KR20140049569A - Prame 정제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 PRAME의 정제 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 희석제 A로부터 희석제 B로 희석제 교환 동안 PRAME의 응집을 저하시키는 방법으로서, (i) 교환 전에 또는 교환과 동시에 희석제 A에 다중음이온 화합물을 첨가하고; (ii) 희석제 A로부터 희석제 B로 단백질을 교환하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법에 의해 생성된 조성물 또한, 제공된다.
Description
본 발명은 PRAME을 정제하는 방법에 관한 것이다.
"흑색종에서 우선적으로 발현되는 항원" 또는 "PRAME"은 PRAME 유전자에 의해 엔코딩된 종양 항원이다.
PRAME은 흑색종, 폐암 및 백혈병을 포함한 다양한 유형의 종양에서 과다발현되는 항원이다 (Ikeda et al., Immunity 1997, 6 (2) 199-208). PRAME은 난소암, 유방암, 폐암 및 흑색종, 모세포종, 육종, 머리 및 목 암, 신경모세포종, 신장암 및 윌름씨 종양, 및 급성 림프구성 및 골수성 백혈병 (ALL 및 AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 호지킨병, 다발성 골수종, 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 및 외투세포림프종 (MCL)을 포함하는 혈액 종양을 포함하는 여러 고형 종양에서 높은 수준으로 발현되는 것으로 보고되었다.
또한, PRAME은 몇몇 정상 조직 예를 들어, 고환, 부신, 난소 및 자궁내막에서 매우 낮은 수준으로 발현된다.
PRAME은 중요한 항암 면역치료제를 대표한다. 면역치료법에서, 암 항원은 예를 들어, 단백질 또는 이의 항원 단편을 함유하는 백신으로서 일반적으로 환자에게 유입되며, 이는 환자의 면역 시스템을 자극하여 동일한 항원을 발현하는 종양을 치사시킨다.
암 항원, 이 경우, PRAME을 포함하는 백신의 생성에는 상당량의 암 항원이 필요하며, 결국 항원의 대규모 발현 및 정제가 요구된다.
발명의 요약
PRAME은 E. coli에서 과다 발현되며, 여기서 봉입체를 형성한다. 봉입체로부터 PRAME을 가용화시키기 위해, 이들을 음이온 세정제 및 우레아를 필요로하는 강한 가용화 조건에 노출시켜야 한다. 그러나, 이러한 조건은 환자에 주입하기 위한 조성물로의 PRAME의 최종 제형에 적합하지 않으며, 정제된 PRAME은 또 다른 희석제로 전달되어야 한다. 본 출원의 발명자들은 PRAME을 가용화시키기 위해 사용된 음이온 세정제를 포함하는 희석제로부터 음이온 세정제가 실질적으로 비함유된 희석제로 PRAME을 전달하면 PRAME의 응집이 초래됨을 발견하였다. 이러한 응집은 시간에 걸쳐 계속되며, 결국은 용액으로부터 PRAME의 침전을 초래한다. 이러한 응집 (항원 크기 성장)은 면역치료 조성물에 이용되기에 적합하지 않기 때문에, 따라서 PRAME을 정제하는 개선된 방법이 당해 분야에 요구된다.
본원에서 PRAME의 응집을 저하시키는 방법 및 공정, 및 이러한 방법 및 공정에 의해 생성된 화합물이 제공된다. 일 구체 예에서, 희석제 A로부터 희석제 B로 희석제를 교환하는 동안 단백질의 응집을 저하시키는 방법으로서, (i) 교환 전에 희석제 A에 다중음이온 화합물을 첨가하고; (ⅱ) 희석제 A부터 희석제 B로 단백질을 교환하는 것을 포함하며, 단백질이 PRAME인 방법을 제공한다. 일 구체 예에서, 희석제 A로부터 희석제 B로 희석제 교환 동안 단백질의 응집을 저하시키기 위한 다중음이온 조성물의 용도를 제공하며, 여기서 단백질은 PRAME이다. 일 구체 예에서, 다중음이온 화합물은 희석제 교환 전에 첨가된다. 일 구체 예에서, 희석제 A는 세정제를 포함한다. 또 다른 구체 예에서, 세정제는 음이온 세정제이다. 또 다른 구체 예에서, 세정제는 SDS, 나트륨 도쿠세이트 및 라우릴 사르코실로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구체 예에서, 희석제 B는 실질적으로 세정제를 함유하지 않는다.
일 구체 예에서, 다중음이온 화합물은 올리고누클레오티드이다. 일 구체 예에서, 올리고누클레오티드는 5 내지 200개 누클레오티드 길이이다. 일 구체 예에서, 올리고누클레오티드는 CpG를 포함한다. 대부분, 일 구체 예에서, 올리고누클레오티드는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:
일 구체 예에서, 희석제 교환은 투석, 정용여과 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 달성된다.
일 구체 예에서, 본 방법은 단백질을 희석제 C로 제형화하는 단계 (ⅲ) 를 추가로 포함한다. 일 구체 예에서, 희석제 C는 트리스 (Tris), 보레이트 (Borate), 수크로오스, 폴록사머 및 CpG를 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생성되는 바와 같이 희석제 C중의 PRAME을 포함하는 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 PRAME 및 올리고누클레오티드를 포함하는 조성물로서, PRAME의 입도가 10-30nm인 조성물을 제공한다. 또 다른 구체 예에서, PRAME의 입도는 15-25nm이다. 또 다른 구체 예에서, 올리고누클레오티드는 CpG를 포함한다. 추가의 구체 예에서, 입도는 동적 광 산란에 의해 측정된다.
또한, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 PRAME 조성물을 생성하는 방법으로서, (a) 본 발명에 따라 희석제 교환을 수행하는 단계; (b) 단백질을 희석제 C로 제형화하는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 생성된 제형을 멸균하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 또 다른 구체 예에서, 본 방법은 단계 (c)에서 생성된 제형을 동결건조하는 추가적 단계 (d)를 포함한다. 또 다른 구체 예에서, 단계 (c)는 여과에 의해 달성된다.
도 1/21: 말번 제타사이저 나노 ZS (Malvern ZetaSizer Nano ZS) 장비로의 PRAME 정제된 항원에 대한 전기영동 이동도 측정 및 제타 포텐셜 계산.
도 2/21: 방출시 GMP 로트 (lot) DPRAAPA003에 대한 SEC-MALLS 분석에 의해 측정된 바와 같은 광 산란 (LS), 굴절률 (RI) 및 몰 질량 (MM) 분포.
도 3/21: 방출시 GMP 로트 DPRAAPA004에 대한 SEC-MALLS 분석에 의해 측정된 바와 같은 광 산란 (LS), 굴절률 (RI) 및 몰 질량 (MM) 분포.
도 4/21: 방출시 GMP 로트 DPRAAPA005에 대한 SEC-MALLS 분석에 의해 측정된 바와 같은 광 산란 (LS), 굴절률 (RI) 및 몰 질량 (MM) 분포.
도 5/21: 방출시 GMP 로트 DPRAAPA003 (청색 프로파일), DPRAAPA004 (적색 프로파일) 및 DPRAAPA005 (녹색 프로파일)의 SV-AUC 분석에 의해 수득된 침강 계수 분포 c(들). SV-AUC에 의해 수득된 미가공 데이타는 세드핏 (Sedfit) 소프트웨어를 사용하여 처리하였음을 주목하시오. 파장은 이러한 시그널 처리로 인한 것이며, 따라서 인공적인 것이다.
도 6/21: 4-12% 브리스-트리스 폴리아크릴아미드 겔 쿠마시 블루 R250 염색 (레인당 5㎍의 단백질이 로딩됨)의 환원 조건하에 SDS-PAGE 분석 - ASA (소르비톨 (Sorbitol))중에 재구성된 최종 컨테이너 - 후속의 25℃에서의 재구성 속도. 레인의 번호는 왼쪽부터 오른쪽으로 매겼다.
도 7/21: PRAME 항원에 대한 웨스턴 블롯 분석. ASA (소르비톨) 버퍼 또는 물에서 재구성된 최종 컨테이너. 후속의 25℃에서의 재구성 속도. 레인당 0.3㎍ 로딩된 단백질을 100V, 알칼리성 포스파타아제 (NBT-BCIP) 검출하에 니트로셀룰로오스 멤브레인상으로 1h 이동시켰다. 레인 1: T0에서 주입을 위해 물중에 재구성된 최종 컨테이너 (FC) - 원심분리 비처리 샘플; 레인 2: 1과 동일 - 원심분리 샘플 (상청액); 레인 3: T0에서 ASA 버퍼중에 재구성된 최종 컨테이너 (FC) - 원심분리 비처리 샘플; 레인 4: 3과 동일 - 원심분리 샘플 (상청액); 레인 5: T 4h 25℃에서 ASA 버퍼중에 재구성된 최종 컨테이너 (FC) - 원심분리 비처리 샘플; 레인 6: 5와 동일 - 원심분리 샘플 (상청액); 레인 7: T 24h 25℃에서 ASA 버퍼중에 재구성된 최종 컨테이너 (FC) - 원심분리 비처리 샘플; 레인 8: 7과 동일 - 원심분리 샘플 (상청액).
도 8/21: PRAME 용액으로의 CpG7909의 단계식 주입에 상응하는 등온 적정 열량 프로파일. PRAME로의 CpG의 결합은 포화에 도달할 때까지 특징적 순서의 시그널을 유도한다.
도 9/21: 상단부 패널은 SDS-PAGE 겔의 은 염색 후 시각화된 PRAME 단백질 분포를 나타낸다. 하단부 패널은 IEX-HPLC-UV 측정 후 그래디언트에 따른 CpG 분포를 나타낸다. 분획물 1은 SDS-PAGE 겔의 상응하는 레인 위의 하이라이팅된 하단부 분획물과 동일하다. 유사하게는, 분획물 12는 상단부 분획물과 동일하며, 분획물 w는 튜브 세척 레인과 동일하다. 적색 박스는 CpG가 항원과 상호작용하는 분획물을 나타냄을 의미한다 (대조군 실험에서, CpG가 단독으로 단지 상단부 분획물에서만 발견됨).
도 10/21: 3개의 별개의 레프로 (repro) 로트에 대한 PRAME 항원과 결합된 GpG의 양을 나타내는 비교 데이타. 청색 막대는 동결건조된 물질의 전-템포 (ex-tempo) 재구성에 상응한다 (그래프의 왼쪽 반은 500㎍ 용량, 오른쪽 반은 100㎍). 녹색 막대는 초원심분리 전 25℃에서 24h 동안 사전-인큐베이션된 샘플에 상응한다. 자홍색의 마름모형은 CpG/Ag 질량비에 상응하며, 오른쪽 축으로부터 해석되어야 한다.
도 11/21: SEC-HPLC 방법 개발. SEC 칼럼 선택. 정제된 항원에 대한 다양한 TSK 칼럼에 대해 수득된 UV 프로파일.
도 12/21: SEC-HPLC 방법 개발. SEC 칼럼 선택. CpG 용액으로 스파이킹된 정제된 항원에 대한 다양한 TSK 칼럼에 대해 수득된 UV 프로파일 (1050㎍/ml).
도 13/21: 220nm에서 UV 검출하에 0.5ml/분의 유속으로, 5mM 보레이트 버퍼 pH 9.8 - 3.15% 수크로오스 (= 정제된 항원의 버퍼)중에 평형화된 TSK G4000 PWxl + G6000 PWxl 칼럼 (+ 가드 칼럼)에 대한 SEC-HPLC 분석 - 정제된 항원 단독으로 수득된 UV 프로파일 또는 증가되는 농도의 CpG로 스파이킹된 후 수득된 UV 프로파일. 항원 충돌 CpG 크로마토그래피 프로파일. N.B. Vo = 칼럼의 빈 부피, 즉, 레진 비드 이외의 부피.
도 14/21: 220nm에서 UV 검출하에 0.5ml/분의 유속으로, 5mM 보레이트 버퍼 pH9.8 - 3.15% 수크로오스 (= 정제된 항원의 버퍼)중에 평형화된 TSK G4000 PWxl + G6000 PWxl 칼럼 (+ 가드 칼럼)상의 SEC-HPLC 분석 - 10㎍/ml 내지 1050㎍/ml의 물중의 CpG 용액에 대해 수득된 UV 프로파일.
도 15/21: 부형제로 스파이킹되거나 되지 않으며, 22℃에서 24h 저장된 정제된 항원 샘플에 대한 동적 광 산란 (말번으로부터의 제타나노® (ZetaNano))에 의한 크기 분석 (육안 관찰에 의해 항원 침전이 관찰되는 경우 크기 측정을 수행하지 않음).
도 16/21: 선택된 부형제 후보로 스파이킹되고, +4℃에서 14일 저장된 정제된 항원 샘플에 대한 동적 광 산란 (말번으로부터의 제타나노®)에 의한 크기 분석.
도 17/21: +4℃에서 14일 후 선택된 부형제 후보로 스파이킹된 정제된 항원 샘플에 대한 탁도 측정 (HACH 2100AN IS®).
도 18/21: ASA (소르비톨)의 이온 세정제와의 양립성 - 동적 광 산란 (말번으로부터의 제타나노®)에 의한 크기 분석.
도 19/21: DLS 측정을 나타내는 그래프.
도 20/21: CpG가 부재하는 샘플 (R19/1) 및 UF 전 HA-FT중의 100㎍/ml CpG로 스파이킹된 샘플 (R26/1 진행)의 시각적 분석.
도 21/21: DLS 측정을 나타내는 그래프.
도 2/21: 방출시 GMP 로트 (lot) DPRAAPA003에 대한 SEC-MALLS 분석에 의해 측정된 바와 같은 광 산란 (LS), 굴절률 (RI) 및 몰 질량 (MM) 분포.
