KR20140091695A - 포스포이노시티드 3-키나제 억제제와 야누스 키나제 2-신호 전달자 및 전사 활성화제 5 경로의 조절제의 조합물 - Google Patents

포스포이노시티드 3-키나제 억제제와 야누스 키나제 2-신호 전달자 및 전사 활성화제 5 경로의 조절제의 조합물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 증식성 질환, 특히 고형 종양 질환의 치료를 위한, (a) 포스포이노시티드 3-키나제 억제제 화합물 및 (b) JAK2-STAT5 경로를 조절하는 화합물을 포함하는 제약 조합물; 상기 조합물을 포함하는 제약 조성물; 증식성 질환 치료용 의약의 제조를 위한 상기 조합물의 용도; 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한 조합 제제로서 상기 조합물을 포함하는 상업용 패키지 또는 제품; 및 온혈 동물, 특히 인간의 치료 방법에 관한 것이다.

Description

포스포이노시티드 3-키나제 억제제와 야누스 키나제 2-신호 전달자 및 전사 활성화제 5 경로의 조절제의 조합물 {COMBINATION OF A PHOSPHOINOSITIDE 3-KINASE INHIBITOR AND A MODULATOR OF THE JANUS KINASE 2-SIGNAL TRANSDUCER AND ACTIVATOR OF TRANSCRIPTION 5 PATHWAY}
본 발명은 구체적으로 증식성 질환, 특히 PI3K/Akt 경로에 동시 조절이상이 있는 증식성 질환의 치료에 있어서 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한, (a) 포스포이노시티드 3-키나제 (PI3K) 억제제 화합물 및 (b) 야누스 키나제 2 (JAK2)-신호 전달자 및 전사 활성화제 5 (STAT5) 경로를 조절하는 화합물, 및 임의로 1종 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조합물; 상기 조합물을 포함하는 제약 조성물; 증식성 질환 치료용 의약의 제조를 위한 상기 조합물의 용도; 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한 조합 제제로서 상기 조합물을 포함하는 상업용 패키지 또는 제품; 및 온혈 동물, 특히 인간의 치료 방법에 관한 것이다.
핵심 신호전달 경로 (예컨대 PI3K/mTOR)를 표적으로 하는 고도로 특이적인 억제제들의 빠른 발전은 암 연구 분야에 커다란 흥미를 불러 일으켰다. 이러한 합리적으로 설계된 요법들 중 일부의 임상적 효능 및 낮은 독성은 암 치료의 새로운 시대에 대한 희망을 야기하였다. 불행하게도, 암을 표적으로 하는 단일-작용제 요법은 종종 적응성 내성, 종양 재발 및 불가피한 쇠퇴 과정에 의해 방해를 받는다. 종양원성 신호전달 경로들 사이에서의 혼신에 대해 더 잘 이해하는 것은 표적화된 요법에 대한 내성을 억제함으로써 반드시 새롭고 희망적으로 치유되는 조합 요법으로 이어지기 위한 기본이 된다. 다양한 정상 세포 기능의 중추적인 조절인자인 포스파티딜이노시톨 3-키나제 (PI3K) 경로는 종종 신생물 형질전환시 교란된다. 암에서의 PI3K 경로의 활성화 메카니즘에는 하기가 포함된다: 키나제의 알파 촉매 서브유닛 p110α를 코딩하는 유전자인 PIK3CA의 돌연변이 및/또는 증폭; PI3K 활성을 되돌리는 포스파타제인 PTEN의 발현 상실; 종양원성 수용체 티로신 키나제의 하류 활성화; 및 Akt 증폭. 세포 사멸을 감소시키고 세포 증식, 이동, 침습, 대사, 혈관신생 및 화학요법에 대한 내성을 증가시키는 것에 의해, 이상 PI3K 경로는 경쟁상 이점을 가지는 암 세포를 제공한다. 당연히, PI3K/Akt/mTOR 캐스케이드는 매력적인 치료 표적으로써, 이 경로의 몇 가지 억제제들이 현재 임상 시험 중에 있다.
몇 가지 세포주 및 삼중-음성 유방암의 일차 종양 모델을 사용하여, 본 발명자들은 전이에 결정적인 역할을 하는 화학주성 시토카인인 IL-8의 분비를 유도하는 JAK2-STAT5 신호전달을 활성화하는 것에 의해, PI3K/mTOR 억제가 악성인 양성 피드백 루프(feedback loop)를 도출한다는 것을 발견하였다. IL-8은 다시 JAK2/STAT5로 피드백됨으로써 루프를 완성한다. 특히, 유도성 JAK2 shRNA 및 JAK2 억제제는 이와 같은 피드백을 종식시킴으로써, 종양 시딩(seeding) 및 전이를 감소시켰다.
PI3K/mTOR 억제에 대한 역학적 이해로부터 수득된 식견을 바탕으로, 본 발명자들은 PI3K/mTOR 및 JAK2-STAT5 경로의 조합된 억제의 치료 효능을 입증하였다. 실제로 PI3K/mTOR 및 JAK2-STAT5의 조합된 억제는 종양 성장 및 시딩은 물론 전이도 감소시켰다.
WO2006/122806호는 PI3-키나제와 같은 지질 키나제의 활성을 억제하는 것으로 기술되어 있는 이미다조퀴놀린 유도체에 대해 기술하고 있다. 본 발명에 적합한 구체적인 이미다조퀴놀린 유도체, 그의 제조 및 그를 함유하는 적합한 제약 제제가 WO2006/122806호에 기술되어 있는데, 거기에는 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 호변이성질체, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 용매화물이 포함된다:
<화학식 I>
Figure pct00001
상기 식에서,
R1은 나프틸 또는 페닐이고 (여기서 상기 페닐은 할로겐; 치환되지 않거나 할로겐, 시아노, 이미다졸릴 또는 트리아졸릴에 의해 치환된 저급 알킬; 시클로알킬; 저급 알킬, 저급 알킬 술포닐, 저급 알콕시 및 저급 알콕시 저급 알킬아미노로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되는 1개 또는 2개의 치환기에 의해 치환된 아미노; 치환되지 않거나 저급 알킬 및 저급 알킬 술포닐로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되는 1개 또는 2개의 치환기에 의해 치환된 피레라지닐; 2-옥소-피롤리디닐; 저급 알콕시 저급 알킬; 이미다졸릴; 피라졸릴; 및 트리아졸릴로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되는 1개 또는 2개의 치환기에 의해 치환됨);
R2는 O 또는 S이고;
R3은 저급 알킬이고;
R4는 치환되지 않거나 할로겐, 시아노, 저급 알킬, 저급 알콕시 또는 치환되지 않거나 저급 알킬에 의해 치환된 피페라지닐에 의해 치환된 피리딜; 치환되지 않거나 저급 알콕시에 의해 치환된 피리미디닐; 치환되지 않거나 할로겐에 의해 치환된 퀴놀리닐; 퀴녹살리닐; 또는 알콕시에 의해 치환된 페닐이고;
R5는 수소 또는 할로겐이고;
n은 0 또는 1이고;
R6은 옥시도이고;
단, n=1인 경우, 라디칼 R6을 보유하는 N-원자는 양의 전하를 가지고;
R7은 수소 또는 아미노이다.
화학식 I 화합물의 정의에서 사용될 때의 라디칼 및 기호들은 WO2006/122806호에서 개시된 것과 같은 의미를 가지며, 상기 공보는 본 출원에 참조로 포함된다.
본 발명의 화합물은 WO2006/122806호에 구체적으로 기술되어 있는 화합물이다. 본 발명의 화합물은 2-메틸-2-[4-(3-메틸-2-옥소-8-퀴놀린-3-일-2,3-디히드로-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일)-페닐]-프로피오니트릴 및 그의 모노토실레이트염 (BEZ-235로도 알려져 있는 화합물 A)이다. 2-메틸-2-[4-(3-메틸-2-옥소-8-퀴놀린-3-일-2,3-디히드로-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일)-페닐]-프로피오니트릴의 합성에 대해서는 예를 들어 WO2006/122806호에 실시예 7로 기술되어 있다. 본 발명의 또 다른 화합물은 8-(6-메톡시-피리딘-3-일)-3-메틸-1-(4-피페라진-1-일-3-트리플루오로메틸-페닐)-1,3-디히드로-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2-온 (화합물 B)이다. 8-(6-메톡시-피리딘-3-일)-3-메틸-1-(4-피페라진-1-일-3-트리플루오로메틸-페닐)-1,3-디히드로-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2-온의 합성에 대해서는 예를 들어 WO2006/122806호에 실시예 86으로 기술되어 있다.
WO07/084786호는 PI3-키나제와 같은 지질 키나제의 활성을 억제하는 것으로 밝혀져 있는 피리미딘 유도체에 대해 기술하고 있다. 본 발명에 적합한 구체적인 피리미딘 유도체, 그의 제조 및 그를 함유하는 적합한 제약 제제가 WO07/084786호에 기술되어 있는데, 거기에는 하기 화학식 II의 화합물, 또는 그의 입체이성질체, 호변이성질체, 또는 제약상 허용되는 염이 포함된다:
<화학식 II>
Figure pct00002
상기 식에서,
W는 CRW 또는 N이고, 여기서 RW는 하기로 이루어진 군에서 선택되고:
(1) 수소,
(2) 시아노,
(3) 할로겐,
(4) 메틸,
(5) 트리플루오로메틸,
(6) 술폰아미도;
R1은 하기로 이루어진 군에서 선택되고:
(1) 수소,
(2) 시아노,
(3) 니트로,
(4) 할로겐,
(5) 치환 및 비치환 알킬,
(6) 치환 및 비치환 알케닐,
(7) 치환 및 비치환 알키닐,
(8) 치환 및 비치환 아릴,
(9) 치환 및 비치환 헤테로아릴,
(10) 치환 및 비치환 헤테로시클릴,
(11) 치환 및 비치환 시클로알킬,
(12) -COR1a,
(13) -CO2R1a,
(14) -CONR1aR1b,
(15) -NR1aR1b,
(16) -NR1aCOR1b,
(17) -NR1aSO2R1b,
(18) -OCOR1a,
(19) -OR1a,
(20) -SR1a,
(21) -SOR1a,
(22) -SO2R1a, 및
(23) -SO2NR1aR1b,
여기서 R1a 및 R1b는 하기로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되고:
(a) 수소,
(b) 치환 또는 비치환 알킬,
(c) 치환 및 비치환 아릴
(d) 치환 및 비치환 헤테로아릴
(e) 치환 및 비치환 헤테로시클릴, 및
(f) 치환 및 비치환 시클로알킬;
R2는 하기로 이루어진 군에서 선택되고:
(1) 수소,
(2) 시아노,
(3) 니트로,
(4) 할로겐,
(5) 히드록시,
(6) 아미노,
(7) 치환 및 비치환 알킬,
(8) -COR2a, 및
(9) -NR2aCOR2b,
여기서 R2a 및 R2b는 하기로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되고:
(a) 수소, 및
(b) 치환 또는 비치환 알킬;
R3은 하기로 이루어진 군에서 선택되고:
(1) 수소,
(2) 시아노,
(3) 니트로,
(4) 할로겐,
(5) 치환 및 비치환 알킬,
(6) 치환 및 비치환 알케닐,
(7) 치환 및 비치환 알키닐,
(8) 치환 및 비치환 아릴,
(9) 치환 및 비치환 헤테로아릴,
(10) 치환 및 비치환 헤테로시클릴,
(11) 치환 및 비치환 시클로알킬,
(12) -COR3a,
(13) -NR3aR3b,
(14) -NR3aCOR3b,
(15) -NR3aSO2R3b,
(16) -OR3a,
(17) -SR3a,
(18) -SOR3a,
(19) -SO2R3a, 및
(20) -SO2NR3aR3b,
여기서 R3a 및 R3b는 하기로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되고:
(a) 수소,
(b) 치환 또는 비치환 알킬,
(c) 치환 및 비치환 아릴,
(d) 치환 및 비치환 헤테로알릴,
(e) 치환 및 비치환 헤테로시클릴, 및
(f) 치환 및 비치환 시클로알킬;
R4는 하기로 이루어진 군에서 선택된다:
(1) 수소, 및
(2) 할로겐.
화학식 II 화합물의 정의에서 사용될 때의 라디칼 및 기호들은 WO07/084786호에서 개시된 것과 같은 의미를 가지며, 상기 공보는 본 출원에 참조로 포함된다.
본 발명의 화합물은 WO07/084786호에 구체적으로 기술되어 있는 화합물이다. 본 발명의 화합물은 5-(2,6-디-모르폴린-4-일-피리미딘-4-일)-4-트리플루오로메틸-피리딘-2-일아민 (BKM-120으로도 알려져 있는 화합물 C)이다. 5-(2,6-디-모르폴린-4-일-피리미딘-4-일)-4-트리플루오로메틸-피리딘-2-일아민의 합성에 대해서는 WO07/084786호에 실시예 10으로 기술되어 있다.
본 발명의 문맥에서, 및 실시예에서 입증될 때, PI3K 억제제는 라파마이신의 포유동물 표적 (mTOR) 억제제로 대체될 수 있다. 따라서, 본원에서 사용될 때, "PI3K 억제제" 및 "포스포이노시티드 3-키나제 (PI3K) 억제제" 화합물이라는 용어에는 mTOR 억제제도 포함된다. 또한, 본원에서 사용될 때, "PI3K 억제제" 및 "포스포이노시티드 3-키나제 (PI3K) 억제제"라는 용어는 AKT와 같은 다른 PI3K 경로 구성요소의 억제제도 포괄한다. mTOR 억제제는 라파마이신의 표적 (mTOR) 경로 활성을 감소시키는 화합물이다. 라파마이신의 표적 경로 활성의 감소는 라파마이신의 표적의 생물학적 기능 감소로 정의된다. 라파마이신의 표적의 생물학적 기능에는 예를 들어 인터류킨-2 (IL-2)에 대한 반응의 억제, T- 및 B-세포 활성화의 차단, 증식의 조절, 및 세포 성장의 조절이 포함된다. mTOR 억제제는 예를 들어 단백질 FK-결합 단백질 12 (FKBP 12)에 결합하는 것에 의해 작용한다. mTOR 억제제들은 업계에 알려져 있거나, 또는 본원에서 기술되는 방법을 사용하여 확인된다. mTOR 억제제는 예를 들어 마크롤리드 항생제 예컨대 라파마이신, 템시롤리무스 (2,2-비스(히드록시메틸)프로피온산; CCI-779) 또는 에베롤리무스 (RAD001); AP23573 또는 이들의 모방체 또는 유도체이다. 다른 mTOR 억제제로는 템시롤리무스, 리다포롤리무스 (AP23573으로도 알려져 있음), MK8669 (이전에는 데포롤리무스로 알려져 있었음), 시롤리무스, 조타롤리무스 및 비올리무스가 있다. 라파마이신의 모방체 및 유도체에 대해서는 업계에 알려져 있는데, 예컨대 US 특허 제RE37.421호; 5,985,890호; 5,912,253호; 5,728,710호; 5,712,129호; 5,648,361호; 7,332,601호; 7,282,505호; 6,680,330호에 기술되어 있는 것들이다. 따라서, 본원에서 사용될 때, PI3K 억제제라는 용어에는 PI3K 및 mTOR 모두를 억제하는 mTOR 억제제 및/또는 화합물, 예컨대 화합물 A도 포함된다.
야누스 키나제 (JAK)들은 4종의 구성원 JAK1, JAK2, JAK3 및 TYK2로써 세포내 단백질 티로신 키나제의 족을 형성한다. 이들 키나제는 세포 증식, 분화 및 세포 생존을 포함한 다양한 생물학적 반응들을 유도하는 시토카인 수용체 신호전달의 매개에 중요하다. 마우스에서의 녹-아웃(knock-out) 실험은 조혈에서 특히 JAK가 중요함을 밝혔다. 또한, JAK2는 골수증식성 질환 및 암에 연관되어 있는 것으로 나타났다. 염색체 재배열 및/또는 음성 JAK/STAT (STAT = 신호 전달 및 활성화 인자(들)) 경로 조절인자의 상실에 의한 JAK2 활성화가 혈액암은 물론 소정의 고형 종양에서 관찰된 바 있다.
