KR20140054179A

KR20140054179A - 핵산 나노- 및 마이크로-기술에 관한 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20140054179A
Application number: KR1020147005854A
Authority: KR
Inventors: 펭 인; 디밍 웨이
Original assignee: 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지
Priority date: 2011-08-05
Filing date: 2012-08-02
Publication date: 2014-05-08
Also published as: EP2739638A1; EP2739638A4; US20140213778A1; CN107698640A; US9796749B2; CA2849072A1; CN103889998A; JP2014525921A; EP2739638B1; SG10201606482TA; AU2012294724A1; AU2012294724B2; WO2013022694A1

Abstract

본 발명은 복수개의 올리고뉴클레오티드로 구성된, 조절된 크기 및 형상의 핵산 구조체, 및 그 합성 방법을 제공한다. 이 구조체는, 적어도 부분적으로 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 자기-조립에 의해 형성된다. 생성된 구조체 내의 각 올리고뉴클레오티드의 위치는 알려져 있다. 이에 따라, 이 구조체는 특이적으로 변형될 수 있다.

Description

핵산 나노- 및 마이크로-기술에 관한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS RELATING TO NUCLEIC ACID NANO- AND MICRO-TECHNOLOGY}

핵산 나노구조체(또는 마이크로구조체)의 합성과 관련한 이전 연구는 자연 발생 "스캐폴드(scaffold)" DNA 수 킬로베이스 길이가, 각각이 스캐폴드 DNA의 2개, 3개 이상의 비인접 영역에 혼성화한 복수개의 헬퍼 가닥의 사용을 통해 구조체로 폴딩(folding)된 "DNA 오리가미(origami)" 접근법을 수반하였다. 이러한 폴딩 접근법은 현재 사용 중인 것(즉, M13mp18 바이러스 게놈 DNA, 약 7 킬로베이스 길이) 이외의 스캐폴드를 얻는 능력에 의해 부분적으로 제한된다. 또한, 이것은, 각 핵산 구조체가 스캐폴드 DNA의 필수적인 폴딩을 생성하기 위해서는 헬퍼 가닥의 특이적 디자인 및 세트(set)를 필요로 하기 때문에 그 융통성에서 제한된다.

또한 이전 연구는 각각이 5개의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로 이루어지고, 상대적으로 경질인 핵 구조체 및 핵산 구조체를 형성하기 위해 다른 단량체에 혼성화되는 플랭킹(flanking) 서열을 갖는 핵산 "타일(tile)" 단량체의 사용을 수반하였다. 이 타일 단량체를 사용하여 생성된 가장 복잡한 구조체는 4 곱하기 4 정사각형 구조체였다.

더 최근 연구는 특정 원주의 DNA 관을 형성하기 위해 동일한 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 서브세트의 사용을 수반하였다. 이 연구는 구조체의 몇 가지 유형, 즉 리본 및 관만을 형성하는 능력에 의해 제한되었다. 게다가, 최종 사용자는 이 구조체를 생성하는데 사용되는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 성질에 기초하여 이러한 구조체의 크기에 대한 많은 제어를 발휘할 수 없었다.

본 발명은 핵산 구조체 그 자체뿐 아니라 알려져 있고 정해져서 조절된 크기, 형상 및 복잡성의 핵산 구조체를 만드는 신규한 방법을 제공한다. 본 발명의 핵산 구조체는 서열-특이적 방식으로 복수개의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드가 서로 결합되어 만들어진다. 핵산 구조체 및 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 각 구조체 내의 각 올리고뉴클레오티드의 위치가 알려져 있고, 이에 따라 구조체 내의 각 위치에서의 뉴클레오티드 서열이 알려지도록 디자인된다. 각 올리고뉴클레오티드의 위치를 알아서 이 구조체 내의 각 자리에서의 뉴클레오티드 서열을 아는 능력은 규정되고 조절된 방식으로 구조체의 변형을 용이하게 한다. 또한, 본 발명은, 크기, 형상 및/또는 복잡성에 대해 실질적으로 단순 분산인 복수개의 핵산 구조체를 제공한다. 또한, 복수개의 핵산 구조체의 구성원은 각 구조체 내에 자리 잡은 올리고뉴클레오티드에 대해 서로 동일할 수 있어, 복수개의 핵산 구조체가 동일한 방식으로 변형될 수 있게 한다. 따라서, 복수개의 구조체는 변형에 대해서도 단순 분산으로 특성화될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 이 접근법의 융통성은, 310개의 올리고뉴클레오티드 풀에서의 서브세트를 사용하여 107개 이상의 분명하게 형상화된 핵산 구조체를, "원-포트(one-pot)" 어닐링 반응을 사용하여, 생성하는 능력에 의해 적어도 부분적으로 입증된다.

본 발명의 특정 핵산 구조체는 교차 또는 반교차, 또는 이들의 일부 조합이 있는 평행 이중 나선으로 구성된다. 전형적으로, 복수개의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 이 구조체 내의 이중 나선을 형성하기 위해 어닐링된다.

핵산 구조체 내의 각 올리고뉴클레오티드는 고유할 수 있거나(즉, 이것이 구조 당 단 한번만 존재할 수 있다) 이것은 한번, 두번, 세번 또는 훨씬 더 자주 존재할 수 있다. 본 발명은 하나 이상의 고유한 올리고뉴클레오티드를 갖는 핵산 구조체를 고려한다. 일부 경우에, 이중 나선에 기여하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드는 고유하다. 일부 경우에, 이 구조체 내의 하나 이상의 이중 나선은 그 나선 내 또는 전체로서 구조체 내의 모든 다른 올리고뉴클레오티드로부터 고유한 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

또한, 본 발명은 핵산 구조체를 생성하는데 사용되는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 상이한 복수개의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드가 원하는 구조체의 형상, 크기 및 복잡성을 비롯하여, 디자인에 따라 변하는 이 복수물의 성질 및 조성으로 제공된다. 본원에 더 상세하게 설명된 바와 같이, 이 복수물은 전형적으로 2-도메인 및 4-도메인 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 및 핵산 구조체가 사실상 모듈형인 것을 고려한다. 본 발명의 방법은, 다양한 형상의 핵산 구조체가 알려진 올리고뉴클레오티드의 서브세트의 포함 및/또는 제외에 의해 만들어지게 한다. 또한, 이 방법은, 예를 들면, 서열 특이성에 기초하여 이러한 구조체가 서로 어닐링되어 서로에 대한 핵산 구조체의 모듈형 조립체를 고려한다. 이 실시태양 중 일부에서, 서로 어닐링된 핵산 구조체는 공통의 형상(에컨대, 모두 관일 수 있거나, 모두 격자일 수 있다)을 공유할 수 있다. 또한, 이 방법은 핵산 구조체와 일체식이거나 그렇지 않을 수 있는 링커를 사용하여 2개 이상의 핵산 구조체가 서로 연결되어 만들어진 복합 핵산 구조체를 고려한다. 이 실시태양에서, 서로 연결된 핵산 구조체는 동일하거나 상이한 형상의 것일 수 있다.

본 발명은 적합한 조건하에서, 정해진 방식으로, 단일 용기에서 복수개의 알려진 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 조합하고 올리고뉴클레오티드가 자기-조립하게 하는 핵산 구조체의 합성을 고려한다. 유사하게, 2개 이상의 핵산 구조체는 적합한 조건하에서, 정해진 방식으로, 단일 용기에서 조합되고 뉴클레오티드 서열 상보성에 기초하여 자기-조립하게 되어, 더 큰 핵산 구조체를 형성할 수 있다.

따라서, 한 측면에서, 본 발명은 2개 이상의 평행 이중 나선으로 배열된 올리고뉴클레오티드 각각이 2개 이상의 도메인을 포함하고, 1개 이상의 이중 나선이 고유 도메인을 포함하는 것인, 복수개의 어닐링된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조체를 제공한다.

일부 실시태양에서, 1개 이상의 이중 나선이 2개 이상의 고유 도메인을 포함한다. 일부 실시태양에서, 이중 나선의 50 % 이상이 하나 이상의 고유 도메인을 포함한다. 일부 실시태양에서, 이 구조체가 5개 이상, 10개 이상, 또는 20개 이상의 평행 이중 나선을 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 2개 이상의 평행 이중 나선으로 배열된 올리고뉴클레오티드 각각이 2개 이상의 도메인을 포함하고, 1개 이상의 이중 나선이 고유한 것인, 복수개의 어닐링된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조체를 제공한다.

일부 실시태양에서, 이 구조체는 2개 이상의 고유 이중 나선을 포함한다. 일부 실시태양에서, 이중 나선의 50 % 이상이 고유하다. 일부 실시태양에서, 이중 나선의 50 % 이상이 하나 이상의 고유 도메인을 포함한다. 일부 실시태양에서, 이 구조체가 5개 이상, 10개 이상, 또는 20개 이상의 평행 이중 나선을 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 2개 이상의 평행 이중 나선으로 배열된 올리고뉴클레오티드 각각이 2개 이상의 도메인을 포함하고, 핵산 구조체 내의 1개 이상의 올리고뉴클레오티드가 고유한 것인, 복수개의 어닐링된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조체를 제공한다.

일부 실시태양에서, 구조체 내의 올리고뉴클레오티드의 50 % 이상이 고유하다. 일부 실시태양에서, 구조체 내의 모든 올리고뉴클레오티드가 고유하다. 일부 실시태양에서, 이 구조체는 5개 이상, 10개 이상, 또는 20개 이상의 평행 이중 나선을 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 복수개의 핵산 구조체가 50 % 이상 동질인, 앞선 청구 중 어느 하나의 복수개의 핵산 구조체를 포함하는 조성물을 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 각각이 2개 이상의 도메인을 포함하고, 1개 이상의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드가 복수개 중 다른 올리고뉴클레오티드의 몰농도보다 10배 낮은 몰농도로 존재하는 것인, 단일 용기에서 복수개의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 어닐링하여 핵산 구조체를 형성하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 각각이 2개 이상의 도메인을 포함하고, 1개 이상의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드가 복수개 중 다른 올리고뉴클레오티드의 몰농도보다 100배 낮은 몰농도로 존재하는 것인, 단일 용기에서 복수개의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 어닐링하여 핵산 구조체를 형성하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

일부 실시태양에서, 어닐링은 일정 기간에 걸친 온도 전이를 통해 일어난다. 일부 실시태양에서, 온도 전이는 승온에서 약 실온으로의 온도 변화이다. 일부 실시태양에서, 온도 전이는 약 90 ℃에서 약 실온으로의 온도 변화이다. 일부 실시태양에서, 어닐링은 약 12-24시간의 기간 동안 일어난다.

다른 측면에서, 본 발명은 앞선 방법 중 어느 하나에 의해 제조된 핵산 구조체를 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 스페이서-링커(spacer-linker)를 통해 서로 접합된, 앞선 청구항 중 어느 하나의 2개 이상의 핵산 구조체를 포함하는 복합 핵산 구조체를 제공한다.

일부 실시태양에서, 스페이서-링커는 핵산 요소 및 비-핵산 요소를 포함한다. 일부 실시태양에서, 스페이서-링커는 탄소 사슬을 포함한다. 일부 실시태양에서, 스페이서-링커는 단일-이기능성 스페이서-링커이다.

앞선 측면 중 어느 하나의 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드의 제1 서브세트는 2개의 도메인을 포함하고 올리고뉴클레오티드의 제2 서브세트는 4개의 도메인을 포함한다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 21-104개 길이의 뉴클레오티드이다. 일부 실시태양에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 DNA 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시태양에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 L-DNA 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시태양에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 RNA 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시태양에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 변형, 예컨대 백본 변형, 당 변형, 염기 변형을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 상기 및 다른 변형에 관해 동질이거나 이질일 수 있다.

한 측면에서, 본 발명은, 모든 올리고뉴클레오티드가 1 kb 길이 미만인, 복수개의 고유한 올리고뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조체를 제공한다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 100 염기 길이 미만이다. 일부 실시태양에서, 구조체 내의 일부 올리고뉴클레오티드는 n 길이의 올리고뉴클레오티드이고(여기서 n은 10.5의 배수인 정수를 나타낸다) 일부 올리고뉴클레오티드는 n/2 길이이다. 일부 실시태양에서, 일부 올리고뉴클레오티드는 약 42 길이의 뉴클레오티드이고(예컨대, 4-도메인 올리고뉴클레오티드) 일부 올리고뉴클레오티드는 약 21 길이의 뉴클레오티드이다(예컨대, 2-도메인 올리고뉴클레오티드).

본 발명은 올리고뉴클레오티드의 다양한 배열을 갖는 핵산 구조체를 고려한다. 일부 실시태양에서, 핵산 구조체는 예로서, 5개의 도메인을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 이러한 2개의 도메인이 구조체 내의 별개이고 분리된 올리고뉴클레오티드 상의 1개의 도메인에 결합된 것이다. 일부 실시태양에서, 또 다른 올리고뉴클레오티드 내의 단일 도메인에 결합한 2개의 도메인이 다른 단일 도메인에 결합될 때 서로 인접하지 않거나 서로 연결되지 않을 수 있다. 일부 실시태양에서, 이 구조체는 반교차를 포함한다. 일부 실시태양에서, 이 구조체는 교차를 함유한다. 일부 실시태양에서, 이 구조체는 반교차 및 교차를 함유한다.

하기 더 상세하게 논의되는 앞선 개념 및 추가 개념의 모든 조합이(이러한 개념이 상호 불일치하지 않으면) 본원에 개시된 본 발명 대상의 일부인 것으로 고려된다는 것이 이해되어야 한다. 구체적으로, 본 개시의 마지막에 나타나는 청구된 대상의 모든 조합이 본원에 개시된 본 발명 대상의 일부인 것으로 고려된다. 또한, 참조로 포함된 임의의 개시에서 나타날 수 있는 본원에 분명하게 이용된 용어가 본원에 개시된 구체적인 개념과 가장 일관되는 의미로 부여되어야 한다는 것이 이해되어야 한다.