도 3/21: 방출시 GMP 로트 DPRAAPA004에 대한 SEC-MALLS 분석에 의해 측정된 바와 같은 광 산란 (LS), 굴절률 (RI) 및 몰 질량 (MM) 분포.
도 4/21: 방출시 GMP 로트 DPRAAPA005에 대한 SEC-MALLS 분석에 의해 측정된 바와 같은 광 산란 (LS), 굴절률 (RI) 및 몰 질량 (MM) 분포.
도 5/21: 방출시 GMP 로트 DPRAAPA003 (청색 프로파일), DPRAAPA004 (적색 프로파일) 및 DPRAAPA005 (녹색 프로파일)의 SV-AUC 분석에 의해 수득된 침강 계수 분포 c(들). SV-AUC에 의해 수득된 미가공 데이타는 세드핏 (Sedfit) 소프트웨어를 사용하여 처리하였음을 주목하시오. 파장은 이러한 시그널 처리로 인한 것이며, 따라서 인공적인 것이다.
도 6/21: 4-12% 브리스-트리스 폴리아크릴아미드 겔 쿠마시 블루 R250 염색 (레인당 5㎍의 단백질이 로딩됨)의 환원 조건하에 SDS-PAGE 분석 - ASA (소르비톨 (Sorbitol))중에 재구성된 최종 컨테이너 - 후속의 25℃에서의 재구성 속도. 레인의 번호는 왼쪽부터 오른쪽으로 매겼다.
도 7/21: PRAME 항원에 대한 웨스턴 블롯 분석. ASA (소르비톨) 버퍼 또는 물에서 재구성된 최종 컨테이너. 후속의 25℃에서의 재구성 속도. 레인당 0.3㎍ 로딩된 단백질을 100V, 알칼리성 포스파타아제 (NBT-BCIP) 검출하에 니트로셀룰로오스 멤브레인상으로 1h 이동시켰다. 레인 1: T0에서 주입을 위해 물중에 재구성된 최종 컨테이너 (FC) - 원심분리 비처리 샘플; 레인 2: 1과 동일 - 원심분리 샘플 (상청액); 레인 3: T0에서 ASA 버퍼중에 재구성된 최종 컨테이너 (FC) - 원심분리 비처리 샘플; 레인 4: 3과 동일 - 원심분리 샘플 (상청액); 레인 5: T 4h 25℃에서 ASA 버퍼중에 재구성된 최종 컨테이너 (FC) - 원심분리 비처리 샘플; 레인 6: 5와 동일 - 원심분리 샘플 (상청액); 레인 7: T 24h 25℃에서 ASA 버퍼중에 재구성된 최종 컨테이너 (FC) - 원심분리 비처리 샘플; 레인 8: 7과 동일 - 원심분리 샘플 (상청액).
도 8/21: PRAME 용액으로의 CpG7909의 단계식 주입에 상응하는 등온 적정 열량 프로파일. PRAME로의 CpG의 결합은 포화에 도달할 때까지 특징적 순서의 시그널을 유도한다.
도 9/21: 상단부 패널은 SDS-PAGE 겔의 은 염색 후 시각화된 PRAME 단백질 분포를 나타낸다. 하단부 패널은 IEX-HPLC-UV 측정 후 그래디언트에 따른 CpG 분포를 나타낸다. 분획물 1은 SDS-PAGE 겔의 상응하는 레인 위의 하이라이팅된 하단부 분획물과 동일하다. 유사하게는, 분획물 12는 상단부 분획물과 동일하며, 분획물 w는 튜브 세척 레인과 동일하다. 적색 박스는 CpG가 항원과 상호작용하는 분획물을 나타냄을 의미한다 (대조군 실험에서, CpG가 단독으로 단지 상단부 분획물에서만 발견됨).
도 10/21: 3개의 별개의 레프로 (repro) 로트에 대한 PRAME 항원과 결합된 GpG의 양을 나타내는 비교 데이타. 청색 막대는 동결건조된 물질의 전-템포 (ex-tempo) 재구성에 상응한다 (그래프의 왼쪽 반은 500㎍ 용량, 오른쪽 반은 100㎍). 녹색 막대는 초원심분리 전 25℃에서 24h 동안 사전-인큐베이션된 샘플에 상응한다. 자홍색의 마름모형은 CpG/Ag 질량비에 상응하며, 오른쪽 축으로부터 해석되어야 한다.
도 11/21: SEC-HPLC 방법 개발. SEC 칼럼 선택. 정제된 항원에 대한 다양한 TSK 칼럼에 대해 수득된 UV 프로파일.
도 12/21: SEC-HPLC 방법 개발. SEC 칼럼 선택. CpG 용액으로 스파이킹된 정제된 항원에 대한 다양한 TSK 칼럼에 대해 수득된 UV 프로파일 (1050㎍/ml).
도 13/21: 220nm에서 UV 검출하에 0.5ml/분의 유속으로, 5mM 보레이트 버퍼 pH 9.8 - 3.15% 수크로오스 (= 정제된 항원의 버퍼)중에 평형화된 TSK G4000 PWxl + G6000 PWxl 칼럼 (+ 가드 칼럼)에 대한 SEC-HPLC 분석 - 정제된 항원 단독으로 수득된 UV 프로파일 또는 증가되는 농도의 CpG로 스파이킹된 후 수득된 UV 프로파일. 항원 충돌 CpG 크로마토그래피 프로파일. N.B. Vo = 칼럼의 빈 부피, 즉, 레진 비드 이외의 부피.
도 14/21: 220nm에서 UV 검출하에 0.5ml/분의 유속으로, 5mM 보레이트 버퍼 pH9.8 - 3.15% 수크로오스 (= 정제된 항원의 버퍼)중에 평형화된 TSK G4000 PWxl + G6000 PWxl 칼럼 (+ 가드 칼럼)상의 SEC-HPLC 분석 - 10㎍/ml 내지 1050㎍/ml의 물중의 CpG 용액에 대해 수득된 UV 프로파일.
도 15/21: 부형제로 스파이킹되거나 되지 않으며, 22℃에서 24h 저장된 정제된 항원 샘플에 대한 동적 광 산란 (말번으로부터의 제타나노® (ZetaNano))에 의한 크기 분석 (육안 관찰에 의해 항원 침전이 관찰되는 경우 크기 측정을 수행하지 않음).
도 16/21: 선택된 부형제 후보로 스파이킹되고, +4℃에서 14일 저장된 정제된 항원 샘플에 대한 동적 광 산란 (말번으로부터의 제타나노®)에 의한 크기 분석.
도 17/21: +4℃에서 14일 후 선택된 부형제 후보로 스파이킹된 정제된 항원 샘플에 대한 탁도 측정 (HACH 2100AN IS®).
도 18/21: ASA (소르비톨)의 이온 세정제와의 양립성 - 동적 광 산란 (말번으로부터의 제타나노®)에 의한 크기 분석.
도 19/21: DLS 측정을 나타내는 그래프.
도 20/21: CpG가 부재하는 샘플 (R19/1) 및 UF 전 HA-FT중의 100㎍/ml CpG로 스파이킹된 샘플 (R26/1 진행)의 시각적 분석.
도 21/21: DLS 측정을 나타내는 그래프.
상세한 설명
본 발명자들은 놀랍게도 희석제 교환 전에 PRAME을 함유하는 희석제에 다중음이온 화합물을 첨가하면 PRAME의 응집을 저하시킬 수 있음을 발견하였다.
응집
상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 방법은 희석제 교환 동안 PRAME의 응집을 저하시킨다. 응집은 개별적 PRAME 분자가 다른 PRAME 분자와 결합하여 멀티머를 형성하는 것을 의미한다. 응집은 당해 분야에 널리 공지된 동적 광 산란 기법을 이용하거나 또는 육안으로 관찰될 수 있다.
PRAME
상기 기술된 바와 같이, PRAME은 흑색종, 폐암 및 백혈병을 포함하는 많은 유형의 종양에서 과다 발현되는 항원이다 (Ikeda et al., Immunity 1997, 6 (2) 199-208). PRAME 단백질은 509개 아미노산 (SEQ ID NO:7)을 갖는다. 항원은 US 특허 제 5,830,753호에 기술되어 있다. PRAME은 또한, 하기 수탁 번호로 애너테이티드 휴먼 진 데이타베이스 (Annotated Human Gene Database H-Inv DB에서 찾아볼 수 있다: U65011.1, BC022008.1, AK129783.1, BC014974.2, CR608334.1, AF025440.1, CR591755.1, BC039731.1, CR623010.1, CR611321.1, CR618501.1, CR604772.1, CR456549.1, 및 CR620272.1. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 PRAME은 전장의 야생형 PRAME 단백질을 포함한다. 이는 또한, 보존성 치환부를 갖는 PRAME 단백질을 포함한다. 일 구체 예에서, 하나 또는 그 초과 즉, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 그 초과의 아미노산이 치환될 수 있다. PRAME 단백질은 야생형 RPAME 서열과 비교하는 경우 추가적으로 또는 대안적으로, 아미노산 서열내에 결실부 또는 삽입부를 함유할 수 있다. 일 구체 예에서, 하나 또는 그 초과 즉, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 그 초과의 아미노산이 삽입되거나 결실될 수 있다.
일 구체 예에서, 용어 PRAME은 전장의 야생형 PRAME 단백질과 80% 또는 그 초과, 즉, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 공유하는 단백질을 포함한다.
용어 PRAME은 또한, PRAME 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. PRAME은 융합 파트너 또는 캐리어 단백질로 융합되거나 컨주게이팅될 수 있다. 예를 들어, 융합 파트너 또는 캐리어 단백질은 단백질 D, NS1 또는 CLytA 또는 이의 단편으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, WO2008/087102 참조.
본 발명의 일 구체 예에서, 사용될 수 있는 면역학적 융합 파트너는 단백질 D, 그람-네거티브 박테리아의 표면 단백질, 헤모필루스 인플루엔자 B (Haemophilus influenza B) (WO91/18926) 또는 이의 유도체로부터 유래된다. 단백질 D 유도체는 단백질의 처음 1/3 또는 대략적으로 단백질의 처음 1/3을 포함할 수 있다. 일 구체 예에서, 단백질 D의 처음 109개 잔기가 융합 파트너로서 이용될 수 있다. 대안적 구체 예에서, 단백질 D 유도체는 처음 N-말단 100-110개 아미노산 또는 약 또는 대략적으로 처음 N-말단 100-110개 아미노산을 포함할 수 있다. 일 구체 예에서, 단백질 D 또는 이의 유도체는 지질화될 수 있으며, 지질단백질 D가 사용될 수 있다.
일 구체 예에서, PRAME 단백질은 a) PRAME 또는 이의 면역원성 단편, 및 b) 단백질 D로부터 유래된 이종 융합 파트너를 포함하는 융합 단백질이며, 상기 융합 단백질은 단백질 D의 분비 서열 (시그널 서열)을 포함하지 않는다. 단백질 D의 분비 또는 시그널 서열 또는 분비 시그널은 단백질 D의 N-말단의 19개 아미노산을 의미한다. 이와 같이, 본 발명의 융합 파트너 단백질은 나머지 전장 단백질 D 단백질을 포함할 수 있거나, 또는 단백질 D의 대략적으로 나머지 N-말단 1/3을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질 D의 나머지 N-말단 1/3은 단백질 D의 대략적으로 또는 약 아미노산 20 내지 127번을 포함할 수 있다. 일 구체 예에서, 단백질 D 서열은 단백질 D의 N-말단 아미노산 서열 20 내지 127번을 포함한다.
일 구체 예에서, PRAME은 단백질 D-PRAME/His 즉, N-말단 내지 C-말단: 아미노산 Met-Asp-Pro; 단백질 D의 아미노산 20 내지 127번; PRAME; 선택적 링커; 및 폴리히스티딘 테일 (His)을 포함하는 융합 단백질일 수 있다: . 선택적으로 사용될 수 있는 링커 및 폴리히스티딘 테일의 예는 예를 들어 하기를 포함한다: TSGHHHHHH; LEHHHHHH 또는 HHHHHH.
본 발명에 사용된 바와 같은 PRAME은 일반적으로, 10-2000mg/ml 즉, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1750 또는 2000mg/ml의 농도일 것이다.
고분자전해질
및
다중음이온
화합물
고분자전해질은 폴리머의 반복 유닛이 전해질 그룹을 지니는 폴리머이다. 이들 그룹들은 수용액 (물)중에 해리되어 폴리머를 하전시킬 것이다. 따라서, 고분자전해질 속성은 전해질 (염) 및 폴리머 (고분자량 화합물) 둘 모두와 유사하며, 때때로 다중염으로 불린다. 염과 같이, 이들의 용액은 도전성을 띤다. 폴리머와 같이, 이들의 용액은 종종 점성을 띤다.
본원에 언급된 바와 같이, 다중음이온 화합물은 전반적으로 네거티브 전하를 갖는 고분자전해질이다. 다중음이온 화합물의 예로는 PLG 및 올리고누클레오티드를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
다중음이온 화합물의 pH7.0에서의 순 네거티브 전하는 임의의 적합한 수단에 의해 계산될 수 있다. 이는 화합물의 평균 속성일 수 있으며, 사용된 다중음이온 화합물의 Mw에 대하여 계산되어야 한다. 예를 들어, 평균 17개 잔기를 갖는 PLG 폴리머의 순 네거티브 전하는 17이어야 한다. 일 구체 예에서, 순 네거티브 전하는 8 이상, 또는 17 이상, 바람직하게는, 8-100, 10-80, 12-60, 14-40, 16-20, 및 가장 바람직하게는, 약 또는 정확히 17이어야 한다.