야누스 키나제 2 (보통 JAK2로 지칭됨)는 유형 II 시토카인 수용체 족 (예컨대 인터페론 수용체), GM-CSF 수용체 족 (IL-3R, IL-5R 및 GM-CSF-R), gp130 수용체 족 (예컨대 IL-6R), 및 단일 사슬 수용체 (예컨대 Epo-R, Tpo-R, GH-R, PRL-R)의 구성원들에 의한 신호전달에 연관되어 있는 인간 단백질이다. JAK2 신호전달은 프로락틴 수용체로부터 하류로 활성화된다. 백혈병 환자에서는, TEL(ETV6) (TEL-JAK2) 및 PCM1 유전자와의 JAK2 유전자 융합이 발견된 바 있다. 또한, JAK2에서의 돌연변이가 진성 다혈구혈증, 본태성 혈소판혈증 및 기타 골수증식성 장애에 연관된 바 있다. 617 위치에서의 발린의 페닐알라닌으로의 변경인 이와 같은 돌연변이는 조혈 세포를 에리트로포이에틴 및 트롬보포이에틴과 같은 성장 인자에 더 감수성이 되게 하는 것으로 보인다. Jak2의 상실은 마우스에서 12 배아일(embryonic day)까지 치명적이다. JAK2 오르토로그(ortholog)는 완전한 게놈 데이터가 가용한 모든 포유동물에서 확인되어 있다. JAK-STAT 신호전달 경로는 세포 외부의 화학 신호로부터 세포 막을 경유하여 세포 핵 내 DNA 상의 유전자 프로모터로 정보를 전송하고, 그것은 세포에서 DNA 전사 및 활성을 야기한다. JAK-STAT 시스템은 제2 메신저 시스템에 대한 주요 신호전달 대안이다. JAK-STAT 시스템은 하기 3개의 주요 구성요소로 구성된다: 수용체, JAK 및 STAT. JAK는 야누스 키나제의 약어이며, STAT는 신호 전달자 및 전사 활성화제의 약어이다. 수용체는 인터페론, 인터류킨, 성장 인자 또는 기타 화학 메신저로부터의 신호에 의해 활성화된다. 이는 자신을 자가인산화하는 JAK의 키나제 기능을 활성화한다 (포스페이트 기는 단백질에서 "온" 및 "오프" 스위치로 작용함). 다음에는, STAT 단백질이 인산화된 수용체에 결합한다. STAT는 인산화된 후, 세포 핵으로 전위되는데, 거기에서 그것은 DNA에 결합하여 STAT에 반응성인 유전자들의 전사를 촉진한다. 포유동물에는 7종의 STAT 유전자가 존재하며, 각각의 것은 서로 다른 DNA 서열에 결합한다. STAT는 다른 DNA 서열의 발현을 조절하는 프로모터로 지칭되는 DNA 서열에 결합한다. 이는 세포 성장, 분화 및 사멸과 같은 기본적인 세포 기능에 영향을 준다. JAK-STAT 경로는 점균류 및 벌레에서부터 포유동물까지 (진균 또는 식물은 아님) 진화상 보존되어 있다. 붕괴되거나 조절에 장애가 있는 JAK-STAT 기능성 (보통 선천적이거나 후천적인 유전적 결함에 의함)은 면역 결핍 증후군 및 암을 초래할 수 있다.
티로신 키나제 활성을 가지고 있는 JAK는 일부 세포 표면 시토카인 및 호르몬 수용체에 결합한다. 수용체에 대한 리간드의 결합은 JAK의 활성화를 촉발한다. 증가된 키나제 활성에 의해, 그것은 수용체 상의 티로신 잔기를 인산화함으로써, 포스포티로신-결합 SH2 도메인을 함유하는 단백질과의 상호작용을 위한 부위를 생성시킨다. 이러한 포스포티로신 잔기에 결합할 수 있는 STAT의 프로세싱 SH2 도메인은 수용체에 동원된 후, 그 자신이 JAK에 의해 티로신-인산화된다. 다음에, 이러한 포스포티로신은 그의 이량체화를 매개하는 다른 STAT의 SH2 도메인을 위한 결합 부위로 작용한다. 상이한 STAT들이 이종- 또는 동종이량체를 형성한다. 활성화된 STAT 이량체들이 세포 핵에 축적되면, 그의 표적 유전자의 전사를 활성화한다. STAT는 표피 성장 인자 수용체와 같은 수용체 티로신 키나제는 물론, c-src와 같은 비-수용체 티로신 키나제에 의해 직접 티로신-인산화될 수도 있다. 경로는 여러 수준에서 음성으로 조절된다. 단백질 티로신 포스파타제는 시토카인 수용체 및 활성화된 STAT로부터 포스페이트를 제거한다. 다른 시토카인 신호전달 억제제 (SOCS)는 JAK에 결합하여 억제하거나 시토카인 수용체상 포스포티로신 결합 부위에 대하여 STAT와 경쟁하는 것에 의해 STAT 인산화를 억제한다. STAT는 또한 몇 가지 메카니즘을 통하여 핵에서 작용하는 활성화된 STAT의 단백질 억제제 (PIAS)에 의해 음성으로 조절된다. 예를 들어, PIAS1 및 PIAS3은 그들이 인식하는 DNA 서열에 결합하여 접근을 차단하는 것에 의해 각각 STAT1 및 STAT3에 의한 전사 활성화를 억제한다.
야누스 키나제 억제제는 야누스 키나제 족의 효소들 (JAK1, JAK2, JAK3, TYK2) 중 하나 이상의 효과를 억제하는 것에 의해 JAK-STAT 신호전달 경로를 방해하는 기능을 하는 의약류이다.
일부 JAK2 억제제는 진성 다혈구혈증, 본태성 혈소판혈증, 및 골수섬유증을 동반한 골수 화생 치료용으로 개발 중에 있다. 일부 JAK2 억제제는 예컨대 건선에 대한 임상 시험 중에 있다.
JAK2 억제제의 예는 하기이다: 급성 골수성 백혈병 (AML) 경우의 JAK2에 대한 레스타우르티닙, 건선, 골수섬유증 및 류마티스 관절염 경우의 JAK1/JAK2에 대한 룩솔리티닙, 재발 림프종, 진행성 골수암, 골수섬유증 및 CIMF 경우의 JAK2에 대한 SB1518, 골수증식성 장애 경우의 JAK2에 대한 CYT387, 류마티스 관절염 경우의 JAK1/JAK2 개시 단계 IIb에 대한 LY3009104 (INCB28050), JAK2에 대한 INC424 (INCB01842로도 알려져 있음), JAK2에 대한 화합물 D, JAK2에 대한 TG101348 (이 경우 골수섬유증에 대한 단계 I 결과가 나와 있음), JAK2에 대한 LY2784544, JAK2에 대한 BMS-911543, 및 NS-018 (문헌 [Nakaya et al., 2011, Blood Cancer Journal, 1, e29; doi:10.1038/bcj.2011.29]).
WO 2005/080393호는 특히 키나제 활성의 이상 또는 탈조절과 연관되어 있는 장애의 치료에 유용한 7H-피롤로[2,3d]피리미딘-2일-아미노 유도체에 대해 개시하고 있다.
문헌 [Bioorganic & Medical Chemistry Letters 16 (2006), 2689]은 국소 부착(focal adhesion) 키나제 억제제로서의 소정 7H-피롤로[2,3d]피리미딘의 설계 및 합성에 대해 개시하고 있다.
WO 2009/098236호에 개시되어 있는 바와 같이, 하기에 제시되어 있는 화학식 III의 7-페닐-7H-피롤로[2,3d]피리미딘-2일-아미노 유도체가 유리한 약리학적 특성들을 가지고 있으며, 예를 들어 JAK2 키나제 및/또는 JAK3-(또한 JAK-1-) 키나제와 같은 야누스 키나제의 티로신 키나제 활성을 억제한다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 화학식 III의 화합물은 예를 들어 JAK2 (및/또는 JAK3) 키나제의 티로신 키나제 활성에 따른 질환, 특히 종양 질환, 백혈병, 진성 다혈구혈증, 본태성 혈소판혈증, 및 골수 화생을 동반한 골수섬유증과 같은 증식성 질환의 치료를 위한 본 발명의 조합물에 사용되기에 적합하다.
한 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 III의 화합물 또는 그의 염에 관한 것이다:
<화학식 III>
Figure pct00003
상기 식에서,
R1은 비치환 또는 치환 헤테로시클릴, 비치환 또는 치환 아릴, 비치환 또는 치환 시클로알킬을 나타내고;
R2는 수소, 할로겐, 저급 알킬, 저급 알킬옥시, 저급 할로알킬, 시클로알킬, 시클로알킬옥시, 할로시클로알킬, 시클로알킬옥시, 할로시클로알킬옥시를 나타내고;
R3은 수소, 할로겐, 저급 알킬, 저급 알킬옥시, 저급 할로알킬, 시클로알킬, 시클로알킬옥시, 할로시클로알킬, 시클로알킬옥시, 할로시클로알킬옥시를 나타내거나; 또는
R2 및/또는 R3이 R5 또는 R7에 연결되어, R2/R3이 결합되어 있는 페닐 고리에 융합된 시클릭 모이어티를 형성하고;
R2a는 수소, 할로겐, 저급 알킬, 저급 알킬옥시, 저급 할로알킬, 시클로알킬, 시클로알킬옥시, 할로시클로알킬, 시클로알킬옥시, 할로시클로알킬옥시를 나타내고;
R3a는 수소, 할로겐, 저급 알킬, 저급 알킬옥시, 저급 할로알킬, 시클로알킬, 시클로알킬옥시, 할로시클로알킬, 시클로알킬옥시, 할로시클로알킬옥시를 나타내고;
R4는
Figure pct00004
의 기를 나타내고, 여기서 A1은 하기 기들 중 하나를 나타내거나:
Figure pct00005
(여기서 *로 표시된 원자는 페닐 고리에의 결합임); 또는
R4는 하기 기들 중 하나를 나타내고:
Figure pct00006
;
R5는 서로 독립적으로 수소, 저급 알킬, 저급 할로알킬, 시클로알킬, 할로시클로알킬을 나타내거나, 또는 그들이 결합되어 있는 탄소와 함께 시클로알킬을 형성하고;
R6 및 R7은 그들이 결합되어 있는 질소와 함께 임의로 치환된 헤테로고리를 나타내거나; 또는
R6은 수소 또는 임의로 치환된 알킬을 나타내고;
R7은 임의로 치환된 알킬을 나타내고;
R8은 알킬, 히드록시, 저급 알킬옥시, 저급 할로알킬옥시, 시클로알킬옥시, 할로시클로알킬옥시, 저급 알킬-술포닐, 저급-할로알킬-술포닐, 시클로알킬-술포닐, 할로시클로알킬-술포닐, 저급 알킬-술피닐, 저급 할로알킬-술피닐, 시클로알킬-술피닐, 할로시클로알킬-술피닐을 나타내고;
R9는 H 또는 저급 알킬을 나타내고;
R10은 수소, 저급 알킬, 저급 할로알킬, 시클로알킬, 할로시클로알킬을 나타내고;
n은 0, 1 또는 2를 나타낸다.
화학식 III 화합물의 정의에서 사용될 때의 라디칼 및 기호들은 WO2009/098236호에서 개시된 것과 같은 의미를 가지며, 상기 공보는 본 출원에 참조로 포함된다.
WO2008/148867호는 하기 화학식 IV의 퀴녹살린 화합물에 대해 개시하고 있다:
<화학식 IV>
Figure pct00007
상기 식에서, 퀴녹살린 고리의 2- 및 8- 위치는 시클릭 기에 의해 치환된다. 상기 화합물은 JAK-2 및 JAK-3 키나제를 포함한 야누스 키나제의 티로신 키나제 활성 억제제로서 유용할 수 있다. WO2008/148867호의 실시예 98은 8-(3,5-디플루오로-4-모르폴린-4-일메틸-페닐)-2-(1-피페리딘-4-일-1H-피라졸-4-일)-퀴녹살린 (BSK805 또는 BSK-805로도 알려져 있는 화합물 D)에 대해 기술하고 있다.
화학식 IV 화합물의 정의에서 사용될 때의 라디칼 및 기호들은 WO2008/148867호에서 개시된 것과 같은 의미를 가지며, 상기 공보는 본 출원에 참조로 포함된다.
본원에서 사용될 때, STAT5는 개별 유전자에 의해 코딩되어 있으나 아미노산 수준에서 90% 동일한 2종의 고도로 관련된 단백질 STAT5A 및 STAT5B를 지칭한다 (문헌 [Grimley PM, Dong F, Rui H, 1999, Cytokine Growth Factor Rev. 10(2):131-157]). 신호 전달자 및 전사 활성화제 5A (STAT5A)는 인간에서 STAT5A 유전자에 의해 코딩되어 있는 단백질이다. STAT5A 오르토로그는 완전한 게놈 데이터가 가용한 수종의 태반에서 확인되어 있다. 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 STAT 족 전사 인자의 구성원이다. 시토카인 및 성장 인자에 반응하여, STAT 족 구성원은 수용체 연관 키나제에 의해 인산화된 다음, 동종- 또는 이종이량체를 형성하고, 그것은 세포 핵으로 전위되어 거기에서 전사 활성화인자로서 작용한다. 이 단백질은 IL2, IL3, IL7 GM-CSF, 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, 및 여러 성장 호르몬들과 같은 많은 세포 리간드들에 의해 활성화되며, 그들의 반응을 매개한다. TEL/JAK2 유전자 융합과 연관되어 있는 골수종 및 림프종에서의 이 단백질의 활성화는 세포 자극과 무관하며, 종양생성에 필수적인 것으로 밝혀졌다. 이 유전자의 마우스 해당물은 BCL2L1/BCL-X(L)의 발현을 유도하는 것으로 보이는데, 이는 세포에서의 이 유전자의 항아폽토시스 기능을 암시한다. STAT5A는 CRKL, 표피 성장 인자 수용체, ERBB4, 에리트로포이에틴 수용체, 야누스 키나제 1, 야누스 키나제 2, MAPK1, NMI 및 PTPN11과 상호작용하는 것으로 밝혀져 있다. 신호 전달자 및 전사 활성화제 5B는 인간에서 STAT5B 유전자에 의해 코딩되어 있는 단백질이다. STAT5B 오르토로그는 완전한 게놈 데이터가 가용한 대부분의 태반에서 확인되어 있다. 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 STAT 족 전사 인자의 구성원이다. 이 단백질은 IL2, IL4, CSF1, 및 여러 성장 호르몬들과 같은 다양한 세포 리간드들에 의해 촉발되는 신호 전달을 매개한다. 그것은 TCR 신호전달, 아폽토시스, 성인 유선 발생, 및 간 유전자 발현의 성별 이형(dimorphism)과 같은 다양한 생물학적 과정에 연관되어 있는 것으로 밝혀졌다. 이 유전자가 급성 전골수구성 백혈병 (APML)의 작은 하위세트에서 레티노산 수용체-알파 (RARA) 유전자에 융합된다는 것이 발견되었다. STAT5B는 PTPN11, 야누스 키나제 2, 야누스 키나제 1 및 글루코코르티코이드 수용체와 상호작용하는 것으로 밝혀져 있다. STAT5 억제제에 대해서는 업계에 알려져 있는데, 예를 들어 문헌 [Cumaraswamy et al., 2011, MedChemComm, DOI: 10.1039/c1md00175b]을 참조하라. 거기에는 피모지드, N'-((4-옥소-4H-크로멘-3-일)메틸렌)니코티노히드라지드 (화합물 E), "IQDMA" (N1-(11H-인돌로[3,2-c]퀴놀린-6-일)-N2,N2-디메틸에탄-1,2-디아민 (화합물 F)는 물론, 문헌 [Cumaraswamy et al., 2011, (MedChemComm, DOI: 10.1039/c1md00175b)]에 기술되어 있는 바와 같은 화합물 12, 13 및 14 (각각 화합물 G, H 및 I)도 포함된다.
따라서, 본 발명은 또한 (a) 포스포이노시티드 3-키나제 (PI3K) 억제제 화합물 및 (b) 야누스 키나제 2 (JAK2)-신호 전달자 및 전사 활성화제 5 (STAT5) 경로를 조절하는 화합물을 포함하는 조합 제제 또는 제약 조성물과 같은 조합물에 관한 것이다. 더 구체적으로, 제1 실시양태에서, 본 발명은 (a) 포스포이노시티드 3-키나제 (PI3K) 억제제 화합물 및 (b) JAK2 조절제를 포함하는 조합물에 관한 것이다.
