KR20140088796A - Marker composition for diagnosis of hereditary hearing loss in Korean population - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 한국인의 유전성 난청 진단용 마커 조성물, 상기 마커를 포함하는 한국인의 유전성 난청 진단 키트 및 진단 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a marker composition for diagnostic of hereditary hearing loss in Korean, a diagnostic kit for hereditary hearing loss in Korean and a diagnostic method thereof.
귀는 귓바퀴와 외이도까지를 외이로 분류하고, 고막과 이소골은 중이, 그리고 달팽이관과 청신경을 내이로 분류한다. 소리는 음향학적 에너지로서 귓바퀴와 외이도를 통해 전달되어 고막을 진동시키게 된다. 고막의 진동은 기계적인 에너지로 고막에 붙어있는 3개의 작은 뼈로 이루어진 이소골로 전달된다. 이소골의 마지막 뼈인 등골은 달팽이관에 연결되어, 달팽이관 내의 림프액으로 에너지를 전달시키게 된다. 전달된 에너지는 림프액에 파동을 일으키고 이러한 파동에 의해 달팽이관 내에 있는 유모세포가 자극받게 된다. 유모세포의 움직임으로 이온변화가 일어나면서 유모세포에 붙어있는 청신경으로 신경전달물질이 전달되고, 소리에너지는 청신경에서 전기적인 에너지 형태로 뇌까지 전달되게 된다. The ears classify the ear canal and the ear canal into the outer ear, the eardrum and ossicles in the middle ear, and the cochlea and the auditory nerve in the inner ear. Sound is acoustical energy transmitted through the auricle and external auditory canal to vibrate the eardrum. The vibration of the eardrum is transferred to the ossicles consisting of three small bones attached to the eardrum with mechanical energy. The last bone of the ossicle, the spine, connects to the cochlea, which transfers energy to the lymph fluid in the cochlea. The delivered energy causes the lymphatic fluid to oscillate, which causes the hair cells in the cochlea to be stimulated. As the hair cells move, the neurons are transferred to the auditory nerves attached to the hair cells, and the sound energy is transferred from the auditory nerve to the brain in the form of electrical energy.
난청은 가장 흔한 감각성 질환으로, 신생아 1000명당 1명의 빈도로 나타난다. 난청은 크게 유전성과 비유전성 난청으로 나뉘는데, 그 중 50% 이상이 유전성 난청이다. 유전성 난청은 다시 증후군성 난청과 비증후군성 난청으로 분류되는데 그 중 30%는 여러 증상이 함께 나타나는 증후군성 난청이며, 나머지 70%가 난청 외에 다른 증상이 함께 나타나지 않는 비증후군성 난청이다. 비증후군성 난청의 경우 상염색체 열성 유전의 양상이 약 80%를 차지하고 있으며, 약 15-20%는 상염색체 우성 유전, 나머지 2% 미만이 X 염색체와 미토콘드리아에 존재하는 유전자에 의한 난청이다. Deafness is the most common sensory illness, occurring in 1 per 1,000 newborns. Deafness is divided into hereditary and non - inductive hearing loss, of which more than 50% is hereditary hearing loss. Hereditary hearing loss is again classified as syndrome deafness and nonsyndromic deafness, 30% of which are symptomatic hearing loss, and the remaining 70% are non-syndromic hearing loss with no other symptoms except hearing loss. Non-syndromic hearing loss accounts for about 80% of autosomal recessive inheritance, about 15-20% for autosomal dominant inheritance, and less than 2% for hearing loss due to genes on X chromosome and mitochondria.
유전성 난청은 가능한 조기에 진단하고, 계속해서 관리해주는 것이 가장 중요하기 때문에, 이를 위하여 유전성 난청과 관련된 유전자에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 그 중 GJB2 (OMIM ID:121011) 유전자의 돌연변이가 유전성 난청의 원인이 되는 것으로 가장 널리 알려져 있으며, 유럽인과 미국인 등 서양인의 유전성 난청의 약 70%가 GJB2 유전자의 돌연변이로 인한 것이라고 알려져 있다. 그러나 한국인의 경우 상기 GJB2 유전자 돌연변이로 인한 유전성 난청 발병 확률은 낮은 편이다. 따라서 한국인을 대상으로 한 유전성 난청 관련 유전자 연구에 대한 필요성이 매우 높아지고 있다. Since it is most important to diagnose hereditary hearing loss as early as possible and to manage it continuously, studies on hereditary deafness related genes have been actively conducted. Among them, the mutation of GJB2 (OMIM ID: 121011) gene is the most widely known cause of hereditary deafness, and it is known that about 70% of hereditary hearing loss in Western people such as Europeans and Americans is caused by mutation of GJB2 gene. However, in Koreans, the probability of hereditary hearing loss due to GJB2 gene mutation is low. Therefore, there is a growing need for studies on hereditary hearing loss genes in Koreans.
