KR20140088227A

KR20140088227A - 단백질 키나아제 3의 발현을 억제하기 위한 수단

Info

Publication number: KR20140088227A
Application number: KR1020147016853A
Authority: KR
Inventors: 조르그 카우프맨; 올리버 케일; 안스갈 산텔
Original assignee: 사일런스 테라퓨틱스 아게
Priority date: 2006-07-21
Filing date: 2007-07-20
Publication date: 2014-07-09

Abstract

본 발명은 이중가닥 구조를 포함하는 핵산 분자에 관한 것으로, 상기 이중가닥 구조는 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하고, 상기 제1 가닥은 인접하는(contiguous) 뉴클레오티드의 제1 스트레치(stretch)를 포함하고 또 상기 제1 스트레치는 표적 핵산에 적어도 부분적으로 상보적이며, 또 상기 제2 가닥은 인접하는 뉴클레오티드의 제2 스트레치를 포함하고 또 상기 제2 스트레치는 제1 스트레치와 적어도 부분적으로 상보적이며, 상기 제1 스트레치는 서열번호 1 (NM_013355)에 따른 핵산서열의 뉴클레오티드 코어 서열 또는 그의 일부에 적어도 부분적으로 상보적인 핵산서열을 포함하고, 상기 뉴클레오티드 코어 서열은 다음 뉴클레오티드 서열
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 482 내지 500 (서열번호 2)
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 1555 내지 1573 (서열번호 4);
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 1556 내지 1574 (서열번호 6);
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 1559 내지 1577 (서열번호 8);
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 1566 내지 1584 (서열번호 10);
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 2094 내지 2112 (서열번호 12);
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 2102 내지 2120 (서열번호 14);
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 2286 내지 2304 (서열번호 16);
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 2761 내지 2779 (서열번호 18);
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 2763 내지 2781 (서열번호 20);
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 2764 내지 2782 (서열번호 22);
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 2843 내지 2861 (서열번호 24);
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 2844 내지 2862 (서열번호 26); 또는
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 2846 내지 2864 (서열번호 28)을 포함하고,
바람직하게는 상기 뉴클레오티드 코어 서열은 다음 뉴클레오티드 서열
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 1555 내지 1573 (서열번호 4);
뉴클레오티드 위치 1556 내지 1574 (서열번호 6);
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 1559 내지 1577 (서열번호 8);
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 1566 내지 1584 (서열번호 10);
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 2094 내지 2112 (서열번호 12); 또는
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 2286 내지 2304 (서열번호 16)을 포함하며,
바람직하게는 상기 제1 스트레치는 부가적으로 뉴클레오티드 코어 서열의 5' 말단 앞의 영역 및/또는 뉴클레오티드 코어 서열의 3' 말단 이후의 영역에 적어도 부분적으로 상보적인 핵산 분자에 관한 것이다.

Description

단백질 키나아제 3의 발현을 억제하기 위한 수단{Means for inhibiting the expression of protein kinase 3}

본 발명은 단백질 키나아제 3의 발현을 억제하는데 적합한 이중가닥 핵산 및 그의 용도에 관한 것이다.

종양발생은 Foulds(Foulds, 1958)에 의해 다단계 생물학적 과정으로 기재되었고, 현재는 유전자 손상의 축적에 의해 생기는 것으로 알려져 있다. 분자 수준에서 종양형성의 다단계 과정은 양성 및 음성 조절 이팩터(effecotrs)(Weinberg, 1989)의 파괴를 포함한다. 인간 대장 암종에 대한 분자 기준은 Vogelstein 및 그의 동료에 의해(Fearon and Vogelstein, 1990) 다수의 발암유전자, 종양 억제 유전자 및 수선 유전자를 포함하는 것으로 가정되었다. 유사하게, 망막모세포종의 발생을 초래하는 결함은 다른 종양 억제 유전자와 관련되어 있었다(Lee et al., 1987). 여전히 다른 발암유전자 및 종양 억제인자는 다른 다수의 악성종양에서 확인되었다. 불행히도, 여전히 치료가능한 암의 수가 불충분하며, 암의 효과는 파괴적이어서 미국에서만 매년 50만명이 넘는 사람이 사망하고 있다.

암은 기본적으로 세포성 DNA에 대한 손상이 세포 증식을 제어하는 정상 메카니즘을 파괴를 초래하는 유전자 질병이다. 종양 억제인자가 게놈 통합성을 유지하는 것에 의한 2개의 작용 메카니즘은 세포 체포에 의해 손상 DNA의 수선을 허용하거나, 또는 세포자살에 의해 손상 DNA의 제거를 허용하는 것이다(Ellisen and Haber, 1998). 다르게 "프로그래밍된 세포 치사"로 불리는 세포 자살은 비가역적으로 손상된 세포를 제거하는 목적으로 세포 자살 프로그램으로 작용하는 생화학적 작용의 조심스럽게 조절되는 네트워크이다. 세포 자살은 종양 괴사 인자의 결합, DNA 손상, 생장인자의 제거, 및 Fas 수용체의 항체 교차결합을 비롯한 다수의 방식으로 유발될 수 있다. 세포자살 과정에 역할을 하는 몇 가지 유전자가 확인되었지만, 세포자살을 초래하는 경로는 충분히 밝혀지지 않았다. 다수의 연구자는, 유전자가 환자에서 암을 치료하기 위해 종양 세포에서 선택적으로 세포자살을 유도하기 위한 수단을 갖게할 목적으로 신규 세포 자살 증진 유전자를 밝혀내려 하고 있다. 암을 치료하는 다른 방법은 엔도스타틴^TM 또는 항-VEGF 항체와 같은 약물을 사용한 혈관신생의 억제를 포함한다. 이러한 방법에서, 상기 목적은 일차 종양의 혈관화를 방지하고 또 실질적인 혈관 생장없이 종양 세포 생존을 지지할 수 있도록 전이 병반의 크기를 억제하는 것이다.

특정 그룹의 암 질병은 종양의 생장 속도, 정상 조직으로의 침투, 화학요법또는 기타 통상적인 치료법에 대한 내성 및 몸 전체를 통한 전이의 형성 측면에서 침습적인 암 질환이다. 더욱 침습적인 암의 경우에서, 암 조직은 정상 조직과 더욱 상이하며 또 종양은 퍼지기가 더 쉽다. 따라서, 현재의 암 연구에서 일개 목적은 종양 생장을 억제하고 및/또는 몸 전체를 통하여 암 세포가 퍼지는 것을 감소시키는 약물을 개발하는 것이다.

무엇이 침습적 암 질환인지에 대한 정의는 http://www.cancer.gov/Templates/db alpha . aspx ? CdrID = 46053 인 National Cancer Institute의 홈페이지로부터 얻을 수 있다. 또한 암 질환의 침습성을 설명하기 위하여, 현미경하에서 조사할 때 이들이 어느 정도 비정상적으로 나타나는지 측면에서 암 세포를 분류하는 계로서 전형적인 등급을 이용한다. 등급 계의 목적은 종양의 적합한 생장 속도 및 그의 퍼지는 경향에 대한 정보를 제공하는 것이다. 종양의 등급을 매기기 위해 이용된 계는 각 암 유형에 따라 달라진다. 등급은 병반 치료에서 중요한 역할을 한다.

이러한 등급 계는 이 기술분야의 당업자에게 잘 공지되어 있다. 이들의 하나는 글리슨 스코어(Gleason score)로서, 이것은 현미경 하에서 어떻게 보이는지를 기본으로 하여 전립선 암 조직의 등급 계를 나타낸다. 글리슨 스코어는 2 내지 10 범위이며 종양이 어떻게 퍼지는지를 나타낸다. 낮은 글리슨 스코어는 암 조직이 정상 전립선 조직과 유사하고 또 종양은 잘 퍼지지 않음을 나타낸다; 높은 글리슨 스코어는 암 조직이 정상 조직과 매우 상이하며 종양이 더욱 쉽게 퍼지는 것을 의미한다.

단백질 키나아제 N 베타 또는 PKN 베타로서 지칭되는 PKN3은 암 및 종양과 관련하여 가치있는 타겟이다. 국제 특허출원 WO 2004/019973호에 기재된 바와 같이, 단백질 키나아제 N 베타는 종양형성 및 전이와 관련된 PI-3 키나아제/PTEN 경로의 다운스트림(downstream) 타겟이다. 특히 후술한 효과는 억제인자(suppressor) 작용, 더욱 특히 PTEN 종양 억제인자 작용의 손실과 강하게 관련된 것으로 보인다. WO 2004/011973호에 나타낸 바와 같이, 단백질 키나아제 N 베타는 PI-3 키나아제 경로에 대한 억제제인 PTEN이 활성이 아닌 조건하에서 상향조절(up-regulated)될 것이다. 단백질 키나아제 N 베타의 상향조절로 인하여, 이러한 상향조절이 생기는 세포는 전이 거동 및 이동 거동에서 개선을 나타낼 것이다. 이것은 단백질 키나아제 N 베타의 억제인자는 세포의 전이 및 이동 거동을 제어하는데 적합한 수단이며 또 이것은 종양 및 암, 보다 특히 전이 및/또는 이동 거동을 나타내는 전이 세포인 종양 및 암을 치료하기 위한 적합한 수단임을 의미한다.

이 기술분야에서 종양 질환의 치료를 위한 수단이 계속 요청되고 있다. 더욱 자세하게는, 공격적이고 또 침해적인 거동인 종양 질병에 적합한 수단도 또한 필요하다.

혈관신생, 더욱 특히 종양 질병의 기초로 되는 병리학적 메카니즘에 관여하는 혈관신생에 영향을 주기에 적합한 수단도 또한 요청되고 있다. 이러한 요청은 본 발명의 기초를 이루는 문제를 정의한다.

본 발명의 기초를 이루는 문제는 첨부된 독립항의 객체에 의해 해결된다. 바람직한 구체예는 종속항으로부터 취할 수 있다.

본 발명의 기초를 이루는 문제는 이중가닥 구조의 핵산 분자에 의해 해결되며, 이때

- 상기 이중가닥 구조는 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하고,

- 상기 제1 가닥은 연속적인(contiguous) 뉴클레오티드의 제1 스트레치(stretch)를 포함하고 또 상기 제1 스트레치는 표적 핵산에 적어도 부분적으로 상보적이며, 또

상기 표적 핵산은 PKN3을 코딩하는 mRNA이다.

더욱 자세하게는, 본 발명의 기초를 이루는 문제는 제1 양태로서, 이중가닥 구조를 포함하는 핵산 분자에 의해 해결되며, 이때

상기 이중가닥 구조는 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하고,

상기 제1 가닥은 연속적인(contiguous) 뉴클레오티드의 제1 스트레치(stretch)를 포함하고 또 상기 제1 스트레치는 표적 핵산에 적어도 부분적으로 상보적이며, 또

상기 제2 가닥은 연속적인 뉴클레오티드의 제2 스트레치를 포함하고 또 상기 제2 스트레치는 제1 스트레치와 적어도 부분적으로 상보적이며,

상기 제1 스트레치는 서열번호 1 (NM_013355)에 따른 핵산서열의 뉴클레오티드 코어 서열 또는 그의 일부에 적어도 부분적으로 상보적인 핵산 서열을 포함하고,

상기 뉴클레오티드 코어 서열은 다음 뉴클레오티드 서열

서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 482 내지 500 (서열번호 2)

서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 1555 내지 1573 (서열번호 4);

서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 1556 내지 1574 (서열번호 6);

서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 1559 내지 1577 (서열번호 8);

서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 1566 내지 1584 (서열번호 10);

서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 2094 내지 2112 (서열번호 12);

서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 2102 내지 2120 (서열번호 14);

서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 2286 내지 2304 (서열번호 16);

서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 2761 내지 2779 (서열번호 18);

서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 2763 내지 2781 (서열번호 20);

서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 2764 내지 2782 (서열번호 22);

서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 2843 내지 2861 (서열번호 24);

서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 2844 내지 2862 (서열번호 26); 또는

서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 2846 내지 2864 (서열번호 28)을 포함하고,

바람직하게는 상기 뉴클레오티드 코어 서열은 다음 뉴클레오티드 서열

서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 1555 내지 1573 (서열번호 4);

뉴클레오티드 위치 1556 내지 1574 (서열번호 6);

서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 1559 내지 1577 (서열번호 8);

서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 1566 내지 1584 (서열번호 10);

서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 2094 내지 2112 (서열번호 12); 또는

서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 2286 내지 2304 (서열번호 16)을 포함하며,

바람직하게는 상기 제1 스트레치는 부가적으로 뉴클레오티드 코어 서열의 5' 말단 앞의 영역 및/또는 뉴클레오티드 코어 서열의 3' 말단 이후의 영역에 적어도 부분적으로 상보적이다.

본 발명의 제1 요지의 일 구체예로서, 핵산의 제1 스트레치는 뉴클레오티드 코어 서열 또는 그의 일부에 상보적이다.

본 발명의 제1 요지의 다른 구체예로서, 핵산의 제1 스트레치는 뉴클레오티드 코어 서열의 3' 말단 이후의 영역 및/또는 뉴클레오티드 코어 서열의 5' 말단 이전의 영역에 또한 상보적이다.

본 발명의 제1 요지의 다른 구체예로서, 핵산의 제1 스트레치는 18 내지 29개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 19 내지 25개의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 19 내지 23개의 뉴클레오티드 이상의 표적 핵산에 상보적이다.

본 발명의 제1 요지의 바람직한 구체예로서, 핵산의 뉴클레오티드는 연속적(consecutive) 뉴클레오티드이다.

본 발명의 제1 요지의 다른 구체예로서, 핵산의 제1 스트레치 및/또는 제2 스트레치는 18 내지 29 개의 연속적 뉴클레오티드, 바람직하게는 19 내지 25개의 연속적 뉴클레오티드 및 더욱 바람직하게는 19 내지 23개의 연속적 뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명의 제1 요지의 다른 구체예로서, 핵산의 제1 가닥은 제1 스트레치로 구성되고 또 핵산의 제2 가닥은 제2 스트레치로 구성된다.

본 발명의 기초를 이루는 문제는 제2 요지로서, 이중가닥 구조를 포함하는 핵산 분자, 바람직하게는 제1 요지에 따른 핵산 분자에 의해 해결되며, 이때 상기 이중가닥 구조는 제1 가닥 및 제2 가닥에 의해 형성되며, 상기 제1 가닥은 연속적인 뉴클레오티드의 제1 스트레치를 포함하고 또 상기 제2 가닥은 연속적인 뉴클레오티드의 제2 스트레치를 포함하며 또 상기 제1 스트레치는 상기 제2 스트레치에 적어도 부분적으로 상보적이며,

- 상기 제1 스트레치는 서열번호 3에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 2에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되며;

- 상기 제1 스트레치는 서열번호 5에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 4에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고;

- 상기 제1 스트레치는 서열번호 7에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 6에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되며;

- 상기 제1 스트레치는 서열번호 9에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 8에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고;

- 상기 제1 스트레치는 서열번호 11에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 10에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되며;

- 상기 제1 스트레치는 서열번호 13에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 12에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고;

- 상기 제1 스트레치는 서열번호 15에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 14에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되며;

- 상기 제1 스트레치는 서열번호 17에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 16에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고;

- 상기 제1 스트레치는 서열번호 19에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 18에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되며;

- 상기 제1 스트레치는 서열번호 21에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 20에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고;

- 상기 제1 스트레치는 서열번호 23에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 22에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되며;

- 상기 제1 스트레치는 서열번호 25에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 24에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고;

- 상기 제1 스트레치는 서열번호 27에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 26에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되며; 또는

- 상기 제1 스트레치는 서열번호 29에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 28에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고;

- 상기 제1 스트레치는 서열번호 31에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 30에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되며;

- 상기 제1 스트레치는 서열번호 33에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 32에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고;

- 상기 제1 스트레치는 서열번호 35에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 34에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되며;

- 상기 제1 스트레치는 서열번호 37에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 36에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고;

- 상기 제1 스트레치는 서열번호 39에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 38에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되며;

바람직하게는,

- 상기 제1 스트레치는 서열번호 17에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 16에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되며; 또는

- 상기 제1 스트레치는 서열번호 31에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 30에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성된다.

본 발명의 제1 요지 및 제2 요지의 일 구체예로서, 핵산 분자의 제1 스트레치 및/또는 제2 스트레치는 2' 위치에서 변형을 갖는 복수의 변형 뉴클레오티드 그룹을 포함함으로써 규칙적인, 바람직하게는 교대되는 위치 패턴을 형성하며, 상기 스트레치 내에서 각 그룹의 변형 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 측면 그룹의 한면 또는 양쪽에서 인접하며, 뉴클레오티드의 측면 그룹을 형성하는 인접 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드의 변형과는 상이한 변형을 갖는 뉴클레오티드이다.

본 발명의 제1 요지 및 제2 요지의 일 구체예로서, 핵산의 제1 스트레치 및/또는 핵산의 제2 스트레치는 변형된 뉴클레오티드 그룹의 패턴 및/또는 뉴클레오티드의 측면 그룹의 패턴을 포함한다.

본 발명의 제1 요지 및 제2 요지의 일 구체예로서, 핵산의 제1 스트레치 및/또는 핵산의 제2 스트레치는 3' 말단에서 디뉴클레오티드를 포함하며, 이러한 디뉴클레오티드는 바람직하게는 TT이다.

본 발명의 제1 요지 및 제2 요지의 바람직한 구체예로서, 핵산의 제1 스트레치 및/또는 핵산의 제2 스트레치의 길이는 19 내지 21개 뉴클레오티드로 구성된다.

본 발명의 제1 요지 및 제2 요지의 일 구체예로서, 핵산의 제1 및/또는 제2 스트레치는 3' 말단에서 1 내지 5개 뉴클레오티드의 오버헹(overhang)을 포함한다.

본 발명의 제1 요지 및 제2 요지의 일 구체예로서, 핵산의 이중가닥 구조의 길이는 약 16 내지 24개 뉴클레오티드 쌍, 바람직하게는 20 내지 22개 뉴클레오티드 쌍이다.

본 발명의 제1 요지 및 제2 요지의 일 구체예로서, 핵산의 제1 가닥 및 핵산의 제2 가닥은 서로에 대하여 공유결합되며, 바람직하게는 제1 가닥의 3'말단이 제2 가닥의 5' 말단에 공유결합된다.

본 발명의 제1 요지 및 제2 요지의 일 구체예로서, 핵산 분자는 하기 각각 2 가닥로 구성되며 밑줄친 뉴클레오티드는 2'-O-메틸이다:

바람직하게는

본 발명의 기초를 이루는 문제는 제3 요지로서, 제1 또는 제2 요지에 따른 핵산을 포함하는 리포좀 제형(liposomal formulation)에 의해 해결된다.

본 발명의 기초를 이루는 문제는 제4 요지로서, 제1 또는 제2 요지에 따른 핵산 분자 및 리포좀을 포함하는 리포플렉스(lipoplex)에 의해 해결된다.

본 발명의 제4 요지의 바람직한 구체예로서, 리포플렉스의 리포좀은

a) 약 50몰%의 β-아르기닐-2,3-디아미노프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드, 바람직하게는 (β-L-아르기닐)-2,3-L-디아미노프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리-히드로클로라이드);

b) 약 48 내지 49 몰%의 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPhyPE); 및

c) 약 1 내지 2 몰%의 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리에틸렌-글리콜, 바람직하게는 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 나트륨염으로 구성된다.

본 발명의 제4 요지의 더욱 바람직한 구체예로서, 리포플렉스의 제타-포텐셜은 약 35 내지 60 mV, 바람직하게는 약 45 내지 50 mV이다.

본 발명의 제4 요지의 일 구체예로서, 리포플렉스의 크기는 QELS에 의해 측정된 바와 같이 약 50 내지 400 nm, 바람직하게는 약 100 내지 140 nm, 더욱 바람직하게는 약 110 nm 내지 약 130 nm 이다.

본 발명의 기초를 이루는 문제는 제5 요지로서, 벡터, 바람직하게는 제1 및 제2 요지에 따른 핵산을 포함하거나 또는 코딩하는 발현 벡터에 의해 해결된다.

본 발명의 기초를 이루는 문제는 제6 요지로서, 상술한 요지의 어느 것에 따른 핵산 또는 상술한 요지의 어느 것에 따른 벡터를 포함하는 세포에 의해 해결된다.

본 발명의 기초를 이루는 문제는 제7 요지로서, 조성물, 바람직하게는 제1 또는 제2 요지에 따른 핵산, 제3 요지에 따른 리포좀 제형, 제4 요지에 따른 리포플렉스, 제5 요지에 따른 벡터 및/또는 제6 요지에 따른 세포를 포함하는 약학적 조성물에 의해 해결된다.

본 발명의 제7 요지의 바람직한 구체예로서, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 경우에 따라 더 포함하는 약학적 조성물이다.

본 발명의 제7 요지의 더욱 바람직한 구체예로서, 상기 조성물은 약학적 조성물이고 또 상기 약학적 조성물은 혈관신생 의존적 질병, 바람직하게는 불충분한, 비정상적 또는 과도한 혈관신생을 특징으로 하거나 그에 의해 유발되는 질병을 치료하기 위한 것이다.

본 발명의 제7 요지의 가장 바람직한 구체예로서, 상기 조성물의 혈관신생은 지방조직, 피부, 심장, 눈, 폐, 장, 생식기관, 뼈 및 관절의 혈관신생이다.

본 발명의 제7 요지의 일 구체예로서, 상기 질병은 전염병, 자가면역 질병, 혈관 기형, 죽상동맥경화증, 이식 동맥병증, 비만, 건선, 사마귀, 알레르기성 피부염, 일차유리체증식증, 당뇨망막병증, 미숙아 망막병증, 노화 관련 황반 질병, 맥락막 혈관신생, 일차 폐 고혈압, 천식, 코의 폴립, 염증성 장 및 치주 질환, 복수, 복막 접합, 자궁내막증, 자궁 출혈, 난소 낭종, 난소 과다자극, 관절염, 윤활막염, 골수염, 골증식체 형성을 포함하는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 제7 요지의 다른 구체예로서, 약학적 조성물은 종양 질병, 바람직하게는 암 질병, 더욱 바람직하게는 고형암의 치료용이다.

본 발명의 제7 요지의 다른 구체예로서, 약학적 조성물은 골암, 유방암, 전립선암, 소화계의 암, 직장결장암, 간암, 폐암, 신장암, 비뇨생식기 암, 췌장암, 뇌하수체 암, 고환암, 안와암, 머리 및 목 암, 중앙신경계의 암 및 호흡기계의 암을 포함하는 군으로부터 선택된 질병 치료용이다.

본 발명의 기초를 이루는 문제는 제8 요지로서, 약물의 제조를 위해 제1 또는 제2 요지에 따른 핵산, 제3 요지에 따른 리포좀 제형, 제4 요지에 따른 리포플렉스, 제5 요지에 따른 벡터 및/또는 제6 요지에 따른 세포를 사용하는 것에 의해 해결된다.

본 발명의 제8 요지의 일 구체예로서, 상기 약물은 본 발명의 제7 요지와 관련하여 정의된 질병의 어느 것을 치료하기 위해 사용된다.

본 발명의 제8 요지의 바람직한 구체예로서, 상기 약물은 일개 또는 몇개의 다른 요법과 조합되어 사용된다.

본 발명의 제8 요지의 더욱 바람직한 구체예로서, 상기 요법은 화학요법, 냉동요법, 온열요법, 항체 요법, 방사선요법 및 항혈관신생요법을 포함하는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 제8 요지의 가장 바람직한 구체예로서, 상기 요법은 항체 요법이고, 더욱 바람직하게는 항-VEGF 항체(예컨대, 제넨테크-로체에 의해 제공되는 종류로서 상품명 Avastin으로 시판되는 것) 또는 항-안기오포에틴(anti-angiopoetin) 항체를 사용한 항체 요법이다.

본 발명의 제8 요지의 일 구체예로서, 상기 항혈관신생 요법은 키나아제 수용체 억제제, 바람직하게는 티로신 키나아제 수용체 억제제를 사용하며, 이러한 수용체는 VEGF 수용체, PDGF 수용체, Tie-2, FGFR 및 EGFR을 포함하는 군으로부터 선택된다. 이러한 종류의 억제제의 예는 VEGF-R 및 PDGF-R을 표적으로 하는 Sorafenib (바이에르 제조), 및 EGFR을 표적으로 하는 항체 Erbitux (머크/세로노 제조)이다. 상기 양쪽 약물은 항혈관신생 종류로 간주된다.

