KR20140054084A - 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 gc-a 아고니스트 및 gc-b 아고니스트를 조합하여 이루어지는 악성 종양의 악화 방지용 의약 - Google Patents

나트륨 이뇨 펩티드 수용체 gc-a 아고니스트 및 gc-b 아고니스트를 조합하여 이루어지는 악성 종양의 악화 방지용 의약 Download PDF

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겐지 간가와
히로시 호소다
다카시 노지리
메이노신 오쿠무라
마유미 후루야
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도쿠리츠교세이호진 고쿠리츠쥰칸키뵤 겐큐센터
고꾸리쯔 다이가꾸 호우징 오사까 다이가꾸
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Abstract

악성 종양에 대한 치료로서 안전성이 높고, 또한 악성 종양을 효과적으로 치료할 수 있는 의약, 즉 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트, 및 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트가, 조합하여 투여되는 악성 종양의 치료, 악성화의 억제 또는 예방을 위한 의약, 상기 의약의 투여에 의한 치료 방법 등을 제공한다.

Description

나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트 및 GC-B 아고니스트를 조합하여 이루어지는 악성 종양의 악화 방지용 의약{DRUG FOR PREVENTING EXACERBATION OF MALIGNANT TUMOR, COMPRISING COMBINATION OF NATRIURETIC PEPTIDE RECEPTOR GC-A AGONIST AND GC-B AGONIST}
본 발명은, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A에 대한 아고니스트와 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B에 대한 아고니스트를 조합하여 이루어지는, 악성 종양을 효과적으로 치료, 또는 그 악성화를 억제 또는 예방하기 위한 의약, 이것을 사용한 악성 종양의 치료 방법 등과, 또한 상기 의약을 별도의 항종양제 등과 병용하는 것에 의한 악성 종양의 효과적인 치료 방법 등을 제공한다.
종양은, 양성 종양과 악성 종양으로 대별된다. 악성 종양은, 종양 세포가 증식능에 더하여, 주변 조직으로의 침윤, 나아가서는 원격 장기에 전이하는 성질을 겸비하는 것을 그 특징으로 할 수 있다.
악성 종양에 있어서의 종양 조직은, 암 세포만으로 구성되어 있는 것처럼 생각하기 쉽지만, 실제로는 그렇지 않으며, 도 11에 나타낸 바와 같이, 암 세포와 암간질(癌間質)이 혼재하여 구성되어 있다. 암간질을 구성하는 세포의 대표격으로서 암관련 섬유아 세포(Cancer Associated Fibroblast; 이하, CAF라고도 함)가 알려져 있고, 암 세포와 CAF는, 서로 자극함으로써 암 세포의 증식 촉진, 상피 간엽 전이(Epithelial Mesenchymal Transition: 이하, EMT라고도 함)에 의한 암 세포의 전이 침윤능 획득 등, 종양의 악성화를 진행시키는 악순환이 형성되어 있다. 즉, 예를 들면, 암간질 세포가 생산하는 사이토카인, 성장 인자 등의 액성(液性) 인자에 의해, 암 세포가 자극되어 암 세포로부터의 액성 인자의 생산이 촉진된다. 이 사이토카인 등에 의한 자극이, 암간질 세포의 액성 인자의 생산을 더욱 항진하는 악순환을 반복함으로써, 종양의 악성화가 진행하는 것으로 알려져 있다. CAF는, 정상적인 섬유아 세포와는 상이한 생물 활성 및 유전자 발현 패턴을 나타내는 것(비특허 문헌 1)이 밝혀져 있고, 전술한 악순환에 중요한 기능을 하는 것(비특허 문헌 2) 등이 알려져 있다. 그러나, 그 성질의 상당수는 아직도 규명되어 있지 않고, 현재도 연구가 진행되고 있다.
항종양제의 상당수는, 종양 세포만을 표적으로 한 것이며, 암간질 세포에 대한 효과는 한정적이다. 이 때문에, 항종양제를 투여해도, 암간질 세포로부터 생산되는 액성 인자에 의해 종양 세포의 악성화가 자극됨으로써, 종양 세포가 살아남는 경우가 많고, 이것이 항종양제에 의한 악성 종양의 근본적인 치료를 방해하는 결정적인 요인으로 되어 있다.
나트륨 이뇨 펩티드로 불리는 펩티드에는, 심방성 나트륨 이뇨 펩티드(ANP), 뇌성 나트륨 이뇨 펩티드(BNP) 및 C형 나트륨 이뇨 펩티드(CNP)가 있으며, 이들 펩티드는, 구아닐레이트 시클라제 도메인을 가지는 수용체와 특이적으로 결합하여, 세포 내의 cGMP를 상승시킴으로써 다양한 생리 활성을 발현하는 것으로 알려져 있다. 이와 같은 수용체로서는 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A(별명: NPR-A)와 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B(별명: NPR-B)의 2종류가 있으며, ANP와 BNP는 GC-A에, CNP는 GC-B에 각각 특이적으로 결합하는 것으로 알려져 있다(비특허 문헌 3).
ANP는, 심방 세포에서 생산되고 분비되는 아미노산 28개로 이루어지는 펩티드이며, 환상(環狀) 구조를 가진다. ANP는, 신장에서는 이뇨 작용을 나타내고, 혈관에서는 혈관 평활근을 이완 및 확장하는 작용을 가진다. ANP는, 또한 레닌·안지오텐신·알도스테론계 및 바소프레신에 대하여 길항적으로 작용한다. 이들 작용에 의해, 종합적으로 혈압의 저하나 체액량의 저감 등을 통해 심장의 부담을 경감시키게 된다. 또한, BNP는, 뇌로부터 발견된 아미노산 32개로 이루어지고, 환상 구조를 가지는 펩티드이지만, 그 후의 연구에 의해 뇌보다 주로 심실 세포에서 생산 및 분비되고 있는 것으로 판명되었고, ANP와 같은 작용을 가진다. ANP와 BNP는, GC-A에 특이적으로 결합하여, cGMP의 생산을 촉진하여 전술한 작용을 발현한다(비특허 문헌 4). 실제로, ANP는 울혈성 심부전 등에 있어서 심방 팽만압의 상승을 수반하여 분비가 촉진되어, 전술한 작용에 의해 울혈성 심부전 등의 증상을 경감하도록 기능하고 있으며, 인간형 ANP(hANP)는 일본에서 급성 심부전 치료약으로서 임상에서 사용되고 있다. 또한, BNP도 심부전 환자에 있어서 분비가 항진되어 전술한 작용에 의해 심부전을 수반하는 여러 증상을 완화시키는 기능을 하고 있으며, 인간형 BNP(hBNP)는 미국 등에서 급성 심부전 치료약으로서 인가되어 있다.
CNP는, 돼지의 뇌 내로부터 발견된 생리 활성 펩티드이며, 포유류의 체내에는, 22개의 아미노산으로 이루어지는 CNP-22와, 그 N 말단측이 연장하여, 53개의 아미노산으로 이루어지는 CNP-53이 존재하는 것이 알려져 있다. CNP는, 당초에는 뇌신경 펩티드로서 기능하고 있는 것으로 여겨졌지만, 그 후의 연구에 의해 말초에도 존재하는 것이 판명되어, 뼈의 성장 과정에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 확인되어 있다. 지금까지, CNP는, 주로 성장판의 연골 조직에 있어서 연골 세포의 분화 및 증식을 제어하고 있는 것이 확인되어 있고, 연골 무형성증을 비롯한 저신장증의 치료약으로서의 가능성이 기대되고 있다. CNP는, 뼈 및 연골 이외에서도 다양한 생리 활성이 알려져 있다. 섬유아 세포에 대한 작용으로서는, 심근 섬유아 세포에 있어서 CNP가 발현하고, 그 발현량이 각종 염증성 사이토카인 자극에 의해 항진함으로써, CNP가 심근 섬유아 세포의 DNA 합성과 콜라겐 등의 세포외 매트릭스의 생산을 억제함으로써 심근의 섬유화를 억제하는 것 등이 알려져 있다(비특허 문헌 5). 그러나, 악성 종양이나 암간질 세포에 대한 CNP의 작용에 대해서는 알려져 있지 않다.
또한, ANP 및 BNP에 대해서도, 이뇨 작용, 혈관 확장 작용 등의 혈압 조정 작용 이외에도 다양한 생리 활성을 가지는 것으로 보고되어 있다. 종양에 대해서는, ANP가, 실험적으로 종양 세포의 증식을 억제하는 효과에 대하여 Vesely et. al.로부터 복수의 보고가 있다(예를 들면, 비특허 문헌 6 등). 이들 보고에서는, ANP뿐만 아니라, Long Acting Natriuretic Peptide, Vessel Dilator 및 Kalliuretic Peptide 등, 그 아미노산 서열로부터는 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A에 결합할 것으로는 생각하기 어려운 펩티드가, ANP와 같거나, 그 이상으로 강한 암 세포 증식 억제 활성을 가지는 것으로 되어 있고, 또한, BNP는 이와 같은 증식 억제 작용을 나타내지 않는 것으로 되어 있다. 이러한 사실로부터, 그들이 보고하는 ANP의 종양 세포 증식 억제 작용은 GC-A에 대한 아고니스트 활성에 기초한 것은 아닌 것으로 여겨지고 있다. 또한, Vesely et. al.의 보고를 포함해도, ANP 및 BNP의 암 세포의 전이에 관련한 작용에 대해서는 알려져 있지 않으며, 또한 악성 종양의 치료를 위하여, ANP 및/또는 BNP와 CNP를 병용하는 것에 대한 보고도 없다.
Nakagawa H, et al., Oncogene, 2004년, 23권, 7366-7377 페이지 Giannoni E., et al., Cancer Research, 2010년, 70권, 17호, 6945-6956 페이지 Silver MA, Curr. Opin. Nephrol. Hypertens., 2006년, 15권, 14-21 페이지 Yoshibayashi M. et al, Eur. J. Endocrinol., 1996년, 135권, 265-268 페이지 Horio T, et al., Endocrinology, 2003년, 144권, 2279-2284 페이지 Vesely BA et al., Eur. J. Clin. Invest., 2005년, 35권, 60-69 페이지
본 발명은, 악성 종양에 대한 치료로서, 안전성이 높고, 또한 악성 종양을 효과적으로 치료 또는 그 악성화를 억제 또는 예방할 수 있는 의약, 치료 방법 등을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은, 악성 종양을 보다 효과적으로 치료할 수 있는 약제에 대하여 검토를 거듭한 결과, (i) 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트가 대표적인 암간질 세포인 암관련 섬유아 세포(CAF)의, 악성 종양을 악화시키는 기능으로서의 각 성장 인자나 염증성 사이토카인 등 액성 인자의 생산을 억제하는 것과, (ii) 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트가 암 세포의 EMT를 억제하고, 암 세포로부터의 악성 종양을 악화시키는 각 성장 인자나 염증성 사이토카인 등의 생산을 특이적으로 억제하는 것과, (iii) 암 세포와 CAF의 공배양(共培養)에 있어서, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트와 GC-B 아고니스트를 동시에 첨가함으로써 악성 종양을 악화시키는 각 성장 인자나 염증성 사이토카인 등의 생산이 현저하게 억제되고, 또한 암 세포의 EMT가 억제되는 것과, (iv) 암 세포와 CAF를 동시에 피하 주입한 마우스에 대하여 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트와 GC-B 아고니스트를 동시에 투여함으로써 종양 조직의 증대가 현저하게 억제되는 것 등을 발견하고, 이러한 지견에 따라, 연구를 더욱 거듭하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은, 이하를 제공한다.
(1) 본 발명은, 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트, 및 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트가, 조합하여 투여되는 것을 특징으로 하는, 악성 종양의 치료 또는 악성화의 억제 또는 예방을 위한 의약을 제공한다. 또한, 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트, 및 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트의 각각의 유효량을 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 악성 종양의 치료 또는 악성화의 억제 또는 예방 방법(이하, 「악성 종양의 치료 또는 악성화의 억제 또는 예방 방법」을, 「치료 방법 등」이라고도 함)이나, 이와 같은 치료 등에서의 사용을 위한, 조합하여 투여되는, 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트, 및 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트에 대해서도, 본 발명이 제공한다.
이들 의약 등에 있어서, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트와 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트가, 각각 상이한 제제(製劑)의 유효 성분으로서 함유되고, 동시에 또는 상이한 시간에 투여될 수도 있고, 단일 제제 중에 함유될 수도 있다. 또한, 상기 의약은, 이들 양쪽을 포함하는 키트 제제의 형태라도된다. 또한, 본 발명의 의약 등에 있어서, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트와 GC-B 아고니스트가, 단일 물질 중에 양쪽 작용을 겸비하는 물질일 수도 있다.
(2) 본 발명은, 또한, 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트를 유효 성분으로서 함유하고, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트와 조합하여 투여되는 것을 특징으로 하는, 악성 종양의 치료 또는 악성화의 억제 또는 예방을 위한 의약, 전술한 바와 같은 치료 방법 등을 제공한다. 이 경우에, 상기 의약 등은, 예를 들면, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트에 의한 치료를 받고 있는 대상에 대하여 투여할 수 있다.
(3) 본 발명은, 또한 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트를 유효 성분으로서 함유하고, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트와 조합하여 투여되는 것을 특징으로 하는, 악성 종양의 치료 또는 악성화의 억제 또는 예방을 위한 의약, 전술한 바와 같은 치료 방법 등을 제공한다. 이 경우에, 상기 의약 등은, 예를 들면, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트에 의한 치료를 받고 있는 대상에 대하여 투여할 수 있다.
(4) 본 발명은 또한, 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트를 유효 성분으로서 함유하고, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트와 조합하여 투여되는 것을 특징으로 하는, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트에 의한 악성 종양의 치료 또는 악성화의 억제 또는 예방 작용을 증강하기 위한 의약, 전술한 바와 같은 치료 방법 등을 제공한다. 이 경우에 있어서, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트를 유효 성분으로서 함유하는 의약은, 예를 들면, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트에 의한 치료를 받고 있는 대상에 대하여 투여된다.
(5) 본 발명은 또한, 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트를 유효 성분으로서 함유하고, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트와 조합하여 투여되는 것을 특징으로 하는, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트에 의한 악성 종양의 치료 또는 악성화의 억제 또는 예방 작용을 증강하기 위한 의약, 전술한 바와 같은 치료 방법 등을 제공한다. 이 경우에 있어서, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트를 유효 성분으로서 함유하는 의약은, 예를 들면, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트에 의한 치료를 받고 있는 대상에 대하여 투여된다.
(6) 본 발명이 제공하는 의약 등에 있어서는, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트가, 이하의 (a1) 내지 (a6)로부터 선택되는 어느 하나 또는 그 약리상 허용되는 염이며, 또한 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A에 대하여 아고니스트 활성을 가지는 물질; (a1) 심방성 나트륨 이뇨 펩티드, (a2) 뇌성 나트륨 이뇨 펩티드, (a3) (a1) 또는 (a2)의 활성 단편을 포함하는 물질, (a4) (a1) 내지 (a3) 중 어느 하나의 아미노산 서열에 있어서 1개∼수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는, 부가된 변이체, (a5) (a1) 내지 (a4) 중 어느 하나의 유도체, 및 (a6) (a1) 내지 (a5) 중 어느 하나의 변형체인 것이 바람직하다.
여기서, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트의 더욱 바람직한 태양으로서, 하기의 것 등을 각각 예로 들 수 있다.
(a1) 심방성 나트륨 이뇨 펩티드는, 서열 목록의 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 것이 바람직하다. (a2) 뇌성 나트륨 이뇨 펩티드는, 서열 목록의 서열 번호 3, 4 또는 5에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 것이 바람직하다. (a3) 활성 단편은, 바람직하게는 서열 목록의 서열 번호 6의 아미노산 서열을 가지는 것, 더욱 바람직하게는, 활성 단편이 서열 목록의 서열 번호 1 또는 2의 7번 내지 27번의 아미노산 서열, 서열 번호 3 또는 4의 10번 내지 30번의 아미노산 서열, 또는 서열 목록의 서열 번호 5의 23번 내지 43번의 아미노산 서열로 이루어지는 것이다. (a4) 변이체는, 바람직하게는 서열 목록의 서열 번호 1 내지 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 서열 번호 6으로 표시된 아미노산 이외의 아미노산의 1개소∼수개소에 있어서, 1개∼수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 것, 더욱 바람직하게는, 변이체가 (i) 서열 번호 1 또는 2의 아미노산 서열의 1번 내지 6번 및 28번 중 어느 1개소∼수개소에 있어서 1개∼수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 펩티드, (ii) 서열 번호 3 또는 4의 아미노산 서열의 1번 내지 9번, 31번 및 32번 중 어느 1개소∼수개소에 있어서 1개∼수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 펩티드, 또는 (iii) 서열 번호 5의 아미노산 서열의 1번 내지 22번, 44번 및 45번 중 어느 1개소∼수개소에 있어서 1개∼수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 펩티드, 이다. (a5) 유도체는, 바람직하게는 서열 목록의 서열 번호 1 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것, 더욱 바람직하게는, 유도체가 면역 글로블린 Fc 부분, 혈청 알부민, 및 그렐린의 C 말단 유래의 부분 서열 중 적어도 하나를 더 포함하는 것이며, 또한 더욱 바람직하게는, 서열 목록의 서열 번호 12, 13 또는 14에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이다. (a6) 변형체는, 바람직하게는 서열 목록의 서열 번호 1 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 그 서열 번호 6으로 표시된 아미노산에 상당하는 것 이외의 아미노산 중 적어도 하나에 있어서, 화학적 변형(chemical modification)을 받고 있는 것, 더욱 바람직하게는, 제약상(製藥上) 사용되는 고분자 폴리머를 부가함으로써 화학적으로 수식된 것이다.
