KR20140085917A - Method of produciton for 3-hydroxypropionic aicd by using glycerol and glucose - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 미생물 배양을 통한 3-히드록시프로피온산(3-Hydroxypropionic acid)의 생산방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 포도당 및 글리세롤을 사용하여 3-히드록시프로피온산의 생산성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for producing 3-hydroxypropionic acid through microbial culture, and more particularly, to a method for increasing the productivity of 3-hydroxypropionic acid using glucose and glycerol.
최근 석유 기반 산업의 확장에 따른 지구 온난화 문제와 석유 가격의 심한 변동 및 상승 등으로 인한 석유 기반 산업의 문제점들이 논의되기 시작하였고, 이에 바이오를 기반으로 한 화학, 에너지 산업이 주목을 받게 되었다. 바이오 연료의 하나인 바이오 디젤은 식물성 기름이나 동물성 지방으로부터 트리글리세리드의 에스테르 교환반응에 의하여 생산되고 있다. 바이오 디젤의 대량생산으로 인하여 부산물인 글리세롤의 생산이 급증하게 되었고, 대량으로 생산되는 글리세롤은 가격이 낮아지는 추세에 있다. 앞으로 바이오 디젤의 시장 수요가 증가하여 시장이 커질수록 부산물인 글리세롤의 생산량은 급격하게 증가할 것이며 글리세롤의 가격도 현재보다 더욱 낮아질 것으로 예측된다. 글리세롤은 유지, 섬유, 피혁의 대전 방지제, 세제용 유화제의 원료로 사용될 수 있으며, 뿐만 아니라 미생물의 탄소원으로 사용가능하여 이를 활용하여 미생물 기반으로 다양한 케미칼을 만들 수 있다.Recently, the problems of global warming caused by the expansion of petroleum - based industries and the problems of petroleum - based industry due to the fluctuation and rise of oil prices have begun to be discussed, and the bio - based chemical and energy industries have been attracting attention. Biodiesel, one of the biofuels, is produced by transesterification of triglycerides from vegetable oils and animal fats. The production of glycerol, a by-product, has increased rapidly due to the mass production of biodiesel, and the price of glycerol, which is produced in large quantities, is being lowered. As the market demand for biodiesel increases, the production of glycerol as a by-product will increase sharply and the price of glycerol will be lower than the present. Glycerol can be used as a raw material for preservatives, antistatic agents for textiles, leather, detergents, and as a carbon source for microorganisms, making it possible to produce various chemicals based on microorganisms.
그 중 3-히드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid; 3-HP)은 젖산, 숙신산과 더불어 다양한 케미칼의 원료로 사용될 수 있는 유망 플랫폼 화학원료 중의 하나로, 글리세롤을 기반으로 미생물 발효에 의해 생산될 수 있다. 3-히드록시프로피온산은 광학적으로 활성이 있는 물질의 합성을 위해 중요한 역할을 하는 2개의 작용기를 가지고 있는데, 이는 화학산업에서 3-히드록시프로피온산이 중요한 전구체로 각광을 받게 하는 요소이다. 3-히드록시프로피온산을 전구체로 하여 합성되는 핵심 화합물로는 아크릴산 (acrylic acid, MW 72.06), 말론산 (malonic acid, MW 104.06), 1,3-프로판디올(1,3-propanediol, MW 76.06) 등이 있다.Among them, 3-hydroxypropionic acid (3-HP) is one of promising platform chemical raw materials that can be used as a raw material of various chemicals in addition to lactic acid and succinic acid, and can be produced by microbial fermentation based on glycerol . 3-Hydroxypropionic acid has two functional groups that play an important role in the synthesis of optically active substances, which is the element that makes 3-hydroxypropionic acid an important precursor in the chemical industry. The core compounds synthesized using 3-hydroxypropionic acid as a precursor include acrylic acid (MW 72.06), malonic acid (MW 104.06), 1,3-propanediol (MW 76.06) .
생물학적으로 두 종의 효소가 촉매하는 탈수 및 산화 공정을 통하여 글리세롤로부터 3-히드록시프로피온산을 생산할 수 있다. 첫 번째 효소인 글리세롤 데하이드라타제(Glycerol dehydratase)로 글리세롤을 탈수반응시켜 3-히드록시프로피온알데히드(3-Hydroxypropionaldehyde; 3-HPA)로 전환하고, 두 번째 효소인 3-히드록시프로피온알데히드 데하이드로게나아제(3-HPA dehydrogenase)로 3-HPA를 산화시켜 3-히드록시프로피온산을 생성하게 된다.Hydroxypropionic acid can be produced from glycerol through dehydration and oxidation processes catalyzed by biologically two enzymes. The glycerol was dehydrated and converted to 3-hydroxypropionaldehyde (3-HPA) with the first enzyme, Glycerol dehydratase, and the second enzyme, 3-hydroxypropionaldehyde dehydro 3-HPA is oxidized with 3-HPA dehydrogenase to produce 3-hydroxypropionic acid.
위에서 언급된 생물학적 반응을 이용하여 3-히드록시프로피온산을 생산할 때 글리세롤을 탄소원으로 주로 이용하게 된다. 글리세롤을 탄소원으로 이용할 경우 글리세롤 데하이드라타제와 3-히드록시프로피온알데히드 두 가지 효소가 관여하는 비교적 간단한 반응을 통해 3-히드록시프로피온산을 생산할 수 있기 때문이다. 그러나 글리세롤을 탄소원으로 사용하게 될 경우 대부분의 미생물의 대사속도가 감소되는 현상을 보이고, 이는 생산성의 감소로 직결된다. 따라서, 생물공학적인 방법을 이용하여 물질을 생산할 때 생산성은 생산원가를 결정하는 중요한 요소로서 3-히드록시프로피온산의 생산성을 증가시킬 수 있는 방법이 요구된다.Glycerol is mainly used as a carbon source when 3-hydroxypropionic acid is produced using the above-mentioned biological reaction. When glycerol is used as a carbon source, 3-hydroxypropionic acid can be produced through a relatively simple reaction involving glycerol dehydratase and 3-hydroxypropionaldehyde. However, when glycerol is used as a carbon source, the metabolic rate of most microorganisms is reduced, which leads to a decrease in productivity. Therefore, when producing a substance using a biotechnological method, productivity is an important factor for determining the production cost, and a method for increasing the productivity of 3-hydroxypropionic acid is required.
3-히드록시프로피온산 생물학적 제조공정에 있어 글리세롤을 단독으로 탄소원으로 사용할 경우 3-히드록시프로피온산의 생산에는 적합하나 트리카르복실산 사이클(tricarboxylic acid cycle, TCA cycle)을 통해 생성되는 에너지의 양이 포도당에 비해 적다. 이러한 이유로 균체내의 전반적인 대사능이 떨어지게 되고 균체수의 확보가 어렵게 된다. 3-Hydroxypropionic acid When glycerol is used alone as a carbon source in the biological production process, it is suitable for the production of 3-hydroxypropionic acid, but the amount of energy generated through the tricarboxylic acid cycle (TCA cycle) . For this reason, the overall metabolic ability in the cells is lowered, and it becomes difficult to secure the number of cells.
3-히드록시프로피온산을 효율적으로 생산하고 위하여, 한국공개특허 10-2012-0108358호는 말로닉세미알데히드의 환원경로를 이용한 새로운 합성 경로를 설계하였고, 한국공개특허 10-2011-0129070은 코엔자임 B12 생성능력을 갖는 재조합 미생물을 사용하였고, 한국공개특허 10-2012-0041826호는 비타민 B12 생성능력을 갖는 재조합 미생물을 사용하였을 뿐, 현재까지 하이드로피온산의 생산 효율을 증가시키지 위한 최적의 배양방법에 대한 기술은 알려진 바 없다.