본 발명의 제8 요지의 바람직한 구체예로서, 상기 억제제는 siRNA, 안티센스 분자, 아프타머(aptamer), 스피겔머(spiegelmer), 고친화성 결합 펩티드, 펩티드 아프타머 및 항체를 포함하는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 제8 요지의 바람직한 구체예로서, 상기 약물은 1개 또는 몇개의 다른 요법, 바람직하게는 항-종양 또는 항암 요법과 함께 사용된다.

본 발명의 제8 요지의 더욱 바람직한 구체예로서, 상기 요법은 화학요법, 냉동요법, 온열요법, 항체 요법 및 방사선 요법을 포함하는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 제8 요지의 더욱 바람직한 구체예로서, 상기 요법은 항혈관신생 요법, 더욱 바람직하게는 항-VEGF 또는 항-안기오포에틴 항체를 사용하는 항체 요법이다.

본 발명의 다양한 요지의 더욱 바람직한 구체예로서, mRNA는 PKN3의 인간 mRNA이다. 더욱 더 바람직한 구체예로서, 상기 표적 핵산은 서열번호 1에 따른 핵산 서열을 갖는 mRNA이다.

더욱 자세하게 설명되는 바와 같이, 상술한 것을 함유하는 핵산 분자 및 약물 및 제형은 각각 침습적인 암, 공격적인 암 및 악성종양을 억제, 예방 또는 치료하기에 특히 적합하다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 침습적 암은 암이 생긴 조직층 밖으로 퍼져서 주위의 건강한 조직으로까지 생장하는 암이다. 이것은 침입성 암으로도 불린다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 공격적 암은 신속하게 생장하는 암이다.

바람직하게는 본 명세서에 사용된 바와 같이, 악성종양은 주변 조직에 침입해서 파괴하며 몸의 다른 부분으로 퍼지는 암종이다.

서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 mRNA와 비교할 때 다양한 개체 또는 개체군, 바람직하게는 군집에서 mRNA에는 1개 또는 몇 개의 단일 뉴클레오티드 변화가 존재할 수 있음을 당업자에게 잘 알려져 있다. 서열번호 1의 핵산 서열을 갖는 mRNA와 비교하여 1 또는 몇 개의 단일 뉴클레오티드 변화를 갖는 mRNA는 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 표적 핵산에 포함될 수 있다. 다른 구체예로서, 본 발명의 다양한 요지에 따른 핵산 분자는 PKN3 및 그를 코딩하는 mRNA의 발현을 억제하기에 적합하다. 더욱 바람직하게는 이러한 발현은 RNA 간섭 또는 전사후 유전자 침묵(post-transcriptional silence)으로 불리는 메카니즘에 의해 억제된다. 본 발명에 따른 siRNA 분자 및 RNAi 분자는 각각 RNA 간섭 감응을 유발하여 바람직하게는 표적 분자에 대한 mRNA의 녹다운(knock-down)을 초래하기에 적합하다. 지금까지, 이런 종류의 핵산 분자는 mRNA 수준에서 발현을 감소시키는 것에 의해 표적 분자의 발현을 감소시키에 적합하다. 본 발명의 범위에 속하는, PKN3을 코딩하는 다른 mRNA가 존재할 수 있는 것도 당업자에게 잘 알려져 있다. 더욱 자세하게는, 서열번호 1을 참조하여 확인된 특정 뉴클레오티드 위치는 본 발명의 내용을 기초로 하여 당업자에 의해 그러한 다른 mRNA에서 확인될 수 있다.

본 발명의 상기 요지에 따른 이중가닥 핵산이 상기 종류의 핵산 분자에 대해 기재된 디자인 중의 어느 것을 가질 수 있음은 잘 알려져 있다. 또한 바람직한 구체예로서 상술한 메카니즘은 서브-요지로 불리는 다양한 요지 및 디자인 원리와 관련하여 본 명세서에 기재된 핵산에 적용될 수 있음도 잘 알려져 있다.

RNA 간섭은 짧은 간섭성 RNA(siRNA)에 의해 매개된 동물에서 서열 특이적 전사후 유전자 침묵 과정을 지칭한다(Fire et al., 1998). 식물에서 상응하는 과정은 흔히 전사후 유전자 침묵 또는 RNA 침묵이라 불리며 또 진균에서는 쿠엘링(quelling)으로 지칭된다. 전사후 유전자 침묵 과정은 다양한 식물상 및 계통에 의해 공통적으로 공유되는 외래 유전자의 발현을 방지하기 위해 사용되는 발생학적으로 보존되는 세포 방어 메카니즘으로 생각된다(Fire, 1998 #263). 외래 유전자 발현으로부터 이러한 보호는 바이러스 감염으로부터 유도된 이중가닥 RNA(dsRNA)의 생산 또는 트랜스포손 요소가 동종 단일쇄 RNA 또는 바이러스성 게놈 RNA를 특이적으로 파괴하는 세포 감응을 통하여 숙주 게놈에 혼입하는 것에 감응하여 발생할 수 있다. 세포에서 dsRNA의 존재는 RNAi 감응을 유발하지만, 이들의 메카니즘은 아직 충분히 특징화되어 있지 않다. 동물 세포, 특히 포유동물 세포에서도 존재하는 이러한 메카니즘은 리보뉴클레아제 L에 의한 mRNA의 비-특이적 분해를 초래하는 단백질 키나아제 PKR 및 2',5'-올리고아데닐레이트 합성효소의 dsRNA-매개된 활성화에 기인한 인터페론 감응과는 상이한 것으로 보인다.

주로 크기에서 상이한 siRNA 분자 또는 RNAi 분자의 기본 디자인은 기본적으로 핵산 분자가 이중가닥 구조를 포함하는 것이다. 이중가닥 구조는 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함한다. 보다 바람직하게는, 제1 가닥은 연속적인 뉴클레오티드의 제1 스트레치를 포함하고 또 제2 가닥은 연속적인 뉴클레오티드의 제2 스트레치를 포함한다. 적어도 제1 스트레치 및 제2 스트레치는 필수적으로 서로에 대해 상보적이다. 이러한 상보성은 전형적으로 왓슨-크릭 염기쌍 또는 후그스텐 염기쌍(Hoogsteen base-pairng)을 비롯한 기타 당업자에게 공지된 염기쌍 메카니즘을 기본으로 하며, 이들에 한정되지 않는다. 이러한 이중가닥 구조의 길이에 따라서 염기 상보성 측면에서 완전한 매치는 반드시 필요한 것은 아니라는 것은 당업자에게 잘 알려져 있다. 그러나, 이러한 완전한 상보성은 일부 구체예에서는 바람직하다. 특히 바람직한 구체예로서 상보성 및/또는 동일성은 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%이다. 다른 특히 바람직한 구체예로서, 상보성 및/또는 동일성은 상보 및/또는 동일한 핵산 분자가 본 발명에 따른 핵산 분자의 스트랜드의 어느 하나, 더욱 바람직하게는 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1mM EDTA, 50℃ 또는 70℃ 혼성화(hybridize) 조건하에서 12-16시간 동안 2개 스트레치 중의 어느 하나와 혼성화된 다음 세척되게 하는 것이다. 각 반응 조건은 그 중에서도 유럽특허 EP 1 230 375호에 기재되어 있다.

이중가닥 구조가 RNA 간섭 메카니즘을 유발하기에 여전히 적합하고 또 바람직하게는 이러한 이중가닥 구조가 세포, 조직, 생물에서 우세한 생리학적 조건하에서 여전히 안정하게 형성되는한 미스매치(mismatch)도 또한 용인된다. 더욱 바람직하게는, 이중가닥 구조는 생리학적 완충액 중, 37℃에서 안정하다. 상기 종류의 미스매치는 바람직하게는 코어 영역이 상이한 본 발명에 따른 핵산 분자 내의 위치에 함유될 수 있음은 당업자들이 잘 알고 있을 것이다.

바람직하게는 본 명세서에 사용된 바와 같이, 핵산 분자 또는 스트레치 또는 그이 일부가 표적 핵산 분자에 부분적으로 상보적이라는 용어는 바람직하게는 이러한 표적 핵산이 RNA 간섭(매개) 핵산에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 표적화되면 표적 핵산과 상기 핵산, 스트레치 또는 그의 일부 사이의 상보성, 또는 그러한 상보성으로 인하여 형성된 이중가닥 구조는 RNA 간섭을 유발할 수 있는 것을 의미한다. 이러한 상보성 요건은 RNA 간섭 메카니즘에만 한정되는 것은 아니며 표적 핵산에 의해 암호화된 폴리펩티드와 같은 분자의 활성에서 하향 조절 또는 감소를 초래하는 어떠한 메카니즘으로 이해될 것이다. 일 구체예로서, 다른 핵산 분자와 부분적으로 상보적인 핵산 분자는 양쪽 핵산 분자를 염기쌍 이루기를 하면 1, 2, 3, 4 또는 5개의 미스매치를 포함한다. 더욱 바람직하게는 이렇게 형성된 이중가닥 핵산 분자는 19 내지 25개 염기 쌍을 포함한다.

제1 스트레치는 전형적으로 표적 핵산과 적어도 부분적으로 상보적이거나 또는 적어도 부분적으로 동일하며 또 제2 스트레치는 제1 및 제2 스트레치 사이의 관계를 고려하여 염기 상보성 측면에서 표적 핵산과 적어도 부분적으로 동일하거나 또는 적어도 부분적으로 상보적이다. hnRNA와 같은 다른 형태의 RNA도 본 명세서에 기재된 핵산 분자의 목적에 적합하지만, 표적 핵산은 바람직하게는 mRNA이다. 바람직하게는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 표적은 PKN3이고 또 표적 핵산은 더욱 바람직하게는 PKN3을 코딩하는 DNA 또는 RNA이거나, 또는 키나아제로서 작용하기 위한 전체길이의 PKN3의 특징을 적어도 갖는 그의 일부이다.

RNA 간섭은 수십개 또 때로는 수백개의 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 쌍을 포함하는 긴 핵산 분자를 사용할 때 관찰될 수 있지만, 더 짧은 RNAi 분자가 일반적으로 바람직하다. 제1 스트레치 및/또는 제2 스트레치의 길이에 대한 더욱 바람직한 범위는 약 18 내지 29개의 연속적 뉴클레오티드 및 더욱 바람직하게는 19 내지 23개 연속적 뉴클레오티드이다. 더욱 바람직하게는, 양쪽 제1 스트레치 및 제2 스트레치는 동일한 길이를 갖는다. 다른 구체예로서, 이중가닥 구조는 바람직하게는 16 내지 29개, 바람직하게는 18 내지 25개, 더욱 바람직하게는 19 내지 23개, 가장 바람직하게는 19 내지 21개 염기쌍을 포함한다.

본 발명에 따르면, 원칙적으로, PKN3을 코딩하는 mRNA의 일부는 이러한 siRNA 분자 및 RNAi 분자의 디자인을 위해 사용될 수 있지만, 본 발명자들은 놀랍게도 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 서열번호 1의 mRNA의 뉴클레오티드 위치 1555, 1556, 1559, 1566, 2094, 2286에서 시작하는 서열은 RNA 간섭 매개 분자에 의해 해결되기에 특히 적합하다는 것을 밝혀내었다.

더욱 특히, 본 발명자들은 이들 서열 및 출발점은 PKN3의 발현 억제를 위한 특히 바람직한 표적 서열이지만, 지금까지 특히 효과적인 이들 서열의 주변에 뉴클레오티드 코어가 존재한다. 이 코어는 일 구체예로서 상기 정의된 뉴클레오티드 서열의 약 9 내지 11개 마지막 뉴클레오티드로 구성된 서열이다. 그로부터 출발하여, 상기 코어는 기능적으로 활성인 이중가닥 핵산 분자가 얻어지도록 확장될 수 있고, 이때 기능적으로 활성이라는 것은 PKN3의 발현 억제에 영향을 주기에 적합하다는 것을 의미한다. 이러한 목적을 위하여, mRNA의 상응하는 일부, 즉 코어 서열과 동일한 제2 스트레치는 5' 말단에서 1개, 바람직하게는 몇 개의 뉴클레오티드에 의해 연장되는 반면에, 이렇게 부가된 뉴클레오티드는 필수적으로 상응하는 위치에서 표적 핵산에 존재하는 뉴클레오티드와 동일하다. 이러한 목적을 위하여, 표적 핵산에 필수적으로 상보적인 제1 가닥은 3' 말단에서 1개, 바람직하게는 몇 개의 뉴클레오티드에 의해 연장되며, 따라서 부가된 뉴클레오티드는 상응하는 위치, 즉 5' 말단에서 표적 핵산 중에 존재하는 뉴클레오티드에 대해 필수적으로 상보적이다.

이 디자인 원리에 따르면, 본 발명에 따른 코어 서열은 다음과 같이 요약될 수 있다:

더욱 바람직하게는, 각 이중가닥 분자의 위에 있는 가닥은 상기 표시에서 센스 가닥인 반면, 아래에 있는 가닥은 안티센스 가닥이며, 양쪽 모두 5' → 3' 방향으로 표시되어 있다.

더욱 더 바람직하게는, 센스 가닥에서 제2 뉴클레오티드에서 출발해서 매 두번째 뉴클레오티드는 2' 위치에서 바람직하게는 2'-O-Me 변형 뉴클레오티드로 변형되며 또 안티센스 가닥에서 제1 뉴클레오티드에서 출발해서 매 두번째 뉴클레오티드는 2' 위치에서 바람직하게는 2'-O-Me 변형 뉴클레오티드로 변형된다. 이러한 종류의 변형 또는 규칙적 또는 공간적 변형 패턴은 바람직한 구체예에서 본 발명에 따른 핵산 분자 상에서 실현될 수 있다.

다른 구체예로서, 코어 서열은 본 발명에 따른 이중 가닥 핵산 분자의 제2 스트레치의 뉴클레오티드 서열과 동일하고 또 제1 스트레치는 그에 대하여 필수적으로 상보적이다. 더욱 바람직한 구체예로서, 본 발명에 따른 이중 가닥 핵산 분자의 길이는 다양한 요지 및 서브요지와 관련하여 본 명세서에 기재된 한도 내에 있다.

당해 기술 분야의 당업자들은 siRNA 분자 및 RNAi 분자의 특정 디자인이 현재 및 미래의 디자인 원리에 따라 변형될 수 있음을 잘 알고 있을 것이다. 당분간은 일부 디자인 원리는 이하에 논의되고 자세히 기재되며 또 본 발명에 따른 핵산의 제1 요지의 서브 요지로 칭해지는 바와 같이 존재할 것이다. 본 발명의 범위내에서 1개 특정 서브요지에 대해 기재된 모든 특징 및 구체예, 즉 핵산의 디자인은 본 발명에 따른 핵산의 다른 요지 및 서브요지에 대해서도 적용될 수 있으므로 각각 그의 다른 구체예를 형성한다.

제1 서브 요지는 본 발명에 따른 핵산에 관련된 것이고, 제1 스트레치는 2' 위치에서 변형을 갖는 복수 그룹의 변형 뉴클레오티드를 포함하며, 상기 스트레치 내에서 각 그룹의 변형 뉴클레오티드는 그의 한쪽 또는 양쪽에서 뉴클레오티드의 측면 그룹에 의해 측면 배치되는 반면에, 뉴클레오티드의 측면 그룹을 형성하는 측면 뉴클레오티드는 비변형 뉴클레오티드이거나 또는 변형 뉴클레오티드의 변형과는 상이한 변형을 갖는 뉴클레오티드이다. 이러한 디자인은 다른 것 중에서도 국제 특허 출원 WO 2004/015107호에 기재되어 있다. 이 요지에 따른 핵산은 바람직하게는 리보핵산이지만, 일부 구체예에 자세히 나타낸 바와 같이, 2' 위치에서 변형은 순수한 화학적 관점에서 더 이상 리보뉴클레오티드가 아닌 뉴클레오티드를 초래한다. 그러나, 본 발명의 범위 니에서 이러한 변형된 리보뉴클레오티드는 이후에서는 리보뉴클레오티드로 간주하고 이러한 변형된 리보뉴클레오티드를 함유하는 분자를 리보핵산으로 본다.

본 발명의 제1 서브요지에 따른 리보핵산의 구체예에서, 리보핵산은 이중 가닥 구조의 한쪽 또는 양쪽에서 무딘 말단(blunt ended)이다. 더욱 바람직한 구체예로서, 이중 가닥 구조는 18 내지 25개, 바람직하게는 18 내지 23개, 더욱 바람직하게는 19, 21 또는 23개 염기쌍을 포함하거나 그로 구성되며, 이러한 이중가닥 구조는 바람직하게는 무딘 말단이다. 더욱 바람직한 구체예로서, 상기 핵산은 제1 스트레치 및 제2 스트레치 만으로 구성된다.

본 발명의 제1 서브 요지에 따른 리보핵산의 다른 구체예로서, 상기 제1 스트레치 및/또는 제2 스트레치는 변형된 뉴클레오티드 기를 복수개 포함한다. 더욱 바람직한 구체예로서, 제1 스트레치는 또한 뉴클레오티드 측면 그룹을 복수개 포함한다. 더욱 바람직한 구체예로서 복수의 기는 적어도 2개의 기를 의미한다.

본 발명의 제1 요지에 따른 리보핵산의 다른 구체예로서, 상기 제2 스트레치는 변형된 뉴클레오티드 기를 복수개 포함한다. 다른 바람직한 구체예로서, 상기 제2 스트레치는 뉴클레오티드의 측면 그룹을 복수개 포함한다. 바람직한 구체예로서, 복수의 기는 적어도 2개 기를 의미한다.

더욱 바람직한 구체예로서, 제1 및 제2 스트레치는 변형된 뉴클레오티드 기 및 뉴클레오티드의 측면 그룹을 복수개 포함한다. 더욱 바람직한 구체예로서, 변형된 뉴클레오티드 기 및 뉴클레오티드의 측면 그룹 복수개는 패턴, 바람직하게는 규칙적이고 및/또는 반복하는 패턴을 제1 스트레치 및/또는 제2 스트레치 상에 형성하며, 더욱 바람직하게는 이러한 패턴은 제1 및 제2 스트레치 모두에 형성된다.

본 발명의 제1 서브요지에 따른 리보핵산의 바람직한 구체예로서, 변형된 뉴클레오티드의 기 및/또는 연속적인 뉴클레오티드의 기는 다수의 뉴클레오티드를 포함하며, 그 수는 1 뉴클레오티드 내지 10개 뉴클레오티드를 포함하는 군으로부터 선택된다. 본 명세서에 규정된 범위와 관련하여, 각 범위는 상기 범위를 규정하는 2개 숫자를 포함하는 범위를 규정하기 위해 사용된 각 숫자 사이의 개별 정수를 나타낸다. 이 경우 상기 기는 따라서 1개의 뉴클레오티드, 2개의 뉴클레오티드, 3개의 뉴클레오티드, 4개의 뉴클레오티드, 5개의 뉴클레오티드, 6개의 뉴클레오티드, 7개의 뉴클레오티드, 8개의 뉴클레오티드, 9개의 뉴클레오티드 및 10개의 뉴클레오티드를 포함한다.

*본 발명의 제1 서브요지에 따른 리보핵산의 다른 구체예로서, 상기 제1 스트레치의 변형된 뉴클레오티드의 패턴은 상기 제2 스트레치의 변형된 뉴클레오티드의 패턴과 동일하다.

본 발명의 제1 서브요지에 따른 리보핵산의 바람직한 구체예로서, 상기 제1 스트레치의 패턴은 상기 제2 스트레치의 패턴과 정렬된다.

본 발명의 제1 서브요지에 따른 리보핵산의 다른 구체예로서, 상기 제1 스트레치의 패턴은 제2 스트레치의 패턴에 대하여 1 이상의 뉴클레오티드에 의해 변이(shifted)된다.

본 발명의 제1 서브요지에 따른 리보핵산의 일 구체예로서, 2' 위치에서 변형은 아미노, 플루오로, 메톡시, 알콕시 및 알킬을 포함하는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 제1 서브요지에 따른 리보핵산의 다른 구체예로서, 이중가닥 구조는 무딘 말단이다.

본 발명의 제1 서브요지에 따른 리보핵산의 바람직한 구체예로서, 이중가닥 구조는 이중 가닥 구조의 양측 상에서 무딘 말단이다.

본 발명의 제1 서브요지에 따른 리보핵산의 다른 구체예로서, 이중 가닥 구조는 제1 가닥의 5'-말단 및 제2 가닥의 3'-말단으로 정의되는 이중가닥 구조의 일측 상에서 무딘 말단이다.

본 발명의 제1 서브요지에 따른 리보핵산의 다른 구체예로서, 이중 가닥 구조는 제1 가닥의 3'-말단 및 제2 가닥의 5'-말단으로 정의되는 이중가닥 구조의 일측 상에서 무딘 말단이다.

본 발명의 제1 서브요지에 따른 리보핵산의 다른 구체예로서, 2중 가닥의 적어도 1개는 5'-말단에서 적어도 1개의 뉴클레오티드의 오버헹을 갖는다.

본 발명의 제1 서브요지에 따른 리보핵산의 바람직한 구체예로서, 상기 오버헹은 적어도 1개의 데옥시리보뉴클레오티드로 구성된다.

본 발명의 제1 서브요지에 따른 리보핵산의 다른 구체예로서, 가닥의 적어도 1개는 3'-말단에서 적어도 1개의 뉴클레오티드의 오버헹을 갖는다.

본 발명의 제1 서브요지에 따른 리보핵산의 일 구체예로서, 이중 가닥 구조의 길이는 약 17 내지 23개, 더욱 바람직하게는 18 또는 19개 염기 또는 염기쌍이다.

제1 서브요지의 리보핵산의 다른 구체예로서, 제1 가닥의 길이 및/또는 제2 가닥의 길이는 서로 독립적으로 약 15 내지 약 23개 염기, 17 내지 21개 염기 및 18 또는 19개 염기 또는 염기쌍, 더욱 바람직하게는 19, 21 또는 23 염기쌍 범위를 포함하는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 제1 서브요지에 따른 리보핵산의 바람직한 구체예로서, 제1 가닥과 표적 핵산 사이의 상보성은 완전하다.

본 발명의 제1 서브요지에 따른 리보핵산의 일 구체예로서, 제1 가닥과 표적 핵산 사이에 형성된 듀플렉스(duplex)는 적어도 15개의 뉴클레오티드를 포함하며, 상기 이중 가닥 구조를 형성하는 제1 가닥과 표적 핵산 사이에는 1개의 미스매치 또는 2개의 미스매치가 존재한다.

본 발명의 제1 서브요지에 따른 리보핵산의 일 구체예로서, 제1 가닥 및 제2 가닥은 각각 변형된 뉴클레오티드의 적어도 1개 기 및 뉴클레오티드의 측면 그룹의 적어도 1개를 포함하며, 변형된 뉴클레오티드의 각 기는 적어도 1개의 뉴클레오티드를 포함하고 또 적어도 1개의 뉴클레오티드를 포함하고 제1 가닥의 변형된 뉴클레오티드의 각 기는 제2 가닥 상의 뉴클레오티드의 측면 그룹와 정렬되며, 제1 가닥의 가장 말단인 5' 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드 기의 뉴클레오티드이고, 제2 가닥의 가장 말단인 3' 뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 측면 그룹의 뉴클레오티드이다.

본 발명의 제1 서브요지에 따른 리보핵산의 바람직한 구체예로서, 변형된 뉴클레오티드의 각 기는 단일 뉴클레오티드로 구성되고 및/또는 각 뉴클레오티드의 측면 그룹는 단일 뉴클레오티드로 구성된다.

본 발명의 제1 서브요지에 따른 리보핵산의 다른 구체예로서, 제1 가닥 상에서 뉴클레오티드의 측면 그룹을 형성하는 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드의 기를 형성하는 뉴클레오티드에 대하여 3' 방향으로 배열된 비변형 뉴클레오티드이고, 또 제2 가닥 상에서 변형된 뉴클레오티드의 기를 형성하는 뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 측면 그룹을 형성하는 뉴클레오티드에 대하여 5' 방향으로 배열된 변형된 뉴클레오티드이다.