(7) 본 발명이 제공하는 의약 등에 있어서는, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트는, 하기 (b1) 내지 (b5)로부터 선택되는 어느 하나 또는 그 약리상 허용되는 염이며, 또한 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B에 대하여 아고니스트 활성을 가지는 물질; (b1) C형 나트륨 이뇨 펩티드, (b2) (b1)의 활성 단편을 포함하는 물질, (b3) (b1) 또는 (b2)의 아미노산 서열에 있어서 1개∼수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는, 부가된 변이체, (b4) (b1) 내지 (b3) 중 어느 하나의 유도체, 및 (b5) (b1) 내지 (b4) 중 어느 하나의 변형체인 것이 바람직하다.
여기서, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트의 더욱 바람직한 태양으로서, 하기의 것 등을 각각 예로 들 수 있다.
(b1) C형 나트륨 이뇨 펩티드는, 서열 목록의 서열 번호 7(hCNP-22), 서열 번호 8(hCNP-53), 서열 번호 9(닭 유래 CNP) 또는 서열 번호 10(개구리 유래 CNP)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 것이 바람직하다. (b2) 활성 단편은, 바람직하게는 서열 목록의 서열 번호 11의 아미노산 서열을 가지는 것, 더욱 바람직하게는, 활성 단편이 서열 목록의 서열 번호 7의 6번 내지 22번의 아미노산 서열(hCNP6-22)로 이루어지는 것이다. (b3) 변이체는, 서열 목록의 서열 번호 7 내지 10 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 서열 번호 11로 표시된 아미노산 이외의 아미노산의 1개소∼수개소에 있어서, 1개∼수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 것, 더욱 바람직하게는 변이체가 (i) 서열 번호 7, 9 또는 10의 아미노산 서열의 1번 내지 5번의 어느 1개소∼수개소에 있어서 1개∼수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 펩티드, 또는 (ii) 서열 번호 8의 아미노산 서열의 1번 내지 36번 중 어느 1개소∼수개소에 있어서 1개∼수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 펩티드이다. (b4) 유도체는, 바람직하게는 서열 목록의 서열 번호 7 내지 11 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것, 면역 글로블린 Fc 부분, 혈청 알부민, 및 그렐린의 C 말단 유래의 부분 서열 중 적어도 하나를 더 포함하는 것이며, 또한 더욱 바람직하게는, 서열 목록의 서열 번호 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이다. (b5) 변형체는, 바람직하게는 서열 목록의 서열 번호 7 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 그 서열 번호 11로 표시된 아미노산에 상당하는 것 이외의 아미노산 중 적어도 하나에 있어서, 화학적 변형을 받고 있는 것, 더욱 바람직하게는 변형체가 제약상 사용되는 고분자 폴리머를 부가함으로써 화학적으로 수식된 것이다.
(8) 본 발명은, 또한 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트와 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트의 병용에 더하여, 또한 별도의 항종양제가 투여되는 것을 포함하는, 악성 종양의 치료 또는 악성화의 억제 또는 예방을 위한 의약, 전술한 바와 같은 악성 종양의 치료 방법 등을 제공한다. 이 경우에 있어서, 상기 별도의 항종양제의 투여량이, 상기 항종양제의 통상 정해진 투여량보다 저용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 본 발명의 의약 또는 치료 방법 등도 본 발명에 포함된다.
본 발명에 따른 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트는, 악성 종양의 종양 조직에 있어서의 암관련 섬유아 세포(CAF)로부터의 악성 종양을 악화시키는 각종 성장 인자, 염증성 사이토카인 등의 액성 인자의 분비를 억제하고, CAF의 자극에 의한 종양의 악성화를 억제하는 효과가 있다. 이 GC-B 아고니스트와, 암 세포의 상피 간엽 전이(EMT)를 억제하는 작용을 가지는 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트를 조합하여 악성 종양의 치료에 적용함으로써, 도 12에 모식적으로 표시된 바와 같이, 암 세포와 CAF의 활성을 동시에 억제함으로써, 종양 조직 전체를 동시에 효과적으로 치료할 수 있다. 이에 따라, 암 세포의 증식, 침윤, 전이와 같은 악성 종양에 있어서 생체에 악영향을 미치는 악성화의 진행을 효과적으로 막을 수 있다. 또한, 대표적인 GC-A 아고니스트인 hANP 및 hBNP는 생체내 물질이며, 또한 이미 급성 심부전 치료약으로서 시판되고 있으며, 그 안전성이 확인되어 있으므로, 안정성이 높은 의약이 되고 있다. 대표적 GC-B 아고니스트인 hCNP-22나 hCNP-53도 내인성의 펩티드 호르몬이므로, 안정성이 높은 의약으로서 응용할 수 있다. 또한, 별도의 항종양제 치료와 조합함으로써, 항종양제의 치료 효과를 증강할 수 있게 된다. 이에 따라, 악성 종양의 제어를 효과적으로 행할 수 있을 뿐만 아니라, 항종양제의 용량을 저감시킴으로써 항종양제에 의한 부작용을 경감시킬 수 있다.
도 1의 A는, 폐암 유래 A549 세포에 대한 나트륨 이뇨 펩티드(hANP(●), hBNP(▼), hCNP-22(○) 자극에 의한 세포내 cGMP 레벨의 변동을 나타낸 그래프이다. 도 1의 B는, 암관련 섬유아 세포(CAF)에 대한 나트륨 이뇨 펩티드(hANP(●), hBNP(▼), hCNP-22(○) 자극에 의한 세포내 cGMP 레벨의 변동을 나타낸 그래프이다. 그래프의 각 점에 있어서의 예의 수는, 도 1의 A에서는 n=5∼7이며, 도 1의 B에서는 n=3∼4이다.
도 2는, 1μM의 hANP 존재하(도 2의 C) 및 비존재하(도 2의 B)에서의 TGF-β1 자극에 의한 A549 세포의 형태 변화를 나타낸 현미경 사진이다(도 2의 A: 무자극 A549 세포(컨트롤), 도 2의 B: TGF-β1(1 ng/ml), 도 2의 C: hANP(1 μM)＋TGF-β1(1 ng/ml).
도 3은, A549 세포를, 1 μM의 hANP 존재하 및 비존재하에서, 각각 0.125, 0.25, 0.5, 1.0 및 2.0 ng/ml의 TGF-β1으로 자극했을 때의, EMT의 지표가 되는 각 인자(각각 도 3의 A: VEGF-A, 도 3의 B: E-카드헤린(E-cad), 도 3의 C: N-카드헤린(N-cad), 도 3의 D: PDGF-B, 도 3의 E: TNF-α 및 도 3의 F: IL-6)의 유전자 발현에 대하여, mRNA 레벨로 나타낸 그래프이다. 그래프 중에서, 가로축은 TGF-β1의 농도를 나타내고, 세로축은, mRNA 레벨(36B4 유전자의 mRNA량에 대한 대상 유전자 mRNA량의 비율)을 나타낸다. 또한, 그래프 중에서, 1 μM의 hANP 비존재하에서의 각 유전자의 발현은, 회색 바로 표시되고, hANP 존재하에서의 각 유전자의 발현은, 흑색 바로 표시된다.
도 4는, A549 세포를, 1 μM의 hANP 존재하 및 비존재하에서, 각각 0.125, 0.25, 0.5 및 1.0 ng/ml의 TGF-β1으로 자극했을 때의, E-카드헤린과 N-카드헤린의 발현 비율(N-Cad/E-Cad)을 나타낸 그래프이다. 그래프의 가로축은 TGF-β1의 농도를 나타내고, 세로축은, E-카드헤린과 N-카드헤린의 발현 비율(N-Cad/E-Cad)을 나타낸다. 1 μM의 hANP 비존재하에서의 발현 비율(N-Cad/E-Cad)은, 회색 바로 표시되고, hANP 존재하에서의 발현 비율(N-Cad/E-Cad)은, 흑색 바로 표시된다.
도 5는, CAF 세포를, 1 μM의 hCNP-22 존재하 및 비존재하에서, 각각 0.125, 0.25, 0.5, 1.0 및 2.0 ng/ml의 TGF-β1으로 자극했을 때의, 암의 악성화와 관련된 각종 사이토카인, 성장 인자(각각 도 5의 A: VEGF-A, 도 5의 B: TGF-β1, 도 5의 C: TNF-α 및 도 5의 D: IL-6)의 유전자 발현에 대하여, mRNA 레벨로 나타낸 그래프이다. 그래프 중에서, 가로축은 TGF-β1의 농도를 나타내고, 세로축은, mRNA 레벨(36B4 유전자의 mRNA량에 대한 대상 유전자 mRNA량의 비율)을 나타낸다. 또한, 그래프 중에서, 1μM의 hCNP-22 비존재하에서의 각 유전자의 발현은, 흑색 바로 표시되고, hCNP-22 존재하에서의 각 유전자의 발현은, 백색 바로 표시된다.
도 6은, 피험물질인 1 μM의 hANP의 존재하 및 비존재하에서, A549 세포와 CAF 세포의 공배양을 행하고, 24시간, 48시간 및 72시간 후의 A549 세포 중의 각종 성장 인자, 사이토카인의 유전자 발현량(각각 도 6의 A: VEGF-A, 도 6의 B: PDGF-B, 도 6의 C: IL-6) 및 E-카드헤린과 N-카드헤린의 발현 비율: N-cad/E-cad(도 6의 D)를 나타낸 그래프이다. 그래프 중에서, 가로축은 공배양의 시간을 나타내고, 세로축은, 도 6의 A로부터 도 6의 C에서는 mRNA 발현 레벨(36B4 유전자의 mRNA량에 대한 대상 유전자 mRNA량의 비율), 도 6의 D에서는 N-Cad/E-cad의 mRNA 레벨의 비율을 나타낸다. 또한, 그래프 중에서, 피험물질의 비존재하에서의 결과는 흑색 바로 표시되고, 피험물질 존재하에서의 결과는 백색 바로 표시된다.
도 7은, 피험물질인 1 μM의 hCNP-22의 존재하 및 비존재하에서, A549 세포와 CAF 세포의 공배양을 행하고, 24시간, 48시간 및 72시간 후의 A549 세포 중의 각종 성장 인자, 사이토카인의 유전자 발현량(각각 도 7의 A: VEGF-A, 도 7의 B: PDGF-B, 도 7의 C: IL-6) 및 E-카드헤린과 N-카드헤린의 발현 비율: N-cad/E-cad(도 7의 D)를 나타낸 그래프이다. 그래프 중에서, 가로축은 공배양의 시간을 나타내고, 세로축은, 도 7의 A로부터 도 7의 C에서는 mRNA 발현 레벨(36B4 유전자의 mRNA량에 대한 대상 유전자 mRNA량의 비율), 도 7의 D에서는 N-Cad/E-cad의 mRNA 레벨의 비율을 나타낸다. 또한, 그래프 중에서, 피험물질의 비존재하에서의 결과는 흑색 바로 표시되고, 피험물질 존재하에서의 결과는 백색 바로 표시된다.
도 8은, 피험물질인 1 μM의 hANP 및 1 μM의 hCNP-22의 양쪽의 존재하 및 비존재하에서, A549 세포와 CAF 세포의 공배양을 행하고, 24시간, 48시간 및 72시간 후의 A549 세포 중의 각종 성장 인자, 사이토카인의 유전자 발현량(각각 도 8의 A: VEGF-A, 도 8의 B: PDGF-B, 도 8의 C: IL-6) 및 E-카드헤린과 N-카드헤린의 발현 비율: N-cad/E-cad(도 8의 D)를 나타낸 그래프이다. 그래프 중에서, 가로축은 공배양의 시간을 나타내고, 세로축은, 도 8의 A로부터 도 8의 C에서는 mRNA 발현 레벨(36B4 유전자의 mRNA량에 대한 대상 유전자 mRNA량의 비율), 도 8의 D에서는 N-Cad/E-cad의 mRNA 레벨의 비율을 나타낸다. 또한, 그래프 중, 피험물질의 비존재하에서의 결과는 흑색 바로 표시되고, 피험물질 존재하에서의 결과는 백색 바로 표시된다.
도 9는, A549 세포와 CAF 세포의 혼합 세포 현탁액을 이식한 마우스(컨트롤군(◆), 저용량 ANP＋CNP 투여군(hANP와 hCNP-22의 양쪽을 0.125μg/kg/분으로 연속 투여: ■), 고용량 hANP＋hCNP-22 투여군(hANP와 hCNP-22의 양쪽을 0.5 μg/kg/분으로 연속 투여: ▲)에 있어서의, 이식 후 7, 14, 21 및 28 일의 종양 볼륨의 변화를 나타낸 그래프이다. 그래프 중에서, 가로축은 현탁액 이식 후의 경과 일수를 나타내고, 세로축은 종양 볼륨(㎜3)을 각각 나타낸다.
도 10은, A549 세포와 CAF 세포의 혼합 세포 현탁액을 이식한 마우스에 있어서, 이식 2주간 후부터 투여를 개시(컨트롤군(생리 식염수: ■), ANP군(hANP를 0.5μg/kg/분으로 연속 투여: ▲), CNP군(hCNP-22를 2.5 μg/kg/분으로 연속 투여: ×), ANP＋CNP군(hANP를 0.5μg/kg/분, hCNP-22를 2.5 μg/kg/분으로 연속 투여: *))한 경우의, 이식 후 14(투여 개시일), 21, 28, 35, 및 42 일의 종양 볼륨의 변화를 나타낸 그래프(◆는, 전체의 대조군으로서 A549 세포만을 이식한 컨트롤 실험의 군(A549군))이다. 그래프 중에서, 가로축은 현탁액 이식 후의 경과 일수를, 세로축은 종양 볼륨(㎜3)을 각각 나타낸다.
도 11은, 생체의 실제 악성 종양에 있어서의 종양 조직의 모델을 나타낸 도면이다.
도 12는, 생체 내의 실제 악성 종양에 있어서의 종양 조직에서 일어나는 암 세포와 암관련 섬유아 세포(CAF)의 사이에 형성되는 암악성화를 항진하는 악순환과, 그 악순환에 대한 GC-A 아고니스트 및 GC-B 아고니스트에 의한 억제 효과를 모식적으로 나타낸 도면이다.
본 발명에 있어서, 「나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트」란, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A(이하, 간단히 「GC-A」로 표기하는 경우도 있음(Chinkers M, et al., Nature 338; 78-83, 1989))에 결합하고, 그 구아닐레이트 시클라제를 활성화하는 작용(이하, 「GC-A 아고니스트 활성」)을 가지는 물질을 의미하고, 본 명세서에 있어서는 간단히 「GC-A 아고니스트」로 표기하는 경우도 있다. 대표적인 GC-A 아고니스트로서는, 예를 들면, 심방성 나트륨 이뇨 펩티드(Atrial Natriuretic Peptide: ANP)나 뇌성 나트륨 이뇨 펩티드(Brain Natriuretic Peptide: BNP) 등이 있다. 본 발명의 GC-A 아고니스트는, GC-A 아고니스트 활성을 가지는 것이면 특별히 한정되지 않고, ANP, BNP, 이들의 활성 단편, 이들의 변이체, 이들의 유도체 및 이들의 변형체 등을 사용할 수 있다. 또한, ANP 및 BN와는 구조상 공통성을 가지고 있지 않은 펩티드나 저분자 화합물이라도, GC-A 아고니스트 활성을 가지는 것이면, 본 발명의 GC-A 아고니스트에 포함된다. 본 발명의 의약 등에는, 1 종류 또는 2 종류 이상의 GC-A 아고니스트가 포함될 수도 있지만, 바람직하게는 5 종류 이하이며, 보다 바람직하게는 3 종류 이하이며, 더욱 바람직하게는 1 종류이다.
본 발명에 있어서의 ANP로서는, 28개의 아미노산으로 이루어지는 인간 유래 ANP(SLRRSSCFGG RMDRIGAQSG LGCNSFRY: 서열 번호 1, 본 명세서 중에서, hANP라고도 함), 랫 유래 ANP(SLRRSSCFGG RIDRIGAQSG LGCNSFRY: 서열 번호 2) 등을 예로 들 수 있다. 인간 유래 ANP에 대해서는, Biochem. Biophys. Res. Co㎜un., 118권, 131페이지, 1984년에 기재된 α-hANP가, 일반명 카페리티드(carperitide)로서 일본에서 제조 판매 승인을 취득하고, 판매(상품명: 한프, HANP)되고 있다. α-hANP는, 일반적으로는 Human Pro-ANP[99-126]로서도 알려져 있다.
본 발명에 있어서의 BNP로서는, 32개의 아미노산으로 이루어지는 인간 유래 BNP(SPKMVQGSGC FGRKMDRISS SSGLGCKVLR RH: 서열 번호 3, 본 명세서 중에서, hBNP라고도 함), 돼지 유래 BNP(SPKTMRDSGC FGRRLDRIGS LSGLGCNVLR RY: 서열 번호 4), 랫 유래 BNP(SQDSAFRIQE RLRNSKMAHS SSCFGQKIDR IGAVSRLGCD GLRLF: 서열 번호 5) 등을 예시할 수 있다. 사람 BNP는 일반명 네시리티드(nesiritide)로서 미국 등에서 약사 승인을 받아, 상품명: 나트레코르(Natrecor)로서 판매되고 있다.