이에 본 발명자들은 한국인의 유전성 난청을 진단하기 위한 마커를 개발하고자 연구를 계속한 결과, GJB2, 미토콘드리아 12S rRNA 및 SLC26A4에 위치한 7개의 돌연변이를 한번에 검출할 수 있는 프라이머 세트를 이용하여 한국인의 유전성 난청을 빠르고 정확하게 진단할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
Therefore, the present inventors continued to develop a marker for diagnosing hereditary deafness in Koreans. As a result, we have found that by using a primer set capable of detecting seven mutations at GJB2, mitochondrial 12S rRNA and SLC26A4 at one time, The present inventors have completed the present invention by confirming that the diagnosis can be made quickly and accurately.
본 발명의 목적은 한국인의 유전성 난청 진단용 마커 조성물을 제공하는 것이다. It is an object of the present invention to provide a marker composition for diagnostic of hereditary hearing loss in Korean.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 마커를 포함하는 한국인의 유전성 난청 진단 키트 및 진단 방법을 제공하는 것이다.
It is still another object of the present invention to provide a diagnostic hereditary hearing loss diagnostic kit and a diagnostic method for a Korean person including the marker.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 14의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트를 포함하는 한국인의 유전성 난청 진단용 마커 조성물을 제공한다. In order to solve the above problems, the present invention provides a marker composition for diagnostic of hereditary hearing loss in Koreans comprising a primer set consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 to 14.
또한, 본 발명은 상기 마커를 포함하는 한국인의 유전성 난청 진단 키트 및 진단 방법을 제공한다.
In addition, the present invention provides a Korean hereditary deafness diagnostic kit and diagnostic method including the marker.
본 발명에 따른 마커 조성물은 한국인의 유전성 난청과 관련된 유전자인 GJB2, 미토콘드리아 12S rRNA 및 SLC26A4에 위치한 7개의 돌연변이를 한번에 검출할 수 있어, 빠르고 정확하게 한국인의 유전성 난청을 진단하는데 유용하게 이용될 수 있다.
The marker composition according to the present invention can detect 7 mutations located in GJB2, mitochondrial 12S rRNA and SLC26A4, which are genes related to hereditary deafness in Korean, at once, and can be used to diagnose Korean hereditary deafness quickly and accurately.
도 1은 7개의 돌연변이 부위를 서열번호 1 내지 14의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 한번에 증폭한 결과를 나타낸 도이다 (M: 100 bp 마커, 1: 정상인 샘플, 2: 난청 환자의 샘플).
도 2는 PCR을 통해 증폭한 산물을 서열번호 15 내지 21의 염기서열로 구성되는 신장 프라이머 세트를 이용하여 돌연변이 부위의 스냅샷 미니 시퀀싱을 수행한 결과를 나타낸 도이다 (패널 1: 정상인의 유전자형, 패널 2~6: 난청 환자의 유전자형).1 shows a result obtained by amplifying seven mutation sites at once using a primer set consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 to 14 (M: 100 bp marker, 1: normal sample, 2: ).
FIG. 2 is a diagram showing a result of performing a snapshot mini-sequencing of a mutation site using a set of elongation primers consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 15 to 21 (see, for example, Panel 1: Panel 2-6: genotype of hearing loss patient).
이하 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명은 서열번호 1 내지 14의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트를 포함하는 한국인의 유전성 난청 진단용 마커 조성물을 제공한다. The present invention provides a marker composition for diagnostic of hereditary hearing loss in Koreans comprising a primer set consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 to 14.
본 발명에서 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 유전성 난청 발병 여부 또는 발명 가능성 여부를 확인하는 것이다. In the present invention, "diagnosis" means identifying the presence or characteristic of a pathological condition. For the purposes of the present invention, the diagnosis is to ascertain whether or not a hereditary hearing loss has occurred or whether it can be invented.
본 발명에서 "마커"란 한국인의 유전성 난청을 진단할 수 있는 물질로, 한국인의 유전성 난청과 관련된 폴리펩타이드, 핵산 (예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. In the present invention, the term "marker" refers to a substance capable of diagnosing hereditary hearing loss in Korean, and includes a polypeptide, a nucleic acid And the like), and the like.
본 발명에서 "프라이머 (primer)"란 적절한 완충용액 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 본 발명의 프라이머는 예를 들면, 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법과 같은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.As used herein, the term "primer" refers to a primer that is hybridized under appropriate conditions in a suitable buffer solution (for example, four different nucleoside triphosphates and a polymer such as DNA, RNA polymerase or reverse transcriptase) Refers to single stranded oligonucleotides that can serve as a starting point for DNA synthesis. The appropriate length of the primer may vary depending on the intended use, but is usually 15 to 30 nucleotides. Short primer molecules generally require a lower temperature to form a stable hybrid with the template. The primer sequence need not be completely complementary to the template, but should be sufficiently complementary to hybridize with the template. The primers of the present invention can be chemically synthesized using methods known in the art such as, for example, the phosphoramidite solid support method. Further, it can be modified by methylation, capping or the like by a known method.