In order to efficiently produce 3-hydroxypropionic acid, Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-2012-0108358 has designed a novel synthesis route using a reducing pathway of malonic semialdehyde, Korean Patent Publication No. 10-2011-0129070 discloses a coenzyme B 12 And Korean Patent Laid-Open No. 10-2012-0041826 uses only a recombinant microorganism having the ability to produce vitamin B 12 , and up to now, an optimum culture method for increasing the production efficiency of hydrofluoric acid Is not known.
본 발명의 목적은 3-히드록시프로피온산의 농도 및 생산성이 향상된 3-히드록시프로피온산의 제조방법을 제공하고자 한다.
It is an object of the present invention to provide a process for producing 3-hydroxypropionic acid in which the concentration and productivity of 3-hydroxypropionic acid are improved.
상기 목적의 달성하기 위하여 본 발명은 글리세롤로부터 3-히드록시프로피온산을 합성하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 3-히드록시프로피온산의 생산방법에 있어서, 상기 배양은 포도당 대 글리세롤의 배양 초기 함량이 1:2 내지 1:16의 중량비로 함유된 배양배지에서 수행되는 것을 특징으로 하는 3-히드록시프로피온산의 생산방법을 제공한다.In order to accomplish the above object, the present invention provides a method for producing 3-hydroxypropionic acid, which comprises culturing a microorganism synthesizing 3-hydroxypropionic acid from glycerol, wherein the culture has an initial culture amount of glucose to glycerol of 1 : ≪ / RTI > 2 to 1: 16 in a weight ratio of 3: 1 to 1: 16.
본 발명의 실시예에 따르면, 배양 초기에 상기 포도당은 5 g/ℓ 내지 40 g/ℓ로 포함되고, 상기 글리세롤은 40 g/ℓ 내지 120 g/ℓ로 포함되는 것을 특징으로 한다.According to an embodiment of the present invention, the glucose is contained at 5 g / L to 40 g / L at the initial stage of culture, and the glycerol is contained at 40 g / L to 120 g / L.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 배양배지에 글리세롤을 포함하는 피딩용액을 공급하는 것을 특징으로 한다. According to an embodiment of the present invention, a feeding solution containing glycerol is supplied to the culture medium.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 글리세롤을 포함하는 피딩 용액을 공급하여 배양배지 내의 글리세롤 함량을 20 g/ℓ 내지 60 g/ℓ로 유지하는 것을 특징으로 한다.According to an embodiment of the present invention, the feeding solution containing the glycerol is fed to maintain the glycerol content in the culture medium at 20 g / l to 60 g / l.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 피딩용액의 글리세롤 함량은 상기 초기 배양배지의 글리세롤 함량 대비 1 내지 10배인 것을 특징으로 한다. According to an embodiment of the present invention, the glycerol content of the feeding solution is 1 to 10 times the glycerol content of the initial culture medium.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 피딩용액은 포도당을 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다. According to an embodiment of the present invention, the feeding solution further comprises glucose.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 피딩용액의 포도당 함량은 상기 피딩용액의 글리세롤 함량 대비 0.001 내지 1인 것을 특징으로 한다.
According to an embodiment of the present invention, the glucose content of the feeding solution is 0.001 to 1 relative to the glycerol content of the feeding solution.
본 발명에 따른 특정한 조성의 글리세롤 및 포도당을 함유하는 배지에서 미생물을 배양하여 3-히드록시프로피온산을 생산할 경우, 글리세롤을 단독으로 탄소원으로 사용한 생산방법에 비해 3-히드록시프로피온산의 생산성 및 농도를 향상시킬 수 있으며, 생산을 위한 배양 시간을 단축할 수 있다. When 3-hydroxypropionic acid is produced by culturing microorganisms in a culture medium containing glycerol and glucose according to the present invention, the productivity and concentration of 3-hydroxypropionic acid are improved compared to the production method using glycerol alone as a carbon source And the incubation time for production can be shortened.
또한 배양과정에서 글리세롤 및 포도당을 비율을 조절하여 3-히드록시프로피온산을 보다 효율적으로 생산할 수 있다.
In addition, 3-hydroxypropionic acid can be produced more efficiently by controlling the ratio of glycerol and glucose in the culturing process.
도 1은 배양배지 내 포도당 및 글리세롤의 초기 함량에 따른 균체 성장을 측정한 결과이다.
도 2는 배양배지 내 포도당 및 글리세롤의 초기 함량에 따른 3-히드록시프로피온산 합성양을 측정한 결과이다.
도 3은 배양 중 첨가되는 피딩용액 내 포도당 함량에 따른 균체 성장을 측정한 결과이다.
도 4는 배양 중 첨가되는 피딩용액 내 포도당 함량에 따른 3-히드록시프로피온산 합성양을 측정한 결과이다.Figure 1 shows the result of measurement of cell growth according to the initial content of glucose and glycerol in the culture medium.
FIG. 2 shows the result of measuring the amount of 3-hydroxypropionic acid synthesized depending on the initial content of glucose and glycerol in the culture medium.
FIG. 3 shows the results of measurement of cell growth according to the glucose content in the feeding solution added during the culture.
FIG. 4 shows the results of measuring the amount of 3-hydroxypropionic acid synthesized depending on the glucose content in the feeding solution to be added during the culture.
상기 상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 글리세롤로부터 3-히드록시프로피온산을 합성하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 3-히드록시프로피온산의 방법에 있어서, 상기 미생물을 포도당 대 글리세롤의 초기 중량비율이 1:2 내지 1:16인 배양배지에서 배양하는 것을 특징으로 한다. 이하 첨부된 도면을 이용하여 본 발명의 구성을 더욱 상세하게 살펴보도록 한다.In order to accomplish the above object, the present invention provides a method for producing 3-hydroxypropionic acid, which comprises culturing a microorganism synthesizing 3-hydroxypropionic acid from glycerol, wherein the microorganism has an initial weight ratio of glucose to glycerol 1: 2 to 1:16. DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS The present invention will now be described in detail with reference to the accompanying drawings.
본 발명은 글리세롤로부터 3-히드록시프로피온산을 합성하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 3-히드록시프로피온산의 생산방법에 있어서, 상기 배양은 포도당 대 글리세롤의 배양 초기 함량이 1:2 내지 1:16의 중량비로 함유된 배양배지에서 수행되는 것을 특징으로 하는 3-히드록시프로피온산의 생산방법을 제공한다. The present invention relates to a process for the production of 3-hydroxypropionic acid comprising the step of culturing a microorganism synthesizing 3-hydroxypropionic acid from glycerol, wherein the culture comprises an initial culture of glucose to glycerol in an amount of 1: 2 to 1:16 In a weight ratio of 1: 1 to 1: 1, in a culture medium containing 3-hydroxypropionic acid.
3-히드록시프로피온산의 제조시 포도당과 글리세롤의 농도비를 조절하는 것이 필요한데, 이는 두 가지 탄소원이 서로 경쟁관계에 있어 각각의 탄소원이 배지 내에 존재하는 농도에 따라 미생물에 의해 이용되는 탄소원의 비율이 변화될 수 있기 때문이다. In the production of 3-hydroxypropionic acid, it is necessary to control the concentration ratio of glucose and glycerol, since the two carbon sources are in competition with each other, and the ratio of the carbon source used by the microorganism varies depending on the concentration of each carbon source in the medium It can be.