또한, 각종 ANP 및 BNP에 있어서, 서열 중에 포함되는 2개의 Cys 잔기 사이의 디술피드 결합에 의해 형성되는 링 구조(예를 들면, hANP에서는, 서열 번호 1의 7번 Cys와 23번 Cys의 사이에서 디술피드 결합하여 링 구조를 형성, hBNP에서는, 서열 번호 3의 10번 Cys와 26번 Cys의 사이에서 디술피드 결합하여 링 구조를 형성)에 포함되는 17개의 아미노산으로 이루어지는 서열 및 그 C 말단에 계속되는 아미노산 서열에 있어서, Cys -Phe -Gly -Xaa1 -Xaa2 -Xaa3 -Asp -Arg -Ieu -Xaa4 -Xaa5 -Xaa6 -Xaa7 -Xaa8 -Leu -Gly -Cys -Xaa9 -Xaa10 -Xaa11 -Arg(여기서, Xaa3은 Met, Leu 또는 Ile를 나타내고, Xaa1∼Xaa2 및 Xaa4∼Xaa11은, 각각 독립적으로, 천연에 존재하는 아미노산, 또는 인공적으로 합성된 아미노산 유사체를 나타냄)(서열 번호 6, 이하 「링 구조 서열 A」라고 함)가, 각종 펩티드 사이에서 양호하게 보존되어 있고, 수용체의 결합과 활성 발현에 중요한 것으로 여겨지고 있다(Silver, MA, Curr. Opin. Nephrol. Hypertens.(2006), 15, p14-21, A. Calderone, Minerva Endocrinol.(2004), 29, p.113-127).
본 발명에 있어서, 「나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트」란, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B(이하, 간단히 「GC-B」로 표기하는 경우도 있음(Suga S., et al., Endocrinology (1992), 130(1), p.229-239))에 결합하고, 그 구아닐레이트 시클라제를 활성화하는 작용(이하, 「GC-B 아고니스트 활성」)을 가지는 물질을 의미하고, 본 명세서에 있어서는 간단히 「GC-B 아고니스트」로 표기되는 경우도 있다. 대표적인 GC-B 아고니스트로서는, 예를 들면, C형 나트륨 이뇨 펩티드(C-type Natriuretic Peptide: CNP)가 있다. 본 발명의 GC-B 아고니스트는, GC-B 아고니스트 활성을 가지는 물질이면 특별히 한정되지 않고, CNP, 그 활성 단편, 이들의 변이체, 이들의 유도체 및 이들의 변형체 등을 사용할 수 있다. 또한, CNP와는 구조상의 공통성을 가지고 있지 않은 펩티드나 저분자 화합물이라도, GC-B 아고니스트 활성을 가지는 것이면, 본 발명의 아고니스트에 포함된다. 본 발명의 의약 등에는, 1 종류 또는 2 종류 이상의 GC-B 아고니스트가 포함되어 있어도 되지만, 바람직하게는 5 종류 이하이며, 보다 바람직하게는 3 종류 이하이며, 더욱 바람직하게는 1 종류이다.
본 발명에 있어서의 CNP로서는, 22개의 아미노산으로 이루어지는 인간 유래 CNP-22(GLSKGCFGLK LDRIGSMSGL GC: 서열 번호 7, 본 명세서 중에서, hCNP-22라고도 함, 돼지 및 랫 등 포유류에서는 공통의 아미노산 서열을 가짐), 53개의 아미노산으로 이루어지는 인간 유래 CNP-53(DLRVDTKSRA AWARLLQEHP NARKYKGANK KGLSKGCFGL KLDRIGSMSG LGC: 서열 번호 8, 본 명세서 중에서, hCNP-53이라고도 함), 닭 유래 CNP(GLSRSCFGVK LDRIGSMSGL GC: 서열 번호 9), 개구리 유래 CNP(GYSRGCFGVK LDRIGAFSGL GC: 서열 번호 10) 등을 예로 들 수 있다.
각종 CNP에 있어서, 서열 중에 포함되는 2개의 Cys 잔기 사이의 디술피드 결합에 의해 형성되는 링 구조(예를 들면, hCNP-22에서는, 서열 번호 7의 6번 Cys와 22번 Cys의 사이에서 디술피드 결합하여 링 구조를 형성)가 GC-B 수용체로의 결합과 활성 발현에 중요한 것으로 여겨지고 있다(Furuya, M. et al, Biochem. Biophys. Res. Co㎜un., (1992), 183, No 3, p.964-969, Silver, MA, Curr. Opin. Nephrol. Hypertens.(2006), 15, p14-21, A. Calderone, Minerva Endocrinol.(2004), 29, p.113-127). Furuya et al의 보고에 의하면, 링 구조만으로 이루어지는 펩티드인 hCNP6-22(서열 번호 7의 아미노산 번호 6 내지 22로 이루어지는 펩티드), 또는 링 구조의 N 말단과 C 말단에 각각 ANP의 N 말단측, 및 C 말단측의 서열을 부가해도, hCNP-22와 대략 동일한 정도의 GC-B 아고니스트 활성을 나타내는 것과, hCNP-22의 9번 Leu와 10번 Lys에 변이를 가지는 펩티드에서는 활성이 감약(減弱)하지만, 그 이외의 부위(예를 들면, 17번 Ser, 18번 Met)에 변이를 가지는 펩티드나 hANP의 10 내지 12 번의 아미노산 서열을 대응하는 hCNP-22의 서열인 Leu-Lys-Leu(서열 번호 7의 9번 내지 11번)로 치환된 펩티드는, hCNP-22와 대략 동일한 정도의 GC-B 아고니스트 활성을 나타내는 것 등이 보고되고 있다. 이들 지견으로부터, GC-B 아고니스트 활성에 중요한 링 구조의 아미노산 서열은, Cys -Phe -Gly -Leu -Lys -Leu -Asp -Arg -Ile -Gly -Xaa1 -Xaa2 -Ser -Gly -Leu -Gly -Cys(여기서, Xaa1은, Ser 또는 Ala, Xaa2는 Met, Phe 또는 Glu를 나타냄: 서열 번호 11)이며, 이하에서, 이 서열을 「링 구조 서열 B」라고 한다.
본 발명에 있어서, 생물 활성을 가지는 펩티드 또는 단백질의 「활성 단편」이란, 상기 펩티드 또는 단백질의 생물 활성과 관련된 부위로 이루어지고, 또한 상기 펩티드 또는 단백질이 가지는 생물 활성 중 적어도 일부를 유지하는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서의 ANP 또는 BNP의 활성 단편으로서, 전술한 GC-A에 결합하고, 그 구아닐레이트 시클라제를 활성화하는 작용을 가지는 펩티드를 사용할 수 있다. 이와 같은 활성 단편으로서는, 전술한 링 구조 서열 A(서열 번호 6의 아미노산 서열)를 가지는 펩티드, 바람직하게는 링 구조 서열 A(서열 번호 6의 아미노산 서열)로 이루어지는 펩티드를 예로 들 수 있다. 그 구체예로서는, 서열 번호 1 또는 2의 7 내지 27 번에 기재된 아미노산 서열, 서열 번호 3 또는 4의 10 내지 30 번에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열 번호 5의 23 내지 43 번에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 등을 예로 들 수 있지만, 이것으로 한정되지 않고, 링 구조 서열 A를 가지고, GC-A 아고니스트 활성을 가지는 것은, 본 발명의 ANP 또는 BNP의 활성 단편으로서 채용할 수 있다.
본 발명에 있어서의 CNP의 활성 단편으로서, 예를 들면, 서열 번호 7 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열 중 적어도 일부 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GC-B 아고니스트 활성을 가지는 펩티드를 바람직하게 사용할 수 있다. 이와 같은 활성 단편으로서는, 전술한 링 구조 서열 B(서열 번호 11의 아미노산 서열)를 가지는 펩티드, 바람직하게는 링 구조 서열 B(서열 번호 11의 아미노산 서열)로 이루어지는 펩티드를 예로 들 수 있고, 그 구체예로서는, hCNP6-22, 서열 번호 7, 9 또는 10의 아미노산 서열의 1번 내지 5번에 있어서, 1번을 포함하는 연속하는 아미노산이 일부 또는 모두 결손된 펩티드, 서열 번호 8의 아미노산 서열의 1번 내지 36번에 있어서, 1번을 포함하는 연속하는 아미노산이 일부 또는 모두 결손된 펩티드 등을 들 수 있지만, 이것으로 한정되지 않고, 링 구조 서열 B를 가지고, GC-B 아고니스트 활성을 가지는 것은, 본 발명의 CNP의 활성 단편으로서 채용할 수 있다.
본 발명의 GC-A 아고니스트 및 GC-B 아고니스트로서는, 전술한 활성 단편 그 자체를 채용할 수도 있고, 또한, 활성 단편의 N 말단, C 말단 또는 그 양쪽에 1개 내지 복수의 아미노산이 부가된 펩티드(활성 단편의 유도체)라도, 원하는 아고니스트 활성을 유지한다면, 채용할 수 있다. 이와 같은 펩티드로서는, hCNP6-22의 N 말단, C 말단 및 그 양쪽에, ANP의 C 말단, 및 N 말단으로부터 유래하는 서열을 부가한 펩티드(Furuya, M. et al, Biochem. Biophys. Res. Co㎜un., (1992), 183, No 3, p.964-969) 등을 예로 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 생물 활성을 가지는 펩티드 또는 단백질의 「변이체」란, 상기 펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열의 1개소∼수개소에 있어서, 1개∼수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는, 부가(이하, 「치환 등」이라고 함)된 것으로서, 또한 상기 펩티드 또는 단백질이 가지는 생물 활성 중 적어도 일부를 유지하는 것을 의미한다. 「수 개소」란, 통상 3개소 정도, 바람직하게는 2개소 정도이다. 「수개」란, 통상 10개 정도, 바람직하게는 5개 정도, 보다 바람직하게는 3개 정도, 더욱 바람직하게는 2개 정도이다. 복수 개소에서 치환 등이 행해지는 경우에는, 치환, 결실, 삽입 및 부가 중 어느 하나라도 되고, 2가지 이상이 조합되어 있어도 된다. 또한, 치환 등이 행해지는 아미노산은, 천연에 존재하는 아미노산이라도 되고, 그 아실화체 등의 변형물이라도 되고, 인공적으로 합성된 아미노산 유사체라도 된다. 또한, 치환 등이 행해지는 부위는, 바탕이 되는 펩티드 또는 단백질의 활성의 일부가 유지된다면, 어느 부위를 선택해도 되지만, 상기 바탕이 되는 펩티드 또는 단백질의 활성 부위 또는 수용체 결합 부위, 그 외의 개소가 치환 등이 행해진 것이 바람직하다. ANP 및 BNP의 변이체로서는, GC-A 아고니스트 활성이 유지된다면, 원하는 부위에 있어서 치환 등이 행해진 것을 채용할 수 있지만, 바람직하게는, 전술한 링 구조 서열 A가 유지되고, 그 이외의 부위에서 치환 등이 행해진 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 예로 들 수 있다.
예를 들면, ANP의 변이체는, GC-A 아고니스트 활성을 가진다면, 예를 들면, 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열 중의 원하는 1개∼복수의 개소에 있어서 1개∼수개의 아미노산이 치환 등이 행해져도 되지만, 바람직하게는, 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열 중의 서열 번호 6으로 표시된 아미노산 이외의 아미노산에 있어서 1개소∼수 개소에서 1개∼수개의 아미노산이 치환 등이 행해진 것이며, 보다 바람직하게는 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 6번 및 28번의 어느 1개소∼수 개소에서 1개∼수개의 아미노산이 치환 등이 행해진 것이다. 또한, BNP의 변이체는, GC-A 아고니스트 활성을 가진다면, 서열 번호 3, 4 또는 5에 기재된 아미노산 서열의 원하는 1개∼복수의 개소에 있어서 1개∼수개의 아미노산이 치환 등이 행해져 있어도 되지만, 바람직하게는, 서열 번호 3, 4 또는 5에 기재된 아미노산 서열 중의 서열 번호 6으로 표시된 아미노산 이외의 아미노산에 있어서 1개소∼수 개소에서 1개∼수개의 아미노산이 치환 등이 행해진 것이며, 보다 바람직하게는 서열 번호 3 또는 4에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 9번, 31번 및 32번의 어느 1개소∼수 개소에서 1개∼수개의 아미노산이 치환 등이 행해진 것, 또는 서열 번호 5에 기재된 아미노산 서열의 1번 내지 22번, 44번 및 45번 중 어느 1개소∼수 개소에서 1개∼수개의 아미노산이 치환 등이 행해진 펩티드 등이다.
ANP의 변이체의 구체예로서는, 예를 들면, hANP의 12번의 Met가 Ile로 치환된 랫 α-rANP(Biochem. Biophys. Res. Co㎜un., 121권, 585페이지, 1984년), N 말단의 Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser가 결실된 hANP 등이 있다. 이와 같은 ANP 또는 BNP 변이체로서는, 예를 들면, Medicinal Research Review, 10권, 115페이지, 1990년에 기재되어 있는 일련의 펩티드 등이 있다. 또한, 아미노산 서열의 1개 내지 복수의 아미노산이 결실되고, 또한 아미노산 서열의 1개 내지 복수의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 예로서는, 예를 들면, 15 아미노산 잔기로 이루어지는 mini-ANP(Science, 270권, 1657페이지, 1995년) 등이 있다.
또한, CNP의 변이체로서는, GC-B 아고니스트 활성이 유지된다면, 원하는 부위에 있어서 치환 등이 행해진 것을 채용할 수 있지만, 바람직하게는, 전술한 링 구조 서열 B가 유지되고, 그 이외의 부위에서 치환 등이 행해진 펩티드를 예로 들 수 있다. 구체적인 CNP의 변이체로서는, GC-B 아고니스트 활성을 가진다면, 서열 번호 7 내지 10에 기재된 아미노산 서열 중의 원하는 1개∼복수의 개소에 있어서 1개∼수개의 아미노산이 치환 등이 행해져 있어도 되지만, 바람직하게는, 서열 번호 7 내지 10 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열 중의 서열 번호 11로 표시된 아미노산 이외의 아미노산에 있어서 1개소∼수 개소에서 1개∼수개의 아미노산이 치환 등이 행해진 것이며, 보다 바람직하게는 서열 번호 7, 9 또는 10에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 5번의 어느 1개소∼수 개소에서 1개∼수개의 아미노산이 치환 등이 행해진 것, 또는 서열 번호 8에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 36번의 어느 1개소∼수 개소에서 1개∼수개의 아미노산이 치환 등이 행해진 것이다.
CNP의 변이체의 구체예로서는, hCNP-22의 17번과 18번에 변이를 가지는 펩티드가 hCNP-22와 동등한 GC-B 아고니스트 활성을 가지는 것, 이와 같은 변이체의 링 구조 부분의 N 말단과 C 말단을 hANP 유래의 서열로 치환한 변이체의 유도체에서도 hCNP-22의 활성의 90% 정도의 GC-B 아고니스트 활성을 나타내는 것, hCNP-22의 9번 내지 11번 중 어느 1개소에 변이를 가지는 펩티드가 hCNP-22의 50% 이상의 GC-B 아고니스트 활성을 나타내는 것, hCNP-22의 10번과 11번의 양쪽에 변이를 가지는 펩티드가 hCNP-22의 40% 이상의 GC-B 아고니스트 활성을 가지는 것 등이 보고되어 있다(Furuya, M. Et al, Biochem. Biophys. Res. Commun.,(1992), 183, No 3, p.964-969). 또한, 다른 문헌에서는, hCNP-22의 각종 변이체가, GC-B 아고니스트 활성을 유지하는 것과, 나아가서는 그 중에는 CNP의 분해 효소인 중성 엔도펩티다아제(NEP)에 의한 절단에 대한 내성을 가지는 것 등에 대하여 기재되어 있다(국제공개 WO 2009/067639호 팜플렛). 또한, 다른 hCNP-22의 유도체로서 CD-NP가 알려져 있다. 이는 hCNP-22의 C 말단에 뱀독 유래의 나트륨 이뇨 펩티드인 DNP (dendroapsis natriuretic peptide)의 C 말단 서열이 부여된 펩티드이며, GC-A 아고니스트 활성과 GC-B 아고니스트 활성의 양쪽을 유지하는 것으로서 알려져 있다(Deborah et al., J. Biol. Chem.,(2008), Vol. 289, No.50, pp.35003-35009).
본 발명에 있어서, 생물 활성을 가지는 펩티드 또는 단백질의 「유도체」란, 통상, 상기 펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열을 포함하고, 또 다른 펩티드 또는 단백질이 부가된 융합 펩티드이며, 또한 상기 생리 활성 펩티드 또는 단백질이 가지는 생물 활성 중 적어도 일부를 유지하는 융합 펩티드를 의미한다. 이와 같은 생물 활성(본 발명에 있어서는, GC-A 또는 GC-B에 결합하고, 그 구아닐레이트 시클라제를 활성화하는 작용) 중 적어도 일부를 가지는 융합 펩티드를, 생리 활성 펩티드의 유도체라고도 한다. 본 발명의 유도체에 있어서, 바탕이 되는 생리 활성 펩티드 또는 단백질의, C 말단 또는 N 말단의 한쪽에 부가 펩티드가 융합되어 있어도 되고, C 말단 및 N 말단의 양쪽에 부가 펩티드가 융합된 것이라도 된다. 부가되는 펩티드로서는, 특별히 한정되지 않지만, 그 펩티드 자신이 생리 활성을 가지지 않는 것이 바람직하다. 또한, 부가 펩티드는 직접 결합하고 있어도 되고, 1개∼수개의 아미노산으로 이루어지는 링커 서열을 통하여 결합하고 있어도 된다. 링커 서열로서는, 다양한 것이 알려져 있지만, Gly, Ser 등을 많이 포함하는 것이 바람직하게 사용된다. 이와 같은 부가 펩티드로서는, 면역 글로블린(바람직하게는 IgG)의 Fc 부위, 혈청 알부민, 그렐린의 C 말단 유래의 부분 서열 등을 예로 들 수 있다(예를 들면, ANP를 면역 글로블린의 Fc 부위와 결합시킨 융합 단백질(미국 특허 출원 공개 US2010-0310561 등 참조), GLP-1을 혈청 알부민과 결합시킨 융합 단백질(국제 공개 WO2002/046227 등 참조). 본 발명의 GC-A 아고니스트로서 사용되는 유도체로서는, ANP 또는 BNP의 유도체, ANP 또는 BNP의 활성 단편의 유도체, ANP 또는 BNP의 변이체의 유도체 등을 예시할 수 있고, 바람직하게는 hANP의 유도체 및 hBNP의 유도체이다. 본 발명의 GC-B 아고니스트로서 사용되는 유도체로서는, CNP의 유도체, CNP의 활성 단편의 유도체, CNP의 변이체의 유도체 등을 예시할 수 있고, 바람직하게는 hCNP-22의 유도체, hCNP-53의 유도체 또는 hCNP6-22의 유도체이다.