본 발명에서 "정방향(forward) 프라이머" 및 "역방향(reverse) 프라이머"는 유전자 증폭반응에 의해 증폭되는 유전자의 특정 부위의 3'-말단 및 5'-말단에 각각 결합하여 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머를 의미한다.In the present invention, "forward primer" and "reverse primer" bind to 3'-terminal and 5'-terminal of a specific site of a gene amplified by gene amplification reaction, respectively, Quot; primer "
본 발명에 따른 프라이머 세트는 한국인의 유전성 난청과 관련된 유전자인 GJB2 유전자(OMIM ID: 121011)의 235번째 염기서열인 C의 결실 부위; 미토콘드리아 12S rRNA 유전자(OMIM ID: 561000)의 1555번째 염기서열인 A의 G로의 치환 부위; 및 SLC26A4(OMIM ID: 605646)의 493번째 염기서열인 A의 G로의 치환, 919-2번째 염기서열인 A의 G로의 치환, 1149+3번째 염기서열인 A의 G로의 치환, 1229번째 염기서열인 C의 T로의 치환 부위 등 7개의 돌연변이에 특이적으로 결합할 수 있어 한국인의 유전성 난청을 빠르고 정확하게 진단할 수 있다.
The primer set according to the present invention includes a deletion site of C, the 235th base sequence of the GJB2 gene (OMIM ID: 121011), which is a gene related to hereditary deafness in Koreans; The substitution site of A in G of the 1555th base sequence of the mitochondrial 12S rRNA gene (OMIM ID: 561000); And substitution of A, which is the 493rd base sequence of SLC26A4 (OMIM ID: 605646) with G, substitution of 919-2th base sequence of A with G, substitution of 1149 + 3th base sequence of A with G, 1229th base sequence And can be specifically bound to seven mutations, such as the substitution site of C in T, so that Koreans can diagnose hereditary hearing loss quickly and accurately.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 14의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트를 포함하는 한국인의 유전성 난청 진단 키트를 제공한다. In addition, the present invention provides a Korean hereditary hearing loss diagnostic kit comprising a primer set consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 to 14.
본 발명의 "키트"는 분석하고자 하는 시료로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합 효소(예를 들면, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermusfiliformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함할 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유할 수 있다. 이외에 PCR산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다. 이 때 MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 주며, 바람직하게는 1.5-2.5 mM의 범위로 사용될 수 있다. 일반적으로 Mg2 +가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭 산물이 증가하고, Mg2 +가 부족한 경우 PCR 산물의 산출률이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 트리톤 X-100이 추가로 포함될 수도 있다.
The term "kit" of the present invention includes genomic DNA derived from a sample to be analyzed, a primer set of the present invention, an appropriate amount of DNA polymerase (for example, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermusfiliformis, Thermis flavus, Thermostable DNA polymerase obtained from Thermococcus literalis or Pyrococcus furiosus (Pfu)), dNTP mixture, PCR buffer solution and water. The PCR buffer may contain KCl, Tris-HCl and MgCl 2. In addition, components necessary for conducting electrophoresis to confirm whether the PCR product is amplified can be further included in the kit of the present invention. At this time, the MgCl 2 concentration greatly affects the specificity and yield of the amplification, preferably 1.5-2.5 mM. Generally, when Mg 2 + is excessive, nonspecific PCR amplification product is increased, and when Mg 2 + is insufficient, the yield of PCR product is decreased. The PCR buffer solution may further contain an appropriate amount of Triton X-100.
또한, 본 발명은 In addition,
(a) 대상 시료에서 DNA를 분리하는 단계; (a) separating DNA from the target sample;
(b) 상기 (a) 단계에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 14의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (b) amplifying the target sequence using the DNA isolated in step (a) as a template and using a primer set consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 to 14; And
(c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 산물의 염기서열을 분석하여 한국인의 유전성 난청을 진단하는 단계;를 포함하는 한국인의 유전성 난청 진단 방법을 제공한다. (c) analyzing the base sequence of the amplified product in step (b) to diagnose a Korean hereditary deafness.
상기 (a) 단계에서 DNA는 gDNA 및 cDNA를 모두 포함한다. In the step (a), the DNA includes both gDNA and cDNA.
상기 (a) 단계에서 DNA의 분리는 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법, CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl AmmoniumBromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980)등을 이용하거나, 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수도 있으며 이에 제한되지 않는다. 만약 대상 시료가 mRNA일 경우, 당업계에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 총 RNA를 분리한 후, cDNA를 합성하여 이용한다. In step (a), the DNA may be separated by a phenol / chloroform extraction method, an SDS extraction method, a CTAB separation method (Murray et al., Nuc. Res. 4321-4325, 1980) Or may be performed using a commercially available DNA extraction kit, but the present invention is not limited thereto. If the target sample is mRNA, total RNA is isolated according to a method commonly used in the art, and cDNA is synthesized and used.