도면은 반드시 일정한 축척이 아니라, 본원에 논의된 각종 개념을 일반적으로 예시할 때 대신 강조하여 나타낸 것이 이해되어야 한다.
도 1은 4개의 도메인을 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드(4-도메인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로 본원에서 지칭됨)의 개략도이다. 각 도메인은 상이한 뉴클레오티드 서열의 것이다(상이한 색으로 표현될 수 있음). 각 도메인은 본원에 논의된 바와 같이, 그 서열 및 그 길이로 특성화된다. 화살표 머리는 올리고뉴클레오티드의 3' 말단을 표현하고 올리고뉴클레오티드의 다른 말단은 5' 말단이다. 본 발명의 특정 올리고뉴클레오티드는 단지 2개의 도메인만을 포함한다(그리고 이것은 2-도메인 올리고뉴클레오티드로 본원에서 지칭된다). 각 올리고뉴클레오티드는 이것의 도메인의 수에 의해, 이러한 도메인 순서 및 이것의 전반적인 뉴클레오티드 서열에 의해 정의된다.
도 2a는 4-도메인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드("U" 형상의 구조로 이 도면에서 표현됨) 및 2-도메인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드(하단에 선형 구조체로 표현됨, 경계면 올리고뉴클레오티드로도 지칭됨)를 도시하는 핵산 구조체의 영역의 개략도이다. 인터-도메인, 인터-올리고뉴클레오티드 결합, 및 나선 간의 반교차가 예시된다. 또한, 반교차가 예시되고, 도면에서 기재된대로 이것은 포스페이트 백본 성분(moiety)으로 구성된다. 반-교차는 전형적으로 뉴클레오티드를 포함하지 않고 따라서 서열-특이적 결합에 기여하지 않고 이 구조체 내의 올리고뉴클레오티드의 위치 또는 자리를 지시하지 않는다. 설명을 위해, 4-도메인 올리고뉴클레오티드 중 9개가 서로 및/또는 다른 올리고뉴클레오티드에 결합된 것이 도시된다. 이 그림에서, 9개 모두가 서로에 대해 고유 서열을 갖는다(상이한 색으로 표현될 수 있음).
도 2b, 2ba 및 2bb 는 2- 및 4-도메인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 배열을 도시하는 2개의 핵산 구조체의 영역의 개략도이다. 상단 개략도에서, 4-도메인 올리고뉴클레오티드 각각은 "U" 형상으로 배치되고 기여되는 2개의 이중 나선 간의 단일 반교차만을 제공한다. 하단 개략도에서, 4-도메인 올리고뉴클레오티드 중 하나가 기여되는 이중 나선 간의 2개의 반교차에 기여한다. 그러므로, 이 구조체는 교차 및 다중 반교차를 함유한다. 동일한 올리고뉴클레오티드는 5' d2-a-b-c-d1 3'의 도메인 순서를 갖는 것을 특징으로 할 수 있고, 여기서 도메인 d1 및 d2는 이중 나선의 형성에서 도메인 d*에 결합한다. 이 도메인은 서로에 대해 고유 서열을 표시하기 위해 상이한 식별자로 표지된다.
도 2c는 핵산 구조체 내의 4-도메인 올리고뉴클레오티드의 또 다른 고려된 배열을 도시하는 개략도이다. 상단 구조체는 복수개의 교차를 포함한다. 하단 구조체는 복수개의 반교차를 포함한다. 상단 구조체 내의 교차간의 거리는 하단 구조체 내의 반교차 간의 거리보다 더 크다. 예로서, 하단 구조체 내 거리가 2개의 도메인일 수 있는 반면, 상단 구조체 내 거리는 4개의 도메인일 수 있다. 상단 배열을 포함하는 핵산 구조체가 실험적으로 만들어졌다.
도 3a는 별개의 12개의 올리고뉴클레오티드 (A)로 만들어진 4개의 평행 이중 나선 격자 및 별개의 40개의 올리고뉴클레오티드 (B)로 만들어진 8개의 평행 이중 나선 정사각형의 개략도이다.
도 3b, 3c, 3d, 3e, 3ea, 3eb, 3ec, 3ed, 3f, 3fa, 3fb, 3fc 및 3fd는 상이한 크기이나 격자로 보통 형상된 핵산 구조의 개략적인 지도이다. 크기는 이중 나선의 수 및 이중 나선 당 나선 회전의 수로 나타낼 수 있다. 전형적으로, 나선 회전의 수는 구조체 내의 이중 나선들 간에 유사하거나 동일하다. 이 도면 각각은 그 도메인 내용 및 순서로 식별되는 복수개의 고유한 올리고뉴클레오티드로 만들어진다. 각 도메인은 특정 알파-숫자 명칭에 의해 식별되고, 각 올리고뉴클레오티드는 그 도메인 내용 및 순서로 식별된다. 올리고뉴클레오티드, 그 명칭, 및 그 도메인 및 서열 조성의 목록이 표 1에 제공된다. 도 3f, 3fa, 3fb, 3fc 및 3fd의 격자는 표 1에 제공된 서열을 갖는 362개의 별개의 올리고뉴클레오티드로 만들어진 24개의 이중 나선 격자이다. 도 3b-3d 내 격자는 이 올리고뉴클레오티드의 서브세트를 포함하고, 경계면 올리고뉴클레오티드로 추가 2-도메인 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
도 3g는 2개의 동일한 올리고뉴클레오티드(5' a-b-c-d 3'으로 표지됨)를 갖는 핵산 구조체의 영역을 도시하는 개략도이다.
도 4는 격자 핵산 구조체를 형성하기 위해 조합되고 어닐링된 복수개의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 개략도이다. 또한, 정제의 부재하에서 어닐링 과정의 생성물의 아가로스 겔 전기영동법 분석 및 이 생성물의 원자력현미경(AFM) 영상이 도시된다. 척도 막대는 100 nm를 나타낸다.
도 5a는 다양하게 형상화된 핵산 구조체의 개략도(상단) 및 어닐링 후 생성물의 AFM 영상(하단)이다. 척도 막대는 100 nm를 나타낸다. 또한, 개략도는 알려진 올리고뉴클레오티드 지도를 갖는 초기 격자 구조체를 사용하여 다양하게 형상화된 핵산 구조체를 생성하는 방법을 예시한다.
도 5b, 5ba, 5bb, 5bc, 5c, 5ca, 5cb 및 5cc는 상이한 크기와 상이한 모서리를 갖는 2개의 삼각형 형상의 핵산 구조체의 개략도이다. 두 구조체는 실험적으로 만들어졌다.
도 5d, 5da, 5db, 5dc 및 5dd는 관으로 만들어질 수 있는 격자의 개략도이다. 상단 열의 도메인 a24.x* 및 b24.x*는 관 형상을 형성하기 위해 하단 열의 a24.x 및 b24.x 각각에 결합할 것이다.
도 6은 올리고뉴클레오티드가 없는 내부 영역을 갖는 직사각형 핵산 구조체의 개략도이다. 이 도면은 이러한 복합 구조체가 이 구조체의 정해지고 알려진 올리고뉴클레오티드 지도에 기초한 이 구조체를 만드는데 사용되는 이 복수물에서 알려진 올리고뉴클레오티드를 단순히 제외하여 형성될 수 있는 용이함을 예시한다.
도 7은 도 5a, 5b, 5ba, 5bb, 5bc, 5c, 5ca, 5cb, 5cc, 5d, 5da, 5db, 5dc 및 5dd의 직사각형 격자의 3배 길이 및 1/3의 폭인 격자로부터 만들어진 관형 핵산 구조체의 투과 전자 현미경(TEM) 영상이다. 이 관은 격자에 필요한 올리고뉴클레오티드의 약 80 %를 사용하고 연결기로 사용되는 일부 추가 올리고뉴클레오티드를 포함하여 생성되었다.
도 8, 8a 및 8b은 L-형상의 핵산 구조체와 4개의 평행 이중 나선 정사각형 핵산 구조체의 어닐링을 도시하는 개략도이다. 이 도면은 본 발명에 따른 핵산 구조체 합성에의 모듈형 접근법을 예시한다.
도 9는 스페이서-링커를 사용하여 3개의 직사각형 핵산 구조체 서로의 부착을 도시하는 개략도이다. 다양한 이 복합 구조체는 스페이서-링커의 배치 및 길이에 따라 만들어질 수 있다.
도 10a, 10aa, 10ab, 10ac, 10ad, 10ae, 10af 및 10b는 "핸들(handle)"이 있는 핵산 구조체를 도시하는 개략도(A) 및 AFM 영상(B)이다. 핸들은 2-도메인 경계면 올리고뉴클레오티드에 부착된 추가 도메인으로 제공되어 3-도메인 경계면 올리고뉴클레오티드를 야기한다. 이 도면에서, 이중 T(T2) 스페이서는 제2 및 제3 도메인 사이에 존재하고, 여기서 제3 도메인은 핸들 도메인을 표현한다. 제3 도메인에 상보적인 올리고뉴클레오티드는 어닐링 반응에 포함될 수 있다. 이 도면에서, 이 상보적인 올리고뉴클레오티드는 y*로 표시되고 그 3' 말단에 바이오틴 변형을 갖는다. 이어서, 바이오틴 성분은 스트렙타비딘을 결합하는데 사용될 수 있다. AFM 영상은 표지된 스트렙타비딘에 결합된 이러한 구조체를 도시한다. 본 발명은 경계면, 가장자리 및/또는 내부를 비롯한, 이 구조체 내 어느 곳에 이러한 핸들 도메인이 혼입되는 것을 고려한다.
도 11, 11a 및 11b는 본 발명에 따라 생성되는 다양한 구조체에 대한 다이아그램(상단 패널) 및 해당하는 AFM 영상(하단 패널)의 편집물이다.
도 12는 복수개의 직사각형, 내부-고리 형상의 구조체의 AFM 영상이다.

본 발명은 가장 넓은 의미에서, 정해져서 조절된 형상, 크기 및 복잡성의 핵산 구조체를 만드는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 선택된 복수개의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드가 조절된 형상, 크기, 복잡성 및 변형의 핵산 구조체를 형성하기 위해 자기-조립될 수 있다는 예기치 않은 발견을 부분적으로 전제한다. 그 중에서도, 정해진 각종 형상 및 조절된 크기의 안정한 핵산 구조체가 복수개의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드만을 사용하여 형성될 수 있다는 것이 놀라운 것으로 간주되었다.

본 발명의 핵산 구조체는 정해지거나 알려진 방식으로 배열된(서열-특이적 어닐링을 통해) 복수개의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 그 결과, 이 구조체 내의 각 올리고뉴클레오티드의 자리가 알려져 있다. 이 방식으로, 이 구조체는, 예를 들면 성분의 부착을 통해 특정 자리에서 변형될 수 있다. 이것은, 시작 물질로 변형된 올리고뉴클레오티드를 사용하거나, 이 구조체가 형성된 후 특정 올리고뉴클레오티드를 변형시켜 달성될 수 있다. 그러므로, 생성된 구조체 내의 시작 올리고뉴클레오티드 각각의 자리를 아는 것은 이 구조체에 대한 주소 지정 능력을 제공한다.

본 발명의 핵산 구조체는, 일부 경우에 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 자기-조립의 과정을 통해 만들어질 수 있다. 이 자기-조립 방법으로, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 단일 용기에서 조합되고 서열 상보성에 기초하여, 서로 어닐링 하게 된다. 일부 경우에, 이 어닐링 과정은 승온에서 올리고뉴클레오티드를 위치시킨 후에 서열-특이적 결합을 돕기 위해 점차 온도를 감소시키는 것을 수반한다. 본원에 사용된 용어 "자기-조립"은 서열-특이적 방식으로, 예측되는 방식으로, 그리고 외부 조절 없이(예컨대, 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 구조체의 순차적인 첨가에 의해) 서로 어닐링하는 올리고뉴클레오티드(그리고 일부 경우에 핵산 구조체)의 능력을 지칭한다.

따라서, 본 발명은 그 중에서도, 본 발명의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물, 정해지거나 알려진 각종 크기, 형상, 복잡성 및 변형의 핵산 구조체를 만드는 방법, 각종 정해지거나 알려진 크기, 형상, 복잡성 및 변형의 핵산 구조체, 크기, 형상, 복잡성 및 변형에 관해 실질적으로 단순 분산일 수 있는 복수개의 핵산 구조체, 2개 이상의 핵산 구조체를 포함하는 조성물 구조체, 및 이러한 복합 구조체를 만드는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 핵산 구조체 및 복합 구조체를 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명의 이러한 측면 및 실시태양은 본원에 더 상세하게 기술될 것이다.

핵산 구조체:

본 발명의 핵산 구조체는 서열-특이적 방식으로 서로 결합된 복수개의 올리고뉴클레오티드로 구성된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 2개 이상의 도메인을 포함한다. 도 1은 4-도메인 올리고뉴클레오티드의 개략도를 제공한다. 핵산 구조체를 형성하는 어닐링 과정 전에, 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 형태이다.

일반적으로, 올리고뉴클레오티드의 모든 도메인은 이 구조체 내의 다른 올리고뉴클레오티드의 다른 도메인에 결합한다. 도 2a는 구조체의 영역 내의 2- 및 4- 도메인 올리고뉴클레오티드 간의 배열 및 결합 상호작용의 개략도를 제공한다. 2-도메인 올리고뉴클레오티드는 하단에서 직선 화살표로 도시되고, 4-도메인 올리고뉴클레오티드는 U-형상의 화살표로 도시된다. 4-도메인 올리고뉴클레오티드는 본 발명의 핵산 구조체에 존재할 때, 약 3 nm 곱하기 7 nm의 면적을 갖는다. 이것은 본원에서 단일-가닥 타일(SST)로 지칭될 수 있다. 핵산 구조체와 관련해서, 각 SST는 "분자 픽셀"로 생각될 수 있다. 각각의 도면에서의 화살표 머리는 올리고뉴클레오티드의 3' 말단을 표현한다. 유사한 표현이 도 2b, 2ba 및 2bb(상단)에 제공된다. 도 2b, 2ba 및 2bb(하단)는 올리고뉴클레오티드가 5개의 도메인으로 구성되고, 이 도메인 중 2개가 물리적으로 분리된 올리고뉴클레오티드 상의 다른 도메인에 함께 결합하는 대체 실시태양을 도시한다. 다른 도메인에 결합될 때, d1 및 d2로 표시되는 이 두 도메인은 서로 바로 접합되지 않고 오히려 그것들 사이에 본질적으로 새김눈(nick)이 존재한다. 또한, 이어서 이 구조체는 5'-d2-a-b-c-d1-3' 올리고뉴클레오티드의 배향에 기초한 교차를 포함한다. 또 다른 배열이 도 2c에 도시된다. 예시된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드는 이 구조체가 교차(도 2c 상단에 도시됨), 반교차(도 2c 하단에 도시됨), 또는 이들의 조합(도 2b, 2ba 및 2bb 하단에 도시됨)을 포함하도록 배열될 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 교차 및/또는 반교차가 제한되지는 않지만 매 2개의 도메인마다 또는 매 4개의 도메인마다 등을 포함하는 상이한 거리로 일어나도록 배열될 수 있다. 따라서, 본 발명이 핵산 구조체 내의 올리고뉴클레오티드에 대한 각종 결합 배열을 고려한다는 것이 이해되어야 한다.

그러나, 일부 경우에, 핵산 구조체 내의 특정 도메인은 이 구조체 내의 다른 도메인에 결합하지 않을 수 있다. 예로서, 일부 경우에, 폴리 T 도메인을 갖는 올리고뉴클레오티드가 이 구조체 내에, 바람직하게는 경계에서 그리고 단일 가닥인 폴리 T 도메인을 야기하는 배치로 존재한다.

다른 예로서, 도메인은 다른 구조체 또는 다른 성분에 어닐링하기 위한 핸들로 사용될 수 있다. 이러한 핸들 도메인은 도 10a, 10aa, 10ab, 10ac, 10ad, 10ae, 10af에서 격자 구조체의 상단 및 하단 경계로 도시된다. 바이오틴 성분을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 이 핸들에 결합되었고 그 후에 이 구조체는 스트렙타비딘과 접촉되었다. 스트렙타비딘의 결합 위치는 도 10b에 도시된다.