본 발명의 글리세롤로부터 3-히드록시프로피온산을 합성하는 미생물은 3-히드록시프로피온산 생산능력을 갖는 단리된 천연 미생물 또는 재조합 미생물이면 제한되지 않으며, 상기 미생물은 글리세롤 탈수효소(dehydratase), 알데히드 탈수소효소(dehydrogenase) 및 추가로 글리세롤 탈수효소 재활성화 인자 및 이들을 암호화하는 유전자를 포함한다. 따라서, 재조합미생물인 경우 글리세롤 탈수효소 및 알데히드 탈수소효소를 암호화하는 유전자로 구성된 재조합 벡터를 형질도입한 것일 수 있다. 또한 상기 재조합 벡터는 글리세롤 탈수효소 재활성인자를 암호화하는 유전자를 추가로 포함할 수 있다.The microorganism synthesizing 3-hydroxypropionic acid from glycerol of the present invention is not limited as long as it is an isolated natural microorganism or recombinant microorganism having the ability to produce 3-hydroxypropionic acid, and the microorganism is selected from the group consisting of glycerol dehydratase, dehydrogenase) as well as glycerol dehydratase re-activation factors and genes encoding them. Therefore, in the case of a recombinant microorganism, it may be transfected with a recombinant vector composed of a gene encoding a glycerol dehydratase and an aldehyde dehydrogenase. The recombinant vector may further comprise a gene encoding a glycerol dehydratase reductant.
본 발명의 글리세롤 탈수효소는 글리세롤을 3-히드록시프로피온알데히드로(3-HPA) 전환시키는 효소를 의미하며, 글리세롤 탈수효소(Glycerol dehydratase) 또는 디올 탈수효소(Diol dehydratases) 등이 포함된다. 본 발명의 글리세롤 탈수효소는 비타민 B12 의존 또는 비의존성일 수 있다. 상기 글리세롤 탈수효소는 이에 제한되는 것은 아니나, 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 시트로박터 프레운디(Citrobacter freundii), 클로스트리디움 파스튜리아늄(Clostridium pasteurianum), 살모넬라 타이티무리움(Salmonella typhimurium) 또는 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum) 등 유래일 수 있다. 구체적으로는 클렙시엘라 뉴모니아 유래의 DhaB1, DhaB2 및 DhaB3 또는 클로스트리디움 부티리쿰 유래의 DhaB1을 들 수 있다.The glycerol dehydratase of the present invention refers to an enzyme that converts glycerol to 3-hydroxypropionaldehyde (3-HPA), and includes glycerol dehydratase or diol dehydratase. The glycerol dehydratase of the present invention may be vitamin B 12 dependent or non-toxic. The glycerol dehydratase can be, but is not limited to, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Clostridium pasteurianum, Salmonella tritiumumurii, typhimurium or Klebsiella oxytoca, Clostridium butyricum, and the like. Specifically, examples include DhaB1, DhaB2 and DhaB3 derived from Klebsiella sp., Or DhaB1 derived from Clostridium butyricum.
상기 본 발명의 글리세롤 탈수효소 재활성화 인자는, 글리세롤 탈수효소가 작용하는 동안 글리세롤 단독 또는 1,3-프로판디올과의 상호작용에 의해 비가역적으로 불활성화되는 것을 다시 활성화시켜주는 폴리펩타이드이다. 본 발명의 미생물은 글리세롤 탈수효소를 활성화시키기 위한 글리세롤 탈수효소 재활성화 인자를 암호화하는 염기서열을 포함한다. 상기 글리세롤 탈수효소 재활성화 인자를 암호화하는 염기서열 역시 상기 클렙시엘라, 클로스트리디움 등으로부터 유래된 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 글리세롤 탈수 효소를 암호화하는 염기서열을 제공하는 미생물과 동종의 미생물이다.The glycerol dehydratase re-activating factor of the present invention is a polypeptide that re-activates glycerol dehydratase by its interaction with glycerol alone or 1,3-propanediol during the action of glycerol dehydratase. The microorganism of the present invention comprises a base sequence encoding a glycerol dehydratase reactivation factor for activating glycerol dehydratase. The nucleotide sequence encoding the glycerol dehydratase re-activating factor may also be derived from, but not limited to, the above-mentioned Klebsiella, Clostridium, and the like. Preferably a microorganism homologous to a microorganism that provides a nucleotide sequence encoding glycerol dehydratase.
본 발명의 알데히드 탈수소효소는 3-히드록시프로피온알데히드를 3-히드록시프로피오산으로 전환하는 활성을 가지며, 3-히드록시프로피온알데히드 탈수소효소, 숙신산 세미알데히드 탈수소효소, 감마-글루타밀-감마-아미노부틸알데히드 데하이드로게나제 등일 수 있다. 본 발명에서 3-히드록시프로피온알데히드 탈수소효소로는 호모 사피엔스(Homo sapiens) 유래의 ALDH2, 효모(S. cerevisiae) 유래의 ALD4, 대장균(E. coli) 유래의 AldA, AldB 또는 AldH 유전자 에서 선택될 수 있고, 엔테로박터 클로아세 유래의 감마-글루타밀-감마-아미노부틸알데히드 데하이드로게나제, 숙신산 세미알데히드 탈수소효소는 쿠프리아비두스 네카터 (Cupriavidus necator) 유래의 gabD4 일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.The aldehyde dehydrogenase of the present invention has an activity of converting 3-hydroxypropionaldehyde to 3-hydroxypropionic acid, and has an activity of converting 3-hydroxypropionaldehyde dehydrogenase, succinic acid semialdehyde dehydrogenase, gamma-glutamyl-gamma-amino Butylaldehyde dehydrogenase, and the like. In the present invention, 3-hydroxypropionaldehyde dehydrogenase is selected from ALDH2 derived from Homo sapiens, ALD4 derived from S. cerevisiae, AldA, AldB or AldH gene derived from E. coli Gamma-glutamyl-gamma-aminobutylaldehyde dehydrogenase, succinic acid semialdehyde dehydrogenase from Enterobacter cloacae may be gabD4 from Cupriavidus necator, It is not.
상기 미생물은 상기 염기서열을 포함하는 재조합 벡터와 같은 발현카세트로 숙주 세포에 도입하는 형질전환 방법에 의하여 만들어질 수 있으며, 상기 상술한 염기서열로 이루어진 핵산분자 중 어느 하나 이상을 BAC, 플라스미드, 포스미드 등의 적절한 벡터에 클로닝하여 제조될 수 있으며, 이를 적당한 숙주세포에 도입하여 형질전환한다. 상기 도입 방법 역시 공지의 기술, 예컨데 염화칼슘법, 열 충격법, 전기충격법 등의 형질전환방법이나 재조합 파지 바이러스를 통한 형질주입방법을 통해 도입할 수 있다. 상기의 숙주 세포 이외에도 발현의 목적에 따라 달라지는 벡터에 의존하여 다양한 균주를 용이하게 이용할 수 있음은 당업자에게 명백한 일이다.The microorganism may be produced by a transformation method of introducing the microorganism into a host cell with an expression cassette such as a recombinant vector comprising the nucleotide sequence. Any one or more of the nucleic acid molecules comprising the above-mentioned nucleotide sequence may be introduced into a host cell such as BAC, plasmid, Meade, etc., which are transformed by introduction into suitable host cells. The introduction method can also be introduced by a known technique, for example, a transformation method such as a calcium chloride method, a heat shock method, an electric shock method, or a transfection method using recombinant phage virus. It will be apparent to those skilled in the art that various strains can be readily used depending on the vector, which varies depending on the purpose of expression, in addition to the above host cells.
본 발명의 재조합 미생물의 제조에 사용 가능한 숙주세포는 에스케리키아 (Escherichia) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 엔테로박테리아 (Enterobacteria) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속, 크렙시엘라(Klebsiella) 속, 시트로박터(Citrobacter) 속, 클로스트리디움(Clostridium) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 슈도모나스 (Pseudomonas) 속, 사카로마이세스(Saccharomyces) 속 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 속으로 이루어진 미생물에서 선택될 수 있다. 이에 제한되지는 않으나 글리세롤 및 포도당의 적정 조합으로부터 대사 효율을 높이기 위해서는 상기 중에서도 대장균(Escherichia coli)이 가장 바람직하다.Host cells that can be used in the preparation of the recombinant microorganism of the present invention include Escherichia genus, Pseudomonas genus, Enterobacteria genus, Brevibacterium genus, Corynebacterium genus, A genus selected from the group consisting of Klebsiella spp., Citrobacter spp., Clostridium spp., Streptomyces spp., Bacillus spp., Lactobacillus spp., Pseudomonas spp. ), Saccharomyces sp., And Aspergillus sp. Can be selected. Escherichia coli is the most preferred among the above to enhance the metabolic efficiency from an appropriate combination of glycerol and glucose.
