트로부터 얻었다. 세포 질량을 OD600 측정에 의해 측정하였고 그리고 박테리아의 2회의 500 OD를 제조자의 지시에 따른 두가지 P500 maxiprep 칼럼 (Macherey Nagel)을 사용하여 최대 플라스미드 DNA 제조를 위해 사용하였다.
VL 가변영역에 대한 유사체, 2차 라운드 VH-JH 제품을 PH1 내지 PH7라고 지칭되는 7 VH 서브풀을 일으키는 일반적인 J 분획 사용량 분포 (표 4 참조)을 얻기 위해 첫번째로 함께 혼합시켰다. 풀을 표 4에 나타낸 퍼센트를 사용하여 정규화된 서열 분포를 얻기 위해 혼합시켰고, VH 단편이 SfiI 및 Xhol 제한 효소로 분해시키고 그리고 상기 기재된 바와 같이 획득한 SfiI-Xhol cut PDV-VL 매개 라이브러리를 결찰시키는 하나의 VH 단편을 얻었다. 결찰 셋업, 정제방법, TG1의 이후의 변형 및 박테리아 획득을 20 변형 및 20 정사각형의 페트리접시가 사용된 것을 제외하고 VL 매개 라이브러리 (상기 참조)에 대해 필수적으로 기재되었다. 최종 라이브러리 (약 1x107 cfu)를 플라이머 세트 측면 주입된 VH-VL 영역을 사용하여 콜로니 PCR와의 주입 주파수를 위해 점검하였다. 90%의 콜로니는 정확한 길이 삽입을 나타내었다. 콜로니 PCR 제품을 이후의 DNA 서열 분석을 위해 사용하여 서열 변이를 점검하고 그리고 완전한 ORF를 나타내는 콜로니의 퍼센트를 측정하였다. 이것은 76%였다. 결과적으로 라이브러리를 CT 보조파지 (WP 02/103012 참조)를 사용하여 유지하고 증폭시키고 아래 기재된 바와 같은 방법을 선별 (panning)하여 파지 항체 선별을 위해 사용하였다.
실시예 2
인플루엔자 A형 및 인플루엔자 B형 헤마글루티닌에 대한 단일 연쇄 Fv 단편을 운반하는 파지의 선별
항체 단편을 상기 기재된 바와 같은 필수적으로 구성된 항체 파지 디스플레이 라이브러리 및 미국 특허 번호 6,265,150 및 WO98/15833 (두개가 본 명세서에 참고문헌으로 통합됨)에서 필수적으로 기재된 통상적인 파지 디스플레이 기술 및 MABSTRACT?? 기술을 사용하여 선별하였다. 또한 (본 명세서에 참고문헌으로 통합된) WO 02/103012에 기재된 방법 및 보조파지를 본 발명에서 사용하였다.
인플루엔자 A형 아형 H1 (A/New Caledonia/20/99), H3 (A/Wisconsin/67/2005), H4 (A/Duck/Hong Kong/24/1976), H5 (A/Chicken/Vietnam/28/2003), H7 (A/Netherlands/219/2003) 및 H9 (A/HongKong/1073/99)의 재조합 헤마글루티닌에 대해 선별하였다. HA 항원을 PBS (5.0 μg/ml)에서 희석하였고, MaxiSorpTM Nunc-Immuno Tubes (Nunc)을 첨가하였고 그리고 회전바퀴 위에서 4℃로 밤새 배양시켰다. 면역관을 비우고 그리고 블록 완충액 (PBS에서 2% 무지분유 (ELK))에서 3회 세척하였다. 이후에 면역관을 블록 완충액으로 완전히 채웠고 상온에서 1-2시간동안 배양시켰다. 파지 디스플레이 라이브러리의 부분표본 (CT 보조파지를 사용하여 증폭된 500-1000μl, 0.5x1013 - 1x1013 cfu)을 상온에서 1-2시간동안 10% 비-열 불활성화된 소태아혈청 및 2% 마우스 혈청으로 보충된 완충액을 차단하였다. 차단된 파지 라이브러리를 면역관에 첨가하고, 상온에서 2시간동안 배양시키고, 세척 완충액 (PBS에서 0.05% (v/v Tween-20)으로 세척하여 비결합된 파지를 제거한다. 결합된 파지를 상온에서 10분동안 100 mM 트리에틸아민 (TEA)의 1 ml와의 배양션에 의해 각각의 항원으로부터 용출시켰다. 이후에 용출된 파지를 1 M Tris-HCl pH 7.5의 0.5 ml와 혼합시켜 pH를 중화하였다. 혼합물을 약 0.3의 OD 600 nm에 37℃로 성장시킨 XL1-Blue 대장균 배양의 5 ml를 감염시키기 위해 사용하였다. 파지를 37℃에서 30분동안 XL1-Blue 박테리아를 감염시키도록 하였다. 이후에 혼합물을 상온에서 3000xg에서 10분동안 원심분리시키고 그리고 박테리아 펠렛을 0.5 ml 2-트립톤 이스트 추출 (2TY) 배지에서 재현탁시켰다. 획득한 박테리아 현탁액을 테트라시클린, 암피실린 및 글루코오스로 보충된 2가지 2TY 배양액 플레이트로 분배시켰다. 37℃에서 플레이트를 밤새 배양시킨 후, 콜로니를 De Kruif 등 (!995) 및 WO 02/103012에 의해 필수적으로 기재된 바와 같이 플레이트로부터 제거하고 그리고 농축된 파지 라이브러리를 제조하기 위해 사용하였다. 간략하게 제거된 박테리아를 ~0.3의 OD 600 nm로 37℃의 온도에서 암피실린, 테트라시클린 및 글루코오스를 함유하는 2TY 배지를 접종하기 위해 사용된다. CT 보조파지를 첨가하고 배지가 암피실린, 테트라시클린 및 카나마이신을 함유하는 2TY로 변화한 후에 박테리아를 감염시키도록 하였다. 배양을 30℃에서 밤새 지속하였다. 다음날 박테리아를 배지의 파지를 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)6000/NaCl을 사용하여 침전된 후에 원심분리에 의해 2TY 배지로부터 제거하였다. 결과적으로 파지를 1% 소혈청 알부민 (BSA)로 PBS의 2 ml을 용해시켰고, 여과-살균시켰고 그리고 다음 라운드의 선택을 위해 사용하였다. 2차 라운드의 선택을 동일한 HA 아형 및/또는 다른 아형의 HA 중 어느 하나로 수행하였다.
두가지 연속 라운드의 선택을 각각의 단일-연쇄 파지 항체의 분리 전에 수행하였다. 2차 라운드의 선택 후에, 각각의 대장균 콜로니를 모노클로날 파지 항체를 제조하기 위해 사용하였다. 필수적으로 각각의 콜로니를 파지 항체 제조가 밤새 진행되도록 한 후에 96 웰 플레이트 포맷에서 로그-파지로 성장시켰고 그리고 VCS-M13 보조파지로 감염시켰다. 파지플라스미드복합체를 서열 분석하였고 그리고 모든 독특한 파지플라스미드복합체를 추가 분석을 위해 사용하였다. 파지 항체를 함유하는 상청액을 HA 항원에 결합하는 ELISA에서 직접 사용하였다. 선택적으로 파지 항체를 두개의 elisa 및 흐름 세포분석법을 위해 PEG/NaCl-침전시키고 그리고 여과-살균하였다.
실시예 3
HA 특이적 단일-연쇄 파지 항체의 확인
상기 기재된 스크리닝에서 획득한 단일-연쇄 파지 항체를 함유하는 선택된 상청액을 특이성, 즉 다른 HA 항원에 결합하는 특이성에 대해 ELISA에서 확인하였다. 본 목적을 위해 재조합 H1 (A/New Caledonia/20/99), H3 (A/Wisconsin/67/2005), H5 (A/Vietnam/1203/04) H7 (A/Netherlands/219/2003), 및 B (B/Ohio/01/2005) HAs (Protein Sciences, CT, USA)을 MaxisorpTMELISA 플레이트로 코팅시켰다. 코팅 후에 플레이트를 상온에서 1시간동안 0.1% v/v Tween-20을 함유하는 PBS로 3회 세척하였고 그리고 3% BSA 또는 2% ELK를 함유하는 PBS에서 차단하였다. 선택된 단일-연쇄 파지 항체를 차단된 파지 항체를 얻기 위해 4% ELK를 함유하는 동일한 부피의 PBS에서 1시간동안 배양하였다. 플레이트를 비웠고, PBS/0.1% Tween-20으로 3회 세척하고 그리고 차단된 단일-연쇄 파지 항체를 벽에 부착하였다. 접종을 한시간동안 진행하도록 하였고, 플레이트를 PBS/0.1% Tween-20으로 세척하였고 그리고 결합된 파지 항체를 과산화물로 접합된 항-M13 항체를 사용하여 (OD 492 nm 측정을 사용하여) 검출하였다. 대조군으로서 단일-연쇄 파지 항체가 없이 그리고 관련되지 않은 음성 대조군 단일-연쇄 파지 항체로 방법을 동시에 수행하였다. 파지 라이브러리를 가지는 다른 HA 항원에 대한 선택으로부터, 인플루엔자 A형 H1, H3, H5, H7 및 인플루엔자 B형 HA에 특이적으로 결합하는 13 독특한 단일-연쇄 파지 항체를 얻었다 (SC09-003, SC09-004, SC09-005, SC09-006, SC09-007, SC09-008, SC09-009, SC09-010, SC09-011, SC09-030, SC09-112, SC09-113 및 SC09-114). 표 5 참조.