구조체 내의 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 평행 배열로 이중 나선을 형성하도록 스스로를 배열한다. 이 이중 나선은 본원에서 나선으로 교환가능하게 지칭된다. 이러한 구조체의 예가 도 3a에서 제공된다. 왼쪽 패널은 4개 나선 격자 구조체를 예시하고 오른쪽 패널은 8개 나선 격자 구조체를 예시한다. 이 이중 나선은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 선택군의 서로에 대한 서열-특이적 어닐링의 결과로 형성된다. 이 구조체 내의 이중 나선 각각은 복수개의 도메인으로 구성된다. 이 도메인은 이 나선을 형성하기 위해 다른 올리고뉴클레오티드의 상보적인 도메인에 결합한다. 인접 나선은 반교차에 의해 서로 연결된다.

본 발명은 핵산 구조체가 합성 전에 디자인될 수 있고 그 크기, 형상, 복잡성 및 변형이 합성 과정에서 선택된 특정 올리고뉴클레오티드를 사용하여 지정되고 조절될 수 있다는 것을 제공한다. 예로서, 도 3b, 3c, 3d, 3e, 3ea, 3eb, 3ec, 3ed, 3f, 3fa, 3fb, 3fc 및 3fd는 여러 다양한 크기의 격자에 대한 올리고뉴클레오티드 지도를 예시한다. 이 구조체 내의 각 도메인 및 각 올리고뉴클레오티드의 위치는 알려져 있고 이 도면에서 제공된다. 이 도메인 및 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 표 1에서 제공된다.

표 1의 올리고뉴클레오티드는 각종 형상의 핵산 구조체가 생성될 수 있는 310개의 "픽셀" 캔버스를 생성하는데 사용될 수 있다. 이 표는 4-도메인 내부 및 경계면 올리고뉴클레오티드의 서열 및 2-도메인 경계면 올리고뉴클레오티드의 서열을 함유한다. 2-도메인 및 4-도메인 경계면 올리고뉴클레오티드가 내부 올리고뉴클레오티드에 의해 형성된 이 구조체의 상단, 하단 및 측모서리에 결합하고, 이에 의해 구조체의 원치않는 응집을 방지하는 반면, 4-도메인 내부 올리고뉴클레오티드는 픽셀을 표현한다. 그러므로, 이 표는 310개의 4-도메인(픽셀 또는 내부) 올리고뉴클레오티드, 24개의 4-도메인(세로 경계면) 올리고뉴클레오티드, 및 28개의 2-도메인(수평 경계면) 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 310개의 내부 올리고뉴클레오티드 풀의 서브세트가 특정 형상의 구조체를 생성하는데 사용될 때, 상이한 2-도메인 및 4-도메인 경계면 올리고뉴클레오티드는 내부 올리고뉴클레오티드의 원하는 구조체의 모서리에 존재하는 서열에 따라 달라질 필요가 있을 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 당업계의 당업자 중 한명은 본원에 제공된 교시를 사용하고 도 2b, 2ba, 2bb 및 3a를 포함하나 이에 제한되지 않는 특정 도면을 참고하여 이러한 경계면 올리고뉴클레오티드의 서열을 결정할 수 있다.

따라서, 내부 올리고뉴클레오티드가 이 구조체의 원하는 형상에 기여하고 경계면 올리고뉴클레오티드가 구조체 서로에 대한 원치 않는 응집을 방지한다는 것이 이해되어야 한다.

또한, 표 1의 서열이 사실상 대표적 예이고 본 발명이 다른 올리고뉴클레오티드 풀을 사용하여 수행될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 이러한 올리고뉴클레오티드 풀은 본원에 제공된 교시에 기초하여 수동으로 또는 컴퓨터 수단으로 디자인될 수 있다.

예로서, 올리고뉴클레오티드 풀은 서열 대칭을 최소화하거나 완전하게 랜덤한 서열로 SST 모티프를 형성하는 과정을 사용하여 구축될 수 있다. 이 과정 중 어느 하나가 유니퀴머(Uniquimer)와 같은 소프트웨어를 이용할 수 있다. 서열 최소화 기초의 디자인을 위해, 서열 생성에 대한 몇 가지 기준이 존재한다: 1) 뉴클레오티드(즉, A, C, G, T)는 하나하나씩 랜덤하게 생성된다. 2) 생성된 것에 대해 상보적인 뉴클레오티드는 하기 염기 짝지음 규칙에 맞춘다: A는 T에 그리고 역도 같음, C는 G에 그리고 역도 같음. 3) 특정 길이(8 nt 또는 9 nt) 이상의 반복 세그먼트(segment)는 허용되지 않는다. 이러한 반복 세그먼트가 디자인 동안 출현하면, 가장 최근에 생성된 뉴클레오티드는 반복 세그먼트 요건이 만족될 때까지 돌연변이가 될 것이다. 4) 4개의 연속적인 A, C, G 또는 T 염기는 허용되지 않는다. 5) 단일-가닥 연결점에서의 사전명시된 뉴클레오티드(예컨대, 이 가닥들의 대부분에 대해 각각 21번째 및 22번째 뉴클레오티드에 대한 T 및 G)는 연결점 주위의 염기 미끄러짐을 피하는데 사용된다. 그러나, 완전하게 랜덤한 서열을 사용하는 디자인에서는, 단계 3 내지 5의 제한이 적용되지 않는다.

올리고뉴클레오티드의 일부 또는 전부가 수동으로 디자인될 수 있다. 예를 들면, 예시된 구조체 중 일부에서, 수동 설게 및/또는 최적화는 핸들 세그먼트 서열 디자인(예컨대, 스트렙타비딘 표지를 위한 3' 바이오틴 가닥을 수용하는 핸들 세그먼트 및 폴리-T 도메인의 농도)을 위해 사용되었다. 추가적으로, 일부 경우에, 상이한 SST 구조체로부터의 세그먼트는 기존의 구조체를 새로운 구조체로 변환시키기 위해 수동으로 조합되었다. 예를 들면, SST의 추가 열은 직사각형 디자인을 관 디자인으로 전환시키기 위해 도입되었다(예컨대, 24H×28T 직사각형 디자인에서 24H×28T 원통형 디자인으로의 전환, 및 24H×28T 직사각형 디자인에서 8H×84T 관형 디자인으로의 전환). 유사하게, 관형 디자인은 직사각형 디자인으로 수동으로도 전환되었다(예컨대, 12H×177T 관에서 36H×41T 직사각형으로의 전환).

일부 경우에, 핵산 구조체 내 1개 이상의 도메인은 고유할 것이고, 이는 이 도메인이 그 구조체에서 단 한번만 나타나는 것을 의미한다. 구조체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000개 또는 그 이상의 고유 도메인을 비롯하여, 1개 이상의 고유 도메인으로 구성될 수 있다. 일부 실시태양에서, 구조체 내의 도메인 중 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 80 %, 또는 90 % 이상이 고유하다. 예로서, 구조체는, 각각이 이 구조체에서 단 한번만 나타나고 이 고유 도메인이 이 구조체 내의 총 도메인 중 75 % 존재할 수 있는 복수개의 제1 도메인, 및 각각이 이 구조체에서 한번 초과로 나타나고 이 반복 도메인이 이 구조체 내의 총 도메인 중 25 % 존재할 수 있는 복수개의 제2 도메인을 포함할 수 있다. 다른 백분율 또한 가능하다는 것이 명백할 것이다. 일부 실시태양에서, 구조체 내의 모든 도메인은 고유하다. 복합 구조체(즉, 스페이서-링커로 서로 연결된 2개 이상의 핵산 구조체를 포함하는 구조체) 내의 모든 도메인이 고유하거나 고유하지 않을 수 있다.

일부 경우에, 구조체 내의 이중 나선의 1개 이상의 도메인은 고유할 것이고, 이는 이 도메인이 그 이중 나선에서 단 한번만 나타나는 것을 의미한다. 이 도메인은 동일한 구조체 내의 다른 나선에 존재할 수 있어서 전체 핵산 구조체에 관련해서는 이것이 고유하지 않을 수 있다. 이것은 도 3g에 예시된다. 5'-a-b-c-d-3'로 명칭되는 올리고뉴클레오티드는 이 구조체에 두 번 존재한다. a 및 이것의 상보체 a*, 및 b 및 이것의 상보체 b*로 명칭되는 도메인이 구조체 내 2개의 나선에 존재하고 도메인 c 및 이것의 상보체 c*, 및 d 및 이것의 상보체 d*도 마찬가지니다. 나선에 관련하여 고유한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 도메인이 나선에 존재할 수 있다. 나선 내 고유 도메인은 그 나선 내의 도메인 중 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 80 %, 90 % 이상, 또는 100%을 나타낼 수 있다. 나선 내 고유 도메인은 그 구조체의 말단에 또는 근처에 위치될 수 있다. 나선 내 고유 도메인은 서로 인접해 있을 수 있거나 이것은 서로 떨어져 있을 수 있다. 이것은 반복 도메인(즉, 나선에 한번 초과로 나타나는 도메인)에 의해 서로 분리될 수 있다.

이 구조체는 고유 도메인을 갖는 1개 이상의 나선을 포함할 수 있다. 이 유형의 나선은 이 구조체에 존재하는 나선 중 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % 또는 90 % 이상 또는 100 %를 나타낼 수 있다. 1개 초과의 이 나선 유형이 이 구조체에 존재한다면, 이것은 서로 인접할 수 있거나 고유 도메인을 함유하지 않는 나선을 포함하는 다른 나선에 의해 분리될 수 있다. 예로서, 고유 도메인을 갖는 나선은 구조체에서 고유 도메인이 결핍된 나선과 번갈아 나올 수 있다.

따라서, 일부 경우에, 핵산 구조체는 1개 이상의 고유 도메인을 각각 갖는 2개 이상의 나선을 포함할 수 있고, 여기서 이 도메인은 개별 나선 자체에 관해서는 고유하고, 전체로서 이 구조체에 관해서도 아마 고유할 것이다. 개별 나선 내의 고유 도메인(들)은 이 구조체 내 다른 나선에 존재할 수 있다. 개별 나선 내의 고유 도메인(들)은 이 구조체 내 다른 나선의 고유 도메인(들)일 수 있다.

일부 경우에, 이 구조체 내 1개 이상의 나선 각각은 전체적으로 고유 도메인으로 구성될 수 있고, 이는 이 도메인 각각이 나선 당 한번만 존재하거나 구조체 당 한번만 존재하는 것을 의미한다.

따라서, 일부 경우에, 본 발명의 핵산 구조체는 1개 이상의 고유 이중 나선을 포함한다. 고유 이중 나선은 이 구조체 내 임의의 다른 나선과 상이한 도메인 조성을 갖는 나선이다. 그러므로, 고유 이중 나선은 또한 이 구조체 내의 임의의 다른 나선과 상이한 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

또 다른 경우에, 본 발명의 핵산 구조체가 고유 도메인으로 구성된 한 영역 및 비-고유 또는 반복 도메인으로 구성된 다른 영역을 포함하도록 디자인될 수 있다.

이 구조체는 적어도 부분적으로 단일 용기에서 복수개의 알려진 올리고뉴클레오티드를 어닐링하여 형성된다. 이것은 도 4에 예시된다. 이 도면은 예측된 격자 구조체 및 어닐링 후 과정의 AFM 영상의 개략도를 도시한다. 어닐링 후 과정의 겔 전기영동 분석은 2개의 밴드(band), 결합되지 않은 올리고뉴클레오티드에 상응하는 하나 및 이 구조체에 상응하는 하나를 도시한다. 이 방법은, 특정 크기의 격자를 생성하는데 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드의 알려진 풀로 시작하여, 선택된 올리고뉴클레오티드가 상이한 형상 및/또는 크기의 구조체를 형성하기 위해서 이 풀에서 제외될 수 있다는 것을 제공한다.

이 방법을 사용하여 만들어질 수 있는 다양한 구조체는 도 5a(상단)에 도시된다. 또한, 이러한 방법으로부터 생성되는 어닐링 후 생성물이 도시된다. 삼각형 구조체를 생성하는데 사용될 수 있는 상세한 올리고뉴클레오티드 지도가 도 5b, 5bb, 5bc 및 5c에 제공된다. 관-형상의 구조체를 생성하는데 사용될 수 있는 상세한 올리고뉴클레오티드 지도가 도 5d, 5da, 5db, 5dc 및 5dd에 제공된다. 본 발명은 또한 구조체에서 내부 올리고뉴클레오티드의 제외를 고려한다. 예로서, 도 6은 내부가 빈 패턴(즉, 임의의 올리고뉴클레오티드가 결핍된 정해진 영역)을 갖는 구조체를 예시한다.

따라서, 일부 경우에, 최종 사용자가 이 구조체 내의 각 위치에 존재하는 특정 올리고뉴클레오티드의 지식으로, 예를 들면, 특정 길이 및 폭 치수를 갖는 격자와 같은 핵산 구조체를 디자인한다. 실제로, 최종 사용자는 이 구조체 내의 각 올리고뉴클레오티드의 정확한 위치를 표시한 물리적인 지도를 갖는다. 지도 내(따라서 핵산 구조체 내) 각 위치에서의 각 올리고뉴클레오티드의 본질의 지식은 최종 사용자가 시작점으로 특정 구조체를 사용하여 특정 패턴 또는 형상을 조작하게 한다. 이러한 조작은 핵산 구조체를 형성하기 위해 조합된 올리고뉴클레오티드의 혼합물로부터 1개 이상의 알려진 올리고뉴클레오티드를 제외하고(거나) 추가로 알려진 올리고뉴클레오티드를 포함하여 일어날 수 있다.

따라서, 예 및 본원에서 입증된 것으로, 최종 사용자는 특정 길이 및 폭을 갖고, 복수개의 고유한 올리고뉴클레오티드로 구성된 2차원 격자를 디자인할 수 있다. 최종 사용자는 격자 내 각 자리에 올리고뉴클레오티드의 본질을 안다. 격자 그 자체를 합성할 수 있는 것 외에, 최종 사용자는 시작점으로 격자를 사용하여 1개 이상의 다른 핵산 구조체를 디자인하고 합성할 수도 있다. 본원에 입증된 바와 같이, 다양한 형상의 핵산 구조체는 전체 격자를 만드는데 사용될 풀에서 1개의 그리고 보통 그 이상의 올리고뉴클레오티드를 제외하여 합성될 수 있다. 이 형상은 격자 또는 내부에 틈 또는 구멍이 있는 다른 구조체뿐 아니라 하트 형상, 갈매기형 및 삼각형을 포함한다.