본 발명에 사용될 수 있는 재조합 미생물로는 특허출원 10-2011-0130386, 특허출원 10-2011-0138193, 특허출원 10-2012-0071376, 특허출원 10-2012-0071380, 10-2012-149270 등에 기재된 재조합 미생물 등이 있으며, 해당 출원에 기재되어 있는 재조합 미생물의 구체적인 제조공정은 모두 본 특허발명에 적용될 수 있다.Recombinant microorganisms that can be used in the present invention include recombinant microorganisms described in Patent Application 10-2011-0130386, Patent Application 10-2011-0138193, Patent Application 10-2012-0071376, Patent Application 10-2012-0071380, 10-2012-149270, Microorganisms, etc., and the specific manufacturing processes of the recombinant microorganisms described in the application can be applied to the present patented invention.
본 발명에 사용되는 배지는 통상의 기술자가 미생물 배양에 적용할 수 있는 것이면 제한되지 않으며, 구체적으로 루리아 베르타니(Luria Bertani, LB) 배지, 리젠버그(Liesenberg) 배지, MRS 배지 등이 사용될 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 배지의 기본 조성에 탄소원으로 글리세롤을 포함하고 있는 것이 3-히드록시프로피온산의 합성면에서 바람직하다.The medium used in the present invention is not limited as long as the conventional art can be applied to microorganism cultivation. Specifically, Luria Bertani (LB) medium, Liesenberg medium, MRS medium and the like can be used More preferably, glycerol is contained as a carbon source in the basic composition of the culture medium in terms of synthesis of 3-hydroxypropionic acid.
본 발명의 미생물의 배양방법은 통상의 기술자가 3-하이드로프로피온산의 생산에 적용할 수 있는 방법이면 제한되지 않고, 배양방법은 배치식, 유가식, 연속식이 가능하며, 바람직하게는 유가식 또는 연속식이다. The culture method of the microorganism of the present invention is not limited as long as it can be applied to the production of 3-hydropropionic acid by a person skilled in the art, and the culture method may be a batch method, a feed method or a continuous method, Respectively.
상기 포도당과 글리세롤의 중량비에서, 포도당 대 글리세롤의 초기 함량비율이 1:16인 경우보다 포도당의 비율이 낮아지면 균주 성장이 느려 3-히드록시프로피온산의 생산성 향상을 기대하기 어렵고, 포도당 대 글리세롤의 초기 함량비율이 1:2인 경우보다 포도당의 비율이 높아지면 3-하이드록시피온산의 합성에 관여하는 유전자의 발현에 보인자로 사용되는 사이클릭에이엠피(Cyclic adenosine monophosphate, cAMP)가 생성되지 않기 때문에, 3-히드록시프로피온산 생산에 필요한 글리세롤 탈수효소와 3-히드록시프로피온알데히드의 합성량이 적어지거나 발현이 되지 않아 3-히드록시프로피온산의 생산량이 감소하게 된다. When the ratio of glucose to glycerol is lower than that of glucose to glycerol at an initial ratio of 1:16, the growth of the strain is slowed, and it is difficult to expect an increase in productivity of 3-hydroxypropionic acid. When the ratio of glucose is higher than that in the case of the content ratio of 1: 2, cyclic adenosine monophosphate (cAMP), which is used as a marker for the expression of genes involved in the synthesis of 3-hydroxyphionic acid, is not produced , The amount of synthesized glycerol dehydratase and 3-hydroxypropionaldehyde required for production of 3-hydroxypropionic acid is reduced or is not expressed, resulting in a decrease in the yield of 3-hydroxypropionic acid.
따라서 배양 시작시 배지내 포도당 대비 글리세롤의 중량 비율은 2 내지 16인 것이 바람직하며, 그 중에서도 2 내지 6인 것이 3-히드록시프로피온산의 합성면에서 더 바람직하다. 특히, 포도당 대 글리세롤의 중량 비율이 1:4인 경우 3-히드록시프로피온산의 합성이 가장 바람직하다.Therefore, the weight ratio of glycerol to glucose in the medium at the start of culture is preferably 2 to 16, more preferably 2 to 6 in terms of synthesis of 3-hydroxypropionic acid. Particularly, when the weight ratio of glucose to glycerol is 1: 4, the synthesis of 3-hydroxypropionic acid is most preferable.
본 발명의 배양배지의 배양 초기 글리세롤 함량은, 배지 부피를 기준으로 40 내지 120 g/ℓ, 바람직하게는 60 내지 100 g/ℓ일 수 있다. 글리세롤이 상기 범위 내로 포함되는 경우 3-히드록시프로피온산의 합성 및 미생물의 균체 성장이 우수하다. The initial glycerol content of the culture medium of the present invention may be 40 to 120 g / l, preferably 60 to 100 g / l, based on the culture medium volume. When glycerol is contained within the above range, synthesis of 3-hydroxypropionic acid and microbial cell growth are excellent.
상기 포도당은 배양 초기 배양배지 부피 대비 5 내지 60 g/ℓ, 바람직하게는 5 내지 40 g/ℓ 로 포함될 수 있다. The glucose may be contained in an amount of 5 to 60 g / l, preferably 5 to 40 g / l, based on the initial culture medium volume of the culture.
또한 본 발명에서는 배양 중 글리세롤을 포함하는 피딩용액을 공급하여 배양 동안 배양배지 내 글리세롤 함량을 적절한 농도를 유지하는 것이 바람직하다. 배양 중 글리세롤은 배양배지 부피를 기준으로 20 내지 60g/ℓ, 그 중에서도 40 내지 50g/ℓ를 유지하는 것이 3-히드록시프로피온산의 합성 및 미생물의 균체 성장면에서 가장 바람직하다.It is also desirable in the present invention to provide a feeding solution comprising glycerol during the culture to maintain an appropriate concentration of glycerol in the culture medium during the culture. It is most preferable that the glycerol is maintained at 20 to 60 g / l, more preferably 40 to 50 g / l, in terms of the volume of the culture medium during cultivation in terms of synthesis of 3-hydroxypropionic acid and microbial growth of microorganisms.
상기 피딩용액의 글리세롤 함량은 상기 배양배지의 초기 글리세롤 함량 대비하여 1 내지 10배일 수 있다. 즉, 피딩 용액 내 글리세롤의 함량은 40 내지 1200 g/ℓ, 바람직하게는 300 내지 800 g/ℓ 일 수 있으며, 보다 바람직하게는 500 내지 700g/ℓ일 수 있다. 배양과정 동안 적절한 글리세롤 함량을 유지해야 3-히드록시프로피온산의 합성 및 균체 성장이 우수한데, 상기 농도를 유지하기 위해 투여하는 피딩용액의 글리세롤 함량이 40 g/ℓ이상인 경우 배양액 내 3-히드록시프로피온산 생산을 위한 기질인 글리세롤의 제공면에서 바람직하고, 피딩용액의 글리세롤 함량이 1200 g/ℓ 이하인 경우 고농도 글리세롤의 삼투압으로 인한 세포 성장 억제 방지면에서 바람직하다.The glycerol content of the feeding solution may be 1 to 10 times the initial glycerol content of the culture medium. That is, the content of glycerol in the feeding solution may be 40 to 1200 g / l, preferably 300 to 800 g / l, more preferably 500 to 700 g / l. When the glycerol content of the feeding solution to be administered to maintain the above concentration is 40 g / l or more, the content of 3-hydroxypropionic acid Is preferable in view of providing glycerol which is a substrate for production, and when the glycerol content of the feeding solution is 1200 g / L or less, it is preferable from the viewpoint of inhibition of cell growth due to osmotic pressure of high concentration glycerol.