본 발명의 제1 서브요지에 따른 리보핵산의 다른 구체예로서, 제1 가닥은 변형된 뉴클레오티드 기를 8 내지 12개, 바람직하게는 9 내지 13개 포함하고, 또 제2 가닥은 변형된 뉴클레오티드 기를 7 내지 13개, 바람직하게는 8 내지 10개 포함한다.

본 발명의 범위내에서 상기 특정된 사항은 제1 및 제2 스트레치에 적용할 수 있다. 이것은 가닥이 스트레치 만으로 구성된 다른 구체예에 대해서 특히 사실이다.

제1 서브 요지에 따른 리보핵산 분자는 제1 가닥에서 유리 5' OH 기로 지칭되는 유리 5' 히드록실 기를 갖도록 고안될 수 있다. 유리 5' OH 기는 제1 가닥을 형성하는 가장 말단인 뉴클레오티드가 존재하고 또 말단 변형에 의해 변형되지 않은 것을 의미한다. 전형적으로, 제2 가닥의 말단 5' 히드록시 기는 비변형된 방식으로 존재한다. 더욱 바람직한 구체예로서, 제1 가닥 및 제1 스트레치의 3'-말단은 유리 3' OH 기로 지칭되는 유리 OH 기를 제공하도록 비변형되며, 5'-말단 뉴클레오티드의 디자인은 상술한 구체예 중의 어느 하나이다.

바람직하게는 이러한 유리 OH 기는 제2 가닥 및 제2 스트레치의 3'-말단에 존재한다. 본 발명에 따라 앞서 기재된 바와 같은 리보핵산 분자의 다른 구체예에서, 제1 가닥 및 제1 스트레치의 3'-말단 및/또는 제2 가닥 및 제2 스트레치의 3'-말단은 3'-말단에서 말단 변형을 가질 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 유리 5' OH 기 및 3' OH 기는 또한 이중 가닥 구조를 형성하는 핵산 또는 가닥 및 스트레치인 폴리뉴클레오티드의 5'-말단 및 3'-말단에 있는 가장 말단인 뉴클레오티드가 OH 기를 제공함을 의미한다. 이러한 OH 기는 뉴클레오티드의 당 잔기로부터, 더욱 바람직하게는 5' OH 기의 경우 5' 위치로부터 또 3' OH 기인 경우 3' 위치로부터, 또는 각 말단 뉴클레오티드의 당 잔기에 부착된 포스페이트 기로부터 유래할 수 있다. 포스페이트 기는 원칙적으로 뉴클레오티드의 당 잔기의 OH 기에 부착될 수 있다. 바람직하게는, 포스페이트 기는 유리 5' OH 기의 경우에 당 잔기의 5' OH 기에 부착되고 및/또는 유리 3' OH 기의 경우에 당 잔기의 3' OH 기에 부착되어 본 명세서에 지칭되는 바와 같은 유리 5' 또는 3' OH 기를 제공한다.

제1 서브요지의 구체예와 관련하여 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 말단 변형은 제1 및/또는 제2 가닥의 가장 5' 또는 3' 뉴클레오티드에 화학성분이 부가되는 것을 의미한다. 이러한 말단 변형의 예는 비제한적으로 유럽특허 EP 0 586 520 B1 또는 EP 0 618 925 B1호에 기재된 바와 같이, 반전(데옥시) 어베이식(abasics), 아미노, 플루오로, 클로로, 브로모, CN, CF, 메톡시, 이미다졸, 카르복실레이트, 티오에이트, C₁-C₁₀ 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알크아릴 또는 아르알킬, OCF₃, OCN, O-, S- 또는 N-알킬; O-, S- 또는 N-알케닐; SOCH₃; SO₂CH₃; ONO₂; NO₂; N₃; 헤테로지시클로알킬; 헤테로지시클로알크아릴; 아미노알킬아미노; 폴리알킬아미노 또는 치환된 실릴이다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 알킬 또는 "알킬"을 포함하는 어떤 용어는 1 내지 12개, 바람직하게는 1 내지 6개, 더욱 바람직하게는 1 내지 2개 C 원자를 포함하는 탄소 원자 사슬을 의미한다.

또한 말단 변형은 비오틴 기이다. 이러한 비오틴 기는 바람직하게는 제1 및/또는 제2 가닥의 가장 5' 또는 가장 3' 뉴클레오티드 또는 양쪽 말단에 부착될 수 있다. 더욱 바람직한 구체예로서, 비오틴 기는 폴리펩티드 또는 단백질에 결합될 수 있다. 본 발명의 범위 내에서 폴리펩티드 또는 단백질은 다른 상술한 말단 변형을 통하여 부착될 수 있다. 폴리펩티드 또는 단백질은 본 발명의 핵산 분자에 다른 특징을 부여할 수 있다. 이들 중에서, 폴리펩티드 또는 단백질은 다른 분자에 대한 리간드로 작용할 수 있다. 상기 다른 분자가 수용체이면 그 수용체의 작용 및 활성은 리간드 결합에 의해 활성화될 수 있다. 상기 수용체는 본 발명의 핵산 분자에 결합된 리간드의 효과적인 형질감염을 허용하는 내재화(Internalization) 활성을 나타낼 수 있다. 본 발명의 핵산 분자에 결합될 리간드의 일례는 VEGF이며 또 상응하는 수용체는 VEGF 수용체이다.

상이한 종류의 말단 변형을 갖는 본 발명의 RNAi의 다양한 가능한 구체예는 하기 표 1에 제시되어 있다.

본 명세서에 기재된 바와 같은 다양한 말단 변형은 바람직하게는 리보핵산의 뉴클레오티드의 리보오스 잔기에 위치할 수 있다. 더욱 특히, 말단 변형은 비제한적으로 2' OH, 3' OH 및 5' OH 위치를 비롯하여 리보오스 잔기의 OH 기의 어느 것에 부착되거나 그를 치환할 수 있으며, 단 이렇게 변형된 뉴클레오티드는 말단 뉴클레오티드이다. 역전 어베이식은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 뉴클레오베이스 잔기를 갖지 않는 리보뉴클레오티드의 하나인 뉴클레오티드이다. 이러한 종류의 화합물은 (Sternberger et al., 2002)에 기재되어 있다.

상술한 말단 변형은 표 1에 도시된 다양한 RNAi의 구체예와 관련하여 사용될 수 있다. 그와 관련하여 센스 가닥과 함께 기재된 RNAi 형태 또는 구체예는 5' 말단에서 말단 변형을 갖는 것에 의해 불활성화되는 것이 특히 유리함이 알려져 있다. 이것은 본 명세서에 기재된 리보핵산의 제2 가닥에 상응하는 센스 가닥의 불활성화로부터 생기며, 그렇지 않으면 세포에서 조절되지 않은 단일 가닥의 RNA를 방해할 것이다. 이러한 발현 및 더욱 특히 세포의 트랜스크립톰(transcriptome)의 번역 패턴은 더욱 특이적으로 영향을 받는다. 이러한 영향은 오프-표적 효과로 불린다. 표 1을 참조하여, 구체예 7 및 8로 표시된 구체예는 그러한 변형이 RNAi (제2 가닥임)의 일부 - 표적 비특이적-의 불활성화를 초래하는 점에서 상기 의미에서 특히 유리하므로, 세포 또는 유사 계에서 제2 가닥과 단일 가닥의 RNA의 비특이적 상호작용을 감소시키며, 본 발명에 따른 RNAi는 특정 리보핵산 및 단백질을 녹다운하기 위해 사용될 것이다.

다른 구체예로서, 제1 서브요지에 따른 핵산은 리보핵산의 5'-말단에서 오버헹을 갖는다. 더욱 특히, 이러한 오버헹은 원칙적으로 본 발명에 따른 리보핵산의 제1 가닥 및 제2 가닥의 하나 또는 양쪽에 존재할 수 있다. 상기 오버헹의 길이는 최소 1개 뉴클레오티드이고 최대 2 내지 8개 뉴클레오티드, 바람직하게는 2, 4, 6 또는 8개 뉴클레오티드이다. 본 발명의 범위 내에서 5' 오버헹은 본 발명에 따른 리보핵산의 제1 가닥 및/또는 제2 가닥에 위치할 수 있다. 오버헹을 형성하는 뉴클레오티드는 데속시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 또는 이들의 조합물일 수 있다.

오버헹은 바람직하게는 적어도 1개의 데속시리보뉴클레오티드를 포함하며, 상기 1개의 데속시리보뉴클레오티드는 바람직하게는 가장 5'-말단에 있는 것이다. 본 발명의 범위 내에서 본 발명의 리보핵산의 각 대형 가닥의 3'-말단은 오버헹을 갖지 않을 것이고, 더욱 바람직하게는 데속시리보뉴클레오티드 오버헹을 가지지 않을 것이다. 여기서, 본 발명의 리보핵산은 본 명세서에 개략적으로 나타낸 바와 같이 표 1 및/또는 말단 변형과 관련하여 개략적으로 기재된 바와 같이 말단 변형 도식을 포함할 수 있다.

연속하는 뉴클레오티드의 스트레치를 고려할 때, 패턴, 바람직하게는 스트레치를 형성하는 뉴클레오티드의 변형의 규칙적 및/또는 반복 패턴은 표준 포스포로디에스테르 결합 또는 적어도 부분적으로 포스포로티오에이트 결합을 통하여 서로에 대하여 공유결합된 단일 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 기가 이러한 유형의 변형을 나타나도록 하는 구체예에 의해 실현될 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 또는 변형 뉴클레오티드 기로 지칭되는 뉴클레오티드 기가 상기 스트레치의 5'-말단 또는 3'-말단을 형성하지 않는 경우, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 기는 앞의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 기의 변형을 갖지 않는 뉴클레오티드의 양측에 이어진다. 그러나 이러한 유형의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 기는 상이한 변형을 가질 수 있다. 이러한 유형의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 기는 뉴클레오티드의 측면 그룹로 지칭된다. 변형된 뉴클레오티드 및 변형된 뉴클레오티드 기, 및 비변형 또는 상이하게 변형된 뉴클레오티드 또는 비변형 또는 상이하게 변형된 뉴클레오티드 기의 서열은 1회 또는 몇 회 반복될 수 있다. 바람직하게는, 상기 서열은 1회 이상 반복된다. 분명히 하기 위하여 상기 패턴은 이하에서 더욱 자세하게 논의되며, 일반적으로 변형된 뉴클레오티드 또는 비변형 뉴클레오티드 기로 지칭되며, 상기 기 각각은 단일 뉴클레오티드를 실제로 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 비변형 뉴클레오티드는 각 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 기를 형성하는 뉴클레오티드에서 상술한 변형을 갖지 않거나, 또는 변형된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 기의 하나와 상이한 변형을 갖는 것을 의미한다.

본 발명의 범위 내에서, 비변형 뉴클레오티드가 변형 뉴클레오티드의 변형과는 상이한 방식으로 실질적으로 변형되는, 비변형 뉴클레오티드의 변형은 상기 비변형 뉴클레오티드를 형성하는 다양한 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드의 다양한 측면 그룹와 동일하거나 또는 상이할 수 있다.

변형 및 비변형 뉴클레오티드의 패턴은 가닥 또는 스트레치의 5'-말단 뉴클레오티드가 뉴클레오티드의 변형 기로 개시되거나 또는 뉴클레오티드의 비변형 기로 개시된다. 그러나, 다른 구체예로서, 5'-말단 뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 비변형 기에 의해 형성될 수 있다.

상기 유형의 패턴은 간섭 RNA의 제1 스트레치 또는 제2 스트레치 중의 어느 하나 또는 양쪽에서 실현될 수 있다. siRNA 듀플렉스의 표적-상보적 가닥 상에서 5' 포스페이트는 siRNA 작용에 필요하므로, 세포는 유리 5' OH (포스포릴화될 수 있는)를 통하여 siRNA의 진위를 확인하고 이러한 진실한 siRNA만이 표적 RNA 파괴를 지시함을 주목해야 한다(Nykanen et al., 2001).

바람직하게는, 제1 스트레치는 뉴클레오티드의 변형 및 비변형 기의 패턴 종류, 즉 변형된 뉴클레오티드 기 및 뉴클레오티드의 측면 그룹 패턴을 나타내는 반면에, 제2 스트레치는 상기 유형의 패턴을 나타내지 않거나 또는 그러한 패턴을 전혀 나타내지 않는다. 이것은 제1 스트레치가 RNA의 간섭 현상의 기초를 이루는 표적-특이적 분해 과정에 대하여 더 중요한 것인 한 유용할 수 있으므로 특이성의 이유로 제2 스트레치는 화학적으로 변형되어 RNA 간섭을 매개하는데 작용하지 않는다.

그러나, 본 발명의 범위 내에서 제1 스트레치 및 제2 스트레치는 이러한 유형의 패턴을 갖는다. 바람직하게는 변형 및 비변형 패턴은 제1 스트레치 및 제2 스트레치에 모두에 대해 동일하다.

바람직한 양태로서, 제2 스트레치를 형성하고 또 제1 스트레치의 뉴클레오티드의 변형된 기에 상응하는 뉴클레오티드 기는 또한 변형되는 반면에, 제2 스트레치의 뉴클레오티드 또는 제2 스트레치를 형성하는 뉴클레오티드의 비변형 기는 제1 스트레치의 뉴클레오티드 또는 제1 스트레치를 형성하는 뉴클레오티드의 비변형 기에 상응한다. 다른 예는 제2 스트레치 및 제2 가닥의 변형 패턴에 대하여 제1 스트레치 및 제1 가닥의 변형 패턴의 상 이동(phase shift)이 존재한다. 바람직하게는, 상기 이동은 제1 가닥의 뉴클레오티드의 변형된 기가 제2 가닥의 뉴클레오티드의 비변형 기에 상응하고 또 그 역도 성립하도록 된다. 본 발명의 범위내에서 변형 패턴의 상 이동은 완전하지 않지만 중복된다.

바람직한 구체예로서, 가닥 및 스트레치의 말단에 있는 제2 뉴클레오티드는 비변형 뉴클레오티드이거나 또는 비변형 뉴클레오티드의 기의 시작이다. 바람직하게는, 상기 비변형 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드의 비변형 기는 제1 및 제2 가닥의 5'-말단에 위치하고, 더욱 바람직하게는 제1 가닥의 5'-말단에 위치한다. 다른 바람직한 구체예로서, 비변형 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드의 비변형 기는 제1 가닥 및 제1 스트레치의 5'-말단에 위치한다. 바람직한 구체예로서, 상기 패턴은 교대되는 단일 변형되고 비변형된 뉴클레오티드로 구성된다.

본 발명의 상기 요지의 더욱 바람직한 구체예로서, 간섭성 리보핵산은 2개 가닥을 포함하며, 이때 2'-O-메틸 변형 뉴클레오티드 및 비변형 뉴클레오티드, 바람직하게는 2'-메틸 변형되지 않은 뉴클레오티드는 교대되는 방식으로 양쪽 가닥에 혼입되며, 이는 매 두번째 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형되고 또 비변형된 뉴클레오티드임을 의미한다. 이것은 제1 가닥에서 1개의 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드는 비변형 뉴클레오티드에 이어지며, 이것은 다시 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드로 이어지는 등을 의미한다. 2'-O-메틸 변형 및 비변형의 동일 순서가 제2 가닥에도 존재하며, 때 제1 가닥 염기 쌍 상의 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드는 제2 가닥 상의 비변형 뉴클레오티드에 의해 상 이동되며, 그 역도 가능하다. 이러한 특정 배열, 즉 양쪽 가닥 상에서 2'-O-메틸 변형된 및 비변형된 뉴클레오티드의 염기 쌍은 짧은 간섭성 리보핵산,즉 본 발명자들은 어떠한 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드의 2개 염기쌍 이루기 사이에는 특정 반반력이 존재해서 듀플렉스, 바람직하게는 짧은 듀플렉스를 불안정화시킬것이라고 추정되기 때문에 짧은 염기쌍 이중가닥 리보핵산인 경우에 특히 바람직하다. 특정 배열에 관해서는, 안티센스 가닥이 5' 말단에서 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드로 개시됨으로써 제2 뉴클레오티드가 비변형되고, 제3, 제5, 제7 등의 뉴클레오티드는 따라서 다시 2'-O-메틸 변형되는 반면에, 제2, 제4, 제6, 제8 등의 뉴클레오티드는 비변형된 뉴클레오티드이다. 어떠한 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 어떠한 변형도 포함하지 않아야 하는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제2, 및 경우에 따라 제4, 제6, 제8 및/또는 그와 유사한 위치가 특히 중요한 것으로 보이는 반면에, 가장 5' 말단에 있는 뉴클레오티드, 즉 안티센스 가닥의 제1의 5' 말단 뉴클레오티드는 안티센스 가닥에서의 제1, 경우에 따라 제3, 제5 및 그 유사한 위치에서 변형되는 것과 같은 홀수 위치에서의 변형과 같은 것도 나타낼 수 있다. 다른 구체예에서, 변형된 및 비변형된 뉴클레오티드의 변형 및 비변형은 본 명세서에 기재된 바와 같다. 더욱 특정한 구체예에서, 본 발명에 따른 이중 가닥의 핵산 분자는 19, 21 또는 23개의 연속적인 뉴클레오티드의 제1 가닥 및 19, 21 또는 23개의 연속적인 뉴클레오티드의 제2 가닥으로 구성되며, 이때 제1 가닥 및 제2 가닥은 서로에 대하여 필수적으로 상보적이다. 또한 상기 더욱 특이적인 구체예로서, 상기 이중가닥 구조는 양쪽 말단에서 무딘 말단이다. 표적 핵산에 대해 필수적으로 상보적인 제1 가닥, 즉 PKN3를 코딩하는 mRNA는 5' 말단에서 2'-O-메틸 기를 형성하는 2' OH 기에서 메틸화된 뉴클레오티드로 시작한다. 상기 제1 가닥의 매 두번째 뉴클레오티드는 동일한 변형, 즉 2' OH 기에서 메틸화된다. 따라서, 제1, 제3, 제5 등, 즉 제1 가닥의 홀수 뉴클레오티드 위치는 상기와 같이 변형된다. 제1 가닥의 짝수 위치에 있는 뉴클레오티드는 비변형 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드일 수 있고, 이때 변형은 제1 가닥의 홀수 뉴클레오티드에서 뉴클레오티드의 변형과는 상이하다. 제1 가닥은 바람직하게는 19, 21 또는 23개 뉴클레오티드를 포함하며, 제2, 제4, 제6 등의 짝수 뉴클레오티드 위치에서 변형된 뉴클레오티드를 갖는다. 다른 뉴클레오티드 중의 어느 것은 비변형 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드일 수 있으며, 이때 변형은 제1 가닥의 짝수 뉴클레오티드에서 뉴클레오티드의 변형과는 상이하다. 따라서, 제2 가닥은 5' 말단에서 상기 의미에서 비변형 뉴클레오티드로 시작한다. 더욱 바람직한 구체예로서, 제1 가닥 및 제2 가닥의 변형된 뉴클레오티드의 변형은 동일하며 또 제1 가닥 및 제2 가닥의 비변형 뉴클레오티드의 변형도 또한 동일하다. 바람직한 구체예로서, 안티센스의 5' 말단, 즉 제1 가닥은 OH-기를 가지며, 바람직하게는 세포에서, 바람직하게는 표적 세포에서 포스포릴화되며, 이때 본 발명의 핵산 분자는 활성 또는 기능적이어야 하거나, 또는 포스페이트 기를 갖는다. 센스 가닥, 즉 제2 가닥의 5' 말단은 바람직하게는 변형되고, 더욱 바람직하게는 본 명세서에 기재된 바와 같이 변형된다. 3' 말단의 양쪽은 일 구체예에서 말단 포스페이트를 갖는다.

본 발명의 범위에서 이중 가닥 구조는 2개의 별도의 가닥, 즉 제1 가닥 및 제2 가닥에 의해 형성된다. 그러나, 본 발명의 범위내에서 제1 가닥 및 제2 가닥은 서로에 대해 공유결합된다. 이러한 결합은 제1 가닥과 제2 가닥을 형성하는 뉴클레오티드 사이에서 일어날 수 있다. 그러나, 양 가닥 사이의 결합은 이중 다각 구조의 한쪽 또는 양쪽 말단에서 더 가깝게 제조되는 것이 바람직하다. 이러한 결합은 공유결합 또는 비공유 결합에 의해 형성될 수 있다. 공유 결합은 양쪽 가닥을 1회 또는 수회 결합시키는 것에 의해 형성되며, 일부 몇 개 위치에서는 메틸렌 기 및 이작용성 기를 포함하는 군으로부터 선택된 화합물에 의해 형성될 수 있다. 이러한 이작용성 기는 바람직하게는 비스(2-클로로에틸)아민, N-아세틸-N'-(p-글리콕시벤조일)시스타민, 4-티오우라실 및 프소랄렌을 포함하는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 제1 서브요지에 따른 리보핵산의 다른 구체예로서, 제1 가닥 및 제2 가닥은 루프(loop) 구조에 의해 결합된다.

본 발명의 제1 서브요지에 따른 리보핵산의 바람직한 구체예로서, 상기 루프 구조는 비핵산 중합체로 구성된다.

본 발명의 바람직한 구체예로서, 비핵산 중합체는 폴리에틸렌 글리콜이다.

본 발명의 제1 서브요지에 따른 리보핵산의 일 구체예로서, 제1 가닥의 5'-말단은 제2 가닥의 3'-말단에 결합된다.

본 발명의 제1 서브요지에 따른 리보핵산의 다른 구체예로서, 제1 가닥의 3'-말단은 제2 가닥의 5'-말단에 결합된다.

일 구체예로서 상기 루프는 핵산으로 구성된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, Elayadi 및 Corey에 기재된 바와 같은 LNA(Elayadi et al., 2001); (Orum and Wengel, 2001); 및 PNA는 핵산으로 간주되며 또 루프 형성 중합체로서 사용될 수 있다. 기본적으로, 제1 가닥의 5'-말단은 제2 가닥의 3'-말단에 결합될 수 있다. 다른 예로서, 제1 가닥의 3'-말단은 제2 가닥의 5'-말단에 결합될 수 있다. 상기 루프 구조를 형성하는 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 임게적으로 간주되지 않는다. 그러나, 이러한 루프를 형성하는 뉴클레오티드 서열의 길이는 입체구조(steric) 이유로 인하여 중요하게 보인다. 따라서, 4개 뉴클레오티드의 최소 길이는 필요한 루프 구조를 형성하기에 적절한 것으로 보인다. 원칙적으로, 혼성화될 양쪽 스트레치 또는 가닥 사이에 힌지 또는 결합을 형성하기 위한 뉴클레오티드의 최대 수는 제한되지 않는다. 그러나, 폴리뉴클레오티드의 길이가 길수록, 2차 및 3차 구조가 형성되므로 스트레치의 필요한 배향이 영향을 받는다. 바람직하게는, 힌지를 형성하는 뉴클레오티드의 최대 수는 약 12개 뉴클레오티드이다. 본 출원의 내용 범위내에서 상술한 디자인은 본 명세서에 기재되고 당해 분야에 공지된 다른 디자인과 조합될 수 있으며, 즉 루프 구조 또는 유사한 구조를 통하여 백 폴딩(back folding)이 생길 수 있도록 2개 가닥을 공유결합적 결합에 의해 조합될 수 있다.