선택적으로 PEG/NaCl-침전된 그리고 여과-살균된 파지 항체를 FACS 분석에 의한 결합 및 특이성을 확인하기 위해 사용하였다. 본 목적을 위해, 총-길이의 재조합 인플루엔자 A형 아형 H1 (A/New 칼레도니아/20/1999), H3 (A/Wisonsin/67/2005) 및 H7 (A/Netherlands/219/2003) HAs를 PER.C6 세포의 표면 위에 발현하였다. 세포를 PBS+0.1%BSA와의 3회 세척 단계 이후에 1시간동안 단일-연쇄 파지 항체로 배양하였다. 파지 라이브러리를 가지는 다른 HA 항원에 대한 선택으로부터 인플루엔자 A형 아형 H1, H3 및 H7의 특이적으로 결합하는 14 단일-연쇄 파지 항체를 발견하였다 (SC09-003, SC09-004, SC09-005, SC09-006, SC09-007, SC09-008, SC09-009, SC09-010, SC09-011, SC09-012, SC09-030, SC09-112, SC09-113 및 SC09-114). 표 6 참조.
모든 16 파지 항체인, SC09-003, SC09-004, SC09-005, SC09-006, SC09-007, SC09-008, SC09-009, SC09-010, SC09-011, SC09-012, SC09-029, SC09-030, SC09-031, SC09-112, SC09-113 및 SC09-114를 완전한 인간 면역글로불린의 구성을 위해 사용하였다.
실시예 4
선택된 단일 연쇄 Fvs로부터 완전한 인간 면역글로불린 분자 (인간 모노클로날 항체)의 구성
선택된 특이적 단일-연쇄 파지 항체 (scFv) 클론 플라스미드로부터 DNA를 획득하고 그리고 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 표준 기술에 따라 측정하였다. scFv의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 IgG 발현 벡터 pIg-C911-HCgammal (SEQ ID 번호: 175 참조), pIG-C909-Ckappa (SEQ ID 번호: 176), 또는 pIg-C910-Clamba (SEQ ID 번호: 177)에서 발현을 위해 제한 분해에 의해 직접 클론하였다. scFv의 VH 및 VL 유전자 확인 (Tomlinson IM 등. V-BASE Sequence Directory. Cambridge United Kingdom: MRC Cetre for Protein Engineering (1997))를 측정하였다 (표 7 참조).
모든 구조물에 대한 뉴클레오티드 서열을 당업자에게 알려진 표준 기술에 따라 확인하였다. 인간 IgG1 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 생성된 발현 구조를 293T 세포에서 조합하여 일시적으로 발현시켰고 인간 IgG1 항체를 함유하는 상청액을 표준 정제 방법을 사용하여 획득하고 그리고 제조하였다.
선택된 면역글로불린 분자의 중쇄 및 경쇄의 CDR의 아미노산 서열은 표 7에 주어진다.
중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 아미노산 차이 및 % 확인의 수는 표 8에 주어진다.
실시예 5
IgG의 교차-결합 반응성
상기 기재된 5개의 IgG 항체 패널인, CR9005, CR9030, CR9112, CR9113 및 CR9114를 결합 특이성, 즉 다른 HA 항원에 대해 결합을 위해 ELISA에서 확인하였다. 본 목적을 위해, 재조합 H1 (A/New 칼레도니아/20/1999), H3 (A/Wisconsin/67/2005), H5 (A/Vietnam/1203/04), H7 (A/Netherlands/219/2003) 및 H9 (A/HongKong/1073/99) HA (Protein Scence, CT, 미국)으로 발현된 바큐로바이러스를 MaxisorpTM ELISA 플레이트로 코팅하였다. 코팅 후에 플레이트를 0.1% v/v Tween-20을 함유하는 PBS로 3회 세척하였고 그리고 상온에서 1시간동안 3% BSA 또는 2% ELK을 함유하는 PBS에서 차단하였다. 플레이트를 비운 후에, PBS/0.1% Tween-20으로 3회 세척하였고 그리고 IgG 항체를 벽에 결합시켰다. 배양을 1시간동안 진행하도록 하였고, 플레이트를 PBS/0.1% Tween-20으로 세척하였고 그리고 결합된 항체를 과산화물에 접합된 항-인간 IgG 항체를 사용하여 (OD 492nm 측정을 사용하여) 검출하였다. 대조군으로서, 관련되지 않은 IgG CR4098을 사용하였다.
CR9005, CR9030, CR9112, CR9113 및 CR9114은 시험된 모든 재조합 HA에 대하여 헤테로서브타입 교차-결합 활성을 가지는 것으로 나타났다. 표 9를 참조하라.
추가적으로 선택된 항체를 FACS 분석에 의해 헤테로서브타입 결합을 시험하기 위해 사용하였다. 본 목적을 위해, 전체-길이의 재조합 인플루엔자 A형 아형 H1 (A/New 칼레도니아/20/1999), H3 (A/Wisonsin/67/2005) 및 H7 (A/Netherlands/219/2003) HA를 PER.C6 세포의 표면 위에 발현시켰다. 세포를 1시간동안 IgG 항체로 배양시킨 후 PBS+0.1%BSA를 사용해 3회 세척단계를 거쳤다. 결합된 항체를 PE 접합된 항-인간 항체를 사용하여 검출하였다. 대조군으로서 감염되지 않은 PER.C6 세포를 사용하였다. CR9005, CR9030, CR9112, CR9113 및 CR9114는 인플루엔자 A형 아형 H1, H3 및 H7 HA 그러나 야생형 PER.C6 세포는 아닌 것에 대해 교차-결합 활성을 나타낸다. 표 9 참조하라.
실시예 6
IgG의 교차-중화활동
선택된 IgG가 다양한 인플루엔자 A형 균주를 차단할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 추가직인 인 비트로 바이러스 중화 분석 (VNA)을 수행하였다. VNA를 MDCK 세포 (ATCC CCL-34) 위에서 수행하였다. MDCK 세포를 MDCK 세포 배양 배지 (항체, 20 mM Hepes로 보충된 MEM 배지 및 10% (v/v) 소태아혈청으로 보충된 이탄산나트륨 (완전한 MEM 배지)에서 배양시켰다. H1 (A/WSN/33, A/New 칼레도니아/20/1999, A/Solomon Islands/IVR-145 (A/Solomon Islands/3/2006의 고-성장 재구분), A/Brisbane/59/2007, A/NYMC/X-181 (고성장 재구분의 A/California/07/2009), H2 (A/Env/MPU3156/05), H3 (A/Hong Kong/1/68, A/Johannesburg/33/94, A/Panama/2000/1999, A/Hiroshima/52/2005, A/Wisconsin/67/2005 and A/Brisbane/10/2007), H4 (A/WF/HK/MPA892/06), H5 (PR8-H5N1-HK97 (6:2 재구분의 A/Hong Kong/156/97 및 A/PR/8/34) 및 A/Eurasian Wigeon/MPF461/07), H6 (A/Eurasian Wigeon/MPD411/07), H7 (NIBRG-60 (6:2 재구분의 A/Mallard/Netherlands/12/2000) 및 PR8-H7N7-NY (7:1 재구분의 A/New York/107/2003 (H7N7) 및 A/PR/8/34)), H8 (A/Eurasian Wigeon/MPH571/08) H9 (A/Hong Kong/1073/99 및 A/Chick/HK/SSP176/09), H10 (A/Chick/Germany/N/49) 및 H14 (PR8-H14N5 (6:2 재구분의 A/mallard/Astrakhan/263/1982 (H14N5) 및 A/PR/8/34)) 분석에 사용되었던 균주는 Spearman 및 Karber의 방법에 따라 계산된 역가와 함께 5.7x103 TCID50/ml (ml당 50% 조직 배양 감염 투여)으로 희석하였다. IgG 제제 (200 μg/ml)를 4개의 웰의 완전한 MEM 배지에서 연속으로 2-폴드 (fold) 희석하였다 (1:2 - 1:512). 25 μl의 각각의 IgG 희석액을 25 μl의 바이러스 현탁액 (100 TCID50/25 μl로 혼합하였고 37℃에서 한시간동안 배양시켰다. 이후에 현탁액을 50 μl 완전한 MEM 배지에서 합류하는 MDCK 배양액을 함유하는 96-웰 플레이트 위에서 4번 이동하였다. 사용 전에 MDCK 세포를 세포가 합류지점으로 도달하고, 300-350 μl PBS, pH 7.4로 세척할 때까지 성장한 MDCK 세포 배양 배지에서 웰당 3x104에서 접종하였고 결과적으로 50 l의 완전한 MEM 배지를 각 웰에 첨가하였다. 비배양한 세포를 37℃에서 3-4일동안 배양하였고 그리고 세포병원성 효과 (CPE)의 개발을 위해 매일 관찰하였다. CPE를 양성 대조군과 비교하였다.
CR9005, CR9112, CR9113 및 CR9114는 모든 시험된 인플루엔자 A형 아형 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9 및 H10 바이러스의 대표 균주에 대한 헤테로서브타입 교차-중화활동을 나타낸다. 표 10을 참조하라.