본원에서 사용될 때의 "조합물" 및 "조합 제제"라는 용어는 상기 정의된 바와 같은 조합 파트너 (a) 및 (b)가 개별적으로, 또는 구별되는 양의 조합 파트너 (a) 및 (b)를 포함하는 상이한 고정 조합물을 사용하여, 즉 동시에 또는 상이한 시점에 투여될 수 있다는 의미에서, "부분들의 키트(kit of parts)"도 한정한다. 따라서, 부분들의 키트의 부분들은 예를 들어 동시에 또는 시기적으로 엇갈려, 즉 상이한 시점에, 부분들의 키트의 소정 부분에 대하여 동일하거나 상이한 시간 간격으로 투여될 수 있다. 조합 제제에서 투여될 조합 파트너 (b)에 대한 조합 파트너 (a)의 총량의 비는 예를 들어 치료될 환자 하위-군집의 필요성 또는 개체의 필요성에 맞추어 가변적일 수 있다.
실시예에 나타낸 바와 같이, PI3K/mTOR 억제제 및 JAK2-STAT5 억제제를 사용한 조합 요법이 종양 질환의 치료에 있어서 예상치 못한 향상을 초래한다는 것이 발견되었다. 동시에, 순차적으로 또는 개별로 투여되었을 때, PI3K/mTOR 억제제와 JAK2-STAT5 억제제는 상승작용적 방식으로 상호작용하여 세포 수 및 종양 성장을 감소시킴은 물론, 순환성 종양 세포의 수 및 전이도 감소시킨다. 이와 같은 예상치 못한 상승작용은 부작용의 감소로 이어지는 각 화합물의 요구 투여량 감소, 및 화합물 및 치료의 임상적 효과 향상을 가능케 한다.
1종 이상 성분들 사이의 상승작용적 상호작용, 효과를 위한 최적의 범위, 및 효과를 위한 각 성분의 절대적 투여량 범위를 측정하는 것은 치료를 필요로 하는 환자에 대한 상이한 w/w 비 범위 및 투여량에 걸친 성분들의 투여에 의해 확실하게 측정될 수 있다. 인간의 경우, 환자에서의 임상 연구를 수행함에 있어서의 복잡성 및 비용이 상승작용에 대한 일차 모델로서의 이와 같은 형태의 시험의 사용을 비실제적인 것이 되게 한다. 그러나, 한 종에서의 상승작용의 관찰로써 다른 종에서의 효과를 예상할 수 있으므로, 상승작용적 효과를 측정하기 위한 본원에서 기술되는 바와 같은 동물 모델들이 존재하는 바, 그와 같은 연구의 결과가 약동학적/약역학적 방법의 적용에 의해 다른 종에서 요구되는 효과적인 투여량 및 혈장 농도 비 범위, 및 절대적인 투여량 및 혈장 농도를 예상하는 데에 사용될 수도 있다. 인간에서 관찰되는 종양 모델과 효과 사이의 확립되어 있는 상관관계들은 동물에서의 상승작용이 예를 들어 하기 실시예에서 기술되는 바와 같은 종양 모델에서 입증될 수 있음을 암시하고 있다.
한 측면에서, 본 발명은 예를 들어 상승작용적 상호작용을 확인하는 데에 사용되는 하기 실시예에서 기술되는 바와 같은 종양 모델에서 관찰되는 범위에 상응하는 조합 범위 (w/w)로, (a) PI3K 억제제 화합물 및 (b) JAK2-STAT5 경로를 조절하는 화합물 또는 이들의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물을 포함하는, 인간 투여용 상승작용적 조합물을 제공한다. 적합하게는, 인간에서의 비 범위는 50:1 내지 1:50 중량부, 50:1 내지 1:20, 50:1 내지 1:10, 50:1 내지 1:1, 20:1 내지 1:50, 20:1 내지 1:20, 20:1 내지 1:10, 20:1 내지 1:1, 10:1 내지 1:50, 10:1 내지 1:20, 10:1 내지 1:10, 10:1 내지 1:1, 1:1 내지 1:50, 1.1 내지 1:20 및 1:1 내지 1:10 사이에서 선택되는 비-인간 범위에 상응한다. 더욱 적합하게는, 인간 범위는 10:1 내지 1:1 또는 5:1 내지 1:1 또는 2:1 내지 1:1 중량부의 비-인간 범위 수준에 상응한다.
추가적인 측면에 있어서, 본 발명은 (a) PI3K 억제제 화합물 및 (b) JAK2-STAT5 경로를 조절하는 화합물 또는 이들의 제약상 허용되는 염을 포함하며, 각 성분의 투여량 범위가 주로 상승작용적 상호작용을 확인하는 데에 사용되는 적합한 종양 모델, 예컨대 하기 실시예에서 기술되는 종양 모델에서 관찰되는 상승작용적 범위에 상응하는, 인간 투여용 상승작용적 조합물을 제공한다. 적합하게는, 인간에서의 PI3K 억제제 화합물의 투여량 범위는 적합한 종양 모델, 예컨대 하기 실시예에서 기술되는 바와 같은 마우스 모델에서의 1-1000 mg/kg, 예를 들어 1-500 mg/kg, 1-1000 mg/kg, 1-200 mg/kg, 1-100 mg/kg, 1-50 mg/kg, 1-30 mg/kg (예컨대 화합물 A의 경우 1-35 mg/kg 또는 1-10 mg/kg, 화합물 B의 경우 1-25 mg/kg)의 투여량 범위에 상응한다. JAK2-STAT5 경로를 조절하는 화합물의 경우, 인간에서의 투여량 범위는 적합하게는 적합한 종양 모델, 예컨대 하기 실시예에서 기술되는 바와 같은 마우스 모델에서의 1-50 mg/kg 또는 1-30 mg/kg (예컨대 1-25 mg/kg, 1-10 mg/kg 또는 1-2.5 mg/kg)의 상승작용적 범위에 상응한다. 적합하게는, 인간에서 사용하기 위한 PI3K 억제제 화합물의 투여량은 하루 1회 또는 하루 2회 (b.i.d.) 또는 하루 3회 (t.i.d.)로 1-1200 mg, 1-500 mg, 1-100 mg, 1-50 mg, 1-25 mg, 500-1200 mg, 100-1200 mg, 100-500 mg, 50-1200 mg, 50-500 mg 또는 50-1OO mg에서 선택되는 범위, 적합하게는 50-1OO mg이며, JAK2-STAT5 경로를 조절하는 화합물의 투여량은 하루 1회, b.i.d. 또는 t.i.d.로 1-1000 mg, 1-500 mg, 1-200 mg, 1-100 mg, 1-50 mg, 1-25 mg, 10-100 mg, 10-200 mg, 50-200 mg 또는 100-500 mg에서 선택되는 범위이다.
추가적인 측면에 있어서, 본 발명은 (a) 최대 허용가능 투여량 (MTD)의 10%-100%, 바람직하게는 50%-100%, 더욱 바람직하게는 70%-100%, 80%-100% 또는 90%-100%인 PI3K 억제제 화합물 및 (b) MTD의 10%-100%, 바람직하게는 50%-100%, 더욱 바람직하게는 70%-100%, 80%-100% 또는 90%-100%인 JAK2-STAT5 경로를 조절하는 화합물을 포함하는 인간 투여용 상승작용적 조합물을 제공한다. 한 실시양태에서, 화합물들 중 1종, 바람직하게는 PI3K 억제제 화합물은 MTD로 투여되며, 다른 화합물, 바람직하게는 JAK2-STAT5 경로를 조절하는 화합물은 MTD의 50%-100%, 바람직하게는 MTD의 60%-90%로 투여된다. MTD는 허용되지 않는 부작용 없이 제공될 수 있는 의약의 최고 투여량에 상응한다. MTD를 결정하는 것은 업계의 소관이다. 예를 들어, MTD는 투여량 제한 독성을 특성화하기 위한 투여량 점증, 및 생물학적으로 활성인 허용 투여량 수준의 결정을 포함한 단계 I 연구에서 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, (a) 포스포이노시티드 3-키나제 (PI3K) 억제제 화합물인 억제제는 화합물 A, 화합물 B 또는 화합물 C로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 한 실시양태에서, (b) JAK2-STAT5 조절제는 레스타우르티닙, 룩솔리티닙, SB1518, CYT387, LY3009104 (INCB28050), INC424 (INCB01842로도 알려져 있음), 화합물 D (BSK-805), TG101348, LY2784544, BMS-911543 및 NS-018로 이루어진 군에서 선택되는 억제제이다.
본 발명의 추가적인 측면에는 대상체의 종양에서의 IL-8 및/또는 JAK2/STAT5의 발현, 또는 대상체의 혈장에서의 IL-8의 존재를 바탕으로 상기 대상체가 BEZ에 대하여 내성일지를 예상하기 위한 키트 및 방법이 포함된다.
본원에서 사용될 때의 "치료하는 것" 또는 "치료"라는 용어는 질환 진행의 지연을 초래하는 치료를 포함한다. 본원에서 사용될 때의 "진행의 지연"이라는 용어는 치료될 증식성 질환의 예비-단계 또는 초기 단계에 있는 환자에 대한 조합물의 투여를 의미하는데, 여기서 상기 환자에서는 예를 들어 예비-형태의 해당 질환이 진단되거나, 또는 상기 환자는 예컨대 의학적 치료 중인 상태, 또는 해당 질환이 발생하게 될 가능성이 있는 사고에 기인하는 상태에 있다.
치료될 대상체는 보통 인간이다. 거의 인간을 지칭하고 있기는 하지만, 본 발명이 인간으로 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서, 대상체는 인간에 더하여 비제한적으로 소, 돼지, 말, 닭, 고양이, 개, 낙타 등과 같은 동물들을 포함한 소정의 온혈 동물일 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 증식성 질환은 유방암, 특히 전이성 유방암 또는 삼중 음성 유형의 유방암이다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 증식성 질환은 고형 종양이다. "고형 종양"이라는 용어는 특히 유방암, 난소암, 결장 및 일반적으로 GI (위장)관 암, 자궁경부암, 폐암 특히 소-세포 폐암 및 비-소세포 폐암, 두부 및 경부의 암, 방광암, 전립선 암 또는 카포시 육종을 의미한다. 본 발명의 조합물은 고형 종양은 물론 액성 종양(liquid tumor)의 성장도 억제한다. 또한, 종양 유형 및 사용되는 구체적인 조합물에 따라, 종양 부피의 감소가 이루어질 수 있다. 본원에서 개시되는 조합물은 또한 예컨대 유방암의 종양 전이 확산, 및 미세전이의 성장 또는 발생을 예방하는 데에 적합하다. 본원에서 개시되는 조합물은 예후가 저조한 환자의 치료에 특히 적합하다.
코드 번호, 일반명 또는 상표명으로 확인되는 상기 활성 작용제들의 구조에 대해서는 표준 편람인 문헌 ["The Merck Index"]의 실용판, 또는 데이터베이스 예컨대 [Patents International] (예컨대 [IMS World Publications])에서 찾아볼 수 있다. 이들의 상응 내용은 본원에 참조로 포함된다.
조합 파트너 (a) 및 (b)에 대한 언급이 제약상 허용되는 염도 포함하여 의미한다는 것은 이해될 것이다. 이러한 조합 파트너 (a) 및 (b)가 예를 들어 1개 이상의 염기성 중심(basic center)을 가지는 경우, 그것은 산 부가염을 형성할 수 있다. 원할 경우, 상응하는 산 부가염은 추가적으로 존재하는 염기성 중심을 가지도록 형성될 수도 있다. 산 기 (예를 들어 COOH)를 가지는 조합 파트너 (a) 및 (b)는 또한 염기와 염을 형성할 수 있다. 조합 파트너 (a) 또는 (b) 또는 이들의 제약상 허용되는 염은 수화물의 형태로 사용되거나, 또는 결정화에 사용되는 다른 용매를 포함할 수도 있다.
(a) 포스포이노시티드 3-키나제 억제제 화합물 및 (b) JAK2-STAT5 경로를 조절하는 화합물 (활성 작용제들은 각 경우 유리 형태 또는 제약상 허용되는 염의 형태로 존재함), 및 임의로 1종 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조합물은 이하 본 발명의 조합물로 지칭될 것이다.
본 발명의 조합물은 효능 및 안전성 모두의 면에서 상승작용 및 상가작용 이점 모두를 가진다. JAK2-STAT5 경로를 조절하는 화합물과 포스포이노시티드 3-키나제 억제제 화합물의 조합물의 치료 효과는 조합물에서의 각 성분의 더 낮은 안전한 투여량 범위를 초래할 수 있다.
본 발명의 조합물의 약리학적 활성은 예를 들어 이하에서 본질적으로 기술되는 바와 같은 임상 연구 또는 시험 절차에서 입증될 수 있다. 적합한 임상 연구는 예를 들어 진행성 고형 종양을 가지는 환자에서의 개방 표지 비-무작위화 투여량 점증 연구이다. 그와 같은 연구는 본 발명의 조합물 활성 성분들의 상가작용 또는 상승작용을 입증할 수 있다. 증식성 질환에 대한 유익한 효과는 이러한 연구의 결과를 통하여 바로, 또는 업계 숙련자에게 그렇다고 알려져 있는 연구 설계의 변화에 의해 측정될 수 있다. 그와 같은 연구들은 활성 성분들을 사용한 단독요법과 본 발명의 조합물의 효과를 비교하는 데에 특히 적합하다. 바람직하게는, 조합 파트너 (a)는 고정된 투여량으로 투여되고, 조합 파트너 (b)의 투여량은 최대 허용 투여량 (MTD)이 달성될 때까지 점증된다.
본 발명의 한 목적은 증식성 질환에 대하여 치료 유효한 양으로 본 발명의 조합물을 포함하는 제약 조성물을 제공하는 것이다. 이와 같은 조성물에서, 조합 파트너 (a) 및 (b)는 하나의 조합된 단위 투여 형태 또는 2종의 개별 단위 투여 형태로 함께, 하나씩 차례로, 또는 개별로 투여될 수 있다. 상기 단위 투여 형태는 고정된 조합물일 수도 있다.
본 발명에 따른 제약 조성물은 원래 알려져 있는 방식으로 제조될 수 있는데, 사람을 포함한 포유동물 (온혈 동물)에 대한 경구 또는 직장과 같은 장내 및 비경구 투여에 적합한 것들이다. 다르게는, 작용제들이 개별로 투여될 경우, 하나는 장내 제제일 수 있으며, 다른 하나는 비경구로 투여될 수 있다.
신규 제약 조성물은 예를 들어 약 10% 내지 약 100%, 바람직하게는 약 20% 내지 약 60%의 활성 성분을 함유한다. 장내 또는 비경구 투여를 위한 조합 요법용의 제약 제제는 예를 들어 당-코팅 정제, 정제, 캡슐 또는 좌약, 및 또한 앰풀과 같은 단위 투여 형태의 것이다. 다르게 표시되지 않는 경우, 이들은 예를 들어 통상적인 혼합, 과립화, 당-코팅, 용해 또는 동결건조 과정에 의해 원래 알려져 있는 방식으로 제조된다. 다수 투여 단위의 투여에 의해 필요한 유효량이 달성될 수 있기 때문에, 각 투여 형태의 개별 투여분에 함유되어 있는 조합 파트너의 단위 함량 자체가 유효량을 구성할 필요는 없다는 것은 알고 있을 것이다.
경구 투여 형태용 조성물을 제조함에 있어서는, 고체 경구용 제제가 액체 제제에 비해 바람직한 예를 들어 분말, 캡슐 및 정제와 같은 경구용 고체 제제의 경우, 예를 들어 물, 글리콜, 오일, 알콜, 향미제, 보존제, 착색제; 또는 담체 예컨대 전분, 당, 미세결정질 셀룰로스, 희석제, 과립화제, 윤활제, 결합제, 붕해제 등과 같은 어떠한 통상적인 제약용 매체도 사용될 수 있다. 투여상의 그의 용이성으로 인하여, 정제 및 캡슐이 가장 유리한 경구용 투여 단위 형태를 대표하는데, 그와 같은 경우 당연히 고체인 제약용 담체가 사용된다.