그러므로, 본 발명은 다시 각 구조체를 디자인해야 함 없이 다수의 상이한 핵산 구조체를 합성하는 방법을 제공한다. 오히려, 초기 핵산 구조체, 예컨대 격자로 시작하여, 다양한 다른 핵산 구조체가 사전 선택된 올리고뉴클레오티드를 제외하고(거나) 사전 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하여 단순하게 형성될 수 있다. 이 방식으로, 원하는 핵산 구조체의 궁극적인 형상 및 크기에 따라 달라지는 복수개의 구성원을 포함하거나 제외하여, 최종 사용자는 모듈형 방식으로 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 복수개의 올리고뉴클레오티드 구성원 간의 상호작용이 상당히 변화할 것으로 예측되지 않으므로, 최종 사용자가 모든 새로운 핵산 구조체를 본질적으로 처음부터 디자인할 필요가 없다. 대신에, 최종 사용자는 원하는 형상, 크기 및 복잡성의 핵산 구조체를 형성하기 위해, 이 구조체 내 상대 빈도에 해당하는 상대 농도에서 그리고 단일 용기에서 각 올리고뉴클레오티드의 스톡(stock)을 제조하고 각종 스톡을 함께 조합한다.

원하는 형상 및 크기의 핵산 구조체에서 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 선택 및 배열은 수동으로 또는 컴퓨터 알고리즘에 의해 행해질 수 있다. 이러한 컴퓨터 알고리즘의 예는 공공에서 공연히 이용가능한 유니퀴머이다.

앞선 도면 중 일부에 예시된 바와 같이, 본 발명의 핵산 구조체의 크기는 어닐링 과정 동안 조절될 수 있다. 이 크기 조절은 1개 이상의 고유 도메인, 또는 1개 이상의 고유 나선을 갖는 구조체를 디자인해서 어닐링 과정에서 선택된 군의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 달성된다. 따라서, 핵산 구조체의 크기도 전형적으로 정해진다.

핵산 구조체의 크기는 그것의 치수들 중 1, 2 또는 3개의 거리로 표현될 수 있다. 이러한 치수는 각각 독립적으로 나노미터 또는 마이크로미터 길이, 또는 그 이상일 수 있다. 예로서, 이 구조체는 10-100 나노미터, 10-500 나노미터, 또는 10-1000 나노미터를 비롯하여, 5-100 나노미터, 5-500 나노미터, 5-1000 나노미터의 범위의 길이를 갖는 1 또는 2개의 치수를 포함한다. 일부 실시태양에서, 이것은 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 nm 또는 그 이상의 1 이상의 치수를 가질 수 있다. 일부 실시태양에서, 이 구조체는 약 3 nm 곱하기 7 nm 또는 약 4 nm 곱하기 7 nm이다. 일부 실시태양에서, 이 구조체는 60 nm 곱하기 100 nm이다.

핵산 구조체의 크기는 이중 나선의 개수뿐 아니라 이 이중 나선의 길이로 제시될 수 있다. 이중 나선의 길이는 이 나선 내 나선 회전의 수로 나타내어질 수 있다. 본 발명이 나노미터 및 마이크로미터 규모, 및 그 이상인 구조체를 만드는 것을 고려한다는 것이 이해되어야 한다.

또한, 핵산 구조체의 크기는 포함되는 4-도메인 올리고뉴클레오티드(SST)의 수로 제시될 수 있다. 이 범위는 1 내지 1000 초과일 수 있다. 본원에 예시된 많은 구조체는 310개의 SST와 동일하거나 그 미만으로 구성된다. 그러나, 핵산 구조체에 기여하는 SST의 수가 원하는 구조체의 크기 및/또는 변형의 정도 및/또는 원하는 복잡성에 따라 달라질 수 있다. 예시된 구조체 중 일부는 이전에 발표된 원-포트 어닐링 구조체에 비해 적어도 4배 더 많은 별개의 분자 성분을 포함한다.

또한, 핵산 구조체의 크기는 포함되는 뉴클레오티드의 수로 제시될 수 있다. 본원에 예시된 구조체 중 일부는 약 15,000개 이상의 뉴클레오티드를 포함하고, 일부는 약 45,000개의 뉴클레오티드를 포함한다. 예시된 구조체 중 일부는 전형적인 DNA 오리가미 구조체(즉, 단일 스캐폴드 가닥 및 복수개의 스테이플 가닥으로 구성된 구조체)보다 3배 이상 더 많은 뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명의 핵산 구조체는 임의의 형상 또는 형태를 취할 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하여 형성될 수 있는 각종 형상 및 형태의 예가 도 5a, 5b, 5ba, 5bb, 5bc, 5c, 5ca, 5cb, 5cc, 5d, 5da, 5db, 5dc, 5dd, 6, 7, 11, 11a 및 11b에 예시된다. 중요한 점은, 본 발명의 방법을 사용하여, 구조체 내 모든 위치에 올리고뉴클레오티드의 본질(따라서 서열)의 지식에 기초한 정확한 조절로 핵산 구조체의 형상, 형태 및 크기를 정해서 미리 디자인하는 것이 가능하다. 이 방법의 효율은 첫 번째 시도에서 관심있는 110개의 구조체 중 103개를 생성하는 94 % 성공 비율로 증명된다. 첫 번째 시도에서 생성되지 않은 7개의 구조체 중 4개는 주로 좁은 연결점 및 영역을 제거하여 약간 재디자인되었고, 이어서 그 후 성공적으로 생성되었다. 현저하게, 예를 들면 310개의 올리고뉴클레오티드 풀의 상이한 서브세트를 사용하여 만들어진 상이한 구조체는 상이한 구조체가 동일한 SST를 포함했을 때도 구조적 일체성의 손실없이 합성 및 정제 후에 혼합될 수 있었다.

본원에 논의된 바와 같이, 핵산 구조체는 단일 어닐링 반응으로 복수개의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 조합하고 어닐링하여 합성되어 원하는 형상, 크기, 복잡성 및 변형의 핵산 구조체를 수득할 수 있다. 또한, 본 발명은 모듈형 방식으로, 분리된 더 작은 핵산 구조체 서로의 어닐링에 의한 핵산 구조체의 합성을 고려한다. 4개의 이중 나선 정사각형 구조체 및 L-형상의 구조체가 별도로 만들어지고, 이어서 서로 조합되고 어닐링되어 8개의 이중 나선 정사각형을 형성하는 이 접근법은 도 8, 8a 및 8b에 예시된다. 이에 따라, 본 발명의 구조체는 도 4에 예시된 것처럼 올리고뉴클레오티드 서로의 어닐링으로부터 및/또는 도 8, 8a 및 8b에 예시된 것처럼 더 작은 구조체를 서로 어닐링하여 만들어질 수 있다. 이 접근법은 격자-형상의 구조체 서로를 그리고 관-형상의 구조체 서로를 함께 융합시키는데 사용되었다. 또한, 이러한 융합은 초기 합성 어닐링 반응 용액으로부터 이 구조체를 정제할 필요없이 일어날 수 있다. 따라서, 정제되든지 안되든지, 이 구조체는 조합되고 어닐링될 수 있다.

일부 실시태양에서, 이 구조체는 승온에 있은 후 서냉 과정을 받아 어닐링된다. 승온은 약 50 ℃, 약 45 ℃, 또는 약 40 ℃일 수 있고, 냉각 과정은 약 실온(예컨대, 약 25 ℃)으로 용액을 냉각시키는 것으로 의도된다. 냉각 기간은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10시간 또는 그 이상을 포함하는 몇 시간일 수 있다. 별법으로, 핵산 구조체는 동일한 시간 길이 동안 예를 들면 실온을 포함하는 단일 온도에서 조합되고 어닐링하게 될 수 있다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 동시에 일어나는 모든 구조체의 혼합 및 어닐링과 비교하여, 구조체의 엇갈리거나 순차적인 추가(및 어닐링)를 고려한다. 순차적인 추가는 더 복잡한 구조체의 합성에 특히 유용할 수 있다. 일부 경우에, 이 방법 및 다른 방법이 정적 환경에서 또는 유동하에서 수행될 수 있다. 유동 환경은 어닐링되지 않은 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 구조체가 후속 성분의 추가 전에 제거되게 한다.

또한, 본 발명은 복수개의 핵산 구조체를 제공한다. 본원에 사용된 용어 복수개(복수물)는 1개 초과를 의미하고, 용어 군과 교환가능하게 사용될 수 있다. 이러한 복수물은 10, 50, 100, 500, 1000개 또는 그 이상의 구조체를 포함할 수 있다. 이러한 복수물은, 이 복수물 중 핵산 구조체의 백분율이 크기, 형상, 복잡성 및/또는 변형과 관련하여 서로 동일한 것을 의미하는 동질성의 여러 정도를 가질 수 있다. 그러므로, 복수개의 구조체는 특정 특징을 갖는 구조체에서 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % 이상 또는 100 % 동질성 일 수 있다. 예로서, 복수개의 격자 형상의 구조체는 이 복수개의 구조체 중 50 % 이상이 격자 형상인 것을 의미하는 50 % 이상 동질성일 수 있다.

이러한 복수물은 그 구성원이 크기, 형상, 복잡성 및/또는 변형을 포함하는 하나 이상의 특징 면에서 동일할 수 있다는 것을 의미하는 단순 분산일 수 있다. 이 복수물은 이 특징 모두에 대해 단순 분산일 수 있다. 일부 경우에, 이 복수물은 실질적으로 단순 분산이다. 실질적으로 단순 분산은 구조체 중 적어도 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 또는 그 이상이 대략 동일한 형상, 크기, 복잡성의 것이고(거나) 동일한 변형을 가지는 것인 복수물을 지칭한다. 일부 실시태양에서, 이 구조체 중 적어도 10 %, 20 %, 30 %, 40 % 또는 그 이상이 대략 동일한 형상, 크기, 복잡성의 것이고(거나) 동일한 변형을 갖는다. 예시적인 복수물이 도 12에 도시된다.

복수물의 동질성(역으로 이질성)의 정도는 AFM 또는 TEM, 및 겔 전기영동법을 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 이 기술은 실시예에서 논의된 바와 같이, 제조된 군의 구조체에서 동질성 정도를 결정하는데 사용되었다. 중요한 점은, 본원에 제공된 어닐링 방법이 지배적인 핵산 구조체 화학종을 갖는 군을 재현할 수 있게 수득한다는 것을 밝혀내었다. 게다가, 그 지배적인 화학종은 본 발명의 디자인 및 지도 작성 접근법을 사용하는 것으로 의도되는 화학종과 동일하게 나타난다.

다수의 도면에 예시된 바와 같이, 일부 경우에, 핵산 구조체가 형성되면, 단일 가닥인 도메인이 또한 존재할 수 있다. 이것은 예를 들면 가장자리에 존재할 수 있다. 이러한 가장자리는 도면에 제공된 구조체의 왼쪽 및 오른쪽 가장자리로 표현된다. 이러한 도메인의 성질이 어닐링 과정의 효율 및 수득률에 영향을 줄 수 있다는 것이 본 발명에 따라 밝혀졌다. 더 구체적으로, 이 단일 가닥 영역이 혼합된 뉴클레오티드 서열의 것이면, 이 구조체는 좀 더 응집할 것이고 수득률은 감소된다. 이러한 응집은 이 단일 가닥 영역의 뉴클레오티드 서열을 처리하여 감소될 수 있다. 구체적으로, 서열 내 폴리 T인 단일 가닥 영역은 응집을 덜 일으킬 것이며, 구조체의 더 나은 수득률을 야기한다. 이 폴리 T 도메인은, 예를 들면, 도 3b, 3c, 3d, 3e, 3ea, 3eb, 3ec, 3ed, 3f, 3fa, 3fb, 3fc 및 3fd에 도시되고, 도메인에서 티미딘의 수를 명시하기 위해 T10 또는 T11로 표현된다. 또한, 폴리 A 및 폴리 C 서열이 사용될 수 있다. 그러므로, 일부 실시태양에서, 특정 단일 가닥 도메인이 구조체에 존재할 수 있고 이러한 도메인은 서열에서 서로 동일할 수 있다.

특정 실시태양에서, 만약 이 구조체가 실질적으로 응집하지 않으면, 가장자리 영역은 폴리 T 도메인 및 혼합된 서열의 다른 도메인의 혼합으로 구성될 수 있다. 이 경우에, 혼합된 서열 도메인은, 예를 들면 도 8, 8a 및 8b에 도시된 바와 같이, 2개 이상의 구조체를 서로 어닐링하는데 사용될 수 있다. 이러한 도메인의 수는 6, 8, 10개 또는 그 이상일 수 있다.

본 발명의 구조체는 합성 동안 또는 합성 후에 변형될 수 있다. 이것은 변형된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 합성 동안 변형될 수 있다. 예를 들면, 구조체를 생성하는데 사용된 1개 이상의 올리고뉴클레오티드는 관심있는 성분에 접합될 수 있다. 변형된 올리고뉴클레오티드는, 이러한 변형이 원하는 구조체를 형성하기 위해 필요로 하는, 다른 올리고뉴클레오티드에 결합하는 올리고뉴클레오티드의 능력을 방해하지 않는다면, 본 발명의 구조체를 생성하는데 사용될 수 있다. 추가적으로 또는 별법으로, 이 구조체는 합성 후에 변형될 수 있다.

달리 변형에 의해 의도되지 않았지만, 올리고뉴클레오티드 서로의 어닐링을 방해하지 않고, 이 구조체를 덜 안정하게 만들지 않는다면, 임의의 변형이 고려된다. 변형은 사실상 화학적 또는 효소적일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 변형은 핵산 접합 성분의 사용을 수반할 수 있다. 이 성분은 사실상 금속, 유기 및 무기일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 이 성분은 인식할 수 있고 구조체 내 올리고뉴클레오티드에 결합하는 핵산에 접합될 수 있다. 이러한 핵산은 예로써 3중 형성 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 다른 경우에, 1개 이상의 비-핵산 성분은 이 구조체에 영구적으로 또는 일시적으로, 공유 결합으로 또는 비공유 결합으로 부착될 수 있다. 본 발명은 고유 및/또는 비-고유한 올리고뉴클레오티드가 변형될 수 있다는 것을 고려한다. 구조체 내의 올리고뉴클레오티드는 그 자체가 그 구조체에 기여하지 않고 그 구조체에 성분을 결합하는데 사용되는 1개 이상의 도메인에 접합될 수 있다. 구조체 내의 각 올리고뉴클레오티드 및 각 도메인의 위치가 정해질 수 있기 때문에, 궁극적으로 생성되는 구조체에 대한 각 변형의 위치도 정해질 수 있음이 이해되어야 한다. 바꿔 말하면, 구조체 내의 각 올리고뉴클레오티드의 위치의 지식이 이 구조체의 주소 지정 능력을 용이하게 한다.

단일 가닥 올리고뉴클레오티드:

본 발명의 핵산 구조체는 서열-특이적 방식으로 서로 어닐링하는 복수개의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 사용하여 디자인되고 만들어진다. 올리고뉴클레오티드는 이것의 길이, 서열, 및 도메인 조성에 의해 특성화될 수 있다. 이것의 도메인의 개수 및 서열은 각 올리고뉴클레오티드의 결합 활성 및 위치를 지배한다. 이것의 도메인 개수는 전형적으로 구조체에서 각 올리고뉴클레오티드가 결합할 올리고뉴클레오티드의 수를 지배한다.