GC-A 아고니스트로서 채용되는 유도체의 예로서는, 예를 들면, ANP를 면역 글로블린의 Fc 부위와 결합시킨 융합 단백질(미국 특허 출원 공개 US2010-0310561등 참조)이 ANP의 생물 활성을 유지한 상태에서, 혈중 체류성이 개선되는 것으로 알려져 있다. 또한, ANP 및 BNP의 각종 유도체로서는, 예를 들면, Medicinal Research Review, 10권, 115페이지, 1990년에 기재되어 있는 일련의 펩티드가 있다.
또한, ANP 및 CNP의 유도체의 구체예로서, 국제 공개 제WO2009/142307호 공보(대응 미국 특허 출원 공개 US2010-305031호 공보)에 개시된 각종 ANP 유도체, CNP 유도체 등을 들 수 있다. 여기서는, ANP, CNP, 모틸린 등의 생리 활성 펩티드에, 그렐린의 C 말단으로부터 유래하는, 일반식(1): Wk-Xl-Y-Zm-Wn(여기서, W는 Lys, Arg 등의 알칼리성 아미노산, Y는 Asp, Glu 등의 산성 아미노산, X와 Z는 동일할 수도 있고 상이할 수도 있으며, 산성 아미노산, 알칼리성 아미노산을 제외한 어떠한 아미노산이라도 된다. K 및 n은 서로 독립적으로, 1 또는 2의 정수를 나타내고, l 및 m은, 서로 독립적으로 0, 1 또는 2의 자연수를 나타낸다. 이와 같은 서열로서 바람직하게는, RKESKK, RKDSKK, RKSEKK, RKSDKK 등을 들 수 있다)에 의해 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 부분 펩티드를 부가한 유도체에 있어서, 원 펩티드의 생리 활성을 유지한 상태에서, 혈중 체류성이 개선된 것으로 보고되어 있다. 본 발명에 있어서의 그렐린의 C 말단 유래의 부분 서열로서 국제 공개 제WO2009/142307호 공보(대응 미국 특허 출원 공개 US2010-305031호 공보)에 기재되어 있는 상기 일반식(1)으로 표시되는 서열을 포함하는 아미노산 서열이 바람직하다. 국제 공개 제WO2009/142307호 공보에서는, hANP의 N 말단 또는 C 말단의 어느 한쪽 및 이들 양쪽에 전술한 그렐린의 C 말단 유래의 부분 펩티드를 부가한 다양한 유도체 모두에 있어서, GC-A 아고니스트 활성이 유지되고, 그 혈중 반감기가 연장되었다. 이와 같은 복합 ANP (A), (B), (C)(서열 번호 12 내지 14) 등은, 본 발명에 있어서의 ANP의 유도체의 바람직한 구체예로서 예시할 수 있다. 또한, hCNP6-22의 N 말단 또는 C 말단의 어느 한쪽 및 이들 양쪽에 전술한 그렐린의 C 말단 유래의 부분 펩티드를 부가한 다양한 유도체 모두에 있어서, GC-B 아고니스트 활성이 유지되고, 그 혈중 반감기가 연장되었다. 이와 같은, 복합 CNP (A) 내지 (K)(서열 번호 15 내지 25)는, 본 발명에 있어서의 CNP의 유도체의 바람직한 구체예로서 예시할 수 있다.
예를 들면, 서열 번호 12의 복합 ANP(A) 등에 있어서 부가된 그렐린의 C 말단 유래의 부분 펩티드는, VQQRKESKKPPAKLQPR(서열 번호 12에서는, hANP의 C 말단 측에 결합한, 23번 내지 45번에 기재된 아미노산 서열)이다. 또한, 서열 번호 23의 복합 CNP(I)에서는, 이 부가 펩티드의 C 말단의 Arg가 아미드화되어 있다.
서열 번호 14의 복합 ANP(C) 등에 있어서, 부가된 그렐린의 C 말단 유래의 부분 펩티드는, RPQLKAPPKKSEKRQQV(서열 번호 14에서는, hANP의 N 말단 측에 결합한, 1번 내지 17번의 아미노산 서열)이다.
서열 번호 19의 복합 CNP(E)에서는, CNP의 N 말단측과 C 말단 측의 양쪽에, VQQRKESKKPPAKLQPR이, 서열 번호 20의 복합 CNP(F)에 있어서는, CNP의 N 말단 측에 RPQLKAPPKKSEKRQQV가, 그 C 말단 측에는 VQQRKESKKPPAKLQPR가, 각각 그렐린 유래의 부분 펩티드로서 부가되어 있다.
서열 번호 24의 복합 CNP(J)에 있어서는, 23번 내지 39번에 기재된 아미노산으로 이루어지는 서열(VQQRKDSKKPPAKLQPR)이; 서열 번호 25의 복합 CNP(K)에 있어서는, 18번 내지 36번의 아미노산 서열(AGSVDHKGKQRKVVDHPKR)이, 각각 부가된 그렐린의 C 말단 유래의 부분 펩티드이다.
국제 공개 제WO2009/142307호 공보에서는, 상기 서열 번호 12∼25의 복합 ANP, 복합 CNP 이외에도, 동일한 그렐린의 C 말단 유래의 부분 서열을 결합시킨 다수의 복합 모틸린에 대해서도 시험하고, 펩티드에 있어서의 부가된 그렐린의 C 말단 유래의 부분 펩티드 중에, 혈중 반감기 연장 작용을 발휘하는 코어 서열로서 상기 일반식(1)으로 표시되는 배열을 특정했다. 이 코어 서열의 구체예로서는, RKESKK(예를 들면, 서열 번호 12의 26번 내지 31번의 아미노산 서열) 또는 그 역배열(KKSEKR), RKDSKK(서열 번호 24의 26번 내지 31번의 아미노산 서열)이다. 또한 이들 지견에 의하면, 상기 일반식으로 표시되는 아미노산 서열에 포함되는 부분 펩티드(예를 들면, RKSEKK, RKSDKK 등)를 코어 서열로서 포함하는 반감기 연장 펩티드는, 생리 활성 펩티드의 활성을 유지한 상태에서 혈중 반감기를 연장하는 것으로 여겨지며, 본 발명에 있어서 펩티드의 유도체에 부가되는 부분 서열로서 사용할 수 있다.
또한, CNP 또는 그 활성 단편의 유도체의 다른예로서, hCNP-22의 C 말단에 ANP의 C 말단 부분이 부가한 펩티드, 및 hCNP6-22의 N 말단 및 C 말단에 ANP의 N 말단 부분 및 C 말단 부분이 부가한 펩티드(CNP 활성 단편의 유도체)에 있어서도, CNP-22와 동일한 정도의 GC-B 아고니스트 활성이 유지되고 있다(Furuya, M. Et al, Biochem. Biophys. Res. Co㎜un., (1992), 183, No 3, p.964-969). 또한, 다른 문헌에 있어서, hCNP-22 및 hCNP-53의 각종 유도체가, GC-B 아고니스트 활성을 유지하는 것과, 그 중의 복수의 유도체가 또한 NEP 분해 내성을 가지는 것 등에 대하여 기재되어 있다(국제 공개 제WO2009/067639호 팜플렛).
이들 기존의 나트륨 이뇨 펩티드의 유도체는, 본 발명의 GC-A 아고니스트 및/또는 GC-B 아고니스트로서 채용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 생물 활성을 가지는 펩티드 또는 단백질의 「변형체」란, 상기 펩티드 또는 단백질에 포함되는 아미노산의 1개소 내지 수 개소가, 다른 화학물질과의 화학 반응에 의해 변형된 것으로, 또한 상기 펩티드 또는 단백질이 가지는 생물 활성 중 적어도 일부를 유지하는 것을 의미한다. 변형되는 부위는, 바탕이 되는 펩티드 또는 단백질의 활성을 유지한다면, 어느 부위를 선택해도 된다. 예를 들면, 폴리머와 같은 어느 정도 큰 화학 물질을 부가하는 변형에서는, 펩티드 또는 단백질의 활성 부위, 또는 수용체 결합 부위 이외의 개소에 있어서 변형되는 것이 바람직하다. 또한, 분해 효소에 의한 절단을 방지하기 위한 변형의 경우, 상기 절단을 받는 개소가 변형된 것도 채용할 수 있다.
화학적 변형의 방법으로서는, 다양한 방법이 알려져 있지만, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐 알코올(PVA) 등 제약 기술에 있어서 이용되는(약리적으로 사용되는) 고분자 폴리머를 부가하는 방법이나, Lys 잔기 등의 측쇄의 아미노기에 링커로 되는 화합물을 부가시키고, 이를 통해 다른 단백질 등(예를 들면, 혈청 알부민)과 결합시키는 방법 등이 알려져 있지만, 이들로 한정되지 않고, 다양한 방법을 채용할 수 있다. 또한, 다양한 생리 활성 펩티드의 변형체의 제조 방법에 대해서는, 예를 들면, 미국 특허 출원 공개 US2009-0175821호 등을 참고하여, 적절하게 제작할 수 있다. 변형체는, 바람직하게는 제약상 사용되는 고분자 폴리머를 부가함으로써 화학적으로 변형된 것이다.
예를 들면, ANP의 변형체는, GC-A 아고니스트 활성을 가진다면, 서열 번호 1 또는 2의 아미노산 서열 중의 원하는 1개∼복수의 개소에 있어서 변형되어 있어도 되지만, 바람직하게는, 서열 목록의 서열 번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하고, 그 서열 번호 6으로 표시된 아미노산에 상당하는 것 이외의 아미노산 중 적어도 1개에 있어서, 화학적으로 변형되어 있는 것이다. 보다 바람직하게는, 서열 번호 1 또는 2의 아미노산 서열 중의 서열 번호 6으로 표시된 아미노산 이외의 아미노산에 있어서 1개소∼수 개소에서 변형된 것이며, 보다 바람직하게는 서열 번호 1 또는 2의 아미노산 서열의 1 내지 6번 및 28번 중 어느 1개소∼수 개소에서 변형된 것이다. 또한, BNP의 변이체는, GC-A 아고니스트 활성을 가진다면, 서열 번호 3, 4 또는 5의 아미노산 서열의 원하는 1개∼복수의 개소에 있어서 변형되어 있어도 되지만, 바람직하게는, 서열 목록의 서열 번호 3, 4 또는 5의 아미노산 서열을 포함하고, 그 서열 번호 6으로 표시된 아미노산에 상당하는 것 이외의 아미노산 중 적어도 1개에 있어서, 화학적으로 변형되어 있는 것이다. 보다 바람직하게는, 서열 번호 3, 4 또는 5의 아미노산 서열 중의 서열 번호 6으로 표시된 아미노산 이외의 아미노산에 있어서 1개소∼수 개소에서 변형된 것이며, 보다 바람직하게는 서열 번호 3 또는 4의 아미노산 서열의 1 내지 9번, 31번 및 32번 중 어느 1개소∼수 개소에서 변형된 것, 또는 서열 번호 5에 기재된 아미노산 서열의 1번 내지 22번, 44번 및 45번 중 어느 1개소∼수 개소에서 변형된 것이다. 또한, 전술한 ANP 또는 BNP의 활성 단편, 변이체 및 이들의 유도체의 변형체도 본 발명에 포함된다. 이와 같은 각종 변형체도 GC-A 아고니스트 활성을 유지한다면, 본 발명에 사용할 수 있다.
이와 같은 GC-A 아고니스트로서 채용될 수 있는 변형체의 구체예로서는, 예를 들면, hBNP, 그 변이체 및 그 활성 단편에, PEG, PVA 등의 친수성 폴리머, 또는 알킬기, 아릴기 등의 탄화수소기로 대표되는 소수성기가 결합된 각종 변형체에 있어서, GC-A 아고니스트 활성을 유지하는 것으로 알려져 있다(미국 특허 USP7,662,773호 등 참조).
ANP 또는 BNP와 GC-A 수용체와의 결합은, ANP 및 BNP의 링 구조와 그 C 말단 테일 부분이 중요하므로, 특히 그 N 말단부에 다른 서열 또는 물질이 결합한 유도체 및 변형체는, 그 부가 펩티드나 변형물이 링 구조에 영향을 미치는 경우가 적고, GC-A 수용체와의 결합을 저해하지 않고 GC-A 아고니스트 활성을 유지하게 된다. 이는, 전술한 많은 문헌에 의해 실증되고 있다.
또한, CNP의 변형체는, GC-B 아고니스트 활성을 가진다면, 서열 번호 7 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열 중의 원하는 1개∼복수의 개소에 있어서 변형되어 있어도 되지만, 바람직하게는, 서열 목록의 서열 번호 7 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 그 서열 번호 11로 표시된 아미노산에 상당하는 것 이외의 아미노산 중 적어도 하나에 있어서, 화학적 변형을 받고 있는 것이며, 보다 바람직하게는, 서열 번호 7 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열 중의 서열 번호 11로 표시된 아미노산 이외의 아미노산에 있어서 1개소∼수 개소에서 변형된 것이며, 더욱 바람직하게는 서열 번호 7, 9 또는 10의 아미노산 서열의 1 내지 5번의 어느 1개소∼수 개소에서 변형된 것이다. 또한, 예를 들면, 효소 NEP에 의한 절단에 대한 내성을 부여하는 변형의 경우에는, 각종 CNP 펩티드에 포함되는, 링 구조 서열 B에 있어서 서열 번호 11의 1번 Cys와 2번 Phe의 사이에서 절단되는 것으로 알려져 있기 때문에, 이 사이의 결합을 변형할 수도 있다.
또한, 전술한 CNP의 활성 단편, 변이체 및 이들 유도체의 변형체도 본 발명에 포함된다. 이와 같은 각종 변형체도 GC-B 아고니스트 활성을 유지한다면, 본 발명에 사용할 수 있다.
이와 같은 CNP, 그 활성 단편, 이들 변이체 및 이들 유도체의 변형체의 구체예로서는, 예를 들면, 국제 공개 WO2009/067639호 팜플렛에 있어서, hCNP-22 및 hCNP-53에 PEG 등의 각종 친수성 폴리머를 결합시킨 변형체나, hCNP-22에 있어서 NEP에 의한 절단 부위인 Cys6-Phe7의 펩티드 결합이 (-CH2-NH-), (-C(=O)-N(R)-: R은, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기, tert-부틸기 등의 저급 알킬기를 나타냄) 등의 위(僞) 펩티드 결합에 치환된 변형체의 복수개가, GC-B 아고니스트 활성을 유지하고, 또한, 그 대부분이 hCNP-22보다 개선된 혈중 체류성을 가지는 것으로 개시되어 있다. 또한, 다양한 생리 활성 펩티드의 변형체의 제조 방법에 대해서는, 예를 들면, 미국 특허 출원 공개 US2009-0175821호 등을 참고하여 적절하게 제작할 수 있다.
CNP와 GC-B 수용체와의 결합은, CNP의 링 구조가 중요하므로, 특히 그 C 말단 및/또는 N 말단부에 다른 서열 또는 물질이 결합한 유도체 및 변형체는, 그 부가 펩티드나 변형물이 링 구조에 영향을 미치는 경우가 적고, GC-B 수용체와의 결합을 저해하지 않고 GC-B 아고니스트 활성을 유지하게 된다. 이는, 전술한 많은 문헌에 의해 실증되고 있다.
상기 ANP, BNP 및 CNP, 이들 활성 단편, 이들의 변이체, 이들의 유도체 및 이들의 변형체는, 천연의 세포 또는 조직으로부터 채취된 것이라도 되고, 유전자 공학적, 세포 공학적인 방법을 이용하여 생산한 것이라도 되며, 화학적으로 합성한 것이라도 되고, 또한 이들을 효소 처리나 화학 처리하여 아미노산 잔기를 변형 또는 아미노산 서열의 일부를 제거한 것이라도 된다. 이와 같은 제조는, 본 명세서에 기재된 문헌을 참고하여, 통상적인 방법에 따라 적절하게 이루어질 수 있다.
어떤 물질이, GC-A 아고니스트 활성을 가지는지의 여부에 대해서는, 당업자이면 종래 알려져 있는 방법에 의해 용이하게 측정을 실시할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, GC-A(Chinkers M, et al., Nature 338; 78-83, 1989)를 강제 발현시킨 배양 세포에 물질을 첨가하고, 세포내 cGMP 레벨을 측정함으로써 가능하게 된다. GC-A 아고니스트 활성의 일부가 유지된다는 것은, 동일한 시험계를 사용하여, GC-A 아고니스트 물질과 ANP 또는 BNP(상기 아고니스트 물질이 ANP 또는 BNP의 서열을 참고로 하여 제작된 것인 경우에는, 상기 참고로 한 펩티드)를 배열하여 GC-A 아고니스트 활성을 측정한 경우에, 상기 아고니스트 물질에 의한 cGMP 상승 활성의 피크가, 적어도 ANP 또는 BNP가 나타내는 cGMP 상승 활성 피크의 약 10% 이상을 유지하는 것을 통상 의미하지만, 바람직하게는 약 30% 이상을 유지하는 것이며, 보다 바람직하게는 약 50% 이상을 유지하는 것이며, 또한 더욱 바람직하게는 약 70% 이상을 유지하는 것을 의미한다. 또한, 피크에 있어서 활성의 상승이 크지 않아도, 생체에 투여한 경우의 활성 지속 시간이 긴 것은, 본 발명에 사용할 수 있다.