일 구체 예에서, 본 발명의 다중음이온 화합물은 pH7.0에서 3개 모노머 당 평균 1 이상의 순 네거티브 전하, 바람직하게는, 3개 모노머 당 2 이상의 순 네거티브 전하, 및 가장 바람직하게는, 각 30개 모노머에 있어서 평균 1 이상의 순 네거티브 전하를 갖는다. 전하는 화합물 길이에 걸쳐 불균일하게 배열될 수 있으나, 바람직하게는, 화합물 길이에 걸쳐 균일하게 분포된다.
당업자는 용어 다중음이온 화합물이 다중음이온 세정제를 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 그러나, 본 발명은 희석제 A로부터 희석제 B로의 희석제 교환 전에 희석제 A에 다중음이온 화합물을 첨가하는 것에 관한 것이며, 여기서 희석제 A는 음이온 세정제를 포함하며, 이어서, 이러한 음이온 세정제는 희석제 A에 첨가된 다중음이온 화합물과 동일하지 않다.
폴리
L-
글루타메이트
(
PLG
)
폴리 L-글루타메이트는 생물학적 분자를 포함하는 희석제를 안정화시키는데 사용된 l-글루타메이트의 폴리머이다. 일 구체 예에서, 저분자량 PLG (6000 Mw 미만, 바람직하게는, 640-5000)이 사용되었다 (예를 들어, PLG는 평균 17개 잔기를 가지며, Mw가 2178임). PLG는 각각의 반복 유닛에서 매달린 자유 y-카르복실기를 갖는 완전히 생분해가능한 폴리아미노산이며 (pKa 4.1), pH7에서 네거티브 하전되며, 이는 이러한 호모폴리머가 수용성을 띠게 하며, 여기에 다중음이온성 구조를 부여한다. PLG는 통상적인 펩티드 합성 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 또한, 이는 비교적 다분산 형태로 시그마-알드리히 (Sigma-Aldrich) (St. Louis, MO, USA) (예를 들어, 다분산도가 약 2.6인 17mer) 또는 비교전 단분산 형태로 네오시스템 (Neosystem) (Strasbourg, France) (예를 들어, 다분산도가 1에 근접한 8, 16, 24 또는 32mer)로부터 입수가능하다.
본 발명에 사용된 바와 같은 PLG는 일반적으로, 10-2000 ㎍/ml 즉, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1750 또는 2000 ㎍/ml 농도일 것이다.
올리고누클레오티드
본 발명에 사용하기 위한 올리고누클레오티드는 리보핵산, 데옥시리보핵산 또는 당해 분야에 공지된 임의의 화학적으로 개질된 핵산으로 구성될 수 있다. 그러나, 본 발명에 사용된 올리고누클레오티드는 전형적으로, 데옥시누클레오티드이다. 올리고누클레오티드는 퓨린 또는 피리미딘의 임의의 서열을 함유할 수 있다.
일 구체 예에서, 올리고누클레오티드는 CpG를 포함한다. CpG는 DNA에 존재하는 시토신-구아노신 디누클레오티드 모티프의 약어이다. 역사적으로, BCG의 DNA 분획이 항종양 효과를 발휘할 수 있는 것으로 관찰되었다. 추가의 연구에서, BCG 유전자 서열로부터 유래된 합성 올리고누클레오티드는 면역자극 효과를 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌다 (실험관내 및 생체내 둘 모두에서). 이들 연구의 저자는 중앙 CG 모티프를 포함하는 특정 회문식 서열이 이러한 활성을 수반하는 것으로 결론내렸다. 면역자극에서 CG 모티프의 중심 역할은 후에 문헌 [Krieg, Nature 374, p546 1995]에서 밝혀졌다. 상세한 분석으로 CG 모티프가 특정 서열 콘택스트 (sequence context)내에 위치하여야 하며, 이러한 서열은 박테리아 DNA에서는 일반적이나, 척추동물 DNA에서는 드물다는 것이 밝혀졌다. 면역자극 서열은 종종, 퓨린, 퓨린, C, G, 피리미딘, 피리미딘 (여기서, 디누클레오티드 CG 모티프는 메틸화되지 않음)이나, 다른 비메틸화된 CpG 서열도 면역자극성을 띠는 것으로 공지되어 있으며, 본 발명에 이용될 수 있다.
6개 누클레오티드의 특정 조합에서, 회문식 서열이 존재한다. 하나의 모티프 또는 다양한 모티프의 조합의 반복부로서 수개의 이들 모티프는 동일한 올리고누클레오티드에 존재할 수 있다. 올리고누클레오티드를 함유하는 하나 또는 그 초과의 이들 면역자극 서열의 존재는 자연 킬러 세포 (이는 인터페론 γ를 생성하며, 세포용해 활성을 띰) 및 마크로파아지를 포함하는 다양한 면역 서브셋 (subset)을 활성화시킬 수 있다 (Wooldrige et al Vol 89 (no. 8), 1977). 그러나, 이러한 컨센서스 서열을 갖지 않는 다른 비메틸화된 CpG 함유 서열도 면역자극성을 띠는 것으로 현재 밝혀졌다.
본 발명의 일 구체 예에서, 올리고누클레오티드는 3개 이상, 바람직하게는, 6개 또는 그 초과의 누클레오티드에 의해 분리된 2개 또는 그 초과의 디누클레오티드 CpG 모티프를 함유한다. 본 발명의 올리고누클레오티드는 전형적으로, 데옥시누클레오티드이다. 바람직한 구체 예에서, 올리고누클레오티드내의 누클레오티드간 결합은 포스포로디티오에이트 또는 더욱 바람직하게는, 포스포로티오에이트 결합이나, 포스포디에스테르 및 기타 누클레오티드간 결합도 혼합된 누클레오티드간 링키지 (linkage)를 갖는 올리고누클레오티드를 포함하는 본 발명의 범위내에 있다.
바람직한 올리고누클레오티드의 예로는 하기 서열을 갖는다. 서열은 바람직하게는, 포스포로티오에이트 개질된 누클레오티드간 링키지를 함유한다.
대안적인 CpG 올리고누클레오티드는 상기 바람직한 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 이들은 여기에 중요치 않은 결실부 또는 첨가부를 갖는다.
본 발명에 이용된 CpG 올리고누클레오티드는 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 합성될 수 있다 (예를 들어, EP 468520). 편리하게는, 이러한 올리고누클레오티드는 자동화된 합성기를 이용하여 합성될 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 올리고누클레오티드는 일반적으로, 2-500개 염기 길이 즉, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500개 염기 길이이다. 일 구체 예에서, 본 발명에 사용하기 위한 올리고누클레오티드는 10-50개 염기 길이 즉, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개 염기 길이이다.
본 발명에 사용된 올리고누클레오티드는 일반적으로, 10-2000 ㎍/ml, 즉, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1750 또는 2000 ㎍/ml의 농도일 것이다.
희석제
용어 희석제는 희석 제제를 나타낸다. 본 발명의 문맥에서, 희석제는 희석제 단독을 나타낼 수 있거나, 하나 또는 그 초과의 용질을 포함하는 희석제를 나타낼 수 있다. 이러한 용질은 염, 버퍼, 세정제, 폴리머, 단백질 및/또는 올리고누클레오티드를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 분자일 수 있다. 희석제는 일반적으로, 물일 수 있으나, 또한 또 다른 적합한 용매일 수 있다.
희석제 A
상기 기술된 바와 같이, PRAME은 E. coli에서 과다발현되며, 여기서 봉입체를 형성하기 때문에, PRAME을 가용화시키기 위해, 봉입체를 음이온 세정제 및 우레아가 요구되는 강한 가용화 조건에 노출시켜야 한다. 또한, 정제 과정 동안 PRAME을 가용화 상태로 유지시키는 것이 필요하다. 희석제 A는 PRAME이 발현되는 세포로부터 PRAME을 직접적으로 가용화시키는데 사용되는 희석제를 나타낼 수 있거나, PRAME의 정제 동안 사용된 임의의 버퍼를 나타낼 수 있다. 용어 "희석제 A"는 다중음이온 화합물의 존재와 무관한 희석제를 나타내는데 이용될 수 있다. 본원에 언급된 바와 같이, 희석제 A는 PRAME의 정제를 위해 현재 공지된 공정에 이용되는 임의의 희석제이다.
일 구체 예에서, 희석제 A는 일반적으로 세정제를 포함할 것이다. 일 구체 예에서, 세정제는 일반적으로, 0.1% w/v 미만의 농도일 것이다. 추가 구체 예에서, 세정제는 음이온 세정제일 것이다. 음이온 세정제는 분자의 친유성 부분이 음이온인 임의의 세정제이다; 예로는 비누 및 합성 장쇄 설페이트 및 설포네이트를 포함한다. 일 구체 예에서, 음이온 세정제는 나트륨 도데실 설페이트 (SDS), 나트륨 도쿠세이트 또는 라우릴 사르코실이다.
일 구체 예에서, 희석제 A는 트리스, NaH2PO4.2H2O, 우레아 및 라우릴 사르코실중 하나 또는 그 초과를 포함한다.
존재하는 경우, 트리스의 농도는 1-200mM, 즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175 또는 200mM일 것이다.
존재하는 경우, NaH2PO4.2H2O의 농도는 1-200mM, 즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 또는 200mM일 것이다.
존재하는 경우, 우레아의 농도는 0.5-9M, 즉, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 또는 9.0M일 것이다.
존재하는 경우, 라우릴 사르코실의 농도는 0.1-10% w/v, 즉, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10%w/v일 것이다.
희석제 B
상기 기술된 바와 같이, 환자에 주입하기 위한 조성물중에 PRAME을 사용하기 위해서는, 이는 적합한 희석제로 전달되어야 한다. 이러한 희석제는 일반적으로, PRAME의 가용화 및 정제에 사용된 세정제를 실질적으로 함유하지 않을 것이다. 일 구체 예에서, 희석제 B는 실질적으로, 세정제를 함유하지 않을 것이다.
용어 "실질적으로 함유하지 않은"은 0.1% w/v 미만의 세정제, 즉 0.09, 0.08, 0.07, 0.06, 0.05, 0.04, 0.03, 0.02, 0.01% w/v 또는 그 미만의 세정제가 존재할 것임을 의미한다. 추가의 구체 예에서, 용어 "실질적으로 함유하지 않은"은 0.01% w/v 미만의 세정제, 즉, 0.009, 0.008, 0.007, 0.006, 0.005, 0.004, 0.003, 0.002, 0.001%, 0.0005% w/v 또는 그 미만의 세정제가 존재할 것임을 의미한다.
일 구체 예에서, 희석제 B는 보레이트 및 수크로오스중 하나 또는 그 초과를 포함한다. 일 구체 예에서, 희석제 B는 보레이트 및 수크로오스를 포함한다.
존재하는 경우, 보레이트의 농도는 1-200mM 즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 또는 200mM일 것이다.
존재하는 경우, 수크로오스의 농도는 0.1-20% w/v, 즉, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20% w/v의 농도일 것이다.
희석제 C
PRAME이 희석제 A로부터 B로 교환되면, PRAME을 새로운 희석제 즉, 희석제 C로 제형화하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 희석제 C는 PRAME을 저장하는데 사용될 수 있거나, PRAME의 동결건조를 허용할 수 있거나, 환자에 직접 사용될 수 있다.
희석제 C로 PRAME을 제형화하기 위해, 희석제 B를 함유하는 PRAME은 상기 기술된 공정을 이용하여 희석제 C로의 희석제 교환 처리될 수 있다. 추가적인 성분들이 새로운 희석제 즉, 희석제 C에 도달하기 위해 희석제 B를 함유하는 PRAME에 첨가될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 희석제 B가 희석되어 희석제 C에 도달될 수 있다. 이들 방법 모두가 본 발명에 의해 고려된다.
일 구체 예에서, 희석제 C는 트리스, 보레이트, 수크로오스, 폴록사머 및 CpG중 하나 또는 그 초과를 포함한다. 일 구체 예에서, 희석제 C는 트리스, 보레이트, 수크로오스, 폴록사머 및 CpG를 포함한다.
존재하는 경우, 트리스의 농도는 1-200mM, 즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175 또는 200mM일 것이다.
존재하는 경우, 보레이트의 농도는 1-200mM, 즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 또는 200mM일 것이다.
존재하는 경우, 폴록사머의 농도는 0.01-2% w/v, 즉, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.10, 0.11, 0.12, 0.13, 0.14, 0.15, 0.16, 0.17, 0.18, 0.19, 0.20, 0.21, 0.22, 0.23, 0.24, 0.25, 0.26, 0.27, 0.28, 0.29, 0.30, 0.35, 0.40, 0.45, 0.50, 0.60, 0.70, 0.80, 0.90, 1.0, 1.25, 1.50, 1.75, 또는 2% w/v일 것이다. 일 구체 예에서, 폴록사머는 폴록사머 188이다.
존재하는 경우, 수크로오스의 농도는 0.1-20% w/v, 즉, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20% w/v일 것이다.
존재하는 경우, CpG의 농도는 10-2000㎍/ml, 즉, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1750 또는 2000㎍/ml일 것이다.
희석제 C는 5-10 범위의 pH 즉, pH 5, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9 또는 10일 수 있다.