구체적으로, 본 발명의 조합물의 조합 파트너 각각의 치료 유효량은 동시에 또는 순차적으로, 및 임의의 순서로 투여될 수 있으며, 또한 성분들이 개별로 또는 고정된 조합물로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 증식성 질환의 진행 지연 또는 치료 방법은 동시의 것이거나 임의 순서의 순차적인 것이며 합쳐서 치료 유효량, 바람직하게는 상승작용적 유효량의 것인 (i) 유리 또는 제약상 허용되는 염 형태인 제1 조합 파트너의 투여, 및 (ii) 유리 또는 제약상 허용되는 염 형태인 제2 조합 파트너의 투여를 포함할 수 있다. 본 발명의 조합물의 개별 조합 파트너들은 치료 과정 동안의 상이한 시점에 개별로, 또는 분할 또는 단일 조합물 형태로 동시에 투여될 수 있다. 또한, 투여하는 것이라는 용어는 생체내에서 조합 파트너 자체로 전환되는 조합 파트너 전구-약물의 사용도 포괄한다. 따라서, 본 발명은 그와 같은 모든 동시 또는 교호 치료 계획을 포괄하는 것으로 이해되어야 하며, "투여하는 것"이라는 용어도 그에 따라 해석되어야 한다.
본 발명의 조합물은 조합 제제 또는 제약 조성물일 수 있다.
한편, 본 발명은 증식성 질환에 대하여 치료 유효한 양으로 본 발명의 조합물을 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 증식성 질환에 걸린 온혈 동물의 치료 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 증식성 질환의 치료 및 증식성 질환 치료용 의약의 제조를 위한 본 발명의 조합물의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 활성 성분으로서 본 발명의 조합물과 함께, 증식성 질환의 진행 지연 또는 치료에서의 그의 동시, 개별 또는 순차적 사용에 대한 지침을 포함하는 상업용 패키지를 제공한다.
본 발명의 실시양태는 하기를 포함하는 조합물들로 대표된다:
· 레스타우르티닙, 및 화합물 A, 화합물 B, 화합물 C, 라파마이신, 템시롤리무스, 에베롤리무스, 템시롤리무스, 리다포롤리무스, MK-8669, 시롤리무스, 조타롤리무스 및 비올리무스로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물.
· 룩솔리티닙, 및 화합물 A, 화합물 B, 화합물 C, 라파마이신, 템시롤리무스, 에베롤리무스, 템시롤리무스, 리다포롤리무스, MK-8669, 시롤리무스, 조타롤리무스 및 비올리무스로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물.
· SB1518, 및 화합물 A, 화합물 B, 화합물 C, 라파마이신, 템시롤리무스, 에베롤리무스, 템시롤리무스, 리다포롤리무스, MK-8669, 시롤리무스, 조타롤리무스 및 비올리무스로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물.
· CYT387, 및 화합물 A, 화합물 B, 화합물 C, 라파마이신, 템시롤리무스, 에베롤리무스, 템시롤리무스, 리다포롤리무스, MK-8669, 시롤리무스, 조타롤리무스 및 비올리무스로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물.
· LY3009104, 및 화합물 A, 화합물 B, 화합물 C, 라파마이신, 템시롤리무스, 에베롤리무스, 템시롤리무스, 리다포롤리무스, MK-8669, 시롤리무스, 조타롤리무스 및 비올리무스로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물.
· INC424, 및 화합물 A, 화합물 B, 화합물 C, 라파마이신, 템시롤리무스, 에베롤리무스, 템시롤리무스, 리다포롤리무스, MK-8669, 시롤리무스, 조타롤리무스 및 비올리무스로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물.
· 화합물 D, 및 화합물 A, 화합물 B, 화합물 C, 라파마이신, 템시롤리무스, 에베롤리무스, 템시롤리무스, 리다포롤리무스, MK-8669, 시롤리무스, 조타롤리무스 및 비올리무스로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물.
· TG101348, 및 화합물 A, 화합물 B, 화합물 C, 라파마이신, 템시롤리무스, 에베롤리무스, 템시롤리무스, 리다포롤리무스, MK-8669, 시롤리무스, 조타롤리무스 및 비올리무스로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물.
· LY2784544, 및 화합물 A, 화합물 B, 화합물 C, 라파마이신, 템시롤리무스, 에베롤리무스, 템시롤리무스, 리다포롤리무스, MK-8669, 시롤리무스, 조타롤리무스 및 비올리무스로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물.
· BMS-911543, 및 화합물 A, 화합물 B, 화합물 C, 라파마이신, 템시롤리무스, 에베롤리무스, 템시롤리무스, 리다포롤리무스, MK-8669, 시롤리무스, 조타롤리무스 및 비올리무스로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물.
· NS-018, 및 화합물 A, 화합물 B, 화합물 C, 라파마이신, 템시롤리무스, 에베롤리무스, 템시롤리무스, 리다포롤리무스, MK-8669, 시롤리무스, 조타롤리무스 및 비올리무스로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물.
· 화합물 E, 및 화합물 A, 화합물 B, 화합물 C, 라파마이신, 템시롤리무스, 에베롤리무스, 템시롤리무스, 리다포롤리무스, MK-8669, 시롤리무스, 조타롤리무스 및 비올리무스로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물.
· 화합물 F, 및 화합물 A, 화합물 B, 화합물 C, 라파마이신, 템시롤리무스, 에베롤리무스, 템시롤리무스, 리다포롤리무스, MK-8669, 시롤리무스, 조타롤리무스 및 비올리무스로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물.
· 화합물 G, 및 화합물 A, 화합물 B, 화합물 C, 라파마이신, 템시롤리무스, 에베롤리무스, 템시롤리무스, 리다포롤리무스, MK-8669, 시롤리무스, 조타롤리무스 및 비올리무스로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물.
· 화합물 H, 및 화합물 A, 화합물 B, 화합물 C, 라파마이신, 템시롤리무스, 에베롤리무스, 템시롤리무스, 리다포롤리무스, MK-8669, 시롤리무스, 조타롤리무스 및 비올리무스로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물.
· 화합물 I, 및 화합물 A, 화합물 B, 화합물 C, 라파마이신, 템시롤리무스, 에베롤리무스, 템시롤리무스, 리다포롤리무스, MK-8669, 시롤리무스, 조타롤리무스 및 비올리무스로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 조합물을 제공한다:
· 화합물 A, 및 레스타우르티닙, 룩솔리티닙, SB1518, CYT387, LY3009104, INC424, LY2784544, BMS-911543, NS-018, 화합물 D, TG101348, 화합물 E, 화합물 F, 화합물 G, 화합물 H 및 화합물 I로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물.
· 화합물 B, 및 레스타우르티닙, 룩솔리티닙, SB1518, CYT387, LY3009104, INC424, LY2784544, BMS-911543, NS-018, 화합물 D, TG101348, 화합물 E, 화합물 F, 화합물 G, 화합물 H 및 화합물 I로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물.
· 화합물 C, 및 레스타우르티닙, 룩솔리티닙, SB1518, CYT387, LY3009104, INC424, LY2784544, BMS-911543, NS-018, 화합물 D, TG101348, 화합물 E, 화합물 F, 화합물 G, 화합물 H 및 화합물 I로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물.
· 라파마이신, 및 레스타우르티닙, 룩솔리티닙, SB1518, CYT387, LY3009104, INC424, LY2784544, BMS-911543, NS-018, 화합물 D, TG101348, 화합물 E, 화합물 F, 화합물 G, 화합물 H 및 화합물 I로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물.
· 템시롤리무스, 및 레스타우르티닙, 룩솔리티닙, SB1518, CYT387, LY3009104, INC424, LY2784544, BMS-911543, NS-018, 화합물 D, TG101348, 화합물 E, 화합물 F, 화합물 G, 화합물 H 및 화합물 I로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물.
· 에베롤리무스, 및 레스타우르티닙, 룩솔리티닙, SB1518, CYT387, LY3009104, INC424, LY2784544, BMS-911543, NS-018, 화합물 D, TG101348, 화합물 E, 화합물 F, 화합물 G, 화합물 H 및 화합물 I로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물.
· 템시롤리무스, 및 레스타우르티닙, 룩솔리티닙, SB1518, CYT387, LY3009104, INC424, LY2784544, BMS-911543, NS-018, 화합물 D, TG101348, 화합물 E, 화합물 F, 화합물 G, 화합물 H 및 화합물 I로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물.
· 리다포롤리무스, 및 레스타우르티닙, 룩솔리티닙, SB1518, CYT387, LY3009104, INC424, LY2784544, BMS-911543, NS-018, 화합물 D, TG101348, 화합물 E, 화합물 F, 화합물 G, 화합물 H 및 화합물 I로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물.
· MK-8669, 및 레스타우르티닙, 룩솔리티닙, SB1518, CYT387, LY3009104, INC424, LY2784544, BMS-911543, NS-018, 화합물 D, TG101348, 화합물 E, 화합물 F, 화합물 G, 화합물 H 및 화합물 I로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물.
· 시롤리무스, 및 레스타우르티닙, 룩솔리티닙, SB1518, CYT387, LY3009104, INC424, LY2784544, BMS-911543, NS-018, 화합물 D, TG101348, 화합물 E, 화합물 F, 화합물 G, 화합물 H 및 화합물 I로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물.
· 조타롤리무스, 및 레스타우르티닙, 룩솔리티닙, SB1518, CYT387, LY3009104, INC424, LY2784544, BMS-911543, NS-018, 화합물 D, TG101348, 화합물 E, 화합물 F, 화합물 G, 화합물 H 및 화합물 I로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물.
· 비올리무스, 및 레스타우르티닙, 룩솔리티닙, SB1518, CYT387, LY3009104, INC424, LY2784544, BMS-911543, NS-018, 화합물 D, TG101348, 화합물 E, 화합물 F, 화합물 G, 화합물 H 및 화합물 I로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물.
추가적인 측면에서, 본 발명은 하기를 제공한다:
· 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한, (a) 활성 성분들이 각 경우 유리 형태 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 임의의 수화물 형태로 존재하는 본 발명의 조합물, 및 임의로 1종 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조합물;
· 합쳐서 증식성 질환에 대하여 치료 유효한 양의 본 발명의 조합물, 및 1종 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물;
· 증식성 질환의 치료를 위한 본 발명의 조합물의 용도;
· 증식성 질환 치료용 의약의 제조를 위한 본 발명의 조합물의 용도;
· PI3K 억제제가 화합물 A, 화합물 B, 화합물 C, 라파마이신, 템시롤리무스, 에베롤리무스, 템시롤리무스, 리다포롤리무스, MK-8669, 시롤리무스, 조타롤리무스 및 비올리무스에서 선택되는 것인, 본 발명의 조합물의 용도; 및
· JAK2-STAT5 경로를 조절하는 화합물이 JAK2를 억제하는 화합물, 예를 들어 레스타우르티닙, 룩솔리티닙, SB1518, CYT387, LY3009104 (INCB28050), INC424 (INCB01842로도 알려져 있음), LY2784544, BMS-911543, NS-018 또는 TG101348인, 본 발명의 조합물의 용도.
또한, 특히 본 발명은 (a) 포스포이노시티드 3-키나제 억제제 화합물의 하나 이상의 단위 투여 형태 및 (b) JAK2-STAT5 경로를 조절하는 화합물을 포함하는 조합 제제에 관한 것이다.
또한, 특히 본 발명은 증식성 질환 치료용 의약의 제조를 위한, (a) 포스포이노시티드 3-키나제 억제제 화합물 및 (b) JAK2-STAT5 경로를 조절하는 화합물을 포함하는 조합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 조합물에서 사용되는 각 조합 파트너의 유효 투여량은 사용되는 구체적인 화합물 또는 제약 조성물, 투여 양식, 치료되는 병태, 치료되는 병태의 중증도에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 발명의 조합물의 투여 요법은 투여 경로, 및 환자의 신장 및 간 기능을 포함한 다양한 인자들에 따라 선택된다. 일반 숙련도의 의사, 임상의 또는 수의사라면, 병태의 진행을 예방, 극복 또는 중지시키는 데에 요구되는 단일 활성 성분의 유효량을 용이하게 결정하여 처방할 수 있다. 독성 없이 효능을 산출하는 범위 내의 활성 성분 농도를 달성함에 있어서의 최적의 정밀도는 표적 부위에 대한 활성 성분 가용성의 동역학을 바탕으로 하는 처방계획을 필요로 한다.
본 발명의 조합물에서 사용되는 조합 파트너가 단일 약물로서의 시판 형태로 적용될 때, 본원에서 다르게 언급되지 않는 경우, 그의 투여량 및 투여 양식은 본원에서 기술되는 유익한 효과를 초래하도록 각 시판 약물의 패키지 삽입물에 제공되어 있는 정보에 따라 이루어질 수 있다.
화합물 A는 약 50 내지 1000 mg/일의 가변적인 투여량 범위로 인간에게 투여될 수 있다. 화합물 B는 약 25 내지 800 mg/일의 가변적인 투여량 범위로 인간에게 투여될 수 있다. 화합물 C는 약 25 내지 800 mg/일의 가변적인 투여량 범위로 인간에게 투여될 수 있다.
실시예에서 입증되는 바와 같이, 본원에서 사용될 때의 "화합물"이라는 용어에는 표적 유전자의 발현을 감소시키거나 침묵화하는(silencing) siRNA도 포함된다. "RNAi"는 동물 및 식물에서의 서열 특이적 전사-후 유전자 침묵화 과정이다. 그것은 이중-가닥이며 서열이 침묵화되는 (표적) 유전자와 상동성인 소형 간섭 RNA 분자(siRNA)를 사용한다. 따라서, 표적 유전자의 전사에 의해 생성된 mRNA와의 siRNA 분자의 서열 특이적 결합이 매우 특이적이고 표적화된 유전자 발현의 녹다운(knockdown)을 가능케 한다. 본 발명에 따른 "siRNA" 또는 "소형-방해 리보핵산"은 하기의 측면을 포함한 업계에 알려져 있는 의미를 가진다. siRNA는 생리적 조건하에서 상보성 영역을 따라 혼성화되는 2개의 리보뉴클레오티드 가닥으로 구성된다. 가닥들은 보통 분리되어 있다. 2개의 가닥이 세포에서 별도의 역할을 하기 때문에, 한 가닥은 "가이드(guide)" 서열로도 알려져 있는 "안티-센스" 가닥으로 지칭되며, 그것을 절단을 위한 올바른 mRNA로 안내하는 기능성 RISC 복합체에서 사용된다. 그것이 RNA 화합물과 관련되기 때문에, 이와 같은 "안티-센스"의 사용은 본 명세서의 다른 어딘가에서 언급되는 안티센스 표적 DNA 화합물과는 다르다. 다른 하나의 가닥은 "안티-가이드" 서열로 알려져 있는데, 그것이 표적 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열을 함유하고 있기 때문에, 센스 가닥으로도 알려져 있다. 소정 실시양태에서는, 상기 가닥들이 분자 링커에 의해 연결될 수 있다. 개별 리보뉴클레오티드들은 비변형 자연 발생 리보뉴클레오티드, 비변형 자연 발생 데옥시리보뉴클레오티드일 수 있거나, 또는 본원의 다른 어딘가에서 기술되는 바와 같이 그것이 화학적으로 변형되거나 합성될 수도 있다.