어떤 물질이, GC-B 아고니스트 활성을 가지는지의 여부에 대해서는, 당업자이면 종래 알려져 있는 방법에 의해 용이하게 측정을 실시할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, GC-B(Chinkers M, etal., Nature 338; 78-83, 1989)를 강제 발현시킨 배양 세포에 물질을 첨가하고, 세포내 cGMP 레벨을 측정함으로써 가능하게 된다. GC-B 아고니스트 활성의 일부가 유지된다는 것은, 동일한 시험계를 사용하여, GC-B 아고니스트 물질과 CNP를 배열하여 GC-B 아고니스트 활성을 측정한 경우에, 상기 아고니스트 물질에 의한 cGMP 상승 활성의 피크가, 적어도 CNP가 나타내는 cGMP 상승 활성 피크의 약 10% 이상을 유지하는 것을 통상 의미하지만, 바람직하게는 약 30% 이상을 유지하는 것이며, 보다 바람직하게는 약 50% 이상을 유지하는 것이며, 또한 더욱 바람직하게는 약 70% 이상을 유지하는 것을 의미한다. 또한, 피크에 있어서 활성의 상승이 크지 않아도, 생체에 투여한 경우의 활성 지속 시간이 긴 것은, 본 발명에 사용할 수 있다.
또한, 이와 같은 평가계에 대하여, 저분자 화합물을 첨가하고, cGMP 생산능이 향상되는 화합물이면, 나트륨 이뇨 펩티드와 공통되는 구조를 가지고 있지 않은 것(예를 들면, 저분자 화합물)이라도, GC-A 아고니스트 또는 GC-B 아고니스트로서 본 발명에 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서의 GC-A 아고니스트로서 바람직한 것은, ANP, BNP, 그 링 구조 서열 A를 가지는 활성 단편, 또는 그 링 구조 서열 A 이외에 있어서 치환 등이 행해된 변이체, 이들의 유도체 또는 변형체이며, 보다 바람직하게는 hANP, hBNP, 이들의 유도체 또는 이들의 변형체이며, 더욱 바람직하게는, hANP 또는 hBNP이다.
본 발명에 있어서의 GC-B 아고니스트로서 바람직한 것은, CNP, 그 링 구조 서열 B를 가지는 활성 단편, 또는 그 링 구조 서열 B 이외에 있어서 치환 등이 행해진 변이체, 이들의 유도체 또는 변형체이며, 보다 바람직하게는 hCNP-22, hCNP-53, 그 활성 단편인 hCNP6-22, 이들의 유도체 또는 이들의 변형체이며, 더욱 바람직하게는, hCNP-22, hCNP-53 또는 hCNP6-22이다.
본 발명에 따른 의약의 유효 성분으로서 이용할 수 있는 물질은, 전술한 GC-A 아고니스트 또는 GC-B 아고니스트의 약학적으로 허용되는 염일 수도 있고, 바람직하게는 hANP, hBNP 또는 hCNP-22, hCNP-53 또는 hCNP6-22의 약학적으로 허용되는 염일 수도 있다. 즉, 본 발명에 있어서는, 전술한 물질의, 무기산, 예를 들면, 염산, 황산, 인산, 또는 유기산, 예를 들면, 포름산, 아세트산, 부티르산, 숙신산, 구연산 등의 산 부가 염을, 유효 성분으로서 사용할 수도 있다. 또는, 본 발명에 있어서는, 전술한 물질의, 나트륨, 칼륨, 리튬, 칼슘 등의 금속염, 유기 염기에 의한 염의 형태를 유효 성분으로서 사용할 수도 있다. 또한, 본 발명에 따른 의약에 있어서의 유효 성분은, 그 유효 성분에 관한 물질의 유리형(遊離型)으로 만들 수도 있고, 또는 그 의약적으로 허용할 수 있는 염일 수도 있다.
또한, 본 발명의 의약의 유효 성분으로서는, 단일 물질 중에 GC-A 아고니스트와 GC-B 아고니스트로서의 양쪽 성질을 겸비하는 물질(본 발명에서는, 「양 활성 물질」이라고도 함)을 사용할 수도 있다. 이와 같은 양 활성 물질을 유효 성분으로서 포함하는 경우, 상기 물질만을 유효 성분으로서 포함해도 본 발명의 효과가 달성되지만, 그 활성의 정도에 따라서는, 전술한 GC-A 아고니스트 또는 GC-B 아고니스트를 조합하여 별도로 투여할 수도 있다. 이와 같은 양 활성 물질로서는, GC-A 아고니스트 활성과 GC-B 아고니스트 활성의 양쪽을 유지하는 물질이면 특별히 한정되지 않는다. 이와 같은 물질로서는, 예를 들면, 링 구조 서열 A(서열 번호 6)와 링 구조 서열 B(서열 번호 11)의 양쪽을 동일 분자 중에 포함하는 물질(예를 들면, 양쪽의 서열을 포함하는 융합 펩티드나, 양쪽의 서열로 이루어지는 펩티드가 링커 화합물을 통하여 연결된 변형체 등)이나, 링 구조 서열 A와 링 구조 서열 B의 특징을 융합하여 겸비하는 아미노산 서열을 포함하는 물질 등이 있다. 이와 같은 양 활성 물질의 구체예로서는, CD-NP가 알려져 있다. 이것은 hCNP-22의 C 말단에 뱀독 유래의 나트륨 이뇨 펩티드인 DNP(dendroapsis natriuretic peptide)의 C 말단 서열이 부여된 펩티드이며, GC-A 아고니스트 활성과 GC-B 아고니스트 활성의 양쪽을 유지하는 것으로서 알려져 있다(Deborah et al., J. Biol. Chem., (2008), Vol. 289, No.50, pp.35003-35009). 또한, 다른예로서는, hANP(서열 번호 1)의 9번 내지 11번을, Leu- Lys- Lue로 치환한 펩티드에 있어서, GC-A 아고니스트 활성과 GCB-아고니스트 활성의 양쪽이 유지되고 있다(Furuya, M. Et al, Biochem. Biophys. Res. Co㎜un., (1992), 183, No 3, p.964-969).
도 11에 나타낸 바와 같이, 생체의 실제 악성 종양에 있어서의 종양 조직은 암 세포만으로 구성되어 있는 것은 아니며, 암 간질과 암 세포가 혼재한 형태로 덩어리로서 존재하고 있다. 암 간질은, 암관련 섬유아 세포(CAF), 염증성 마크로파지, 혈관 내피 세포 등으로 구성되어 있고, CAF는 암 간질의 대부분을 차지하고 있다.
GC-A 아고니스트는, 암 세포의 악성화의 계기가 되는 EMT를 억제하는 효과를 가진다. 그러나, GC-A 아고니스트는, 도 12에 나타낸 바와 같이 악성 종양의 종양 조직에 있어서 암 세포와 혼재하고 있는 암 관련 섬유아 세포(CAF)로 대표되는 암 간질에 대해서는 작용하지 않으므로, 악성 종양 환자에게 단독으로 투여한 경우에는, CAF가 생산하는 성장 인자, 사이토카인 등에 의해 암 세포가 자극을 받으므로, GC-A 아고니스트에 의한 EMT 억제 효과는 감약(減弱)하는 경우가 있다.
한편, GC-B 아고니스트는, CAF의 TGF-β 등의 자극에 따른 VEGF나 PDGF 등의 성장 인자나, TNF-α, IL-6 등의 사이토카인의 생산 항진을 억제하는 작용이 있다. 그러나, 암 세포 자체에 대해서는 작용하지 않으므로, 실제 악성 종양의 종양 조직에 있어서는 충분한 치료 효과가 얻어지지 않는 것으로 여겨진다.
본 발명은, 이들 GC-A 아고니스트와 GC-B 아고니스트를 조합하여 투여함으로써, 도 12에 모식적으로 나타낸 바와 같이, 암 세포와 CAF의 활성을 동시에 억제하고, 종양 조직 전체에 작용함으로써 악성 종양을 효과적으로 치료하거나, 또는 종양의 악성화를 효과적으로 억제 또는 예방하는 것을 가능하게 하는 것이다. 본 발명은, 이와 같은 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트, 및 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트를 조합한 악성 종양의 치료 또는 악성화의 억제 또는 예방 방법, 거기에 사용되는 의약 등을 제공한다.
복수의 유효 성분 또는 약제가 「조합하여 투여되는 의약」이란, 상기 유효 성분 또는 약제가 조합하여 투여되는 것을 상정(想定)한 의약이다. 이 경우에, 각각의 유효 성분이 단일 제제 중에 배합되어 있어도 되고, 키트로서 하나의 제품 중에 양쪽이 포함되어 있어도 된다. 또한, 각각의 유효 성분이, 상이한 제제로서 제품화되어 그 한쪽의 유효 성분을 포함하는 제품에 첨부된 서류에, 다른 쪽의 유효 성분과 조합하여 투여할 수 있는 것이 기재되어 있어도 된다. 「조합하여 투여된다」의 문언은, 예를 들면, 「조합하여 이루어진다」, 「조합하여 사용된다」, 「조합하여 복용된다」, 「동일 기간중에 투여된다」, 「동일한 치료에 사용된다」 등의 문언과 대체할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 복수의 유효 성분 또는 약제가 「조합하여 투여된다」란, 어느 일정 기간에 있어서, 피투여 대상이, 조합되는 모든 유효 성분 또는 약제를 그 체내에 받아들이는 것을 의미한다. 모든 유효 성분이 단일 제제 중에 포함된 제제가 투여될 수도 있고, 또한 각각의 유효 성분이 별개로 제제화되어 별개로 이들 모두가 투여될 수도 된다. 별개로 제제화되는 경우, 그 투여 시기는 특별히 한정되지 않고, 동시에 투여될 수도 있고, 시간을 두고 상이한 시간에, 또는 상이한 날에, 투여될 수도 있다. 그리고, 복수의 유효 성분 또는 약제가 「조합하여 투여된다」에는, GC-A 아고니스트 및 GC-B 아고니스트로서 작용하는 양 활성 물질이 단독으로 투여되는 것도 포함된다. 복수의 유효 성분이, 각각 상이한 시간 또는 날에 투여되는 경우, 유효 성분의 투여의 순번은 특별히 한정되지 않는다. 통상, 각각의 제제는, 각각의 투여 방법에 의해 투여되므로, 이들 투여는, 동일 횟수로 이루어지는 경우도 있고, 상이한 횟수로 이루어지는 경우도 있다. 또한, 각각의 유효 성분이 별개로 제제화되는 경우, 각 제제의 투여 방법(투여 경로)은 동일할 수도 있고, 상이한 투여 방법(투여 경로)으로 투여될 수도 있다. 또한, 모든 유효 성분이 동시에 체내에 존재할 필요는 없으며, 어느 일정 기간(예를 들면, 1개월, 바람직하게는 1주일, 보다 바람직하게는 몇일, 또한 더욱 바람직하게는 1일)의 사이에, 모든 유효 성분이 체내에 받아들여지고 있으면 되며, 하나의 유효 성분 투여시에 다른 유효 성분이 체내로부터 소실되어 있어도 된다.
본 발명의 의약의 투여 형태를 예시하면, 예를 들면, 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트, 및 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트가, 조합하여 투여되는 의약이면, 1) 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트, 및 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트를 포함하는 단일 제제의 투여, 2) 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트와 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트를 별개로 제제화하여 얻어지는 2종의 제제의 동일 투여 경로에서의 동시 투여, 3) 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트와 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트를 별개로 제제화하여 얻어지는 2종의 제제의 동일 투여 경로에서의 시간차를 둔 투여, 4) 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트와 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트를 별개로 제제화하여 얻어지는 2종의 제제의 상이한 투여 경로에서의 동시 투여, 5) 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트와 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트를 별개로 제제화하여 얻어지는 2종의 제제의 상이한 투여 경로에서의 시간차를 둔 투여(예를 들면, 먼저 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트를 유효 성분으로 하는 제제를 투여하고, 일정 시간 경과 후, 다음에, 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트를 유효 성분으로 하는 제제를 투여하는, 순서의 투여, 또는 그 역순의 투여) 등을 예로 들 수 있다.
본 발명에 있어서 「유효 성분」이란, 의약품에 포함되는 조성의 하나이며, 상기 의약품이 목적으로 하는 약리 작용 중 적어도 일부 작용을 가지는 조성을 의미한다. 의약품에 대한 함유량/함유 비율은 특별히 한정되지 않고, 상기 조성이 가지는 약리 작용의 정도에 의존하며, 다양한 비율로 배합될 수 있다.
본 발명의 의약은, 본 발명의 효과를 얻을 수 있다면, 유효 성분 이외의 성분을 포함할 수도 있다. 유효 성분 이외에, 공지의 약리학적으로 허용할 수 있는 담체, 부형제, 희석제 등을 포함하는 조성물로 하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 의약의 유효 성분으로서 이용할 수 있는 물질 또는 그 약리학적으로 허용할 수 있는 염은, 공지의 약리학적으로 허용할 수 있는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 의약에 일반적으로 사용되고 있는 투여 방법, 즉 경구 투여 방법, 또는, 경점막 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여 또는 피하 투여 등의 비경구 투여 방법에 의해 개체에 투여하는 것이 바람직하다.
유효 성분이 펩티드성 물질인 경우, 소화관 내에서 쉽게 분해되지 않는 제제, 예를 들면, 활성 성분인 펩티드를 리보솜 중에 포용(包容)한 마이크로 캡슐제로서 경구 투여할 수도 있다. 또한, 직장(直腸), 비내(鼻內), 설하(舌下) 등의 소화관 이외의 점막으로부터 흡수하는 투여 방법도 사용 가능하다. 이 경우에는 좌제(坐劑), 점비(点鼻) 스프레이, 흡입약, 설하정(舌下錠)과 같은 형태로 개체에 투여할 수 있다. 또한, 덱스트란 등의 다당류, 폴리아민, PEG 등으로 대표되는 생분해성 고분자를 캐리어로 한 각종 방출 제어 제제, 지속화 제제 등을 채용함으로써, 펩티드의 혈중 체류성을 개선시킨 제제도, 본 발명에 있어서 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 의약의 유효 성분으로서 이용할 수 있는 물질의 투여량은, 질환의 종류, 개체(환자)의 연령, 체중, 증상의 정도 및 투여 경로 등에 따라 상이하지만, 일반적으로, 1종류의 유효 성분에 대하여, 1일당 합계 투여량의 상한으로서는, 예를 들면, 약 100 mg/kg 이하이며, 바람직하게는 약 50 mg/kg 이하이며, 더욱 바람직하게는 1 mg/kg 이하이다. 또한, 1종류의 유효 성분의 1일당 합계 투여량의 하한으로서는, 예를 들면, 약 0.1μg/kg 이상이며, 바람직하게는 0.5μg/kg 이상이며, 더욱 바람직하게는, 1μg/kg 이상이다.
본 발명에 따른 약제(의약)의 투여 빈도는, 사용하는 유효 성분, 투여 경로, 및 처치(處置)하는 특정 질환에 의해서도 변동한다. 예를 들면, 나트륨 이뇨 펩티드를 경구 투여하는 경우, 1일당 4회 이하의 투여 횟수로 처방하는 것이 바람직하고, 또한 비경구 투여, 예를 들면, 정맥내 투여하는 경우에는 주입 펌프(infusion pump), 카테터(catheter) 등을 이용하여 지속적으로 투여하는 것이 바람직하다.
ANP, BNP, CNP 등의 펩티드 또는 이들의 염을 투여하는 경우에는, 예를 들면, 동결 건조 제제를 주사용수에 혼합하여 미량 수액 펌프(그것이 없는 경우에는, 소아용 미량 수액 세트) 등을 사용하여 연속 투여(계속 투여라고도 함)하면 된다. 연속 투여하는 경우의 투여 기간으로서는, 통상 수 시간∼몇 일간이며, 예를 들면, 1 내지 14 일간이며, 바람직하게는 3∼7 일간 정도이다. 이 경우의 투여량의 유효 성분으로서의 상한은, 각 유효 성분에 대하여, 예를 들면, 약 50μg/kg/분(1일당, 약 72 mg/kg) 이하의 농도를 적절하게 채용할 수 있고, 약 5μg/kg/분(1일당, 약 7.2 mg/kg) 이하라도 되고, 바람직하게는 약 0.5μg/kg/분(1일당, 약 720μg/kg) 이하이며, 보다 바람직하게는 약 0.2μg/kg/분 이하이며, 더욱 바람직하게는 약 0.1μg/kg/분 이하이며, 가장 바람직하게는 약 0.05μg/kg/분 이하이다. 또한 하한으로서는, 통상 약 0.0001μg/kg/분(1일당 약 0.144μg/kg) 이상이며, 바람직하게는 약 0.001μg/kg/분(1일당 약 1.44μg/kg) 이상, 더욱 바람직하게는 약 0.01μg/kg/분(1일당 약 14.4μg/kg) 이상이다. 구체적인 투여 방법으로서는, 예를 들면, 3 내지 4일간 정도, 약 0.025μg/kg/분을 채용할 수 있으며, 이 경우의 1일당 투여량은, 유효 성분으로서 약 36μg/kg이 된다.
나트륨 이뇨 펩티드는, 전술한 바와 같이 혈관을 이완·확장하여 혈압을 저하시키는 작용을 가지므로, 악성 종양의 치료 또는 악성화의 억제 또는 예방에 있어서는, 혈압을 필요 이상으로 저하시키지 않는 속도로 투여하는 것이 바람직하고, 투여시 및 투여 직후에는 혈압을 모니터링하는 것이 바람직하다. 또한, 이 경우의 hANP 등의 투여 기간은, 통상 수 시간 이상, 바람직하게는 1일간 이상이다. 이 기간 동안, 계속 투여하는 것이 바람직하고, 그 기간은 통상 1일 이상이며, 바람직하게는 1∼14 일간 정도이며, 더욱 바람직하게는, 1∼5 일간 정도이다. 장기간에 걸쳐 악성 종양을 제어하는 경우, 전술한 투여 방법을 적절하게 반복하거나, 환자의 상태에 따라 투여량이나 투여 기간을 적절하게 변경할 수 있다.