상기 피딩용액은 포도당을 포함하지 않아도 되나, 피딩용액의 글리세롤의 함량 대비 중량비율로 0.001 내지 1, 바람직하게는 0.001 내지 0.5에 해당하는 포도당을 추가로 포함할 수 있다.The feeding solution may not contain glucose, but may further include glucose corresponding to 0.001 to 1, preferably 0.001 to 0.5 in weight ratio with respect to the content of glycerol in the feeding solution.
상기 피딩용액을 공급하는 시기 및 횟수는 특별히 제한되지는 않으며, 상기 농도 범위를 유지하기 위한 적절한 범위 내에서 일회, 또는 수회로 나누어 공급할 수 있다. 예를 들어, 배양 초기 배양배지의 글리세롤의 함량이 80 g/ℓ, 포도당의 함량이 20g/ℓ인 배양배지에서 3-히드록시프로피온산 합성 미생물을 배양하다가 글리세롤의 함량이 50 g/ℓ되었을 때, 피딩용액을 수회로 나누어 공급하면서 배양배지의 글리세롤 함량을 50 g/ℓ로 유지할 수 있다.The feeding timing and the number of feeding times of the feeding solution are not particularly limited, and they may be fed once or several times in an appropriate range to maintain the concentration range. For example, when the 3-hydroxypropionic acid synthesis microorganism was cultured in a culture medium having a glycerol content of 80 g / L and a glucose content of 20 g / L in the initial culture medium, when the content of glycerol was 50 g / L, The feeding solution can be divided into several batches to maintain the glycerol content of the culture medium at 50 g / l.
본 발명의 3-히드록시프로피온산의 생산을 위한 배양조건은 통상의 미생물을 배양하는 조건이면 제한되지 않으나, 호기성 조건하에 pH 6.5 내지 7.5, 28℃ 내지 35℃에서, 30 내지 60시간 동안 배양하는 것이 미생물의 균체 확보 및 최종산물의 수율면에서 바람직하다. pH 7.0 내지 7.3, 30℃ 내지 33℃에서, 40 내지 60시간 동안 배양하는 것이 더욱 바람직하다.The culture conditions for the production of the 3-hydroxypropionic acid of the present invention are not limited as long as the conditions for culturing conventional microorganisms are not limited, but cultivation under aerobic conditions at pH 6.5 to 7.5 and 28 to 35 ° C for 30 to 60 hours It is preferable in terms of securing microorganism cells and the yield of the final product. more preferably at a pH of 7.0 to 7.3 and at a temperature of 30 to 33 DEG C for 40 to 60 hours.
본 발명의 3-히드록시프로피온산은 상술한 방법에 의하여 미생물을 배양한 후 그 배양액으로부터 3-히드록시프로피온산을 회수하는 과정을 통해 얻을 수 있다. 상기 3-히드록시프로피온산의 회수는 통상적인 분리 기술, 예를 들어 막분리, 증류, 전기투석, 투과증발, 크로마토그래피, 용매추출, 반응추출 등을 이용할 수 있으며, 통상적으로는 순도가 높은 물질을 분리하기 위하여 이들을 조합하여 이용할 수 있다.The 3-hydroxypropionic acid of the present invention can be obtained by culturing the microorganism by the above-mentioned method and recovering 3-hydroxypropionic acid from the culture solution. The recovery of the 3-hydroxypropionic acid can be carried out by conventional separation techniques such as membrane separation, distillation, electrodialysis, pervaporation, chromatography, solvent extraction, reaction extraction, and the like. They can be used in combination to separate them.
상기 제조된 3-히드록시프로피온산은 이를 전구체로 하여 아크릴산, 아크릴산 에스테르, 말론산, 1,3-프로판디올 등을 제조할 수 있다.
The prepared 3-hydroxypropionic acid can be used as a precursor to produce acrylic acid, acrylic ester, malonic acid, 1,3-propanediol, and the like.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It should be understood, however, that these examples are for illustrative purposes only and are not to be construed as limiting the scope of the present invention.
[[ 제조예Manufacturing example ] 재조합 미생물의 제조] Preparation of recombinant microorganisms
1) One) 쿠프리아비두스Kupriavidus 네카터Yes Carter (( CupriavidusCupriavidus necatornecator ) 유래의 숙신산 ) Succinic acid 세미알데히드Semi-aldehyde 데하이드로게나제Dehydrogenase (( succinatesuccinate semialdehydesemialdehyde dehydrogenasedehydrogenase ) 발현 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제작) Production of a recombinant vector containing an expression gene
한국특허출원 제2012-149270호에서와 같은 방법으로 3-히드록시프로피온산을 생산하는 재조합 미생물을 제조하였다. A recombinant microorganism producing 3-hydroxypropionic acid was prepared in the same manner as in Korean Patent Application No. 2012-149270.
쿠프리아비두스 네카터 ATCC 17699로부터 게놈 DNA를 추출하고 정방향 프라이머(AAAGCTAGCATGTACCAGGATCTCGCCC (NheI);서열번호 1) 및 역방향 프라이머(AATGGTACCTCAGGCCTGGGTGATGAACTT (KpnI);서열번호 2)를 이용하여 PCR을 수행하여 gabD4 유전자를 증폭하고, NheI과 KpnI으로 절단하였다. 이때, PCR은 Cycle Ⅰ (95℃, 5분), Cycle Ⅱ (30 cycles/ 95℃, 30초 / 55℃, 30초 / 72℃, 1분 45초), Cycle Ⅲ (72℃, 5분)의 과정으로 수행되었다. 증폭된 DNA를 동일 효소로 처리한 pTrcHisC 벡터(Invitrogen)에 도입하여 pTH-Cn-gabD4 벡터를 제작하였다.
Genomic DNA was extracted from Kupriavidus necator ATCC 17699 and PCR was performed using a forward primer (AAAGCTAGCATGTACCAGGATCTCGCCC (NheI); SEQ ID NO: 1) and a reverse primer (AATGGTACCTCAGGCCTGGGTGATGAACTT (KpnI); SEQ ID NO: 2) to amplify the gabD4 gene And cut with NheI and KpnI. PCR was carried out at Cycle I (95 ° C for 5 minutes), Cycle II (30 cycles / 95 ° C for 30 seconds / 55 ° C, 30 seconds / 72 ° C for 1 minute and 45 seconds) . The amplified DNA was introduced into a pTrcHisC vector (Invitrogen) treated with the same enzyme to prepare a pTH-Cn-gabD4 vector.
2) 글리세롤 탈수효소 및 재활성화 인자의 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 재조합 미생물의 제작2) Production of recombinant vector and recombinant microorganism containing genes of glycerol dehydratase and reactivation factor
먼저, 클렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumonia DSM 2026)의 게놈 DNA로부터 dhaB123-gdrA 및 gdrB 유전자를 PCR 증폭하고 pET-Duet (Novagen)벡터의 NcoIEcoRI및 EcoRI-SalI 위치에 각각 삽입하여 pET-BAB 벡터를 제작하였다. First, dhaB123-gdrA and gdrB genes were amplified from the genomic DNA of Klebsiella pneumonia DSM 2026 by PCR and inserted into the NcoIEcoRI and EcoRI-SalI sites of the pET-Duet (Novagen) vector, respectively, to obtain pET-BAB vector Respectively.
