KR20140049502A

KR20140049502A - 인조 오일 바디

Info

Publication number: KR20140049502A
Application number: KR1020137023460A
Authority: KR
Inventors: 라젠드라나다 차크라파니 위제순데라; 쯔핑 쉔; 토마스 보이트오; 싱칭 슈; 리프 룬딘
Original assignee: 코몬웰스 싸이언티픽 엔드 인더스트리얼 리서치 오가니제이션
Priority date: 2011-02-07
Filing date: 2012-02-07
Publication date: 2014-04-25
Also published as: NZ613916A; US20140024714A1; BR112013020001A2; AU2012214094A1; EP2672953A4; CA2826629A1; EP2672953A1; JP6121913B2; CN103547252A; US20170000149A1; JP2014505697A; CN103547252B; AU2012214094B2; WO2012106751A1

Abstract

본 발명은 올레오신(현재 규정된 것으로서는 올레오신, 스테로레오신 및 폴리올레신을 포함하는 것임), 인지질을 포함하는 계면활성제, 및 4개 또는 그 이상의 이중결합을 갖는 다중불포화 지방산과 같은 지방산을 포함하는 오일을 포함하는 인조 오일 바디에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 인조 오일 바디의 제조방법에 관한 것이다. 이러한 AOB들은 추가로 다른 분자, 예컨대 광범위한 제품에 사용되는 생리활성 분자를 추가로 보함하며, 특히 첨가된 항산화제의 부재시 산화적으로 안정한 수중유적형 에멀젼을 제조하는데 유용하다. 본 발명은 또한 식물 추출물로부터의 올레오신의 부분 정제를 위한 방법을 추가로 포함한다.

Description

인조 오일 바디{ARTIFICIAL OIL BODIES}

본 발명은 지방산을 포함하는 인조 오일 바디, 상기 인조 오일 바디들의 제조 방법들에 관한 것이다. 인조 오일 바디들은 매우 다양한 제품들에 사용될 수 있으며, 특히 항산화제들의 부재시에 산화적으로 안정적인 수중유적형 에멀젼을 제조하는데 유용하다.

지방은 높은 칼로리 함량을 가지며, 인간 식이 에너지 섭취에 주로 기여한다. 포화 지방 및 트랜스 지방과 같은 지방의 특정 타입들은 심혈관 질병을 포함하는 다양한 질병 질환들에 연루되어 왔다. 그러나, 지방은 또한 인간 건강 및 영양에 긍정적인 역할도 하며, 국제 식이 가이드라인들은 ‘좋은 지방(good fats)’이라면, 지방으로부터 유도되는 식이 에너지의 특정 비율을 허용한다. ‘좋은 지방’은 단일불포화 및 다중불포화 오일들이며, 식품에 있어서 포화 지방을 건강에 좋은 불포화 오일들로 대체하는데 관심이 높아지고 있다. 그리고, 근래 수년동안, 특정 그룹의 다중불포화 오일들, 즉 장쇄 오메가-3 오일들이 그들에 의해 기인했던 심혈관 질병들을 예방하는 것을 포함하여 건강에 많은 유익한 점들로 인해 매우 주목받고 있다. 오메가-3 오일들의 건강에 유익한 점의 증가하는 목록에서 시작하여, 전세계의 식품 산업은 오메가-3 오일들이 강화된 식품들을 제조하는데 매진하고 있다.

오메가-3 강화 식품들, 및 고도 불포화 오일을 함유하는 유사 건강식품들의 확장에 주요 장애물들 중 하나는 저장하는 동안 상기 오일들이 산화적으로 변패하기 매우 쉽다는 점이다. 산화에 의해, 매우 바람직하지 않은 풍미 특성들을 가질 수 있는 몇몇 제품들이 제조되어, 제품의 기호성 및 저장수명을 감소시킨다. 그러므로, 상기 오일들을 산화로부터 적당하게 보호하는 것이 중요하다. 식품의 고도 불포화 오일들의 산화를 조절하기 위한 전략으로서 항-산화제들 첨가 및 마이크로캡슐화가 성공적으로 사용되어 왔던 반면, 이들 기술들은 비용, 자연도, 및 일반적인 적용성에 관한 여러 단점들을 가진다.