일부 실시양태에서, siRNA 분자는 표적 유전자 코딩 서열의 1개 이상 영역과 실질적으로 동일해서, 유전자의 하향-조절을 가능케 한다. 일부 실시양태에서, siRNA 분자의 서열과 표적으로 하는 유전자 영역 사이의 동일성 정도는 60% 이상 서열 동일성이며, 일부 실시양태에서는 75% 이상 서열 동일성, 예를 들어 85% 동일성, 90% 동일성 이상, 95% 이상 동일성, 97% 이상 또는 99% 이상 동일성이다. 상이한 아미노산/폴리펩티드/핵산 서열들 사이의 % 동일성의 계산은 하기와 같이 수행될 수 있다. 먼저, 클러스탈X(ClustalX) 프로그램 (쌍별 파라미터: 간극 개방 10.0, 간극 연장 0.1, 단백질 매트릭스 가넷(gonnet) 250, DNA 매트릭스 IUB; 다중 파라미터: 간극 개방 10.0, 간극 연장 0.2, 지연 분기 서열 30%, DNA 변이 중량 0.5, 음성 매트릭스 오프, 단백질 매트릭스 가넷 시리즈, DNA 중량 IUB; 단백질 간극 파라미터, 잔기-특이적 페널티 온, 친수성 페널티 온, 친수성 잔기 GPSNDQERK, 간극 분리 거리 4, 말단 간극 분리 오프)에 의해 다중 정렬(multiple alignment)이 생성된다. 다음에, (N/T)*100으로서 다중 정렬로부터 % 동일성이 계산되는데, 여기서 N은 2개의 서열이 동일한 잔기를 공유하는 위치의 수이며, T는 비교되는 총 위치의 수이다. 다르게는, % 동일성은 (N/S)*100으로서 계산될 수 있는데, 여기서 S는 비교되는 더 짧은 서열의 길이이다. 아미노산/폴리펩티드/핵산 서열은 새로 합성될 수 있거나, 또는 천연 아미노산/폴리펩티드/핵산 서열, 또는 이들의 유도체일 수 있다. 실질적으로 유사한 뉴클레오티드 서열은 엄격한 조건하에서 본원에서 언급되는 핵산 서열들 중 어느 것 또는 그의 상보체에 혼성화되는 서열에 의해 코딩될 것이다. 엄격한 조건이란, 뉴클레오티드가 대략 45℃에서 6× 나트륨 클로라이드/나트륨 시트레이트 (SSC) 중 필터-결합 DNA 또는 RNA에 혼성화된 후, 이어서 0.2× SSC/0.1% SDS 중에서 대략 5-65℃로 1회 이상 세척된다는 것을 의미한다. 다르게는, 실질적으로 유사한 폴리펩티드는 1개 이상, 5, 10, 20, 50 또는 100개 미만 아미노산으로 본 발명에 따른 펩티드 서열과 다를 수 있다. 유전자 코드의 축퇴성으로 인하여, 그에 의해 코딩되는 단백질의 서열에 실질적으로 영향을 주지 않으면서도 소정의 핵산 서열이 변화 또는 변경됨으로써 그의 기능성인 변이체를 제공할 수 있다는 것은 분명하다. 적합한 뉴클레오티드 변이체는 서열 내에서 동일한 아미노산을 코딩하는 상이한 코돈의 치환에 의해 변경된 서열을 가짐으로써 침묵 변화를 산출하는 것들이다. 다른 적합한 변이체는 상동성인 뉴클레오티드 서열을 가지나, 그것이 치환하는 아미노산과 유사한 생물물리학적 특성의 측쇄를 가지는 아미노산을 코딩하는 상이한 코돈의 치환에 의해 변경되어 보존성 변화를 산출하는 서열의 전체 또는 일부를 포함하는 것들이다. 예를 들어, 소형의 비-극성이며 소수성인 아미노산에는 글리신, 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린 및 메티오닌이 포함되며; 대형의 비-극성이며 소수성인 아미노산에는 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신이 포함되고; 극성의 중성 아미노산에는 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴 및 글루타민이 포함되며; 양으로 하전된 (염기성) 아미노산에는 리신, 아르기닌 및 히스티딘이 포함되고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산에는 아스파르트산 및 글루탐산이 포함된다. 단백질 또는 DNA 서열의 정확한 정렬은 복잡한 과정으로써, 수많은 연구자들에 의해 상세하게 조사된 바 있다. 특히 중요한 것은 최적 서열 정합(matching)과 그와 같은 정합을 수득하기 위한 간극 도입 사이의 절충이다. 단백질의 경우, 정합이 점수화되는 수단 역시 중요하다. 팸(PAM) 매트릭스 (예컨대 문헌 [Dayhoff, M. et al., 1978, Atlas of protein sequence and structure, Natl. Biomed. Res. Found.]) 및 블로섬(BLOSUM) 매트릭스 계열이 보존성 치환의 특성 및 가능성을 정량함으로써 다중 정렬 알고리즘에 사용되고 있지만, 업계 숙련자에게는 다른 동일하게 적용가능한 매트릭스들이 알려져 있을 것이다. 대중적인 다중 정렬 프로그램인 클러스탈W 및 그의 윈도우 버젼인 클러스탈X (문헌 [Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680]; [Thompson et al., 1997, Nucleic Acids Research, 24, 4876-4882])는 단백질 및 DNA의 다중 정렬을 생성시키는 효율적인 방법이다. 자동으로 생성되는 정렬은 종종 연구되는 단백질 족에 대한 훈련된 사용자의 지식, 예를 들어 핵심 보존 부위에 대한 생물학적 지식을 활용한 수동 정렬을 필요로 한다. 한 가지 그와 같은 정렬 편집 프로그램으로 얼라인(Align) (문헌 [http://www.gwdg.de/dhepper/download/; Hepperle, D., 2001: Multicolor Sequence Alignment Editor. Institute of Freshwater Ecology and Inland Fisheries, 16775 Stechlin, Germany])이 있지만, 잘뷰(JalView) 또는 시네마(Cinema)와 같은 다른 것들 역시 적합하다. 단백질들 사이의 % 동일성의 계산은 다중 정렬의 생성 동안 클러스탈에 의해 이루어진다. 그러나, 정렬이 수동으로 개선된 경우에, 또는 2종 서열의 정교한 비교를 위해서는 해당 값이 재계산될 필요가 있다. 정렬 내에서 단백질 서열 쌍에 대하여 이와 같은 값을 계산하는 프로그램에는 아미노산 치환 (P)을 위한 모델로서의 "유사성 표" 선택사항을 사용하는 필립(PHYLIP) 계통발생학 패키지 (문헌 [Felsenstein; http://evolution.gs.washington.edu/phylip.html]) 내의 프로트디스트(PROTDIST)가 포함된다. DNA/RNA의 경우, 필립의 디엔에이디스트(DNADIST) 프로그램 내에 동일한 선택사항이 존재한다. 본 발명에 따른 dsRNA 분자는 표적 유전자 mRNA의 영역과 실질적으로 동일한 이중-가닥 영역을 포함한다. 표적 유전자의 상응 서열과 100% 동일성을 가지는 영역이 적합하다. 이와 같은 상태는 "완전히 상보성인" 것으로 지칭된다. 그러나, 영역은 표적 유전자의 상응하는 영역과 비교하였을 때 표적으로 하는 mRNA의 영역 길이에 따라 1개, 2개 또는 3개의 부정합(mismatch)을 함유할 수도 있으며, 그에 따라 완전히 상보성은 아닐 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 RNA 분자는 구체적으로 1종의 주어진 유전자를 표적으로 한다. 원하는 mRNA 만을 표적으로 하기 위하여, siRNA 시약은 표적 mRNA에 대해서는 100% 상동성을 가지며, 세포 또는 생물체에 존재하는 다른 모든 유전자들에 대해서는 2개 이상의 부정합 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 특정 표적 서열의 발현을 효과적으로 억제하기 위하여 충분한 서열 동일성을 가지는 siRNA를 분석 및 확인하는 방법에 대해서는 업계에 알려져 있다. 서열 동일성은 업계에 알려져 있는 서열 비교 및 정렬 알고리즘 (문헌 [Gribskov and Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991] 및 거기에 인용되어 있는 참고문헌 참조), 및 예를 들어 디폴트 파라미터들 (예컨대 위스콘신 대학교 유전학 전산 그룹)을 사용하여 베스트핏(BESTFIT) 소프트웨어 프로그램에서 실행되는 바와 같은 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 알고리즘에 의해 뉴클레오티드 서열들 사이의 % 차이를 계산하는 것에 의해 최적화될 수 있다. 본 발명에 있어서, 표적에 상보성인 siRNA 영역의 길이는 10 내지 100개 뉴클레오티드, 12 내지 25개 뉴클레오티드, 14 내지 22개 뉴클레오티드, 또는 15, 16, 17 또는 18개 뉴클레오티드일 수 있다. 상응하는 표적 영역에 대한 부정합이 존재하는 경우, 상보성 영역의 길이는 일반적으로 다소 길어질 필요가 있다. 한 실시양태에서, 억제제는 siRNA 분자로써, 대략 5 bp 내지 50 bp 사이, 일부 실시양태에서는 10 bp 내지 35 bp 사이, 또는 15 bp 내지 30 bp 사이, 예를 들어 18 bp 내지 25 bp 사이를 포함한다. 일부 실시양태에서, siRNA 분자는 20 초과 내지 23 bp 미만을 포함한다.
siRNA가 돌출 말단 (표적에 대하여 상보성일 수 있거나 그렇지 않을 수 있음), 또는 표적 유전자가 아닌 자신에 대하여 상보성인 추가 뉴클레오티드들을 보유할 수 있기 때문에, siRNA 각 개별 가닥의 총 길이는 10 내지 100개 뉴클레오티드, 15 내지 49개 뉴클레오티드, 17 내지 30개 뉴클레오티드 또는 19 내지 25개 뉴클레오티드일 수 있다. "각 가닥이 49개 뉴클레오티드 이하임"이라는 구는 모든 변형 또는 비변형 뉴클레오티드는 포함하나 가닥의 3' 또는 5' 말단에 첨가될 수 있는 임의의 화학적 모이어티는 포함하지 않는 가닥 내 연속 뉴클레오티드들의 총 수를 의미한다. 가닥에 삽입된 짧은 화학적 모이어티가 계수되지는 않지만, 2개의 개별 가닥을 연결하도록 설계되는 화학적 링커는 연속 뉴클레오티드를 생성시키는 것으로 간주되지 않는다.
"5' 말단 및 3' 말단 중 1개 이상에서 돌출되는 1 내지 6개 뉴클레오티드"라는 구는 생리적 조건하에서 2개의 개별 가닥으로부터 형성되는 상보성 siRNA의 구조를 지칭한다. 말단 뉴클레오티드들이 siRNA 이중-가닥 영역의 일부인 경우, siRNA는 평활 말단인 것으로 간주된다. 1개 이상의 뉴클레오티드가 말단에서 쌍을 이루지 않는 경우, 돌출이 생성된다. 돌출 길이는 돌출되는 뉴클레오티드의 수에 의해 측정된다. 돌출되는 뉴클레오티드는 양 가닥의 5' 말단 또는 3' 말단 중 어느 하나 상의 것일 수 있다.
본 발명에 따른 siRNA는 높은 생체내 안정성을 나타내므로, 가닥들 중 1개 이상에 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함시키는 것에 의한 경구 전달용으로 특히 적합할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 siRNA는 1개 이상의 변형 또는 비-자연 리보뉴클레오티드를 함유한다. 많은 공지의 화학적 변형에 대한 장황한 기술들이 공개된 PCT 특허 출원 WO200370918호에 제시되어 있다. 전달을 위한 적합한 변형에는 화학적 변형이 포함되는데, 하기 중에서 선택될 수 있다: a) 3' 캡; b) 5' 캡; c) 변형된 뉴클레오시드간 연결; 또는 d) 변형된 당 또는 염기 모이어티. 적합한 변형에는 당 모이어티 (즉 당 모이어티의 2' 위치, 예를 들자면 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE (문헌 [Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504]), 즉 알콕시알콕시 기), 또는 염기 모이어티 (즉 상대 뉴클레오티드 사슬의 또 다른 특이적 염기와 쌍을 이루는 능력을 유지하는 비-자연 또는 변형 염기)의 변형이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 변형에는 비제한적으로 포스포에스테르 기 (인접 리보뉴클레오티드들을 연결함)를 예를 들어 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트로 대체하는 것을 포함한 소위 '백본(backbone)' 변형이 포함된다. 본원에서 때로는 3' 캡 또는 5' 캡으로 지칭되는 말단 변형은 중요할 수 있다. 캡은 단순히 siRNA에 안정성을 부여하는 것으로 밝혀진 바 있는 "T-T"와 같은 추가적인 뉴클레오티드를 첨가하는 것으로 구성될 수 있다. 캡은 업계 숙련자에게 알려져 있는 더욱 복잡한 화학으로 구성될 수도 있다.
적합한 siRNA 분자의 설계는 복잡한 과정으로써, 표적 mRNA 분자의 서열을 매우 신중하게 분석하는 것을 포함한다. siRNA의 한 가지 대표적인 설계 방법이 WO2005/059132호에 예시되어 있다. 다음에, 상당한 발명상의 노력을 기울여, 발명자들은 소정의 뉴클레오티드 염기 조성을 가짐으로써 RNA 방해를 야기하는 데에 요구되는 친화성 및 또한 안정성을 가지게 되는 정해진 siRNA 서열을 선택해야 한다. siRNA 분자는 새로 합성되거나, 또는 미생물에 의해 생산되는 것 중 어느 하나일 수 있다. 예를 들어, siRNA 분자는 박테리아, 예를 들어 이. 콜라이(E. coli)에 의해 생산될 수 있다. 1개 이상의 변형 또는 비-자연 리보뉴클레오티드를 함유하는 siRNA를 포함한 siRNA의 합성 방법에 대해서는 잘 알려져 있으며, 업계 숙련자에게 용이하게 가용하다. 예를 들어, 공개된 PCT 특허 출원 WO2005021749호 및 WO200370918호에 다양한 합성 화학들이 제시되어 있다. 반응은 용액 중에서, 또는 일부 실시양태에서는 고체 상에서, 또는 중합체 지지된 시약을 사용하여 수행될 수 있으며, 이후 RNAi를 매개할 수 있는 siRNA 분자가 형성되는 조건하에서 합성된 RNA 가닥들을 조합하는 것이 이어질 수 있다. siNA (소형 간섭 핵산)는 우라실 (siRNA) 또는 티미딘 (siDNA)을 포함할 수 있다는 것을 알아야 한다. 따라서, 상기에서 언급되는 바와 같은 뉴클레오티드 U 및 T는 호환될 수 있다. 그러나, siRNA가 사용되는 것이 바람직하다. 의혹을 방지하기 위하여, 본원에서 사용될 때의 siRNA라는 용어에는 miRNA, shRNA 및 shRNAmir도 포함된다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용되는 유전자-침묵화 분자, 즉 억제제는 핵산 (예컨대 siRNA 또는 안티센스 또는 리보자임)이다. 그와 같은 분자는 (반드시는 아니지만) 치료되는 대상체 세포의 DNA에 도입되는 것일 수 있다. 비분화 세포는 유전자-침묵화 분자에 의해 안정하게 형질전환됨으로써 유전적으로 변형된 딸 세포 (이 경우, 예컨대 특정 전사 인자 또는 유전자 활성화제를 사용한 대상체에서의 발현의 조절이 필요할 수 있음)의 생성으로 이어질 수 있다. 유전자-침묵화 분자는 새로 합성되거나, 또는 표적 세포에서 유전자-침묵화 (예컨대 RNA 방해에 의함)를 유도하기에 충분한 양으로 도입되는 것 중 어느 하나일 수 있다. 다르게는, 분자는 미생물 예컨대 이. 콜라이에 의해 생산된 다음 표적 세포에서 유전자 침묵화를 유도하기에 충분한 양으로 도입될 수 있다. 상기 분자는 유전자-침묵화 서열을 코딩하는 핵산을 보유하는 벡터에 의해 제조될 수 있다. 상기 벡터는 핵산의 발현을 조절 및/또는 강화할 수 있는 요소를 포함할 수 있다. 벡터는 재조합 벡터일 수 있다. 벡터는 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 파지 또는 바이러스 DNA를 포함할 수 있다. 유전자-침묵화 분자를 합성하는 데에 벡터를 사용하는 것 이외에도 또는 그 대신, 벡터는 유전자 침묵화 서열을 사용하여 표적 세포를 형질전환시키기 위한 전달 시스템으로 사용될 수 있다.
재조합 벡터는 다른 기능적 요소도 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 벡터는 표적 세포에서 벡터가 자동으로 복제되도록 설계될 수 있다. 이와 같은 경우에는, 핵산 복제를 유도하는 요소가 재조합 벡터에 필요할 수 있다. 다르게는, 재조합 벡터는 벡터와 재조합 핵산 분자가 표적 세포의 게놈에 통합되도록 설계될 수 있다. 이와 같은 경우에는, 표적화된 통합 (예컨대 상동 재조합에 의함)을 선호하는 핵산 서열이 바람직하다. 재조합 벡터는 클로닝 과정에서 선택가능 마커로 사용될 수 있는 유전자를 코딩하는 DNA를 가질 수도 있다. 재조합 벡터는 필요한 만큼 핵산의 발현을 조절하는 프로모터 또는 조절인자 또는 인핸서(enhancer)를 포함할 수도 있다. 조직 특이적 프로모터/인핸서 요소가 특정 세포 유형 예컨대 내피 세포에서의 핵산의 발현을 조절하는 데에 사용될 수도 있다. 프로모터는 상시성 또는 유도성일 수 있다.
다르게는, 유전자 침묵화 분자는 그것이 벡터에 도입되거나 도입되지 않고도 대상체의 표적 세포 또는 조직에 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 분자는 리포솜 또는 바이러스 입자 (예컨대 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스, 폭스 바이러스, 박시나 바이러스, 아데노바이러스, 렌티바이러스 등) 내에 도입될 수 있다. 다르게는, "네이키드(naked)" siRNA 또는 안티센스 분자가 적합한 수단, 예컨대 직접 세포내이입 흡수에 의해 대상체의 세포에 삽입될 수 있다.