여기서, dhaB123-gdrA 유전자 증폭을 위해 사용된 프라이머는 다음과 같다: 정방향 프라이머(ATATCATGAAAAGATCAAAACGATTT (BspHI); 서열번호 3), 역방향 프라이머(AAAGAATTCCGCGAGCGCCCGTTTAATTC (EcoRI); 서열번호 4). Here, the primers used for the amplification of the dhaB123-gdrA gene are as follows: a forward primer (ATATCATGAAAAGATCAAAACGATTT (BspHI); SEQ ID NO: 3), and a reverse primer (AAAGAATTCCGCGAGCGCCCGTTTAATTC (EcoRI); SEQ ID NO: 4).
gdrB 유전자 증폭을 위해 사용된 프라이머는 다음과 같다: 정방향 프라이머(TTTGAATTCTAACGAGGGGACCGTCATGTC (EcoRI); 서열번호 5), 역방향 프라이머(ATAGTCGACTCAGTTTCTCTCACTTAACGG (SalI); 서열번호 6). The primers used for gdrB gene amplification are as follows: forward primer (TTTGAATTCTAACGAGGGGACCGTCATGTC (EcoRI); SEQ ID NO: 5), reverse primer (ATAGTCGACTCAGTTTCTCTCACTTAACGG (SalI); SEQ ID NO: 6).
이때, PCR은 Cycle Ⅰ (95℃, 5분), Cycle Ⅱ (30 cycles/ 95℃, 30초 / 55℃, 30초 / 72℃, 5분(dhaB123-gdrA) 혹은 30초(gdrB)), Cycle Ⅲ (72℃, 5분)의 과정으로 수행되었다.At this time, the PCR was carried out in a cycle of Cycle I (95 ° C, 5 minutes), Cycle II (30 cycles / 95 ° C, 30 seconds / 55 ° C, 30 seconds / 72 ° C, 5 minutes (dhaB123- gdrA) Cycle III (72 ° C, 5 minutes).
앞서 얻어진 pET-BAB 벡터에 pET-Duet 벡터로부터 pseudo-유전자를 PCR 증폭하여 삽입하는 방식으로 pET-BAB 벡터의 시작코돈을 포함하고 있는 NdeI 뒤에 NheI에 해당하는 염기서열(GCTAGC)을 추가하여 pET-BAB-(NheI) 벡터를 제작하였다. The nucleotide sequence corresponding to NheI (GCTAGC) was added to the pET-BAB vector obtained previously by PCR amplification of the pET-Duet vector from the pET-BAB vector, followed by insertion of pET- BAB- (NheI) vector was constructed.
이때, PCR은 Cycle Ⅰ (95℃, 5분), Cycle Ⅱ (30 cycles/ 95℃, 30초 / 55℃, 30초/ 72℃, 30초), Cycle Ⅲ (72℃, 5분)의 과정으로 수행되었다. 사용된 프라이머쌍은 다음과 같다: 정방향 프라이머 (TTTCATATGGCTAGCGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTC (NdeI & NheI); 서열번호 7), 역방향 프라이머 (TTTGGTACCTTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTC (KpnI); 서열번호 8).At this time, the PCR was performed in a cycle of Cycle I (95 ° C., 5 minutes), Cycle II (30 cycles / 95 ° C., 30 seconds / 55 ° C., 30 seconds / . The primer pairs used are: forward primer (TTTCATATGGCTAGCGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTC (NdeI &NheI); SEQ ID NO: 7), reverse primer (TTTGGTACCTTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTC (KpnI); SEQ ID NO: 8).
상기에서 제조한 pTH-Cn-gabD4를 NheI과 KpnI으로 절단한 다음 앞서 얻어진 pET-BAB-(NheI) 벡터에 각각 삽입하여 재조합 벡터 pET-BAB-gabD4를 제작하였다. 이렇게 제조된 재조합 벡터 pET-BAB-gabD4를 대장균BL21(DE3)에 형질전환시켜 본 발명에 따른 재조합 균주를 제작하였다.
The pTH-Cn-gabD4 prepared above was digested with NheI and KpnI and inserted into the pET-BAB- (NheI) vector obtained above to prepare a recombinant vector pET-BAB-gabD4. The thus-constructed recombinant vector pET-BAB-gabD4 was transformed into E. coli BL21 (DE3) to prepare a recombinant strain according to the present invention.
[[ 비교예Comparative Example 1] One]
액상 루리아 베르타니(Luria Bertani, LB)배지(트립톤 10.0g/ℓ, 효모추출액 5.0g/ℓ, 염화나트륨 10.0g/ℓ) 50ml에, 상기 제조예의 재조합 균주를 접종하였다. 접종 후 진탕 배양기를 이용하여 33℃에서, 250 RPM 속도로 교반하며 약 12시간 배양하여 균체를 600nm에서 흡광도 측정시 약 2.0 이상이 될 때까지 배양하였다.The recombinant strain of the above production example was inoculated into 50 ml of a liquid Luria Bertani (LB) medium (10.0 g / l of tryptone, 5.0 g / l of yeast extract and 10.0 g / l of sodium chloride). After inoculation, the cells were incubated at 33 ° C at 250 RPM for about 12 hours using a shaking incubator, and the cells were cultured at 600 nm until the absorbance reached about 2.0 or higher.
이후 1.5L 발효기를 이용하여, 상기 배양액 전부를 리젠버그 배지(Risenberg Medium) 600ml에 각각 접종하였으며, pH 7.0, 33℃ 상태로 배양하였다. 공기(Air)의 공급은 1 vvm, 교반속도는 800 rpm으로 하여 배양을 수행하였다. 이후 균체의 흡광도(600nm)가 0.6~0.8이 되었을 시 배지 내 0.05mM IPTG(isopropyl-1-thio-β-galactopyranoside) 첨가를 통해 도입효소의 발현유도(induction)를 실시하였으며 이와 동시에 보효소(vitamin B12) 50μM를 배지 중에 보충하였다. Then, the whole of the culture was inoculated into 600 ml of Risenberg Medium using a 1.5 L fermenter, and cultured at pH 7.0 and 33 ° C. Air was supplied at 1 vvm, and the stirring speed was 800 rpm. When the absorbance (600 nm) of the cells was 0.6 to 0.8, the induction of the transfected enzyme was performed by adding 0.05 mM IPTG (isopropyl-1-thio-β-galactopyranoside) 12 ) supplemented into the medium.
이후 배양액의 글리세롤 농도가 50 g/ℓ 에 도달하면, 표 2의 조성을 갖는 피딩용액(A) 액체 배지를 공급하여 배양액 내의 글리세롤 함량을 50~40 g/ℓ 내외로 유지시키는 방법으로 배양하면서 균체량 및 3-하이드록시프로피온산을 분석하였다.
Then, when the concentration of glycerol in the culture solution reaches 50 g / l, the liquid medium for feeding the composition (A) having the composition shown in Table 2 is fed to maintain the glycerol content in the culture medium at about 50 to 40 g / 3-hydroxypropionic acid was analyzed.
[[ 비교예Comparative Example 2] 2]
비교예 1과 같이 배양하되 발현 유도 후 배양액의 글리세롤 농도가 50g/ℓ 에 도달하면, 표 3의 조성을 갖는 피딩용액(3) 액체 배지를 공급하여 배양액 내의 Glucose농도를 10 g/ℓ 내외, 글리세롤 함량을 50 g/ℓ 내외로 유지시키는 방법으로 배양하면서 균체량 및 3-하이드록시프로피온산을 분석하였다.
When the concentration of glycerol in the culture solution reached 50 g / L after the induction of induction, as shown in Comparative Example 1, the liquid medium of the feeding solution (3) having the composition shown in Table 3 was fed to adjust the concentration of glucose in the culture liquid to about 10 g / Was kept at about 50 g / l, and the cell mass and 3-hydroxypropionic acid were analyzed.