식물의 오일 및 오일시드는 이들이 존재하는 식물 종들과 무관한 구조와 유사한 오일 바디들(OB)로 언급되는 별도의 부착물의 형태이다. 천연 OB들의 두드러진 특징은 세포들 및 분리된 제조물들 내부 모두 이례적으로 우수한 물리적 안정성이다. 두 상황 모두에서, OB는 각 성분들로서 발생하며, 저장을 연장한 후에도 다른 하나에 대해 압착할 때 응집 또는 합체되지 않으며; 생체내에서는 건조에 기인하고, 및 생체외에서는 부유 원심분리에 기인한다(Tzen and Huang, 1992). OB의 우수한 물리적 안정성은 오일 바디 표면에서 발생하는 올레오신이라고 불리우는 독특한 양친매성 단백질들의 덕분으로 본다(Huang, 1994). 오일 바디의 전체 표면은 올레오신으로 덮여 있어서, 압착된 OB들은 성숙 종자의 세포들내에서 합쳐지거나 응집되지 않는다고 제시되어 왔다(Tzen and Huang, 1992). 올레오신의 함량은 전체 오일 바디들의 1-4%이며; OB들이 가장 작은 종, 예를 들면 평지/카놀라에서 가장 많은 양이 발생한다(Huang, 1992; Tzen, 1993).

양호한 물리적 안정성에 더해, 오일 시드내 OB들은 산화에 대하여 자연적으로 보호된다. 최근의 연구에서 이 산화안정성이 수분산물 오일 바디 분리물들로 확장됨이 알려졌다. Fisk와 그의 동료들(2008)은 해바라기 씨로부터 추출되어, 연속 수상내에 분산된 고유의 OB들은 해바라기 오일 및 유화제로부터 제조된 균등한 에멀젼들보다 산화에 대하여 더욱 내성을 가짐을 보여줬다. 보다 최근, 고도 불포화 스테아리돈산을 함유하는 에치움 오일 바디 분리물에 대하여, 유사한 결과들이 얻어졌다(Gray et al, 2010). 유화제로서 Tween40을 사용하여 제조된 균등한 카놀라 수중유적형 에멀젼보다 우수한 고유 카놀라 OB들의 수성 분산액의 산화적 안정성이 보고되어 있다(Shen and Wijesundera, 2009).

OB들을 그들의 구성성분들로부터 재조립하기 위한 제한된 시도들이 있어왔다. Murphy 및 Cummins(1989)는 평지씨 오일 바디막 재료를 갖는 평지씨 오일 또는 정제된 트리올레인으로부터 추출된 TAG를 배양함으로써, 천연 오일 바디들과 유사한 치수의 오일 안정성 소적들의 외관이 얻어짐을 보고하였다. 이후, Tzen 및 Huang(1992)은 트리올레인과 트리리놀레인의 TAG 혼합물(1:2몰량)을 밀, 벼, 평지, 대두 또는 호호바로부터 분리된 디올레오일 포스파티딜콜린 및 올레오신과 조합하여, 물리적으로 안정적인 인조 (재구성) 오일 바디들(AOBs)을 성공적으로 제조하였다. 그러나, 상기 인조 OB의 산화안정성은 조사된 것으로 보이지 않는다.

첨가물 산화방지제를 사용하는데 의존하지 않는, 산화로부터 지방산들을 보호하는 수단이 필요하다.

본 발명은 인조 오일 바디를 제공하는 것을 목적으로 한다.

4개 또는 그 이상의 이중결합들을 갖는 높은 수준의 다중불포화 지방산들을 함유하는 오일들, 예를 들면 ω3 지방산들이 풍부한 수산 오일은 오일씨와 같은, 식물에서 제조된 오일들과 화학적으로 구분된다. 그러나, 본 발명자들은 놀랍게도, 상업용 카놀라 밀과 같은 식물 밀로부터 추출된 올레오신이 ω3 지방산이 풍부한 수산 오일 및/또는 어유들과 같은 고도 다중불포화 오일들에 의해 인조 오일 바디들을 구조하는데 사용될 수 있음을 발견하였다. 본 발명자들은, 또한 놀랍게도 오일 바디들의 인지질 성분이 산화안정성에 역효과를 미치지 않으면서 광범위한 계면활성제들에 의해 치환될 수 있음을 발견하였다.