본 발명자들은 놀랍게도 루프가 안티센스 가닥, 즉 본 발명에 따른 리보핵산의 제1 가닥의 3'에 위치하면, 상기 종류의 RNAi의 활성은 안티센스 가닥의 루프 5'의 위치에 비교하여 더 높다는 것을 밝혀내었다. 따라서, 안티센스 가닥 및 센스 가닥, 즉 제1 가닥 및 제2 가닥에 대한 루프의 특정 배열은 중요하며 또 그러한 배향은 아무런 관련이 없는 것으로 말한 종래 기술에서의 이해와 대비된다. 그러나, 이것은 본 명세서에 제시된 실험 결과를 고려할 때 참이 아닌 것으로 보인다. 종래 기술에 나타낸 바와 같은 이해점은 RNAi가 비-루프 결합된 RNAi가 생성되는 동안 가공처리된다는 가정을 기본으로 한다. 그러나, 그러한 경우, 안티센스의 루프 위치 3'를 갖는 구조의 분명하게 증가된 활성은 설명될 수 없다. 지금까지 상기 유형의 소형 간섭성 RNAi의 5'→3' 방향이 바람직한 배열이다. 각 작제물은 적합한 벡터 계로 혼입될 수 있다. 바람직하게는 벡터는 RNAi의 발현을 위한 프로모터를 포함한다. 바람직하게는 각 프로모터는 pol III이며 더욱 바람직하게는 프로모터는Good et al. (Good et al., 1997)에 기재된 바와 같은 U6, H1, 7SK 프로모터이다.

본 발명의 제1 요지의 제2 서브요지는 본 발명에 따른 핵산에 관한 것으로, 이때 제1 스트레치 및/또는 제2 스트레치는 3'-말단에서 디뉴클레오티드를 포함하며, 이러한 디뉴클레오티드는 바람직하게는 TT이다. 바람직한 구체예로서, 제1 스트레치 및 제2 스트레치의 길이는 19 또는 21개 또는 23개 뉴클레오티드로 구성되며, 더욱 바람직하게는 이중 가닥 구조는 18 내지 22개 및 더욱 바람직하게는 19 내지 21개 염기쌍을 포함한다. 상기 서브요지에 따른 핵산의 디자인은 국제 특허 출원 WO 01/75164호에 자세하게 기재되어 있다.

본 발명의 제1 요지의 제3 서브요지는 본 발명에 따른 핵산에 관한 것으로, 이때 제1 및/또는 제2 스트레치는 3' 말단에서 1 내지 5개 뉴클레오티드의 오버헹을 포함한다. 상기 서브요지에 따른 핵산의 디자인은 국제 특허출원 WO 02/44321호에 자세하게 기재되어 있다. 더욱 바람직하게는 이러한 오버헹은 리보핵산이다. 바람직한 구체예로서, 제1 스트랜드, 더욱 바람직하게는 상기 정의된 스트레치 각각은 19 내지 25개 뉴클레오티드 길이를 가지며, 더욱 바람직하게는 상기 가닥은 스트레치로 구성된다. 바람직한 구체예로서, 본 발명에 따른 핵산의 이중가닥 구조는 17 내지 25개 염기쌍, 바람직하게는 19 내지 23개 염기쌍, 더욱 바람직하게는 19 21 또는 23개 염기쌍을 포함한다.

본 발명의 제1 요지의 제5 서브요지에서, 본 발명에 따른 핵산은 CD31 mRNA의 분해를 지시하는, 바람직하게는 RNA 간섭을 통하여 지시하는 화학적으로 합성된 이중가닥의 짧은 간섭성 핵산(siNA) 분자인 이중가닥 핵산이며, 상기 siNA 분자의 각 가닥은 18 내지 27개 또는 19 내지 29개 뉴클레오티드 길이이며 또 상기 siNA 분자는 적어도 1개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 비-뉴클레오티드를 포함한다. 상기 서브요지에 따른 핵산의 디자인은 국제 특허출원 WO 03/070910호 및 UK 특허 2 397 062호에 더욱 자세하게 기재되어 있다.

그의 일 구체예로서, siNA 분자는 리보뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 다른 구체예로서, siNA 분자는 1 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구체예로서, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드는 2'-데옥시 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구체예로서, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드는 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구체예로서, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구체예로서, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 결합을 포함한다. 다른 구체예로서, 비-뉴클레오티드는 어베이식 잔기를 포함하며, 바람직하게는 어베이식 잔기는 역전 데옥시 잔기를 포함한다. 다른 구체예로서, 비-뉴클레오티드는 글리세릴 잔기를 포함한다.

다른 구체예로서, 제1 가닥 및 제2 가닥은 링커 분자를 통하여 결합된다. 바람직하게는, 링커 분자는 폴리뉴클레오티드 링커이다. 다르게는, 링커 분자는 비-뉴클레오티드 링커이다.

*제5 서브-요지에 따른 핵산의 다른 구체예로서, 제2 가닥의 피리미딘 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 피리미딘 뉴클레오티드이다.

제5 서브-요지에 따른 핵산의 다른 구체예로서, 제2 가닥 중의 퓨린 뉴클레오티드는 2'-데옥시 퓨린 뉴클레오티드이다.

제5 서브-요지에 따른 핵산의 다른 구체예로서, 제2 가닥 중의 피리미딘 뉴클레오티드는 2'-데옥시-2'-플루오로 피리미딘 뉴클레오티드이다.

제5 서브-요지에 따른 핵산의 다른 구체예로서, 제2 가닥은 5' 말단, 3' 말단 또는 5' 말단 및 3' 말단 모두에서 말단 캡 잔기를 포함한다.

제5 서브-요지에 따른 핵산의 다른 구체예로서, 제1 가닥 중의 피리미딘 뉴클레오티드는 2'-데옥시-2'-플루오로 피리미딘 뉴클레오티드이다.

제5 서브-요지에 따른 핵산의 다른 구체예로서, 제1 가닥 중의 퓨린 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 퓨린 뉴클레오티드이다.

제5 서브-요지에 따른 핵산의 다른 구체예로서, 제1 가닥 중의 퓨린 뉴클레오티드는 2'-데옥시 퓨린 뉴클레오티드이다.

제5 서브-요지에 따른 핵산의 다른 구체예로서, 제1 가닥은 제1 가닥의 3' 말단에서 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 결합을 포함한다.

제5 서브-요지에 따른 핵산의 다른 구체예로서, 제1 가닥은 제1 가닥의 3' 말단에서 글리세릴 변형을 포함한다.

제5 서브-요지에 따른 핵산의 다른 구체예로서, 제1 가닥 및 제2 가닥의 약 19 내지 23개 뉴클레오티드는 염기쌍을 이루고 또 바람직하게는 siNA 분자의 각 가닥의 적어도 2개의 3' 말단 뉴클레오티드는 다른 가닥의 뉴클레오티드에 대해 염기쌍을 이루지 않는다. 바람직하게는, siNA 분자의 각 가닥의 2개 3' 말단 뉴클레오티드 각각은 2'-데옥시-피리미딘이다. 보다 바람직하게는, 2'-데옥시-피리미딘은 2'-데옥시-티미딘이다.

제5 서브-요지에 따른 핵산의 다른 구체예로서, 제1 가닥의 5' 말단은 포스페이트 기를 포함한다.

본 발명에 따른 핵산의 제5 서브-요지의 일 구체예로서, 본 발명의 siNA 분자는 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 반면에, RNAi를 매개할 수 있는 능력을 유지한다. 변형된 뉴클레오티드는 시험관내 또는 생체내에서 안정성, 활성 및/또는 생체이용성과 같은 특징을 개선시키기 위해 사용될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 siNA 분자는 siNA 분자에 존재하는 뉴클레오티드의 전체 수의 %로서 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 그와 같이, 본 발명의 siNA 분자는 일반적으로 약 5% 내지 약 100% 변형된 뉴클레오티드(약, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95 % 또는 100% 변형된 뉴클레오티드)를 포함한다. 주어진 siNA 분자에 존재하는 변형된 뉴클레오티드의 실제 %는 siNA중에 존재하는 뉴클레오티드의 전체 수에 따라 다를 것이다. siNA 분자가 단일 가닥이면, % 변형은 단일 가닥의 siNA 분자중에 존재하는 뉴클레오티드의 전체 수를 기본으로 할 수 있다. 마찬가지로, siNA 분자가 이중가닥이면, % 변형은 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 센스 및 안티센스 가닥 모두에 존재하는 뉴클레오티드의 전체 수를 기본으로 할 수 있다.

비제한적인 실시예로서, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 본 발명에 따른 핵산의 제5 서브-요지의 핵산 분자로 도입하는 것은 외인성으로 유도된 천연 RNA 분자에 고유한 생체내 안정성 및 생체이용율의 가능한 제한을 극복하기 위한 강력을 수단을 제공한다. 예컨대, 화학적으로 변형된 핵산 분자의 사용은 화학적으로 변형된 핵산 분자가 혈청에서 더 긴 반감수명을 갖는 경향이 있기 때문에 소정 치료 효과에 대한 특정 핵산 분자의 더 낮은 투여량을 가능하게 할 수 있다. 또한, 특정 화학적 변형은 특정 세포 또는 조직을 표적화하는 것에 의해 및/또는 핵산 분자의 세포 흡수를 향시키는 것에 의해 핵산 분자의 생체이용율을 개선시킬 수 있다. 따라서, 화학적으로 변형된 핵산 분자의 활성은 천연 핵산 분자와 비교하여 감소되며, 예컨대 모든 RNA 핵산 분자와 비교할 때, 변형된 핵산 분자의 전체 활성은 개선된 안정성 및/또는 분자 전달로 인하여 천연 분자에 비하여 훨씬 더 클 수 있다. 천연 비변형 siNA와는 달리, 화학적으로 변형된 siNA는 인간에서 인터페론 활성을 활성화하는 능력을 최소화할 수 있다.

바람직하게는 본 발명에 따른 핵산의 제5 서브-요지와 관련하여, 본 발명의 siNA의 안티센스 가닥, 즉 제1 가닥은 상기 안티센스 영역의 3' 말단에서 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 결합을 포함할 수 있다. 안티센스 가닥은 상기 안티센스 영역의 5'-말단에서 약 1 내지 약 5개의 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 결합을 포함할 수 있다. 본 발명의 siNA 분자의 3'-말단 뉴클레오티드 오버헹은 핵산 당, 염기 또는 주쇄에서 화학적으로 변형된 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 3'-말단 뉴클레오티드 오버헹은 1 이상의 유니버샬 염기 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 3'-말단 뉴클레오티드 오버헹은 1 이상의 아크릴 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

당업자에게 잘 알려진 바와 같이 뉴클레오티드로 제조된 루프를 포함하는 본 발명의 구체예는 사용되기에 적합하고 또 벡터에 의해 발현된다. 바람직하게는, 벡터는 발현 벡터이다. 이러한 발현 벡터는 유전자 치료 요법에 특히 유용하다. 따라서, 이러한 벡터는 본 명세서에 기재된 질병의 치료를 위해 바람직하게 사용될 수 있는 의약의 제조를 위해 사용될 수 있다. 그러나, 당업자들이 숙지하는 바와 같이, 비-천연 산출 변형을 포함하는 본 발명에 따른 핵산의 구체예는 벡터 및 세포, 조직, 기관 및 생물과 같은 벡터에 대한 발현 계에 발현되기위해 즉각적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명의 범위 내에서 상기 변형은 본 발명에 따른 벡터 유도된 또는 벡터 발현된 핵산에 전형적으로 벡터에 의한 핵산의 발현 이후에 부가될 수 있다. 특히 바람직한 벡터는 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터이다. 발현 벡터 중의 siRNA 분자 및 RNAi 분자를 사용하는 방법에 대한 기술적 시사점은 예컨대 국제 특허 출원 WO 01/70949호에 기재되어 있다. 당업자들이 숙지하고 있는 바와 같이, 이러한 벡터는 본 발명에 따른 핵산의 지연 존재가 바람직하고 유용한 경우 치료적 또는 예방적인 방법에 유용하며, 본 발명에 따른 비-벡터 핵산 및 특히 본 발명에 따른 화학적으로 변형된 또는 화학적으로 합성된 핵산은 분자의 일시적 존재가 바람직하거나 유용할 때 특히 유용하다.

여기에 기재된 핵산 분자를 합성하기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 방법은 그 중에서도 (Caruthers et al., 1992), Thompson et al., 국제 PCT 공개 번호 WO 99/54459호, (Wincott et al., 1995), (Wincott and Usman, 1997), Brennan et al., 1998, Biotechnol Bioeng., 61, 33-45, and Brennan, 미국특허 번호 6,001,311에 기재되어 있다. 이들 참고문헌 전부는 참고문헌으로 본 명세서에 포함된다.

다른 요지로서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 분자의 1개 또는 몇 개를 포함하거나 특이적으로 함유하는 리포좀 제형에 관한 것이다. 바람직하게는 이러한 리포좀 제형은 내부 부피를 규정하는 지질로 구성된다. 이러한 내부 부피는 바람직하게는 본 발명의 핵산 분자를 함유한다. 더욱 바람직하게는 이러한 제형은 리포좀을 포함하며, 바람직한 구체예로서, 상기 리포좀은 1 또는 몇 개의 양이온성 지질을 포함한다. 가장 바람직한 구체예로서, 리포좀 제형은 본 발명의 핵산 분자의 1개 또는 몇 개를 함유하며 이러한 핵산 분자는 리포좀의 외부 표면에서 또는 위에서 검출되거나 존재한다. 본 명세서에 바람직하게 사용된 바와 같이, 리포좀의 외부 표면은 리포좀을 둘러싸는 환경과 접촉하는, 특히 리포좀에 의해 포함되는 액체와 접촉하는 리포좀의 표면과 접촉하는 리포좀의 표면이다. 특히 바람직한 구체예로서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 상기 리포좀 및 리포좀 제형에 의해 또는 그 안에 포장되거나 캡슐화된다.

다른 요지로서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 리포플렉스에 관한 것으로, 이러한 리포플렉스는 1 또는 몇 개의 핵산 분자 및 1 또는 몇 개의 리포좀으로 구성된다. 바람직한 구체예로서, 리포플렉스는 1개의 리포좀과 몇 개의 핵산 분자로 구성된다.

리포플렉스는 다음과 같이 특징화될 수 있다. 본 발명에 따른 리포플렉스는 약 40 내지 55 mV, 바람직하게는 약 45 내지 50 mV의 제타-포텐셜을 갖는다. 본 발명에 따른 리포플렉스의 크기는 제조자의 추전에 따라 N5 서브마이크론 입자 크기 분석기 (베크만 쿨터 제조)를 이용하는 것과 같이 다이나믹 광 산란(QELS)에 의해 측정한 바와 같이 약 80 내지 200 nm, 바람직하게는 약 100 내지 140 nm, 더욱 바람직하게는 약 110 nm 내지 130 nm이다.

본 발명에 따른 리포플렉스의 일부를 형성하는 리포좀은 바람직하게는

c) 약 1 내지 2 몰%의 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리에틸렌-글리콜, 바람직하게는 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 나트륨염으로 구성되는 양으로 하전된 리포좀이다.

리포플렉스 및 리포좀을 형성하는 지질 조성물은 바람직하게는 담체에 함유된다. 그러나, 리포플렉스는 동결건조된 형태로 존재할 수 있다. 담체에 함유된 지질 조성물은 통상 분산액을 형성한다. 더욱 바람직하게는, 담체는 이하에 자세하게 설명한 바와 같이 수성 매질이거나 또는 수용액이다. 지질 조성물은 전형적으로 담체 중에 리포좀을 형성하며, 이러한 리포좀은 바람직하게는 내부에 담체를 함유한다.

담체에 함유된 지질 조성물 및 담체는 각각 바람직하게 약 50 내지 600 모스몰/kg, 바람직하게는 약 250-350 모스몰/kg, 더욱 바람직하게는 약 280 내지 320 모스몰/kg의 삼투압을 갖는다.

제1 지질 성분 및 경우에 따라 제1 헬퍼 지질에 의해, 바람직하게는 제1 지질 성분과 조합되어 형성된 리포좀은 약 20 내지 200 nm, 바람직하게는 약 30 내지 100 nm, 더욱 바람직하게는 약 40 내지 80 nm의 입자 크기를 나타낸다.

또한, 입자의 크기는 특정 통계적 분포를 따를 것이다.

본 발명에 따른 지질 조성물의 다른 임의적 특징은 담체의 pH가 바람직하게는 약 4.0 내지 6.0이다. 그러나, 4.5 내지 8.0, 바람직하게는 약 5.5 내지 75., 더욱 바람직하게는 약 6.0 내지 7.0 범위의 다른 pH 범위도 본 발명에 속한다.

이들 특정 특징을 실현하기 위하여 다양한 측정을 실시할 수 있다. 삼투압을 조절하기 위하여, 당 또는 당의 조합물이 특히 유용하다. 지금까지, 본 발명의 지질 조성물은 다음 당: 수크로오스, 트레할로오스, 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 말토오스, 락툴로오스, 이눌린 및 라피노오스 중의 1개 또는 몇 개를 포함할 수 있고, 수크로오스, 트레할로오스, 이눌린 및 라피노오스가 특히 바람직하다. 특히 바람직한 구체예로서, 당을 부가함으로써 조절된 삼투압은 약 300 모스몰/kg이며, 이는 270 mM의 수크로오스 용액 또는 280 mM의 글루코오스 용액에 상응한다. 바람직하게는 담체는 지질 조성물이 투여되는 체액에 대해 등장성이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이 삼투압이 당의 부가에 의해 주로 조절된다는 용어는 상기 당 또는 상기 당의 조합에 의해 적어도 약 80%, 바람직하게는 약 90%의 삼투압이 제공됨을 의미한다.

본 발명의 지질 조성물의 pH가 조절되면, 이것은 당업자에게 잘 알려진 완충액 물질을 사용하여 실시한다. 바람직하게는, 양이온성 지질의 염기성 특징, 더욱 자세하게는 양이온성 헤드 기의 암모늄 기에 대하여 보상하기에 적합한 염기성 물질이 사용된다. 염기성 아미노산 및 약염기와 같은 염기성 물질을 부가할 때, 상기 삼투압을 고려해야 한다. 이러한 지질 조성물 및 이러한 지질 조성물에 의해 형성된 리포좀의 입자 크기는 제조자의 추천에 따라 바람직하게는 N5 서브아미크론 입자 크기 분석기(베크만 쿨터 제조)를 사용하는 것에 다이나믹 광 산란에 의해 측정한다.

상기 지질 조성물이 1 또는 몇 개의 핵산을 함유하면, 이러한 지질 조성물은 보통 리포플렉스 착물, 즉 리포좀 및 핵산으로 구성된 착물을 형성한다. 바람직하게는 등장성 270 mM 수크로오스 또는 280 mM 글루코오스 중의 리포플렉스 중의 전체 지질 함량의 더욱 바람직한 농도는 약 0.01 내지 100 mg/ml, 바람직하게는 0.01 내지 40 mg/ml 및 더욱 바람직하게는 0.01 내지 25 mg/ml 이다. 이 농도는 합리적인 저장액을 제조하기 위하여 2 내지 3배로 증가될 수 있다. 본 발명의 범위내에서 상기를 기준으로 하여, 희석물을 제조하며, 이러한 희석은 전형적으로 삼투압이 상기 규정된 범위에 들도록 실시한다. 더욱 바람직하게는, 희석물은 지질 조성물과 관련하여 사용되거나 또는 지질 조성물이 함유된 담체와 동일하거나 또는 작용 및 더욱 특히 삼투압 측면에서 유사한 담체 중에서 제조된다. 본 발명의 지질 조성물의 구체예로서, 상기 지질 조성물은 핵산, 바람직하게는 작용성 핵산, 비제한적으로 siRNA를 포함하며, 지질 조성물 중의 siRNA의 농도는 약 0.2 내지 0.4 mg/ml, 바람직하게는 0.28 mg/ml이고, 또 전체 지질 농도는 약 1.5 내지 2.7 mg/ml, 바람직하게는 2.17 mg/ml이다. 핵산 분획과 지질 분획 사이의 중량비는 실현된 전하 비율에 대하여 특히 바람직한 것으로 알려져 있다. 본 발명의 지질 조성물의 농축물 또는 희석물과 관련하여, 이러한 특정 구체예에서 실현된 중량비 및 전하 비율은 농도 또는 희석에도 불구하고 바람직하게 유지된다.

이러한 농도가 예컨대 사용되면, 약학적 조성물은 지질을 적합한 양의 배지, 바람직하게는 생리학적으로 허용되는 완충액 또는 본 명세서에 기재된 담체에 분산시키는 것에 의해 얻을 수 있거나, 또는 적절한 수단에 의해 농축될 수 있다. 이러한 적절한 수단은 예컨대 교차유동 한외여과를 비롯한 한외 여과법이다. 필터막은 1,000 내지 300,000 Da 분자량의 컷오프(MWCO)의 기공 폭 또는 5 nm 내지 1 ㎛를 나타낼 수 있다. 특히 바람직한 것은 약 10,000 내지 100,000 Da MWCO의 기공 폭이다. 상기 지질 조성물 더욱 자세하게는 본 발명에 따른 리포플렉스는 동결건조된 형태로 존재할 수 있음은 당업자들이 잘 알고 있을 것이다. 이러한 동결건조된 형태는 전형적으로 리포플렉스의 저장기간을 증가시키기에 적합하다. 그 중에서도 적절한 삼투압을 제공하기 위해 부가된 당은 동결방지제(cryo-protectant)와 관련하여 사용된다. 이와 관련하여 삼투압, pH 뿐만 아니라 리포플렉스 농도의 상술한 특징은 담체 중에 지질 조성물의 용해된, 현탁된 또는 분산된 형태를 지칭하며, 이러한 담체는 원칙적으로 본 명세서에 기재된 담체이며 또 전형적으로 생리적으로 허용되는 완충액, 바람직하게는 등장 완충액 또는 등장 용액과 같은 수성 담체이다.

특히 상기 제형과는 별도로, 본 발명에 따른 핵산 분자는 공지된 바와 같이 약학적 조성물로 제형화될 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 단독으로 또는 다른 요법과 조합되어 바람직하게는 의약 및 진단약으로서 사용되기에 적합하다. 예컨대, 본 발명에 따른 핵산 분자는 환자에게 투여하기 위한 리포좀을 비롯한 전달 비히클(vehicle), 담체 및 희석제 및 이들의 염을 포함할 수 있거나 및/또는 약학적으로 허용되는 제형으로 존재할 수 있다. 핵산 분자의 전달 방법은 예컨대 본 명세서에 참고문헌으로 포함된 (Agrawal and Akhtar, 1995; Akhtar and Juliano, 1992), (Maurer et al., 1999); (Hofland and Huang, 1995); and Lee et al., 2000, ACS Symp. Ser., 752, 184-192에 기재되어 있다. Beigelman et al.에 의한 미국특허 번호 6,395,713호 및 Sullivan et al.에 의한 PCT WO 94/02595호도 또한 핵산 분자를 전달하기 위한 일반적 방법을 기재한다. 이들 방법은 어떠한 실제적 핵산 분자의 전달을 위해서도 이용될 수 있다. 핵산 분자는 비제한적으로 리포좀 내에 캡슐화하는 것에 의한 방법, 이온토포레시스(iontophoresis)에 의한 방법 또는 히드로겔, 시클로덱스트린(예컨대 Gonzalez et al., 1999), 생분해성 나노캡슐 및 생접착성 미세구와 같은 다른 비히클에 혼입하는 것에 의한 방법, 또는 단백질성 벡터(O'Hare and Normand, 국제 PCT 공보 WO 00/53722)에 의한 방법을 비롯한 당해 분야의 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 세포에 투여될 수 있다. 다르게는, 핵산/비히클 조합물은 직접적 주사에 의해 또는 주입 펌프의 이용에 의해 국소적으로 전달될 수 있다. 본 발명의 핵산의 직접적 주사(피하, 근육내 또는 피부내)는 표준 바늘 및 주사기 방법을 이용하여 실시할 수 있거나, 또는 (Conry et al., 1999) 및 Barry et al., 국제 PCT 공보 WO 99/31262호에 기재된 바와 같은 바늘이 없는 수법에 의해 실시할 수 있다. 본 발명의 분자는 약학적 물질로서 사용될 수 있다. 바람직하게는 약학적 물질은 검체에서 질병의 발생을 방지, 조절하거나 또는 질병을 치료(증상, 바람직하게는 모든 증상을 어느 정도 경감하는 것)한다.