실시예 7
팬-인플루엔자 항체는 HA의 전-융합 형태에 결합한다
선택된 IgG가 HA 분자의 전 또는 후-융합 형태에 결합할 수 있는지 여부 결정하기 위해, 인 비트로 pH-변화 실험을 수행하였다. 본 목적을 위해 총-길이의 재조합 인플루엔자 A형 아형 H1 (A/New Calendonia/20/99), H3 (A/Wilonsin/67/2005), H5 (A/Vietnam/1203/04), H7 (A/Netherlands/219/03) 및 H9 (A/HongKong/1073/99) HA을 PER.C6 세포의 표면 위에 발현시켰다. 다른 구조적 HA 형태에 결합하는 mAb을 측정하기 위해 세포를 PBS-EDTA를 사용하여 가소제 지지체로부터 분리시키고 이후에 RT에서 5분동안 트립신 (TrypLETMSelect, Gibco)으로 처리하고, 세척하였고 (PBS에서 1% BSA) 그리고 구연산-인산나트륨 완충액 (pH 4.9)에서 15분동안 배양하였다. 세포 샘플을 각 처리 단계 (비트립신화/HA0; 트립신화d/HA1-HA2; pH 4.9/융합 HA)후에 별도로 두었고 그리고 각 치료 단편을 1시간동안 mAb CR9114로 배양하였다. 이후에 세포를 1% BSA에서 피코에리트린-접합된 항-인간 IgG (Southern Biotech)을 사용하여 30분동안 배양하였다. 균주 세포를 FACS Diva 소프트웨어 (Becton Dickinson)를 가지는 FACS Canto를 사용하여 분석하였다.
발현된 표면으로 IgG1의 FACS 결합은 트립신 및 pH 완충된 배지로 순차적인 치료후에 이루어졌고 비치료된 HA (A)에 결합하는 퍼센티지로 표현된다. 도 1A 참조하라.
항체 CR9114는 HA 분자의 낮은 pH 유도된 형태 변화 전에서만 에피토프에만 존재하는 특이성을 나타내는 pH-변화후에 결합의 뚜렷한 감소를 나타낸다.
선택적으로 IgG가 HA의 낮은 pH 유도된 형태 변화를 차단하는지 여부 결정하기 위해 항체 CR9114를 낮은 pH 단계 전에 첨가하엿다. 연속적으로 치료한 샘플을 나누고 피코에리트린-접합된 항-인간 IgG (Southern Biotech) 중 하나로 염색하였다. 염색된 세포를 FACS Diva 소프트웨어 (Becton Dickinson)을 가지는 FACS Canto를 사용하여 분석하였다. 도 1B를 참조하라.
항체 CR9114는 이들 항체가 HA 분자에 결합될 경우, 낮은 pH 유도된 형태 변화가 발생하지 않는 것을 나타내는 pH-변화 후에 다양한 HA에 대한 높은 수준의 잔류 결합을 나타낸다.
실시예 8
다양한 인플루엔자 A 및 B HA에 대한 Fab의 친화성 측정
곤충 세포에서 바큐로바이러스 벡터를 사용하여 제조된 A/New Caledonia/20/1999 (H1), A/Brisbane/59/2007 (H1), A/Wisconsin/67/2005 (H3), A/Brisbane/10/2007 (H3, B/Florida/4/2006 (B), B/Brisbane/60/2008 (B) and B/Malaysia/2506/2004 (B)의 재조합형 가용성 HA를 Protein Sciences Corp (CT, 미국)으로부터 구매하였고 EZ-결합 설포-NHS-LC-LC-비오틴 (Pierce)을 사용하여 40분동안 상온에서 (RT) 비오틴을 부착하였다. PBS로의 완충액 교환 단계를 Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filter (Millipore)을 사용하여 수행하였다. 비오틴이 부착된 HA를 1200 초동안 37℃에서 Streptavidin 센서에 결합하였다. HA로의 CR9005, CR9112, CR9113 및 CR9114의 Fab 단편의 관련성을 1x 운동성 완충액 (ForteBio)에서 100 nM 항체로 센서를 노출시켜 37℃에서 700초동안 Octet QK (ForteBio)에서 측정하였다. Fab 단편의 분리를 37℃에서 9000 초동안 1x 운동성 완충액에 센서를 노출시켜 측정하였다. CR9005, CR9112, CR9113 및 CR9114의 Fab 단편은 H1, H3 및 인플루엔자 B HA에 대한 마이크로 내지 피코몰 친화성과 결합한다.
실시예 9
다른 줄기 결합 항체와의 결합을 위한 경쟁
곤충 세포에서 바큐로바이러스 벡터를 사용하여 제조된 A/New Caledonia/20/1999 (H1N1) 및 A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)의 재조합형 가용성 HA를 Protein Sciences Corp (CT, 미국)에서 구매하였고 그리고 EZ-결합 설포-NHS-LC-LC-비오틴 (Pierce)를 사용하여 40분동안 상온 (RT)에서 비오틴을 부착시켰다. PBS에 대한 완충액 교환 단계를 Amicon Ultra 0.5 ml의 원심분리 여과 (Millipore)을 사용하여 수행하였다. 비오틴이 부착된 HA를 1200초동안 37에서 Streptavidin 센서에 결합하였다. H1 HA에 대한 항체 CR9114 및 CR6261의 연관성을 추가 결합도를 37℃에서 700초동안 첫번째 항체 (100 nM)의 존재 하에 두번째 항체로 (1x 운동성 완충액에서 100 nM) 센서를 노출시켜 측정한 후에 1x 운동성 완충액 (ForteBio)으로 측정하였다. 대조군으로서, mAb CR9020, H1의 구형 헤드에 대한 결합을 하였다. H3 HA에 대한 항체 CR9114 및 CR8020의 연관성을 추가 결합도를 37℃에서 900초동안 첫번째 항체 (100 nM)의 존재 하에 두번째 항체 (1x 운동성 완충액에서 100 nM)로 센서를 노출시켜 축정한 후에 1x 운동성 완충액 (ForteBio)에서 100 nM 항체로 센서를 노충시켜 37℃에서 900초동안 Octet QK (ForteBio)에서 측정하였다. 대조군으로서 H3의 구형 헤드에 결합하는 mAb CR8057을 함께 수행하였다.
CR9114는 H1 HA를 CR6261과 결합 및 H3 HA를 CR8020과 결합하기 위해 경쟁한다. 그러므로 CR9114는 HA의 줄기-영역에서 CR6261 및 CR8020의 두가지 에피토프에 겹쳐지는 에피토프에 결합하기 쉽다 (도 2 참조).
실시예 10
치명적인 인플루엔자 B형 챌린지 (challenge) 인 비보 에 대한 인간 IgG 모노클로날 항체 CR9114의 예방활동
연구를 인플루엔자 B형 바이러스 인 비보와의 치명적인 챌린지에 대한 모노클로날 항체 CR9114의 예방효과를 시험하기 위해 수행하였다. MAb CR9114를 인플루엔자 B형/Florida/04/2006 바이러스 (Central Veterinary Institute (CVI), Lelystad, Netherlands)에 적용된 마우스를 가지는 마우스 치명적인 챌린지에서 예방효능을 위해 시험하였다. B/Florida/04/2006 바이러스를 5 폐 사이의 통과 후에 마우스에 적용하였다. 인플루엔자 B형 통과 5 바이러스가 적용된 마우스를 CVI의 실험실에서 부화된 닭의 달걀에서 번식시켰다. 모든 마우스 (Balb/c, 암컷, 6-8주의 나이, 그룹당 n=10)를 실험 시작 전에 4일 이상동안 적응시키고 유지시켰다. MAb CR9144를 마우스당 평균 18 중량 및 0.2 mL의 고정된 투여부피를 가정하면서 챌린지에 (vena coccygeus)-하루 전에 꼬리 혈관에서 정맥내로 15 mg/kg을 투여하였다. 대조군을 비히클 대조군으로 함께 투여하였다. 이후에 마우스를 자가 (intransal) 접종에 의해 25 LD50 B/Florida/04/2006 인플루엔자 B형 바이러스로 0일에 챌린지하였다. 임상 사인 및 체중을 8일까지 챌린지 1일전후로 매일 측정하였다. 임상 사인을 점수 시스템 (0=임상 사인 없음; 1=거친 코팅; 2=처리 동안에 거친 코트, 낮은 반응성; 3=처리 동안에 거친 코트, 롤업, 힘든 호흡, 낮은 반응성; 4= 조작/처리에 대한 거친 코팅, 롤업 힘든 호흡, 불활성 반응)으로 점수화하였다. 4점에서 동물을 안락사시켰다.
연구는 생체 내에서 인플루엔자 B형 바이러스에 대해 치사 챌린지 단일클론 항체 CR9114의 예방효과
모든 마우스는 적응기간동안 질병의 증상을 나타내지 않고 활동적이고 건강하게 보였다. 도 3A는 mAb 투여를 따르는 마우스의 생존비율을 나타낸다. 15 mg/kg mAb CR9114로 투여된 마우스는 대조군 mAb 50%가 생존한 반면 100%의 생존율을 나타냈다.
도 3B에서 mAb를 따르는 8일의 연구기간동안 마우스의 평균 체중변화가 나타난다. mAb CR9114 군에서 마우스는 비히클 대조군의 체중감소가 관찰된 반면 8일 이상의 연구 기간 동안 체중이 감소하지 않았다. 마우스의 중앙값의 임상 점수는 도 3C에 나타난다. 챌린지에-하루 전에 15 mg/kg mAb CR9114로 치료한 마우스들 중에서, 모든 마우스가 생존하였고 그리고 동물들 중에 관찰 기간 (감염 0일로부터 8일 후)동안 어느 임상 증상을 나타내는 동물은 없었다. 이들 결과는 본 명세서에 기재된 바와 같이 확인하고 개발한 인간 항 인플루엔자 항체 CR9114는 인플루엔자 B형 바이러스 인 비보의 치사량에 대한 보호를 제공할 수 있는 것을 나타낸다. 15 mg/kg 또는 그 이상의 투여량에서 감염 할 n전에 투여된 경우, mAb CR9114를 마우스에서 인플루엔자 B형 감염의 임상 증상을 완전히 예방할 수 있었다.