상기 (b) 단계에서 표적 서열을 증폭하는 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR, 복구 연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication), 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP) 등을 이용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 일반적인 PCR 수행 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수 있다. 또한, 상기 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The amplification of the target sequence in the step (b) can be performed using polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), ligase chain reaction (LCR), Gap-LCR, repair chain reaction, transcription-mediated amplification (TMA), self sustained sequence replication, and hybridization of the target polynucleotide sequence The primers used in this study include selective amplification of target polynucleotide sequences, consensus sequence primer polymerase chain reaction (CP-PCR), arbitrarily primed polymerase chain reaction (AP-PCR) Nucleic acid sequence based amplification (NASBA), strand displacement amplification and loop-mediat amplification ed isothermal amplification (LAMP), and the like. General PCR methods are well known in the art and commercially available kits can be used. In addition, the amplified target sequence may be labeled with a detectable labeling substance. The labeling substance may be a fluorescent, phosphorescent or radioactive substance, but is not limited thereto.
상기 (c) 단계에서 상기 증폭된 산물의 염기서열 분석은 당업계에서 통상적으로 사용되는 다양한 방법에 의하여 이루어질 수 있으며, 예를 들면, 스냅샷(sNaPShot) 분석 방법, DNA 서열분석 (sequencing) 방법, PCR-SSCP (single stranded conformation polymorphism) 분석 방법, RFLP (restriction fragment length polymorphism) 분석 방법, 대립형질 (allele) 특이적 혼성화 방법, DNA 칩 방법, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 방법, 면역블롯 (immunoblot) 방법, TDGS(Two-dimensional Gene Scanning) 방법, Taq-Man 방법, TOGATM 방법 등을 이용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
In step (c), the amplified product may be analyzed by a variety of methods commonly used in the art. For example, the analysis may be performed by a method such as a snapshot analysis method, a DNA sequencing method, PCR-SSCP (single stranded conformation polymorphism) analysis method, restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis method, allele-specific hybridization method, DNA chip method, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method, immunoblot ) Method, a two-dimensional Gene Scanning (TDGS) method, a Taq-Man method, a TOGATM method, and the like.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. It will be apparent to those skilled in the art that the embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention.
실시예Example 1. One. DNADNA 샘플의 준비 Preparation of samples
197명의 정상청력인과 139명의 난청 여부를 알 수 없는 신생아를 대상으로 실험을 수행하였다. 상기 대상으로부터 FlexiGene DNA 키트(Qiagen, Hilden, Germany) 및 Gentra Puregene Buccal Cell 키트(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여, 키트 내 제공되는 실험 방법에 따라 말초 혈액 및 구강 세포로부터 게놈 DNA를 수득하였다.
We conducted an experiment with 197 normal hearing people and 139 newborn babies with unknown hearing loss. Genomic DNA was obtained from the peripheral blood and oral cells using the FlexiGene DNA kit (Qiagen, Hilden, Germany) and the Gentra Puregene Buccal Cell kit (Qiagen, Hilden, Germany) according to the experimental method provided in the kit.
실시예Example 2. 2. PCRPCR 멀티플렉스 증폭 반응 Multiplex amplification reaction
한국인의 난청과 관련된 유전자 3개에 위치한 7개의 돌연변이 부위의 증폭을 위하여 총 14개의 PCR 프라이머를 디자인하였다. 상기 프라이머 염기서열은 한국인의 난청과 관련된 7개의 돌연변이를 한번에 확인하기 위해 프라이머 염기서열의 길이, PCR 조건 등을 모두 고려하여 디자인된 것이다. 구체적인 PCR 프라이머 염기서열을 하기 표 1에 나타내었다.A total of 14 PCR primers were designed to amplify seven mutation sites located in three genes related to Korean deafness. The primer base sequence was designed in consideration of the length of the primer sequence and the PCR conditions in order to confirm seven mutations related to the hearing loss of Koreans at a time. The specific PCR primer base sequences are shown in Table 1 below.