따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 1 이상의 핵산을 안정화제, 완충액 등과 같은 적절한 담체 내에 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 핵산(분자)는 안정화제, 완충액 등을 경우에 따라 사용하여 표준 수단에 의해 검체에 투여(예컨대 RNA, DNA 또는 단백질)하거나 또는 도입하여 약학적 조성물을 형성한다. 리포좀 전달 메카니즘을 이용하는 것이 필요한 경우, 리포좀을 형성하는 표준 수법을 이용할 수 있다. 본 발명의 조성물은 경구 투여용 정제, 캡슐, 엘릭서, 직장 투여용의 좌약, 주사 투여용의 멸균 용액, 현탁액, 및 당해 분야에 공지된 다른 조성물로 제형화되어 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 핵산 분자의 약학적으로 허용되는 제형도 또한 제공된다. 이들 제형은 상술한 화합물의 염, 예컨대 산 부가염, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 아세트산 및 벤젠설폰산의 염을 포함한다.

약학적 조성물 또는 제형은 인간을 비롯한 세포 또는 검체에 투여, 예컨대 전신 투여하기에 적합한 형태의 조성물 또는 제형을 지칭한다. 적합한 형태는 부분적으로 경구, 경피, 또는 주사와 같은 투여 경로 또는 용도에 따라 달라진다. 이러한 형태는 상기 조성물 또는 제형이 표적 세포(즉, 음으로 하전된 핵산이 전달을 위해 바람직한 세포)에 도달하지 않게 해야 한다. 예컨대, 혈류에 주사되는 약학적 조성물은 가용성이어야 한다. 다른 인자도 당해 분야에 공지되어 있으며, 또 상기 조성물 또는 제형이 그의 효과를 발휘하지 못하게 하는 형태 및 독성과 같은 것도 고려해야 한다.

"전신 투여"라는 것은 바람직하게는 혈류내에 약물을 생체내로 전신적 흡수 또는 축적에 이은 전신을 통한 분포를 의미한다. 전신 흡수를 초래하는 투여 경로는 비제한적으로 정맥내 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 흡입, 경구 투여, 폐 내 투여 및 근육내 투여를 포함한다. 이들 투여 경로는 각각 본 발명의 siNA 분자를 접근가능한 병든 조직에 노출시킨다. 약물이 순환계로 진입하는 속도는 분자량 또는 크기의 함수인 것으로 나타났다. 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 리포좀 또는 기타 약물 담체의 사용은 예컨대 신생물(neoplastic) 조직과 같은 특정 조직 형태 내에 약물을 강력하게 위치시킬 수 있다. 약물과 림프구 및 대식세포와 같은 세포 표면의 결합을 용이하게 할 수 있는 리포좀 제형이 또한 유용하다. 이러한 방법은 종양 조직을 형성하는 세포와 같은 비정상 세포의 대식세포 및 림프구 면역 인식의 특이성의 이점을 이용함으로써 약물을 표적 세포로 전달 향상을 제공할 수 있다.

"약학적으로 허용되는 제형"이라는 것은 바람직하게는 본 발명에 따른 핵산 분자가 소망하는 활성을 위해 가장 적합한 물리적 형태로 효과적인 분포를 허용하는 조성물 또는 제형을 의미한다. 본 발명에 따른 핵산 분자와의 제형에 적합한 물질의 비제한적인 예는 약물이 CNS(Jolliet-Riant and Tillement, 1999)로 진입하는 것을 향상시킬 수 있는 P-글리코단백질 억제제(Pluronic P85와 같은); 뇌내 이식 후 방출 제어 전달을 위한 폴리(DL-락티드-코글리콜리드) 미세구와 같은 생분해성 중합체(Emerich et al., 1999) (Alkermes, Inc. Cambridge, MA); 및 혈액 뇌 장벽을 거쳐 약물을 전달하고 뉴런 흡수 메카니즘을 변형시킬 수 있는 폴리부틸시아노아크릴레이트로 제조된 것과 같은 로딩된 나노입자(Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 23, 941-949, 1999)를 포함한다. 본 발명의 핵산 분자를 전달하기 위한 다른 비제한적인 전달 전략은 (Boado et al., 1998); Tyler et al., 1999, FEBS Lett., 421, 280-284; pardridge et al., 1995, PNAS USA., 92,5592-5596; Boado, 1995, Adv. Drug Delivery Rev., 15,73-107; Aldrian-Herrada et al., 1998, Nucleic Acids Res., 26, 4910-4916; and Tyler et al., 1999, PNAS USA., 96, 7053-7058에 기재된 물질을 포함한다.

본 발명에 따르면, 폴리(에틸렌 글리콜)지질(PEG-변형된, 또는 장기 순환 리포좀 또는 스텔스 리포좀(stealth liposome)을 함유하는 표면 변형된 리포좀을 포함하는 조성물의 사용이 제공된다. 이들 제형은 표적 조직에서 약물의 축적을 증가시키는 방법을 제공한다. 이 종류의 약물 담체는 단핵성 식균 계(MPS 또는 RES)에 의한 옵소닌 작용 및 제거를 견디며, 그에 의해 더 긴 혈액 순환 시간 및 캡슐화된 약물에 대한 조직 노출을 향상시킨다(Lasic et al. Chem. Rev. 1995, 95, 2601-2627; Ishiwata et al., Chem. Pharm. Bull. 1995, 43, 1005-1011). 이러한 리포좀은 혈관신생된 표적 조직에서 혈관밖유출(extravasation) 및 포획에 의해 종양에서 선택적으로 축적되는 것으로 밝혀졌다(Lasic et al., Science 1995, 267, 1275-1276; Oku et al., 1995, Biochim. Biophys. Acta, 1238, 86-90). 장기 순환성 리포좀은 MPS 조직에서 축적되는 것으로 공지된 통상적인 양이온성 리포좀과 비교하여 DNA 및 RNA의 약동학 및 약역학을 향상시킨다(Liu et al., J. Biol. Chem. 1995,42,24864-24780; Choi et al., 국제 PCT 공보 번호 WO 96/10391호; Ansell et al., 국제 PCT 공보 번호 WO 96/10390호; Holland et al., 국제 PCT 공보 번호 WO 96/10392호). 장기 순환성 리포좀은 간 및 비장과 같은 대사학적으로 공격적인 MPS 조직에서 축적을 피하는 능력을 기본으로 하여 양이온성 리포좀과 비교하여 뉴클레아제 분해로부터 약물을 보호하는 것으로 보인다.

약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제에 약학적 유효량의 소망하는 화합물을 포함하는 투여 저장을 위해 제조된 조성물이 제공된다. 치료용도에 적합한 담체 또는 희석제는 약학 분야에 잘 공지되어 있고 또 예컨대 본 명세서에 참고문헌으로 포함된 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985)에 기재되어 있다. 예컨대, 보존제, 안정화제, 염료 및 향미제가 제공될 수 있다. 이들은 나트륨 벤조에이트, 소르브산 및 p-히드록시벤조산의 에스테르를 포함한다. 또한 산화방지제 및 현탁제도 사용될 수 있다.

약학적 유효 투여량은 질병 상태의 발생을 방지, 억제하거나, 또는 치료하는(증상, 바람직하게는 모든 증상을 어느 정도 경감시키는)데 필요한 투여량이다. 약학적 유효 투여량은 질병의 유형, 사용된 조성물, 투여 경로, 처리되는 포유동물의 유형, 특정 포유동물의 신체 특징, 동시 투약, 및 의학 분야의 통상의 지식을 가진 사람이 인식하는 다른 인자에 따라 달라진다. 일반적으로, 음으로 하전된 중합체의 효능에 따라 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg 체중/일 양의 활성성분을 투여한다.

본 발명에 따른 핵산 분자 및 그의 제형은 통상적인 비독성의 약학적으로 허용되는 담체, 보조제 및/또는 비히클을 함유하는 투약 단위 제형으로 경구, 국소, 비경구적, 흡입 또는 분무에 의해, 또는 직장으로 투여될 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 비경구적은 피부경유, 피하, 혈관내(예컨대 정맥내), 근육내 또는 경막내 주사 또는 주입 수법 등을 포함한다. 또한, 본 발명의 핵산 분자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 제형이 제공된다. 본 발명에 따른 1 이상의 핵산 분자는 1 이상의 비독성 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제 및/또는 보조제, 및 필요한 경우, 다른 활성 성분과 조합되어 존재할 수 있다. 본 발명에 따른 핵산 분자를 함유하는 약학적 조성물은 경구 사용에 적합한 형태, 예컨대 정제, 트로체, 로젠지, 수성 또는 오일성 현탁액, 분산성 분말 또는 과립, 에멀젼, 경질 또는 연질 캡슐, 또는 시럽 또는 엘릭서일 수 있다.

경구 사용을 위한 조성물 및 특히 약학적 조성물은 약학적 조성물을 제조하기 위해 당해 분야에 공지된 방법에 따라 제조할 수 있으며 또 이러한 조성물은 약학적으로 부드럽고 맛좋은 제제를 제공하기 위하여 1 이상의 감미제, 향미제, 착색제 또는 보존제를 함유할 수 있다. 정제는 정제를 제조하기에 적합한 비독성의 약학적으로 허용되는 부형제와 혼합된 활성 성분을 함유한다. 이들 부형제는 예컨대 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토오스, 인산칼슘 또는 인산 나트륨과 같은 불활성 희석제; 예컨대 옥수수 녹말, 또는 알긴산과 같은 과립화제 및 붕해제; 예컨대 녹말, 젤라틴 또는 아카시아와 같은 결합제; 및 예컨대 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 또는 활석과 같은 윤활제일 수 있다. 정제는 코팅되지 않을 수 있거나 또는 이들은 공지 수법으로 코팅될 수 있다. 일부 경우 이러한 코팅은 위장관에서 분해와 흡수를 지연시키기 위한 공지 수법에 의해 제조될 수 있으므로 장시간 동안에 걸쳐 지연된 작용을 제공한다. 예컨대, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 시간 지연 물질이 이용될 수 있다.

경구 사용을 위한 제형은 활성 성분이 불활성 희석제, 예컨대 탄산칼슘, 인산칼슘 또는 카올린과 혼합되는 경질 젤라틴 캡슐로서, 또는 활성성분이 물 또는 오일성 매질, 예컨대 땅콩유, 액체 파라핀 또는 올리브 오일과 혼합되는 연질 젤라틴 캡슐로서 제공될 수 있다.

수성 현탁액은 수성 현탁액 제조를 위해 적합한 부형제와 혼합된 활성 물질을 함유한다. 이러한 부형제는 예컨대 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 알긴산나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 검 트라가칸트 및 검 아카시아와 같은 현탁제이며; 분산제 또는 습윤제는 천연 산출 포스파티드, 예컨대 레시틴, 또는 알킬 옥사이드와 지방산의 축합 생성물, 예컨대 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 에틸렌 옥사이드와 장쇄 지방산 알코올의 축합 생성물, 예컨대 헵타데카에틸렌옥시옥탄올, 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유도된 부분적 에스테르의 축합 생성물, 예컨대 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레에이트일 수 있다. 수성 현탁액은 또한 1 이상의 보존제, 예컨대 에틸, 또는 n-프로필 p-히드록시벤조에이트, 1 이상의 착색제, 1 이상의 향미제, 및 수크로오스 또는 사카린과 같은 1 이상의 감미제를 또한 함유할 수 있다.

오일성 현탁액은 예컨대 아라키스 오일, 올리브 오일, 참기름 또는 코코넛 오일과 같은 식물성 오일, 또는 액체 파라핀과 같은 무기 오일 내에 활성 성분을 현탁시키는 것에 의해 제형화될 수 있다. 오일성 현탁액은 증점제, 예컨대 밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알코올을 함유할 수 있다. 감미제 및 향미제는 맛좋은 경구 제제를 제공하기 위해 제공될 수 있다. 이들 조성물은 아스코르브산과 같은 산화방지제를 부가하는 것에 의해 보존될 수 있다.

물의 부가에 의해 수성 현탁액을 제조하기에 적합한 분산성 분말 및 과립은 분산제 또는 습윤제, 현탁제 및 1 이상의 보존제와 조합된 활성 성분을 제공한다. 적합한 분산제 또는 습윤제 또는 현탁제는 상기에서 이미 예시되어 있다. 부가적인 부형제, 예컨대 감미제, 향미제 및 착색제도 또한 존재할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 o/w 에멀젼 형태로 존재할 수 있다. 오일상은 식물성 오일 또는 무기 오일 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 적합한 유화제는 예컨대 검 아카시아 또는 검 트라가칸트와 같은 천연 산출 검, 예컨대 콩, 레시틴 및 지방산 및 헥시톨로부터 유래한 에스테르 또는 부분적 에스테르와 같은 천연 산출 포스파티드, 예컨대 소르비탄 모노올레에이트와 같은 무수물, 및 상기 부분적 에스테르와 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트일 수 있다. 에멀젼은 또한 감미제 및 향미제를 함유할 수 있다.

시럽 및 엘릭서는 예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨, 글루코오스 또는 수크로오스와 같은 감미제와 제형화될 수 있다. 이러한 제형은 또한 점활제(demulcent), 보존제 및 향미제 및 착색제를 함유할 수 있다. 약학적 조성물은 멸균성 주사가능한 수성 또는 유질 현탁액 형태일 수 있다. 현탁액은 상술한 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 공지 방법에 따라 제형화될 수 있다. 멸균 주사가능한 제제는 또한 비독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매, 예컨대 1,3-부탄디올 중의 용액 중의 멸균 주사가능한 용액 또는 현탁액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 희석제 및 용매는 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이다. 또한 멸균성 고정 오일은 용매 또는 현탁 매질로서 흔히 사용된다. 이를 위하여, 합성 모노- 또는 디글리세리드를 포함하는 블렌드 고정 오일이 사용될 수 있다. 또한 올레산과 같은 지방산은 주사가능한 제제에 사용될 수 있다.

본 발명의 핵산 분자는 예컨대 약물을 직장에 투여하기 위한 좌약 형태로 투여될 수 있다. 이들 조성물은 약물을 보통 온도에서 고체이지만 직장 온도에서는 액체인 적합한 비자극성 부형제와 혼합하여 제조할 수 있으므로 직장에서 용융되어 약물을 방출할 것이다. 이러한 물질은 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.

본 발명의 핵산 분자는 멸균 매질로 비경구적으로 투여될 수 있다. 사용된 비히클 및 농도에 따라서 약물은 비히클에 현탁되거나 용해될 수 있다. 유리하게는 국소 마취제, 보존제 및 완충제와 같은 보조제가 부형제에 용해될 수 있다.

의약 및 약학적 조성물의 투여 정도는 통상의 실험에 의해 당업자가 정할 수 있다.

특정 검체에 대한 특정 투여량 정도는 사용할 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적 건강, 성별, 식이, 투여 시간, 투여 경로, 및 분비 속도, 약물 조합 및 치료중인 특정 질병의 심각도에 따라서 달라질 수 있음을 알아야 한다.

본 발명에 따른 약물을 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 염소, 양, 마우스, 래트, 햄스터 및 기니아 피그와 같은 비인간 동물에 투여하기 위해서는, 조성물은 바람직하게는 동물 사료 및 마시는 물에 부가할 수 있다. 동물 사료 및 마시는 물을 제형화하여서 동물이 치료에 적절한 양의 조성물을 그 식사와 함께 취하도록 하는 것이 유리할 수 있다. 조성물을 사료 또는 마시는 물에 부가하기 위한 프리믹스로 제공하는 것도 유리할 수 있다.

본 발명의 핵산 분자는 전체 치료 효과를 증가시키기 위하여 다른 치료 화합물과 조합하여 검체에 투여될 수 있다. 증상을 치료하기 위해 화합물을 다수회 사용하는 것은 유리한 효과를 증가시킬 수 있으면서 부작용의 존재도 감소시킬 수 있다.

일 구체예로서, 다양한 구체예에서와 같은 핵산 분자 형태 및 제형은 각각 화학요법, 냉동요법, 온열요법, 항체 요법, 방사능 요법 및 항-혈관신생 요법과 같은 기타 요법과 함께 이용될 수 있다. 특히 바람직한 요법은 항-혈관신생 요법이다. 항-혈관신생 요법과 관련하여 특히 바람직한 표적은 VEGF 수용체 및 PDGF 수용체이다. 항-혈관신생 요법은 전형적으로 VEGF 수용체 및 PDGF 수용체와 같은 혈관신생 관련된 표적에 대한 억제제를 사용함으로써 전형적으로 실시된다. 소형 분자 이외에, 다른 종류의 화합물도 또한 생성되거나 또는 제공되거나 또는 사용되어 그러한 표적에 대한 억제제로 작용한다. 이하의 종류의 화합물이 사용될 수 있다: WO 00/44895호 또는 WO 01/75164호에 기재된 바와 같은 siRNA; US 5,849,902호, US 5,989,912호에 기재되거나 또는 유전자 블록으로 공지된 안티센스 분자; EP 0 533 838B1호에 기재된 아프타머; WO 98/08856호에 기재된 스피겔머; 아프타머와 유사한 방식으로 아미노산 서열에서 상이하므로 때때로 펩티드 아프타머로도 불리는 10² 내지 19¹⁸ 펩티드를 포함하는 랜덤 서열 펩티드 라이브러리로부터 확인될 수 있는 고친화성 결합 펩티드; DE 197 42 706호에 기재된 바와 같은 안티칼린; 및 "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory (eds. Harlow, E. and Lane D.)에 기재된 바와 같은 항체.

일 구체예로서, 본 발명에 따른 핵산 분자를 특정 세포 유형에 투여하기에 적합한 조성물이 제공되며, 이러한 조성물은 전형적으로 다음 주요 분자의 1개 또는 몇 개를 혼입한다. 예컨대, 아시알로글리코단백질 수용체(ASGPr)(Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262, 4429-4432)는 간세포에 독특하며 또 아시알로오로소뮤코이드(ASOR)와 같은 분기된 갈락토오스-말단 당단백질에 결합된다. 다른 예로서, 폴레이트 수용체는 많은 암세포에서 과발현된다. 이러한 당단백질, 합성 글리코콘쥬게이트, 폴레이트를 수용체 결합시키는 것은 올리고당 사슬의 분기 정도에 강하게 의존하는 친화성을 갖도록 실시되며, 예컨대 트리아-테나리(tria-tennary) 구조는 바이아테나리(biatenarry) 또는 모노아테나리(monoaternnary) 사슬보다 큰 치환성을 갖고 결합된다(Baenziger and Fiete, 1980, Cell, 22, 611-620; Connolly et

al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 939-945). 갈락토오스와 비교하여 수용체에 대해 더 높은 친화성을 갖는, N-아세틸-D-갈락토사민을 탄수화물 잔기로 사용하는 것을 통하여 높은 친화성을 달성한 Lee and Lee, 1987. Glycoconjugate J., 4, 317-328. 이러한 "군생 효과"는 만노실-말단 당단백질 또는 글리코콘쥬게이트의 결합 및 흡수에 대해 기재되었다(Ponpipom et al., 1981, J. Med. Chem., 24, 1388-1395). 외인성 화합물을 세포막을 통하여 수송하기 위한 갈락토오스, 갈락토사민 또는 폴레이트 계 콘쥬게이트는 간 질병, 간의 암, 또는 기타 암의 치료를 위해 표적화된 전달 방식을 제공할 수 있다. 바이오콘쥬게이트(bioconjugate)의 사용은 치료에 필요한 치료 화합물의 필요한 투여량의 감소를 제공할 수 있다. 또한 치료 생체유용성, 약역학 및 약동학 변수는 본 발명의 핵산 바이오콘쥬게이트의 사용을 통하여 조절될 수 있다. 이러한 바이오콘쥬게이트의 비제한적인 예는 Vargeese et al.에 의해 2001년 8월 13일 출원된 USSN 10/201,394호 및 Matulic-Adamic et al.,에 의해 2002년 3월 6일 출원된 USSN 60/362,016호에 기재되어 있다.

다양한 구체예 중 본 발명에 따른 핵산 분자, 이를 함유하는 벡터, 세포, 의약, 조성물 및 특히 약학적 조성물, 이러한 핵산 분자를 함유하는 본 발명에 따른 조직 및 동물은 치료용으로서 뿐만 아니라 진단 및 연구 목적으로 사용될 수 있다.

다음 질병에 관여한 다양한 조직 및 혈관 내피에서 PKN3의 분포로 인하여, 본 발명에 따른 핵산 분자는 병리학적 메카니즘 또는 그러한 질병, 바람직하게는 병든 조직, 세포, 바람직하게는 PTEN-음성인 종양 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 질병의 치료 및/또는 예방을 위해 사용될 수 있다.

따라서, 본 명세서에 기재된 핵산 분자 및 이를 함유하는 약물 및 약학적 조성물은 불충분한, 비정상적인 또는 과도한 혈관신생을 특징으로 하거나 그에 의해 유발되는 질병을 비롯하여 친-혈관신생 및 항-혈관신생 모두에 대해 사용될 수 있다. 이러한 질병은 전염병, 자가면역 질병, 혈관 기형, 죽상동맥경화증, 이식 동맥병증, 비만, 건선, 사마귀, 알레르기성 피부염, 일차유리체증식증, 당뇨망막병증, 미숙아 망막병증, 노화 관련 황반 질병, 맥락막 혈관신생, 일차 폐 고혈압, 천식, 코의 폴립, 염증성 장 및 치주 질환, 복수, 복막 접합, 자궁내막증, 자궁 출혈, 난소 낭종, 난소 과다자극, 관절염, 윤활막염, 골수염, 골증식체 형성을 포함한다.

다른 질병은 신생물성 조직을 포함하거나 또는 신생물성 조직에 의해 특징화된다. 본 명세서에 바람직하게 사용되는 바와 같이, 용어 신생물성 조직은 생물, 이러한 생물의 조직 또는 세포에 의해 생성되며 생성시키려 의도하지 않고 또 병리적으로 간주되는, 즉 각 질병에 걸리지 않은 검체에서는 존재하지 않는 조직을 지칭한다. 또한, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 신생물성 질병은 직접적으로 또는 간접적으로 신생물성 조직의 존재에 기인한 질병으로서, 바람직하게는 신생물성 조직은 바람직하게는 조직의 자동 생장을 잘못조절되거나(dysregulated) 또는 조절되지 않는 것(unregulated)에 의해 생긴다. 더욱 바람직하게는, 신생물성 질병은 예컨대 골암, 유방암, 전립선암, 소화기계 암, 직결장암, 간암, 폐암, 신장암, 비뇨생식기암, 췌장암, 뇌하수체 암, 고환암, 안와암, 머리 및 목 암, 중앙신경계의 암 및 호흡기 계의 암을 포함하는 군으로부터 선택된다.