유전자 침묵화 분자는 형질감염, 감염, 미세주사, 세포 융합, 원형질체 융합 또는 탄도 충격(ballistic bombardment)에 의해 치료될 대상체의 세포에 전달될 수도 있다. 예를 들어, 전달은 하기에 의한 것일 수 있다: 코팅된 금 입자에 의한 탄도 형질감염; siNA 분자를 함유하는 리포솜; 유전자 침묵화 서열을 포함하는 바이러스 벡터; 또는 직접적인 유전자 침묵화 분자의 적용에 의한 직접 핵산 흡수 (예컨대 세포내이입)를 제공하는 수단. 본 발명의 한 실시양태에서, siNA 분자는 표적 세포 (벡터 내의 것인지 "네이키드"인지에 관계없이)에 전달된 다음, 숙주 세포에 의존하여 복제됨으로써 치료 유효한 수준에 도달할 수 있다. 이러한 경우, 일부 실시양태에서, siNA는 세포 내에서 siNA가 전사되는 것을 가능케 하게 되는 발현 카세트에 도입된 다음 번역을 방해한다 (표적 유전자 생성물을 코딩하는 내생 mRNA의 파괴를 유도하는 것에 의함).
하기의 실시예는 상기한 본 발명을 예시하는 것이나; 어떠한 방식으로도 그것으로써 본 발명의 영역을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 발명의 조합물의 유익한 효과는 관련 업계의 숙련자에게 그렇다고 알려져 있는 다른 시험 모델에 의해 측정될 수도 있다.
도면 범례
도 1. 화합물 A에 의한 이중 PI3K / mTOR 억제는 시험관내 및 생체내에서 JAK2/STAT5를 활성화함. (A) 표시되어 있는 바와 같이 화합물 A (BEZ-235)를 사용하여 처리된 3종의 상이한 유방암 세포주에서 수행된 시간-추이 실험에 따른 용해물의 이뮤노블롯 (인간 세포주: MDA 468 및 MDA 231 LM2). 생체내 데이터의 경우, 이종이식편을 보유하는 SCID/베이지 마우스를 표시된 시점에서의 절제 전에 비히클 또는 30 mg/kg의 화합물 A로 1회 처리하였다. (B) siRNA에 의해 JAK2 및 JAK1이 고갈된 MDA 468 및 MDA 231 LM2 인간 세포주 유래 용해물의 이뮤노블롯. siNT = 비-표적 대조 siRNA이다. (C) siRNA (좌측 패널) 또는 JAK2-특이적 억제제 BSK-805 (화합물 D) (우측 패널)에 의해 JAK2/STAT5 신호전달이 차단된 8시간-BEZ 처리 MDA 468 세포 유래 용해물의 이뮤노블롯. pJAK2는 ELISA에 의해 측정한 후, 총 JAK2 수준에 대하여 표준화하였다. 농도측정 정량은 총 STAT5에 대하여 표준화된 pSTAT5에 대해 제공된다.
도 2. 화합물 A와 JAK2 억제제 화합물 D의 조합물은 세포 생존력을 감소시켜 아폽토시스를 촉발함. (A) 저혈청 조건 (0.5%)하에서 성장되고 300 nM의 BEZ (화합물 A) 및/또는 350 nM의 BSK (화합물 D)를 사용하여 그대로 72시간 동안 처리된 세포주의 WST-1 생존 검정에 의해 측정하였을 때의 세포 생존력의 평균 백분율을 보여주는 막대 그래프 (좌측 패널). 처리 8시간 후의 동일 세포주 유래 용해물의 이뮤노블롯 (우측 패널). 데이터는 4회 개별 실험의 평균 ± SD이며; *P < 0.05, **P < 0.01이다. (B) 단일 및 조합 처리 20시간 후의 3종 세포주 유래 용해물의 이뮤노블롯. (C) 300 nM의 BEZ (화합물 A) 및/또는 350 nM의 BSK (화합물 D)를 사용하여 표시되어 있는 바와 같이 처리된 아넥신(Annexin)V 및 PI 염색 세포의 FACS 분석법에 의해 측정하였을 때의 처리 48시간 후 아폽토시스 세포의 평균 백분율을 보여주는 막대 그래프 (좌측). 300 nM의 BEZ (화합물 A) 및/또는 350 nM의 BSK (화합물 D)를 사용하여 24시간 동안 처리된 세포 유래 용해물의 이뮤노블롯 (우측). 데이터는 평균 ± SD (n=5, *P < 0.05, **P < 0.01)이다. (C) 300 nM의 BEZ 및/또는 350 nM의 BSK를 사용하여 표시되어 있는 바와 같이 처리된 아넥신(Annexin)V 및 PI 염색 세포의 FACS 분석법에 의해 측정하였을 때의 처리 48시간 후 아폽토시스 세포의 평균 백분율을 보여주는 막대 그래프 (좌측). 300 nM의 BEZ 및/또는 350 nM의 BSK를 사용하여 24시간 동안 처리된 세포 유래 용해물의 이뮤노블롯 (우측). 데이터는 평균 ± SD (n=5, *P < 0.05, **P < 0.01)이다.
도 3. 화합물 A (이중 PI3K / mTOR 억제)는 유방암에서 IL -8 분비를 유도함. (A) BEZ-처리된 세포 유래의 가용성 인자가 JAK2/STAT5를 활성화한다. 나타낸 것은 300 nM의 BEZ를 사용하여 24시간 동안 처리된 세포 유래의 컨디셔닝된 배지를 사용하여 30분 동안 처리된 세포의 용해물의 이뮤노블롯이다. 컨디션 배지에 존재하는 BEZ에 대한 대조로는, BEZ를 함유하는 배지를 사용하여 처리된 세포의 용해물 (SN BEZ ctrl)을 사용하였다. (B) BEZ를 사용한 유방암 세포 처리시 IL-8이 분비된다. 각각 300 nM BEZ를 사용하여 24시간 동안 처리된 세포, 또는 30 mg/kg의 BEZ를 사용하여 10일 동안 처리된 동종이식편 보유 마우스의 상청액 (상부 패널) 또는 종양 용해물 (저부 패널)에서의 표시되어 있는 시토카인의 발현을 보여주는 시토카인 정렬. 마우스 MIP2는 인간 IL-8의 기능성 상동체이다. (C) BEZ 처리시의 IL-8 과발현의 동역학. 300 nM의 BEZ를 사용하여 표시되어 있는 바와 같이 처리된 세포에서의 IL-8 분비 (좌측 패널) 및 mRNA 상향조절 (우측 패널)의 시간별 추이를 보여주는 막대 그래프. IL-8의 수준은 각각 ELISA 및 RQ-PCR에 의해 측정하여, 평균 ± SD (n=4, *P < 0.05)로 나타내었다. (D) BEZ는 유방암 세포주 패널에서 IL-8 분비 및 JAK2/STAT5의 인산화를 증가시켰다. 300 nM의 BEZ-235를 사용하여 8시간 동안 처리된 삼중 음성 및 발광 유방암 세포주 패널에서의 IL-8 분비와 JAK2 활성화 사이의 상관관계 그래프 (계수 = 0.77) (표 1 참조).
도 4. 화합물 A ( PI3K / mTOR 억제)는 JAK2 / STAT5 의 2단계 활성화를 유도함. (A) 단독, 또는 용해 30분 전에 첨가된 IgG 또는 CXCR1 차단 항체와의 조합물로써의 DMSO 또는 300 nM BEZ를 사용하여 처리된 세포 유래 용해물의 이뮤노블롯. (B) 300 nM의 BEZ를 사용하여 표시되어 있는 바와 같이 처리된 세포 유래 용해물의 이뮤노블롯. (C) DMSO 또는 300 nM BEZ를 사용하여 8시간 동안 처리된 세포 유래 용해물의 면역침전 (IP) 및 이뮤노블롯팅. WCL: 전 세포 용해물. (D) DMSO 또는 300 nM BEZ를 사용한 8시간 동안의 처리 전에 siRNA에 의해 IRS1이 고갈된 세포 유래 용해물의 이뮤노블롯. siNT는 비-표적화 siRNA를 지칭한다. (E) 300 nM의 BEZ 및/또는 350 nM의 BSK를 사용한 20시간 (좌측) 또는 8시간 (우측) 동안의 처리시 IL-8 분비 (좌측) 및 mRNA (우측)의 수준을 보여주는 막대 그래프. IL-8의 수준은 각각 ELISA 및 RQ-PCR에 의해 측정하여, 평균 ± SD (n=4, *P < 0.05)로 나타내었다.
도 5. PI3K / mTOR (화합물 A)와 JAK2 / STAT5 (화합물 D)를 공동표적화하는 것은 일차 종양 성장 및 전이를 감소시킴. (A)-(D) 비히클 대조 (VHC), 30 mg/kg의 BEZ, 120 mg/kg의 BSK, 또는 25 mg/kg의 BEZ와 100 mg/kg의 BSK를 사용하여 처리된 마우스의 종양 성장 곡선, 및 종양 용해물 이뮤노블롯. C에서, JAK2는 JAK2 shRNA (shJAK2)의 활성화로 이어지는 독스(dox) 투여에 의해 억제된다. shNT는 비-표적화 shRNA를 지칭하며, 주사는 동소 세포 주사를 지칭하고, 화살표는 처리 및/또는 독스 투여의 개시를 표시한다. B에서 나타낸 것은 처리 종료 1일 전의 루시퍼라제 발현 MDA 231 LM2 종양의 대표적인 생물발광 영상이다. 이뮤노블롯팅은 MDA 468의 경우 처리 14일, MDA 231 LM2의 경우 처리 10일, 및 4T-1의 경우 처리 6일 후에 수확된 종양에서 수행하였다. 결과는 평균 종양 부피 ± SEM (n=4-8, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001)으로 나타내었다. (E) A-D에서와 같이 처리 개시 21일 (MDA 231 LM2) 또는 5일 (4T-1) 후에 수행된 꼬리 정맥 혈액에서의 GFP+ 세포의 FACS 분석법에 의해 측정하였을 때의 순환성 종양 세포 (CTC)의 수를 보여주는 막대 그래프. 데이터는 105 말초 혈액 세포 (PBC)에 대하여 표준화된 GFP+ CTC로 나타내었는데, 평균 ± SEM (n=4)이다. (F) 상부 좌측 및 중간: B-C에서와 같이 처리된 종양 보유 마우스 유래 일차 종양의 제거 4주 후 수확된 폐의 대표적인 영상. 상부 우측: D와 같은 처리 19일 후 종양 보유 마우스로부터 수확된 폐의 대표적인 영상. 막대 그래프는 B-D에서와 같이 처리된 마우스의 전이 지수를 나타낸다. 전이 지수는 눈에 보이는 폐 전이 결절의 총 수를 종양 부피로 나누는 것에 의해 계산하였다. 결과는 평균 ± SD (n=4-8, *P < 0.05, **P < 0.01)로 나타내었다.
도 6. 생체내에서의 IL -8 분비는 화합물 A ( BEZ ) 처리시 강화되며, 화합물 D ( JAK2 / STAT5 차단)에 의해 감소됨 . (A) 도 5A-D에서와 같이 처리된 마우스의 종양에서 ELISA (좌측 및 중간) 또는 시토카인 정렬 정량 (우측)에 의해 측정된 IL-8 수준을 보여주는 막대 그래프. 결과는 평균 ± SD (n=3-8)이다. (B) 도 5A-C에서와 같이 처리된 종양 보유 마우스의 혈장에서 ELISA에 의해 측정된 IL-8 수준을 보여주는 막대 그래프. 결과는 평균 ± SD (n=4)이다. (C) PI3K/mTOR의 억제에 의해 촉발되는 확인된 양성 피드백 루프, 및 JAK2/STAT5 억제에 의한 그의 차단을 도시하는 개략도.
도 7. 화합물 A ( BEZ 처리)는 인간 일차 삼중-음성 유방 종양에서 JAK2/STAT5 및 IL -8 분비를 활성화함. (A) 면역결핍 마우스에서 성장되고 30 mg/kg의 BEZ 또는 비히클 (VHC)을 사용하여 4일 동안 처리된 일차 삼중-음성 유방 종양 유래 용해물의 이뮤노블롯. (B) 30 mg/kg의 BEZ 또는 비히클 (VHC)을 사용한 처리 3일차에 마우스로부터 유래하는 절제된 종양, 또는 마우스의 혈장에서 ELISA에 의해 측정된 IL-8 수준을 보여주는 막대 그래프.
도 8. 이중 PI3K / mTOR 억제는 물론, 단일 PI3K 또는 단일 mTOR 억제도 JAK2/STAT5를 활성화함. (A) 표시되어 있는 바와 같은 BEZ 처리를 사용한 시간-추이 실험으로부터의 세포 용해물의 이뮤노블롯. (B) 표시되어 있는 바와 같은 RAD001 또는 BKM120 처리를 사용한 시간-추이 실험으로부터의 세포 용해물의 이뮤노블롯.
도 9. 조합된 PI3K / mTOR 및 JAK2 / STAT5 억제는 세포 생존력을 감소시킴. (A) 300 nM의 화합물 A (BEZ) 및/또는 350 nM의 화합물 D (BSK)를 사용하여 48시간 동안 처리된 3종 유방암 세포주의 FACS 세포 주기 분석. 데이터는 평균 ± SD (n=4, *P < 0.05, **P < 0.01)이다. (B) 및 (C) 최대 혈청 조건 (10% FCS)에서의 300 nM의 화합물 A (BEZ) 및/또는 350 nM의 화합물 D (BSK)를 사용한 처리, 또는 저혈청 조건 (0.5% FCS)에서의 화합물 A (BEZ) 및 독시시클린-유도성 JAK2 하향조절을 사용한 처리 72시간 후의 WST-1 생존 검정을 보여주는 막대 그래프. 양 세포주에서 JAK2의 녹-다운을 보여주는 세포 용해물의 이뮤노블롯 ((C), 우측 패널).
도 10. IL -8 수용체 CXCR1 이 유방암 세포에서 발현되며, IL -8은 JAK2 / STAT5 를 활성화함. (A) 세포에서의 CXCR1 표면 수용체의 존재를 확인해 주는, MDA 468 (상부 패널) 및 MDA 231 LM2 (저부 패널)에서의 2종의 IL-8 수용체 CXCR1 및 CXCR2 발현 수준의 FACS 분석을 보여주는 막대 그래프. 데이터는 평균 ± SD (n=3, *P < 0.05, **P < 0.01)이다. (B) 재조합 시토카인 (IL-8, IL-6, G-CSF 10 ng/ml, EPO 20 단위/ml)을 사용한 자극 30분 후에 용해된 세포의 이뮤노블롯.
도 11. 이중 PI3K / mTOR 및 JAK / STAT5 억제는 일차 종양 성장을 감소시키며, 마우스의 체중에 대한 역효과는 가지지 않음. (A) MDA 468 종양 보유 마우스의 체중을 매주 모니터링하였는데, 처리/조합시 유의성 있는 변화는 관찰되지 않았다 (좌측 패널). 가공 전의 절제된 종양의 중량 (우측 패널). 데이터는 각 n=6-8의 평균 ± SEM이다. (B) 증식에 대한 척도로써 H&E 염색 종양 절편상에서 세포분열상(mitotic figure)을 평가하고, 유사분열 지수로 나타내었다. 데이터는 각 n=6-8 종양/처리 군의 평균 ± SEM이다. (C) 처리된 종양에서 pSTAT5, pAKT 및 pS6에 대한 IHC 염색을 수행하고, 대표적인 사진을 나타내었다. (D) MDA 231 LM2 모델에서의 체중 및 종양 중량 ((A) 참조). 데이터는 각 n=7-8의 평균 ± SD이다. (E) 및 (F) 처리 종료시의 처리된 4T-1 종양의 유사분열 지수 ((B) 참조). 데이터는 각 n=5-7 종양/처리 군의 평균 ± SD이다. (G) 처리된 종양에서 pSTAT5, pAKT 및 pS6에 대한 IHC 염색을 수행하고, 대표적인 사진을 나타내었다.