일부 경우에, 구조체를 만드는데 사용되는 올리고뉴클레오티드는 짝수개의 도메인을 포함한다. 각 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 2개 이상의 도메인을 포함한다. 일부 실시태양에서, 구조체를 만드는데 사용되는 올리고뉴클레오티드는 2- 및 4-도메인 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 2- 및 6-도메인 올리고뉴클레오티드, 3- 및 6-도메인 올리고뉴클레오티드, 2- 및 8-도메인 올리고뉴클레오티드, 4- 및 8-도메인 올리고뉴클레오티드 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 올리고뉴클레오티드의 다른 조합을 사용하여 구조체를 형성하는 것이 또한 가능하다.

본원에 사용된 도메인은 뉴클레오티드 서열을 지칭한다(즉, 보체에 서열-특이적 방식으로 결합하는 능력을 가진 다수개의 인접 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 유사체). 복수개의 올리고뉴클레오티드 내의 또는 핵산 구조체 내의 도메인은 다른 올리고뉴클레오티드 내 도메인에 어닐링되도록 디자인된다. 올리고뉴클레오티드의 모든 도메인의 공동 상보성은 이러한 올리고뉴클레오티드의 자기-조립을 용이하게 하여 핵산 구조체를 형성한다.

도메인 길이는 달라질 수 있다. 동일한 나선에 기여하는 2개의 인접한 도메인의 조합된 길이는 전형적으로 h x k인 길이를 가질 것이고, 여기서 h는 완전한 나선 회전을 만드는데 필요한 단량체 단위(예를 들면 뉴클레오티드와 같음)의 개수를 나타내고 k는 1 이상의 임의의 정수를 나타낸다. 예로서, RNA의 경우, 나선 회전 당 11개의 뉴클레오티드가 존재하는 반면, B형 DNA의 경우, 전형적으로 나선 회전 당 10.5개의 뉴클레오티드가 존재한다. 따라서, 사실상 B형 DNA인 도메인의 경우, 동일 나선에 기여하는 2개의 인접한 도메인의 조합된 길이는 10.5 * k(가장 가까운 정수로 반올림)로 나타내질 수 있고, 여기서 k는 1 이상의 정수를 나타내고, *는 곱하기 부호를 의미한다.

동일한 올리고뉴클레오티드로부터의 2개의 인접한 도메인이 동일한 나선에 기여하고 있는 상황에서, 2개의 도메인의 길이는 상호관련성이 있을 것이다. 2개의 이러한 도메인의 조합된 길이는 x로 가정하고, 여기서 x는 상기 정의된 h * k이다. 이 경우, y가 1 이상이면, 1개의 도메인은 y의 길이를 갖고 다른 도메인은 x-y의 길이를 갖는다. 예로서, 한 실시태양에서, 제1 및 제2 DNA 도메인 각각은, 2개의 도메인의 조합된 길이가 21개의 뉴클레오티드이면, 1-20개의 뉴클레오티드 길이 범위일 수 있다.

일부 실시태양에서, 동일한 나선에 기여하는 2개의 인접한 도메인은 약 21개 +/- 2개의 뉴클레오티드의 길이 또는 10.5의 임의의 정수 배수개의 뉴클레오티드의 조합된 길이를 가질 수 있다. 따라서, 단일 도메인은 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 2개의 인접한 도메인은 예를 들면, 19, 20, 21, 22 또는 23개의 뉴클레오티드의 총 조합된 길이를 가질 수 있다. 2-도메인 올리고뉴클레오티드는 예를 들면, 21개 +/- 2개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 4-도메인 올리고뉴클레오티드는 예를 들면, 42개 +/- 4개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다.

따라서 일반적으로, 상기 정의된 총 길이 x = h * k와 동일한 이중나선에 참여하는 2개의 연속적인 도메인에서, x는 h * k +/- a일 수 있고, 여기서 a= 0, 1, 2, …, y이고, y = (h/2) * k(가장 가까운 정수로 반올림)이다. 예를 들면, 한 실시태양에서, h = 11(RNA의 경우), k = 1, 및 y = 6이다. 그러므로, x는 11 +/- 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일 수 있다. 다른 예로서, h = 10.5(B형 DNA의 경우), k = 2, y = 10이다. 그러므로, x는 21 +/- 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 수 있다.

일부 중요한 실시태양에서, 도메인은 10 또는 11개의 뉴클레오티드 길이를 갖고, 2개의 인접한 도메인은 21개의 뉴클레오티드 길이를 갖고, 4-도메인 올리고뉴클레오티드는 42개의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 본 발명이 21 배수개의 뉴클레오티드인 길이를 갖는 2개의 인접한 도메인(모두 단일 나선에 기여함)을 갖는 올리고뉴클레오티드를 고려한다는 것이 이해되어야 한다.

첫 번째 숫자는 첫 번째 도메인의 길이를 나타내고, 두 번째 숫자는 두 번째 도메인의 길이를 나타내고, 세 번째 숫자는 세 번째 도메인의 길이를 나타내고, 네 번째 숫자는 네 번째 도메인의 길이를 나타내고 네 개의 도메인이 도 1에서와 같이 배열되는, 10-11-11-10, 11-10-10-11, 11-10-11-10, 및 10-11-10-11과 같은 도메인 길이 조합이 본 발명에 의해 고려된다.

전형적으로 주어진 합성 방법 또는 생성된 구조체에서, 동일한 개수의 도메인을 갖는 올리고뉴클레오티드는 또한 동일한 길이를 가질 것이다. 예로서, 한 실시태양에서, 모든 4-도메인 올리고뉴클레오티드는 동일한 길이일 것이고 모든 2-도메인 올리고뉴클레오티드는 동일한 길이(그러나 이 길이는 4-도메인 올리고뉴클레오티드의 것과 상이할 것이다)일 것이다. 더 구체적으로, 일부 실시태양은 하나의 길이(예컨대, n 뉴클레오티드)인 4-도메인 올리고뉴클레오티드 및 그 길이의 반(예컨대, n/2 뉴클레오티드)인 2-도메인 올리고뉴클레오티드를 사용할 것이다.

4-도메인 "내부" 올리고뉴클레오티드는 본 발명의 구조체를 위한 단량체 단위를 나타낸다. 독립 단량체로서, 4-도메인 올리고뉴클레오티드는 잘 규정된 구조체를 갖지 않는다. 그러나, 이웃하는 2- 및/또는 4-도메인 올리고뉴클레오티드와의 상호작용시, 이것은 타일형 형상으로 폴딩한다. 이것은 규정된, 구조적으로 경질(또는 반경질)인 몸체 및 몇몇 점착성 말단을 갖는 다중가닥 구조체로 독립적으로 폴딩하는 이전 타일 단량체와 대비된다.

본 발명은 임의의 개수의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조체를 고려한다. 예로서, 핵산 구조체는 올리고뉴클레오티드를 제한없이 겨우 4개만을 포함할 수 있고 무려 1000개(또는 그 이상)나 포함할 수도 있다. 유사하게, 핵산 구조체를 생성하는데 사용되는 복수개의 올리고뉴클레오티드는 제한없이 올리고뉴클레오티드 중 겨우 4개의 상이한 유형만을(뉴클레오티드 서열에 의해 정의됨) 포함할 수 있고 무려 1000개(또는 그 이상)의 상이한 올리고뉴클레오티드 화학종(뉴클레오티드 서열에 의해 정의됨)을 포함할 수도 있다. 따라서, 실시태양에 따라, 핵산 구조체는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500개, 또는 그 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 유사하게 실시태양에 따라, 핵산 구조체를 생성하는데 사용되는 복수개의 올리고뉴클레오티드는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500개 또는 그 이상의 상이한 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본 발명에 관련해서, 올리고뉴클레오티드는 D형 DNA 및 L형 DNA와 같은 DNA 및 RNA뿐 아니라 이들의 각종 변형을 포함한다. 변형은 염기 변형, 당 변형, 및 백본 변형을 포함한다. 이들의 비제한적인 예가 하기에 제공된다.

본 발명에서 사용될 수 있는 DNA 변이체의 비제한적인 예는 L-DNA(문헌에서 알려진 DNA의 백본 거울상이성질체), 펩티드 핵산(PNA) 비스PNA 클램프(clamp), 의사상보적 PNA, 잠금 핵산(LNA), 또는 DNA-LNA 공핵산과 같은 상기의 공핵산이다. 본 발명의 생성물 및 방법에 사용되는 올리고뉴클레오티드가 사실상 동질이거나 이질일 수 있음이 이해되어야 한다. 예로서, 이것은 사실상 완벽하게 DNA일 수 있거나 이것은 DNA 및 비-DNA(예컨대, LNA) 단량체 또는 서열로 구성될 수 있다. 따라서,핵산 원소의 임의의 조합이 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 변형은 올리고뉴클레오티드가 특정 조건하에서 더 안정하고(거나) 분해에 덜 민감하게 만들 수 있다. 예를 들면, 일부 경우에, 이 올리고뉴클레오티드는 핵산분해효소-저항성이다.

올리고뉴클레오티드는 동질인 백본(예컨대, 전제적으로 포스포디에스테르 또는 전체적으로 포스포로티오에이트) 또는 이질인(또는 키메라성) 백본을 가질 수 있다. 포스포로티오에이트 백본 변형은 올리고뉴클레오티드가 핵산분해효소에 덜 민감하게 하여 특정 조건 하에서 더 안정하게 만들 수 있다(본래의 포스포디에스테르 백본 핵산와 비교할 때). 올리고뉴클레오티드에게 더 많은 안정성을 제공할 수 있는 다른 연결은 포스포로디티오에이트 연결, 메틸포스포네이트 연결, 메틸포스포로티오에이트 연결, 보라노포스포네이트 연결, 펩티드 연결, 알킬 연결, 데포스포형 연결 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 따라서, 일부 경우에, 올리고뉴클레오티드는 비-자연적으로 발생하는 백본을 갖는다.

올리고뉴클레오티드는 시험관에서 합성될 수 있다. 또한, 자동 핵산 합성을 비롯한, 핵산 합성 방법은 당업계에 알려져 있다. 변형된 백본, 예컨대 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 백본을 갖고, 키메라 변형된 백본을 포함하는 것을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 포스포르아미데이트 또는 H-포스포네이트 화학반응 중 하나를 이용하는 자동 기술을 사용하여 합성될 수 있다. (문헌[F. E. Eckstein, "Oligonucleotides and Analogues - A Practical Approach" IRL Press, Oxford, UK, 1991], 및 문헌[M. D. Matteucci and M. H. Caruthers, Tetrahedron Lett. 21, 719 (1980)]) 아릴- 및 알킬-포스포네이트 연결은, 예컨대 미국 특허 번호 4,469,863에 기술된 바와 같이 만들어질 수 있고, 알킬포스포트리에스테르 연결(하전된 산소 성분이 알킬화된)은, 예컨대 미국 특허 번호 5,023,243 및 유럽 특허 번호 092,574에 기술된 바와 같이, 시판되는 시약을 사용하는 자동 고체상 합성에 의해 제조될 수 있다. 다른 DNA 백본 변형 및 치환체를 만드는 방법이 기술되어 왔다. 문헌[Uhlmann E et al. (1990) Chem Rev 90:544]; 문헌[Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1:165]; 문헌[Crooke ST et al. (1996) Annu Rev Pharmacol Toxicol 36:107-129]; 및 문헌[Hunziker J et al. (1995) Mod Synth Methods 7:331-417] 참조.

올리고뉴클레오티드는 추가적으로 또는 별법으로 그 당 내 변형을 포함한다. 예를 들면, β-리보스 단위 또는 β-D-2'-데옥시리보스 단위가 변형된 당 단위에 의해 교체될 수 있고, 여기서 변형된 당 단위는, 예를 들면 β-D-리보스, α-D-2'-데옥시리보스, L-2'-데옥시리보스, 2'-F-2'-데옥시리보스, 아라비노스, 2'-F-아라비노스, 2'-O-(C₁-C₆)알킬-리보스로부터 선택되고, 바람직하게는 2'-O-(C₁-C₆)알킬-리보스는 2'-O-메틸리보스, 2'-O-(C₂-C₆)알케닐-리보스, 2'-[O-(C₁-C₆)알킬-O-(C₁-C₆)알킬]-리보스, 2'-NH₂-2'-데옥시리보스, β-D-크실로-푸라노스, α-아라비노푸라노스, 2,4-디데옥시-β-D-에리트로-헥소-피라노스, 및 카르보시클릭(예를 들면, 문헌[Froehler J (1992) Am Chem Soc 114:8320]에 기술됨) 및/또는 열린-사슬 당 유사체(예를 들면, 문헌[Vandendriessche et al. (1993) Tetrahedron 49:7223]에 기술됨) 및/또는 바이시클로당 유사체(예를 들면, 문헌[Tarkov M et al. (1993) Helv Chim Acta 76:481]에 기술됨)이다.

올리고뉴클레오티드는 그 염기 내 변형을 포함할 수 있다. 변형된 염기는 변형된 시토신, 예컨대 5-치환된 시토신(예컨대, 5-메틸-시토신, 5-플루오로-시토신, 5-클로로-시토신, 5-브로모-시토신, 5-아이오도-시토신, 5-히드록시-시토신, 5-히드록시메틸-시토신, 5-디플루오로메틸-시토신, 및 비치환되거나 치환된 5-알키닐-시토신), 6-치환된 시토신, N4-치환된 시토신(예컨대, N4-에틸-시토신), 5-아자-시토신, 2-머캅토-시토신, 이소시토신, 슈도(pseudo)-이소시토신, 고리 시스템이 축합된 시토신 유사체(예컨대, N,N'-프로필렌 시토신 또는 페녹사진), 및 우라실 및 그의 유도체(예컨대, 5-플루오로-우라실, 5-브로모-우라실, 5-브로모비닐-우라실, 4-티오-우라실, 5-히드록시-우라실, 5-프로피닐-우라실), 변형된 구아닌, 예컨대 7-데아자구아닌, 7-데아자-7-치환된 구아닌(예컨대, 7-데아자-7-(C2-C6)알키닐구아닌), 7-데아자-8-치환된 구아닌, 하이포크산틴, N2-치환된 구아닌 (예컨대, N2-메틸-구아닌), 5-아미노-3-메틸-3H,6H-티아졸로[4,5-d]피리미딘-2,7-디온, 2,6-디아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 퓨린, 인돌, 아데닌, 치환된 아데닌(예컨대, N6-메틸-아데닌, 8-옥소-아데닌), 8-치환된 구아닌(예컨대, 8-히드록시구아닌 및 8-브로모구아닌), 및 6-티오구아닌을 포함한다. 핵산은 보편적인 염기(예컨대, 3-니트로피롤, P-염기, 4-메틸-인돌, 5-니트로-인돌, 및 K-염기) 및/또는 방향족 고리계(예컨대, 플루오로벤젠, 디플루오로벤젠, 벤즈이미다졸 또는 디클로로-벤즈이미다졸, 1-메틸-1H-[1,2,4]트리아졸-3-카르복실산 아미드)를 포함할 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있는 구체적인 염기 쌍은 문헌[Yang et al. NAR, 2006, 34(21):6095-6101]에 의해 보고된 dZ 및 dP 비-표준 핵염기 쌍이다. dZ, 피리미딘 유사체는 6-아미노-5-니트로-3-(1'-β-D-2'-데옥시리보푸라노실)-2(1H)-피리돈이고, 이것의 왓슨-크릭(Watson-Crick) 상보서열 dP, 퓨린 유사체는 2-아미노-8-(1'-β-D-1'-데옥시리보푸라노실)-이미다조[1,2-a]-1,3,5-트리아진-4(8H)-원이다.