지질 조성물 및 리포플렉스를 포함하는 본 발명에 따른 약학적 조성물 및 의약을 사용하여 처리될 수 있는 다른 특정 질병은 다음 목록으로부터 선택할 수 있다: 급성 림프모세포 백혈병, (성인) 급성 림프모세포 백혈병, (유년기), 급성 골수모양 백혈병, (성인), 급성 골수모양 백혈병, (유년기), 부신피질 암종, 부신피질 암종, (유년기), AIDS-관련 암, AIDS-관련 림프종, 항문암, 별아교세포종, (유년기), 소뇌 별아교세포종, (유년기) 뇌, 담관암, 간외, 방광암, 방광암, (유년기), 골암, 골육종/악성 섬유성 조직구종, 뇌 줄기 신경아교종, (유년기), 뇌 종양, (성인), 뇌 종양, 뇌 줄기 신경아교종, (유년기), 뇌 종양, 소뇌 별아교세포종, (유년기), 뇌종양, 뇌 별아교세포종/악성 신경아교종, (유년기), 뇌종양, 뇌실막세포종, (유년기), 뇌종양, 솔질모세포종, (유년기), 뇌종양, 천막위 원시 신경외배엽 종양, (유년기), 뇌종양, 시각경로 및 시상하부 신경아교종, (유년기), 뇌종양, (유년기), 유방암, 유방암, (유년기), 유방암, 웅성, 기관지 샘종/카르시노이드, (유년기), 버킷 림프종, 카르시노이드 종양, (유년기), 카르시노이드 종양, 비공지 일차의 위장관 암종, 중앙신경계 림프종, 일차, 소뇌 별아교세포종, (유년기), 뇌 별아교세포종/악성 신경아교종, (유년기), 경부암, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 골수증식성 질병, 결장암, 결직장암, (유년기), 피부 T-세포 림프종, 자궁내막암, 뇌실막세포종, (유년기), 식도암, 식도암, (유년기), 종양의 어빙 패밀리, 두개외 배세포종, (유년기), 고환외 배세포종, 간외 담관암, 눈암, 눈안 흑색종, 눈 암, 망막모세포종, 담낭암, 위(위장) 암, 위(위장)암, (유년기), 위장관 카르시노이드 종양, 배세포종, 두개외, (유년기), 배세포종양, 고환외, 배세포 종양, 난소, 임신성 영양막 종양, 신경아교종, (성인), 신경아교종, (유년기) 뇌줄기, 신경아교종, (유년기) 뇌 별아교세포종, 신경아교종, (유년기) 시각 경로 및 시상하부, 털세포 백혈병, 머리 및 목 암, 간세포(간) 암, (성인) (일차), 간세포(간) 암, (유년기)(일차), 호지킨스 림프종, (성인), 호지킨스 림프종, (유년기), 하인두 암, 시상하부 및 시각 경로 신경아교종, (유년기), 안내 흑색종, 섬세포 암종(내분비 췌장), 카포씨 육종, 신장(신장 세포)암, 신장 암, (유년기), 후두암, 후두암, (유년기), 백혈병, 급성 림프모세포, (성인), 백혈병, 급성 림프모세포, (유년기), 백혈병, 급성 골수모양, (성인), 백혈병, 급성 골수모양, (성인), 밸혈병, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성, 밸혈병, 털세포, 입술 및 구강 암, 간암, (성인) (일차), 간암, (유년기)(일차), 폐암, 비-소형세포, 폐암, 소세포, 림프종, AIDS-관련된, 림프종, 호지킨스, (유년기), 림프종, 비-호지킨스, (성인), 림프종, 비-호지킨스, (유년기), 림프종, 일차 중앙신경계, 고분자글로불린혈증, 골육종의 발덴스트롬스 악성 섬유성 조직구증, 솔질모세포종, (유년기), 흑색종, 흑색종, 안내 (눈), 메르켈 세포 암종, 중피종, (성인), 악성, 중피종, (유년기), 잠재 원발을 갖는 전이 편평세포 목암, 다발성 내분비 신생물 증후군, (유년기), 다발성 골수종/혈장 세포 신생물, 균상 식육종, 골수형성이상 증후군, 골수형성이상/골수증식성 질병, 골수성 백혈병, 만성 골수모양 백혈병, (성인) 급성, 골수모양 백혈병, (유년기) 급성, 골수종, 다발성, 골수증식성 질병, 만성 비강 및 부비동 암, 코인두암, 코인두 암, (유년기), 신경모세포종, 비-호지킨스 림프종, (성인), 비-호지킨스 림프종, (유년기), 비-소세포 폐암, 구암, (유년기), 구강 암, 입술 및 입인두 암, 뼈의 골육종/악성 섬유성 조직구종, 난소암, (유년기), 난소 상피암, 난소 배세포 종양, 난소 하부 악성 포텐셜 종양, 췌장암, 췌장암, (유년기), 췌장암, 섬세포, 부비동 및 비강 암, 부갑상샘암, 음경암, 크롬친화세포종, 솔방울모세포종 및 천막위 원시 신경외배엽 종양, (유년기), 뇌하수체 종양, 혈장세포 신생물/다발상 흑색종, 흉막폐 모세포종, 임신 및 유방암, 임신 및 호지킨스 림프종, 임신 및 비-호지킨스 림프종, 일차 중앙신경계 림프종, 전립선암, 직장암, 신장세포(신장)암, 신장세포(신장)암, (유년기), 신우 및 요관, 이행세포 암, 망막모세포종, 횡문근육종, (유년기), 침샘암, 침샘암, (유년기), 육종, 어빙스, 육종, 카포씨, 육종, 연조직, (성인), 육종, 연조직, (유년기), 육종, 자궁, 세자리(Sezary) 증후군, 피부암 (비-흑색종), 피부암, (유년기), 피부암 (흑색종), 피부 암종, 메르켈 세포, 소세포 폐암, 소장 암, 연조직 육종, (성인), 연조직 육종, (유년기), 편평세포 암종, 잠재 원발을 갖는 편평세포 목암, 전이 위장 (위)암, 위장 (위) 암, (유년기), 천막위 원시 신경외배엽 종양, (유년기), T-세포 림프종, 피부, 고환암, 가슴샘종, (유년기), 가슴샘종 및 흉선 암종, 갑상샘암종 감상샘암, (유년기), 신우 및 요관의 이행세포 암, 영양막 종양, 임신성 요관 및 신우, 이행세포 암, 요도암, 자궁암, 자궁내막, 자궁 육종, 질암, 시각경로 및 시상하부 신경아교종, (유년기), 음문암, 발덴스트롬스 고분자글로불린혈증, 빌름 종양.

PKN3이 혈관신생, 보다 특히 내피세포의 이동성 억제에 관여하는 이외에, 종양 혈관신생 및 종양, 더욱 특히 전립선암의 이동에도 기여한다(Leenders et al., 2004, EMBO J. 23 (16):3303-3313 참조). PKN3은 P13-키나아제 경로의 일부이다.

PI 3-키나아제 경로는 생장인자 유도 및 평행 시그널링 경로에 대한 PI-3 키나아제 활성을 특징으로 한다. 세포의 생장인자 자극은 세포막에서 이들의 인식 수용체의 활성화를 초래하며, 다시 PI 3-키나아제와 같은 세포내 시그널링 분자와 결합하거나 또는 이를 활성화한다. PI 3-키나아제의 활성화(조절성 p85 및 촉매성 p110 서브유닛으로 구성)는 포스포릴화에 의해 Akt의 활성화를 초래하며, 그에 의해 증식, 생존 또는 더 하류로의 이동과 같은 세포 반응을 지지한다. PTEN은 포스파티딜이노시톨 (PI) 3-키나아제 경로에 관여하고 또 세포 생장 및 형질전환 조절에서 역할을 하는 과거에 광범위하게 연구된 종양 억제인자(suppressor)이다 (참고: Stein, R. C. and Waterfield, M. D. (2000) PI3-kinase inhibition: a target for drug development Mol Med Today 6, 347-357; Vazquez, F. and Sellers, W. R. (2000). PTEN 종양 억제인자 단백질: 포스포이노시티드 3-키나아제 시그널링의 길항물질. Biochim Biophys Acta 1470, M21-35; Roymans, D. and Slegers, H. (2001). Phosphatidylinositol 3-kinases in tumor progression. Eur J Biochem 268, 487-498). 종양 억제인자 PTEN은 PI 3-키나아제 촉매화된 반응을 역전시키는 것에 의해 PI 3-키나아제의 음성 조절제로서 작용함으로써 경로의 활성화가 일시적 및 제어되는 방식으로 생기게 한다. PI 3-키나아제 시그널링의 만성 과활성화는 PTEN의 기능적 불활성화에 의해 유발된다. PI 3-키나아제 활성은 소분자 억제제 LY294002를 부가함으로써 차단될 수 있다. 평행 경로에서 작용하는 시그널링 키나아제 MEK의 활성 및 하류 반응은 예컨대 소분자 억제제 PD98059에 의해 억제된다.

PTEN 기능 상실을 통한 PI 3-키나아제 경로의 만성 활성화는 종양형성 및 전이에 주요한 원인이며, 이 종양 억제인자는 제어되는 세포 증식에 대한 중요한 확인점을 나타낸다. PTEN 녹아웃 세포는 PI 3-키나아제 경로가 PI 3-키나아제의 활성화된 형태를 통하여 만성적으로 유도되었던 세포와 유사한 특징을 나타낸다(Di Cristofano, A., Pesce, B., Cordon-Cardo, C. and Pandolfi, P. P. (1998). PTEN은 배아 발생 및 종양 억제에 필수적이다. Nat Genet 19, 348-355. Klippel, A., Escobedo, M. A., Wachowicz, M. S., Apell, G., Brown, T. W., Giedlin, M. A., Kavanaugh, W. M. and Williams, L. T. (1998). 포스파티딜이노시톨 3-키나아제의 활성화는 세포 주기 진입에 충분하며 또 발암 형질전환의 세포 변화 특징을 증진시킨다. Mol Cell Biol 18, 5699-5711. Kobayashi, M., Nagata, S., Iwasaki, T., Yanagihara, K., Saitoh, I., Karouji, Y., Ihara, S. and Fukui, Y. (1999). 포스파티딜이노시톨 3-키나아제의 활성화에 의한 샘암종의 탈분화. Proc Natl Acad Sci USA 96, 4874-4879).

PI 3-키나아제 경로를 포함하는 질병 및 상태를 기재하는 다수의 종래 기술이 존재한다. 이들 상태 및 질병은 본 명세서에 기재된 방법 및 약물 및 진단약에 의해 해결될 수 있으며, 이들의 디자인, 스크리닝 또는 제조는 본 명세서에 기재되어 있다. 예시를 위한 것이나 비제한적으로 다음을 들 수 있다: 자궁내막암, 결직장 암종, 신경아교종, 자궁내막암, 샘암종, 자궁내막 과형성증, 코우덴스 증후군, 유전성 비-폴립증 결직장 암종, Li-프로우멘스 증후군, 유방-난소암, 전립선암(Ali, I.U., Journal of the National Cancer Institute, Vol. 92, no. 11, June 07, 2000, page 861 - 863), 반나얀-조나나 증후군, LDD (레르미트-듀크로스 증후군: Lhermitte-Duklos' syndrome) (Macleod, K., supra), 카우 질병(CD) 및 반나얀-루발카바-릴리 증후군(BRR)을 비롯한 과오종-대두증 질병, 점막피부 병반(예컨대 트리킬레몬마스), 대두증, 정신지체, 위장관 과오종, 지방종, 갑상샘 샘종, 유방의 섬유낭병, 소뇌 형성이상 신경절신경종 및 유방 및 갑상샘 악성(Vazquez, F., Sellers, W. R., 상기 참조).

상기와 같은 점에서, PKN3은 PKN3의 상류를 표적으로 하는 다른 약물에 비하여 부작용이 덜한 약물에 의해 해결될 수 있는 PI 3-키나아제 경로의 유용한 하류 약물 표적이다. 이팩터 분자의 상기 특정 분획, 즉 상기 경로에 관여한 단백질 PKN3 및 더 하류의 분자에 대한 제어를 가짐으로써, 시그널링 캐스케이드 중의 오직 제한된 수의 평행 분기 또는 상류 표적이 바람직하지 않은 효과를 초래할 것이다. 따라서, 세포 주기, DNA 수선, 세포자살, 글루코오스 수송, 번역에 관련된 PI-3 키나아제/PTEN 경로의 다른 활성은 영향을 받지 않을 것이다. 또한, 인슐린 시그널링은 유도되지 않는데, 이는 LY294002의 사용과 관련된 당뇨병 반응 또는 기타 부작용이 실질적으로 피해질 수 있음을 의미한다. LY294002 (2-(4-모르폴리닐)8-페닐크로멘)은 릴리 리서치 라보라토리즈(인디애나폴리스 소재)에 의해 PK-3K에 대한 억제제(Vlahos et al. 1994, JBC 269, 5241 - 5248)로서 개발된 몇 개의 크로멘 유도체 소분자 억제제 중의 하나이다. 이것은 PI-3K 분자의 촉매적 서브유닛, p110을 표적으로 하며 또 촉매적 중심에서 ADP 결합과 경쟁하는 것에 의해 작용한다. 그러나, LY294002는 상이한 세포 작용을 갖는 것으로 제시된 p110(알파, 베타, 감마, 델타)의 상이한 이소형태를 구별할 수 없다.

PKN3은 또한 라파마이신에 의해 해결되는 mTOR의 하류에 있다. Raft 또는 FRAP로도 공지된 mTOR (파라마이신의 포유류 표적)은 pp70 S6 키나아제 의존적으로 세포 주기에 진입하는 것과 같은 과정을 조절하도록 PI 3-키나아제의 하류로 작용한다. mTOR은 pp70 S6 키나아제 및 개시 인자 4E의 세균 활성화를 통하여 번역을 제어하기 위한 생장인자 및 영양 이용율에 대한 센서로 작용한다. mTOR 작용은 세균성 마크롤라이드 라파마이신에 의해 억제되며, 이것은 T-세포 및 특정 종양 세포의 생장을 차단한다(Kuruvilla and Schreiber 1999, Chemistry & Biology 6, R129-R136).

라파마이신 및 그의 유도체가 임상에서 현재 사용되는 적절한 약물이라는 사실은 약물 표적이 더욱 유용하고 또 부작용이 덜하며 특정 분자 메카니즘, 예컨대 Yu et al.(Yu, K. et al (2001) Endocrine-RelatCanc 8, 249)에 예시된 바와 같은 메카니즘에 더욱 특이적이라는 것을 보여준다.

PKN3은 단백질 키나아제 C 패밀리의 구성원으로서, 이들 모두는 단백질-세린/트레오닌 키나아제로 불린다. 전형적으로, 이러한 유형의 단백질 키나아제는 1개의 조절 서브유닛 및 1개의 촉매적 서브유닛을 포함하며 또 칼슘 이온 및 인지질을 공동인자로 사용한다. 디아실 글리세롤은 상기 종류의 단백질 키나아제 패밀리의 활성제로서 작용한다. 단백질 키나아제 C 패밀리의 구성원은 호르몬 또는 신경전달물질에 결합된 몇 개의 시그널링 경로에 관여한다. 이들 단백질 키나아제는 포스포릴화에 의해 이들의 표적 단백질의 활성을 조절한다. 단백질 키나아제 C의 비생리적으로 지속되는 활성화는 형질전환된 세포성 표현형을 초래하고 이것은 암의 발생을 초래할 수 있음이 당해 분야에 알려져 있다.

PKN3의 mRNA로서 완전한 서열은 데이터뱅크, 예컨대 수탁번호 gi 7019488 또는 NM_013355으로 입수할 수 있다. 유전자 코드를 이용하여, 특정 아미노산 서열은 이 mRNA로부터 유추될 수 있다. 또한 PKN3의 아미노산 서열은 수탁번호 gi7019489 또는 NP_037487.1으로 데이터뱅크로부터 입수할 수 있다.

인간 PKN3에 대한 상동체는 엠. 무스쿨루스(M. musculus), 알. 노르베지쿠스(R. norvegicus), 에이. 틸리아나(A. thaliana)), 씨. 엘레간스(C. elegans), 디. 멜라노가스터(D. melanogaster) 및 에스. 세레비시아애(S. cerevisiae)에서 찾아 볼 수 있다. 상술한 다양한 종에 대하여 정렬된 영역의 % 상동성 및 길이는 67 % 및 279 아미노산, 51 % 및 866 아미노산, 38 % 및 305 아미노산, 36 % 및 861 아미노산, 63 % 및 296 아미노산 그리고 44 % 및 362 아미노산이다. 이들의 어느 것 또는 다른 상동체는 이러한 상동체를 사용하여 생성한 약물이 인간의 단백질 키나아제 N 베타 또는 기타 목적하는 단백질 키나아제 N 베타와 여전히 상호작용하는 하지 않는 한, 원칙적으로 본 발명을 실시하기에 적합한 것으로 당해 분야의 통상의 지식을 가진 사람들에 의해 인정되고 있다.

인간 아미노산 서열은 ProtETST, 수탁번호 pir:JC7083으로부터 취할 수 있고, 이때 각 단백질 키나아제 N 베타는 JC7083 단백질 키나아제로 칭한다. 인간 단백질 키나아제 N 베타에 대한 유전자는 인간 염색체 번호 9 상에 위치한다. 단백질 키나아제 N 베타에 대한 cDNA 공급원은 일반적으로 다수의 암 및 다양한 태아 또는 배아 조직, 더욱 특히 그 중에서도, 위장, 샘암종, 뇌, 유방, 버킷 림프종, 경부, 연골육종, 결장, 태아 눈, 태아 수정체, 태아 눈 안구앞부분, 태아 광학 신경, 태아 망막, 태아 망막 중심와(foveal), 태아 황반, 태아 맥락막, 피브로테오마(fibrotheoma), 생식선, 머리, 목, 심장, 신장, 대세포 암종, 평활근육종, 전이 연골육종, 난소, 부갑상샘, 망막모세포종, 횡문근육종, 소세포 암종, 편평세포 암종, 고환 및 자궁이다. 상기 목록으로 부터 본 명세서에서 의약으로 지칭되는 약물은 본 명세서에 개시된 바와 같은 다른 질병 이외에 상기 질병 또는 특정 세포, 조직 또는 기관을 포함하는 질병을 치료 및/또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 이들 질병 및 병든 상태는 "본 명세서에 기재한 바와 같은 질병" 용어에 포함되는 것이다.

본 발명에 따른 핵산 분자 및 이들 함유하는 의약에 의해 치료되거나 및/또는 예방될 수 있는 본 명세서에 기재된 바와 같은 질병뿐만 아니라 본 명세서에 기재된 바와 같은 병든 상태는 또한 종양생성 및 전이를 포함한다. 이것은 특히 본 명세서에 기재된 질병 및 본 명세서에 기재된 병든 상태에 특히 적용되며, 이때 이러한 질병 또는 병든 상태에 관여한 세포는 PTEN 음성이며, 이는 종양 억제인자 PTEN이 활성이 아니거나 또는 감소된 수준의 활성을 갖는 것을 의미한다. 이러한 질병은 또한 PI 3-키나아제 경로가 일반적으로 포함되는 질병을 포함한다. 특히 전이성 종양 이외에, 당뇨병도 이러한 유형의 질병 및 병든 상태에 포함된다. 따라서, 세포, 특히 본 명세서에 기재된 바와 같은 질병 또는 병든 상태에 관여하며 또 PTEN 음성인 세포는 약물에 의한 치료에 처리되며, 그 작용 모드는 관여된 각 세포에서 PKN3의 활성을 감소 또는 경감시키는 것이다. 따라서, 종양 환자는 바람직하게는, 비제한적으로 PI 3-키나아제 경로의 성분을 암호화하는 유전자의 증폭 또는 돌연변이를 통하여 과활성화된 PI 3-키나아제 경로를 특징으로 하거나 또는 PTEN 음성이거나 또는 PTEN 음성인 세포를 갖는 사람, 특히 이들 세포가 본 명세서에 기재한 바와 같은 질병 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 병든 상태에 속하면, 상술한 약물을 사용하여 유리하게 치료될 수 있다. 이러한 활성 감소는 PKN3의전사 수준의 감소 또는 번역 수준에서의 감소, 즉 효소 활성의 감소로부터 기인할 수 있다. 어떠한 이론에 얽매이는 것은 아니나, 후자의 경우, 즉 PKN3의 활성을 조절하는 것은 PKN3의 특징에 의해 유발되며, 즉 PKN3의 효소 활성은 상향조절 및 하향 조절, 더욱 바람직하게는 하향조절될 수 있다.

상기 약물을 사용하여 처리될 수 있는 다른 그룹의 환자는 낮은 PTEN 기능 손실에 대한 높은 발생빈도를 갖는 암에 걸린 환자, 특히 후기 종양 환자이다(Cantley and Neel, 1999). PTEN의 손실은 각 종양 세포의 공격성 및 침습성 증가와 관련된다.

본 발명에 따른 약학적 조성물이 사용될 수 있는 치료 및 예방용으로 본 명세서에 기재된 다양한 질병은 본 명세서에 기재된 의약이 사용될 수 있는 예방 및/또는 치료용 질병이며, 그 역도 성립함을 알 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 질병은 이러한 질병의 예방을 포함할 것이다.

또한, 특징, 구체예 및 이점은 다음 도면으로부터 알 수 있다.

도 1은 PI 3-경로에서 PKN3의 관여를 나타내는 개략도이다.
도 2는 인간 세포주(HeLa, HUVEC) 및 마우스 세포주(EOMA)에서 PKN3 특이적 siRNA를 사용한 녹다운 실험의 웨스턴 블럿 분석 결과를 도시한다.
도 3은 HeLa 및 HUVEC 세포에서 siRNA 분자의 IC50을 측정하기 위한 리포플렉스로서 제형화된 PKN3 특이적 siRNA 분자의 상이한 농도를 사용한 녹다운 실험 결과를 도시한다.
도 4는 PKN3 특이적 siRNA 분자 및 대조군으로서 PKN3 특이적 안티센스 분자를 사용한 녹다운 실험의 웨스턴 블럿 분석 결과를 도시하며, 상기 분자의 녹다운 강도 면에서 효능은 상이한 시점에서 평가하였다.
도 5는 녹다운 실험의 웨스턴 블럿 분석의 결과를 도시하며, 이때 상이한 농도의 PKN3 특이적 siRNA 리포플렉스를 사용하며, 3' 말단에서 포스페이트 기를 나타내거나 나타내지 않는다.
도 6은 상이한 PKN3 특이적 siRNA 분자를 사용한 녹다운 실험의 웨스턴 블럿 분석 결과를 도시하며(도 6A) 및 세포외 매트릭스 상에서 HUVEC 생장에 대한 PKN3 기능의 손실을 나타내는 현미경 사진(도 6B)을 도시한다.
도 7은 PKN3 특이적 siRNA 분자의 생체내 효능(도 7A) 및 s.c. PC-3 이종이식 종양 마우스 모델에서 종양 부피에 대한 이러한 분자의 영향(도 7B) 및 체중에 대한 이러한 분자의 영향(도 7C)을 도시한다.
도 8은 PKN3 특이적 siRNA 분자의 생체내 효능(도 8A) 및 s.c. PC-3 이종이식 종양 마우스 모델에서, 체중 또는 종양 부피의 %로 표시된 이러한 siRNA 분자의 상이한 투여량 효과(도 8B) 및 체중 또는 종양 부피의 %로서 표시한 상기 분자를 사용한 상이한 치료 계획의 효과(도 8C)를 도시한다.
도 9는 PKN3 특이적 siRNA 분자의 생체내 효능(도 9A) 및 전립선내 PC-3 이종이식 종양 마우스 모델에서, 전립선 종양 부피 및 림프절 전이에 대한 상기 분자의 효과(도 9B) 및 폐에서 PKN-3 및 Tie2 mRNA의 감소에 대한 상기 분자의 효과(도 9C)를 도시한다.
도 10은 전신 투여시 특이적 siRNA 분자를 사용한 상이한 처리 계획의 생체내 효능(도 10A) 및 전립선내 PC-3 이종이식 종양 마우스 모델에서, 전립선 종양 부피(도 10B) 및 림프절 전이 부피(도 10C)에 대한 상기 상이한 처리 계획의 효과를 도시한다.
도 11은 전신 투여시 PKN-3 특이적 siRNA 분자를 사용한 상이한 처리 계획의 생체내 효능(도 11A) 및 전립선 종양 부피(도 11B) 및 림프절 전이 부피(도 11C)에 대한 상기 다양한 투여량의 효과를 도시한다.
도 12A는 리포플렉스를 형성하는 화합물을 도시한다.
도 12B는 리포좀과 비교한 본 발명에 따른 리포플렉스의 구조를 도시하는 개략도이다.
도 13은 19개 염기쌍 또는 23개 염기쌍을 갖는 PKN3 특이적 siRNA 분자를 사용한 녹다운 실험의 웨스턴 블럿 분석의 결과를 도시한다.
도 14는 상이한 PKN3 특이적 siRNA 분자를 사용한 녹다운 실험의 웨스턴 블럿 분석의 결과를 도시한다.
도 15는 3개의 상이한 세포주에서 19개 염기쌍 또는 23개 염기쌍을 갖는 siRNA 분자를 사용한 녹다운 실험의 웨스턴 블럿 분석의 결과를 도시하며, 이때 siRNA 분자는 상이한 농도로 사용된다.
도 16은 PKN3 특이적 siRNA 분자의 생체내 효능(도 16A) 및 그자리 전립선 암 마우스 모델에서, 전립선 종양 부피(도 16B) 및 림프절 전이 부피(도 16C) 그리고 림프절 전이 확산(도 16D) 감소에 대한 19개 염기쌍 또는 23개 염기쌍을 갖는 PKN3 특이적 siRNA 분자의 효과를 시험하기 위한 실험 디자인을 도시한다.
도 17은 23개 염기쌍을 포함하는 PKN3 특이적 siRNA 분자의 다양한 투여량의 생체내 효능(도 17A) 및 그자리 전립선 암 마우스 모델에서, 전립선 종양 부피(도 17B) 및 림프절 전이 부피(도 17C) 그리고 림프절 전이 확산(도 17D) 감소에 대한 상기 다양한 투여량의 효과를 실험하기 위한 실험 디자인을 도시한다.