(pmol/μl)Final concentration
(pmol / μl)
상기 실시예 1에서 수득한 각 개체의 20 ng의 DNA 주형, 0.2 mM 데옥시뉴클레오티드, 1× 멀티플렉스 PCR 프라이머 혼합물, 1× h-Taq 반응 완충액, 및 0.5 U의 h-Taq DNA 폴리머라아제(Solgent, Daejeon, Korea)를 포함하는 최종 부피 25 μl의 PCR 반응 혼합물을 제조한 후, 하기 조건에 따라 PCR을 수행하였다. 상기 1×멀티플렉스 PCR 프라이머 혼합물은 2.5×멀티플렉스 PCR 프라이머 혼합물을 반응 당 10 μl씩 사용한 것으로, 2.5×멀티플렉스 PCR 프라이머 혼합물은 상기 표1에서의 프라이머들의 최종 농도보다 각각 2.5배의 농도로 혼합시킨 것이다. 7개의 돌연변이 중 일부를 가지고 있는 한국인 난청 환자 6명으로부터 분리한 DNA를 양성 대조군으로 하였으며, 돌연변이가 없는 정상적인 유전자를 음성 대조군으로 이용하였다. 구체적으로, 6 명의 양성 대조군은 각각 GJB2 유전자의 235 번째 C가 결실된 돌연변이를 동형접합체로 갖고 있는 난청 환자, 미토콘드리아 DNA의 1555 번째 A가 G로 치환된 난청 환자, SLC26A4의 439 번째 A의 G로의 치환과 919-2번째 A의 G로의 치환 돌연변이를 복합이형접합체로 갖고 있는 난청 환자, 2168 번째 A가 G로 바뀌는 돌연변이와 1149+3번째 A가 G로 바뀌는 돌연변이를 복합이형접합체로 갖고 있는 난청 환자, 2168 번째 A의 G로의 치환과 1229번째 C의 T로의 치환 돌연변이를 복합이형접합체로 갖고 있는 난청 환자이다. 20 ng of DNA template, 0.2 mM deoxynucleotide, 1 × multiplex PCR primer mixture, 1 × h-Taq reaction buffer, and 0.5 U of h-Taq DNA polymerase (obtained in Example 1) Solgent, Daejeon, Korea) was prepared and PCR was performed according to the following conditions. The 1 × multiplex PCR primer mixture was prepared by mixing 2.5 × multiplex PCR primer mixture with 10 μl per reaction and mixing the 2.5 × multiplex PCR primer mixture with 2.5 times the final concentration of the primers in Table 1 It is. DNA isolated from six Korean hearing impaired patients with some of the seven mutations was used as a positive control and normal genes without mutations were used as negative controls. Specifically, six positive control groups were selected from the group consisting of hearing loss patients with a homozygous deletion mutant of the 235th C of the GJB2 gene, a hearing loss patient with a 1555th A substitution of G for mitochondrial DNA, G for 439th A of SLC26A4 Hearing loss patients with a complex heterozygote for substitution and substitution mutation to G in 919-2th A, hearing loss patients with mutant heterozygous mutations in 2168th A to G and 1149 + 3rd A to G , Substitution of G at position 2168 for G, and substitution mutation for T at position 1229 C as a complex heterozygote.
[95°C에서 15분간 최초 변성 (initial denaturation); Initial denaturation at 95 ° C for 15 minutes;
94°C에서 20 초 변성, 57°C에서 20초 어닐링, 72°C에서 40초 신장 과정을 40 사이클 반복; Repeat 40 cycles of 20 sec denaturation at 94 ° C, 20 sec annealing at 57 ° C, and 40 sec elongation at 72 ° C;
72°C에서 5분간 최종 신장 (final extension);]Final extension at 72 ° C for 5 minutes;
수득된 PCR 산물은 2% 아가로오스 겔에서 전기영동을 통해 확인하였으며, PCR 산물의 정제를 위해 SAP (Shrimp alkaline phosphatase (USB, Cleveland, USA)) 및 엑소뉴클레아제 I (USB, Cleveland, USA)을 이용하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.The obtained PCR products were confirmed by electrophoresis on 2% agarose gel. To purify the PCR products, SAP (Shrimp alkaline phosphatase (USB, Cleveland, USA)) and exonuclease I (USB, Cleveland, USA ) Were used. The results are shown in Fig.
도 1에 나타낸 바와 같이, 정상인과 난청 환자의 샘플로부터 1회의 PCR을 통해 7개의 돌연변이 부위를 한번에 증폭시킬 수 있음을 확인하였다.
As shown in FIG. 1, it was confirmed that one mutation site can be amplified at once by PCR from a sample of normal and deaf persons.
실시예Example 3. 3. 스냅샷Snapshot ( ( SNaPshotSNaPshot ) ) 미니시퀀싱Mini Sequencing 반응 reaction
스냅샷 미니시퀀싱을 통해 상기 실시예 1에서 수득한 각 개체의 유전자형을 분석하기 위하여, 총 7개의 신장 프라이머를 디자인하였다. 구체적인 신장 프라이머 (extension primer) 염기서열을 하기 표 2에 나타내었다. GJB2의 235 번째 C결실 돌연변이 외에 6 개의 돌연변이 모두 A/G 혹은 T/C의 염기전이돌연변이(transition mutation)로서 비슷한 위치에서 결과 피크가 겹쳐질 수도 있는 가능성을 배제하기 위해, SLC26A4의 c.1149+3A>G 돌연변이의 신장 프라이머는 R 방향으로 선택하였다. In order to analyze the genotype of each individual obtained in Example 1 through snapshot mini sequencing, a total of 7 extension primers were designed. Specific elongation primer base sequences are shown in Table 2 below. In addition to the 235th C deletion mutation of GJB2, all six mutations were transient mutations of A / G or T / C, so as to exclude the possibility of overlapping the resultant peaks at similar positions, the c.1149 + The elongation primers of 3A> G mutants were selected in the R direction.