합성 방법:

본 발명은 어닐링 과정을 통한 핵산 구조체의 합성을 고려한다. 한 접근법에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드가 식별되고 합성되었을 때(예컨대, 바이오니어(Bioneer)와 같은 상업용 벤더를 사용하여), 이것은 단일 용기, 예컨대 제한되지는 않지만 관, 웰(well), 바이알 등에서 조합된다. 사용되는 올리고뉴클레오티드의 몰량은 원하는 구조체 내의 각 올리고뉴클레오티드의 빈도 및 원하는 구조체의 양에 따라 달라질 것이다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 등몰 농도로 존재할 수 있다. 일부 실시태양에서, 각 올리고뉴클레오티드는 약 100 nM의 농도로 존재할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 용액에 위치된다. 바람직하게 용액은, 어닐링 반응이 완충액의 부재하에서 일어날 수도 있음에도 완충된다. 용액은 추가로 2가 양이온, 예컨대 제한되지는 않지만 Mg² ⁺를 포함할 수 있다. 양이온 또는 염 농도는 달라질 수 있다. 예시적인 농도는 약 25 mM이다. 또한, 용액은 올리고뉴클레오티드의 분해를 방지하기 위해 EDTA 또는 다른 핵산분해효소 억제제를 포함할 수 있다.

어닐링 반응은 용액을 가열한 후 용액을 천천히 식히게 하여 수행된다. 반응 온도는 임의의 바람직하지 않은 2차 구조체, 예컨대 헤어핀 구조체를 용융시키고 올리고뉴클레오티드 화학종이 다른 비-상보성 올리고뉴클레오티드에 부정확하게 결합되지 않는다는 것을 확실히 하기에 충분히 높아야 한다. 그러므로, 온도를 일부 실시태양에서 약 100 ℃, 약 95 ℃, 약 90 ℃, 약 85 ℃, 80 ℃, 75 ℃, 70 ℃, 65 ℃ 또는 60 ℃로 초기에 올릴 수 있다. 열탕 배스 또는 가열 블록 내 용기 또는 온도를 조절할 수 있는 장치, 예컨대 PCR 기계를 위치시켜 온도를 올릴 수 있다. 용기는 수 초 또는 수 분 동안 그 환경에서 유지될 수 있다. 전형적으로, 약 1-10분의 인큐베이션이 충분하다.

승온에서 인큐베이션이 완성되면, 다수의 방식으로 온도를 떨어뜨릴 수 있다. 특정 양만큼 온도를 떨어뜨리고, 온도를 다시 떨어뜨리기 전에 특정 기간 동안 그 온도를 유지하는 컴퓨터 알고리즘을 사용하는 자동 방식으로 온도를 떨어뜨릴 수 있다. 이러한 자동 방법은 각 단계에서 1도씩 또는 각 단계에서 수 도씩 온도를 떨어뜨리는 것을 수반할 수 있다. 따라서, 용기는 동일한 장치에서 가열되고 냉각될 수 있다.

예시적인 과정이 제공된다. 약 90 ℃에서 약 25 ℃로의 온도의 하락을 이루기 위해, 온도를 1도 당 10분의 속도로 1도의 증분에서 90 ℃에서 61 ℃로 변화시킨다(즉, 10분 동안 90 ℃, 10분 동안 89 ℃ 등). 이어서, 온도를 1도 당 약 20분의 속도로 1도의 증분에서 60 ℃에서 25 ℃로 변화시킨다(즉, 20분 동안 60 ℃, 20분 동안 59 ℃ 등). 이 과정 동안의 총 어닐링 시간은 약 17시간이다. 본 발명에 따르면, 이 조건하에서, 올리고뉴클레오티드는 정해진 원하는 형상 및 크기의 핵산 구조체로 자기-조립한다.

별법으로, 용기는 예를 들면, 실온 환경(예컨대, 약 25 ℃)를 비롯한, 상이한 환경에 위치될 수 있다. 이것은 올리고뉴클레오티드를 정해진 방식으로 서로 어닐링하게 하기 위해여 연장된 기간 동안 거기에 유지된다. 식히는 기간은, 제한되지는 않지만 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20시간 또는 그 이상의 시간을 비롯한, 몇 시간 동안 계속될 수 있다. 일부 경우에, 식히는 기간은 20시간보다 더 길고 25, 30, 25, 40, 50, 55, 60시간, 또는 그 이상의 시간일 수 있다.

이 예는 트리스(Tris)-EDTA(TE) 중의 100 nM 올리고뉴클레오티드, 25 mM MgCl₂ 용액을 사용하고 약 90 ℃로 용액을 가열한 후 90 ℃와 61 ℃ 사이에서는 1도 당 10분의 하락 및 60 ℃와 25 ℃ 사이에서는 1도 당 10분의 하락으로 상기 기술된 바와 같이, 약 17시간의 기간에 걸쳐 약 25 ℃로 용액을 냉각시키는 특이적 어닐링 과정을 기술한다.

자기-어닐링에 대한 또 다른 세트의 조건은 TE/Mg² ⁺ 완충액(20 mM 트리스, pH 7.6, 2 mM EDTA, 12.5 mM MgCl₂) 및 동일한 온도 감소 과정을 포함한다.

올리고뉴클레오티드의 화학량비는 엄밀하게 조절될 필요는 없다.

어닐링 과정 후에, 반응 혼합물은 바로 사용될 수 있거나, 이것은 핵산 구조체 생성물을 추가로 단리시키기 위해 더 분획될 수 있다. 예로서, 반응 혼합물은 다른 구조체 또는 기재들로부터 관심있는 구조체를 물리적으로 분리시키기 위해, 겔 전기영동법, 예컨대 2 % 천연 아가로스 겔 전기영동법을 받을 수 있다. 전형적으로, 단일한 주 밴드가 관찰된다. 이 밴드는 예를 들면, 원심분리를 통해 겔로부터 추출되고 추가로 정제될 수 있다. 이어서, 정제된 생성물은 다시 겔 전기영동법을 받을 수 있고, 다시 단일 밴드가 예측된다. 이 정제된 생성물은 AFM 또는 TEM을 통해 영상화될 수 있다. 이러한 영상화는 정제된 생성물의 치수, 임의의 변형(예컨대, 스트렙타비딘 변형)의 정도 및 위치를 밝히고, 수득률 및 순도를 결정하는데 사용될 수 있다. 이러한 분석은 대략적으로 예측된 치수를 갖는 구조체의 형성을 밝혀내었다.

또한, 원하는 생성물의 수득률은 어닐링 후에 결정될 수 있다. "조립 수득률"은 천연 겔 전기영동법에 의해 먼저 추산될 수 있고, 샘플은 SYBR 세이프(safe)로 염색된다. 수득률("겔 수득률"로 지칭됨)은 원하는 생성물 밴드의 형광 강도 및 전체 래인(lane)의 것 간의 비율(배경 보정 후)로 계산된다. 그러므로, 이 비율은 수득률의 표지일 것이다. 측정된 겔 수득률은 6-40 % 범위이다. SYBR 세이프의 염색 효율에서 명백한 구조체 및 서열-의존적 변이가 존재하기 때문에, 이러한 비율은 과대평가일 수 있다는 것이 본 발명에 따라 밝혀졌다. 일부 경우에, 수득률은 측정된 겔 수득률의 약 60-100 %일 수 있다.

또한, 어닐링 과정의 효율은 AFM 분야에서 모든 식별할 수 있는 형상의 백분율로 "잘-형성된" 구조체의 분율을 측정하여 결정될 수 있다. 15 nm 지름보다 더 큰 예측된 외곽선에 결점이 없고 10 nm 지름보다 더 큰 내부에 결점이 없다면, 이 구조체는 "잘-형성된" 것으로 간주된다. 상기 기준에 따라, 약 20-85 %의 범위인 "잘-형성된" 비율, 또는 "AFM 수득률"이 구조체의 스펙트럼에 걸쳐 관찰되었다. 특정 경우에, 이 비율은, 일부 경우에 이 구조체의 상대적인 취약성 및 샘플 침착 또는 영상화 동안 일어날 것인 상당한 정제 후 손상으로 인해, 정제된 생성물 내의 "잘-형성된" 구조체의 실제 비율의 과소평가일 것이다. 이러한 취약성은 예를 들면, 4-올리고뉴클레오티드 SST의 2개의 말단의 라이게이션(ligation) 또는 이웃한 4-올리고뉴클레오티드 SST들의 가교를 통해 조립된 구조체로 더 많은 공유 결합을 도입하여 완화될 수 있다.

깊이를 갖는 일부 구조체(예컨대, 관 또는 배럴)의 경우, 잘-형성된 구조체의 정도는 TEM 영상화를 사용하여 결정될 수 있다. 이 경우에, TEM 수득률은 나선 회전 당 3.5 nm 추정에 기초하여, 예측된 완전한 길이(예컨대, 관 또는 배럴 길이)에서 5 nm 편차 내로 측정하는 식별할 수 있는 구조체(예컨대, 관 또는 배럴)의 백분율로 정의되었다.

본 발명은 본 발명의 구조체를 합성하기 위한 수동 또는 자동 수단을 고려한다. 자동 수단의 예, 컴퓨터 프로그램(예컨대, 매트랩(MATLAB) 프로그램)은 구조체가 만들어질 캔버스를 표시하는 그래픽 인터페이스를 제공한다(예컨대, 310-올리고뉴클레오티드 풀의 경우에, 직사각형 캔버스가 시작점이다). 캔버스에 원하는 구조체의 지도를 만들고, 구조체를 합성하는데 필요한 픽셀(또는 SST)을 식별한다. 또한, 이 프로그램은 액체 처리 로봇(브라보(Bravo), 애질런트(Agilent))을 사용하여 가닥 선발 및 혼합의 과정을 자동화하는데 도움이 될 수 있다. 따라서, 최종 사용자가 그래픽 인터페이스로 구조체의 지도를 만들시, 컴퓨터 프로그램은 후속 어닐링에 대해 적합한 가닥을 선발하고 혼합하기 위한 로봇 액체 처리기에 대한 지시를 출력한다. 이어서, 가닥 혼합물은 AFM 영상화를 위한 형상을 생성하기 위해 표준 원-포트 어닐링에서 사용된다. 각종 시험에서, 각 로봇 뱃치(batch)는, 형상 당 수 인간-노동 시간을 1 기계-시간으로 효율적으로 감소시켜 대략 48시간에 48개의 형상을 생성하는 것으로 밝혀졌고, 잠재적 인간 실수를 피한다. 이러한 로봇 시스템은 본원에 기술된 형상 중 44개를 생성하는데 사용되었다.

이 프로그램 인터페이스는 3가지 기능을 특징으로 한다: (1) 형상 디자인, (2) 피펫 서열 생성, 및 (3) 프로토콜 출력. 이 프로그램을 사용하여, 3가지 단계가 표적 형상을 디자인하고 형상에 대한 어닐링 전 가닥 혼합물을 생성하는데 수반된다. 먼저, 이 프로그램은 2D 격자("분자 캔버스")의 개략도를 표시하고, 사용자가 맨 처음부터 형상을 그리거나, 영상을 업로드하고 이것을 표적 형상으로 변환시키게 한다. 이어서, 구성하는 가닥의 목록이 형상에 대해 생성된다. 로봇에 의해 사용되는 96 웰 플레이트에서의 공급원 가닥 배열에 기초하여, 그 후 이 가닥 목록은 피펫 서열의 목록으로 전환된다. 최종적으로, 지시 세트(작동 세트)가 xml 형식으로 생성되고 로봇 제어 소프트웨어(VWorks, 애질런트)에 의해 바로 설치되고 실행될 수 있다.

복합 구조체:

본 발명은 추가로 본원에 기술된 핵산 구조체 그 자체가 더 높은 차수 또는 복합 구조체를 형성하기 위해, 본질적으로 단량체 또는 빌딩 블록으로 사용될 수 있다는 것을 고려한다. 본 발명의 복합 구조체는 스페이서-링커를 사용하여 서로 연결된 핵산 구조체로 구성된다. 이 링커는 적합한 작용기를 통해 이 구조체에 부착될 수 있음에도, 전형적으로 핵산 구조체에 필수불가결하지는 않다. 2개 이상의 핵산 구조체를 함께 부착하는 능력은 더 큰 크기 및 복잡성의 구조체가 만들어지게 한다. 이러한 구조체 및 배열의 예는 도 9에 도시된다.

이 복합 구조체의 치수는 제한 없이, 500 nm 내지 100 마이크로미터, 또는 1-1000 마이크로미터 범위일 수 있다.

용도:

본 발명의 핵산 구조체는 나노미터 또는 마이크로미터 규모에서 1개 이상의 성분을 정확하게 배치하고 중요하게 배열하는 능력에서 이익을 얻을 것을 포함하는 다양한 용도로 사용될 수 있다.

예로서, 이 구조체는 전자장치, 플라스마 장치, 및 양자 컴퓨터 용도에 유용한 것과 같은 무기 물질을 배열하거나 패턴화하는 템플릿으로 사용될 수 있다. 핵산 구조체에 부착될 수 있는 성분은 금속 입자, 예컨대 금 나노입자(참고문헌 5, 35), 양자점(참고문헌 6), 탄소 나노튜브(참고문헌 7) 등을 포함한다. 이 방식으로, 본 발명에 의해 제공된 핵산 구조체는 다른 성분이 배열될 수 있고(거나) 다른 구조체가 나노미터 정밀도 및 조절로 합성될 수 있는 스캐폴드로 작용한다. 예를 들면, 탄소 나노튜브는 기능성 분자 전자장치 시스템으로 조직화될 수 있고; 금 나노입자의 조정 가능한 기하학적 배열이 기능성 분자 전자장치 회로 및 신규한 플라스마 장치 회로를 만드는데 사용될 수 있고; 자기입자의 조직화된 정해진 배열이 나노-인덕터 또는 기억장치를 만드는데 사용될 수 있고; 양자점의 조직화되고 정해진 배열이 신규한 양자 컴퓨터를 만드는데 사용될 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 구조체가 전자장치에 대한 부품을 만들기 위해 금속화될 수 있다는 것을 고려한다. DNA 관은 나노 와이어로 금속화되었다(참고문헌 4, 15, 19). 본 발명의 핵산 구조체의 조절된 금속화는 다른 것들 중에서도 지름이 조절된 나노-와이어를 만들어서 조절된 전자 특성을 만드는데 사용될 수 있다. 추가로, 신규한 분자 전자 부품 및 회로가 본 발명에 의해 제공된 스트러트(strut) 기초의 핵산 구조체의 조절된 금속화를 통해 만들어질 수 있다.