실시예 1: 재료 및 방법

시험관내 형질감염 및 면역블로팅 ; 항체

세포주는 상술한 양이온성 리포좀을 사용하여 siRNA에 의해 형질감염시켰다. 간단히 말해, 세포 씨딩(seeding)한지 약 12시간 후, 10% 혈청 함유 배지로 희석한 상이한 양의 siRNA-리포플렉스 용액을 상기 세포에 부가하여 1-50 nM siRNA 범위의 형질감염 농도를 달성하였다. 형질감염(48 시간) 후, 세포를 용균시키고 상기 기재한 바와 같이 면역블로팅시켰다(Klippel et al., 1998). 단백질 농도는 DC 단백질 에세이(BioRad)를 이용하여 측정하였고 다음 항체를 사용하여 면역블럿 분석을 위해 동량을 로딩하였다: Rabbit 항-PTEN (Ab-b, Neomarkers), Akt-1, 토끼 항-PKN3 (Leenders et al., 2004).

세포주

PC-2, HeLa, HUVEC (인간 제대 정맥 내피 세포), 및 EOMA 세포주를 ATCC의 추천에 따라 배양하였다.

종양 이종이식

웅성 Hsd:MNRI-nu/nu 마우스 (8주령)을 이 연구에 사용하였다. 확립된 종양 이종이식에 대한 종양 요법 실험을 위해, 총 5.0 x 10⁶ 종양 세포 /100㎕ PBS를 피하 이식하였다. 종양 부피는 측경기를 이용하여 측정하였고 또 다음 식에 따라 계산하였다: 부피 = (길이 x 폭²)/2. 종양 요법 실험을 위해 siRNA-리포플렉스 용액을 예컨대 저압, 저부피로 꼬리 정맥 주사에 의해 투여하였다. 동소이식(orthotopic) 종양 모델에서 2.0 x 10⁶ PC-3 세포/30㎕ PBS를 전신 마취하의 전립선의 좌측 등쪽 엽에 주사하였다(Stephenson et al., 1992). 조작한지 50일 후 동물을 치사시키고 또 종양의 부피 및 국소적인 전이(꼬리, 허리 및 신장 림프절 전이)를 상술한 바와 같이 측정하였다.

정맥 투여의 경우, siRNA-리포플렉스는 최종 투여량 1.88 mg/kg siRNA 및 14.5 mg/kg 지질로 하고 다른 계획의 경우 가변적 투여량으로 200 ㎕ 용액을 단일 꼬리 정맥 주사를 통하여 siRNA 리포플렉스를 정맥 투여하는 것에 의해 실시하였다(지시된 바와 같이).

통계적 분석

데이터는 평균 ± s.e.m으로 표시하였다. 차이의 통계적 유의성은 맨-휘트니 유-시험(Mann-Whitney U test)에 의해 측정하였다. P 값 < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

마트리겔 ( Matrigel ) 에세이

마트리겔 매트릭스에서 세포 생장을 에세이하기 위해, HUVEC는 siRNA에 의해 48시간 동안 형질감염되었다. 트립신처리한 후, 세포는 250 ㎕ 마트리겔 기저 막 매트릭스에 의해 예비코팅된 24-웰 플레이트 상에 중복해서 씨딩(110,000 세포/웰)하고 또 재플레이팅한지 240시간 후 Axiovert S100 현미경에 부착된 Axiocam 카메라를 사용하여 x 1.25 또는 x 2.5 배율로 현미경 사진을 찍었다.

실시예 2: PKN3 siRNA 분자

(Czauderna et al., 2003)에 기재된 바와 같고 또 BioSpring (Frankfurt a. M., Germany)에 의해 합성된 siRNA 분자로도 불리는 본 발명에 따른 분자(AtuRNAi, 표 1a 및 1b 참조)를 이 연구에 사용하였다.

상기 분자의 듀플렉스는 각 센스 가닥 및 안티센스 가닥에 의해 형성되며, 이들은 각각 표 1a 및 1b에 5' → 3' 방향으로 나타내어져 있다. 따라서, 이중가닥의 분자는 각 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 조합함으로써 형성되며, 예컨대 PKN3-hm-1s 및 PKN3-hm-1as는 이중 가닥 구조를 갖는 분자를 형성하며, 이것은 특정 실시예에서는 PKN3(1)으로 지칭한다. 그러나 이 분자는 무딘 말단이고, 이중 가닥의 분자를 형성하는 각 가닥은 3'-말단에 포스페이트 부착되며, 보다 특히 말단 3'-OH 말단에 부착된다. 이들 분자는 양쪽 가닥에 교대되는 2'-O-메틸 당 변형에 의해 화학적으로 안정화되며, 따라서 비변형된 뉴클레오티드는 표 1a로부터 분명하듯이 대향하는 가닥 상에서 변성과 조우한다. 이들 이중가닥의 분자는 본 발명에 따른 핵산 분자의 특히 바람직한 구체예이다.

[표 1a]

2'-O-메틸 변형을 갖는 뉴클레오티드는 밑줄로 표시한다; 그러한 밑줄로부터 모든 두번째 뉴클레오티드는 상기 종류의 변형을 가지므로, 이러한 변형은 안티센스 가닥 상의 제1 뉴클레오티드에서 개시되고, 또 센스 가닥 위에서 제2 뉴클레오티드로 개시됨을 분명히 알 수 있다(단 양쪽 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 5' - 3' 방향 형태로 좌측에서 우측으로 표시됨).

s는 제2 가닥으로도 지칭되는 센스 가닥을 의미한다; 또

as는 제1 가닥으로도 지칭되는 안티센스 가닥을 의미하므로, 제1 가닥은 연속적인 뉴클레오티드의 제1 스트레치를 포함하고 또 상기 제1 스트레치는 표적 핵산에 대해 적어도 부분적으로 상보적이며, 상기 표적 핵산은 본 명세서에 기재된 바와 같이 바람직하게는 분해될 핵산이다. 이들 분자는 PKN3 특이적 siRNA로 지칭하며 또 2개의 인간 세포주, 즉 HeLa, HUVEC, 및 1개의 마우스 세포주(EOMA)에서 스크리닝하였다. 20 nM의 siRNA를 형질감염시키고 또 실시예 1에 기재된 바와 같이 형질감염된지 48시간 후에 전체 세포 분해물로부터 면역블럿을 실시하였다. 결과를 도 2에 도시한다. 도 2로부터 알 수 있듯이, 특히 바람직한 것은 핵산 분자 PKN3 (2), PKN3(3), PKN3 (4), PKN3 (5), PKN3 (6), PKN3 (8)이다.

더욱 더 바람직한 분자는 PKN3 (3)이며, 다음 연구에 처리하였다.

PKN3 (3)을 기초로 하여 이하의 표 1b에 나타낸 siRNA 분자를 디자인하였고 또 PKN3-hm-3A23v1 및 PKN3-hm-3B23V1 분자로 구성된 분자에 대한 PKN3-23-v1으로 표시하며, 즉 PKN3-hm-3A23v2 및 PKN3-hm-3B23v2 분자로 구성된 분자에 대해서는 PKN3-23-v2로 표시된 단일 가닥, PKN3-hm-3A23v3 및 PKN3-hm-3B23v3 분자로 구성된 분자에 대해서는 PKN3-23-v3으로 표시된 단일 가닥, 즉 PKN3-hm-3A23v4 및 PKN3-hm-3B23v4 분자로 구성된 분자에 대해서는 PKN3-23-v4로 표시된 단일 가닥, 즉 PKN3-hm-3A23v5 및 PKN3-hm-3B23v5 분자로 구성된 분자에 대해서는 PKN3-23-v5로 표시된 단일 가닥, 즉 단일 가닥으로 표시한다.

이들 siRNA 분자들이 제공되고 표시되는 방식은 표 1a에 함유된 siRNA 분자와 관련하여 기재된 것과 동일하다. 표 1b로부터 분명한 바와 같이, 표 1b에서 PKN3-hm-3A19/PKN3-hm-3B19로 지칭되는 PKN3 (3)에서 시작하여, 총 4개 뉴클레오티드가 센스 가닥의 3' 말단 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 부가되었고(PKN3-23-v1), 총 4개의 뉴클레오티드가 센스 가닥의 5' 말단 및 총 4개의 뉴클레오티드가 안티센스 가닥의 3' 말단에 부가되며(PKN3-23-v2), 1개의 뉴클레오티드가 5'말단에 또 센스 가닥의 3' 말단에 3개의 뉴클레오티드 및 5' 말단에 3개의 뉴클레오티드 및 안티센스 가닥의 3'말단에 1개의 뉴클레오티드가 부가되며(PKN3-23-v3), 2개의 뉴클레오티드가 5' 말단에 또 2개의 뉴클레오티드가 센스 가닥의 3' 말단에 부가되고(PKN3-23-v4), 또 3개의 뉴클레오티드가 5' 말단에 또 1개의 뉴클레오티드가 센스 가닥의 3' 말단에 또 1개의 뉴클레오티드가 5' 말단에 또 3개의 뉴클레오티드가 안티센스 가닥의 3' 말단에 부가된다(PKN3-23-v5). 이렇게 새롭게 부가된 뉴클레오티드는 표 1b에서 이탤릭체로 나타낸다.

[표 1b]

표 1b의 siRNA 분자를 녹다운 효능에 대해 시험하였고 또 19개 뉴클레오티드 길이를 갖는 PKN3 특이적 siRNA 중의 하나, 더욱 특히 PKN3 (3)과 비교하였다. 이러한 목적을 위해, HeLa B 세포를 6개 웰(40k)에 플레이팅(plated)하고, 16시간 후에 20 nM 으로 형질감염시키고 또 형질감염된 지 48시간 후 단백질 추출하기 위해 용균시켰다. 이와 다르게 나타내지 않는 한, 이들 siRNA 분자와 관련하여 사용된 수법 및 과정은 실시예 부분, 더욱 특히 실시예 1에 기재된 바와 같다.

항-PKN3 항체 및 항-PTEN 항체(로딩 대조용으로 작용)를 사용하여 프로우빙된(probed) 용균물의 웨스턴 블럿은 도 13에 도시한다. 도 13으로부터 분명하듯이, PKN3-23-v1은 효능 면에서 PKN3-23-v4, PKN3-23-v5, PKN3-23-v2 및 PKN3-23-v3보다 특히 효과적이다. 안티센스 가닥으로

및 안티센스 가닥으로서

을 포함하는 루시페라아제 특이적 siRNA 분자를 대조용(KO)으로 사용하였다.

하기 표 2에 수록된 바와 같은 가능한 siRNA 분자를 스크리닝하며, 그 제시 및 변형 방식은 상기 표 1a 및 표 1b에 도시된 siRNA 분자와 관련하여 기재한 바와 같다.

표 2에 나타낸 이들 siRNA 분자는 상기 기재한 바와 같이 HUVEC 세포에서 일차 스크리닝하였다. 세포를 6개 웰(40k)에 플레이팅하고, 16시간 후 20 nM siRNA 및 1 ㎍/ml AtuFECT01을 사용하여 형질감염시키고 또 형질감염된지 72시간 후 단백질 추출을 위해 용균시켰다. 항-PKN3 및 항-PTEN (로딩 대조용으로 작용)으로 프로빙된 용균물의 웨스턴 블럿은 도 14에 도시하며, 이때 u는 미처리를 의미하고; 상기 정의한 바와 같이 Luci는 루시페라아제 siRNA를 의미하며; 또 co3은 다음을 의미한다:

상반되게 나타내지 않는한, 이들 siRNA 분자와 관련하여 사용된 수법 및 방법은 실시예 부분, 특히 실시예 1에 기재한 바와 같다.

실시예 3: PKN3 특이적 siRNA 분자의 리포플렉스 제형

리포플렉스 제형은 Santel (Santel et al., 2006)에 기재되어 있다.

양이온성 지질 AtuFECT01 (β-L-아르기닐-2,3-L-디아미노프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드, Atugen AG), 중성 인지질 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPhyPE)(Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster, AL) 및 페길화된(PEGylated) 지질 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 나트륨염(DSPE-PEG) (Lipid GmbH, Ludwigshaften, Germany)를 50/49/1의 몰비로 300 mM 멸균 RNase-유리 수크로오스 용액 중 지질막 재수화에 의해 총 지질 농도 4.34 mg/ml 으로 혼합하였다. 다르게 나타내지 않는한, 전형적으로 30 g 마우스에 대해 단일 정맥 주사를 1.88 mg/kg siRNA 및 14.5 mg/kg 지질의 표준 투여량으로 실시하였다. 또한 다르게 나타내지 않는 한, PKN3 특이적 siRNA 분자는 실시예 2에 정의한 바와 같은 PKN3(3) 분자이다. 본 발명에 따라 리포플렉스를 형성하는 PKN3(3)을 비롯한 다양한 화합물은 도 12A에 도시하며, 이 도면으로부터 특이적 siRNA 분자는 원칙적으로 본 명세서에 기재한 바와 같이 siRNA 분자, 바람직하게는 표 1a 및 표 1b에 기재한 바와 같은 siRNA 분자일 수 있음을 알 수 있다.

도 12B는 siRNA 리포플렉스, 즉 siRNA 분자 사이 또는 siRNA 분자와 상술한 지질, 즉 양이온 지질, 헬퍼 지질로도 불리는 DPhyPE, 및 PG-지질, 즉 DSPE-PEG와 함께 형성된 착물을 개략적으로 도시한다. PKN3-특이적 siRNA의 진하게 나타낸 뉴클레오티드는 개별 뉴클레오티드의 2'-O-메틸 변형을 나타낸다.

실시예 4: IC50 의 측정

흔히 siRNA-PKN3(3) 리포플렉스로도 불리는, PKN3(3) 분자와 실시예 3에 특정된 지질에 의하여 형성된 리포플렉스의 IC50은 HeLa 및 HUVEC 세포에서 형질감염후 측정하였다. 단백질 용균물은 형질감염된지 48시간 후에 제조하며 PKN3 및 PTEN-특이적 항체를 사용하여 면역블럿을 실시하였다.

리포플렉스화된 (리포플렉스로 제형화된) siRNA 분자("siRNA-PKN3(3)")의 농도는 1, 5, 10 및 20 nM이었다.

결과를 도 3에 도시한다.

도 3으로부터, HeLa 세포에서 5nM의 siRNA-PKN3(3)의 농도는 단백질 수준에서 PKN3을 녹다운하기에 적합하다는 것을 알 수 있다. HUVEC 세포에서도 마찬가지이며, HeLa 세포에서 동일한 녹다운 정도에 도달하기 위해서 약간 더 높은 농도가 필요하다. PTEN은 로딩 대조용으로 사용되었다.

본 명세서 표 1b에 기재한 바와 같은 PKN3 분자, 더욱 특히 PKN3-23-v1으로부터 형성된 리포플렉스는 19mer인 PKN3(3)과 대조적으로 세포주 HUVEC 및 EOMA에서 투여량 적정처리하였다. 앞의 실시예에서 기재한 바와 같이, 세포를 6 웰(40k)에 플레이팅하고, 지정된 농도의 siRNA를 이용하여 16시간 동안 형질감염시킨 다음 형질감염된지 48시간 후 단백질 추출을 위해 용균시켰다. 항-PKN3 항체 및 항-PTEN 항체(로딩 대조용으로 작용함)에 의해 포로빙된 용균물의 웨스턴 블럿은 도 15에 도시한다.

도 15로부터 알 수 있는 바와 같이, PKN3-23-v1 siRNA는 PKN3(3) 중의 하나의 효능에 필적한다. 19mer 및 23mer 분자의 IC50은 세포 형질감염 실험한 다음 반정량적(semiquantitative) 면역블럿에 의해 평가하였으며 3개의 상이한 세포주에 대해 유사한 효능(IC50 ~ 5 nM)을 나타낸다. EOMA는 마우스 유래 내피세포주이며, 마우스 및 인간에 대한 활성을 나타냄이 중요하다.

실시예 5: PKN3 특이적 siRNA 분자의 일시적( transient ) 효과

PKN3 특이적 siRNA 분자, 즉 siRNA-PKN-3(3) 및 PKN3 특이적 안티센스 분자(GB 대조용)의 녹다운 효과의 일시적 특징을 나타내기 위하여(Leenders et al., 2004), 이들 분자를 HeLa 세포에 형질감염시켰다. 단백질 용균물은 48시간, 96시간, 144시간 및 192 시간에서 제조하였다. 각각의 경우에서, 세포를 실시예 3에 기재된 바와 같이 PKN3(3) 분자를 함유하는 siRNA 리포플렉스에 노출시키고 또 상기 siRNA 리포플렉스는 24시간 후 제거하였다.

결과를 도 4에 도시한다.

도 4로부터, 단백질 수준에서 PKN3 상의 siRNA PKN3(3)의 효과는 96시간 까지 관찰될 수 있고, 144시간 후에는 특정 siRNA 분자의 효능은 감소되는 것으로 보이며 또 192 시간 후에는 녹다운 효과는 더 이상 관찰되지 않았다. GB 대조용과 비교하여, 본 발명에 따른 siRNA 분자는 안티센스 분자에 비교하여 더 길게 지속되는 활성을 나타내며, 96시간 후에는 녹다운이 현저히 감소됨을 알 수 있다.

실시예 6: 본 발명에 따른 siRNA 분자의 3' 말단에 부착된 포스페이트 기의 효과

이 실시예에서, 본 발명에 따라 이중 가닥 구조 또는 분자를 형성하는 센스 및 안티센스 가닥의 3'-말단에서 3'-포스페이트 변형의 효과를 연구하며, PKN3(3)은 녹다운을 매개하는 핵산 분자로 사용되었고 또 상기 핵산 분자는 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조된 각 리포플렉스를 형성하도록 제형화되었다. 이렇게 수득한 리포플렉스를 HeLa 세포에서 시험하였고, 상이한 양의 상기 siRNA 분자 및 리포플렉스를 각각 형질감염시키고 또 형질감염한지 48시간 후 단백질 용균물을 얻었다. 면역블럿은 본 명세서에 기재한 바와 같이 분석하고 결과를 도 5에 도시한다.

도 5로부터 알 수 있듯이, 포스페이트 변형은 siRNA 분자 및 이를 함유하는 리포플렉스의 효능에 아무런 영향을 갖지 않는다.

실시예 7: 세포외 매트릭스 상에서 HUVEC 생장에 대한 PKN3 기능의 상실

본 발명에 따른 분자를 사용하여 PKN3의 녹다운시 일부 생리학적 및 형태학적 변화가 있음을 더 보여주기 위하여, 세포외 매트릭스 생장 에세이를 이용하였다(Leenders et al., 2004).

더욱 자세하게는, HUVEC를 4개의 상이한 siRNA-PKN3 리포플렉스(개별적으로 또 별개로 PKN3(1), PKN3(3), PKN3(4) 및 PKN3(5)를 siRNA 분자로 함유하는)에 의해 형질감염시키고 또 대조용으로는 siRNA Luc-리포플렉스(20 nM)를 사용하였다. 세포는 형질감염된 후 첫 48시간 이내에 콘플루언시(confluency)에 도달하도록 생장시켰다. 48시간 후 세포를 트립신처리하고, 동일한 세포 수(110,000 세포)를 재플레이팅하고 또 24개 웰을 함유하는 마티겔 상에서 플레이팅하였다.

재 플레이팅한지 20시간에서 HUVEC 세포 생장에서의 변화를 모니터링하기 위하여 대표적인 현미경 사진을 찍었다. 결과를 도 6에 도시한다.

예상된 바와 같이, 강력한 siRNA PKN3 리포플렉스, 바람직하게는 PKN3 리포플렉스 및 PKN3(5) 리포플렉스의 경우에서, 생장의 현저한 억제가 관찰되었다.

실시예 8: 피하 s.c. PC -3 이종이식 종양 생장의 억제

PC3 세포의 피하 주사에 의하여 PC-3 이종이식 종양 모델을 생성하였다. 이렇게 하여 생성한 종양은 실시예 3에 기재한 바와 같이 리포플렉스에 의해 처리하였다. 이러한 리포플렉스에 함유된 siRNA 분자는 PKN3 (3)이었다. 기본적인 실험 디자인은 도 7A에 도시한다. 총 3개의 상이한 처리 그룹을 확립하며, 각 그룹은 6개 마우스로 구성된다. 제1 그룹은 수크로오스만으로 처리되고, 제2 그룹은 루시페라아제에 대하여 siRNA를 함유하는 리포플렉스(siRNALuc-리포플렉스)로 처리되며, 또 제3 그룹은 PKN3에 대해 특이적인 siRNA를 함유하는 리포플렉스(siRNA PKN3-리포플렉스)로 처리되었다.

*종양 세포 접종 후, 다양한 물질을 25 내지 35일 동안 투여하였다. 주사는 하루에 8번찍 정맥 주사로 실시하였다. siRNA 리포플렉스 투여량은 1.88 mg/kg siRNA 및 14.5 mg/kg 전체 지질 (Santel et al., 2006a; Santel et al., 2006b).

더불어, PKN3-23-v1 siRNA 분자도 PKN3(3)에 대조적으로 평가하였다. 각 기본적 실험 디자인은 도 16A에 도시하며, 종양 세포 접종 후 당야한 물질, 즉 수크로오스, PKN3(3) 및 PKN3-23-v1을 29일에서 시작해서 47일까지 투여하며, 이러한 투여는 10 x 정맥 주사를 이틀마다 실시하였다(12마리 마우스 그룹에서). siRNA 리포플렉스 투여는 2.8 mg/kg siRNA 및 21.7 mg/kg 전체 지질(Santel et al., 2006a, Santel et al., 2006b)이었다.

이러한 처리 계획의 결과는 PKN3(3)에 대해서는 도 7B 및 도 7C에 도시하고 또 PKN3(3)과 대조적으로 PKN3-23-v1 siRNA 분자에 대해서는 도 16B 내지 도 16D에 도시한다.

도 7B로부터 알 수 있는 바와 같이, 확립된 PC-3 이종이식의 생장은 나타낸 바와 같이 처리된 siRNA Luc-리포플렉스(삼각형)와 대조적으로, siRNA PKN3 리포플렉스(다이아몬드)(표준 투여량 1.88 mg/kg/일 siRNA; 14.5 mg/kg/일 지질; 화살표) 에 의해 또는 등장 수크로오스(진한 구형)에 의해 억제되었다. 체중의 변화는 도 7B에 도시한 바와 같이 처리하는 동안 모니터링하였다. 개별 데이터는 매일 종양 부피 s.e.m의 평균을 나타낸다. 다양한 리포플렉스의 투여시 오직 적은 체중 감소만이 관찰될 수 있음은 동물 건강에 대한 리포플렉스의 지질 성분의 효과가 최소임을 확인시켜 준다.

도 16B, 16C 및 16D로부터 알 수 있는 바와 같이, 시험한 siRNA 분자, 즉 PKN3(3), 즉 "19mer" 및 PKN3-23-v1, 즉 "23mer"는 전립선 종양 부피에서 감소(도 16B), 림프절 전이 부피의 감소(도 16C) 및 림프절 전이 확산(도 16D)에서 감소로 표시된 바와 같이 전립선 종양 모델에서 동일 효능을 나타낸다.

실시예 9: 피하 PC -3 이종이식 종양 생장의 억제: 상이한 리포플렉스 투여량의 효능

피하 PC-3 이종이식 종양 생장의 억제에 대한 상이한 리포플렉스의 효능을 조사하기 위하여 이하의 실험을 실시하였다. 더욱 자세하게는, siRNA PKN3(3) 리포플렉스를 사용하였다. 리포플렉스는 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조하였다. 실험 디자인은 도 8A로부터 취할 수 있다. 처리 그룹은 6마리 마우스로 구성되며, 1개 동물 그룹은 음성 대조군으로서 수크로오스만 처리되는 반면에, 다른 그룹은 siRNA-리포플렉스, 더욱 자세하게는 siRNA PKN3(3) 리포플렉스로 처리되었다. 피하 종양 세포 접종 후 동물에게 하루에 11번씩 22일 내지 38일 동안 정맥 주사를 투여하고 67일 후 생존을 평가하였다.

siRNA 리포플렉스 제형의 형성은 다음과 같았다: 1.88 mg/kg siRNA + 14.5 mg/kg atuFect0/1% PEG.