희석제 교환
희석제 교환은 단백질을 제 1 희석제로부터 단백질의 제 2 희석제로 전달하는 것에 관한 것이다. 단백질 자체가 전달될 수 있으나, 희석제가 전달되는 것이 더욱 일반적이다. 희석제 교환의 예로는 투석, 정용여과 및 크기 배제 크로마토그래피를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 목적은 희석제 교환 동안 단백질 응집을 저하시키는 것이다. 본 발명의 방법은 희석제 B로의 희석제 교환 전에 희석제 A에 다중음이온 화합물을 첨가하는 것에 관한 것이다. 그러나, 당업자는 다중음이온 화합물이 희석제 교환과 동시에 희석제 A에 첨가될 수 있는 경우가 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 다중음이온 화합물이 희석제 B중에 존재할 수 있다. 희석제 교환 시작시, 희석제 B에 존재하는 다중음이온 화합물이 희석제 A로 부가될 것이다. 또 다른 예에서, 다중음이온 화합물은 희석제 교환이 시작된 후 희석제 A와 B의 조합물에 첨가될 수 있다. 이러한 경우도 또한, 본 발명에 의해 고려된다.
투석
투석은 막을 통과하는 입자의 능력 차이에 기초한 액체중의 입자 분리에 의존적이다. 예를 들어, 단백질을 함유하는 소량의 희석제 A를 밀봉된 반투과성 막에 위치시킨다. 그 후, 막을 더 큰 용량의 희석제 B에 위치시킨다. 막은 반투과성 막을 통해 작은 용해질 분자 및 용매의 이동은 허용하나, 더 큰 단백질 분자의 이동은 허용하지 않는다. 소정의 기간 후, 막의 내부와 외부상의 희석제는 평형을 이룬다. 2개 희석제의 큰 용량 차이로 인해, 평형은 희석제 A의 희석제 B로의 교환을 효과적으로 유도한다.
정용여과
정용여과는 또한, 희석제 교환에 사용되는 막 기반 분리법이다. 배치식 정용여과에서, 희석제 A는 전형적으로, 새로운 희석제 즉, 희석제 B를 사용하여 2배로 희석되며, 접선 유동 여과 (TFF)에 의해 원래의 부피로 되돌아 오고, 부피를 초기 값으로 감소시키기 위해 투과 배제가 이용되며, 전체 공정이 수회 반복되어 원래의 희석제 A의 배제가 달성된다. 연속 정용여과에서, 희석제 B는 투과 속도와 동일한 속도로 첨가된다.
조성물
상기 기술된 바와 같이, 본 출원의 발명자에 의해 확인되고 해결된 문제점은 PRAME의 응집에 관한 것이다. 강한 세정제를 포함하는 희석제로부터 실질적으로 세정제가 없는 희석제로의 RPAME의 전달은 PRAME의 응집을 초래한다. 이러한 응집은 시간에 걸쳐 계속되며, 결국은 용액으로부터의 PRAME의 침전을 초래한다.
상기 기술된 바와 같은 본 발명의 방법은 이러한 문제점을 해소하고, 일관된 유체역학적 반경을 갖는 PRAME 조성물의 생성을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명은 PRAME 및 올리고누클레오티드를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 PRAME의 입도는 10-40nm, 즉, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40nm이다. 추가의 구체 예에서, PRAME의 입도는 15-25 nm, 즉, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25nm이다. 추가의 구체 예에서, PRAME의 입도는 16-20nm, 즉, 16.1, 16.2, 16.3, 16.4, 16.5, 16.6, 16.7, 16.8, 16.9, 17.0, 17.1, 17.2, 17.3, 17.4, 17.5, 17.6, 17.7, 17.8, 17.9, 18.0, 18.1, 18.2, 18.3, 18.4, 18.5, 18.6, 18.7, 18.8, 18.9,19.0, 19.1, 19.2, 19.3, 19.4, 19.5, 19.6, 19.7, 19.8, 19.9, 또는 20.0nm이다.
본 발명은 또한, PRAME 및 올리고누클레오티드를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 PRAME은 상기 기술된 바와 같은 입도 및 0.1 내지 0.4, 즉, 0.11, 0.12, 0.13, 0.14, 0.15, 0.16, 0.17, 0.18, 0.19, 0.20, 0.21, 0.22, 0.23, 0.24, 0.25, 0.26, 0.27, 0.28, 0.29, 0.30, 0.31, 0.32, 0.33, 0.34, 0.35, 0.36, 0.37, 0.38, 0.39 또는 0.40nm의 다분산 지수를 갖는다. 추가의 구체 예에서, PRAME은 0.2 내지 0.3, 즉,. 0.20, 0.21, 0.22, 0.23, 0.24, 0.25, 0.26, 0.27, 0.28, 0.29, 또는 0.30의 다분산 지수를 갖는다.
유체역학적 반경 및 다분산 지수 둘 모두는 동적 광 산란에 의해 측정될 수 있다.
동적 광 산란 (
DLS
)
광자 상관 분광법 (PCS) 또는 준-탄성 광산란 (QELS)으로 또한, 알려진 동적 광 산란 (DLS)은 산란된 광을 이용하여 용액중의 단백질 입자의 확산 속도를 측정하는 것이다. 이러한 모션 데이타 (motion data)는 샘플에 대한 크기 분포를 유도하도록 처리되고, 여기에서 크기는 단백질 입자의 "스토크 반경 (Stokes radius)" 또는 "유체역학적 반경"에 의해 주어진다. 이러한 유체역학적 크기는 질량 및 형상 (형태) 둘 모두에 의존적이다. 동적 산란은 매우 소량의 응집된 단백질의 존재도 검출가능하게 해준다 (<0.01 중량%).
동적 광 산란에서, 10분의 몇 마이크로세컨드 내지 수 밀리세컨드 범위의 시간에 걸쳐 용액의 매우 작은 영역으로부터 분산된 광의 시간 의존도가 측정된다. 산란광 강도의 이러한 변동은 연구되는 영역 내 및 외의 분자의 확산 속도에 관련되며 (브라운 운동), 산란하는 입자의 확산 계수를 직접 제공하도록 데이타가 분석될 수 있다. 여러 종류가 존재하는 경우, 확산 계수의 분포를 나타낸다.
전형적으로, 확산 계수의 관점에서 데이타를 제시하기 보다는, 데이타는 입자의 "크기" (반경 또는 직경)를 제공하도록 처리된다. 확산과 입자 크기의 관계는, 원래 아인슈타인에 의해 도출된 구형 입자의 브라운 운동에 대한 이론적 관계에 기초한다. 이러한 방법에서 파생된 "유체역학적 직경" 및 "스토크 반경" Rh는 단백질의 확산 계수와 동일한 확산 계수를 가질 구형 입자의 크기이다.
대부분의 단백질은 구형이 아니며, 이들의 겉보기 유체역학적 크기는 이들의 형상 (형태) 및 이들의 분자 질량에 의존적이다. 추가로, 이들의 확산은 또한, 단백질에 의해 결합되거나 포획되는 물 분자에 의해 영향을 받는다. 따라서, 유체역학적 반경은 실제 물리적 크기 (예를 들어, NMR 또는 x-선 크리스탈로그래피에 의해 관찰된 크기)와 현저하게 상이할 수 있다.
유체역학적 크기 및 다분산 지수는 DLS에 의해 측정되었다. 일 구체 예에서, 유체역학적 크기 및 다분산 지수는 말번의 제타나노®에 의해 측정되었다.
약제학적으로 허용되는 조성물
본 발명은 또한, (a) 본 발명의 방법에 따라 희석제 교환을 수행하는 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 생성된 제형을 멸균하는 단계를 포함하여, 약제학적으로 허용되는 PRAME 용액을 생성하는 방법을 제공한다.
일 구체 예에서, 본 방법은 단계 (b) 전에 희석제 C로 단백질을 제형화하는 추가적인 단계 (b')를 포함한다. 추가의 구체 예에서, 본 방법은 단계 (b')에서 생성된 제형을 동결건조하는 추가적 단계 (c)를 포함한다. 멸균화는 UV 멸균, 열 멸균 또는 여과를 포함하나 이에 제한되지 않는 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 통해서 수행될 수 있다. 일 구체 예에서, 멸균은 여과를 이용하여 달성된다. 필터의 기공 크기는 일반적으로, 0.05-1.0㎛ 즉, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0㎛일 것이다. 추가의 구체 예에서, 일련의 하나 또는 그 초과의 필터가 멸균을 달성하기 위해 사용될 수 있으며, 멸균은 상기 기술된 단계 동안 임의의 시점에서 발생될 수 있다.
본 명세서 및 하기 청구범위에 걸쳐, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 용어 "포함" 및 변형 예컨대, "포함한다" 및 "포함하는"은 언급된 정수 또는 단계 또는 언급된 정수 또는 단계의 그룹을 포함함을 의미하나, 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다.
본 발명은 하기 비제한적인 도면 및 실시예를 참조하여 추가로 기술될 것이다.
실시예
실시예
1 -
PRAME
의 특성 분석
등전점
말번으로부터의 제타나노®로의 제타 포텐셜 계산 및 전기영동 이동 측정에 의해 PRAME 항원의 등전점 (IEP)을 5mM 보레이트 버퍼 pH 9.8 - 3.15% 수크로오스중에 가용화된 정제된 항원에 대해 측정하였다. 실험에 의해 수득된 값 6.44는 이론적 아미노산 조성으로부터 계산된 값 (6.41)에 매우 근접하였다. 애주번트 시스템 A (ASA) (소르비톨)에서 재구성된 백신의 pH가 8.0이기 때문에, 존재하는 CpG, 항원 및 PRAME이 전체적으로 네거티브 하전될 것으로 예측된다. 따라서, 정전기적 상호작용이 두 엔티티 사이에서 발생하지 않을 것으로 예상되었다.
등전점
(
IEP
) 측정을 위한 재료 및 방법:
샘플을 5mM 보레이트 버퍼 pH 9.8 - 3.15% 수크로오스중에 희석하고, pH를 HCl 및/또는 NaOH로 원하는 pH로 조정하였다. 보고된 제타 포텐셜은 5개의 연속 측정치의 평균이다. IEP는 측정된 "제타 포텐셜 대 pH" 곡선에서 0 제타 포텐셜에서의 pH이다 (도 1/21). 참조 표준은 장비 및 측정 셀의 성능을 확인하기 위해 시험하였다.
표 1에 기록된 실험 조건을 이용하여 샘플 측정을 수행하였다:
레이저 파장: | 633nm |
레이저 파워: | 4mW |
검출된 산란된 광: | 13° |
온도: | 22℃ |
기간: | 소프트웨어에 의해 자동 측정 |
연속 측정 수: | 3-5 연속 측정 |
IEP가 필요로 하는 경우 pH 조절 용액 | HCl 0.3M, NaOH 0.5M |
PRAME
의 응집 상태
응집 프로파일
안정성을 위해 제안된 계획의 일부로서, 정제된 PD1/3-PRAME (SEQ ID NO:8)-His 벌크의 응집 상태를 하기에 의해 모니터링하였다:
ㆍ동적 광산란 (DLS) 분석 및
ㆍ멀티-앵글 레이저 광 산란 (MALLS) 검출 및 굴절율 (RI)과 같은 농도 민감성 검출과 함께 크기-배제 고성능 액체 크로마토그래피 (SEC).
PD1/3-PRAME-His의 정제된 벌크 (PB)는 또한, 분석적 초원심 분리를 이용한 침강 속도 프로파일 (Sedimentation Velocity profiling using Analytical Ultracentrifugation (SV-AUC))에 의해 특성 결정하였다.
DLS
에 의한 크기 분석
유체역학적 크기 및 다분산 지수를 방출시 (T0) 각 정제된 PD1/3-PRAME-His 벌크에 대해 DLS에 의해 측정하였다. 로트 DPRAAPA003, DPRAAPA004 및 DPRAAPA005에 있어서, 유체역학적 크기 (Z-평균, nm) 및 다분산도의 값은 배치 사이에 재현가능하였다. 항원은 16.6 내지 19.9nm의 크기로 응집되며; 다분산도는 0.218 내지 0.284 범위이다. PB 로트 DPRAAPA003, DPRAAPA004 및 DPRAAPA005가 4℃에서 4시간 동안 인큐베이션되거나 -70℃에서 12개월 동안 저장되는 경우, 현저한 크기 변화는 DLS에 의해 검출될 수 없었다 (m3.2.S.7.3 참조).
SEC
-
MALLS
분석
분석 방법:
UV, MALLS 및 RI 검출기를 이용한 SEC 분석은 교정 표준을 참조하지 않고 이들의 분자 형태에 대한 사전 추정 없이 용액중의 폴리머 또는 바이오폴리머의 절대 몰 질량 (MM) 및 크기 (유체역학적 반경 또는 Rh nm)의 측정을 가능하게 한다. 또한, 이는 소량이라 하더라도 응집을 검출하는 민감한 방법이다.
결과 및 고찰:
이러한 분석은 PB 로트 DPRAAPA003, DPRAAPA004 및 DPRAAPA005에 대해 수행하였다. 도 2/21, 도 3/21 및 도 4/21은 방출시 3개의 GMP 로트의 SEC-MALLS 분석에 의해 수득된 용출 부피에 따라 광 산란 (LS) 프로파일, RI 프로파일 및 몰 질량 (MM) 분포를 나타낸다.
최종 버퍼 (5mM 보레이트, 3.15% 수크로오스, pH 9.8)에서, PB는 다분산성의 가용성 응집물로 구성되며, 이들은 6.0 내지 7.7mL에서 용출되며, MM 값은 600 내지 3,000kDa로 다양하다.
더 높은 분자 질량의 응집물은 5.0 내지 6.0mL에서 용출되나, 이들은 총 정제된 단백질 벌크중 작은 분획을 나타낸다. 이는 도 5/21 및 표 2에서 하기 기재된 SV-AUC 분석에 의해 확인되었다.