[[ 실시예Example 1] One]
액상 루리아 베르타니(Luria Bertani, LB)배지(트립톤 10.0 g/ℓ, 효모추출액 5.0 g/ℓ, 염화나트륨 10.0 g/ℓ) 50ml에, 상기 제조예의 재조합 균주를 접종하였다. 접종 후 진탕 배양기를 이용 33℃, 교반속도 250 RPM 으로 약 12시간 배양하여 균체를 600nm에서 흡광도 측정시 약 2.0 이상이 될 때까지 배양하였다.The recombinant strain of the above-mentioned production example was inoculated into 50 ml of a liquid Luria Bertani (LB) medium (10 mg / L of tryptone, 5.0 g / L of yeast extract, 10.0 g / L of sodium chloride). After inoculation, the cells were incubated at 33 ° C. with a shaking incubator at a stirring speed of 250 rpm for about 12 hours, and the cells were cultured at 600 nm until the absorbance was measured to about 2.0 or more.
이후 1.5L 발효기를 이용하여, 상기 배양액 전부를 포도당이 5 g/ℓ로 포함된 리젠버그 배지(Risenberg Medium) 600ml에 접종하였으며, pH 7.0, 33℃ 상태로 배양하였다. 공기(Air)의 공급은 1 vvm, 교반은 800 rpm으로 배양을 수행하였다. 이후 균체의 흡광도(600nm)가 0.6~0.8이 되었을 시, 배지 내 0.05mM IPTG(isopropyl-1-thio-β-galactopyranoside) 첨가를 통해 도입효소의 발현유도(induction)를 실시하였으며 이와 동시에 보효소(vitamin B12) 50μM를 배지 중에 보충하였다. Then, the whole culture was inoculated into 600 ml of Risenberg Medium containing 5 g / l of glucose using a 1.5 L fermenter and cultured at pH 7.0 and 33 ° C. Air was supplied at 1 vvm and agitation was performed at 800 rpm. Then, when the absorbance (600 nm) of the cells became 0.6-0.8, the induction of the transfected enzyme was performed by adding 0.05 mM IPTG (isopropyl-1-thio-β-galactopyranoside) B 12 ) was supplemented into the medium.
이후 발효조에 대하여 리젠버그 액체 배지의 글리세롤 농도가 50 g/ℓ 에 도달하면, 표 3의 조성을 갖는 피딩용액(3) 액체 배지를 공급하여 배양액 내의 포도담 함량을 10 g/ℓ 내외, 글리세롤 함량을 50~10 g/ℓ 내외로 유지시키는 방법으로 배양하면서 균체량 및 3-하이드록시프로피온산을 분석하였다.
Then, when the glycerol concentration of the liquid medium of Regenberg was 50 g / l, the liquid medium of the feeding solution (3) having the composition shown in Table 3 was fed to the fermentation tank so that the content of the grape sugar in the culture liquid was about 10 g / l and the glycerol content And 50 to 10 g / L, respectively, and the cell mass and 3-hydroxypropionic acid were analyzed.
[[ 실시예Example 2] 2]
실시예 2는 초기 배지로 포도당을 10 g/ℓ 함유하는 리젠버그 배지(Risenberg Medium)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하였다.
Example 2 was carried out in the same manner as in Example 1, except that a Risenberg medium containing 10 g / l of glucose as an initial medium was used.
[[ 실시예Example 3] 3]
실시예 3은 초기 배지로 포도당을 20 g/ℓ 함유하는 리젠버그 배지(Risenberg Medium)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하였다.
Example 3 was carried out in the same manner as in Example 1, except that a Risenberg medium containing 20 g / l of glucose as an initial medium was used.
[[ 실시예Example 4] 4]
실시예 4는 초기 배지로 포도당을 40 g/ℓ 함유하는 리젠버그 배지(Risenberg Medium)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하였다.
Example 4 was carried out in the same manner as in Example 1, except that Risenberg Medium containing 40 g / l of glucose as an initial medium was used.
[[ 실시예Example 5] 5]
피딩용액의 글루코스 농도를 조절하면서 3-히드록시프로피온산을 생산하였다. 실시예 1과 같이 배양하되 초기 배지를 포도당이 20 g/ℓ로 포함된 리젠버그 배지(Risenberg Medium)를 사용하고, 표 3의 조성을 갖는 피딩용액(2)를 공급하여 배양하면서 균체 성장과 3-히드록시프로피온산 생산량을 측정하였다.
3-hydroxypropionic acid was produced while controlling the glucose concentration of the feeding solution. The culture medium was prepared as in Example 1 except that the initial medium was fed with a feeding solution (2) having the composition shown in Table 3 using a Risenberg medium containing 20 g / The production of hydroxypropionic acid was measured.
[[ 실시예Example 6] 6]
실시예 6은 표 3의 조성을 갖는 피딩용액(1)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5와 동일하게 실시하였다.
Example 6 was carried out in the same manner as in Example 5, except that the feeding solution (1) having the composition shown in Table 3 was used.
각 실시예와 비교예의 배양 조건을 정리하면 하기 표 4와 같다.
The culture conditions of each of the Examples and Comparative Examples are summarized in Table 4 below.
[[ 실험예Experimental Example ] ]
1. 균체 성장 및 3-히드록시프로피온산 합성 측정1. Cell growth and synthesis of 3-hydroxypropionic acid
균체의 성장 정도는 600nm에서 흡광도를 측정하여 평가하였다. 3-히드록시프로피온산은 반응액 1 ㎖를 취하여 HPLC(Waters e2695)를 사용하여 정량하였다. HPLC 분석에 있어 Aminex HPX-87H 컬럼과 9% 아세토니트릴(acetonitrile)을 포함한 0.5% 황산을 용매로 사용하였으며, 컬럼의 온도는 35℃였으며, 검출기는 RI 및 UV/VIS(210 nm) 듀얼모드를 이용하였다.
The degree of growth of the cells was evaluated by measuring the absorbance at 600 nm. 3-Hydroxypropionic acid was quantified by HPLC (Waters e2695) taking 1 ml of the reaction solution. For the HPLC analysis, 0.5% sulfuric acid containing 9% acetonitrile was used as the solvent, and the temperature of the column was 35 ° C. The detector was equipped with RI and UV / VIS (210 nm) dual mode Respectively.
2. 실험결과2. Experimental results
1) 배양배지 내 포도당 및 글리세롤의 초기 함량에 따른 영향1) Effect of initial content of glucose and glycerol in culture medium
배양배지 내 포도당 및 글리세롤의 초기 함량에 따른 균체 성장 측정 결과 및 3-히드록시프로피온산 합성양의 측정 결과를 각각 도 1 및 도 2에 나타냈다. The results of measurement of cell growth and the amount of 3-hydroxypropionic acid synthesis according to the initial content of glucose and glycerol in the culture medium are shown in FIGS. 1 and 2, respectively.
배양 결과, 포도당을 첨가하지 않고 배양한 경우(비교예 1,2)보다, 포도당을 첨가한 경우(실시예 1 내지 4) 균체량 및 3-히드록시프로피온산 생산이 증가하고 배양시간이 단축되는 것을 확인하였다. 즉, 글리세롤만을 포함하는 배지로 배양하는 경우(비교예 1), 균주의 성장도 더디고 이에 따라 3-히드록시프로피온산의 생산량도 낮음을 알 수 있다.As a result of culturing, it was confirmed that when glucose was added (Examples 1 to 4), the amount of cells and the production of 3-hydroxypropionic acid were increased and the culture time was shortened, compared with the case of culturing without addition of glucose (Comparative Examples 1 and 2) Respectively. That is, when cultured in a culture medium containing only glycerol (Comparative Example 1), the growth of the strain was slower and the production of 3-hydroxypropionic acid was also low.
또한, 초기배지에는 포도당을 포함하지 않는 경우 피딩용액에 포도당을 공급하더라도(비교예 2) 초기 배지에 포도당을 첨가한 실시예들보다 균주의 성장 및 3-히드록시프로피온산의 생산량이 낮았다.In addition, in the case where glucose was not contained in the initial medium, the growth of the strain and the yield of 3-hydroxypropionic acid were lower than those in Examples in which glucose was added to the initial medium even when glucose was supplied to the feeding solution (Comparative Example 2).