구체적으로 ANP를, 예를 들면, 정맥에 투여하는 경우에는, 예를 들면, hANP의 1000μg(예를 들면, 한프 주사용(hANP for injection) 1000(상품명), 다이이치산쿄(주) 제조)을 주사용수 10 mL에 용해하고, "체중×약 0.06 mL/시간"의 속도(약 0.1μg/kg/분) 또는 그 이하의 투여 속도로 투여하는 것이 바람직하다. 투여 속도는, 상기 속도로 한정되지 않으며, 병세에 따라, 약 0.2μg/kg/분 이하의 속도(바람직하게는, 약 0.01μg/kg/분 이상)로, 혈압이나 심박수를 모니터링하면서 적절하게 조정하는 것이 바람직하다. 특히, hANP를, 약 0.025μg/kg/분의 용량으로 3 또는 4일간 정도 계속 투여해도, 혈압, 심박 등의 혈행 동태를 크게 변동시키지 않는 것이 확인되어 있어, 이 용량 용법을 채용하는 것도 바람직하다.
hBNP를, 예를 들면, 정맥에 투여하는 경우에는, 예를 들면, 약 0.01μg/kg/분으로 연속 투여하는 것이 바람직하고, 또한 그 연속 투여 전에, 약 2μg/kg의 hBNP를 볼러스(bolus) 투여하는 것을 조합한 투여 방법을 채용할 수도 있다. 이 경우에도, 혈압을 필요 이상으로 저하시키지 않는 속도로 투여하는 것이 바람직하고, 투여시 및 투여 직후에는 혈압을 모니터링하는 것을 추천한다. ANP 및 BNP가 상기 투여 속도에서 혈압이나 심박수 등에 큰 영향을 미치지 않는 경우에는, 투여 속도를 더 높일 수도 있다.
본 발명에서는 전술한 바와 같은 현재 임상에서 적용되고 있는 hANP, 또는 hBNP 등의 투여에, CNP 등의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트를 추가로 투여할 수도 있다. 이 경우에, CNP의 투여량은 ANP, BNP의 투여량을 참고하여 설정할 수도 있고, 병세에 따라 적절하게 변경하여 투여할 수도 있다. 예를 들면, hCNP-22를 연속 투여하는 경우, 예를 들면, 정맥에 0.01 내지 1.0 μg/kg/분의 속도로, 혈압이나 심박수를 모니터링하면서 적절하게 조정하여 투여하는 것이 바람직하다.
천연형(hANP, hBNP, hCNP-22 등)이 아닌, ANP, BNP, CNP의 활성 단편, 변이체, 유도체, 변형체 등을 사용하는 경우, 그 활성의 강도, 체내에 있어서의 지속성, 분자량 등, 그 물질의 특징을 고려하여, 투여량, 투여 방법, 투여 속도, 투여 빈도 등을 적절하게 결정할 수 있다. 또한, hANP 또는 hBNP, 및 CNP(hCNP-22) 등의 유효 성분에 대하여, 방출 제어 제제 기술 또는 지속화 제제 기술, 펩티드가 쉽게 분해되지 않도록 하는 각종 변이체, 유도체 또는 변형체 등을 채용함으로써, 연속 투여 또는 볼러스 투여로 한정되지 않고, 환자에 대한 부담의 보다 적은 투여 방법, 투여 빈도 등의 선택이 가능하게 된다.
본 발명의 의약의 투여 대상은, 통상 악성 종양 환자이다. 악성 종양 환자는, 다른 기초 질환이 없는 환자일 수도 있고, 또한, 예를 들면, 심부전 리스크가 높은 환자일 수도 있다. 악성 종양의 종류는, 특별히 한정되지 않으며, 다양한 종양에 적용할 수 있다. 이와 같은 대상으로서 바람직한 것은, 종양 조직의 암 세포에 있어서 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A가 발현하고 있는 악성 종양이며, 예를 들면, 폐암, 췌장암, 갑상선암, 유방암, 자궁암, 난소암, 전립선암, 대장암, 식도암, 신장암, 골종양, 뇌종양 등이 있다. 또한, 후술하는 별도의 항종양제(나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트 및 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트와는 별도의 항종양제) 중 적어도 하나가 투여되고 있는 악성 종양 환자 등도, 본 발명에 있어서의 바람직한 투여 대상이다. 환자에 있어서의 종양은 원발성 종양일 수도 있고, 전이성 종양일 수도 있다. 원발성 종양의 경우, 종양 조직의 절제 수술과 병행하여 투여하는 것이 바람직하다. 전이성 종양의 경우 제거 수술이 가능하면, 마찬가지로 수술과 병행하여 수술 중으로부터 몇일간 투여되는 것이 바람직하다. 제거가 곤란하거나, 또는 다른 장기로의 전이가 의심되는 경우에는, 정기적으로 또는 계속적으로 투여함으로써, 암 세포의 악성화를 억제하여, 증식이나 전이를 제어하는 것이 바람직하다. 이 경우에, 종래 사용되는 항종양제에 의한 치료와 본 발명의 의약을 조합하여 투여함으로써, 보다 효과적인 악성 종양의 제어가 가능하게 된다. 일정 기간 항종양제와 병용한 후에는, GC-A 아고니스트와 GC-B 아고니스트만을 정기적으로 또는 계속적으로 사용할 수도 있다. 또한, 본 발명의 의약의 투여 대상을 선별하는 데 있어서는, 투여 전에 종양 조직을 채취하고, 암 세포에 있어서의 GC-A 수용체의 발현, 및/또는, 암관련 섬유아 세포에 있어서의 GC-B 수용체의 발현을 확인하고, 수용체의 발현이 확인된 대상에 대하여 투여할 수도 있다.
또한, 본 발명의 의약은, 또한 통상적으로 사용되는 다른 항종양제 중 적어도 하나와 병용함으로써, 암의 치료를 효율적으로 행할 수 있고, 본 발명은 이와 같은 별도의 항종양제와 병용하는 요법도 제공한다. 본 발명의 의약은, 암 세포와 암관련 섬유아 세포의 활성화, 악성화를 동시에 제어할 수 있기 때문에, 별도의 항종양제 치료 중에 또한 조합하여 적절하게 투여함으로써, 상기 항종양제 등에 의한 치료의 효율을 높일 수 있고, 또한 치료 예후를 개선할 수 있다. 또한, 상기 별도의 항종양제의 투여량을, 상기 항종양제의 통상의 투여량보다 낮은 용량으로 투여 해도, 우수한 치료 효과를 얻을 수 있다. 조합하는 별도의 항종양제를 낮은 용량으로 사용함으로써, 투약량을 저감할 수 있다. 여기에 대해서 부언하면, 투약량이 소량으로 충분할 뿐 아니라, 적용 빈도를 줄일 수 있고, 또는 부작용의 발생을 줄일 수 있는 이점이 있다.
병용되는 항종양제로서는, 예를 들면, 알킬화제, 대사 길항제, 항종양 항생 물질, 항종양성 식물 성분, BRM(생물학적 응답성 제어 물질), 호르몬, 비타민, 항종양성 항체, 분자 표적약, 그 외의 항종양제 등이 있다.
보다 구체적으로, 알킬화제로서는, 예를 들면, 니트로겐 무스타드, 니트로겐 무스타드 N-옥시드 또는 클로람부실(chlorambucil) 등의 알킬화제; 카르보쿠온(carboquone) 또는 티오테파 등의 아지리딘계 알킬화제; 디브로모만니톨 또는 디브로모둘시톨 등의 에폭시드계 알킬화제; 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 세무스틴, 니무스틴하이드로클로라이드, 스트렙토조신(streptozocin), 클로로조토신(chlorozotocin) 또는 라니무스틴 등의 니트로소우레아계 알킬화제; 부설판(busulfan), 토실산 임프로설판 또는 다카르바진(dacarbazine) 등이 있다.
각종 대사 길항제로서는, 예를 들면, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌 또는 티오이노신 등의 퓨린 대사 길항제; 플루오로우라실, 테가푸르(tegafur), 테가푸르·우라실, 카르모푸르, 독시플루리딘, 브록스우리딘, 시타라빈 또는 에노시타빈 등의 피리미딘 대사 길항제; 메토트렉세이트(methotrexate) 또는 트리메트렉세이트 등의 엽산 대사 길항제 등이 있다.
항종양성 항생 물질로서는, 예를 들면, 마이토마이신 C, 블레오마이신, 페플로마이신, 다우노루비신(daunorubicin), 아크랄루비신(aclarubicin), 독소루비신(doxorubicin), 피라루비신, THP-아드리아마이신, 4'-에피독소루비신 또는 에피루비신 등의 안트라사이클린계 항생 물질 항종양제; 크로모마이신 A3 또는 악티노마이신 D 등이 있다.
항종양성 식물 성분으로서는, 예를 들면, 빈데신, 빈크리스틴 또는 빈브라스틴 등의 빈카알칼로이드(vinca alkaloid)류; 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀 등의 탁산(taxane)류; 또는 에토포시드 또는 테니포시드 등의 에피포도필로톡신류가 있다.
BRM으로서는, 예를 들면, 종양 괴사 인자 또는 인도메타신 등이 있다.
호르몬으로서는, 예를 들면, 하이드로코르티존, 덱사메타존, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프라스테론, 베타메타존, 트리암시놀론, 옥시메트론, 난드롤론, 메테놀론, 프스페스트롤(fosfestrol), 에티닐에스트라디올, 클로르마디논(chlormadinone) 또는 메드록시프로게스테론 등이 있다.
비타민으로서는, 예를 들면, 비타민 C 또는 비타민 A 등이 있다.
항종양성 항체, 분자 표적약으로서는, 트라스트주맙(trastuzumab), 리툭시맙(rituximab), 세툭시맙(cetuximab), 니모투주맙(nimotuzumab), 데노수맙, 베바시주맙, 인플릭시맙, 메실산 이마티니브, 게피티니브, 엘로티니브, 수니티니브, 라파티니브, 소라페니브 등이 있다.
그 외의 항종양제로서는, 예를 들면, 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥사리플라틴, 타목시펜, 캄프토테신, 이포스파미드, 시클로포스파미드, 멜팔란, L-아스파라기나아제, 아세글라톤, 시조피란(sizofiran), 피시바닐, 프로카르바진, 피포브로만(pipoburoman), 네오카르지노스타틴(neocarzinostatin), 하이드록시우레아, 우베니멕스 또는 크레스틴 등이 있다.
또한, 최근에는 비아그라(등록상표)로 대표되는 PDE5 저해제가 악성 종양에 대한 억제 효과를 가지는 것이 보고되어 있고(Das et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (2010), vol/107, No. 42, pp.18202-18207), 본 발명의 의약은 이들 PDE5 저해제와 병용할 수도 있다. PDE5 저해제로서는, PDE5 효소에 의한 cGMP의 분해를 저해하는 활성을 가지는 물질이면, 특별히 한정되지 않고, 다양한 약제를 채용할 수 있다(예를 들면, M. P. Govannoni, et al.(Curr. Med. Chem. (2010)17, pp. 2564-2587) 등 참조). 바람직하게는, 실데나필(sildenafil), 바르데나필(vardenafil), 타달라필(tadalafil), 우데나필(udenafil), 미로데나필(mirodenafil), SLx-2101, 로데나필(lodenafil), Lodenafil carbonate, Exisulind 등, 및 이들의 유도체, 및 이들의 약리학적으로 허용되는 염이며, 보다 바람직하게는, 실데나필, 바르데나필, 타달라필, 우데나필, 미로데나필 또는 이들의 약리학상 허용되는 염이며, 더욱 바람직하게는, 시트르산 실데나필, 염산 바르데나필, 타달라필, 우데나필 또는 미로데나필이며, 가장 바람직하게는, 시트르산 실데나필이다. 이들 약제는, 상기 참고 문헌(그 인용 문헌을 포함함)의 기재 및 주지의 기술에 의해, 제조 및 제제화할 수 있다.
본 발명에 있어서, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트, 및 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트의 병용에 더하여, 나아가서는 별도의 항종양제를 조합하여 투여하는 경우, 조합하여 투여되는 상기 GC-A 아고니스트, GC-B 아고니스트 및 별도의 항종양제는, 전술한 바와 같이 단일 제제 중에 함유되어 있어도 되고, 각각 상이한 제제의 유효 성분으로서 함유되어 있어도 된다. GC-A 아고니스트, GC-B 아고니스트 및 별도의 항종양제를 투여하는 순번 등도 특별히 한정되지 않는다.
또한, 본 발명에 있어서의 GC-B 아고니스트는, 이들 별도의 항종양제와 병용함으로써, 상기 항종양제의 치료 효과를 높일 수 있다. 즉, 항종양제가 암 세포 및 종양 조직에 작용하고, GC-B 아고니스트가 암관련 섬유아 세포에 작용함으로써, 종양 조직 전체의 활성화, 악성화를 억제할 수 있다. 이 경우에, GC-A 아고니스트는, 반드시 조합하여 투여되지 않아도 된다.
본 발명은, 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트를 유효 성분으로서 함유하고, 별도의 항종양제와 조합하여 투여되는, 악성 종양의 치료 또는 악성화의 억제 또는 예방을 위한 의약, 이와 같은 치료 또는 예방 방법 등도 포함한다.
본 발명은, 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트를 유효 성분으로서 함유하고, 별도의 항종양제와 조합하여 투여되는, 상기 항종양제에 의한 악성 종양의 치료 또는 악성화의 억제 또는 예방 작용을 증강하기 위한 의약, 이와 같은 방법 등도 포함한다.
상기 의약 등에 있어서는, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트 및 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트와는 별도의 항종양제의 투여량을, 상기 항종양제의 통상 정해진 투여량보다 낮은 용량으로 투여하는 것이 바람직하다. 상기 별도의 항종양제는 특별히 한정되지 않고, 전술한 것 등을 사용할 수 있다. 또한, GC-B 아고니스트와 상기 항종양제는, 다른 제제로서 별개로 투여되어 있어도 되고, 단일 제제에 배합되어 있어도 되고, 키트 제제의 형태라도 된다.
또한, 본 발명은, GC-A 아고니스트와 GC-B 아고니스트를 조합하여 함유하는 악성 종양의 치료 또는 악성화의 억제 또는 예방을 위한 키트도 제공한다. 이와 같은 키트로서는, hANP나 hBNP 등의 GC-A 아고니스트 또는 이들의 염과 hCNP-22나 hCNP-53 등의 GC-B 아고니스트 또는 이들의 염의 양쪽을 동결 건조 제제로서 봉입(封入)한 병(vial)(단일 병에 봉입되어 있어도 되고, 별개의 병에 봉입되어 있어도 됨)과 그것을 용해하기 위한 주사용수를 조합하여 키트로 한 것 등을 예로 들 수 있고, 또한 용해 및 투여에 사용하는 주사용 시린지를 이들과 조합할 수도 있고, 또한 미량 수액 펌프, 소아용 미량 수액 세트 등을 조합할 수도 된다.
또한, 본 발명의 GC-A 아고니스트 또는 GC-B 아고니스트가 펩티드성의 물질인 경우, 이것을 코딩하는 유전자 도입에 의해 환자의 체내에서, GC-A 아고니스트펩티드 및/또는 GC-B 아고니스트 펩티드를 발현시키는 것에 의한 유전자 치료를 행할 수도 있다. 이 경우에, 양쪽의 아고니스트를 유전자 치료에 의해 발현시켜도 되고, 한쪽만을 유전자 치료에 의해 발현시키고, 다른 쪽은 체외로부터 투여하도록 제제화된 것을 사용할 수도 있다.
예를 들면, ANP의 유전자로서는, 서열 번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자(예를 들면, Science, 226권, 1206페이지, 1984년에 기재되어 있는 것)를 사용하면 된다. 또한, BNP의 유전자로서는, 서열 번호 3, 4 또는 5의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자(예를 들면, Biochem. Biophys. Res. Co㎜un., 165권, 650페이지, 1989년에 기재되어 있는 것)를 사용하면 된다. 또한, CNP의 유전자로서는, 서열 번호 7 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자(예를 들면, Biochem. Biophys. Res. Co㎜un., 165권, 650페이지, 1989년에 기재되어 있는 것)를 사용하면 된다. 전술한 유전자를 사용하여 치료를 행하는 경우에는, RNA 종양 바이러스, 아데노바이러스, 아데노 수반 바이러스 또는 인공 벡터를 벡터로서 사용하여, 근육 주사나 국소 주사에 의해 유전자를 도입하면 된다. 또한, 전술한 바와 같은 벡터를 사용하지 않고, 플라스미드의 형태로 유전자를 도입할 수도 있다. 구체적인 유전자 치료의 방법에 대해서는, 실험 의학, 12권, 303페이지, 1994년에 기재된 방법 또는 거기에 인용되어 있는 문헌의 방법 등을 사용하면 된다.
본 발명은 또한, 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트를 유효 성분으로서 함유하고, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트와 조합하여 투여되는, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트에 의한 악성 종양의 치료 또는 악성화의 억제 또는 예방 작용을 증강하기 위한 의약, 및 상기 의약을 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트와 조합하여 투여하는 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트에 의한 악성 종양의 치료 또는 악성화의 억제 또는 예방 작용을 증강하는 방법도 포함한다. 상기 의약의 투여 대상은, 예를 들면, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트에 의한 치료를 받고 있는 대상이다. 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트에 의한 치료를 받고 있는 대상은, 통상, 전술한 악성 종양 환자이다.
본 발명은 또한, 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트를 유효 성분으로서 함유하고, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트와 조합하여 투여되는, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트에 의한 악성 종양의 치료 또는 악성화의 억제 또는 예방 작용을 증강하기 위한 의약, 및 상기 의약을 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트와 조합하여 투여하는 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트에 의한 악성 종양의 치료 또는 악성화의 억제 또는 예방 작용을 증강하는 방법 등도 포함한다. 상기 의약의 투여 대상은, 예를 들면, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트에 의한 치료를 받고 있는 대상이다. 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트에 의한 치료를 받고 있는 대상은, 통상, 전술한 악성 종양 환자이다.