SV
-
AUC
분석
분석 방법:
용액중의 바이오폴리머의 응집 프로파일이 분석될 용액과 크로마토그래피 베드 사이의 추정적 상호작용에 의해 영향을 받지 않고/거나 초래되지 않음을 보장하기 위해, 단백질 응집 상태 및 분포를 분석적 초원심분리에 의해 용액중에서 실시간으로 직접적으로 실시간 분석하였다. 간단하게는, 참조 (단백질 버퍼) 및 샘플 용액을 고속 (35,000rpm)으로 원심분리하고, 280nm에서 이들의 흡광도를 기록하였다. 획득된 데이타는 침강하는 종의 공간적 농도 그래디언트 및 원심장 적용 후 생성된 시간에 따른 이들의 전개를 반영한다. 침강은 단백질의 크기 및 형상 둘 모두에 의존적이다. 또한 침강 속도 (SV-AUC)로 불리는 침강 공정의 시간 경로 분석은 침강 계수(들)의 계산을 가능하게 한다. s 값은 Svedberg (S) 유닛으로 보고되며, 1 유닛은 10-13초에 상응한다.
정제된 PD1/3-PRAME-His 벌크에 있어서, 침강 계수 분포 c(들)는 세드핏 소프트웨어를 사용하여 수득하였다.
결과 및 고찰
도 5/21은 방출시 PB 로트 DPRAAPA003, DPRAAPA004 및 DPRAAPA005에 대해 수행된 SV-AUC 분석 결과를 보여준다.
표 4는 도 5/21에서 검출된 각 응집물과 이의 각각의 침강 계수 및 분자량 사이의 대응 관계를 보여준다. 이러한 정성적 해석은 전자 현미경에 의해 입증된 바와 같이 72-kDa 모노머 PD1/3-PRAME-His 단백질이 구형의 밀집한 응집물을 형성한다는 점에 기초한다. 이러한 구형 응집물에 있어서, 1.2의 고전 마찰 비율 (classical friction ratio) f/f°로 나타낼 수 있다.
도 5/21 및 표 2에 기재된 바와 같이, 72-kDa 모노머 형태 내지 20개 모노머 분자로 구성된 응집된 복합물 (MW = 1,440 kDa)에 해당하는 정제된 단백질 벌크의 대부분은 다분산성 군집 (3.6 내지 30 S의 침강 계수를 특징으로 함)에 의해 용액중에 나타났다. 로트 DPRAAPA003, DPRAAPA004 및 DPRAAPA005로부터의 PB에 대해 방출시 수득된 평균 침강 계수 (s 막대)는 각각 13.5, 10.2 및 11.1 S이다.
3.6 - 30-S 다분산성 군집은 각각 로트 DPRAAPA003, DPRAAPA004 및 DPRAAPA005로부터의 전체 PB의 95%, 97% 및 96%를 차지한다. 나머지는 더 높은 침강 상수 (30 내지 60S)를 특징으로 하는 더 큰 응집물을 나타낸다.
결론적으로, PD1/3-PRAME-His의 3개의 GMP 로트는 유사한 침강 계수 분포를 갖는다.
실시예
2 -
CpG
와의 상호작용 입증
SDA
-
Page
/
WB
항-
PRAME
(
모노머
위의 추가 밴드 7
kDA
)
ASA (소르비톨)에서 재구성된 최종 컨테이너에 대한 SDS-PAGE 분석을 수행하였다. 도 6/21에 설명된 바와 같이, 추가적인 밴드 (밴드 1)은 T0에서 최종 컨테이너에서 검출되었다 (레인 3 참조). 농도계 (Biorad GS-700 Imaging densitometerTM)에 의한 분석에 기초하여, 이러한 추가적 밴드는 PRAME 모노머 밴드 (밴드 2) 보다 더 높은 7 kDa의 MW를 특징으로 하며, 이의 강도는 시간에 걸쳐 증가하나, 96h 재구성 후 4% 미만 (w/w 대 모노머)으로 유지되었다. 특정 항-PRAME 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석 (도 7/21)은 추가적인 밴드가 생성물 관련되며, 이의 명도가 시간에 걸쳐 약간 증가함을 확인시켜 준다 (레인 3 vs. 7).
등온 적정 열량계
ITC는 2개 성분을 혼합함으로써 촉발된 화학 반응과 관련된 에너지 (열)을 직접적으로 측정하였다. 전형적인 ITC 실험은 하나의 반응물을 함유하는 용액을 다른 반응물을 함유하는 반응 셀에 단계식 주입함으로써 수행되었다. PRAME 항원/CpG 복합물의 연구에 사용된 ITC 설정은 CpG 액체 벌크 (재구성된 백신 버퍼 (보레이트 5mM 수크로오스 3.15% pH 9.8)중에 희석됨)의 PRAME 항원 용액 (동일한 버퍼중)으로의 주입을 포함하였다. 전형적인 적정 프로파일은 도 8/21에 제시되어 있다.
도 8/21에서 관찰되는 바와 같이, PRAME 용액으로의 CpG의 각각의 주입은 네거티브 피크를 유도하였으며, 이는 매우 상당한 발열성 결합 반응을 나타낸다. 이용가능한 비복합된 단백질의 양이 각각의 연속 주입 후 점진적으로 감소하기 때문에, 완전한 포화에 도달할 때까지 피크의 크기가 작아진다. 참고로, 항원 없는 PRAME 버퍼의 주입으로 이루어진 대조군 실험 (데이타 미도시)은 평평한 프로파일을 제공한다.
포화의 플래듀 (plateau)에 도달하는데 필요한 CpG의 양은 초원심분리에 의해 결정된 복합적 화학양론과 잘 일치하는 0.05 내지 0.10 범위의 CpG/항원 질량비와 동일하다.
재료 및 방법
등온 적정 열량계는 고도로 유효한 열 전도 물질로 제조된 2개의 동일한 셀로 구성된다. 참조 셀 (물로 충전됨)과 샘플 셀 (수중유 에멀션 함유, AS03) 사이의 온도 차이를 모니터링하였다. 측정은 참조 셀과 샘플 셀 사이에 동일한 온도를 유지하는데 필요한 파워 (μcal/s로서 나타냄)의 시간-의존적 인풋 (time-dependent input)으로 구성되었다. ITC 장치에 대해 사용된 일반적 프로토콜 및 설정은 제조업자 (MicroCal, USA)가 제공한 설명서를 따른다. 사용전 모든 샘플을 5분 동안 탈기시켜 기포의 존재로 인한 데이타 간섭을 최소화시켰다. CpG를 주입 주사기에 충전하고, 항원을 함유하는 샘플 셀로 적정하였다. 적정은 2㎕의 1회 주입에 이어서 10㎕의 24회 연속 주입으로 구성되며, 각 주입 사이에 6분의 간격을 두었다. 항원을 샘플 셀에 충전된 수준으로 로딩하였다 (이러한 장치에서 샘플 셀은 1404㎕ 충전 수준의 내부 부피를 갖는다).
CpG 및 항원 단독에 대한 대조군 적정은 항상 시험 프로토콜내에 포함된다.
속도침강
초원심분리
자유 항원 및 CpG로부터 PRAME/CpG 복합물을 분리할 목적으로, 속도침강 원심분리를 수행하였다. 샘플을 선형의 수크로오스 그래디언트 상단부에 로딩하고 이들의 침강 속도에 기초하여 분리하였다. 상기 기술된 ITC와 달리, 이러한 설정은 재구성된 백신 샘플의 분석을 추가적으로 가능하게 한다. 실험 조건의 최적화 후, 수크로오스 그래디언트에서 CpG 및 항원의 분포를 도 9/21에 도시된 바와 관찰하였다.
후속하여, SDS-PAGE를 RP-HPLC-UV로 대체하여 수크로오스 분획물중 항원의 정량적 측정치를 수득하였다. CpG/항원 상호작용이 유의한 배치-대-배치 변형에 의해 영향을 받는지의 여부를 측정하기 위해, 용량당 500㎍의 PRAME를 함유하는 3개의 레프로 로트 및 100㎍/용량의 3개 로트를 속도침강 초원심분리 처리하고, CpG/항원 복합물의 화학량론을 측정하기 위해 추가로 분석하였다. 이는 도 10/21에 도시되어 있다.
결과는 항원과 결합된 CpG의 양이 로트 사이에 매우 유사함을 보여주었다. 예상된 바와 같이, 500㎍에서 100㎍로의 항원 용량의 감소는 복합물에서 CpG 양의 감소를 유도하였다. 그러나, CpG/Ag 질량 비에 의해 나타낸 바와 같이 화학량론은 항원 투여량과 직접적으로 비례하지 않았다. 25℃에서 24h 동안의 샘플의 사전-인큐베이션은 복합물 화학량론에 영향을 끼치지 않았다.
이들 결과는 CpG가 PRAME과 일관되게 상호작용함을 강하게 시사한다.
재료 및 방법
14 x 89mm 원심분리 튜브에서, 5ml의 25% 수크로오스 용액을 동일한 부피 5ml의 5% 수크로오스 용액 하에 첨가하였다. 튜브를 마스터 그래디언트 (Master Gradient) 상에 로딩하여 연속 그래디언트 5-25%를 진행시켰다. 그래디언트 튜브상에서 1ml 용량을 제거하였다. 이 용량을 그래디언트 하단부에서 1ml의 50% 수크로오스 용액으로 대체하였다. 샘플 (또는 대조군)을 25℃에서 15분 동안 사전-인큐베이션하여, 4℃에서 저장된 것을 포함한 모든 샘플을 동일한 온도에서 원심분리를 시작하도록 하였다. 샘플의 250㎕ ml 분취액을 그래디언트 상단에 로딩하였다. 그래디언트를 4℃에서 67h 동안 100 000 상대 원심력 (rcf)으로 원심분리하였다.
수크로오스 분획물 수집
초원심분리로부터 유도된 분획물을 튜브 상단으로부터 피펫팅함으로써 수집하였다. 1-mL 분획물의 연속 석션을 수행하였다. 수집되면, 후속 분석 때까지 4℃에서 분획물을 저장하였다.
분획물 분석
ASCI 항원 검출
항원을 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 대안적으로, RP-HPLC-UV를 정량적 목적으로 사용하였다.
리포좀 성분의 검출
콜레스테롤 측정에 의해 리포좀 위치화를 수행하였다 (비색 키트 (colorimetric kit), 로슈 디아그노스틱스 (Roche Diagnostics)). 대안적으로, IP-HPLC-UV를 사용하였다.
CpG의 검출
CpG를 IEX-HPLC-UV에 의해 측정하였다.
샘플
항원 PB: Prame:R03
최종 컨테이너 (동결건조된 케이크): Prame: 08H14PRA01, 08H20PRA01, 08I09PRA01 (500㎍/HD)
08H14PRA02, 08H20PRA02, 08I09PRA02 (100㎍/HD). AS01B:DA1BA008A
CpG 액체 벌크: DCPGAFA003
ELISA
(간섭) -
PD
-
PRAME
-
his
:
Ph
I/
II
물질에 대한
ELISA
에 의한 항원 함량
PRAME과 CpG 사이의 관찰된 상호작용을 추가로 조사하기 위해, mAb 항-PRAME 및 폴리클로날 항체 (Pab) 항 단백질 D (PD)의 사용에 기초한 샌드위치 ELISA를 전개시켜 항원 함량을 측정하였다.
PB의 항원 함량을 시험하기 위해 이러한 ELISA를 사용하면 PB들 (PB)의 예상치를 제공한다. 그러나, ELISA가 최종 컨테이너 (FC)에 적용되는 경우, 항원성 손실이 관찰되었다.
N.B. PB는 보레이트 5mM 수크로오스 3.15% 버퍼중의 항원을 함유하는 반면, FC는 CpG (420㎍/용량), 0.24%의 폴록사머 188, 수크로오스 4% 및 트리스 16mM을 함유하였다.
표 3에 기록된 바와 같이, 이러한 관찰된 결과가 CpG와 관련이 있는지의 여부를 시험하기 위해, PB에 증가하는 용량의 CpG로 스파이킹하면서, 항원 함량을 ELISA에 의해 측정하였다.
이러한 결과는 PB중의 CpG 첨가가 특히, 10 내지 100㎍/ml로 포함된 농도에서 특히 항원성의 감소와 관련되며, 이는 CpG가 첨가될 경우 항원 형태의 변화를 나타냄을 보여준다.
재료 및 방법
본 방법은 "샌드위치" ELISA에 기초한다: 항원 PDPRAME-his (레프로 로트 R02)의 첨가 전에, 면역플레이트를 PRAME (MK1H8C8 희석됨 500x)에 대해 유도된 마우스 모노클로날 항체로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 37℃에서 90' 동안 항원과 반응시킨 후, PC에 대해 유도된 래빗 폴리클로날 항체 (LAS98733)을 37℃에서 90' 동안 첨가하였다. 37℃에서 90' 동안 Pab와 반응시킨 후, 래빗 면역글로불린에 대한 바이오티닐화된 덩키 전체 항체를 37℃에서 90' 동안 첨가하였다. 항원-항체 복합물은 37℃에서 30' 동안 스트렙타비딘-바이오티닐화된 퍼옥시다아제 복합물과 인큐베이션시켜 드러나게 하였다. 그 후, 이러한 복합물을 실온에서 15' 동안 테트라메틸 벤지딘 (TMB)을 첨가하여 드러나게 하고, 0.2M H2SO4로 반응을 중단시켰다. 광밀도는 450nm에서 기록하였다.
샘플의 농도를 표준 항원 (1604㎍/ml에서 레프로 로트 R01)을 참조로 하여 소프트맥스프로TM (SoftMaxProTM)로 계산하였다.