(pmol/μl)Final concentration
(pmol / μl)
상기 실시예 2에서 수득한 멀티플레스 PCR 산물 2.45 μl, 1× 신장 프라이머 혼합물 및 SNaPshot Multiplex Ready Reaction Mix (Applied Biosystems, Foster City, USA) 3 μl를 포함하는 최종 부피 15 μl의 반응 혼합물을 제조한 후, 하기 조건에 따라 단일 염기 신장 (single base extension, SBE) 반응을 수행하였다. 상기 1× 신장 프라이머 혼합물은 2.5× 신장 프라이머 혼합물을 반응 당 6 μl씩 사용한 것으로, 2.5× 신장 프라이머 혼합물은 상기 표2에서의 프라이머들의 최종농도보다 각각 2.5배의 농도로 혼합시킨 것이다.A reaction mixture of final volume 15 μl containing 2.45 μl of the multiple PCR product obtained in Example 2, 1 × elongation primer mixture and 3 μl of SNaPshot Multiplex Ready Reaction Mix (Applied Biosystems, Foster City, USA) was prepared , A single base extension (SBE) reaction was performed according to the following conditions. The 1 × extension primer mixture was prepared by mixing 2.5 × elongation primer mixture with 6 μl per reaction and 2.5 × elongation primer mixture at 2.5 times the final concentration of the primers in Table 2 above.
[96°C에서 10초간 변성, [Denaturation at 96 ° C for 10 seconds,
50°C에서 5초간 프라이머 어닐링, Primer annealing at 50 ° C for 5 seconds,
60°C에서 30초간 프라이머 신장 반응을 30 사이클 반복]30 cycles of primer extension reaction at 60 ° C for 30 seconds]
수득된 SBE 반응 산물의 정제를 위해 SAP를 이용하였으며, 스냅샷 미니시퀀싱 결과를 재 검증하기 위해 공지된 방법에 따라 Sanger 시퀀싱을 수행한 후 결과를 비교하였다. 그 결과를 도 2 및 표 3에 나타내었다. SAP was used for purification of the obtained SBE reaction product. Sanger sequencing was performed according to a known method to re - verify the snapshot mini - sequencing results, and the results were compared. The results are shown in FIG. 2 and Table 3.
(n=394)Number of alleles
(n = 394)
(n=278)Number of alleles
(n = 278)
heteroplasmym.1555A> G
heteroplasmy
도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 2에서 음성 대조군 및 양성 대조군으로 이용한 샘플의 유전자형을 분석해본 결과, 음성 대조군의 경우는 각각의 돌연변이 위치에서 정상의 유전자형 피크만을 나타냄을 확인하였으며, 각각의 돌연변이를 가지고 있는 양성 대조군의 경우는 돌연변이가 없는 부위에서는 음성 대조군과 같은 피크를 나타냈지만 각각의 개체가 가진 돌연변이 위치에서는 음성 대조군과 달리 돌연변이 유전자형 피크를 나타냄을 확인하였다. As shown in FIG. 2, the genotypes of the samples used as the negative control and the positive control in Example 2 were analyzed. As a result, it was confirmed that the negative control group showed only the normal genotype peak at each mutation position, Positive control group showed the same peak as that of the negative control at the site without mutation but it was confirmed that the mutant site of each individual had a mutant genotype peak unlike the negative control group.
또한, 표 3에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 개체에서 나타나는 돌연변이의 빈도를 분석한 결과, 20세의 정상 청력을 가진 여성이 미토콘드리아 12S rRNA 유전자의 m.1555A>G를 헤테로플라스미(heteroplasmy)로 가지고 있었으며, 35세 정상 청력을 가진 여성이 GJB2 유전자의 c.235delC 및 SLC26A4 유전자의 c.2168A>G 부위에서 이형 접합 대립 유전자 (heterozygous alleles)를 가지고 있음을 확인하였다. 또한, 8명의 정상 청력을 가진 한국인 및 6명의 신생아가 각각의 돌연변이를 가지고 있음을 확인하였다. 따라서 이를 통해, 돌연변이를 이형접합체로만 가지고 있는 개체는 유전성 난청이 나타날 가능성은 적으나, 각각의 개체가 가지고 있는 돌연변이에 대해 보인자임을 알 수 있다.