유효 성분인 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트, 및 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트, 및 이들의 투여 방법 등은, 전술한 의약에 있어서설명한 것과 동일하다.
[실시예]
이하에서, 실시예를 사용하여, 본 발명을 구체적으로 설명한다. 실시예에 나타낸 것은, 본 발명의 실시형태의 일례이며, 본 발명은 이것으로 한정되는 것은 아니다.
이하의 실시예에 있어서 사용되는 실험 재료의 입수 방법 및 조제 방법은 다음과 같다.
hANP(서열 번호 1), 및 hCNP-22(서열 번호 7)는 공지의 방법에 의해 제조하였고, hBNP(서열 번호 3)는 펩티드 연구소(오사카)로부터 입수했다. 각각의 동결 건조품을, IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine)를 포함하는 생리 식염수로 용해하고, 이것을 적절하게 농도를 조절하여 IBMX의 최종 농도가 5×10-4 M로 되도록 하여, 하기 실험에 사용하였다.
폐선암 유래 세포주 A549 세포는, ATCC(Manassas, VA)로부터 입수했다. 세포 배양은, 10% FCS를 포함하는 DMEM(Invitrogen사, Carlsbad, VA) 배양액을 사용하여, 37℃, 5% CO2의 조건하에서 행하였다. 배양액량은, 6-웰 디쉬(well dish)에서는 1.5 ml, 24-웰 디쉬에서는 400 μl, 96-웰 디쉬에서는 150 μl로 하였다. 하기 실시예 중에서는, 특별히 지정하지 않는 한 전술한 배양액 및 배양 조건을 채용하였다.
CAF(Cancer Associated Fibroblast)는, 폐암 수술 시행 환자로부터 적출한 조직을, 본인의 동의 하에, 초기 배양을 행하고, 10% FCS를 포함하는 DMEM 배양액을 사용하여 37℃, 5% CO2의 조건하에서 세포 배양을 행한 것이며, 5계대까지의 것을 사용하였다.
TGF-β1(Transforming growth factor β1)은, R＆D systems사(Minneapolis, MN)로부터 구입한 것을 사용하였고, 생리 식염수를 사용하여 적절하게 희석하여 하기 실험에 사용하였다.
<실시예 1> 나트륨 이뇨 펩티드 자극에 의한 세포내 cGMP 레벨의 변동
A549 세포를, 24-웰 디쉬에 4×104 cell/well로 가하여 배양하였고, 다음날 FCS free의 DMEM 배양액으로 교환하였다. CAF는 24-웰 디쉬에 1×104 cell/well로 가하여 배양하였고, 다음날 1% FCS를 포함하는 DMEM 배양액으로 교환하였다.
이들 배양액 중에, hANP, hBNP 및 hCNP-22 용액(최종 농도: 1×10-11 M에서 1×10-6 M의 10배 희석 계열, 컨트롤에는 동일한 양의 생리 식염수)를 첨가하였고, 그 10분 후에 400μL의 냉각 70% 에탄올(0.1 N 염산 함유)을 가하여, 신속하게 초음파 처리하였다. 처리 후의 용액을 동결 건조하고, Cyclic GMP Assay kit(야마사 사 제조)를 사용하여 cGMP 레벨을 측정하였다. cGMP 레벨의 측정 결과를 도 1의 A 및 도 1의 B에 나타내었다.
도 1의 A에 나타낸 바와 같이 A549 세포에 대해서는, GC-A 아고니스트인 hANP와 hBNP는, 세포내 cGMP를 농도 의존적으로 항진시켰지만, GC-B 수용체 아고니스트에서, GC-A 수용체에는 결합하지 않는 hCNP-22에서는, 이와 같은 항진은 관찰 되지 않았다. 반대로, 도 1의 B로부터 알 수 있는 바와 같이 CAF에 대해서는, hCNP-22가 농도 의존적으로 cGMP 레벨을 항진한 것에 비해, hANP와 hBNP에서는 이와 같은 작용은 관찰되지 않았다.
이러한 사실로부터, A549 세포에서는 GC-A 수용체로부터의 자극, CAF에서는 GC-B 수용체로부터의 자극에, 각각 특이적으로 응답하여 시그널 전달이 일어나는 것을 나타내고 있다.
<실시예 2> TGF-β1에 의한 EMT 유도에 대한 ANP의 효과
A549 세포를, 6-웰 디쉬에, 1×105 cell/well로 가하여 배양하였고, 다음날 FBS free의 DMEM의 배양액으로 교환하고, 24시간 배양한 것을, 하기 실험에 사용하였다. ANP군(hANP 용액 첨가(최종 농도: 1μM) 및 컨트롤군(동일한 양의 생리 식염수 첨가)을 제작하고, 각각(hANP 용액 또는 생리 식염수)을 A549 세포에 첨가한 2시간 후에 TGF-β1을 최종 농도가 0.125, 0.25, 0.5, 1.0 및 2.0 ng/ml로 되도록 첨가하고, 24시간 후에 현미경하에서 세포의 형태 변화를 관찰하고, 사진 촬영하였다(도 2).
그 후, TRIZOL total RNA isolation reagent(Invitrogen사)를 사용하여, 전술한 바와 같이 제작한 ANP군 및 컨트롤군으로부터 total RNA를 회수하고, 역전사(逆轉寫) 효소를 사용하여 cDNA를 합성하고, 정량 RT-PCR법에 따라, E-cadherin(E-카드헤린), N-cadherin(N-카드헤린), VEGF-A, PDGF-B, TNF-α 및 IL-6의 mRNA 레벨을 측정하였다. mRNA 레벨 측정의 결과를 도 3에 나타내었다. 여기서, 대상 유전자의 mRNA 레벨은, 동시에 측정한 하우스키핑 유전자인 36B4 유전자의 mRNA량에 대한 상대적인 비율로서 산출한 값이다. 하기 실시예에서의, mRNA 레벨은, 특별히 다른 기재가 없는 한, 전술한 바와 동일하게 산출한 값을 사용하고 있다.
또한, EMT에 있어서는, E-카드헤린의 발현이 감소하고, N-카드헤린의 발현이 항진하는 것으로 알려져 있고, 이 2종류의 카드헤린의 발현 비율(N-cad/E-cad)은, EMT의 정도를 나타낸 지표로서 유용한 것으로 여겨진다. 이 비율을 도 4에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 1 μM의 hANP(도 2의 C)는, TGF-β1 자극에 의해 유도된 EMT에 의한 세포의 형태 변화(도 2의 B와 같이 간엽계 성분과 동일하게 방추형(紡錘形)으로 변화함)를 현저하게 억제했다. 또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, hANP는, TGFβ-1 자극으로 유도된 EMT에 의해 발현이 항진하는 성장 인자(VEGF-A, PDGF-B)나 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6)의 유전자 발현을 현저하게 억제했다. 또한, TGF-β1 자극에 의한 N-cadherin의 발현 항진은, hANP에 의해 현저하게 억제되고, 동일한 자극에 의한 E-cadherin의 발현 감소가 저해되었다. 그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 EMT의 중요한 지표인 N-cad/E-cad의 발현 비율은, 1 μM의 hANP 존재하에서 현저하게 저하되었다. 또한, 폐대세포암 유래의 H460 세포를 사용한 동일한 시험에서도 동일한 결과를 얻을 수 있었다.
또한, 동일한 시험에 있어서, 피험 물질로서 hANP 대신 hBNP(최종 농도: 1 μM), CD-NP(최종 농도: 10 μM(Deborah et al., J. Biol. Chem., (2008), Vol. 289, No.50, pp.35003-35009 참조)), LKL-ANP(최종 농도: 1 μM(hANP의 10∼12 번의 아미노산이 LKL로 치환된 변이체(Furuya, M. et al, Biochem. Biophys. Res. Co㎜un., (1992), 183, No 3, p.964-969 참조))를 사용한 시험을 행하였고, 그 결과, E-cad/N-cad의 값에 있어서, TGF-β1로 유도되는 EMT의 억제율은, BNP에서 44.8%, CD-NP에서 37.7%, LKL-ANP에서 52.9%였다. 이와 같이, 각종 GC-A 아고니스트가, 종양 세포의 EMT를 억제하는 작용을 나타낸다.
한편, hANP 대신 hCNP-22를 첨가하여 동일한 시험을 행한 바, 세포의 형상, 각 사이토카인, 성장 인자, 카드헤린의 발현량에 대하여, 컨트롤과 전혀 차이가 관찰되지 않았다.
이와 같이, GC-A 아고니스트인 hANP, hBNP 등은, 1 μM의 농도에 있어서, 암의 전이, 악성화의 계기가 되는 중요한 현상인 EMT를 현저하게 억제하는 효과를 나타낸다. 이와 같은 작용은 GC-B 특이적인 아고니스트인 hCNP-22에서는 전혀 관찰 되지 않았다.
<실시예 3> CAF의 암악화 인자 생산에 대한 CNP의 효과
CAF를, 6-웰 디쉬에, 5×104 cell/well로 가하여 배양하였고, 다음날 1% FBS를 포함하는 DMEM의 배양액으로 교환하고, 24시간 배양한 것을, 하기 실험에 사용하였다.
CNP군(hCNP-22 용액 첨가(최종 농도: 1μM) 및 컨트롤군(동일한 양의 생리 식염수 첨가)을 제작하였고, 각각(hCNP-22 용액 또는 생리 식염수)을 CAF에 첨가한 2시간 후에 TGF-β1을 최종 농도가 0.125, 0.25, 0.5, 1.0 및 2.0 ng/ml로 되도록 첨가하고, 24시간 후에 TRIZOL total RNA isolation reagent를 사용하여 total RNA를 회수하였고, 역전사 효소를 사용하여 cDNA를 합성하였고, 정량 RT-PCR법에 따라, VEGF-A, TGF-β1, TNF-α 및 IL-6의 mRNA 레벨을 측정하였다. mRNA 레벨 측정의 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, TGFβ1 자극으로 발현이 항진하는 성장 인자(VEGF-A, TGF-β1)나 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6)의 유전자 발현은, hCNP-22의 첨가에 의해 현저하게 억제되었다.
한편, hCNP-22 대신 hANP 또는 hBNP를 사용하여 동일한 시험을 행한 바, hANP 및 hBNP 존재하와 비존재하에서 전혀 차이가 인정되지 않으며, hANP 및 hBNP는 CAF에 대해서는 작용이 없었다.
이와 같이, GC-B 아고니스트인 hCNP-22는, 1 μM의 농도에 있어서, 암간질의 대표격인 CAF의 암 세포에 부여하는 양(＋)의 제어를 억제하는 효과를 나타낸다. 이와 같은 작용은 GC-A 특이적인 아고니스트인 hANP나 hBNP에서는 인정되지 않았다.
실시예 1∼3의 결과로부터, 암 세포에는 GC-A 수용체에 대한 특이적인 자극에 의해, EMT에 의한 암 세포의 악성화가 억제되는 것과, CAF에 대해서는, GC-B 수용체에 대한 특이적인 자극에 의해, 암 악화 인자의 생산이 억제되는 것을 나타내고 있다.
<실시예 4>　암 세포와 CAF의 공배양계에 대한 ANP와 CNP의 효과
전술한 결과에 따라, 실제 종양 조직과 마찬가지로, 동일한 배양계에 종양 세포와 CAF가 공존하는, 공배양계에 있어서의, GC-A 아고니스트 및 GC-B 아고니스트의 효과를 조사하였다.
A549 세포는, 6-웰 디쉬에, 1×105 cell/well로 가하여 배양하였고, 다음날 FBS free의 DMEM의 배양액으로 교환하고, 24시간 배양했다. CAF는, 6-웰 디쉬에 cell culture insert(1.0㎛ pore size, BD사)를 삽입한 후에, 5×104 cell/well로 가하여 배양하였고, 다음날 1% FBS를 포함하는 DMEM의 배양액으로 교환하고, 24시간 배양했다. 이들 세포의 배양액에 각종 피험 물질을 첨가한 군과 무첨가의 컨트롤군을 제작하였고, 2시간 배양 후에 공배양에 제공했다. 피험물질의 첨가군은, 양쪽의 세포 배양액에, hANP를 최종 농도 1μM로 첨가한 것을 ANP군, hCNP-22를 최종 농도 1μM로 첨가한 것을 CNP군, hANP와 hCNP-22의 양쪽을 최종 농도 1μM씩 되도록 첨가한 것을 ANP＋CNP군으로 하였다.
전술한 처리를 행한 A549 세포의 6-웰 디쉬 상에 상기 CAF의 cell culture insert를 올리고, 배양액만이 왕래할 수 있는 공배양 실험 모델을 제작하였다. 그 후 24, 48 및 72 시간 배양 후의 A549 세포 만의 total RNA를 회수하고, cDNA를 합성한 후, 정량 RT-PCR법에 따라, E-cadherin, N-cadherin, VEGF-A, PDGF-B 및 IL-6의 mRNA 레벨을 측정하였다(도 6∼도 8). ANP 단독 시험(ANP군: 도 6), CNP 단독 시험(CNP군: 도 7) 및 ANP와 CNP의 병용 시험(ANP＋CNP군: 도 8)은 다른 실험으로서, 각각에 컨트롤군을 두고 실시하였다.
ANP 단독 및 CNP 단독으로는, 공배양에 의해 발현이 항진하는 성장 인자(VEGF-A, PDGF-B) 또는 염증성 사이토카인(IL-6)의 유전자 발현을 억제할 수 없었다(도 6, 도 7). 그러나, ANP와 CNP를 동시에 첨가함으로써, 도 8에 나타낸 바와 같이, 24, 48 및 72 시간 후의 모두에 있어서 각종 성장 인자 및 사이토카인의 발현이 억제되었다. 또한, EMT의 지표인 N-cadherin과 E-cadherin의 발현 비율(N-cad/E-cad)에 대해서도, 단독 시험에서는 피험 물질의 효과가 인정되지 않았지만, ANP와 CNP를 병용함으로써 비율의 저하가 인정되어 EMT가 억제된 것을 나타낸다.
즉, hANP는 A549 세포에 대해서만 효과를 발휘하므로, CAF와의 공배양 실험에서는 CAF가 생산하는 성장 인자나 사이토카인의 자극에 의하여, 그 효과가 감약한 것으로 여겨진다. 마찬가지로 hCNP-22는 CAF에 대해서만 효과를 발휘하므로, A549 세포와의 공배양 실험에서는, A549 세포가 생산하는 성장 인자 및 사이토카인의 자극에 의해 그 효과가 감약한 것으로 여겨진다.
한편, hANP와 hCNP-22의 병용에서는, A549 세포와 CAF의 양쪽에 대하여 효과를 발휘함으로써 공배양 실험에서도 성장 인자·사이토카인 생산 억제 효과와 EMT 억제 효과를 발휘했다.
<실시예 5> 암 세포와 CAF의 마우스 이식 모델에 대한 ANP와 CNP의 효과
본 실시예 및 실시예 6에서는, 마우스는 5주령의 수컷의 면역 부전 마우스(KSN 마우스, 일본 SLC)를 사용하였다. 또한, Osmotic pump는 ALZET(Cupertino, CA)의 MODEL2004(28일간 투여용)를 사용하였다.
면역 부전 마우스의 등쪽 피하에, 생리 식염수를 넣은 Osmotic pump를 삽입한 것을 컨트롤군으로 하였다. 마찬가지로, hANP와 hCNP-22의 양쪽이 0.125μg/kg/분(저용량 ANP＋CNP군) 또는 0.5μg/kg/분(고용량 ANP＋CNP군)의 투여량으로 투여되도록 조제된 Osmotic pump를 마우스의 피하에 삽입한 군을 제작하였다.
A549 세포와 CAF의 세포 혼합 현탁액을, FBS free의 DMEM을 사용하여, A549 세포가 1×106 cell/100 μl, CAF가 0.5×106 cell/100 μl로 되도록 조제했다. 이 혼합 현탁액을, 상기 마우스에 1마리당 100μl, 등쪽 피하에 주입하였다. 1주마다, 세포 주입부의 종양의 크기를 계측하여, 종양 볼륨을 하기 추정식에 의해 산출하였다(도 9).
종양 볼륨(㎜3)=(π/6)×d3
d=세로와 가로의 평균 직경(㎜)
도 9에 나타낸 바와 같이, 컨트롤과 비교하여, hANP와 hCNP-22의 병용 투여에 의해 종양의 증식이 현저하게 억제되었다. 또한, 이 때 저용량 투여군에 있어서, 고용량 투여군과 동일한 정도의 억제 효과가 관찰되었다.
<실시예 6> 암 세포와 CAF의 마우스 이식 모델에 대한 ANP와 CNP의 효과(2)
실시예 5와 동일한 종양 이식 모델에 있어서, 종양 조직 정착 후부터 hANP와 hCNP의 투여를 개시한 경우의 효과를 확인하였다.
A549 세포와 CAF의 세포 혼합 현탁액을, FBS free의 DMEM을 사용하여, A549 세포가 1×106 cell/100 μl, CAF가 0.5×106 cell/100 μl로 되도록 조제했다. 이 혼합 현탁액을, 면역 부전 마우스에 1마리당 100μl, 등쪽 피하에 주입하였다. 또한, 전체의 비교 대조군으로서 A549 세포의 현탁액만을 주입(1.5×106 cell/mouse)한 군(A549군)도 함께 실험을 행하였다.
세포액 주입으로부터 2주간 관찰한 후, 혼합 현탁액을 주입한 마우스를 무작위로 4군(컨트롤군, ANP군, CNP군, ANP＋CNP군)으로 군을 분류하고, 하기와 같이, 각각의 군에 따른 투여로 조정한 Osmotic pump를 마우스 피하에 삽입하고, 투여를 개시하였다.