핵산 구조체는 생물학적 또는 유기 분자에 대한 주형으로 사용될 수 있다. 이러한 주형화된 분자 및 시스템은, 예를 들면, 진단 및 연구 용도에서 유용할 수 있다. 생물학적 또는 유기 분자는 단백질 및 펩티드, 예컨대 항체 및 항체 단편, 효소 및 효소 도메인, 수용체 및 수용체 도메인, 생물학적 리간드, 예컨대 호르몬 및 다른 신호전달 성분, 폴리사카라이드, 세포, 세포 응집체 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다양한 전략이 DNA 격자 상의 주형 단백질에 대해 입증되었다(참고문헌 4, 23, 36). 프로그램 가능한 나노미터 정밀도를 갖는 규정된 기하학적 패턴으로의 단백질의 조직화는 예를 들면, 생물학적 모터 단백질의 협동 행동을 연구하는데 사용될 수 있다(참고문헌 37). 또한, 특정 핵산 구조체는 세포 또는 조직 배양에 사용될 수 있다. 이 실시태양에서, 예로서, 이 구조체는 생물학적 성분, 예컨대 성장 인자 및 세포외 기질 성분으로 기능화될 수 있다. 이 방식에서, 기능화된 구조체는 2 또는 3차원의 생체내 환경을 모방하기 위해 배양물에 배열될 수 있다. 추가 예로서, 더 높은 차수의 기능화 구조체가 임의의 특정 생물학적 성분에 대한 농도 구배를 나타내는 것으로 만들어질 수 있다는 것이 고려된다. 이어서, 이 시스템은 세포 개발, 많은 세포 유형에 대한 분화 및/또는 운동을 연구하는데 사용될 수 있다. 또 다른 경우에, 본 발명의 더 높은 차수의 구조체는 세포 성장 및 시험관내 또는 셍체내의 분화를 위한 스캐폴드로 사용될 수 있다.

이 다양한 용도에서, 본 발명은 추가로 본 발명의 구조체로 구성된 핵산 스캐폴드가 유지될 수 있거나 이것이 주형인 것을 그만둘 때, 이것이 제거(예컨대, 소화 또는 분해를 통해)될 수 있다는 것을 고려한다. 예를 들면, 목표가 금 입자의 정해진 배열을 생성하는 것이고, 이러한 입자가 핵산 스캐폴드와는 무관하게 원할 경우 서로에 대해 연결된다면, 스캐폴드는 제거되어, 금 나노입자 네트워크만 남을 수 있다.

하기 실시예는 예시의 목적을 위해 포함되고 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.

실시예

실시예 1.

물질 및 방법

샘플 제제. DNA 가닥은 인테그레이티드 DNA 테크놀로지, 인크.(Integrated DNA Technology, Inc.) 또는 바이오니어 코퍼레이션에 의해 합성되었다. 이 구조체를 조립하기 위해, 12.5 또는 25 mM MgCl₂로 보충한 0.5×TE 완충액(5 mM 트리스, pH 7.9, 1 mM EDTA)에서 대부분의 구조체(24H×28T 직사각형에 기초한 상이한 형상을 제외, 이것을 200 nM로 제조하였다)에 대해 가닥 화학종 당 100 nM의 대략 균등한 최종 몰농도로 DNA 가닥을 혼합하였다. 이 농도는 제작자 사양 시트에 기초하였고, 추가적인 사내 교정을 실행하였다. 따라서, 이 가닥에 대한 화학량비를 엄격하게 조절하지 않았다. 이어서, 이 혼합물을 상이한 냉각 프로그램으로 17-58시간의 기간에 걸쳐 90 ℃에서 25 ℃로 냉각시켜 PCR 열 사이클에서 어닐링하였다. 이어서, 어닐링된 샘플을 얼음물 배스에서 1.5 또는 2 퍼센트 아가로스 겔 전기영동법(10 mM MgCl₂로 보충한 0.5×TBE 완충액에서 제조되고 SYBR 세이프로 사전염색된 겔)에 적용하였다. 이어서, 표적 겔 밴드를 잘라내고 동결 'N 압착 컬럼(바이오-라드 래버로토리스, 인크.(Bio-Rad Laboratories, Inc.))내로 넣었다. 이 겔 조각을 컬럼에서 마이크로관 막자에 의해 미세한 조각으로 파쇄하였고, 이어서 이 컬럼을 바로 3분 동안 438 g에서 원심분리를 하였다. 260 nm에서의 자외선 흡수의 측정에 의한 농도 추산을 위해 이 컬럼을 통해 원심분리된 샘플을 수집하였다. 이러한 추산은 AFM 또는 TEM 영상화 전에 희석 인자를 추산하는데 유용할 것이다.

스트렙타비딘 표지. 스트렙타비딘 표지를 2가지 상이한 접근법으로 행하였다. 1) 24H×28T 직사각형의 상단 및 하단 열 또는 내부 부위를 표지. 24H×28T 직사각형의 상단 및 하단(또는 내부 부위)의 각 타일을 3' 17 nt 핸들을 갖도록 변형하였다(스페이서로서의 TT 및 서열이 TCCTCCATCCCTTCC-바이오틴, 서열 번호 364인 3' 바이오틴 변형 가닥에 상보적인 GGAAGGGATGGAGGA, 서열 번호　363). 상단 및 하단 열(또는 내부 부위)의 특별한 타일, 및 직사각형 격자의 성분 타일의 나머지를 1-2×농도의 30개의 바이오틴 변형 가닥과 혼합하였고(특별하고 일반적인 성분 타일의 농도는 100 nM였고 14개의 상이한 특별한 타일 화학종이 있었을 때, 3' 바이오틴 변형 가닥의 1×농도는 100×14=1400 nM였다), 이것은 0.5×TE 완충액(25 mM MgCl₂)에서, 특별한 타일의 핸들 서열에 상보적이다. 이어서, 이것을 17시간에 걸쳐 어닐링하였고 아가로스 겔 전기영동법 후에 정제하였다. 이어서, 정제된 샘플을 AFM 영상화하였다. 영상화의 1단계 후에, 스트렙타비딘(0.5×TE 완충액(10 mM MgCl₂) 중의 10 mg/mL의 1 μL)을 재영상화전에 2분의 인큐베이션 동안 영상화 샘플(~40 μL)에 첨가하였다. 2) 관 구조체의 폴리-T 말단을 표지. 관 정제 후에, 3' 바이오틴 변형된 폴리-A 가닥(폴리-T 대응부에 5-10×)을 하룻밤동안 실온에서 샘플과 혼합하였다. 이어서 샘플을 AFM 영상화하였다. 영상화의 1단계 후에, 스트렙타비딘(0.5×TE 완충액(10 mM MgCl₂) 중의 10 mg/mL의 1 μL)을 재영상화전에 2분의 인큐베이션 동안 운모 위 영상화 샘플에 첨가하였다.

샘플 제제를 위한 로봇 자동화. 매트랩 프로그램을 디자인하여 복합 형상 디자인을 돕고 액체 처리 로봇(브라보, 애질런트)에 의해 가닥 혼합을 자동화하였다. 각각의 형상에 대해, 수용액 중 각 단일 가닥 타일의 10 μM의 5 μL를 선발하였고 2 mL 미만의 최종 부피로 혼합하였고(정확한 부피는 표적 형상에 대한 다수의 요소 가닥에 의해 결정되었다), 250 nM 용액의 200 μL로 진공 증발시켰다. 이어서, 이 혼합물을 50 μL 62.5 mM Mg² ⁺ 완충액으로 보충하여 어닐링을 준비하기 위한 250 μL 최종 혼합물에 도달하였다. 이 어닐링 전 용액은 하기 최종 농도를 가졌다: SST 화학종마다 200 nM DNA 가닥 및 12.5 mM Mg² ⁺. 각각의 실행은 48개의 형상을 제공하였고 마치는데 약 2일이 걸렸다.

AFM 영상화. AFM 영상화를 디지털 인스트러먼트 나노스코프 V 컨트롤러(Digital Instruments Nanoscope V controller)(Vecco)와 같이 SPM 멀티모드(Multimode)를 사용하여 얻었다. 정제와 함께 어닐링된 샘플의 5 μL 적하(2~5 nM) 후에 0.5×TE(10 mM MgCl₂)의 40 μL 적하를 새롭게 잘라진 운모의 표면 상에 적용하였고 대략 2분 동안 놔두었다. 때때로, 샘플의 추가 희석을 실행하여 원하는 샘플 밀도를 달성하였다. 몇몇 경우에, 보충량 10 mM NiCl₂를 첨가하여 DNA-운도 결합의 강도를 증가시켰다. 샘플을 액체 태핑(tapping) 모드를 사용하여 영상화하였다. 사용된 AFM 팁은 SNL-10 질화규소 캔티레버(cantilever) 칩(Vecco 프로브) 중 짧고 얇은 캔티레버였다.

TEM 영상화. 영상화를 위해, 3.5 μL 샘플(1~5 nM)을 4분 동안 글로우 방전된 탄소-코팅된 TEM 격자에 흡착시켰고, 이어서 1분 동안 25 mM NaOH를 함유하는 2 % 수성 우라닐 포메이트 용액을 사용하여 염색하였다. 영상화를 80 kV로 작동되는 JEOL JEM-1400을 사용하여 실행하였다.

SYBR 세이프 염색을 이용한 수득률 정량화. 수득률을 먼저 천연 아가로스 겔 전기영동법 분석에 의해 추산하였다. 표적 밴드의 형광 강도와 전체 레인의 것 간의 비율을 구조 형성의 현재 총 수득률에 맞추었다. 24H×28T 직사각형의 경우, 독립적인 대체 정량화 과정으로, 표적 밴드의 강도를 표준 샘플(1 kb 사다리형 혼합물의 1500 bp DNA)과 비교하였다. 표적 밴드의 질량값을 표준 샘플에 기초한 강도-질량 곡선에서 뺐고, 원하는 구조체의 수득률을 계산하는데 사용하였다.

측정 및 통계. AFM 측정을 Veeco에 의해 제공된 나노현미경 분석(버전 1.20)을 사용하여 얻었다. 단면 기능을 거리 측정 과제(상이한 크기의 직사각형의 길이 및 폭)에 대해 적용하였다. 측정을 위해 "잘-형성된" 구조체를 선택하였다. 이 관의 TEM 영상을 NIH에 의한 이미지J(버전 1.43u)를 사용하여 분석하였다. "직선" 기능을 관의 폭을 측정하기 위해 적용하였다. "선분" 기능을 관의 윤곽 길이를 강조하고 측정하기 위해 적용하였다. 30개의 샘플 포인트를 각각의 거리 측정(예컨대, 24H×28T 직사각형의 폭)을 위해 수집하였고 통계(예컨대, 평균, 표준 편차)는 30개의 데이터 포인트에 기초하였다.

실시예 2.

본원에 기술된 방법을 사용하여, 우리는 복수개의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 사용하여 선행기술인 DNA 오리가미 접근법으로부터 만들어진 것만한 크기의 DNA 구조체를 구축하였다. 더 구체적으로, 우리는 362개의 상이한 단일 가닥 DNA를 자기-조립시켜 약 60 nm 곱하기 약 100 nm 크기인 직사각형 격자, 및 이것의 유도 구조체를 구축하였다.

올리고뉴클레오티드를 합성하였고(예컨대, 바이오니어) MgCl₂로 TE 완충된 용액(농도 25 mM)에서 원하는 농도(예컨대, 100 nM)로 함께 혼합하였다. 이 혼합물은 서냉각을 수반하는 어닐링 과정(예컨대, 본원에 기술된 바와 같이, 17시간 동안 약 90 ℃에서 시작하고 약 25 ℃에서 종료)을 받았다. 이 어닐링 과정은 올리고뉴클레오티드를 자기-조립하게 하여, 핵산 구조체를 형성하게 한다.

어닐링을 완료하면, 이 구조체의 정제 전과 후에 반응 혼합물을 분석하였다. 이 구조체를 아가로스 겔 전기영동법, AFM 및 TEM을 사용하여 특성화하였다.

이 접근법을 사용하여 만들어졌던 구조체는 도 3b, 3c, 3d, 3e, 3ea, 3eb, 3ec, 3ed, 3f, 3fa, 3fb, 3fc, 3fd, 5b, 5ba, 5bb, 5bc, 5c, 5ca, 5cb, 5cc, 5d, 5da, 5db, 5dc, 5dd, 10a, 10aa, 10ab, 10ac, 10ad, 10ae 및 10af(표 1, 하기를 참고하여 도면에서 도시된 올리고뉴클레오티드를 사용함)에서 도시된 것을 포함한다. 또한, 도 4 및 5a, 5b, 5ba, 5bb, 5bc, 5c, 5ca, 5cb, 5cc, 5d, 5da, 5db, 5dc 및 5dd에 도시된 구조체는 이 접근법을 사용하여 만들어졌다.

실시예 3.

이어서, 우리는 또한 각각 관 형상인 2개의 핵산 구조체를 연결하도록 하여 더 크고 더 높은 차수의 구조체를 형성하였다.

먼저, 관형 구조체 각각을 본원에 기술된 올리고뉴클레오티드를 혼합하고 어닐링하여 만들었다. 올리고뉴클레오티드를 조합하고 약 17시간 동안 약 90 ℃에서 약 25 ℃로의 온도 전이를 사용하여 어닐링하였다. 이어서, 생성된 핵산 구조체를 함께 혼합하였고 약 7시간 동안 약 45 ℃에서 약 25 ℃로의 온도 전이를 사용하여 추가로 어닐링하였다. 이 과정은 동일 기간 동안 실온에서 이 구조체를 단순히 유지한 것보다 향상된 수득률을 제공하였다. 추가로, 첫 번째 어닐링 단계 후에 정제되었는지와 무관하게 이 구조체를 적절히 어닐링 할 수 있었다는 것을 유념해야 한다.

등가물

여러 본 발명의 실시예가 본원에서 기술되고 도시되었지만, 본 기술 분야의 당업자는 본원에서 기술된 기능을 수행하고(거나) 결과 및/또는 하나 이상의 장점을 얻기 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 쉽게 생각할 것이고, 각각의 그러한 변경 및/또는 변형은 본원에 기술된 본 발명 실시태양의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 더 일반적으로, 본 기술 분야의 당업자는 본원에서 기술된 모든 파라미터, 치수, 물질, 및 구성은 예시적인 것으로 의도되고, 실제 파라미터, 치수, 물질, 및/또는 구성은 본 발명의 교시가 사용되는 구체적인 용도 또는 용도들에 의존할 것임을 쉽게 이해할 것이다. 본 기술 분야의 당업자는 단지 통상적인 실험을 사용하여, 본원에서 기술된 구체적인 본 발명의 실시태양에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있다. 그러므로, 상기 실시예는 단지 예시적으로 제시되었고, 첨부된 청구항 및 그에 대한 등가물의 범위 내에서, 본 발명의 실시태양은 구체적으로 기술되고 청구된 바와 달리 실시될 수 있음을 이해하여야 한다. 본 개시의 본 발명의 실시태양은 본원에서 기술된 각각의 개별적인 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트, 및/또는 방법에 관한 것이다. 또한, 2개 이상의 그러한 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트, 및/또는 방법의 임의의 조합은, 그러한 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트, 및/또는 방법이 상호 불일치하지 않으면, 본 개시의 발명 범위 내에 포함된다.