SEC
-
HPLC
(간섭)
재료 및 방법
겔 투과 또는 겔 여과 크로마토그래피로 또한 불리는 크기-배제 크로마토그래피 (SEC)는 분자를 이들의 크기 또는 형상에 기초하여 용액중의 분자를 분리하는 방법이다. 제형 공정을 통한 항원 크기 추적은 백신 후보를 개발할 때 성공 기준중 하나이다. 따라서, 첫 번째 목표는 본 목적을 위한 분석 SEC 방법을 개발하는 것이었다. CpG가 백신 후보에 첨가되기 때문에, 5mM 보레이트 버퍼 pH9.8 - 3.15% 수크로오스 (= 정제된 항원의 버퍼)중에 평형화된 정제된 항원 단독 (도 11/21) 또는 CpG 용액으로 스파이킹된 정제된 항원 (도 12/21)을 0.5ml/min의 유속 및 220nm의 UV 검출 하에 토소 (Tosoh) 공급업체로부터의 수개의 SEC 칼럼상에 주입하였다 (단독으로 또는 조합으로). 또한, 토소 공급업체에 의해 권고된 가드 칼럼을 각 칼럼 또는 칼럼의 조합과 사용하였다. 도 12/21에 도시된 바와 같이, 단일 칼럼 (TSK G5000 PWxl 또는 TSK G6000Pwxl)상으로의 CpG 용액으로 스파이킹된 정제된 항원의 주입은 분자 피크의 상당한 오버랩핑을 초래하는 반면, 일련의 2개 칼럼의 조합은 해상도를 증가시켰다. 따라서, 2개의 칼럼의 조합 즉, TSK G4000PWxl + G 6000 PWxl을 후속 제형 개발을 위한 SEC 분석 도구로서 선택하였다.
시험 칼럼의 특성
ㆍTSKgel PWxlTM 가드 칼럼: 6mm 내부 직경 (ID) x 4cm 길이 (L) - 토소 - Ref 08033
ㆍTSK G4000 PWxlTM 칼럼: 7.8 mm ID x 30 cm L - 토소 - Ref 08022
ㆍTSK G6000 PWxlTM 칼럼: 7.8 mm ID x 30 cm L - 토소 - Ref 08024
ㆍTSK G5000 PWxlTM 칼럼: 7.8 mm ID x 30 cm L - 토소 - Ref 08023
도 13/21에 도시된 바와 같이, 정제된 항원 (1.68mg의 단백질/ml)에 대한 보유 시간 및 표면적의 증가는 10㎍/ml 이하의 CpG 용액으로의 스파이킹 후 이미 관찰되었다. 더 긴 보유 시간은 더 작은 크기를 시사할 것이다 (= 항원 용해도에 대한 CpG의 긍정적 효과를 간접적으로 나타냄). 따라서, 정제된 항원을 증가하는 농도의 올리고누클레오티드 용액 (10㎍/ml로부터 1050㎍/ml 까지)으로 추가로 스파이킹시켰다. 제 1 용출 피크 (피크 1)의 표면적은 60㎍/ml 이하의 CpG 농도에 대해 증가되었으며, 그 후 1050㎍ CpG/ml 까지의 모든 상위 스파이킹 농도에 대해 일정하게 유지되었다. 자유 CpG에 상응하는 제 2 피크 (피크 2) (도 14/21은 다양한 농도의 CpG 용액의 주입 후 수득된 UV 프로파일을 나타냄)는 180㎍/ml의 CpG로부터 검출되었다.
실시예
3 - 부형제 스크리닝
5mM 보레이트 pH9.8 - 수크로오스 3.15%에 가용화된 정제된 항원으로부터 출발하여, 25개 부형제를 +4℃ 및 +22℃에서 저장시 항원 크기의 안정화에 대해 평가하였다. 시험한 부형제 및 농도의 목록은 표 4에 기록되어 있다.
첫 번째 후보 선택은 22℃에서 24h 저장 후 동적 광 산란에 의한 크기 분석 및 시각적 관찰을 통해 수행하였다 (표 4 및 도 15/21 참조). 시험한 모든 부형제중에서, 이들중 단지 4개만 항원 크기 안정화를 가능하게 하였다: SDS 0.01%, 나트륨도쿠세이트 0.01%, 사르코실 0.03% 및 CpG (20㎍/ml 내지 50㎍/ml).
표 4: 22℃에서 24h 저장 후 부형제로 스파이킹되거나 되지 않은 정제된 항원 샘플에 대한 시각적 관찰 및 항원 크기의 안정화에 대해 시험한 부형제의 목록 및 농도. PB = 5mM 보레이트 pH 9.8 - 수크로오스 3.15%중의 정제된 항원
부형제
|
농도
|
단위
|
시각적 관찰
24h 22℃ |
L-글리신 |
10 100 |
mM mM |
흐림 불투명 |
L-히스티딘 |
10 100 |
mM mM |
흐림 불투명 |
L-글루탐산 |
1 10 |
mM mM |
약간 흐림 흐림 |
L-아스파르트산 |
0.5 100 |
mM mM |
약간 흐림 불투명 |
L-류신.2HCl |
5 30 |
mM mM |
약간 흐림 흐림 |
MgCl2.6H2O |
1 50 |
mM mM |
불투명 불투명 |
MgSO4.7H2O |
1 50 |
mM mM |
불투명 불투명 |
트레할로스.2H2O |
1 5 |
% % |
약간 흐림 흐림 |
폴리에틸렌글리콜 300 |
1 5 |
% % |
약간 흐림 흐림 |
폴리에틸렌글리콜 6000 |
1 5 |
% % |
흐림 흐림 |
(Myo-)이노시톨 |
1 5 |
% % |
흐림 매우 흐림 |
D-만니톨 |
1 5 |
% % |
불투명 불투명 |
소르비톨 |
1 5 |
% % |
불투명 매우 흐림 |
SDS 나트륨 라우릴 설페이트 |
0.01 0.03 |
% % |
투명 투명 |
나트륨 도쿠세이트 |
0.01 0.03 |
% % |
투명 투명 |
솔루톨 HS15 |
0.01 0.05 |
% % |
매우 약간 흐림 매우 약간 흐림 |
트리톤 X-100 (옥토시놀 9) |
0.3 0.5 |
% % |
약간 흐림 약간 흐림 |
폴록사머 188 (루트롤 F68) |
0.05 0.5 |
% % |
약간 흐림 약간 흐림 |
설포베타인 ( SB3-12) |
0.01 0.03 |
% % |
약간 흐림 약간 흐림 |
2-피롤리돈 |
0.01 0.05 |
% % |
약간 흐림 약간 흐림 |
프로필렌글리콜 |
0.1 1.5 |
% % |
약간 흐림 약간 흐림 |
a-토코페릴 히드로숙시네이트 (Vit E 숙시네이트) | 1 5 |
mM mM |
투명 투명 |
CPG |
0 20 30 35 40 45 50 |
㎍/ml ㎍/ml ㎍/ml ㎍/ml ㎍/ml ㎍/ml ㎍/ml |
약간 흐림 약간 흐림 약간 흐림 약간 흐림 약간 흐림 약간 흐림 약간 흐림 |
사르코실 | 0.03 | % | 약간 흐림 |
정제된 항원 (= PB) |
1500 1250 1125 |
㎍/ml ㎍/ml ㎍/ml |
약간 흐림 약간 흐림 약간 흐림 |
추가적인 안정도 데이타를 4개의 선택된 후보 (SDS, 나트륨 도쿠세이트, 사르코실 및 CpG)에 대해 4℃에서 14일까지 생성시켰다. 도 16/21에 도시된 바와 같이, 항원 크기는 4개의 부형제의 존재하에 안정되게 유지된 반면, 비스파이킹된 (non-spiked) 정제된 항원 (= PB 샘플)에 대해서는 84nm까지 증가하였다. 동일한 샘플에 대한 혼탁도 측정 (도 17/21 참조)은 단지 비스파이킹된 정제된 항원에 대한 전개만 확인하였다.
다음 단계는 이온 세정제 (사르소실, SDS 및 나트륨 도쿠세이트)와의 ASA (소르비톨) 양립성 (리포좀 크기 및 QS21 켄칭)의 평가를 포함하였다. 리포좀 크기는 1% SDS 또는 나트륨 도쿠세이트의 존재하에 증가하였으며, 1% 이하의 사르코실에 대해 안정하게 유지되었다 (도 18/21 참조). 단독으로 3개의 이온성 세정제가 적혈구 세포 용해물을 포함하였다.
결론:
단독으로 SDS 즉, 나트륨 도쿠세이트 및 사르코실이 적혈구 세포 용해를 유도한다는 점 및 이들 부형제의 제한된 또는 불가능한 주입성을 고려하여, PB중의 부형제로서의 CpG의 사용을 우선으로 하였다.
실시예
4 -
PRAME
PB
용해도에 대한
CpG
의 영향
도입
본 실시예는 최종 정제 버퍼중에서 PRAME 항원에 대한 CpG7909의 가용화 효과를 기록하기 위해 수집된 데이타를 요약하였다.
최종 버퍼 (5mM 보레이트 - 3.15% 수크로오스 버퍼) 중에 넣은 경우, PRAME 항원이 불용성 응집물을 형성하고 침전을 초래하는 것으로 매우 여겨짐이 관찰되었다. 단백질의 용해도를 증강시키는 부형제를 찾고자 하는 노력을 기울였다. 부형제 후보 패널중에, CpG를 평가하였으며, 최종 버퍼에서 PRAME 용해도의 (예상치 못한) 증가가 입증되었다.
CpG 농도 스크리닝 실험 결과는 하기 기술되었다.
제 1
CpG
농도 스크리닝 - 투석 시험
실험 계획
300ppm 라우릴-사르코실 (LS)를 함유하는 보레이트-수크로오스 버퍼중에 PRAME의 PB 샘플로 개시하는 것이 목적이다. 이러한 양의 세정제는 단백질을 가용성 상태로 유지시키는 이의 능력을 입증하였다. 그 후, 본 발명자들은 LS를 제거하고 이를 증가되는 양의 CpG로 대체시키기 위한 투석 작업을 이용하였다. 버퍼 교환 후, 생성물의 응집물 전개를 DLS에 의해 모니터링하여 안정된 응집 상태를 유지하는데 필요한 CpG의 양을 추정하였다.
재료 & 버퍼
개시 물질: 버퍼 5mM 보레이트/ 3.15% 수크로오스 / 300ppm 라우릴-사르코실 - pH 9.8중의 PB PRAME (설계된 R23/1). 2ml PB의 4개 샘플을, CpG의 농축액을 이용하여 시험된 농도까지 스파이킹시켰다: 0㎍/ml CpG (대조군); 50㎍/ml CpG; 200㎍/ml CpG; 400㎍/ml CpG. 투석 버퍼 = 5mM 보레이트 / 3.15% 수크로오스 - pH 9.8 (검정 당 2 x 1L). 투석 카세트 [피어스 슬라이드-A-라이저 (Pierce Slide-A-Lyzer) 20,000 MWCO].
방법
2ml의 샘플을 투석 카세트에 유입시켰다. 각 카세트를 1L의 투석 버퍼를 함유하는 수용기에 함침시켰다. 실온하에 완만한 진탕 (자성 교반기)하에 수행하였다.
제 1의 1L 투석조를 2시간 후 1L의 새로운 버퍼로 대체하고, 실온에서 밤새 완만한 진탕하에 유지시켰다.
다음 날, 카세트내의 샘플을 에펜도르프 컨테이너 (PP)에서 회수하고, 추가 분석을 위해 +4℃에서 저장하였다.
분석
분석을 하기에 의해 수행하였다: 시각적 측면; 잔존하는 CpG 함량을 모니터링하기 위한 HPLC-IEX-UV (다이오넥스 DNAPac PA200TM (Dionex DNAPac PA200TM) 칼럼)에 의한 CpG 함량; LS (초기 가용화 세정제)가 잘 제거되었음을 확실히 하기 위한, RP-HPLC-UV (워터스 선파이어 C18 (Waters SunFire C18) 칼럼)에 의한 라우릴-사르코실 함량; 동적 광 산란 (DLS) (말번의 제타나노®)을 +4℃에서 24h 및 72h 저장 기간 후 투석된 생성물에 대해 측정하고 후속 크기 전개를 수행하였다.
결과
시각적 측면: 모든 샘플은 투석 작업 후 투명하였다.
샘플 |
24h/RT 투석 후 | 72h/+4℃ 후 | ||
Z-ave(nm) | 다중 분산도 (PdI) | Z-ave(nm) | PdI | |
네거티브 대조군 (비투석) | 22.8 | 0.17 | - | - |
+ 0 ㎍ CpG (포지티브 대조군) | 56.6 | 0.134 | - | - |
+ 50 ㎍ CpG | 24.9 | 0.18 | 27.6 | 0.17 |
+ 200 ㎍ CpG | 20.4 | 0.21 | 20.6 | 0.26 |
+ 400 ㎍ CpG | 20.4 | 0.21 | 21.04 | 0.24 |
샘플 |
LS 함량 ppm |
CpG 함량 (㎍/ml) |
CpG 회수율 % |
PRAME 대조군 (T0 - 비투석) | 293 | - | - |
PRAME + 50 ㎍ CpG (+투석) | <0.5 | 39 | 78 |
PRAME + 200 ㎍ CpG (+투석) | <0.5 | 153 | 77 |
PRAME + 400 ㎍ CpG (+투석) | <0.5 | 317 | 79 |
BO3-수크로오스 + 100 ㎍ CpG (비투석) | - | 94.2 | 94 |
BO3-수크로오스 + 100 ㎍ CpG (+투석) | - | 71.6 | 72 |
LS를 투석 작업 동안 잘 제거하였으며 (투석된 샘플에 대해 LOQ 미만으로 측정), CpG는 PRAME의 부재시에도 약 80%의 평균 회수율로 투석 카세트의 내면상에 유지되었다.