따라서, 한 측면에서, 본 발명은 3개 또는 그 이상의 이중결합들, 보다 바람직하게는 4개 또는 그 이상의 이중결합들을 갖는 다중불포화 지방산들을 포함하는 오일, 올레오신 및 계면활성제를 포함하는 인조 오일 바디를 제공한다.

한 구체예에서, 계면활성제는 인지질이다.

한 구체예에서, 다중불포화 지방산의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20% 또는 적어도 25%는 4개 또는 그 이상의 이중결합들을 가진다.

다른 측면에서, 본 발명은 지방산을 포함하는 오일, 계면활성제 및 올레오신을 포함하는 인조 오일 바디를 제공하며, 상기 계면활성제의 적어도 일부는 인지질이 아니다.

올레오신이 어느 공급원으로부터나 얻어질 수 있는 반면, 바람직한 구체예에서, 올레오신은 오일시드 올레오신이다.

오일은 어느 공급원으로부터나 얻어질 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 오일은 수산 오일 및/또는 어유이다.

추가의 구체예에서, 지방산의 적어도 50%, 적어도 75% 또는 적어도 90%는 글리세라이드의 형태로 되어 있다.

한 구체예에서, 인조 오일 바디의 건조중량중 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%는 오일이다.

본 발명의 오일 바디들은 캐리어로서 사용될 수도 있어서, 1개 또는 그 이상의 다른 분자들을 추가로 포함할 수 있다. 상기 다른 분자들의 예로는 생균제, 방부제, 치료제, 진단제, 전달제 또는 식품 풍미제가 포함되며, 여기에 제한되지는 않는다.

오일 바디의 크기는 올레오신에 대한 오일의 상대 농도를 조정함으로써 다양해질 수 있으며, 올레오신의 상대 양이 적어질수록 크기는 커진다. 한 구체예에서, 오일 바디는 약 0.1 내지 약 100㎛, 또는 적어도 약 0.5 내지 약 50㎛, 또는 적어도 약 0.5 내지 약 10㎛, 또는 적어도 약 0.5 내지 약 2㎛의 크기를 가진다.

추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 1개 또는 그 이상의 인조 오일 바디들 및 캐리어를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 구체예에서, 캐리어는 탈염수이다.

한 구체예에서, 조성물은 수중유적형 에멀젼이다. 특히, 본 발명의 수중유적형 에멀젼은 올레오신의 부재하에 Tween40과 같은 유화제로서 사용하여 제조된 지방산을 포함하는 수중유적형 에멀젼보다 산화에 대하여 보다 내성이 있다.

본 발명자들은 본 발명의 인조 오일 바디들이 산화에 대하여 일반적으로 내성을 갖는다는 사실을 발견하였다. 따라서, 한 구체예에서, 인조 오일 바디들 및/또는 조성물이 합성 항산화제를 포함하지 않는다. 그리고, 바람직한 구체예에서, 본 발명의 인조 오일 바디들은 산화적으로 안정적이다.

한 구체예에서, 인조 오일 바디는 올레오신, 계면활성제, 및 4개 또는 그 이상의 이중결합들을 갖는 다중불포화 지방산들과 같은 지방산들을 포함하는 오일로 구성된다.

치료제를 전달하는데 사용할 수 있는 것 외에도, 본 발명의 인조 오일 바디는 오일 바디들의 지방산, 특히 다중불포화 지방산들의 잘 알려진 잇점들로 인해 질병들을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 따라서, 추가의 측면에서, 본 발명은 지방산으로부터 유용되는, 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 1개 또는 그 이상의 오일 바디들 및/또는 본 발명의 조성물을 질환을 앓는 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.

또한, 지방산으로부터 유용되는, 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제를 제조하기 위해, 본 발명의 1개 또는 그 이상의 오일 바디들 및/또는 본 발명의 조성물을 사용하는 것이 제공된다.