도 12. IL -8 및 JAK2 신호전달은 전이성 세포에서 더 높음. (A) 모 유방암 세포주 (168FARN 및 MDA 231) 대 그의 전이성 하위세포주(subline) (4T-1 및 MDA 231 LM2) 유래 세포 용해물의 이뮤노블롯 및 ELISA 측정치. (B) MDA 231 및 MDA 231 LM2 세포에서의 IL-8 상청액 ELISA 및 IL-8 RQ-PCR을 보여주는 그래프. 나타낸 결과는 평균 ± SD (n=3, *P < 0.05)이다. (C) MDA 231 및 MDA 231 LM2 세포에서의 CXCR1 및 CXCR2 발현의 FACS 분석 사진. 나타낸 결과는 3회 개별 실험의 대표적인 그래프이다. (D) FACS에 의해 측정하였을 때의 처리된 종양에서의 IL-8 수용체 CXCR1의 종료점 발현 수준을 보여주는 막대 그래프, MFI = 평균 형광 강도임. (E) 관강내(luminal) (회색) 및 삼중 음성 세포주 (흑색)의 침습 잠재력에 대하여 블롯팅된 기본 IL-8 분비를 보여주는 그래프.
도 13. 화합물 A ( BEZ )-매개 JAK2 및 IL -8 활성화는 억제제에 대한 감수성과 상관됨. (E) BEZ 비감수성 유방암 세포주 (문헌 [Brachmann et al., 2009])는 감수성 세포주에 비해 더 높은 BEZ-유도 JAK2 인산화 및 IL-8 분비를 나타낸다. BEZ 처리시 pJAK2 (좌측) 및 IL-8 분비 (우측)의 수준, 및 BEZ에 대한 감수성을 바탕으로 블롯팅된 표 1에서와 같은 유방암 세포주를 보여주는 그래프.
도 14. 세포 생존력. 0.5% 혈청하에서 성장되고 300 nM의 BEZ 및/또는 350 nM의 BSK를 사용하여 72시간 동안 처리된 2종의 BEZ-비감수성 세포주 (좌측 패널) 및 2종의 BEZ-감수성 세포주 (우측 패널)의 WST-1 검정에 의해 측정하였을 때의 세포 생존력의 평균 백분율을 보여주는 막대 그래프. 데이터는 평균 ± SEM (n=4, *P < 0.05)이다.
도 15. PI3K / mTOR 와 JAK2 / STAT5 를 공동- 표적화하는 것은 일차 종양 성장, 종양 시딩 및 전이를 감소시킴. (A) 실험 설정의 도면. (B) VHC-, BEZ-, BSK- 및 BEZ/BSK-처리된 동물 유래 폐의 대표적인 IHC 사진. 좌측 패널: 기술된 바와 같이 처리된 MDA 231 LM2-보유 동물 유래의 H&E- (좌측) 및 비멘틴(Vimentin)- (우측) 염색 폐. 축적자 250 ㎛. 우측 패널: 기술된 바와 같이 처리된 4T-1 보유 동물 유래 H&E-염색 폐. 화살표는 전이를 나타내며; 우측의 영상은 단일 전이 부위의 확대도이다. 축적자 200 ㎛.
도 16. (A) 기술된 바와 같이 처리된 마우스 절편 당 비멘틴-양성 폐 면적의 백분율을 보여주는 막대 그래프. 결과는 평균 ± SEM (n=8)으로 나타내었다. (B) BSK는 종양 세포-자율 방식으로 전이를 감소시킨다. 좌측 패널: 실험 설정의 도면. MDA 231 LM2 shJAK2 또는 MDA 231 LM2 shNT 종양을 보유하는 마우스를 기술된 바와 같이 BSK로 처리하였다. 우측 패널: 눈에 보이는 폐 전이 결절의 총 수를 종양 부피로 나누는 것에 의해 계산된 전이 지수를 보여주는 막대 그래프. 결과는 평균 ± SEM (n=3-4, *P < 0.05)으로 나타내었다.
도 17. (A) 마트리겔(Matrigel)-코팅된 보이덴(Boyden) 챔버 상에 시딩되고 300 nM의 BEZ, 350 nM의 BSK 및/또는 CXCR1 차단 항체를 사용하여 처리된 MDA 231 LM2 세포의 상대적 침습을 보여주는 막대 그래프. 침습은 48시간 후에 평가하였다. 데이터는 세포 수에 대하여 표준화된 상대적 침습 값을 나타내며, 평균 ± SEM (n=4, *P < 0.05)이다. (B) 기술된 바와 같이 처리된 마우스의 MDA 231 LM2 종양에서의 CXCR1+ 세포의 백분율을 보여주는 막대 그래프. 데이터는 평균 ± SEM (n=4-6, *P < 0.05)이다. (C) 기술된 바와 같이 억제제들을 사용하여 처리된 CXCR1- (상부 패널), 아넥신V- 및 PI-염색 (저부 패널) MDA 231 LM2 세포에서 수행된 FACS 분석의 대표적인 점도표. 처리 48시간 후의 아폽토시스 및 사멸 세포의 평균 백분율을 보여주는 막대 그래프. 데이터는 평균 ± SEM (n=4, *P < 0.05)이다. (D) 상부 패널: 실험 설정의 도면. MDA 231 LM2 종양을 보유하는 마우스를 기술된 바와 같이 처리하였다. 종양을 절제하여, 분리한 후, 상이한 희석률로 재-이식하였다. PI-FACS 염색에 의해 재-이식 전의 세포 생존력을 분석하였는데, 모든 처리 군에서 동일한 것으로 밝혀졌다 (데이터 미도시). 저부 패널: 기술된 바와 같은 처리 후의 TIC 빈도를 보여주는 막대 그래프. 데이터는 총 n=7 마우스의 3회 개별 실험으로부터의 평균 추정치이다 (*P < 0.05, ***P < 0.0001).
도 18. BEZ235 처리는 일차 인간 TNBC 이종이식편에서 JAK2 / STAT5 및 IL -8 분비를 활성화함. (A) 30 mg/kg의 BEZ 또는 VHC를 사용하여 4일 동안 처리된 일차 TNBC 이종이식편 유래 용해물의 이뮤노블롯. ELISA 데이터는 평균 ± SD (n=3)이다. (B) 30 mg/kg의 BEZ 또는 VHC를 사용한 처리 3일차에 마우스로부터 유래하는 절제된 종양, 또는 마우스의 혈장에서 ELISA에 의해 측정된 IL-8 수준을 보여주는 막대 그래프. 데이터는 평균 ± SEM (n=3-4, *P < 0.05)이다.
도 19. PI3K / mTOR 와 JAK2 를 공동- 표적화하는 것은 2종의 전이성 유방암 모델에서의 무-사례( event - free ) 및 전체 생존률을 증가시킴. (A) 상부 패널: 실험 설정의 도면. 저부 패널: 기술된 바와 같이 BEZ 및/또는 BSK를 사용하여 처리된 MDA 231 LM2 (좌측) 및 4T-1 (우측) 종양-보유 마우스의 카플란-메이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선. 종양이 1 cm3에 도달하면 사례를 점수화한다 (n=4, *P < 0.05, **P < 0.01). (B) 상부 패널: 실험 설정의 도면. 저부 패널: 기술된 바와 같이 BEZ 및/또는 BSK를 사용하여 처리된 MDA 231 LM2 (좌측) 및 4T-1 (우측) 종양-보유 마우스의 카플란-메이어 생존 곡선. 사례는 마우스가 소정의 고통 신호를 나타낼 때 점수화한다 (n=4, *P < 0.05, **P < 0.01).
도 20. CXCR1 의 억제는 p- FAK 을 차단하며, JAK2 / STAT5 활성화의 제1 단계는 EGFR 비의존성임 . (A) 비-표적화 siRNA (siNT), 및 CXCR1을 표적으로 하는 2종의 상이한 siRNA를 사용하여 형질감염된 MDA 468 및 MDA 231 LM2 세포에서의 CXCR1 mRNA의 수준을 보여주는 막대 그래프. CXCR1 수준은 RT-qPCR에 의해 측정하였으며, 평균 ± SEM (n=2)으로 나타내었다. (B) 비-표적화 siRNA (siNT) 또는 CXCR1을 표적으로 하는 siRNA (siCXCR)를 사용하여 일시적으로 형질감염되고 DMSO 또는 300 nM의 BEZ를 사용하여 처리된 세포 유래 용해물의 이뮤노블롯. ELISA 데이터는 평균 ± SD (n=3)이다. (C) 300 nM의 BEZ235 및/또는 100 nM의 AEE788을 사용하여 8시간 동안 처리된 세포 유래 용해물의 이뮤노블롯.
도 21. JAK2 / STAT5 및 IL -8/ CXCR1 신호전달은 침습 및 전이를 촉진함. (A) 300 nM의 BEZ235 및/또는 350 nM의 BSK로 48시간 동안 처리된 MDA 231 LM2 세포를 사용하여 수행된 침습 검정으로부터의 대표적인 사진. 축적자 50 ㎛. (B) 기술된 바와 같이 처리된 마우스 유래 종양의 흡수율을 보여주는 표. R 및 "스탯모드(statmod)" 패키지 (문헌 [Hu and Smyth, 2009])를 사용하여 종양 개시 세포 (TIC) 빈도의 추정치 및 신뢰 구간을 계산하였다.
실시예
화합물 및 제제
NVP-BEZ235 (AN4) (PI3K/mTOR 억제제), NVP-BSK805 (JAK2 억제제), NVP-BKM-120 (pan-PI3K 억제제) 및 RAD001 (mTORC1 억제제)은 모두 스위스 바젤 소재 노파르티스(Novartis)의 것이었다. 화합물들은 DMSO 중 10 mmol/L 모 용액으로 제조된 후, -20℃에서 광으로부터 보호하면서 저장하였다. 마우스에 대한 투여를 위하여, NVP-BSK805는 NMP/PEG300/솔루톨 HS15 (5%/80%/15%) 중에서 새로 제제화되었으며, NVP-BEZ235는 NMP/PEG300 (10%/90%) 중에서 새로 제제화되었는데, 모두 경구 섭취에 의해 10 mL/kg으로 적용되었다.
세포주, 세포 배양 및 시험관내 실험
모 MDA-MB-231의 폐 전이성 하위세포주인 MDA 231 LM2 (또는 4175)는 조안 마싸그(Joan Massague) (뉴욕 메모리알 슬로안-케터링 암 센터)로부터 입수하였다. MCF10A 세포는 5% 말 혈청 (하이클론(Hyclone)), 20 ng/ml의 표피 성장 인자 (EGF) (페프로테크(Peprotech)), 0.5 ㎍/ml의 히드로코르티손 (시그마(Sigma)), 100 ng/ml의 콜레라 독소 (시그마), 10 ㎍/ml의 인슐린 (시그마), 100 IU/ml의 페니실린 및 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F12 (인비트로젠(Invitrogen)) 중에서 배양하였다. SUM159PT 세포는 친절하게도 샤롯떼 쿠퍼워써(Charlotte Kuperwasser) (터프츠 대학교, 매사추세츠 보스턴 소재)에 의해 제공되었으며, 햄(Ham's) F12, 5% FCS, 1 ㎍/ml의 인슐린, 0.5 ㎍/ml의 히드로코르티손 중에서 증식시켰다. Balb/c 세포주 4T-1, 4T-1-GFP 및 168FARN은 낸시 하이네스(Nancy Hynes) (FMI, 스위스 바젤 소재)에 의해 제공되었다. 모든 다른 세포주들은 ATCC의 것으로써, 배양 조건은 ATCC 프로토콜에 따랐다. 억제제를 사용한 처리를 위하여, 혈청 o/n 없이 세포들을 동기화한 다음, 표시되어 있는 바와 같이 자극 및 처리하였다. 독시사이클린-유도성 shRNA를 사용한 실험에서는, 500 ng/ml의 독시사이클린 (시그마)을 배지에 첨가하고, 48시간 후에 실험을 개시함으로써 표적의 효율적인 녹다운을 보장하였다. 시험관 내에서의 세포 생존력은 세포 증식 시약 WST-1 (로슈(Roche))을 사용하여 측정하였다. 간단하게 말하자면, 세포 (2.5-4×103개)를 200 μl의 정상 성장 배지 중에서 4반복으로 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 배양 배지에 대한 DMSO 또는 억제제의 첨가 전 24시간 동안 결합시켰다. 72시간 후, 20 μl/웰의 포르마잔 염료를 첨가하였다. 인큐베이션 (4시간, 37℃, 5% CO2 분위기) 후, ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 490 nm에서의 흡광도를 기록하였다. 인간 시토카인인 인터류킨-6, 인터류킨-8, GCSF 및 에리트로포이에틴 (EPO)은 페프로테크로부터 입수하였으며, EPO의 경우 10 mg/ml/5000 단위/ml로 PBS 중에 용해시켰다. 시토카인 자극은 저혈청 조건하에서 유지되는 세포를 사용하여 10 ng/ml (EPO의 경우 10 단위/ml)로 30분 동안 수행하였다. 항체 차단 실험은 세포 용해 전에 항-CXCR1 (R&D, MAB330, 1 ㎍/ml), 항-CXCR2 (R&D, MAB331, 2.5 ㎍/ml) 또는 마우스 IgG 항체 (R&D, 1 ㎍/ml)를 사용하여 45분 동안 수행하였다.
이뮤노블롯팅 및 면역침전
웨스턴 블롯팅 및 ELISA용 세포는 리파(RIPA) 완충제를 사용하여 용해시켰다. 이종이식편 용해물은 리파 완충제 (50mM 트리스-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% SDS) 중에 냉동-균질화 종양 분말을 용해시킴으로써 제조하였다. 리파에는 1× 프로테아제 억제제 칵테일 (콤플리트 미니(Complete Mini), 로슈), 0.2 mmol/L의 나트륨-바나데이트, 20 mM의 나트륨 플루오라이드 및 1 mmol/L의 페닐메틸술포닐 플루오라이드를 보충하였다. IRS-1 면역침전에서는, 500-1000 ㎍의 단백질을 함유하는 세포 용해물을 1 ㎍의 항체 및 20-50 μl의 단백질 A-세파로스 비드 (자임드 래보러토리즈, 인크.(Zymed Laboratories, Inc.), 캘리포니아 사우스 샌프란시스코 소재)와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 면역 침전물 또는 전 세포 용해물 (30-80 ㎍)을 SDS-PAGE에 적용하고, PVDF 막 (이모빌론(Immobilon)-P, 밀리포어(Millipore))으로 옮긴 후, PBS-0.1% 트윈 20 중 5% 우유를 사용하여 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 다음에, 막을 표시되어 있는 바와 같은 항체와 함께 밤새 인큐베이팅하고, 이차 HRP-커플링 항-마우스 또는 -토끼 항체에 1:5-10,000으로 실온에서 1시간 동안 노출시켰다. ECL 키트 (아머샴(Amersham)) 또는 강화된 화학발광 검출 시스템 (피어스 바이오테크놀로지(Pierce Biotechnology))을 사용하여 단백질을 가시화하였다. 제시된 연구 각각에서, 나타낸 결과는 통상적으로 3회 이상 개별 실험의 것이다. 하기의 항체들을 사용하였다: 항-JAK2 (셀 시그널링(Cell Signaling)), 항-JAK1 (셀 시그널링), 항-pSTAT5 (Tyr694, 셀 시그널링), 항-STAT5 (STAT5A&B, 셀 시그널링), 항-STAT3 (셀 시그널링), 항-pSTAT3 (Tyr705, 셀 시그널링), 항-AKT pan (셀 시그널링), 항-pAKT (Thr308 및 Ser473, 셀 시그널링), 항-ERK2 (산타 크루즈(Santa Cruz)), 항-S6 (셀 시그널링), 항-pS6 (Ser235/236, 셀 시그널링), 항-PARP (셀 시그널링), 항-MCL1 (셀 시그널링), 항-BIM (EL, L 및 S 동형, 셀 시그널링), 항-pIGF1R/plnsR (인비트로젠), 항-IGF1R베타 (셀 시그널링), 항-InsR베타 (산타 크루즈), 항-IRS1 (업스테이트(Upstate)), 항-pIRS1 (Tyr612, 칼바이오켐(Calbiochem)).
ELISA 및 시토카인 정렬
pJAK2 수준을 평가하기 위해서는, 시험된 모든 pJAK2 항체의 교차-반응성으로 인하여 ELISA 검정 (Tyr1007/1008, 인비트로젠)을 적용하였다. 리파 용해물, 세포 배양 상청액 및 마우스 꼬리 정맥혈 혈장에서의 인터류킨-8 수준 역시 ELISA (바이오레전드(Biolegend))에 의해 측정하였다. 세포 배양 상청액 및 마우스 종양 용해물에서의 시토카인 정렬은 제조자의 프로토콜 (R&D 시스템즈, 인간 및 마우스 시토카인 정렬 배널 A)에 따라 수행하였다.