본 발명자들은 50 내지 200㎍/ml의 CpG 정량이 라우릴-사르코실의 제거 후 약 20nm의 입도를 유지함을 관찰하였다. 이러한 관찰은 PRAME-CpG 상호작용이 PRAME의 용해도에 유익함을 시사한다.
제 2
CpG
농도 스크리닝 -
초여과
시험 (
UltraFiltration
trials
)
목적
평가용 초여과 시스템을 이용하여 PRAME을 가용성으로 유지시키는데 필요한 CpG 정량 스크리닝.
재료 & 버퍼
개시 물질: R25/2 정제로부터의 히드록시아파타이트 플로우-쓰루 (HydroxyApatite Flow-through) (HA-FT) 항원 분획
샘플 버퍼 조성물 = 20mM 트리스 - 6M 우레아 - 0.5% 라우릴 사르코실 - 50mM PO4 - ~80mM 이미다졸
약 70ml HA-FT의 4개 샘플을 4개의 독립적인 UF (초여과) 실험에서 처리하였다. CpG의 소량의 수성 농축액을 하기 농도에 도달하도록 첨가하였다: 50㎍/ml CpG -> UF-A (정용여과 버퍼중 CpG 비함유); 75㎍/ml CpG -> UF-B (정용여과 버퍼중 CpG 비함유); 100㎍/ml CpG -> UF-C (정용여과 버퍼중 CpG 비함유); 50㎍/ml CpG -> UF-D (정용여과 버퍼중 50㎍/ml CpG)
CpG 스파이킹된 샘플을 초여과 전에 매우 완만한 진탕하에 실온에서 1h 동안 인큐베이션하였다.
정용여과 버퍼: 5mM 보레이트 / 3.15% 수크로오스 - pH 9.8 (UF-A/B/C); 5mM 보레이트 / 3.15% 수크로오스 + 50 ㎍/ml CpG - pH 9.8 (UF-D)
초여과 카세트 [미니메이트TM (MinimateTM) - 오메가 (Omega) - 폴 컷-오프 (from Pall Cut-off) 30kD] - 표면 50cm2
초여과 시스템 [JM JM 바이오커넥트 II (JM JM Bioconenct II)로부터의 크로스플로TM (KrossFloTM)]: 연동 펌프 포함, UF 카세트 및 3 압력 게이지를 수용하는데 적합한 튜빙
방법
적합한 CpG 함유물로 스파이킹된 70ml의 HA-FT 샘플을 정용여과 버퍼의 15 정용여과 부피 (Vol 총 정용여과 버퍼 = 1050ml)에 대해 정용여과하였다.
UF-조건:
재순환 유속 = 35ml/min
TMP 조절: 투석유물 카운터-압력 밸브 조절에 의해 DV1에 있어서 8psi -> DV9에 있어서 8 그 후, 12psi -> 15
Ag의 농축은 수행되지 않음 - 단지 정용여과
작업 말기: 최종 투석유물 생성물을 추가 분석을 위해 +4℃에서 보관하였다.
NaOH 0.5N (정적) 하의 2 x 30min의 제자리 세정 (CIP)을 다양한 UF 사이에 수행하였다.
분석
분석을 하기에 의해 수행하였다: HPLC-IEX-UV (다이오넥스 DNAPac PA200 칼럼)에 의한 CpG 함량; RP-HPLC-UV (워터스 선파이어 C18 칼럼)에 의한 라우릴-사르코실 함량; 동적 광 산란 (DLS) (말번의 제타나노®)를 UF 후 직접 측정하고, 1주 후 +4℃ 및 실온에서 저장하고 후속하여 크기 전개시켰다.
결과
버퍼 조건 | 안정점 | Z-평균 (nm) | PdI |
$A + 50㎍/ml CpG | To | 22.47 | 0.102 |
$A + 50㎍/ml CpG | 1w/RT | 23.85 | 0.095 |
$A + 50㎍/ml CpG | 1w/+4℃ | 24.19 | 0.106 |
$B + 75㎍/ml CpG | To | 18.11 | 0.121 |
$B + 75㎍/ml CpG | 1w/RT | 18.98 | 0.104 |
$B + 75㎍/ml CpG | 1w/+4℃ | 26.55 | 0.289 |
$C + 100㎍/ml CpG | To | 16.62 | 0.135 |
$C + 100㎍/ml CpG | 1w/RT | 16.29 | 0.108 |
$C + 100㎍/ml CpG | 1w/+4℃ | 16.02 | 0.134 |
$D + Tp Diaf : 50 ㎍/ml CpG | To | 10.61 | 0.247 |
$D + Tp Diaf : 50 ㎍/ml CpG | 1w/RT | 11.28 | 0.221 |
$D + Tp Diaf : 50 ㎍/ml CpG | 1w/+4℃ | 10.84 | 0.289 |
샘플 |
LS 함량 ppm |
CpG 함량 (㎍/ml) |
회수율 % |
내부 대조군 (150 ppm 버퍼) | 161 | - | - |
$A + 50 ㎍ CpG | <0.5 | 40 | 80 |
$B + 75 ㎍ CpG | - | 49 | 65 |
$C + 100 ㎍ CpG | - | 79 | 79 |
LS는 15 정용여과 부피 후 완전히 제거되었다 (CpG의 존재하에서도). CpG 회수율은 65-80%로 측정되었다.
결론
초여과를 사용하는 경우 CpG의 가용화 효과를 관찰하였다.
도 19/21에서 녹색 화살표는, 샘플이 시간에 걸쳐 가장 안정적이기 때문에, 즉, 1주 후에도 크기가 증가하지 않으므로, UF-R 전의 HA-FT중의 100㎍/ml CpG 스파이킹 농도가 적합한 농도로서 선택됨을 나타낸다.
다량의 CpG가 샘플 측에 잔존하며 생성물을 가용화 상태로 유지시키는데 충분하므로, 정용여과 버퍼 (UF-D)중의 CpG를 첨가할 필요가 없는 것으로 보인다. 그 후, 1L 규모 정제에 대하여 100㎍ CpG로의 HA-FT의 스파이킹을 조사하였다.
1L 규모에서 100㎍
CpG
스파이킹
옵션의 검증
목적
1L 규모 공정으로 100㎍/ml CpG로의 스파이킹의 실행가능성 입증 (최종 전개 스케일)
과정
ㆍ R26/1 수행: 1L 규모로 완전 PRAME 정제 + UF 전 HA - FT 중의 100㎍/ ml CpG로 스파이킹
ㆍ 전형적인 스트레스 시험으로 최종 산물의 안정도 검사
ㆍ -70℃ / +4℃ / 실온 및 37℃에서의 1주 안정도
ㆍ 2 내지 3회 동결 / 해동 주기 (-70℃ - RT)
ㆍ RP-HPLC-UV에 의한 LS 제거 검사
ㆍ 1L 규모 조건에서 UF 말기에 CpG 함량 검사 (IEX-HPLC-UV)
결과
스트레스 조건 | Zav (nm) | PdI |
T0 | 18.7 | 0.14 |
1w / -70℃ | 19.6 | 0.15 |
1w / +4℃ | 21 | 0.24 |
1w / RT | 20.9 | 0.2 |
1w / 37℃ | 19.2 | 0.1 |
2회 사이클 F/T | 19.6 | 0.17 |
3회 사이클 F/T | 40.9 | 0.29 |
1w/+4-RT-37℃ 및 2 F/T 사이클 후 입도 (Zav = 18.7 - 20.9nm)의 현저한 증가는 없었다. 3F/T 사이클 후 입도의 증가는 더욱 현저하였다. CpG 함량 = 101㎍/ml. LS 함량 <0.5㎍/ml.
결론
R26/1 수행은 HA-FT중의 100㎍/ml CpG 스파이킹이 1L 규모에 적합하며, PRAME의 침전을 해결함을 보여준다 (도 20/21).
실시예
5 -
PRAME
PB
용해도에 대한
PLG
및 추가적인
CpG
올리고누클레오티
드의 효과
CPG
및
PLG
용액 제조 및 정량화
CpG 15-mer 및 30-mer의 스톡액을 물중에서 30mg/ml로 제조하였다 (30ml/ml의 CpG-24mer의 스톡액은 이미 입수가능함). 폴리글루타메이트 (PLG)-24mer의 스톡액을 물중에서 10mg/ml로 제조하였다. 3개의 스톡액을 0.22㎛ PVDF 막상에서 여과하였다 (밀레스 GV (millex GV)). 스톡액중의 CpG 함량은 RMN 분석에 의해 측정하였다. 함량은 CpG 15-mer에 있어서 30.20mg/ml이며, CpG 30-mer에 있어서 29.34mg/ml이었다. 폴리글루타메이트 (PLG)-24mer 함량은 중량에 기초한 것이다.
투석 시험
투석 단계는 원래의 가용화제 (라우릴 사르코실 - PRAME 용해도를 유지시키는데 요구됨)를 제거하고 이를 평가하의 대안 후보로 대체하기 위해 제안되었다.
실험 조건:
개시 샘플: 5mM 보레이트 - 3.15% 수크로오스 - 300ppm 라우릴 사르코실 - pH 9.8 버퍼중의 2ml의 PRAME 정제된 벌크
실험 계획에 따라, 일부 샘플을 가용화제 후보로 스파이킹하였다 (표 10 참조).
- 투석 막 컷-오프 : 20kDa
- 투석 버퍼: 2 x 1L의 5mM 보레이트 - 3.15% 수크로오스 - pH9.8
실험 계획에 따라, 일부 버퍼를 가용화제 후보로 스파이킹하였다 (표 10 참조).
- 각 샘플을 실온에서 2h 동안 완만한 진탕 하에 1L 버퍼에 대해 투석하였다. 그 후, 버퍼를 새롭게 하고, 투석을 실온에서 밤새 완만한 진탕 하에 수행하였다.
- 각 샘플에 대한 2.0ml 내지 2.1ml 용량을 투석 후 회수하였다 (무시해도 좋을 만한 희석 효과).
분석
RPC
에 의한
PRAME
함량
PD1/3-Prame-His 함량을 UV 검출기에 결합된 역상 고성능 액체 크로마토그래피 시스템을 사용하여 측정하였다. 표준 및 샘플을 나트륨 도데실 설페이트 용액중에 전처리 하기 전에 적합한 버퍼중에 희석시켰다.
PD1/3-Prame-His의 검출을 214nm에서 수행하였다. 교정 곡선을 공지된 단백질 농도의 PD1/3-Prame-His 참조 표준으로 제조하였다. 표준 용액의 농도에 따라 PD1/3-Prame-His 피크 영역을 플롯팅한 후, PD1/3-Prame-His 함량을 선형회귀식으로 추론하였다.
모든 샘플중에 측정된 Prame 함량은 모든 샘플에서 일관되었다. 보레이트 버퍼중의 샘플과 다양한 mer의 CpG 또는 PLG를 함유하는 샘플 사이에 Prame 함량의 현저한 차이는 관찰되지 않았다.
RP
-
HPLC
에 의한
사르코실
함량
잔여 LS 함량의 측정은 LS가 잘 제거되었는지를 확실히 하기 위해, 투석 후 수행하였다.
재료 & 방법:
LS
함량은
RP
-
HPLC
기법에 의해 측정하였다.
- 칼럼: 워터스 선파이어 C18 5㎛ (4.6 x 100mm 칼럼)
- UV 검출기 (214nm)
- 유속: 1ml/min
- 온도: 40℃
- 용출 그래디언트:
ㆍ 용매 A: 95% 아세토니트릴 - 5% H20 - 0.1% TFA
ㆍ 용매 B: 5% 아세토니트릴 - 95% H20 - 0.1% TFA
상 | 시간 ( min ) | %A |
평형 | 0 | 50 |
그래디언트 | 1.4 | 100 |
단계 | 5.6 | 100 |
그래디언트 | 5.9 | 50 |
단계 | 9.9 | 50 |
결과
샘플 | LS 함량 |
A | 268.0 |
B | 267.5 |
C | 4.0 |
D | 5.0 |
E | 1.9 |
F | 3.0 |
G | <0.5 |
H | <0.5 |
I | 2.4 |
J | <0.5 |
K | 2.8 |
본 발명자들은 투석된 샘플에 대해서 LS가 효과적으로 제거된 것으로 결론지었다 (C 내지 K): 측정된 모든 LS 농도는 <0.5㎍/ml 내지 5.0㎍/ml의 범위였다.
IEX
에 의한
CpG
및
PLG
함량
모든 샘플중의 CpG 및 PLG의 양은 참조 표준으로서 상동성 물질을 이용하여 HPLC에 의해 계산하였다. 다중음이온은 의도된 바와 같이 100㎍/ml에 근접한 농도로 존재함이 하기 표에서 입증되었다.
PLG 함량 | 정용여과 | 샘플 | PLG 24mer (㎍/mL) |
스파이크 100㎍ PLG 24 mer 스파이크 100㎍ PLG 24 mer |
버퍼 + CpG 버퍼 단독 |
G K |
105 105 |
CpG 함량 | 정용여과 | 샘플 | CpG ㎍/mL |
스파이크 100㎍ CpG 15 mer 스파이크 100㎍ CpG 15 mer |
버퍼 + CpG 버퍼 단독 |
D H |
98 100 |
스파이크 100㎍ CpG 24 mer 스파이크 100㎍ CpG 24 mer |
버퍼 + CpG 버퍼 단독 |
E I |
99 95 |
스파이크 100㎍ CpG 30 mer 스파이크 100㎍ CpG 30 mer |
버퍼 + CpG 버퍼 단독 |
F J |
108 107 |
동적 광 산란에 의한 크기
도 21/21는 CpG-15mer, CpG 24-mers, CpG 30-mers 및 PLG의 존재하에 항원 크기가 제어됨을 입증하였다. CpG는 PLG 보다 항원 크기 안정도에 대해 매우 약간 더 양호한 영향을 끼치는 것으로 보인다 (농도 증대 고려).