상이한 리포플렉스 투여량은 다음과 같았다:

- 0.94 mg/kg siRNA 매일 투여 22-32일간

- 1.88 mg/kg siRNA 매일 투여 22-32일간

- 1.88 mg/kg siRNA 1일 2회 50% 투여량으로 22-28일간

- 1.88 mg/kg siRNA 이틀에 한번 투여, 22-38일간

결과를 도 8B에 도시한다. 도 8B로부터 알 수 있는 바와 같이, 1.88 mg/kg 매일 투여는 종양 부피의 현저한 감소를 초래하였고, 리포플렉스 제형에 대해서는 체중은 약간 변하였고 또 아무런 음성 효과가 관찰되지 않았다.

실시예 10: 피하 PC -3 이종이식 종양 생장의 억제: 상이한 처방의 효능

실험 디자인은 실시예 8에 기재된 바와 같았다.

결과를 도 8C에 도시한다. 더욱 자세하게는 도 8C로부터 알 수 있는 바와 같이 이 실시예에서 조사된 처리 계획의 효과는 종양 부피의 효능 면에서 다르지 않았다. 그러나, 매일 2회, 매일 1회 및 이틀에 1회 투여하는 것으로 구성된 처리 계획은 동일 종양 생장 억제를 나타내었는데, 이는 이틀마다 PKN3-siRNA 리포플렉스를 투여하는 것만으로 치료 효과를 유지하기에 충분함을 의미한다. 1일 2회 처리는 현저한 체중 감소를 나타내었는데, 이는 부가적인 치료 이점없이 투여를 제한함을 의미한다(Santel et al., 2006a).

실시예 11: 그자리 ( orthotopic ) 이종이식 종양 모델에서 siRNA PKN3 (3) 리포플렉스에 의한 마우스의 전신 처리

이 실험은 그자리 이종이식 종양 모델에서 종양 생장에 대한 siRNA PKN3 리포플렉스, 더욱 자세하게는 siRNA-PKN3 (3) 리포플렉스에 의한 마우스 전신 처리의 효과를 연구하기 위하여 실시하였다(실험의 상세한 경우는 Santel et al., 2006a) 참조).

그자리 PC-3 전립선 종양 및 림프절 전이 모델에서 siRNA-PKN3 (3) 리포플렉스 처리의 효능을 분석하기 위한 실험 디자인은 도 9A에 도시되어 있다. 각각 9 마리 마우스로 구성된 총 4개 처리 그룹을 정의하며, 즉 그룹은 수크로오스, siRNA Luc-리포플렉스, siRNA-PKN3-리포플렉스 및 siRNA Tie2-리포플렉스로 처리되었다. 전립선내(intraprostatic) 종양 세포접종 후 1.88 mg/kg siRNA 및 14.5 mg/kg atuFect01/1%PEG로 구성된 siRNA 리포플렉스 투여량을 35 내지 49일 동안 이틀 마다 8회 정맥 주사로 주사하였다. 35일에 예비처리 대조를 실시하였다.

이 실험으로부터, 수크로오스 또는 루시페라아제 특이적 siRNA 분자(siRNALuc), 더욱 특히 도 9B에 도시한 바와 같이(전립선 종양의 부피크기 및 림프절 전이의 부피)로 처리한 그룹과 대조적으로, 지시된 siRNA 리포플렉스로 처리된 후 마우스에서 전립선 PC-3 종양 및 림프절 전이 부피의 감소가 관찰되었다.

처리 개시 전에 전립선 전이 부피는 좌측에 나타내어져 있다(35일, 대조용). 통계학적 유의성은 아스테리크로 표시한다. 도면으로부터 알 수 있는 바와 같이, PKN3 특이적 siRNA 분자, 더욱 자세하게는 이를 함유하는 리포플렉스는 전립선 종양의 부피 및 림프절 전이 부피를 감소시키는데 아주 효과적이었다.

PKN-3-siRNA 리포플렉스의 정맥 투여에 의한 체내 RNA 간섭을 나타내기 위하여, 폐 조직에서 mRNA 녹다운을 분석하였다. 더욱 자세하게는, 정량적 TaqMan 역전사-중합효소 사슬 반응에 의해 분명한 바와 같이, 상응하는 siRNA 리포플렉스로 처리된 마우스로부터 얻은 폐 조직에서 PKN-3 및 Tie2 mRNA 수준의 감소는 도 9C에 도시한다. CD34 mRNA에 정규화된 폐에서 Tie2 또는 PKN3 mRNA 수준의 상대적 평균 양은 생체내에서 생체내 리포플렉스 매개된 간섭을 나타내도록 도시된다. 대조용 TIE-2 수용체 특이적 siRNA 리포플렉스를 마찬가지로 시험하며, 그에 의해 표적 특이적 mRNA 감소(도 9, 오른쪽 패널)를 나타내지만 음성적 루시페라아제 특이적 siRNA-리포플렉스와 비교할 때 림프절 전이 형성 또는 종양 생장의 현저한 억제를 나타내지 않는다. 이들 데이터는 PKN3-siRNA-리포플렉스에 의한 표적 유전자 특이적 치료 효과를 나타낸다.

실시예 12: 그자리 이종이식 종양 모델에서 siRNA - PKN3 - 리포플렉스를 사용한 마우스의 전신 처리: 처리 계획의 효과

이 실험은 siRNA-PKN3-리포플렉스, 더욱 특히 siRNA-PKN3(3) 리포플렉스를 사용한 전신 처리와 관련한 상이한 시험 계획을 시험하기 위하여 그자리 이종이식 종양 모델에서 실시하였다.

실험 셋업은 도 10A에 도시한다. 9마리 마우스로 구성된 2개 그룹이 있으며, 마우스는 수크로오스 또는 siRNA PKN3 리포플렉스 투여되었다. 전립선내 종양 세포 접종 후, 35일 내지 53일에 이틀 간격 또는 사흘 간격으로 10/7 x i.v 주사를 실시하였다. 2개의 상이한 siRNA 리포플렉스 투여량을 다음과 같이 이용하였다: 1.88/2.8 mg/kg siRNA 14.5/21.7 mg/kg atuFect01/1%PEG, 즉 14.5/21.7 mg/kg 전체 지질.

결과를 전립선 종양 부피(도 10B) 및 림프절 전이 부피(도 10C)로서 도시하였다. 양쪽 변수 종양 부피 및 LN 전이 형성의 경우 억제가 관찰되었지만, 사흘 간격으로 처리되는 그룹과 비교할 때 이틀 간격으로 처리되는 그룹에서 현저한 효능의 증가는 보이지 않았다. 그러나 더 높은 매일 투여량(2.8 mg/kg siRNA)의 경우 더욱 현저한 전이 형성의 억제가 관찰된다. 이들 데이터는 siRNA 매개된 억제는 매일 정맥 투여에 한정되지 않고 또 그 치료 효과는 이틀 간격으로 치료한 경우에도 달성될 수 있음을 나타낸다.

실시예 13: 그자리 이종이식 종양 모델에서 siRNA - PKN3 (3)- 리포플렉스의 전신 처리: 상이한 투여량의 영향

이 실험은 그자리 이종이식 종양 모델에서 리포플렉스, 더욱 자세하게는 siRNA-PKN3(3) 리포플렉스(도 11) 및 siRNA-PKN3-23-v1 (도 17)를 사용하여 마우스를 전신 처리하는 것과 관련하여 siRNA-PKN3 리포플렉스의 상이한 투여량을 시험하기 위하여 실시하였다.

이 실험 셋업은 도 11A에 도시되어 있다. 10마리 마우스로 구성된 3개 처리 그룹이 존재하며, 마우스들은 수크로오스, siRNA-PKN3 리포플렉스 또는 리포플렉스 만을 투여하였다. 전립선내 종양 세포 접종 후, 28일 내지 46일 까지 이틀 간격으로 10 x i.v. 주사를 투여하였다. siRNA 리포플렉스 투여량은 다음과 같았다: 0.7/1.4/2.8 mg/kg siRNA; 5.4/10.9/21.7 mg/kg의 전체 지질(리포플렉스에서, 3개 모두: atuFect01/헬퍼지질/1%PEG). 3개 투여량 범위는 이틀간격으로 정맥 주사로 투여하였다.

결과를 전립선 종양의 부피(도 11B) 및 림프절 전이의 부피(도 11C)로서 도시한다. 양쪽 경우에서, 2.8 mg 또는 1.4 mg siRNA/kg 의 투여량으로 매일 투여하는 경우에 현저한 억제가 관찰되며, 이것은 이들 siRNA 분자에 대한 치료 윈도우를 나타낸다.

PKN3(3) 보다는 siRNA 종으로서 PKN3-23-v1을 포함하는 siRNA PKN3 리포플렉스의 경우에서는, 수크로오스, siRNA-PKN3 리포플렉스 또는 리포플렉스만을 투여한 7 내지 8마리 마우스로 구성된 상이한 3개 처리 그룹이 있다. 전립선내 종양 세포 접종후, 7 내지 63일로 4일 간격으로 15 x i.v. 주사를 하였다. siRNA 리포플렉스 투여량은 1.4 mg/kg siRNA (10.9 mg 전체 지질/kg) 및 0.7 mg/kg siRNA (5.4 mg 전체 지질/kg)이었다.

결과는 전립선 종양 부피(도 17B) 및 림프절 전이의 부피(도 17C)로서 도시한다. 양쪽 경우에서, 1.4 mg/kg 및 0.7 mg/kg siRNA의 투여량의 경우에서 현저한 억제가 관찰되었으며, 이는 이들 siRNA 분자 투여량에 대한 치료 윈도우를 나타낸다.

또한, 마우스 포스트 세포 챌린지의 체중을 기록하고 도 17B에 도시한다. 이 도면으로부터, 이러한 처방은 마우스의 체중을 감소시키지 않으며, 체중과 관련된 전체적 독성 효과가 없음을 의미하며, 일반적으로 동물 건강의 지표이다.

참고문헌

종래 기술의 다양한 문헌을 지칭하는 정도에 있어서, 자세한 서지적 데이터가 다음과 같은 문헌은 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다:

본 명세서, 청구범위, 서열목록 및/또는 도면에 기재된 본 발명의 특징은 모두 개별적으로 또는 조합되어 다양한 형태로 본 발명을 실현하기 위한 재료일 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Atugen AG <120> Means for inhibiting the expression of protein kinase 3 <130> A 19032 EP <160> 57 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 3385 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mRNA <222> (1)..(3385) <223> Protein kinae 3 <400> 1 ggctcccgcg ggcgcgcggc ggggaaggcc agaggacctg ggcgcgggcg atgtgcctcc 60 tgagcgtcca aaccgggggt gaggcgcggt cacgcccagc gggaaccgca ggcgccgaag 120 cccgggtact gggcccagaa tcccgcggaa ttttggatcc gagggaggcg ctggggcgcg 180 ggacctcggg cgtggggtcc cgggcgctgg atcggcgcgg acgggaggcg gcgctggtcc 240 cgcgggccag cgggtctcgg gagggggcgc ccgatcccgc gtctccggcg ccgcttcccg 300 ggaagtttca agtttgaaag tcctggcgga gggtctgcgg cttccgggac cggagtggct 360 gagaggaggg ccccaagcgg ccggagcggc gccatggagg agggggcgcc gcggcagcct 420 gggccgagcc agtggccccc agaggatgag aaggaggtga tccgccgggc catccagaaa 480 gagctgaaga tcaaggaggg ggtggagaac ctgcggcgcg tggccacaga ccgccgccac 540 ttgggccatg tgcagcagct gctgcggtcc tccaaccgcc gcctggagca gctgcatggc 600 gagctgcggg agctgcacgc ccgaatcctg 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Claims

이중가닥 구조를 포함하는 핵산 분자로서,
상기 이중가닥 구조는 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하고,
상기 제1 가닥은 인접하는(contiguous) 뉴클레오티드의 제1 스트레치(stretch)를 포함하고 또 상기 제1 스트레치는 표적 핵산에 적어도 부분적으로 상보적이며, 또
상기 제2 가닥은 인접하는 뉴클레오티드의 제2 스트레치를 포함하고 또 상기 제2 스트레치는 제1 스트레치와 적어도 부분적으로 상보적이며,
상기 제1 스트레치는 서열번호 1 (NM_013355)에 따른 핵산서열의 뉴클레오티드 코어 서열 또는 그의 일부에 적어도 부분적으로 상보적인 핵산 서열을 포함하고,
상기 뉴클레오티드 코어 서열은 다음 뉴클레오티드 서열
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 482 내지 500 (서열번호 2)
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 1555 내지 1573 (서열번호 4);
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 1556 내지 1574 (서열번호 6);
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 1559 내지 1577 (서열번호 8);
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 1566 내지 1584 (서열번호 10);
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 2094 내지 2112 (서열번호 12);
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 2102 내지 2120 (서열번호 14);
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 2286 내지 2304 (서열번호 16);
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 2761 내지 2779 (서열번호 18);
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 2763 내지 2781 (서열번호 20);
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 2764 내지 2782 (서열번호 22);
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 2843 내지 2861 (서열번호 24);
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 2844 내지 2862 (서열번호 26); 또는
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 2846 내지 2864 (서열번호 28)을 포함하고,
바람직하게는 상기 뉴클레오티드 코어 서열은 다음 뉴클레오티드 서열
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 1555 내지 1573 (서열번호 4);
뉴클레오티드 위치 1556 내지 1574 (서열번호 6);
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 1559 내지 1577 (서열번호 8);
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 1566 내지 1584 (서열번호 10);
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 2094 내지 2112 (서열번호 12); 또는
서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 2286 내지 2304 (서열번호 16)을 포함하며,
바람직하게는 상기 제1 스트레치는 부가적으로 뉴클레오티드 코어 서열의 5' 말단 앞의 영역 및/또는 뉴클레오티드 코어 서열의 3' 말단 이후의 영역에 적어도 부분적으로 상보적인 핵산 분자.
제 1항에 있어서, 제1 스트레치는 뉴클레오티드 코어 서열 또는 그의 일부에 상보적인 핵산.
제 1항 또는 제2항에 있어서, 제1 스트레치는 뉴클레오티드 코어 서열의 3' 말단 이후의 영역 및/또는 뉴클레오티드 코어 서열의 5' 말단 이전의 영역에 또한 상보적인 핵산.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 스트레치는 18 내지 29개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 19 내지 25개의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 19 내지 23개의 뉴클레오티드의 표적 핵산에 상보적인 핵산.
제 4항에 있어서, 상기 뉴클레오티드는 연속적 뉴클레오티드인 핵산.
제 1항에 있어서, 상기 제1 스트레치 및/또는 상기 제2 스트레치는 18 내지 29 개의 연속적 뉴클레오티드, 바람직하게는 19 내지 25개의 연속적 뉴클레오티드 및 더욱 바람직하게는 19 내지 23개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는 핵산.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 가닥은 제1 스트레치로 구성되고 또 상기 제2 가닥은 제2 스트레치로 구성되는 핵산.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
핵산 분자, 바람직하게는 이중가닥 구조를 포함하는 핵산 분자로서,
상기 이중가닥 구조는 제1 가닥 및 제2 가닥에 의해 형성되며, 상기 제1 가닥은 인접하는 뉴클레오티드의 제1 스트레치를 포함하고 또 상기 제2 가닥은 인접하는 뉴클레오티드의 제2 스트레치를 포함하며 또 상기 제1 스트레치는 상기 제2 스트레치에 적어도 부분적으로 상보적이며,
- 상기 제1 스트레치는 서열번호 3에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 2에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되며;
- 상기 제1 스트레치는 서열번호 5에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 4에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고;
- 상기 제1 스트레치는 서열번호 7에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 6에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되며;
- 상기 제1 스트레치는 서열번호 9에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 8에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고;
- 상기 제1 스트레치는 서열번호 11에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 10에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되며;
- 상기 제1 스트레치는 서열번호 13에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 12에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고;
- 상기 제1 스트레치는 서열번호 15에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 14에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되며;
- 상기 제1 스트레치는 서열번호 17에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 16에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고;
- 상기 제1 스트레치는 서열번호 19에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 18에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되며;
- 상기 제1 스트레치는 서열번호 21에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 20에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고;
- 상기 제1 스트레치는 서열번호 23에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 22에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되며;
- 상기 제1 스트레치는 서열번호 25에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 24에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고;
- 상기 제1 스트레치는 서열번호 27에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 26에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되며; 또는
- 상기 제1 스트레치는 서열번호 29에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 28에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고;
- 상기 제1 스트레치는 서열번호 31에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 30에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되며;
- 상기 제1 스트레치는 서열번호 33에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 32에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고;
- 상기 제1 스트레치는 서열번호 35에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 34에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되며;
- 상기 제1 스트레치는 서열번호 37에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 36에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고;
- 상기 제1 스트레치는 서열번호 39에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 38에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되며;
바람직하게는,
- 상기 제1 스트레치는 서열번호 5에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 4에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고;
- 상기 제1 스트레치는 서열번호 7에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 6에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되며;
- 상기 제1 스트레치는 서열번호 9에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 8에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고;
- 상기 제1 스트레치는 서열번호 11에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 10에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되며;
- 상기 제1 스트레치는 서열번호 13에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 12에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고;
- 상기 제1 스트레치는 서열번호 17에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 16에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되며; 또는
- 상기 제1 스트레치는 서열번호 31에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되고 또 상기 제2 스트레치는 서열번호 30에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되는 핵산 분자.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 스트레치 및/또는 상기 제2 스트레치는 2' 위치에서 변형을 갖는 복수의 변형 뉴클레오티드 그룹을 포함함으로써 규칙적인, 바람직하게는 교대되는 위치 패턴을 형성하며, 상기 스트레치 내에서 각 그룹의 변형 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 측면 그룹 한면 또는 양쪽에서 측면배치하며, 뉴클레오티드의 인접기를 형성하는 인접 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드의 변형과는 상이한 변형을 갖는 뉴클레오티드인 핵산 분자.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 스트레치 및/또는 상기 제2 스트레치는 변형된 뉴클레오티드 그룹의 패턴 및/또는 뉴클레오티드의 인접기의 패턴을 포함하는 핵산.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 바람직하게는 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 스트레치 및/또는 상기 제2 스트레치는 3' 말단에서 디뉴클레오티드를 포함하며, 이러한 디뉴클레오티드는 바람직하게는 TT인 핵산.
제 11항에 있어서, 상기 제1 스트레치 및/또는 상기 제2 스트레치의 길이는 19 내지 21개 뉴클레오티드로 구성되는 핵산.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 바람직하게는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및/또는 상기 제2 스트레치는 3' 말단에서 1 내지 5개 뉴클레오티드의 오버헹(overhang)을 포함하는 핵산.
제 13항에 있어서, 이중가닥 구조의 길이는 약 16 내지 24개 뉴클레오티드 쌍, 바람직하게는 20 내지 22개 뉴클레오티드 쌍인 핵산.
제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 가닥 및 상기 제2 가닥은 서로에 대하여 공유결합되며, 바람직하게는 제1 가닥의 3' 말단이 제2 가닥의 5' 말단에 공유결합되는 핵산.
제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분자는 하기 2개 가닥으로 구성되며 밑줄친 뉴클레오티드는 2'-O-메틸인 핵산:

바람직하게는
제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하는 리포좀 제형.
제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따른 핵산 및 리포좀을 포함하는 리포플렉스.
제 18항에 있어서, 상기 리포좀은
a) 약 50몰%의 β-아르기닐-2,3-디아미노프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드, 바람직하게는 (β-L-아르기닐)-2,3-L-디아미노프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리-히드로클로라이드);
b) 약 48 내지 49 몰%의 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPhyPE); 및
c) 약 1 내지 2 몰%의 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리에틸렌-글리콜, 바람직하게는 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 나트륨염으로 구성되는 리포플렉스.
제 19항에 있어서, 상기 리포플렉스의 제타-포텐셜은 약 3540 내지 6055 mV, 바람직하게는 약 45 내지 50 mV인 리포플렉스.
제 19항 또는 제 20항에 있어서, 상기 리포플렉스의 크기는 QELS에 의해 측정된 바와 같이 약 50 내지 400 nm, 바람직하게는 약 100 내지 140 nm, 더욱 바람직하게는 약 110 nm 내지 약 130 nm인 리포플렉스.
제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하거나 코딩하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터.
전술한 청구항에 따른 핵산 또는 전술한 청구항에 따른 벡터를 포함하는 세포.
제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따른 핵산, 제 17항에 따른 리포좀 제형, 제 18항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 따른 리포플렉스, 제 22항에 따른 벡터 및/또는 제23항에 따른 세포를 포함하는 조성물, 바람직하게는 약학적 조성물.
제 24항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 경우에 따라 더 포함하는 약학적 조성물인 조성물.
제 25항에 있어서, 상기 조성물은 약학적 조성물이고 또 상기 약학적 조성물은 혈관신생 의존적 질병, 바람직하게는 불충분한, 비정상적 또는 과도한 혈관신생을 특징으로 하거나 그에 의해 유발되는 질병을 치료하기 위한 것인 조성물.
제 26항에 있어서, 혈관신생은 지방조직, 피부, 심장, 눈, 폐, 장, 생식기관, 뼈 및 관절의 혈관신생인 약학적 조성물.
제 26항 또는 제 27항에 있어서, 상기 질병은 전염병, 자가면역 질병, 혈관 기형, 죽상동맥경화증, 이식 동맥병증, 비만, 건선, 사마귀, 알레르기성 피부염, 일차유리체증식증, 당뇨망막병증, 미숙아 망막병증, 노화 관련 황반 질병, 맥락막 혈관신생, 일차 폐 고혈압, 천식, 코의 폴립, 염증성 장 및 치주 질환, 복수, 복막 접합, 자궁내막증, 자궁 출혈, 난소 낭종, 난소 과다자극, 관절염, 윤활막염, 골수염, 골증식체 형성을 포함하는 군으로부터 선택되는 약학적 조성물.
제 25항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 바람직하게는 제 25항에 있어서, 종양 질병, 바람직하게는 암 질병, 더욱 바람직하게는 고형암 치료용의 약학적 조성물.
제 25항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 바람직하게는 제 29항에 있어서, 골암, 유방암, 전립선암, 소화계의 암, 직장결장암, 간암, 폐암, 신장암, 비뇨생식기 암, 췌장암, 뇌하수체 암, 고환암, 안와암, 머리 및 목 암, 중앙신경계의 암 및 호흡기계의 암을 포함하는 군으로부터 선택된 질병 치료용의 약학적 조성물.
약물 제조를 위한 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따른 핵산, 제 17항에 따른 리포좀 제형, 제 18항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 따른 리포플렉스, 제 22항에 따른 벡터 및/또는 제23항에 따른 세포의 용도.
제 31항에 있어서, 상기 약물은 제 26항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 질병을 치료하기 위한 용도.
제 32항에 있어서, 약물은 1 또는 몇 개의 다른 요법과 조합되어 사용되는 용도.
제 33항에 있어서, 상기 요법은 화학요법, 냉동요법, 온열요법, 항체 요법, 방사선요법 및 항혈관신생요법을 포함하는 군으로부터 선택되는 용도.
제 34항에 있어서, 상기 요법은 항체 요법이고, 더욱 바람직하게는 항-VEGF 항체 또는 항-안기오포에틴 항체를 사용한 항체 요법인 용도.
제 34항에 있어서, 상기 항혈관신생 요법은 키나아제 수용체 억제제, 바람직하게는 티로신 키나아제 수용체 억제제를 사용하며, 이러한 수용체는 VEGF 수용체, PDGF 수용체, Tie-2, FGFR 및 EGFR을 포함하는 군으로부터 선택되는 용도.
제 36항에 있어서, 상기 억제제는 siRNA, 안티센스 분자, 아프타머(aptamer), 스피겔머(spiegelmer), 고친화성 결합 펩티드, 펩티드 아프타머 및 항체를 포함하는 군으로부터 선택되는 용도.