그리고, 지방산으로부터 유용되는, 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제로서 본 발명의 1개 또는 그 이상의 오일 바디들 및/또는 본 발명의 조성물을 사용하는 것이 제공된다.

상기 방법 및 용도의 구체예에서, 질환은 4개 또는 그 이상의 이중결합들을 갖는 다중불포화 지방산들로부터 혜택을 얻는다.

오일 바디들은 매우 다양한 제품들에 사용될 수 있다. 따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 1개 또는 그 이상의 인조 오일 바디들 및/또는 조성물을 포함하는 제품을 제공한다. 상기 제품들의 예로는 식품 또는 사료제품, 음료제품, 개인생활용품, 약품 또는 공산품이 포함되며, 여기에 제한되지 않는다.

바람직한 구체예에서, 제품은 수중유적형 에멀젼이거나, 또는 수중유적형 에멀젼을 포함한다.

또한, 제품 제조에 사용하는 본 발명의 1개 또는 그 이상의 인조 오일 바디들 및/또는 본 발명의 조성물의 용도도 제공된다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 사료, 식품 또는 음료품을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 1개 또는 그 이상의 인조 오일 바디들 및/또는 본 발명의 조성물을 1개 또는 그 이상의 다른 식용성분들과 혼합하는 단계를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 인조 오일 바디들의 제조방법을 제공하며, 상기 방법은:

ⅰ) 4개 또는 그 이상의 이중결합들을 갖는 다중불포화 지방산들을 포함하는 오일, 계면활성제 및 올레오신을 얻는 단계, 및

ⅱ) 상기 올레오신, 계면활성제 및 오일을 혼합하여, 인조 오일 바디를 제조하는 단계를 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 인조 오일 바디를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은:

ⅰ) 올레오신, 계면활성제, 및 지방산을 포함하는 오일을 얻는 단계(상기 계면활성제의 적어도 일부는 인지질이 아님), 및

한 구체예에서, 계면활성제는 올레오신 혼합전에 오일내에 혼합 및 용해된다.

또 다른 구체예에서, 상기 방법은,

ⅲ) 인조 오일 바디들을 선택하는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명자들은 본 발명의 인조 오일 바디들에 사용하기 위한 올레오신을 얻는 방법들을 확인했다. 본 발명자들은 특히, 놀랍게도 비교적 낮은 함량의 올레오신(예를 들면, 총 단백질의 약 10%)을 갖는 매우 불균일한 단백질군들을 포함하는 단백질 추출물이 사용될 수 있음을 발견하였으며, 오일, 계면활성제 및 올레오신의 천연 친화도는 외견상으로는, 인조 오일 바디들을 형성하는데 매우 유효하다. 이는 특히, 대규모 정제과정들을 진행할 필요가 없게 되고, 비교적 저렴한 올레오신 공급원을 제공하기 때문에, 유리하다. 따라서, 또 다른 구체예에서, 단계 ⅰ)는:

a) 올레오신을 포함하는 식물 추출물을 얻는 단계, 및

b) 상기 추출물로부터 단백질을 적어도 부분 정제하는 단계(여기에서, 상기 단백질은 올레오신을 포함함)를 포함한다.

바람직하게는, 단계 b)는:

1) 상기 추출물의 pH를 적어도 약 11.5의 pH로 조정하는 단계,

2) 1)을 분리하여, 고체 및 액체 상을 생성하고, 액체 상을 선별하는 단계,

3) 상기 액체 상의 pH를 감소시켜, 단백질을 침전시키는 단계,

4) 3)을 분리하여, 고체 및 액체 상을 생성하고, 고체 상을 선별하는 단계, 및

5) 고체 상을 캐리어내에 분산시키는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 제조된 인공 오일 바디를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 식물 추출물로부터 올레오신을 부분 정제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은:

1) 상기 추출물의 pH를 적어도 약 11.5의 pH로 조정하는 단계,

3) 상기 액체 상의 pH를 감소시켜, 상기 단백질을 침전시키는 단계,

5) 상기 고체 상을 캐리어 내에 분산시키는 단계를 포함한다.