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서열
>sc09-003 VH DNA (SEQ ID 번호: 1)
gaggtgcagctggtggagtctggggctgaggtcaagaaggctgggtcctcggtgaaagtctcctgcaagtcttctggaggcacctccaacaactttggtatcagctgggtacgacaggcccctggccaaggccttgagtggatgggcgggatcagcccaatctttggttcgacagtctacgcacagaaatttcagggcagagtcactatttccgcggacatattttcacacactgcctacatggagatgaacagcctgacatctgaggacacggccgtctatttctgtgcgaggcacggaaattattatttctactccggtatggacctctggggccaagggaccacggtcacc
>sc09-003 VH PROTEIN (SEQ ID 번호: 2)
EVQLVESGAEVKKAGSSVKVSCKSSGGTSNNFGISWVRQAPGQGLEWMGGISPIFGSTVYAQKFQGRVTISADIFSHTAYMEMNSLTSEDTAVYFCARHGNYYFYSGMDLWGQGTTVT
>sc09-003 VL DNA (SEQ ID 번호: 3)
tcctatgtgctgactcagccaccctcggtgtcagtggccccaggacagacggccacgatttcctgtgggggagacaacgttggaagtaacagtgtgcactggtaccagcagaagccaggccaggcccctgtgctggtcgtctatgatgatcgcgaccgaccctcagggatccctgagcgattctctggctccaactctgggaacacggccaccctgaccatcagcagggtcgaagccggggatgaggccgactattactgtcaggtgtgggatagtagtagtgatcatcgagtcttcggaactgggaccaaggtcaccgtcctag
>sc09-003 VL PROTEIN (SEQ ID 번호: 4)
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>sc09-004 VH DNA (SEQ ID 번호: 5)
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>sc09-004 VH protein (SEQ ID 번호: 6)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKSSGGTSNNYAISWVRQAPGQGLDWMGGVSPIFGSTAYAQKFQGRVTISADIFSNTAYMELNSLTSEDTAVYYCARHGNYYYNSGMDVWGQGTTVT
>sc09-004 VL DNA (SEQ ID 번호: 7)
cagtctgtgctgacgcagccgcccgcagtgtctgggacccccgggcagagggtcaccatctcgtgttctggaagtgattccaacatcgggagaagaagtgtaaactggtaccagcagttcccaggaacggcccccaaactcctcatctatagtaacgatcagcggccctcagtggtccctgaccgattctctggctccaagtccggcacctcagcctccctggccatcagtgggctccagtctgaagatgaggccgaatattactgtgcagcatgggatgacagcctgaagggggctgtgttcggaggaggcacccagctgaccgtcctcg
>sc09-004 VL protein (SEQ ID 번호: 8)
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>sc09-005 VH DNA (SEQ ID 번호: 9)
caggtgcagctggtgcaatctggggctgaggtcaagaggcctgggtcctcggtgaaagtctcctgcaagtcttctggaggcacctccaataactatgctattagttgggtgcgacaggcccctggacaaggccttgactggatgggcgggatcagccctatctttggttcgacagtctacgcacagaaattccagggcagagtcactatttccgcggacatattttcgaacacagcctacatggagctgaacagcctgacatctgaggacacggccgtatatttctgtgcgaggcacgggaactattattactactccggtatggacctctggggccaagggaccacggtcacc
>sc09-005 VH Protein (SEQ ID 번호: 10)
QVQLVQSGAEVKRPGSSVKVSCKSSGGTSNNYAISWVRQAPGQGLDWMGGISPIFGSTVYAQKFQGRVTISADIFSNTAYMELNSLTSEDTAVYFCARHGNYYYYSGMDLWGQGTTVT
>sc09-005 Vl dna (SEQ ID 번호: 11)
cagtctgccctgactcagcctgcctccgtgtctgggtctcctggacagtcgatcaccatctcctgcactggaaccagcagtgacgtcggtggttataactatgtctcctggtaccaacaacacccaggcaaagcccccaaactcctgatttttgatgtcagtgatcggccctcaggggtttctgatcgcttctctggctccaagtctgcggacacggcctccctgaccatctctggactccaggctcaggacgaggctgattattactgctgctcatatgcaggtagtgccaagggcgtcttcggaactgggaccaaggtcaccgtcctag
>sc09-005 vL protein (SEQ ID 번호: 12)
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>sc09-006 VH DNA (SEQ ID 번호: 13)
gaggtgcagctggtggagtctggggctgaggtcaagaggcctgggtcctcggtgaaagtctcctgcaagtcttctggaggcacctccaataactatgctattagttgggtgcgacaggcccctggacaaggccttgactggatgggcgggatcagccctatctttggttcgacagtctacgcacagaaattccagggcagagtcactatttccgcggacatattttcgaacacagcctacatggagctgaacagcctgacatctgaggacacggccgtatatttctgtgcgaggcacgggaactattattactactccggtatggacctctggggccaagggaccacggtcacc
>sc09-006 VH PROTEIN (SEQ ID 번호: 14)
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>sc09-006 Vl DNA (SEQ ID 번호: 15)
tcctatgtgctgactcagccaccctcggtgtcagtggccccaggacagacggccaggattacctgtgggggaaacaacattggaagtaaaactgtgcattggtaccagcagaactcaggccaggcccctgtgctggtcgtctatggtgatagcgaccggccctcagggatccctgagcgattctctggctccaactctgggaccacggccaccctgaccatcagcagggtcgaagccggggatgaggccgactattactgtcaggtgtgggatagtagtagtgatcatcccggtgctgtgttcggaggaggcacccagctgaccgtcctcg
>sc09-006 Vl PROTEIN (SEQ ID 번호: 16)
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>sc09-007 VH DNA (SEQ ID 번호: 17)
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>sc09-007 VH PROTEIN (SEQ ID 번호: 18)
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>sc09-007 Vl DNA (SEQ ID 번호: 19)
tcctatgtgctgactcagccaccctcagcgtctgggacccccgggcagagggtcaccatctcttgttctggaagcagctccaacatcggaagtaatactgtaaactggtaccagcaggtccccggaacggcccccaaactcctcatctatggtgatgatcagcggccctcaggggtccctgaccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcagtgggctccagtctgaggatgaggctgattattactgtgcaacatgggatgacagcctgaatggtcatgtgttcggaggaggcacccagctgaccgtcctcg
>sc09-007 Vl PROTEIN (SEQ ID 번호: 20)
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>sc09-008 VH DNA (SEQ ID 번호: 21)
gaggtccagctggtgcagtctggggctgaggtcaagaagcctgggtcctcggtgagagtctcctgtaagtcttctggaggcacctccaataactatgctatcagctgggtgcgacaggcccctggacaaggccttgactggatgggcgggatcagccctatctttggttcgacagcctacgcacagaagttccagggcagagtcactatttccgcggacatattttcgaacacagcctacatggagctgaacagcctgacatctgaggacacggccgtatatttctgtgcgaggcacgggaattattattactactccggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcgagc
>sc09-008 VH PROTEIN (SEQ ID 번호: 22)
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>sc09-008 Vl DNA (SEQ ID 번호: 23)
tcctatgtgctgactcagccaccctcggtgtcagtggccccaggacagacggccaggattacctgtgggggaaacaacattggaagtaaaactgtgcattggtaccagcagaactcaggccaggcccctgtgctggtcgtctatggtgatagcgaccggccctcagggatccctgagcgattctctggctccaactctgggaccacggccaccctgaccatcagcagggtcgaagccggggatgaggccgactattactgtcaggtgtgggatagtagtagtgatcatcccggtgctgtgttcggaggaggcacccagctgaccgtcctcg
>sc09-008 Vl PROTEIN (SEQ ID 번호: 24)
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>sc09-009 VH DNA (SEQ ID 번호: 25)
caggtgcagctggtgcaatctggggctgaggtcaagaagcctgggtcctcggtgaaagtctcctgcaagtcttctggaggcacctccaataactatgctatcagctgggtgcgacaggcccctggacaaggccttgactggatgggcgggatcagccctatctttggttcgacagcctacgcacagaaattccagggcagagtcactatttccgcggacatattttcgaacacagcctacatggagctgaacagcctggcatctgaggacacggccgtatatttctgtgcgaggcacgggaattattattactactccggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcgagc
>sc09-009 VH PROTEIN (SEQ ID 번호: 26)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKSSGGTSNNYAISWVRQAPGQGLDWMGGISPIFGSTAYAQKFQGRVTISADIFSNTAYMELNSLASEDTAVYFCARHGNYYYYSGMDVWGQGTTVTVSS
>sc09-009 Vl DNA (SEQ ID 번호: 27)
gacatccagatgacccagtctccatcttccgtgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgtcgggcgagtcagcatattagcagttggttagcctggtatcagcagaagccagggaaaggccctcagctcctgatctattctgcatcccgtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttactattgtcaacaggctaacagtttccccctcactttcggccctgggaccaaagtggatatcaaac
>sc09-009 Vl PROTEIN (SEQ ID 번호: 28)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQHISSWLAWYQQKPGKGPQLLIYSASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPLTFGPGTKVDIK
>sc09-010 VH DNA (SEQ ID 번호: 29)
gaggtgcagctggtggagtccggggctgaggtcaagaagcctgggtcctcggtgaaagtctcctgcaagtcttctggaggcacctccaataattatgctatcagctgggtgcgacaggcccctggacaaggccttgactggatgggcgggatcagccctatctttggttcgacagcctacgcacagaagttccagggcagagtcactatttccgcggacatattttccaacacagcctacatggagctgaacagcctgacatctgaggacacggccgtatattactgtgcgaggcacgggaattattattactactccggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcgagc
>sc09-010 VH PROTEIN (SEQ ID 번호: 30)
EVQLVESGAEVKKPGSSVKVSCKSSGGTSNNYAISWVRQAPGQGLDWMGGISPIFGSTAYAQKFQGRVTISADIFSNTAYMELNSLTSEDTAVYYCARHGNYYYYSGMDVWGQGTTVTVSS
>sc09-010 VL DNA (SEQ ID 번호: 31)
tcctatgtgctgactcagccaccctcggtgtcagtggccccaggacagacggccaggattacctgtgggggaaacaacatyggaagtaaaactgtgcattggtaccagcagaactcaggccaggcccctgtgctggtcgtctttgttgatagcgaccgtccctcagggatccatgagcgattctgtggctccaactctgggtccacggccaccctgaccatcagcagcgtcgaagccggggatgaggccgactattactgtcaggtgtgggatagtaatagcgatcatcccggtgctgtgttcggaggaggcacccagctgaccgtcctcg
>sc09-010 VL PROTEIN (SEQ ID 번호: 32)
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>sc09-011 VH DNA (SEQ ID 번호: 33)
gaggtccagctggtacagtctggggctgaggtcaagaagcctgggtcctcggtgaaggtctcctgcaagtcttctggaggcacctccaataactatgctatcagctgggtgcggcaggcccctggacaaggccttgactggatgggagggatcagccctatctttggttcagcagcctacgcacagaagttccagggcagagtcactattaccgcggacatattttcgaacacagtgtacatggagctgaacagcctgacatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacacgggaattattattactactccggtacggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcgagc
>sc09-011 VH PROTEIN (SEQ ID 번호: 34)
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>sc09-011 VL DNA (SEQ ID 번호: 35)
tcctatgtgctgactcagccacccgcagtgtctgggacccccgggcagagggtcaccatctcgtgttctggaagtgattccaacatcgggagaagaagtgtaaactggtaccagcagttcccaggaacggcccccaaactcctcatctatagtaacgatcagcggccctcagtggtccctgaccgattctctggctccaagtccggcacctcagcctccctggccatcagtgggctccagtctgaagatgaggccgaatattactgtgcagcatgggatgacagcctgaagggggctgtgttcggaggaggcacccagctgaccgtcctcg