본원에서 정의되고 사용된 바와 같은 모든 정의는 사전적인 정의, 참조로 포함된 문헌의 정의, 및/또는 정의된 용어의 통상적인 의미에 대해 우선하는 것으로 이해되어야 한다.

본원에 개시된 모든 참고 문헌, 특허 및 특허 출원은 각각 인용된 대상과 관련하여 참고로 포함되고, 일부 경우에 이것은 그 문헌의 전체를 포괄할 수 있다.

명세서 및 청구항에서 본원에서 사용되는 바와 같은 부정관사는 명확히 대조적으로 표시되지 않으면, "하나 이상"을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

명세서 및 청구항에서 본원에서 사용되는 바와 같은 "및/또는"이라는 문구는 그렇게 결합된 요소들, 즉 몇몇 경우에 결합되어 존재하고 다른 경우에 분리되어 존재하는 요소들 중 "하나 또는 모두"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"으로 나열된 복수의 요소들은 동일한 방식으로 해석되어야 하고, 즉 요소들 중 "하나 이상"이 그렇게 결합된다. "및/또는" 문구에 의해 구체적으로 식별된 요소 이외의 다른 요소들이 구체적으로 식별된 그러한 요소들에 관련이 있거나 없든지 간에, 임의로 존재할 수 있다. 따라서, 비제한적인 예로서, "A 및/또는 B"에 대한 참조는 "포함하는"과 같은 개방형 단어와 함께 사용될 때, 일 실시예에서 (B 이외의 요소를 임의로 포함하는) A만을; 다른 실시예에서 (A 이외의 요소를 임의로 포함하는) B만을; 또 다른 실시예에서 (다른 요소들을 임의로 포함하는) A 및 B를 지칭할 수 있다.

명세서 및 청구항에서 본원에서 사용되는 바와 같이, "또는"은 위에서 정의된 바와 같이 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록 내에서 품목들을 분리할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인 것으로, 즉 다수의 또는 열거된 요소들 중 1개 초과를 포함하는 적어도 하나 그리고 임의로 추가의 미열거된 항목의 포함으로서 해석되어야 한다. "~ 중 단지 하나" 또는 "~ 중 정확히 하나" 또는 청구항 내에서 사용될 때 "~로 이루어진"과 같은 대조적으로 명확히 표시된 용어만이 다수의 또는 열거된 요소들 중 정확히 하나의 요소의 포함을 지칭할 것이다. 대체로, 본원에서 사용되는 바와 같은 "또는"이라는 용어는 "각", "~ 중 하나", "~ 중 단지 하나", 또는 "~ 중 정확히 하나"와 같은 배타적인 용어가 선행될 때, 배타적인 대안 (즉, "모두가 아닌 하나 또는 다른 하나")를 표시하는 것으로 해석되어야 한다. "~로 본질적으로 구성된"은 청구항 내에서 사용될 때, 특허법의 분야에서 사용되는 바와 같은 그의 통상적 의미를 가질 것이다.

명세서 및 청구항 내에서 본원에서 사용되는 바와 같이, 하나 이상의 요소들의 목록을 참조하는 "하나 이상"이라는 문구는 요소들의 목록 내의 요소들 중 임의의 하나 이상으로부터 선택된 하나 이상의 요소를 의미하지만, 요소들의 목록 내에서 구체적으로 열거된 각각의 모든 요소 중 적어도 하나를 반드시 포함하지는 않으며 요소들의 목록 내의 요소들의 임의의 조합을 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 정의는 또한 구체적으로 식별된 요소들에 관련이 있거나 없든지 간에, "하나 이상"이라는 문구가 지칭하는 요소들의 목록 내에서 구체적으로 식별된 요소 이외의 요소가 임의로 존재할 수 있음을 허용한다. 따라서, 비제한적인 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나" (또는 동등하게는, "A 또는 B 중 적어도 하나", 또는 동등하게는 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는 일 실시예에서 B가 존재하지 않으며 (B 이외의 요소를 임의로 포함하는), 하나를 초과하는 것을 임의로 포함하는 하나 이상의 A; 다른 실시예에서 A가 존재하지 않으며 (A 이외의 요소를 임의로 포함하는) 하나를 초과하는 것을 임의로 포함하는 하나 이상의 B; 또 다른 실시예에서 하나를 초과하는 것을 임의로 포함하는 하나 이상의 A 및 하나를 초과하는 것을 임의로 포함하는 하나 이상의 B(및 다른 요소를 임의로 포함하는) 것 등을 지칭할 수 있다.

명확히 대조적으로 표시되지 않으면, 하나를 초과하는 단계 또는 작용을 포함하는 본원에서 청구되는 임의의 방법에서, 방법의 단계 또는 작용들의 순서는 방법의 단계 또는 작용들이 언급된 순서로 반드시 제한되지 않음을 또한 이해하여야 한다.

청구항 및 상기 명세서에서, "포함하는(comprising)", "포함하는(including)", 보유하는", "갖는", "함유하는", "수반하는", "유지하는", "~로 구성된" 등과 같은 모든 연결구는 개방형으로, 즉 포함하지만 제한되지 않음을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "~로 이루어진" 및 "~로 본질적으로 구성된"이라는 연결구만이 각각 특허 심사 절차, 섹션 2111.03의 미국 특허청 매뉴얼에 기술되어 있는 바와 같이, 폐쇄형 또는 반폐쇄형 연결구이다.

SEQUENCE LISTING <110> President and Fellows of Harvard College Yin, Peng Wei, Diming <120> COMPOSITIONS AND METHODS RELATING TO NUCLEIC ACID NANO- AND MICRO-TECHNOLOGY <130> H0498.70412WO00 <140> TBD <141> 2012-08-02 <150> 61/515435 <151> 2011-08-05 <150> 61/612018 <151> 2012-03-16 <160> 364 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 1 cagggtggta ctatttatcg t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 2 cctccgggca ctcagcttac t 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 3 caaccgatct ctggataata t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 4 cccgtcaaag cttatatttc t 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 5 ctatttagaa ctccaggaag t 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 6 ccaggcccac ctatatggat t 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 7 cttaaaggct ctggttgaag t 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 8 cagatcacga ctaacacacc t 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 9 cgcctctatc ctgtgaacac t 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 10 cggctgagaa cttaagtttc t 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 11 cggtctcgcc cttagaatga t 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 12 cgggcgccaa ctgaagccct t 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 13 cgggacatcc ctttagtcga t 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA 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ctgggctgcg tgtgtagagg gattgttgaa ga 42 <210> 328 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 328 cctatggaca ctacgcacgt tgttaagtcc gatagcaccg aa 42 <210> 329 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 329 cagagatgaa cttgactcgt tgatcgccag gacggagctc ga 42 <210> 330 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 330 caccctagcg ctgggcactt tgcgactcac gacgctttgt ga 42 <210> 331 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 331 cctgcccgta ctatacatag tgtagggagg gagcgccctt ta 42 <210> 332 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 332 cgaagagacc cttgatttgg tgcaattcta gagtggcata ca 42 <210> 333 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 333 cctttgccgg cttctatact tgtcccagcc gaatgagagg ca 42 <210> 334 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 334 tttttttttt tcagtatgta tgggcaggca tgtttttttt tt 42 <210> 335 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 335 ctgtatcggc tttagtataa tgtatagtct tgaagttagc aa 42 <210> 336 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 336 catctgggtc tacaagaccc tggatgcgcg tgagcgtcct ga 42 <210> 337 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 337 cacagatgtc tatttgcgag tgcagcttta cgaataaacg ga 42 <210> 338 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 338 cagcgtggac tcgtaacaat tgtgcattca cgatagacca ta 42 <210> 339 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 339 ccggctcgcc tctgggtagc tgtattaccg agagtctacc ga 42 <210> 340 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 340 cgcctagctc tagcaaactg tggagactct tgatagcata aa 42 <210> 341 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 341 cccggctatc tagtgcgacg tgggccagcc ggactgtcta aa 42 <210> 342 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 342 ccagaatgac tcgacctcgg tgtgtccata ggacgcagcc ca 42 <210> 343 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 343 caaagacgac tctattccgt tgttcatctc tgaacgtgcg ta 42 <210> 344 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 344 ctgggccaac tacgggcctc tgcgctaggg tgaacgagtc aa 42 <210> 345 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 345 cgtgtgtgac tgttcggacc tgtacgggca ggaaagtgcc ca 42 <210> 346 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 346 caccgtttcc taagtagtca tgggtctctt cgactatgta ta 42 <210> 347 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 347 cccaggcttc tgtaagagta tgccggcaaa ggaccaaatc aa 42 <210> 348 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 348 cttggaagac tttttttttt tttttttttt ttaagtatag aa 42 <210> 349 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 349 gccgatacag atacatactg a 21 <210> 350 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 350 gacccagatg attatactaa a 21 <210> 351 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 351 gacatctgtg agggtcttgt a 21 <210> 352 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 352 gtccacgctg actcgcaaat a 21 <210> 353 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 353 ggcgagccgg aattgttacg a 21 <210> 354 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 354 gagctaggcg agctacccag a 21 <210> 355 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 355 gatagccggg acagtttgct a 21 <210> 356 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 356 gtcattctgg acgtcgcact a 21 <210> 357 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 357 gtcgtctttg accgaggtcg a 21 <210> 358 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 358 gttggcccag aacggaatag a 21 <210> 359 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 359 gtcacacacg agaggcccgt a 21 <210> 360 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 360 ggaaacggtg aggtccgaac a 21 <210> 361 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 361 gaagcctggg atgactactt a 21 <210> 362 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 362 gtcttccaag atactcttac a 21 <210> 363 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 363 ggaagggatg gagga 15 <210> 364 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> Biotin <222> (15)..(15) <223> C modified with biotin <400> 364 tcctccatcc cttcc 15

Claims

2개 이상의 평행 이중 나선으로 배열된 올리고뉴클레오티드 각각이 2개 이상의 도메인을 포함하고, 1개 이상의 이중 나선이 고유 도메인을 포함하는 것인, 복수개의 어닐링된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 1개 이상의 이중 나선이 2개 이상의 고유 도메인을 포함하는 것인 핵산 구조체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 이중 나선의 50 % 이상이 하나 이상의 고유 도메인을 포함하는 것인 핵산 구조체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 5개 이상, 10개 이상, 또는 20개 이상의 평행 이중 나선을 포함하는 핵산 구조체.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 제1 서브세트가 2개의 도메인을 포함하고 올리고뉴클레오티드의 제2 서브세트가 4개의 도메인을 포함하는 것인 핵산 구조체.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 21-104개 길이의 뉴클레오티드인 핵산 구조체.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 DNA 올리고뉴클레오티드인 핵산 구조체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 L-DNA 올리고뉴클레오티드인 핵산 구조체.
2개 이상의 평행 이중 나선으로 배열된 올리고뉴클레오티드 각각이 2개 이상의 도메인을 포함하고, 1개 이상의 이중 나선이 고유한 것인, 복수개의 어닐링된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조체.
제9항에 있어서, 2개 이상의 고유 이중 나선을 포함하는 핵산 구조체.
제9항 또는 제10항에 있어서, 이중 나선의 50 % 이상이 고유한 것인 핵산 구조체.
제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 이중 나선의 50 % 이상이 하나 이상의 고유 도메인을 포함하는 것인 핵산 구조체.
제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 5개 이상, 10개 이상, 또는 20개 이상의 평행 이중 나선을 포함하는 핵산 구조체.
제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 제1 서브세트가 2개의 도메인을 포함하고 올리고뉴클레오티드의 제2 서브세트가 4개의 도메인을 포함하는 것인 핵산 구조체.
제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 21-104개 길이의 뉴클레오티드인 핵산 구조체.
제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 DNA 올리고뉴클레오티드인 핵산 구조체.
제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 L-DNA 올리고뉴클레오티드인 핵산 구조체.
2개 이상의 평행 이중 나선으로 배열된 올리고뉴클레오티드 각각이 2개 이상의 도메인을 포함하고, 핵산 구조체 내의 1개 이상의 올리고뉴클레오티드가 고유한 것인, 복수개의 어닐링된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조체.
제18항에 있어서, 구조체 내의 올리고뉴클레오티드의 50 % 이상이 고유한 것인 핵산 구조체.
제18항에 있어서, 구조체 내의 모든 올리고뉴클레오티드가 고유한 것인 핵산 구조체.
제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 5개 이상, 10개 이상, 또는 20개 이상의 평행 이중 나선을 포함하는 핵산 구조체.
제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 제1 서브세트가 2개의 도메인을 포함하고 올리고뉴클레오티드의 제2 서브세트가 4개의 도메인을 포함하는 것인 핵산 구조체.
제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 21-104개 길이의 뉴클레오티드인 핵산 구조체.
제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 DNA 올리고뉴클레오티드인 핵산 구조체.
제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 L-DNA 올리고뉴클레오티드인 핵산 구조체.
복수개의 핵산 구조체가 50 % 이상 동질인, 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 복수개의 핵산 구조체를 포함하는 조성물.
단일 가닥 올리고뉴클레오티드 각각이 2개 이상의 도메인을 포함하고, 1개 이상의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드가 복수개 중의 다른 올리고뉴클레오티드의 몰농도보다 10배 낮은 몰농도로 존재하는 것인, 단일 용기에서 복수개의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 어닐링하여 핵산 구조체를 형성하는 것을 포함하는 방법.
단일 가닥 올리고뉴클레오티드 각각이 2개 이상의 도메인을 포함하고, 1개 이상의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드가 복수개 중의 다른 올리고뉴클레오티드의 몰농도보다 100배 낮은 몰농도로 존재하는 것인, 단일 용기에서 복수개의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 어닐링하여 핵산 구조체를 형성하는 것을 포함하는 방법.
제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 어닐링이 일정 기간에 걸친 온도 전이를 통해 일어나는 것인 방법.
제29항에 있어서, 온도 전이가 승온에서 약 실온으로의 온도 변화인 방법.
제29항에 있어서, 온도 전이가 약 90 ℃에서 약 실온으로의 온도 변화인 방법.
제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 어닐링이 약 12-24시간의 기간에 걸쳐 일어나는 것인 방법.
제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 제1 서브세트가 2개의 도메인을 포함하고 올리고뉴클레오티드의 제2 서브세트가 4개의 도메인을 포함하는 것인 방법.
제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 21-104개 길이의 뉴클레오티드인 방법.
제26항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 DNA 올리고뉴클레오티드인 방법.
제26항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 L-DNA 올리고뉴클레오티드인 방법.
제26항 내지 제36항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 핵산 구조체.
스페이서-링커(spacer-linker)를 통해 서로 접합된, 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항 중 2개 이상의 핵산 구조체를 포함하는 복합 핵산 구조체.
제38항에 있어서, 스페이서-링커가 핵산 요소 및 비-핵산 요소를 포함하는 것인 복합 핵산 구조체.
제38항 또는 제39항에 있어서, 스페이서-링커가 탄소 사슬을 포함하는 것인 복합 핵산 구조체.
제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서-링커가 단일-이기능성 스페이서-링커인 복합 핵산 구조체.