또한, 초기 배지에 포도당이 20 g/ℓ 포함(글리세롤 80 g/ℓ)된 경우(실시예 3), 균체의 성장이 적절하고 3-히드록시프로피온산이 최대로 생산됨을 확인하였다.
In addition, it was confirmed that when the initial medium contained 20 g / L of glucose (glycerol 80 g / L) (Example 3), growth of the cells was adequate and 3-hydroxypropionic acid was maximally produced.
2) 배양 중 첨가되는 피딩용액 내 포도당 함량에 따른 영향2) Effect of glucose content in feeding solution added during culture
피딩용액 내 포도당의 함량에 따른 균체 성장 측정 결과 및 3-히드록시프로피온산 합성양의 측정 결과를 각각 도 3 및 도 4에 나타냈다. The measurement results of the cell growth and the amount of 3-hydroxypropionic acid synthesis according to the content of glucose in the feeding solution are shown in FIG. 3 and FIG. 4, respectively.
실험결과, 피딩용액내 포도당 농도가 감소함에 따라 3-히드록시프로피온산의 최종 생산 농도가 증가하여 포도당을 넣지 않은 경우(실시예 6)의 3-히드록시프로피온산 생산량이 40.08g/ℓ로 가장 높았다.
As a result, the final yield of 3-hydroxypropionic acid increased as the concentration of glucose in the feed solution decreased, and the yield of 3-hydroxypropionic acid was the highest at 40.08 g / L in the case of no glucose added (Example 6).
결론적으로, 본 발명은 포도당 첨가를 통하여 글리세롤만을 탄소원으로 사용하는 경우 나타나는 균체 성장저하 현상을 완화시켜 3-히드록시프로피온산 농도를 비교예 대비 27 % ~ 51 % 증가시켰으며, 생산성은 시간당 0.64 g/ℓ 수준에서 1.12~1.27 g/ℓ로 향상시켰음을 알 수 있다. 또한, 피딩용액 내 포도당 농도를 조절하여 최종 3-히드록시프로피온산 생산성을 글리세롤만 사용한 배양 결과 대비 약 60% 이상 증가시킬 수 있었다.
As a result, the present invention increases the concentration of 3-hydroxypropionic acid by 27% to 51% relative to the comparative example by mitigating the phenomenon of degradation of the cell growth when only glycerol is used as a carbon source through the addition of glucose, and the productivity is 0.64 g / l at the level of 1.12 ~ 1.27 g / l. In addition, the final 3-hydroxypropionic acid productivity could be increased by about 60% compared to the culture using only glycerol by controlling the glucose concentration in the feeding solution.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to specific embodiments thereof, those skilled in the art will appreciate that such specific embodiments are merely preferred embodiments and that the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. It is therefore intended that the scope of the invention be defined by the claims appended hereto and their equivalents.
<110> Samsung Petrochemical Co., Ltd. <120> METHOD OF PRODUCITON FOR 3-HYDROXYPROPIONIC AICD BY USING GLYCEROL AND GLUCOSE <130> DP120241 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for gabD4 of Cupriavidus necator <400> 1 aaagctagca tgtaccagga tctcgccc 28 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for gabD4 of Cupriavidus necator <400> 2 aatggtacct caggcctggg tgatgaactt 30 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for dhaB123-gdrA of Klebsiella pneumonia <400> 3 atatcatgaa aagatcaaaa cgattt 26 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for dhaB123-gdrA of Klebsiella pneumonia <400> 4 aaagaattcc gcgagcgccc gtttaattc 29 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for gdrB of Klebsiella pneumonia <400> 5 tttgaattct aacgagggga ccgtcatgtc 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for gdrB of Klebsiella pneumonia <400> 6 atagtcgact cagtttctct cacttaacgg 30 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for pseudo gene of pET-Duet vector <400> 7 tttcatatgg ctagcgctcg tcgtttggta tggcttc 37 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for pseudo gene of pET-Duet vector <400> 8 tttggtacct tttgccttcc tgtttttgct c 31 <110> Samsung Petrochemical Co., Ltd. <120> METHOD OF PRODUCTION FOR 3-HYDROXYPROPIONIC AICD BY USING GLYCEROL AND GLUCOSE <130> DP120241 <160> 8 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for gabD4 of Cupriavidus necator <400> 1 aaagctagca tgtaccagga tctcgccc 28 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for gabD4 of Cupriavidus necator <400> 2 aatggtacct caggcctggg tgatgaactt 30 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for dhaB123-gdrA of Klebsiella pneumonia <400> 3 atatcatgaa aagatcaaaa cgattt 26 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for dhaB123-gdrA of Klebsiella pneumonia <400> 4 aaagaattcc gcgagcgccc gtttaattc 29 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for gdrB of Klebsiella pneumonia <400> 5 tttgaattct aacgagggga ccgtcatgtc 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for gdrB of Klebsiella pneumonia <400> 6 atagtcgact cagtttctct cacttaacgg 30 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for pseudo gene of pET-Duet vector <400> 7 tttcatatgg ctagcgctcg tcgtttggta tggcttc 37 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for pseudo gene of pET-Duet vector <400> 8 tttggtacct tttgccttcc tgtttttgct c 31
Claims (7)
A process for the production of 3-hydroxypropionic acid comprising culturing a microorganism synthesizing 3-hydroxypropionic acid from glycerol, wherein the culture is carried out in such a manner that the initial concentration of glucose to glycerol is 1: 2 to 1:16 Lt; RTI ID = 0.0 > 3-hydroxypropionic < / RTI > acid.
배양 초기에 상기 포도당은 5g/ℓ 내지 60 g/ℓ로 포함되고, 상기 글리세롤은 40g/ℓ 내지 120g/ℓ로 포함되는 것을 특징으로 하는 3-히드록시프로피온산의 생산방법.
The method according to claim 1,
The method for producing 3-hydroxypropionic acid according to claim 1, wherein the glucose is contained in an amount of 5 g / l to 60 g / l in the initial stage of culture, and the glycerol is contained in an amount of 40 g / l to 120 g / l.
상기 배양배지에 글리세롤을 포함하는 피딩용액을 공급하는 것을 특징으로 하는 3-히드록시프로피온산의 생산방법.
The method of claim 1, wherein
Wherein a feeding solution containing glycerol is fed to the culture medium.
상기 배양배지에 글리세롤을 포함하는 피딩용액을 공급하여 배양배지 내의 글리세롤 함량을 20g/ℓ 내지 60g/ℓ로 유지하는 것을 특징으로 하는 3-히드록시프로피온산의 생산방법.
The method of claim 3,
Wherein the feeding solution containing glycerol is fed to the culture medium to maintain the glycerol content in the culture medium at 20 g / l to 60 g / l.
상기 피딩용액의 글리세롤 함량은 상기 초기 배양배지의 글리세롤 함량 대비 1 내지 10배인 것을 특징으로 하는 3-히드록시프로피온산의 생산방법.
The method of claim 3,
Wherein the glycerol content of the feeding solution is 1 to 10 times the glycerol content of the initial culture medium.
상기 피딩용액이 포도당을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 3-히드록시프로피온산의 생산방법.
The method of claim 3,
Lt; RTI ID = 0.0 > 3-hydroxypropionic < / RTI > acid, wherein the feeding solution further comprises glucose.
상기 피딩용액의 포도당 함량은 상기 피딩용액의 글리세롤 함량 대비 0.001 내지 1인 것을 특징으로 하는 3-히드록시프로피온산의 생산방법.The method according to claim 6,
Wherein the glucose content of the feeding solution is 0.001 to 1 relative to the glycerol content of the feeding solution.
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