>sc09-011 VL PROTEIN (SEQ ID 번호: 36)
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>sc09-012 VH DNA (SEQ ID 번호: 37)
gaggtccagctggtacagtctggggctgaggtcaagaagcctgggtcctcggtgaaggtctcctgcaagtcttctggaggcacctccaataattatgctatcagctgggtgcgacaggcccctggacaaggccttgactggatgggagggatcagccctatttttggttcagcagtctacgcacagaagttccagggcagagtcactattaccgcggacatattttcgaacacagtgtacatggagctgaacagcctgacatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacacgggacttattattactactccggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcgagc
>sc09-012 VH PROTEIN (SEQ ID 번호: 38)
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>sc09-012 VL DNA (SEQ ID 번호: 39)
cagtctgtcgtgacgcagccgccctcagtgtctggggccccagggcagagggtcaccatctcctgcactgggagcagctccaacatcggggcaggttatgatgtacactggtaccagcagcttccagggacagcccccaaactcctcatctatggtaacaacaatcggccctcaggggtccctgaccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcactgggctccaggttgaggatgaggctgattattactgccagtcctatgaccagaacctgagtgagggggtcttcggcggagggaccaagctgaccgtcctag
>sc09-012 VL PROTEIN (SEQ ID 번호: 40)
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>sc09-029 VH DNA (SEQ ID 번호: 41)
gaggtgcagctggtggagtccggggctgaggtcaagaagcctgggtcctcggtgaaagtctcctgcaagtcttctggaggcacctccaataactatgctatcagctgggtgcgacaggcccctggacaaggccttgactggatgggcgggatcagccctatctttggttcgacagcctacgcacagaagttccagggcagagtcactatttccgcggacatattttcgaacacagcctacatggagctgaacagcctgacatctgaggacacggccgtatattactgtgcgaggcacgggaattattattactactccggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcgagc
>sc09-029 VH PROTEIN (SEQ ID 번호: 42)
EVQLVESGAEVKKPGSSVKVSCKSSGGTSNNYAISWVRQAPGQGLDWMGGISPIFGSTAYAQKFQGRVTISADIFSNTAYMELNSLTSEDTAVYYCARHGNYYYYSGMDVWGQGTTVTVSS
>sc09-029 VL DNA (SEQ ID 번호: 43)
gaaattgtgatgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctcctggggaaagaggcaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagctacttagcctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccaccagggccactggcatcccagacaggttcactggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggagcctgaagattttgcagtgtattactgtcagcagtatgggagctcaccattcgctttcggccctgggaccaaggtggagatcaaa
>sc09-029 VL PROTEIN (SEQ ID 번호: 44)
EIVMTQSPGTLSLSPGERGTLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPDRFTGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPFAFGPGTKVEIK
>sc09-030 VH DNA (SEQ ID 번호: 45)
cagatgcagctggtgcagtctggggctgaggtcaagaagcctgggtcctcggtgaaagtctcctgcaagtcttctggaggcacctccaataactatgctatcagctgggtgcgacaggcccctggacaaggccttgactggatgggcgggatcagccctatctttggttcgacagcctacgcacagaagttccagggcagagtcactatttccgcggacatattttcgaacacagcctacatggagctgaacagcctgacatctgaggacacggccgtatatttctgtgcgaggcacgggaattattattactactccggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcgagc
>sc09-030 VH PROTEIN (SEQ ID 번호: 46)
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tcctatgtgctgactcagccaccctcggtgtcagtggccccaggacagacggccaggattacctgtgggggaaacaacattggaagtaaaagtgtgcactggtaccagcagaagccaggccaggcccctgtgctggtcgtctatggtgatagcgaccggccctcagggatccctgagcgattctctggctccaactctgggaccacggccaccctgaccatcagcagggtcgaagccggggatgaggccgactattactgtcaggtgtgggatagtagtagtgatcatcccggtgctgtgttcggaggaggcacccagctgaccgtcctcg
>sc09-030 VL PROTEIN (SEQ ID 번호: 48)
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>sc09-031 VH DNA (SEQ ID 번호: 49)
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>sc09-112 VH PROTEIN (SEQ ID 번호: 54)
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>sc09-112 VL DNA (SEQ ID 번호: 55)
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>sc09-112 VL PROTEIN (SEQ ID 번호: 56)
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>sc09-113 VH DNA (SEQ ID 번호: 57)
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>sc09-113 VH PROTEIN (SEQ ID 번호: 58)
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>sc09-113 VL DNA (SEQ ID 번호: 59)
cagtctgtgctgactcagccacccgcagtgtctgggacccccgggcagagggtcaccatctcgtgttctggaagtgattccaacatcgggagaagaagtgtaaactggtaccagcagttcccaggaacggcccccaaactcctcatctatagtaacgatcagcggccctcagtggtccctgaccgattctctggctccaagtccggcacctcagcctccctggccatcagtgggctccaggctgaggatgaggctgattattactgtgcagcatgggatgccagcctgagtggtcctgtgttcggaggaggcacccagctgaccgtcctcg
>sc09-113 VL PROTEIN (SEQ ID 번호: 60)
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>sc09-114 VH DNA (SEQ ID 번호: 61)
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>sc09-114 VL DNA (SEQ ID 번호: 63)
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>sc09-114 VL PROTEIN (SEQ ID 번호: 64)
SYVLTQPPAVSGTPGQRVTISCSGSDSNIGRRSVNWYQQFPGTAPKLLIYSNDQRPSVVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEAEYYCAAWDDSLKGAVFGGGTQLTVL
Vector pIg-C911-HCgamma1 (SEQ ID 번호:175)
tcgacggatc gggagatctc ccgatcccct atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga 60
tgccgcatag ttaagccagt atctgctccc tgcttgtgtg ttggaggtcg ctgagtagtg 120
cgcgagcaaa atttaagcta caacaaggca aggcttgacc gacaattgca tgaagaatct 180
gcttagggtt aggcgttttg cgctgcttcg ctaggtggtc aatattggcc attagccata 240
ttattcattg gttatatagc ataaatcaat attggctatt ggccattgca tacgttgtat 300
ccatatcata atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa cattaccgcc atgttgacat 360
tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat 420
atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac 480
ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc 540
cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg 600
tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat 660
tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc 720
atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt 780
gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac 840
caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc 900
ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc 960
gcctggagac gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa gacaccggga ccgatccagc 1020
ctccgcggcc gggaacggtg cattggaagc tggcctggat atcctgactc tcttaggtag 1080
ccttgcagaa gttggtcgtg aggcactggg caggtaagta tcaaggttac aagacaggtt 1140
taaggagatc aatagaaact gggcttgtcg agacagagaa gactcttgcg tttctgatag 1200
gcacctattg gtcttactga catccacttt gcctttctct ccacaggtgt ccactcccag 1260
ttcaattaca gctcgccacc atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtactgctgc 1320
tggcccagcc ggccagtgac cttgaccggt gcaccacttt tgatgatgtt caagctccta 1380
attacactca acatacttca tctatgaggg gggtttacta tcctgatgaa atttttagat 1440
cggacactct ttatttaact caggatttat ttcttccatt ttattctaat gttacagggt 1500
ttcatactat taatcatacg tttggcaacc ctgtcatacc ttttaaggat ggtatttatt 1560
ttgctgccac agagaaatca aatgttgtcc gtggttgggt ttttggttct accatgaaca 1620
acaagtcaca gtcggtgatt attattaaca attctactaa tgttgttata cgagcatgta 1680
actttgaatt gtgtgacaac cctttctttg ctgtttctaa acccatgggt acacagacac 1740
atactatgat attcgataat gcatttaatt gcactttcga gtacatatct gatgcctttt 1800
cgcttgatgt ttcagaaaag tcaggtaatt ttaaacactt acgagagttt gtgtttaaaa 1860
ataaagatgg gtttctctat gtttataagg gctatcaacc tatagatgta gttcgtgatc 1920
taccttctgg ttttaacact ttgaaaccta tttttaagtt gcctcttggt attaacatta 1980
caaattttag agccattctt acagcctttt cacctgctca agacatttgg ggcacgtcag 2040
ctgcagccta ttttgttggc tatttaaagc caactacatt tatgctcaag tatgatgaaa 2100
atggtacaat cacagatgct gttgattgtt ctcaaaatcc acttgctgaa ctcaaatgct 2160
ctgttaagag ctttgagatt gacaaaggaa tttaccagac ctctaatttc agggttgttc 2220
cctcaggaga tgttgtgaga ttccctaata ttacaaactt gtgtcctttt ggagaggttt 2280
ttaatgctac taaattccct tctgtctatg catgggagag aaaaaaaatt tctaattgtg 2340
ttgctgatta ctctgtgctc tacaactcaa catttttttc aacctttaag tgctatggcg 2400
tttctgccac taagttgaat gatctttgct tctccaatgt ctatgcagat tcttttgtag 2460
tcaagggaga tgatgtaaga caaatagcgc caggacaaac tggtgttatt gctgattata 2520
attataaatt gccagatgat ttcatgggtt gtgtccttgc ttggaatact aggaacattg 2580
atgctacttc aactggtaat tataattata aatataggta tcttagacat ggcaagctta 2640
ggccctttga gagagacata tctaatgtgc ctttctcccc tgatggcaaa ccttgcaccc 2700
cacctgctct taattgttat tggccattaa atgattatgg tttttacacc actactggca 2760
ttggctacca accttacaga gttgtagtac tttcttttga acttttaaat gcaccggcca 2820
cggtttgtgg accaaaatta tccactgacc ttattaagaa ccagtgtgtc aattttaatt 2880
ttaatggact cactggtact ggtgtgttaa ctccttcttc aaagagattt caaccatttc 2940
aacaatttgg ccgtgatgtt tctgatttca ctgattccgt tcgagatcct aaaacatctg 3000
aaatattaga catttcacct tgctcttttg ggggtgtaag tgtaattaca cctggaacaa 3060
atgcttcatc tgaagttgct gttctatatc aagatgttaa ctgcactgat gtttctacag 3120
caattcatgc agatcaactc acaccagctt ggcgcatata ttctactgga aacaatgtat 3180
tccagactca ggcaggctgt cttataggag ctgagcatgt cgacacttct tatgagtgcg 3240