컨트롤군, 및 A549군; 생리 식염수 투여
ANP군; hANP를 0.5μg/kg/분의 투여량으로 투여
CNP군; hCNP-22를 2.5μg/kg/분의 투여량으로 투여
ANP＋CNP군; hANP를 0.5μg/kg/분, hCNP-22를 2.5μg/kg/분의 투여량으로 투여
투여 개시 후 4주간 관찰을 더 계속하고, 1주마다, 세포 주입부의 종양의 크기를 계측하여, 종양 볼륨을 실시예 5와 동일한 방법으로 산출하였다(도 10).
도 10에 나타낸 바와 같이, 종양 세포만을 이식한 A549군과 비교하여, A549 세포와 CAF를 혼합하여 이식한 컨트롤군에서는, 종양 볼륨이 현저하게 증대하고 있어, 종양 세포와 CAF의 상호 작용이 종양의 증식을 가속시키는 것을 나타내고 있다.
hANP와 hCNP-22는, 각각의 단독 투여에 의해서도, 컨트롤군과 비교하여, 종양 증식을 억제하는 효과가 나타났다. 또한, 이들을 병용 투여한 경우(ANP＋CNP군)에는 종양 증식이 가장 현저하게 억제되고, 이 경우의 종양 볼륨의 증대 정도는 A549 세포만을 이식한 경우보다 더욱 낮았다. 이와 같이, 종양 세포와 CAF의 활성을 동시에 억제하고, 이들 사이의 악순환을 차단하는 것은, 악성 종양의 증식이나 악성화를 억제하는 데 있어서, 즉 악성 종양의 치료에 있어서, 매우 유효한 것을 나타낸다.
이들 실시예의 결과로부터, 도 12에 있어서 모식적으로 나타낸 바와 같은 GC-A 아고니스트와 GC-B 아고니스트의 병용 효과가 나타났다. 즉, 암 세포가 생산하는 VEGF, PDGF-B, IL-6 등의 액성 인자가, CAF를 자극하고, CAF로부터의 VEGF, bFGF, TNF-α, IL-6 등의 생산을 항진한다. CAF로부터 생산된 이들 액성 인자가 암 세포를 더욱 자극한다. 종양 조직에서는, 이와 같은 악순환에 의해 종양의 악성화가 진행하는 것으로 여겨지고 있다. ANP 등의 GC-A 아고니스트는, 암 세포에 작용하고, 이들 액성 인자의 생산을 억제하는 효과를 가진다. 한편, CNP 등의 GC-B 아고니스트는, CAF에 작용하고, 이들 액성 인자의 생산을 억제하는 효과를 가진다. 그러므로, 본 발명에 있어서는, 종양 조직에 대하여 GC-A 아고니스트와 GC-B 아고니스트를 조합하여 작용시킴으로써, 암 세포와 CAF의 사이의 악순환을 차단함으로써, 악성 종양의 효과적인 치료가 달성된다. 즉, 암 세포와 CAF가 혼재하는 종양 조직에 대하여, 암 세포의 EMT를 억제하는 GC-A 아고니스트와 CAF의 형질 전환을 억제하는 GC-B 아고니스트를 동시에 작용시킴으로써, 암 세포와 CAF의 사이에 형성되는 종양의 악성화를 진행시키는 악순환을 차단하여, 암을 효과적으로 치료하거나 또는 예방할 수 있게 된다.
본 명세서의 실시예에서는, 대표적인 종양 세포로서 인간 폐암 유래의 A549 세포, H460 세포를 채용하였다. 이들 폐암 유래의 세포로 한정되지 않고, 췌암 유래(epithelioid carcinoma)의 PANC1, 전립선암 유래(adenocarcinoma)의 PC3, 위암 유래(adenocarcinoma)의 GCIY, 대장암 유래(colorectal adenocarcinoma)의 CaCo2, 난소암 유래(adenocarcinoma)의 OVCAR-3 등 많은 종양 세포에 있어서, GC-A 수용체의 발현을 확인할 수 있으므로, GC-A 아고니스트와 GC-B 아고니스트의 조합에 의한 치료는 광범위한 종류의 종양에 대하여 작용 효과를 얻을 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> National cerebral and cardiovascular center Osaka University Daiichi Sankyo Company, Limited <120> A drug for preventing progression of malignant tumor by conbination therapy with GC-A agonist and GC-B agonist <130> D26F4253 <150> JP2011-179751 <151> 2011-08-19 <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly 1 5 10 15 Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 20 25 <210> 2 <211> 28 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 2 Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Ile Asp Arg Ile Gly 1 5 10 15 Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 20 25 <210> 3 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp 1 5 10 15 Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His 20 25 30 <210> 4 <211> 32 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 4 Ser Pro Lys Thr Met Arg Asp Ser Gly Cys Phe Gly Arg Arg Leu Asp 1 5 10 15 Arg Ile Gly Ser Leu Ser Gly Leu Gly Cys Asn Val Leu Arg Arg Tyr 20 25 30 <210> 5 <211> 45 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 5 Ser Gln Asp Ser Ala Phe Arg Ile Gln Glu Arg Leu Arg Asn Ser Lys 1 5 10 15 Met Ala His Ser Ser Ser Cys Phe Gly Gln Lys Ile Asp Arg Ile Gly 20 25 30 Ala Val Ser Arg Leu Gly Cys Asp Gly Leu Arg Leu Phe 35 40 45 <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ring structure sequence of ANPs and BNPs <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid or artificial amino acid mimetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa can be Met, Leu or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(14) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid or artificial amino acid mimetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(20) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid or artificial amino acid mimetic <400> 6 Cys Phe Gly Xaa Xaa Xaa Asp Arg Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Gly 1 5 10 15 Cys Xaa Xaa Xaa Arg 20 <210> 7 <211> 22 <212> PRT <213> mammalian/homo sapience <400> 7 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser 1 5 10 15 Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 8 <211> 53 <212> PRT <213> mammalian <400> 8 Asp Leu Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu 1 5 10 15 Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly 20 25 30 Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met 35 40 45 Ser Gly Leu Gly Cys 50 <210> 9 <211> 22 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 9 Gly Leu Ser Arg Ser Cys Phe Gly Val Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser 1 5 10 15 Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 10 <211> 22 <212> PRT <213> Rana sp. <400> 10 Gly Tyr Ser Arg Gly Cys Phe Gly Val Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ala 1 5 10 15 Phe Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ring structure sequence of CNP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(12) <223> the amino acid could be Ser or Ala on position 11 and Met, Phe or Glu on position 12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid or artificial amino acid mimetics, preferably Ser or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid or artificial amino acid mimetics, preferably Met, Phe or Glu <400> 11 Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Xaa Xaa Ser Gly Leu Gly 1 5 10 15 Cys <210> 12 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric ANP (A) (SEQ ID NO;106) of US2010-305031 and WO2009/142307 <400> 12 Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly 1 5 10 15 Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr Val Gln Gln Arg 20 25 30 Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg 35 40 45 <210> 13 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric ANP (B) (SEQ ID NO;107) of US2010-305031 and WO2009/142307 <400> 13 Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro 1 5 10 15 Arg Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile 20 25 30 Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 35 40 45 <210> 14 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric ANP (C) (SEQ ID NO;108) of US2010-305031 and WO2009/142307 <400> 14 Arg Pro Gln Leu Lys Ala Pro Pro Lys Lys Ser Glu Lys Arg Gln Gln 1 5 10 15 Val Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile 20 25 30 Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 35 40 45 <210> 15 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric CNP (A) (SEQ ID NO;109) of US2010-305031 and WO2009/142307 <400> 15 Arg Pro Gln Leu Lys Ala Pro Pro Lys Lys Ser Glu Lys Arg Gln Gln 1 5 10 15 Val Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu 20 25 30 Gly Cys <210> 16 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric CNP (B) (SEQ ID NO;110) of US2010-305031 and WO2009/142307 <400> 16 Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly 1 5 10 15 Cys Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln 20 25 30 Pro Arg <210> 17 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric CNP (C) (SEQ ID NO;124) of US2010-305031 and WO2009/142307 <400> 17 Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly 1 5 10 15 Cys Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln 20 25 30 Pro Arg <210> 18 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric CNP (D) (SEQ ID NO;125) of US2010-305031 and WO2009/142307 <400> 18 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser 1 5 10 15 Met Ser Gly Leu Gly Cys Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro 20 25 30 Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg 35 <210> 19 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric CNP (E) (SEQ ID NO;126) of US2010-305031 and WO2009/142307 <400> 19 Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro 1 5 10 15 Arg Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu 20 25 30 Gly Cys Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu 35 40 45 Gln Pro Arg 50 <210> 20 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric CNP (F) (SEQ ID NO;127) of US2010-305031 and WO2009/142307 <400> 20 Arg Pro Gln Leu Lys Ala Pro Pro Lys Lys Ser Glu Lys Arg Gln Gln 1 5 10 15 Val Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu 20 25 30 Gly Cys Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu 35 40 45 Gln Pro Arg 50 <210> 21 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric CNP (G) (SEQ ID NO;128) of US2010-305031 and WO2009/142307 <400> 21 Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro 1 5 10 15 Arg Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu 20 25 30 Gly Cys <210> 22 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric CNP (H) (SEQ ID NO;129) of US2010-305031 and WO2009/142307 <400> 22 Arg Pro Gln Leu Lys Ala Pro Pro Lys Lys Ser Glu Lys Arg Gln Gln 1 5 10 15 Val Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu 20 25 30 Gly Cys <210> 23 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric CNP (I) (SEQ ID NO;130) of US2010-305031 and WO2009/142307 <220> <221> Amidation <222> (34)..(34) <223> The Arg residue on C-terminal is amidated <400> 23 Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly 1 5 10 15 Cys Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln 20 25 30 Pro Arg <210> 24 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric CNP (J) (SEQ ID NO;157) of US2010-305031 and WO2009/142307 <400> 24 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser 1 5 10 15 Met Ser Gly Leu Gly Cys Val Gln Gln Arg Lys Asp Ser Lys Lys Pro 20 25 30 Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg 35 <210> 25 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric CNP (K) (SEQ ID NO;158) of US2010-305031 and WO2009/142307 <400> 25 Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly 1 5 10 15 Cys Ala Gly Ser Val Asp His Lys Gly Lys Gln Arg Lys Val Val Asp 20 25 30 His Pro Lys Arg 35

Claims (34)

  1. 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트, 및 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트가, 조합하여 투여되는, 악성 종양의 치료 또는 악성화의 억제 또는 예방을 위한 의약.
  2. 제1항에 있어서,
    나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트와 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트가, 각각 상이한 제제(製劑)의 유효 성분으로서 함유되고, 동시에 또는 상이한 시간에 투여되는, 의약.
  3. 제1항에 있어서,
    나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트와 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트가, 단일 제제 중에 함유되어 있는, 의약.
  4. 제1항에 있어서,
    나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트와 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트를 포함하는 키트 제제인, 의약.
  5. 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트를 유효 성분으로서 함유하고, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트와 조합하여 투여되는, 악성 종양의 치료 또는 악성화의 억제 또는 예방을 위한 의약.
  6. 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트를 유효 성분으로서 함유하고, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트와 조합하여 투여되는, 악성 종양의 치료 또는 악성화의 억제 또는 예방을 위한 의약.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트가, 하기 (a1) 내지 (a6)으로부터 선택되는 어느 하나 또는 그 약리상 허용되는 염이며, 또한 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A에 대하여 아고니스트 활성을 가지는 물질인 의약:
    (a1) 심방성 나트륨 이뇨 펩티드,
    (a2) 뇌성 나트륨 이뇨 펩티드,
    (a3) (a1) 또는 (a2)의 활성 단편을 포함하는 물질,
    (a4) (a1) 내지 (a3)의 아미노산 서열에 있어서 1개∼수개의 아미노산이 치환, 결실(缺失), 삽입, 및/또는, 부가된 변이체,
    (a5) (a1) 내지 (a4) 중 어느 하나의 유도체, 및
    (a6) (a1) 내지 (a5) 중 어느 하나의 변형체.
  8. 제7항에 있어서,
    심방성 나트륨 이뇨 펩티드가, 서열 목록의 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드인, 의약.
  9. 제7항에 있어서,
    뇌성 나트륨 이뇨 펩티드가, 서열 목록의 서열 번호 3, 4 또는 5에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드인, 의약.
  10. 제7항에 있어서,
    활성 단편이, 서열 목록의 서열 번호 6의 아미노산 서열을 가지는 것인, 의약.
  11. 제7항에 있어서,
    활성 단편이, 서열 목록의 서열 번호 1 또는 2의 7번 내지 27번의 아미노산 서열, 서열 번호 3 또는 4의 10번 내지 30번의 아미노산 서열, 또는 서열 목록의 서열 번호 5의 23번 내지 43번의 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 의약.
  12. 제7항에 있어서,
    변이체가, 서열 목록의 서열 번호 1 내지 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 서열 번호 6으로 표시된 아미노산 이외의 아미노산의 1개소∼수개소에 있어서, 1개∼수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 것인, 의약.
  13. 제7항에 있어서,
    변이체가, (i) 서열 번호 1 또는 2의 아미노산 서열의 1번 내지 6번 및 28번 중 어느 1개소∼수개소에 있어서 1개∼수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 펩티드, (ii) 서열 번호 3 또는 4의 아미노산 서열의 1번 내지 9번, 31번 및 32번 중 어느 1개소∼수개소에 있어서 1개∼수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 펩티드, 또는 (iii) 서열 번호 5의 아미노산 서열의 1번 내지 22번, 44번 및 45번 중 어느 1개소∼수개소에 있어서 1개∼수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 펩티드인, 의약.
  14. 제7항에 있어서,
    유도체가, 서열 목록의 서열 번호 1 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 의약.
  15. 제7항에 있어서,
    유도체가, 면역 글로블린 Fc 부분, 혈청 알부민, 및 그렐린의 C 말단 유래의 부분 서열 중 적어도 하나를 더 포함하는, 의약.
  16. 제7항에 있어서,
    변형체가, 서열 목록의 서열 번호 1 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 그 서열 번호 6으로 표시된 아미노산에 상당하는 것 이외의 아미노산 중 적어도 하나에 있어서, 화학적 변형(chemical modification)을 받고 있는 것인, 의약.
  17. 제7항에 있어서,
    변형체가, 제약상(製藥上) 사용되는 고분자 폴리머를 부가함으로써 화학적으로 수식된 것인, 의약.
  18. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트가, 하기 (b1) 내지 (b5)로부터 선택되는 어느 하나 또는 그 약리상 허용되는 염이며, 또한 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B에 대하여 아고니스트 활성을 가지는 물질인, 의약:
    (b1) C형 나트륨 이뇨 펩티드,
    (b2) (b1)의 활성 단편을 포함하는 물질,
    (b3) (b1) 또는 (b2)의 아미노산 서열에 있어서 1개∼수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는, 부가된 변이체,
    (b4) (b1) 내지 (b3) 중 어느 하나의 유도체, 및
    (b5) (b1) 내지 (b4) 중 어느 하나의 변형체.
  19. 제18항에 있어서,
    C형 나트륨 이뇨 펩티드가, 서열 목록의 서열 번호 7, 8, 9 또는 10에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드인, 의약.
  20. 제18항에 있어서,
    활성 단편이, 서열 목록의 서열 번호 11의 아미노산 서열을 가지는 것인, 의약.
  21. 제18항에 있어서,
    활성 단편이, 서열 목록의 서열 번호 7의 6번 내지 22번의 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 의약.
  22. 제18항에 있어서,
    변이체가, 서열 목록의 서열 번호 7 내지 10 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 서열 번호 11로 표시된 아미노산 이외의 아미노산의 1개소∼수개소에 있어서, 1개∼수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 것인, 의약.
  23. 제18항에 있어서,
    변이체가, (i) 서열 번호 7, 9 또는 10의 아미노산 서열의 1번 내지 5번 중 어느 1개소∼수개소에 있어서 1개∼수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 펩티드, 또는 (ii) 서열 번호 8의 아미노산 서열의 1번 내지 36번 중 어느 1개소∼수개소에 있어서 1개∼수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 펩티드인, 의약.
  24. 제18항에 있어서,
    유도체가, 서열 목록의 서열 번호 7 내지 11 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 의약.
  25. 제18항에 있어서,
    유도체가, 면역 글로블린 Fc 부분, 혈청 알부민, 및 그렐린의 C 말단 유래의 부분 서열 중 적어도 하나를 더 포함하는, 의약.
  26. 제18항에 있어서,
    변형체가, 서열 목록의 서열 번호 7 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 그 서열 번호 11로 표시된 아미노산에 상당하는 것 이외의 아미노산 중 적어도 하나에 있어서, 화학적 변형을 받고 있는, 의약.
  27. 제18항에 있어서,
    변형체가, 제약상 사용되는 고분자 폴리머를 부가함으로써 화학적으로 수식된 것인, 의약.
  28. 제15항에 있어서,
    유도체가, 서열 번호 12, 13 또는 14에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인, 의약.
  29. 제25항에 있어서,
    유도체가, 서열 번호 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인, 의약.
  30. 제1항에 있어서,
    나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트와 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트가, GC-A 아고니스트 활성과 GC-B 아고니스트 활성의 양쪽을 겸비하는 단일 물질인, 의약.
  31. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트와 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트의 병용에 더하여, 또한 별도의 항종양제가 투여되는 것을 포함하는, 의약.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 별도의 항종양제의 투여량이, 상기 항종양제의 통상 정해진 투여량보다 저용량으로 투여되는, 의약.
  33. 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트, 및 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트의 각각의 유효량을 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 악성 종양의 치료 또는 악성화의 억제 또는 예방 방법.
  34. 악성 종양의 치료 또는 악성화의 억제 또는 예방에 있어서의 사용을 위한, 조합하여 투여되는 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트, 및 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트.
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