In addition, as shown in Table 3, the frequency of mutation in the individual of Example 1 was analyzed. As a result, it was found that a woman with normal hearing ability of 20 years old had heteroplasmy m.1555A> G of the mitochondrial 12S rRNA gene, were taken with, it was confirmed that women with normal hearing the age of 35 have a heterozygous allele (heterozygous alleles) in c.2168A> G sites of c.235delC and SLC26A4 gene of GJB2 gene. In addition, it was confirmed that there were mutations in each of 8 Korean normal hearing and 6 newborn babies. Thus, individuals with mutations only as heterozygotes are less likely to have hereditary hearing loss, but they can be seen to have mutations in each individual.
이상의 실험 결과를 통하여, 본 발명의 프라이머 세트는 한국인의 유전성 난청과 관련된 유전자인 GJB2, 미토콘드리아 12S rRNA 및 SLC26A4에 위치한 7개의 돌연변이를 한번에 검출할 수 있어, 빠르고 정확하게 한국인의 유전성 난청을 진단하고, 발병 가능성 여부를 예측하는데 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.Through the above experimental results, the primer set of the present invention can detect seven mutations located in GJB2, mitochondrial 12S rRNA and SLC26A4, which are genes related to hereditary deafness in Korean, at once to diagnose Korean hereditary deafness quickly and accurately, And that it can be used to predict the likelihood.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Marker composition for diagnosis of hereditary hearing loss in Korean population <130> s <160> 21 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GJB2 forward Primer <400> 1 tcttttccag agcaaaccgc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GJB2 reverse Primer <400> 2 gatgcggacc ttctgggttt 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mt 12S rRNA forward Primer <400> 3 cgtcaccctc ctcaagtata cttc 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mt 12S rRNA reverse Primer <400> 4 gctttgtgtt aagctacact ctgg 24 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC26A4 (c.439A>G) forward Primer <400> 5 tttttaaacc ctatgcagac aca 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC26A4 (c.439A>G) reverse Primer <400> 6 ttaatacagt tccattgctg ctg 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC26A4 (c.919-2A>G) forward Primer <400> 7 caaaatccca gtccctattc cta 23 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC26A4 (c.919-2A>G) reverse Primer <400> 8 ggttgtttct tccagatcac acac 24 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC26A4 (c.1149+3A>G) forward Primer <400> 9 gcttgttctc ggagatgctg 20 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC26A4 (c.1149+3A>G) reverse Primer <400> 10 agtgatgcag tgtgtctatt cc 22 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC26A4 (c.1229C>T) forward Primer <400> 11 ggatcgttgt catccagtct c 21 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC26A4 (c.1229C>T) reverse Primer <400> 12 ttaccaggcc atctgtctcc 20 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC26A4 (c.2168A>G) forward Primer <400> 13 cctgggcaat agaatgagac tc 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC26A4 (c.2168A>G) reverse Primer <400> 14 aaatggaacc ttgaccctct tg 22 <210> 15 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GJB2 extension Primer <400> 15 acgatcacta cttccccatc tcccacatcc ggctatgggc c 41 <210> 16 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mt 12S rRNA extension Primer <400> 16 ttaactaaaa cccctacgca tttatataga ggag 34 <210> 17 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC26A4 (c.439A>G) extension Primer <400> 17 ttaataactg attaattgtt agagactttt tttccccagg accttttcca gtggtgagtt 60 ta 62 <210> 18 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC26A4 (c.919-2A>G) extension Primer <400> 18 aagttcagca ttatttggtt gacaaacaag gaattattaa aaccaatgga gtttttaaca 60 tcttttgttt tatttc 76 <210> 19 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC26A4 (c.1149+3A>G) extension Primer <400> 19 tatgtttttt tcctgtttcc agccctataa aaccagttca gcaaaagggc accca 55 <210> 20 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC26A4 (c.1229C>T) extension Primer <400> 20 cctttgggat cagcaacatc ttctcaggat tcttctcttg ttttgtggcc accactgctc 60 tttcccgca 69 <210> 21 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC26A4 (c.2168A>G) extension Primer <400> 21 ggttctttga cgacaacatt agaaaggaca cattcttttt gacggtcc 48 <110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Marker composition for diagnosis of hereditary hearing loss in Korean population <130> s <160> 21 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GJB2 forward Primer <400> 1 tcttttccag agcaaaccgc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GJB2 reverse Primer <400> 2 gatgcggacc ttctgggttt 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mt 12S rRNA forward Primer <400> 3 cgtcaccctc ctcaagtata cttc 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mt 12S rRNA reverse Primer <400> 4 gctttgtgtt aagctacact ctgg 24 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC26A4 (c.439A> G) forward Primer <400> 5 tttttaaacc ctatgcagac aca 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC26A4 (c.439A> G) reverse primer <400> 6 ttaatacagt tccattgctg ctg 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC26A4 (c.919-2A> G) forward Primer <400> 7 caaaatccca gtccctattc cta 23 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC26A4 (c.919-2A> G) reverse primer <400> 8 ggttgtttct tccagatcac acac 24 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC26A4 (c.1149 + 3A> G) forward Primer <400> 9 gcttgttctc ggagatgctg 20 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC26A4 (c.1149 + 3A> G) reverse primer <400> 10 agtgatgcag tgtgtctatt cc 22 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC26A4 (c.1229C> T) forward Primer <400> 11 ggatcgttgt catccagtct c 21 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC26A4 (c.1229C> T) reverse primer <400> 12 ttaccaggcc atctgtctcc 20 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC26A4 (c.2168A> G) forward Primer <400> 13 cctgggcaat agaatgagac tc 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC26A4 (c.2168A> G) reverse primer <400> 14 aaatggaacc ttgaccctct tg 22 <210> 15 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GJB2 extension Primer <400> 15 acgatcacta cttccccatc tcccacatcc ggctatgggc c 41 <210> 16 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mt 12S rRNA extension Primer <400> 16 ttaactaaaa cccctacgca tttatataga ggag 34 <210> 17 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC26A4 (c.439A> G) extension Primer <400> 17 ttaataactg attaattgtt agagactttt tttccccagg accttttcca gtggtgagtt 60 ta 62 <210> 18 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC26A4 (c.919-2A> G) extension Primer <400> 18 aagttcagca ttatttggtt gacaaacaag gaattattaa aaccaatgga gtttttaaca 60 tcttttgttt tatttc 76 <210> 19 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC26A4 (c.1149 + 3A> G) extension Primer <400> 19 tatgtttttt tcctgtttcc agccctataa aaccagttca gcaaaagggc accca 55 <210> 20 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC26A4 (c.1229C> T) extension Primer <400> 20 cctttgggat cagcaacatc ttctcaggat tcttctcttg ttttgtggcc accactgctc 60 tttcccgca 69 <210> 21 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC26A4 (c.2168A> G) extension Primer <400> 21 ggttctttga cgacaacatt agaaaggaca cattcttttt gacggtcc 48
Claims (6)
A marker composition for diagnostic hereditary hearing loss in Koreans comprising a primer set consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 to 14.
A hereditary hearing loss diagnostic kit for Koreans comprising a primer set consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 to 14.
(b) 상기 (a) 단계에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 14의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 산물의 염기서열을 분석하여 한국인의 유전성 난청을 진단하는 단계;를 포함하는 한국인의 유전성 난청 진단 방법.
(a) separating DNA from the target sample;
(b) amplifying the target sequence using the DNA isolated in step (a) as a template and using a primer set consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 to 14; And
(c) analyzing the base sequence of the amplified product in step (b) to diagnose a Korean hereditary deafness.
상기 (b) 단계의 표적 서열 증폭은 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), 복구연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication), 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR), 핵산염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 한국인의 유전성 난청 진단 방법.
The method of claim 3,
The amplification of the target sequence in step (b) may be performed using a polymerase chain reaction (PCR), a reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), a ligase chain reaction (LCR) repair chain reaction, transcription-mediated amplification (TMA), self-sustained sequence replication, selective amplification of target polynucleotide sequences, consensus sequence priming (PCR), arbitrary primed polymerase chain reaction (PCR), nucleic acid sequence based amplification (NASBA), and primer-based amplification Strand displacement amplification and loop-mediated isothermal amplification (LAMP). ≪ RTI ID = 0.0 > The method being characterized in that the method is performed by a method as described above.
상기 (c) 단계의 염기 서열 분석 방법은 스냅샷(sNaPShot) 분석 방법, DNA 서열분석 (sequencing) 방법, PCR-SSCP (single stranded conformation polymorphism) 분석 방법, RFLP (restriction fragment length polymorphism) 분석 방법, 대립형질 (allele) 특이적 혼성화 방법, DNA 칩 방법, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 방법, 면역블롯 (immunoblot) 방법, TDGS(Two-dimensional Gene Scanning) 방법, Taq-Man 방법 및 TOGATM 방법으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 한국인의 유전성 난청 진단 방법.
The method of claim 3,
The method of analyzing the nucleotide sequence of step (c) may include a method of analyzing a sequence, such as a snapshot analysis method, a DNA sequencing method, a PCR-SSCP method, a restriction fragment length polymorphism (RFLP) An allele-specific hybridization method, a DNA chip method, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method, an immunoblot method, a two-dimensional Gene Scanning (TDGS) method, a Taq-Man method and a TOGATM method ≪ / RTI > wherein the method is performed by at least one method selected from the group consisting of:
상기 (c) 단계의 염기 서열 분석 방법을 위해 스냅샷 분석 방법을 이용할 경우, 서열번호 15 내지 21로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 한국인의 유전성 난청 진단 방법.6. The method of claim 5,
Wherein the method is performed using a primer set consisting of SEQ ID NOS: 15 to 21 when the snapshot analysis method is used for the base sequence analysis method of the step (c).
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2013
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