acattcctat tggagctggc atttgtgcta gttaccatac agtttcttta ttacgtagta 3300
ctagccaaaa atctattgtg gcttatacta tgtctttagg tgctgatagt tcaattgctt 3360
actctaataa caccattgct atacctacta acttttcaat tagcattact acagaagtaa 3420
tgcctgtttc tatggctaaa acctccgtag attgtaatat gtacatctgc ggagattcta 3480
ctgaatgtgc taatttgctt ctccaatatg gtagcttttg cacacaacta aatcgtgcac 3540
tctcaggtat tgctgctgaa caggatcgca acacacgtga agtgttcgct caagtcaaac 3600
aaatgtacaa aaccccaact ttgaaatatt ttggtggttt taatttttca caaatattac 3660
ctgaccctct aaagccaact aagaggtctt ttattgagga cttgctcttt aataaggtga 3720
cactcgctga tgctggcttc atgaagcaat atggcgaatg cctaggtgat attaatgcta 3780
gagatctcat ttgtgcgcag aagttcaatg gacttacagt gttgccacct ctgctcactg 3840
atgatatgat tgctgcctac actgctgctc tagttagtgg tactgccact gctggatgga 3900
catttggtgc tggcgctgct cttcaaatac cttttgctat gcaaatggca tataggttca 3960
atggcattgg agttacccaa aatgttctct atgagaacca aaaacaaatc gccaaccaat 4020
ttaacaaggc gattagtcaa attcaagaat cacttacaac aacatcaact gcattgggca 4080
agctgcaaga cgttgttaac cagaatgctc aagcattaaa cacacttgtt aaacaactta 4140
gctctaattt tggtgcaatt tcaagtgtgc taaatgatat cctttcgcga cttgataaag 4200
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ctaaaatgtc tgagtgtgtt cttggacaat caaaaagagt tgacttttgt ggaaagggct 4380
accaccttat gtccttccca caagcagccc cgcatggtgt tgtcttccta catgtcacgt 4440
atgtgccatc ccaggagagg aacttcacca cagcgccagc aatttgtcat gaaggcaaag 4500
catacttccc tcgtgaaggt gtttttgtgt ttaatggcac ttcttggttt attacacaga 4560
ggaacttctt ttctccacaa ataattacta cagacaatac atttgtctca ggaaattgtg 4620
atgtcgttat tggcatcatt aacaacacag tttatgatcc tctgcaacct gagcttgact 4680
cattcaaaga agagctggac aagtacttca aaaatcatac atcaccagat gttgattttg 4740
gcgacatttc aggcattaac gcttctgtcg tcaacattca aaaagaaatt gaccgcctca 4800
atgaggtcgc taaaaattta aatgaatcac tcattgacct tcaagaactg ggaaaatatg 4860
agcaatatat taaatggcct ctcgacgaac aaaaactcat ctcagaagag gatctgaatg 4920
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tggtgatctc agccatcctg gccctggtgg tgctcaccat catctccctt atcatcctca 5040
tcatgctttg gcagaagaag ccacgttagg cggccgctcg agtgctagca ccaagggccc 5100
cagcgtgttc cccctggccc ccagcagcaa gagcaccagc ggcggcacag ccgccctggg 5160
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gaccagcggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagc agcggcctgt acagcctgag 5280
cagcgtggtg accgtgccca gcagcagcct gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa 5340
ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa acgcgtggag cccaagagct gcgacaagac 5400
ccacacctgc cccccctgcc ctgcccccga gctgctgggc ggaccctccg tgttcctgtt 5460
cccccccaag cccaaggaca ccctcatgat cagccggacc cccgaggtga cctgcgtggt 5520
ggtggacgtg agccacgagg accccgaggt gaagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga 5580
ggtgcacaac gccaagacca agccccggga ggagcagtac aacagcacct accgggtggt 5640
gagcgtgctc accgtgctgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt 5700
gagcaacaag gccctgcctg cccccatcga gaagaccatc agcaaggcca agggccagcc 5760
ccgggagccc caggtgtaca ccctgccccc cagccgggag gagatgacca agaaccaggt 5820
gtccctcacc tgtctggtga agggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag 5880
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cttcttcctg tacagcaagc tcaccgtgga caagagccgg tggcagcagg gcaacgtgtt 6000
cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac acccagaaga gcctgagcct 6060
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aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag 6240
taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga 6300
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cagctggggc tctagggggt atccccacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg 6420
tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt 6480
cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg 6540
ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga 6600
ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac 6660
gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc 6720
tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct attggttaaa 6780
aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattaattc tgtggaatgt gtgtcagtta 6840
gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat 6900
tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc 6960
atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta 7020
actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac taattttttt tatttatgca 7080
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ggcctaggct tttgcaaaaa gctcccggga gcttgtatat ccattttcgg atctgatcaa 7200
gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg 7260
gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat cggctgctct 7320
gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac 7380
ctgtccggtg ccctgaatga actgcaggac gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg 7440
acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg 7500
ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa 7560
gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca 7620
ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt 7680
gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga actgttcgcc 7740
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ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg 7860
ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt 7920
ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag 7980
cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgag cgggactctg gggttcgaaa 8040
tgaccgacca agcgacgccc aacctgccat cacgagattt cgattccacc gccgccttct 8100
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gggatctcat gctggagttc ttcgcccacc ccaacttgtt tattgcagct tataatggtt 8220
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gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt ctgtataccg tcgacctcta 8340
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caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag 8460
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cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc 8580
gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 8640
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tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc 9660
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gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat 9900
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ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa 10080
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caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca 10380
tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat 10440
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aagtgccacc tgacg 10515
Vector pIg-C909-Ckappa (SEQ ID 번호:176)
tcgacggatc gggagatctc ccgatcccct atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga 60
tgccgcatag ttaagccagt atctgctccc tgcttgtgtg ttggaggtcg ctgagtagtg 120
cgcgagcaaa atttaagcta caacaaggca aggcttgacc gacaattgtt aattaacatg 180
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tagccatatt attcattggt tatatagcat aaatcaatat tggctattgg ccattgcata 300
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gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 480
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 540
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 600
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 660
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 720
tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 780
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Vector pIg-C910-Clambda (SEQ ID 번호:177)
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참고문헌