RNA 제조 및 RQ - PCR
총 RNA는 RN이지 미니 키트(RNeasy Mini Kit) 및 DNase 제거 컬럼을 사용하여 제조자의 프로토콜 (퀴아젠(Qiagen))에 따라 추출하였다. 인비트로젠의 써모 스크립트(Thermo Script) RT-PCR 시스템을 사용하여 1 ㎍의 총 RNA를 전사하였다. PCR 및 형광 검출은 스텝원플러스(StepOnePlus) 서열 검출 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 스위스 롯크류즈 소재)을 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 1× 택맨(TaqMan)? 유니버설 PCR 마스터 믹스(Universal PCR Master Mix) (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)) 및 25 ng의 cDNA를 함유하는 20 μl의 반응 부피로 수행하였다. IL-8, GAPDH 및 RPLP0 mRNA의 정량에는, 1× 택맨? 유전자 발현 검정법 Hs00174103_m1, Hs02758991_g1 및 Hs99999902_m1 (어플라이드 바이오시스템즈)을 사용하였다. 모든 측정은 2반복으로 수행하였으며, Ct-값의 산술 평균을 계산에 사용하였는데; 표적 유전자 평균 Ct-값은 각 살림 유전자 (GAPDH 및 RPSO), 평균 Ct-값 (내부 참조 유전자, Ct), 다음에는 실험 대조에 대하여 표준화하였다. 수득된 값은 상대적 정량의 실험 대조 (2(-ΔΔCt)) 방법에 비교한 조절의 n-배 변화로 표현되도록 지수화하였다 (2(-ΔΔCt)) (문헌 [Livak and Schmittgen, 2001]).
유전자 침묵화 절차
siRNA는 시그마-알드리치로부터 RP-HPLC 정제 이중체로서 주문하였는데, 그 서열은 하기와 같다:
Figure pct00008
JAK2의 경우, 시그마-알드리치로부터 확인된 스텔스(Stealth) RNAi™ siRNA를 주문하였다 (VHS41246). siRNA의 형질감염은 제조자의 지침 (Dharma Feet 1, Dharmacon)에 따라 수행하였다. 렌티바이러스 생산을 위하여, 293T 세포를 배양 접시 10 cm 당 2.5×106 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 15 ㎍의 pLK01-tet-on-JAK2 shRNA (#629, 표적 서열: TGGATAGTTACAACTCGGCTT (서열 5)) 또는 pLK01-tet-on-non-silencing shRNA (문헌 [Wiederschain et al., 2009]) 중 어느 하나, 및 10 ㎍의 3차 세대 패키징 플라스미드 믹스를 사용한 PEI법 (PEI:DNA 비 = 4:1)에 의해 세포를 공동형질감염시켰다. 16시간 후, 배양 배지를 새로운 배지로 교체하였다. 형질감염 48 및 72시간 후에 상청액을 수집하였다. 바이러스 역가를 측정하기 위하여, 105 MDA-MB-468 및 MDA-MB-231-LM2 세포를 6-웰 플레이트에 시딩하고, 밀리리터 당 8 μ의 폴리브렌 (시그마-알드리치)의 존재하에 다양한 희석률의 벡터를 사용하여 형질도입시켰다. 72시간 후, 1.5 ㎍/ml의 농도로 퓨로마이신 (시그마-알드리치)을 함유하는 새로운 배지로 배양 배지를 교체하였다. 20의 감염 다중도로 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 MDA-MB-468 및 MDA-MB-231-LM2 세포를 실험에 사용하였다.
유동 세포측정법
트립신-EDTA를 사용하여 세포를 탈착시키고, 정상 성장 배지에 현탁한 후, 계수하였다. 종양을 기계적으로 및 효소적으로 분리시켰다 (콜라게나제 II 및 HyQtase 소화 사용). 아넥신 V 염색을 위하여, 0.5×106 세포를 저온 PBS/5% BSA로 세척하고, 70 μl의 결합 완충제에 재현탁한 후, 제조자의 프로토콜에 따라 (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)) 아넥신 V에 대한 피코에리트린 (PE)-표지 항체로 표지하였다. 세포 주기 분석을 위하여, 1×106 세포를 PBS 중에서 세척하고, 70% 에탄올 중에서 4℃로 60분 동안 고정한 후, 2회 세척하고, PI 완충제 (50 ㎍/ml의 프로피듐 아이오다가드, 10 ㎍/ml의 RNAse A, 0.1% 나트륨 시트레이트 및 0.1% 트리톤(Triton) X-100이 보충된 PBS) 중에 재현탁하였다. CXCR1 및 CXCR2 세포 표면 발현의 분석을 위하여, 세척 및 분석 전에 암흑하에서, 2.5 ㎍/106 세포의 항-CXCR1 (R&D, MAB330), 항-CXCR2 (R&D, MAB331) 또는 1 ㎍/106 세포의 마우스 IgG 항체 (R&D)로 4℃에서 20분 동안, 다음에는 이차 항-마우스 IgG-알렉사플루오르(AlexaFluor)647 (바이오레전드)로 4℃에서 15분 동안, 세포를 인큐베이팅하였다. FACScan 유동 세포측정기 (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson), 스위스 바젤 소재)를 사용하여, 샘플 당 104 세포 이상을 분석하였다.
동물 실험
SCID/베이지, SCID/NOD 및 Balb/c 마우스 (잭슨 랩스(Jackson Labs))를 특정 병원체가 없는 조건하에 유지하면서, 실험 동물 사용에 대한 제도 및 국가 규제 표준에 부합하는 FMI의 제도적 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인된 프로토콜에 맞추어 사용하였다. 유방암 세포주의 동소 이식을 위하여, 1×106 MDA-MB-468, 1×106 MDA-MB-231-LM2 및 0.5×106 4T-1 또는 4T-1-GFP 세포를 베이스먼트 멤브레인 매트릭스 페놀 레드-프리(Basement Membrane Matrix Phenol Red-free) (BD 바이오사이언시즈) 및 PBS 1:1의 100 μl 혼합물에 현탁한 후, 유선 4, 또는 유선 2와 3 사이에 주사하였다. 일차 환자 유방 종양을 1 mm×1 mm 절편으로 절단한 후, 유선 4에 이식하였다. 처리 개시 전에 종양 부피를 기준으로 종양-보유 마우스를 무작위화하고, 평균 종양 부피가 100 mm3 이상이 되었을 때 처리를 개시하였다. 6 연속일마다 (1일의 약물 휴일이 이어짐) BEZ-235 및 BKS-805를 경구로 (제제는 상기 참조) 제공하였다. 음용수 중에 독시사이클린 (5% 수크로스 용액 중 2 g/l)을 첨가함으로써 (48시간마다 교체해 줌) shRNA의 발현을 유도하였다. 베르니어 캘리퍼스(vernier calipers)를 사용하여 3 내지 4일마다 종양을 측정하고, 수학식 0.5×(더 큰 직경)×(더 작은 직경)2에 의해 종양 부피를 계산하였다. 수학식 AB/C < A/C × B/C (식 중, C = 종양 부피 VHC, A = 종양 부피 화합물 1, B = 종양 부피 화합물 2, AB = 종양 부피 조합물임)를 사용하여, 상승작용에 대하여 종료점 종양 크기를 분석하였다 (문헌 [Clarke, 1997]).
면역조직화학
종양을 10% NBF (중성 완충 포르말린) 중에 4℃로 24시간 동안 고정하고, 70% EtOH로 세척하여, 파라핀에 삽입한 후, H&E, 항-Ki67 (써모 사이언티픽), 항-pSTAT5 (Tyr694, 셀 시그널링), 항-pAKT (Ser473, 셀 시그널링), 항-pS6 (Ser235/236, 셀 시그널링), 항-PARP (셀 시그널링) 및 항-마우스 F4/80 (AbD 세로텍(Serotec)) 항체를 사용하여 염색하였다. 부잉(Bouin's) 고정제 중에 마우스 폐를 고정하고, 양안을 사용하여 눈에 보이는 전이성 폐 결절을 계수하였다.
통계 분석
보고된 각 값은 3회 이상 개별 실험의 평균 ± s.d. 또는 s.e.를 나타낸다. 데이터는 정상 분포 또는 스투덴트 t-검정에 대하여 검정하거나, 또는 프로그램 JMP4 (SAS, 미국 노스 캐롤라이나 캐리 소재)를 사용하여 비모수 만-휘트니 U-검정(nonparametric Mann-Whitney U-test)을 적용하였다. < 0.05의 P-값이 ?계적 유의성이 있는 것으로 간주되었다.
본 발명자들은 단일 투여량의 화합물 A, 이중 PI3K 및 mTOR 억제제를 적용하고, 처리 2, 4, 8 및 20시간 후에 표적 억제 및 잠재적 신호전달 경로 혼신을 분석하였다. 화합물 A가 PTEN-결핍 MDA 468 및 RAS-돌연변이 MDA 231 LM2 유방암 세포주는 물론, 마우스 유방암 세포주 4T-1에서 처리 후 20시간까지 pAKT를 감소시키고 pS6 수준을 완전히 차단한다는 것이 밝혀졌다. 본 발명자들은 또한 이러한 결과를 확인하기 위한 생체내 모델을 사용하였다. 놀랍게도, 시험관 내에서의 BEZ 처리 4시간-8시간 후, 및 생체내에서의 처리 8시간 후에, pJAK2 및 pSTAT5의 상당한 상향조절이 검출되었다. 그러나, pSTAT3의 수준은 거의 BEZ 처리에 의한 영향을 받지 않고 유지되었다. 이중 억제제 화합물 A의 어느 편이 관찰된 JAK2에 대한 혼신의 원인이 될 수 있었는지를 밝히기 위하여, 본 발명자들은 PI3K-특이적 억제제 (BKM120) 및 mTOR 억제제 (RAD001)을 사용하였다. PI3K와 mTOR의 양 단일 억제가 pJAK2 및 pSTAT5를 (그러나 상이한 시점에) 상향조절한다는 것이 발견되었다. RAD001이 처리 4시간에 시작하여 JAK2를 용이하게 활성화한 반면, BKM120 처리에서는 화합물 첨가 8시간 후에 시작하는 늦은 반응이 관찰되었다. 세포 유형 및 그들이 연관되어 있는 수용체에 따라서는 JAK2 및 JAK1 모두가 STAT5 및 STAT3에 신호전달을 할 수 있다는 사실에 기초하여 (문헌 [Desrivieres et al., 2006]; [Bezbradica et al., 2009]), 본 발명자들은 양 JAK의 siRNA 결실을 수행하여, JAK2만이 STAT5 활성화의 원인이되는 반면, JAK1은 사용된 실험 모델에서 STAT3의 상류에 있음을 발견하였다. 다음에는, JAK2 활성화가 BEZ 처리에 의한 pSTAT5의 상향조절에 필요한지, 및 고도로 특이적인 JAK2 억제제인 화합물 D (문헌 [Radimerski et al, 2010])가 이와 같은 혼신을 차단하기에 충분할 것인지를 조사하였다. 결과는 JAK2의 siRNA 결실 및 그의 활성의 억제 모두가 BEZ에 의한 pSTAT5의 상향조절에 대항하는 것으로 나타났다. 이에 따라, 본 발명자들은 이중 PI3K/mTOR 억제에 대한 내성을 야기하는 JAK2/STAT5-유발 양성 피드백 루프를 발견하였다. 당연히, PI3K/mTOR 억제는 수종의 세포주 및 일차 삼중-음성 유방암에서 JAK2/STAT5의 IRS1-의존성 활성화 및 IL-8의 분비를 증가시켰다. JAK2의 유전적 또는 약리학적 억제는 이와 같은 피드백 루프를 종식시켰다. 또한, 조합된 PI3K/mTOR 및 JAK2 억제는 시험관 내에서의 암 세포 수는 물론, 생체내에서의 종양 성장, 순환성 종양 세포의 수 및 전이를 상승작용적으로 감소시킨다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명자들의 연구는 성장 인자 신호전달, JAK/STAT 활성화 및 시토카인 분비 사이의 새로운 연결고리를 밝혔다. 이러한 결과들은 증식성 질환에서의 PI3K/mTOR 및 JAK2/STAT5 경로의 조합 표적화의 근거를 제공한다.
표 1. 유방암 세포주의 패널에서 BEZ 는 JAK2 / STAT5 의 인산화 및 IL -8 분비를 증가시켰음. 300 nM의 BEZ를 사용한 각각 8시간 또는 20시간 동안의 삼중-음성 (짙은 색) 및 관강내 (회색) 유방암 세포주의 처리시의 JAK2/STAT5 인산화 및 IL-8 분비의 수준을 나타낸다. pSTAT5/STAT5 수준은 이뮤노블롯팅에 의해 평가하고 농도측정법에 의해 정량하였다. pJAK2/JAK2 및 IL-8 수준은 ELISA에 의해 측정하였다. BEZ-처리 대비 DMSO 세포로부터의 값들이 제공된다. 데이터는 평균 ± SD (n=3)으로 나타낸다.
Figure pct00009
SEQUENCE LISTING <110> Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research <120> Combination of a phosphoinositide 3-kinase inhibitor and a modulator of the Janus Kinase 2 - Signal Transducer and Activator of Transcription 5 pathway <130> 54884 <160> 5 <170> BiSSAP 1.0 <210> 1 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> source <222> 1..25 <223> /mol_type="RNA" /organism="Homo sapiens" <400> 1 gcacagaaga cggaggaaau gguau 25 <210> 2 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> source <222> 1..25 <223> /mol_type="RNA" /organism="Homo sapiens" <400> 2 gccuuaagga auaucuucca aagaa 25 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> source <222> 1..21 <223> /mol_type="RNA" /organism="Homo sapiens" <400> 3 aacaagacag cugguaccag g 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> source <222> 1..21 <223> /mol_type="RNA" /organism="Homo sapiens" <400> 4 auucuaucac uagcgugacu u 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> source <222> 1..21 <223> /mol_type="DNA" /organism="Homo sapiens" <400> 5 tggatagtta caactcggct t 21

Claims (14)

  1. 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한, (a) 포스포이노시티드 3-키나제 (PI3K) 억제제 화합물 및 (b) 야누스 키나제 2 (JAK2)-신호 전달자 및 전사 활성화제 5 (STAT5) 경로를 조절하는 화합물, 및 임의로 1종 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조합물이며, 여기서 활성 성분들은 각 경우 유리 형태 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 임의의 수화물 형태로 존재하는 것인, 의약으로서 사용하기 위한 상기 조합물.
  2. 제1항에 있어서, 포스포이노시티드 3-키나제 억제제 화합물이 화합물 A, 화합물 B, 화합물 C, 라파마이신, 템시롤리무스, 에베롤리무스, 템시롤리무스, 리다포롤리무스, MK-8669, 시롤리무스, 조타롤리무스 및 비올리무스로 이루어진 군에서 선택되는 것인 조합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, JAK2-STAT5 경로를 조절하는 화합물이 레스타우르티닙, 룩솔리티닙, SB1518, CYT387, LY3009104, INC424, LY2784544, BMS-911543, NS-018, TG101348, 화합물 D, 화합물 E, 화합물 F, 화합물 G, 화합물 H 및 화합물 I로 이루어진 군에서 선택되는 것인 조합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 포스포이노시티드 3-키나제 억제제 화합물 및/또는 JAK2-STAT5 경로를 조절하는 화합물이 siRNA인 조합물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, JAK2-STAT5 경로를 조절하는 화합물이 인터류킨 8 (IL8)의 분비를 억제하는 것인 조합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 포스포이노시티드 3-키나제 억제제가 화합물 A인 조합물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 포스포이노시티드 3-키나제 억제제가 화합물 C인 조합물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 포스포이노시티드 3-키나제 억제제가 에베롤리무스인 조합물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 증식성 질환의 치료에 사용하기 위한 조합물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 고형 종양의 치료에 사용하기 위한 조합물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 유방암의 치료에 사용하기 위한 조합물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 전이성 유방암의 치료에 사용하기 위한 조합물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 삼중-음성 유방암의 치료에 사용하기 위한 조합물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 포스포이노시티드-3 키나제 (PI3K) 억제제의 하나 이상의 단위 투여 형태 및 (b) JAK2-STAT5 경로를 조절하는 화합물의 하나 이상의 단위 투여 형태를 포함하는 조합물.
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