SEQUENCE LISTING
<110> GlaxoSmithKline
<120> PRAME purification
<130> VB64710FF
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Immunostimulant
<400> 1
tccatgacgt tcctgacgtt 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Immunostimulatory oligonucleotide
<400> 2
tctcccagcg tgcgccat 18
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Immunostimulatory oligonucleotide
<400> 3
accgatgacg tcgccggtga cggcaccacg 30
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Immunostimulatory oligonucleotide
<400> 4
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Immunostimulatory oligonucleotide
<400> 5
tccatgacgt tcctgatgct 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Immunostimulatory oligonucleotide
<400> 6
tcgacgtttt cggcgcgcgc cg 22
<210> 7
<211> 509
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Met Glu Arg Arg Arg Leu Trp Gly Ser Ile Gln Ser Arg Tyr Ile Ser
1 5 10 15
Met Ser Val Trp Thr Ser Pro Arg Arg Leu Val Glu Leu Ala Gly Gln
20 25 30
Ser Leu Leu Lys Asp Glu Ala Leu Ala Ile Ala Ala Leu Glu Leu Leu
35 40 45
Pro Arg Glu Leu Phe Pro Pro Leu Phe Met Ala Ala Phe Asp Gly Arg
50 55 60
His Ser Gln Thr Leu Lys Ala Met Val Gln Ala Trp Pro Phe Thr Cys
65 70 75 80
Leu Pro Leu Gly Val Leu Met Lys Gly Gln His Leu His Leu Glu Thr
85 90 95
Phe Lys Ala Val Leu Asp Gly Leu Asp Val Leu Leu Ala Gln Glu Val
100 105 110
Arg Pro Arg Arg Trp Lys Leu Gln Val Leu Asp Leu Arg Lys Asn Ser
115 120 125
His Gln Asp Phe Trp Thr Val Trp Ser Gly Asn Arg Ala Ser Leu Tyr
130 135 140
Ser Phe Pro Glu Pro Glu Ala Ala Gln Pro Met Thr Lys Lys Arg Lys
145 150 155 160
Val Asp Gly Leu Ser Thr Glu Ala Glu Gln Pro Phe Ile Pro Val Glu
165 170 175
Val Leu Val Asp Leu Phe Leu Lys Glu Gly Ala Cys Asp Glu Leu Phe
180 185 190
Ser Tyr Leu Ile Glu Lys Val Lys Arg Lys Lys Asn Val Leu Arg Leu
195 200 205
Cys Cys Lys Lys Leu Lys Ile Phe Ala Met Pro Met Gln Asp Ile Lys
210 215 220
Met Ile Leu Lys Met Val Gln Leu Asp Ser Ile Glu Asp Leu Glu Val
225 230 235 240
Thr Cys Thr Trp Lys Leu Pro Thr Leu Ala Lys Phe Ser Pro Tyr Leu
245 250 255
Gly Gln Met Ile Asn Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ser His Ile His Ala
260 265 270
Ser Ser Tyr Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu Gln Tyr Ile Ala Gln Phe
275 280 285
Thr Ser Gln Phe Leu Ser Leu Gln Cys Leu Gln Ala Leu Tyr Val Asp
290 295 300
Ser Leu Phe Phe Leu Arg Gly Arg Leu Asp Gln Leu Leu Arg His Val
305 310 315 320
Met Asn Pro Leu Glu Thr Leu Ser Ile Thr Asn Cys Arg Leu Ser Glu
325 330 335
Gly Asp Val Met His Leu Ser Gln Ser Pro Ser Val Ser Gln Leu Ser
340 345 350
Val Leu Ser Leu Ser Gly Val Met Leu Thr Asp Val Ser Pro Glu Pro
355 360 365
Leu Gln Ala Leu Leu Glu Arg Ala Ser Ala Thr Leu Gln Asp Leu Val
370 375 380
Phe Asp Glu Cys Gly Ile Thr Asp Asp Gln Leu Leu Ala Leu Leu Pro
385 390 395 400
Ser Leu Ser His Cys Ser Gln Leu Thr Thr Leu Ser Phe Tyr Gly Asn
405 410 415
Ser Ile Ser Ile Ser Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly
420 425 430
Leu Ser Asn Leu Thr His Val Leu Tyr Pro Val Pro Leu Glu Ser Tyr
435 440 445
Glu Asp Ile His Gly Thr Leu His Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Leu His
450 455 460
Ala Arg Leu Arg Glu Leu Leu Cys Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met Val
465 470 475 480
Trp Leu Ser Ala Asn Pro Cys Pro His Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr
485 490 495
Asp Pro Glu Pro Ile Leu Cys Pro Cys Phe Met Pro Asn
500 505
<210> 8
<211> 626
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Met Asp Pro Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys
1 5 10 15
Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro
20 25 30
Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp
35 40 45
Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val
50 55 60
Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe
65 70 75 80
Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Met
100 105 110
Glu Arg Arg Arg Leu Trp Gly Ser Ile Gln Ser Arg Tyr Ile Ser Met
115 120 125
Ser Val Trp Thr Ser Pro Arg Arg Leu Val Glu Leu Ala Gly Gln Ser
130 135 140
Leu Leu Lys Asp Glu Ala Leu Ala Ile Ala Ala Leu Glu Leu Leu Pro
145 150 155 160
Arg Glu Leu Phe Pro Pro Leu Phe Met Ala Ala Phe Asp Gly Arg His
165 170 175
Ser Gln Thr Leu Lys Ala Met Val Gln Ala Trp Pro Phe Thr Cys Leu
180 185 190
Pro Leu Gly Val Leu Met Lys Gly Gln His Leu His Leu Glu Thr Phe
195 200 205
Lys Ala Val Leu Asp Gly Leu Asp Val Leu Leu Ala Gln Glu Val Arg
210 215 220
Pro Arg Arg Trp Lys Leu Gln Val Leu Asp Leu Arg Lys Asn Ser His
225 230 235 240
Gln Asp Phe Trp Thr Val Trp Ser Gly Asn Arg Ala Ser Leu Tyr Ser
245 250 255
Phe Pro Glu Pro Glu Ala Ala Gln Pro Met Thr Lys Lys Arg Lys Val
260 265 270
Asp Gly Leu Ser Thr Glu Ala Glu Gln Pro Phe Ile Pro Val Glu Val
275 280 285
Leu Val Asp Leu Phe Leu Lys Glu Gly Ala Cys Asp Glu Leu Phe Ser
290 295 300
Tyr Leu Ile Glu Lys Val Lys Arg Lys Lys Asn Val Leu Arg Leu Cys
305 310 315 320
Cys Lys Lys Leu Lys Ile Phe Ala Met Pro Met Gln Asp Ile Lys Met
325 330 335
Ile Leu Lys Met Val Gln Leu Asp Ser Ile Glu Asp Leu Glu Val Thr
340 345 350
Cys Thr Trp Lys Leu Pro Thr Leu Ala Lys Phe Ser Pro Tyr Leu Gly
355 360 365
Gln Met Ile Asn Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ser His Ile His Ala Ser
370 375 380
Ser Tyr Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu Gln Tyr Ile Ala Gln Phe Thr
385 390 395 400
Ser Gln Phe Leu Ser Leu Gln Cys Leu Gln Ala Leu Tyr Val Asp Ser
405 410 415
Leu Phe Phe Leu Arg Gly Arg Leu Asp Gln Leu Leu Arg His Val Met
420 425 430
Asn Pro Leu Glu Thr Leu Ser Ile Thr Asn Cys Arg Leu Ser Glu Gly
435 440 445
Asp Val Met His Leu Ser Gln Ser Pro Ser Val Ser Gln Leu Ser Val
450 455 460
Leu Ser Leu Ser Gly Val Met Leu Thr Asp Val Ser Pro Glu Pro Leu
465 470 475 480
Gln Ala Leu Leu Glu Arg Ala Ser Ala Thr Leu Gln Asp Leu Val Phe
485 490 495
Asp Glu Cys Gly Ile Thr Asp Asp Gln Leu Leu Ala Leu Leu Pro Ser
500 505 510
Leu Ser His Cys Ser Gln Leu Thr Thr Leu Ser Phe Tyr Gly Asn Ser
515 520 525
Ile Ser Ile Ser Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu
530 535 540
Ser Asn Leu Thr His Val Leu Tyr Pro Val Pro Leu Glu Ser Tyr Glu
545 550 555 560
Asp Ile His Gly Thr Leu His Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Leu His Ala
565 570 575
Arg Leu Arg Glu Leu Leu Cys Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met Val Trp
580 585 590
Leu Ser Ala Asn Pro Cys Pro His Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr Asp
595 600 605
Pro Glu Pro Ile Leu Cys Pro Cys Phe Met Pro Asn His His His His
610 615 620
His His
625
<210> 9
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Immunostimulatory oligonucleotide
<400> 9
tcgtcgtttt gtcgt 15
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Immunostimulatory oligonucleotide
<400> 10
Tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtttcgtcg 30
Claims (28)
- 희석제 A로부터 희석제 B로의 희석제 교환 동안 단백질 응집을 저하시키는 방법으로서,
(i) 교환 전에 또는 교환과 동시에 다중음이온 화합물을 희석제 A에 첨가하고;
(ⅱ) 단백질을 희석제 A로부터 희석제 B로 교환하는 것을 포함하며,
단백질이 PRAME인 방법. - 희석제 A로부터 희석제 B로의 희석제 교환 동안 단백질 응집을 저하시키기 위한 다중음이온 조성물의 용도로서, 단백질이 PRAME인 용도.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 다중음이온 화합물이 희석제 교환 전에 첨가되는 방법 또는 용도.
- 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 희석제 A가 세정제를 포함하는 방법 또는 용도.
- 제 4항에 있어서, 세정제가 음이온 세정제인 방법 또는 용도.
- 제 5항에 있어서, 세정제가 SDS, 소듐 도쿠세이트 및 라우릴 사르코실로 구성된 군으로부터 선택되는 방법 또는 용도.
- 제 1항 내지 제 6항 중의 어느 한 항에 있어서, 희석제 B가 세정제를 실질적으로 비함유하는 방법 또는 용도.
- 제 1항 내지 제 7항 중의 어느 한 항에 있어서, 희석제 B가 pH9.8에서 5.0mM 보레이트, 수크로오스 3.15% w/v를 포함하는 방법 또는 용도.
- 제 1항 내지 제 8항 중의 어느 한 항에 있어서, 단백질이 His-tag를 포함하는 방법 또는 용도.
- 제 1항 내지 제 9항 중의 어느 한 항에 있어서, 다중음이온 화합물이 8이상의 순 네거티브 전하를 갖는 방법 또는 용도.
- 제 1항 내지 제 10항 중의 어느 한 항에 있어서, 다중음이온 화합물이 올리고누클레오티드인 방법 또는 용도.
- 제 11항에 있어서, 올리고누클레오티드가 5 내지 200개 누클레오티드 길이인 방법 또는 용도.
- 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 올리고누클레오티드가 CpG를 포함하는 방법 또는 용도.
- 제 1항 내지 제 14항 중의 어느 한 항에 있어서, 희석제 교환이 투석 또는 정용여과에 의해 달성되는 방법 또는 용도.
- 제 1항 내지 제 15항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 단백질을 희석제 C로 제형화하는 단계 (ⅲ)를 추가로 포함하는 방법 또는 용도.
- 제 16항에 있어서, 희석제 C가 트리스, 수크로오스, 보레이트, 폴록사머 및 CpG를 포함하는 방법 또는 용도.
- 제 16항 또는 제 17항의 방법에 의해 생성된 바와 같은 PRAME을 포함하는 조성물.
- PRAME 및 올리고누클레오티드를 포함하는 조성물로서, PRAME의 입도가 10-30nm인 조성물.
- 제 19항에 있어서, PRAME의 입도가 15-25nm인 조성물.
- 제 19항 또는 제 20항에 있어서, 입도가 동적 광 산란에 의해 측정되는 조성물.
- 약제학적으로 허용되는 PRAME 조성물을 생성하는 방법으로서,
(a) 제 1항, 및 제 3항 내지 제 13항 중의 어느 한 항에 따른 방법에 따라 희석제 교환을 수행하는 단계; 및
(b) 단계 (a)에서 생성된 제형을 멸균하는 단계를 포함하는 방법. - 제 22항에 있어서, 단백질을 희석제 C로 제형화하는 추가적 단계 (b')를 단계 (b) 전에 포함하는 방법.
- 제 22항 또는 제 23항에 있어서, 단계 (b)에서 생성된 제형을 동결건조하는 추가적 단계 (c)를 포함하는 방법.
- 제 22항 내지 제 24항 중의 어느 한 항에 있어서, 멸균이 여과에 의해 달성되는 방법.
- 약제학적으로 허용되는 PRAME 조성물을 생성하는 공정으로서,
(a) 희석제 A로부터 희석제 B로 PRAME의 희석제 교환을 수행하는 단계; 및
(b) PRAME을 포함하는 희석제 B를 수득하는 단계를 포함하며,
다중음이온성 화합물이 희석제 교환 전에 또는 교환 동안 희석제 A 또는 희석제 B에 첨가되는 공정. - 제 26항에 있어서,
(i) PRAME을 포함하는 희석제 B를 멸균하고;
(ⅱ) 첫 번째로 PRAME을 포함하는 희석제 B를 PRAME을 포함하는 희석제 C로 제형화하고, 두 번째로 PRAME을 포함하는 희석제 C를 멸균하는 것으로 구성된 군으로부터 선택된 추가적 단계 (c)를 포함하는 공정. - 제 26항 또는 제 27항에 있어서, PRAME 조성물을 동결건조하는 추가적 단계를 포함하는 방법.
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