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SEQUENCE LISTING <110> Crucell Holland BV <120> Human binding molecules capable of neutralizing influenza A viruses of phylogenetic group 1 and phylogenetic group 2 and influenza B viruses <130> 0190 WO 00 ORD <140> PCT/EP2012/063637 <141> 2012-07-12 <150> EP11173953.8 <151> 2011-07-14 <150> US 61/572,417 <151> 2011-07-14 <160> 177 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SC09-003 VH DNA <400> 1 gaggtgcagc tggtggagtc tggggctgag gtcaagaagg ctgggtcctc ggtgaaagtc 60 tcctgcaagt cttctggagg cacctccaac aactttggta tcagctgggt acgacaggcc 120 cctggccaag gccttgagtg gatgggcggg atcagcccaa tctttggttc gacagtctac 180 gcacagaaat ttcagggcag agtcactatt tccgcggaca tattttcaca cactgcctac 240 atggagatga acagcctgac atctgaggac acggccgtct atttctgtgc gaggcacgga 300 aattattatt tctactccgg tatggacctc tggggccaag ggaccacggt cacc 354 <210> 2 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SC09-003 VH PROTEIN <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ala Gly 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ttattctaat gttacagggt 1500 ttcatactat taatcatacg tttggcaacc ctgtcatacc ttttaaggat ggtatttatt 1560 ttgctgccac agagaaatca aatgttgtcc gtggttgggt ttttggttct accatgaaca 1620 acaagtcaca gtcggtgatt attattaaca attctactaa tgttgttata cgagcatgta 1680 actttgaatt gtgtgacaac cctttctttg ctgtttctaa acccatgggt acacagacac 1740 atactatgat attcgataat gcatttaatt gcactttcga gtacatatct gatgcctttt 1800 cgcttgatgt ttcagaaaag tcaggtaatt ttaaacactt acgagagttt gtgtttaaaa 1860 ataaagatgg gtttctctat gtttataagg gctatcaacc tatagatgta gttcgtgatc 1920 taccttctgg ttttaacact ttgaaaccta tttttaagtt gcctcttggt attaacatta 1980 caaattttag agccattctt acagcctttt cacctgctca agacatttgg ggcacgtcag 2040 ctgcagccta ttttgttggc tatttaaagc caactacatt tatgctcaag tatgatgaaa 2100 atggtacaat cacagatgct gttgattgtt ctcaaaatcc acttgctgaa ctcaaatgct 2160 ctgttaagag ctttgagatt gacaaaggaa tttaccagac ctctaatttc agggttgttc 2220 cctcaggaga tgttgtgaga ttccctaata ttacaaactt gtgtcctttt ggagaggttt 2280 ttaatgctac taaattccct tctgtctatg catgggagag 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ttctactgga aacaatgtat 3180 tccagactca ggcaggctgt cttataggag ctgagcatgt cgacacttct tatgagtgcg 3240 acattcctat tggagctggc atttgtgcta gttaccatac agtttcttta ttacgtagta 3300 ctagccaaaa atctattgtg gcttatacta tgtctttagg tgctgatagt tcaattgctt 3360 actctaataa caccattgct atacctacta acttttcaat tagcattact acagaagtaa 3420 tgcctgtttc tatggctaaa acctccgtag attgtaatat gtacatctgc ggagattcta 3480 ctgaatgtgc taatttgctt ctccaatatg gtagcttttg cacacaacta aatcgtgcac 3540 tctcaggtat tgctgctgaa caggatcgca acacacgtga agtgttcgct caagtcaaac 3600 aaatgtacaa aaccccaact ttgaaatatt ttggtggttt taatttttca caaatattac 3660 ctgaccctct aaagccaact aagaggtctt ttattgagga cttgctcttt aataaggtga 3720 cactcgctga tgctggcttc atgaagcaat atggcgaatg cctaggtgat attaatgcta 3780 gagatctcat ttgtgcgcag aagttcaatg gacttacagt gttgccacct ctgctcactg 3840 atgatatgat tgctgcctac actgctgctc tagttagtgg tactgccact gctggatgga 3900 catttggtgc tggcgctgct cttcaaatac cttttgctat gcaaatggca tataggttca 3960 atggcattgg agttacccaa aatgttctct atgagaacca aaaacaaatc gccaaccaat 4020 ttaacaaggc gattagtcaa attcaagaat cacttacaac aacatcaact gcattgggca 4080 agctgcaaga cgttgttaac cagaatgctc aagcattaaa cacacttgtt aaacaactta 4140 gctctaattt tggtgcaatt tcaagtgtgc taaatgatat cctttcgcga cttgataaag 4200 tcgaggcgga ggtacaaatt gacaggttaa ttacaggcag acttcaaagc cttcaaacct 4260 atgtaacaca acaactaatc agggctgctg aaatcagggc ttctgctaat cttgctgcta 4320 ctaaaatgtc tgagtgtgtt cttggacaat caaaaagagt tgacttttgt ggaaagggct 4380 accaccttat gtccttccca caagcagccc cgcatggtgt tgtcttccta catgtcacgt 4440 atgtgccatc ccaggagagg aacttcacca cagcgccagc aatttgtcat gaaggcaaag 4500 catacttccc tcgtgaaggt gtttttgtgt ttaatggcac ttcttggttt attacacaga 4560 ggaacttctt ttctccacaa ataattacta cagacaatac atttgtctca ggaaattgtg 4620 atgtcgttat tggcatcatt aacaacacag tttatgatcc tctgcaacct gagcttgact 4680 cattcaaaga agagctggac aagtacttca aaaatcatac atcaccagat gttgattttg 4740 gcgacatttc aggcattaac gcttctgtcg tcaacattca aaaagaaatt gaccgcctca 4800 atgaggtcgc taaaaattta aatgaatcac tcattgacct tcaagaactg ggaaaatatg 4860 agcaatatat taaatggcct ctcgacgaac aaaaactcat ctcagaagag gatctgaatg 4920 ctgtgggcca ggacacgcag gaggtcatcg tggtgccaca ctccttgccc tttaaggtgg 4980 tggtgatctc agccatcctg gccctggtgg tgctcaccat catctccctt atcatcctca 5040 tcatgctttg gcagaagaag ccacgttagg cggccgctcg agtgctagca ccaagggccc 5100 cagcgtgttc cccctggccc ccagcagcaa gagcaccagc ggcggcacag ccgccctggg 5160 ctgcctggtg aaggactact tccccgagcc cgtgaccgtg agctggaaca gcggcgcctt 5220 gaccagcggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagc agcggcctgt acagcctgag 5280 cagcgtggtg accgtgccca gcagcagcct gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa 5340 ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa acgcgtggag cccaagagct gcgacaagac 5400 ccacacctgc cccccctgcc ctgcccccga gctgctgggc ggaccctccg tgttcctgtt 5460 cccccccaag cccaaggaca ccctcatgat cagccggacc cccgaggtga cctgcgtggt 5520 ggtggacgtg agccacgagg accccgaggt gaagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga 5580 ggtgcacaac gccaagacca agccccggga ggagcagtac aacagcacct accgggtggt 5640 gagcgtgctc accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 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ccccgtcaag ctctaaatcg 6540 ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga 6600 ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac 6660 gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc 6720 tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct attggttaaa 6780 aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattaattc tgtggaatgt gtgtcagtta 6840 gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat 6900 tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc 6960 atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta 7020 actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac taattttttt tatttatgca 7080 gaggccgagg ccgcctctgc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga 7140 ggcctaggct tttgcaaaaa gctcccggga gcttgtatat ccattttcgg atctgatcaa 7200 gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg 7260 gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat cggctgctct 7320 gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg 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gcctgaccgt 2220 gcccttcggc cagaagccca acatcgacgt gaccgacgcc atggtggacc aggcctggga 2280 cgcccagcgg atcttcaagg aggccgagaa gttcttcgtg agcgtgggcc tgcccaacat 2340 gacccagggc ttttgggaga acagcatgct gaccgacccc ggcaatgtgc agaaggccgt 2400 gtgccacccc accgcctggg acctgggcaa gggcgacttc cggatcctga tgtgcaccaa 2460 agtgaccatg gacgacttcc tgaccgccca ccacgagatg ggccacatcc agtacgacat 2520 ggcctacgcc gcccagccct tcctgctgcg gaacggcgcc aacgagggct ttcacgaggc 2580 cgtgggcgag atcatgagcc tgagcgccgc cacccccaag cacctgaaga gcatcggcct 2640 gctgagcccc gacttccagg aggacaacga gaccgagatc aacttcctgc tgaagcaggc 2700 cctgaccatc gtgggcaccc tgcccttcac ctacatgctg gagaagtggc ggtggatggt 2760 gtttaagggc gagatcccca aggaccagtg gatgaagaag tggtgggaga tgaagcggga 2820 gatcgtgggc gtggtggagc ccgtgcccca cgacgagacc tactgcgacc ccgccagcct 2880 gttccacgtg agcaacgact actccttcat ccggtactac acccggaccc tgtaccagtt 2940 ccagttccag gaggccctgt gccaggccgc caagcacgag ggccccctgc acaagtgcga 3000 catcagcaac agcaccgagg ccggacagaa actgttcaac atgctgcggc tgggcaagag 3060 cgagccctgg accctggccc tggagaatgt ggtgggcgcc aagaacatga atgtgcgccc 3120 cctgctgaac tacttcgagc ccctgttcac ctggctgaag gaccagaaca agaacagctt 3180 cgtgggctgg agcaccgact ggagccccta cgccgaccag agcatcaaag tgcggatcag 3240 cctgaagagc gccctgggcg acaaggccta cgagtggaac gacaacgaga tgtacctgtt 3300 ccggagcagc gtggcctatg ccatgcggca gtacttcctg aaagtgaaga accagatgat 3360 cctgttcggc gaggaggacg tgagagtggc caacctgaag ccccggatca gcttcaactt 3420 cttcgtgacc gcccccaaga acgtgagcga catcatcccc cggaccgaag tggagaaggc 3480 catccggatg agccggagcc ggatcaacga cgccttccgg ctgaacgaca actccctgga 3540 gttcctgggc atccagccca ccctgggccc tcccaaccag ccccccgtga gcatctggct 3600 gatcgtgttt ggcgtggtga tgggcgtgat cgtggtggga atcgtgatcc tgatcttcac 3660 cggcatccgg gaccggaaga agaagaacaa ggcccggagc ggcgagaacc cctacgccag 3720 catcgatatc agcaagggcg agaacaaccc cggcttccag aacaccgacg acgtgcagac 3780 cagcttctga taatctagaa cgagctcgaa ttcgaagctt ctgcagacgc gtcgacgtca 3840 tatggatccg atatcgccgt ggcggccgca ggccagccca aggccgctcc cagcgtgacc 3900 ctgttccccc cctcctccga ggagctgcag gccaacaagg ccaccctggt gtgcctcatc 3960 agcgacttct accctggcgc cgtgaccgtg gcctggaagg ccgacagcag ccccgtgaag 4020 gccggcgtgg agaccaccac ccccagcaag cagagcaaca acaagtacgc cgccagcagc 4080 tacctgagcc tcacccccga gcagtggaag agccaccgga gctacagctg ccaggtgacc 4140 cacgagggca gcaccgtgga gaagaccgtg gcccccaccg agtgcagcta atagacttaa 4200 gtttaaaccg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc 4260 cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa 4320 atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg 4380 ggcaggacag caagggggag gattgggaag acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg 4440 gctctatggc ttctgaggcg gaaagaacca gctggggctc tagggggtat ccccacgcgc 4500 cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac 4560 ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg 4620 ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt 4680 tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc 4740 cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct 4800 tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga 4860 ttttggccat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga 4920 attaattctg tggaatgtgt gtcagttagg gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg 4980 cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc aggtgtggaa agtccccagg 5040 ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc 5100 gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca 5160 tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctctgcct ctgagctatt 5220 ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt tgcaaaaagc tcccgggagc 5280 ttgtatatcc attttcggat ctgatcagca cgtgatgaaa aagcctgaac tcaccgcgac 5340 gtctgtcgag aagtttctga tcgaaaagtt cgacagcgtc tccgacctga tgcagctctc 5400 ggagggcgaa gaatctcgtg ctttcagctt cgatgtagga gggcgtggat atgtcctgcg 5460 ggtaaatagc tgcgccgatg gtttctacaa agatcgttat gtttatcggc actttgcatc 5520 ggccgcgctc ccgattccgg aagtgcttga cattggggaa ttcagcgaga gcctgaccta 5580 ttgcatctcc cgccgtgcac agggtgtcac gttgcaagac ctgcctgaaa ccgaactgcc 5640 cgctgttctg cagccggtcg cggaggccat ggatgcgatc gctgcggccg atcttagcca 5700 gacgagcggg ttcggcccat tcggaccgca aggaatcggt caatacacta catggcgtga 5760 tttcatatgc gcgattgctg atccccatgt gtatcactgg caaactgtga tggacgacac 5820 cgtcagtgcg tccgtcgcgc aggctctcga tgagctgatg ctttgggccg aggactgccc 5880 cgaagtccgg cacctcgtgc acgcggattt cggctccaac aatgtcctga cggacaatgg 5940 ccgcataaca gcggtcattg actggagcga ggcgatgttc ggggattccc aatacgaggt 6000 cgccaacatc ttcttctgga ggccgtggtt ggcttgtatg gagcagcaga cgcgctactt 6060 cgagcggagg catccggagc ttgcaggatc gccgcggctc cgggcgtata tgctccgcat 6120 tggtcttgac caactctatc agagcttggt tgacggcaat ttcgatgatg cagcttgggc 6180 gcagggtcga tgcgacgcaa tcgtccgatc cggagccggg actgtcgggc gtacacaaat 6240 cgcccgcaga agcgcggccg tctggaccga tggctgtgta gaagtactcg ccgatagtgg 6300 aaaccgacgc cccagcactc gtccgagggc aaaggaatag cacgtgctac gagatttcga 6360 ttccaccgcc gccttctatg aaaggttggg cttcggaatc gttttccggg acgccggctg 6420 gatgatcctc cagcgcgggg atctcatgct ggagttcttc gcccacccca acttgtttat 6480 tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt 6540 tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg 6600 tataccgtcg acctctagct agagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg 6660 aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc 6720 ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt 6780 ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg 6840 cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt 6900 tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc 6960 aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa 7020 aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa 7080 tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc 7140 ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc 7200 cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag 7260 ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga 7320 ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc 7380 gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac 7440 agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg 7500 cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca 7560 aaccaccgct ggtagcggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 7620 atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 7680 acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 7740 ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta 7800 ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt 7860 tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag 7920 tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca 7980 gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc 8040 tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt 8100 tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag 8160 ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt 8220 tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat 8280 ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt 8340 gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc 8400 ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat 8460 cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag 8520 ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt 8580 ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg 8640 gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta 8700 ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc 8760 gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cg 8792

Claims (11)

  1. 계통발생군 1의 인플루엔자 A형 바이러스 아형 및 계통발생군 2의 아형의 인플루엔자 A형 바이러스 아형의 헤마글루티닌 단백질 (HA)의 줄기 영역 (stem region)에서 에피토프 (epitope)에 특이적으로 결합할 수 있고 그리고 계통발생군 1 및 계통발생군 2의 인플루엔자 A형 바이러스 아형을 중화시킬 수 있는 분리된 결합분자로, 상기 결합분자는 또한 인플루엔자 B형 바이러스 아형의 헤마글루티닌 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 분리된 결합분자.
  2. 제 1항에 있어서, 결합분자는 인플루엔자 B형 바이러스 아형을 중화시킬 수 있는 결합분자.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 결합분자는 H1, H2, H5, H6, H8, H9 및 H11 아형 중의 HA를 포함하는 인플루엔자 A형 바이러스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 군 1 인플루엔자 A형 바이러스 아형, 및 H3, H4, H7, 및 H10 아형 중의 HA를 포함하는 인플루엔자 A형 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 군 2 인플루엔자 A형 바이러스 아형, 및 하나 이상의 인플루엔자 B형 바이러스 아형을 중화시킬 수 있는 결합분자.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 결합분자는 적혈구응집 억제 활성을 가지지 않는 결합분자.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 결합분자는 SEQ ID 번호: 133 또는 SEQ ID 번호: 139의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, SEQ ID 번호: 134, SEQ ID 번호: 140 또는 SEQ ID 번호: 151의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 SEQ ID 번호: 135, SEQ ID 번호: 141, SEQ ID 번호: 145, SEQ ID 번호: 152, SEQ ID 번호: 161, 및 SEQ ID 번호: 162로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 결합분자.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 결합분자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합분자:
    a) SEQ ID 번호: 133의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호: 134의 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호: 135의 중쇄 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
    b) SEQ ID 번호: 139의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호: 140의 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호: 141 중쇄 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
    c) SEQ ID 번호: 139의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호: 134의 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호: 145의 중쇄 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
    d) SEQ ID 번호: 139의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호: 151의 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호: 152의 중쇄 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
    e) SEQ ID 번호: 139의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호: 134의 중쇄 CDR2 영역, SEQ ID 번호: 152의 중쇄 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
    f) SEQ ID 번호: 139의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호: 151의 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호: 161의 중쇄 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
    g) SEQ ID 번호: 139의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호: 151의 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호: 162의 중쇄 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
    h) SEQ ID 번호: 139의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호: 134의 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호: 141의 중쇄 CDR3 영역을 포함하는 결합분자.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 결합분자는 SEQ ID 번호: 139의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID 번호: 134의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 영역, 및 SEQ ID 번호:145 또는 SEQ ID 번호:152의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 영역을 포함하는 결합분자.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합분자는 인간 모노클로날 항체, 또는 그의 항원-결합 단편인 결합분자.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 따른 결합분자를 인코딩하는 핵산분자.
  10. 약제로서의 용도 그리고 바람직하기는 인플루엔자 감염의 진단적, 치료학적 및/또는 예방적 치료를 위한 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 따른 결합분자, 및/또는 제 9항에 따른 핵산분자.
  11. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 따른 결합분자, 및/또는 제 9항에 따른 핵산분자, 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.


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