한 구체예에서, 단계 3)은 액체 상의 pH를 약 7 미만으로, 약 pH 4 내지 약 7로, 또는 약 pH 5.5 내지 약 7로 감소시키는 단계를 포함한다.

바람직하게는, 상기 두 측면의 방법은 유기 용매를 사용하지 않는다.

추출물은 식물 밀과 같은 식물로부터 추출될 수 있다. 그러나, 바람직한 구체예에서, 식물은 오일시드이다.

본 발명자들은 또한, 오일시드의 시드들과 같은, 식물 재료로부터 오일들을 추출함으로써 얻은 밀이 올레오신의 공급원으로서 사용될 수 있음을 발견하였다. 본 발명의 청구된 은전으로서, 올레오신을 부분 정제한 후, 남은 식물 추출물이 동물 사료로서 사용될 수 있다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 추출물은 오일 추출 후 생성된 밀이다.

본 발명은 또한, 본 발명의 방법에 의해 제조된 적어도 부분정제된 올레오신을 제공한다.

본 명세서의 어느 구체예든, 특별히 다르게 지시하지 않는한, 다른 구체예에 필요한 부분만 약간 수정하여 적용될 수 있다.

본 발명은 본 명세서에 설명된 특정 구체예에 의해 국한되지 않으며, 이는 예시의 목적으로만 간주된다. 기능적으로-균등한 생성물들, 조성물들, 및 방법들은 본 명세서에 설명된 바와 같이, 본 발명의 범주내에서 분명하다.

본 명세서 전반적으로, 특별히 다르게 지시하지 않는한, 또는 문맥이 다르게 요구하지 않는한, 단일 단계, 물질의 조성물, 단계의 그룹, 또는 물질의 조성물의 그룹에 대한 참고는 상기 단계들 중 1개 또는 복수(즉, 1개 또는 그 이상)의 단계, 물질의 조성물, 단계들의 그룹 또는 물질의 조성물의 그룹을 포함하는 것으로 여겨진다.

본 발명은 이하에, 첨부된 도면을 참조하여 비-제한적인 실시예들을 통해설명된다.

도 1: 카놀라 밀로부터 올레오신을 추출하기 위한 과정.
도 2: 카놀라 밀로부터의 올레오신 추출물의 전기영동 분석.
도 3: 카놀라 밀로부터의 올레오신 회수물에 추출 배지의 pH가 미치는 효과.
도 4: 다른 pH 값들에서 추출된 올레오신의 전기영동 분석. 레인 2 및 3 - pH 10.5; 레인 4 및 5 - pH 11.0; 레인 6 및 7 - pH 11.5; 레인 8 및 9 - pH 12.0.
도 5: 자가 산화가 촉진되는(60℃) Tween 40 및 올레오신 에멀젼에 대하여, D[3.2] 및 d(0.5)의 입자 크기(㎛) 변화. 중복 측정으로부터 평균 데이터.
도 6: 인조 참치 오일 바디의 표면단백질의 전기영동 분석. 레인들: M - 마커, 미가공 pH12 - 카놀라 밀로부터의 pH12 가용성 조단백질 추출물, CP1 - 카놀라 오일 및 재용해된 pH 6.5-침전된 카놀라 밀 단백질로부터 제조된 인조 카놀라 오일 바디들로부터 추출된 단백질, CP1+PL-카놀라 오일, 재용해된 pH 6.5-침전된 카놀라 밀 단백질 및 인지질로부터 제조된 인조 카놀라 오일 바디들로부터 추출된 단백질.
도 7: 각각 Tween40 및 올레오신 추출물에 의해 제조된 참치 오일의 촉진된 산화반응동안 트랜스,트랜스,2,4,헵타디에날의 발달. 중복 측정들로부터의 평균 데이터. 7A - 60℃에서 산화; 7B - 40℃에서 산화.
도 8: 60℃에서 저장하는 동안, Tween40 및 올레오신 추출물(각각)로 제조된 참치 오일 에멀젼에서 EPA 및 DHA의 결실. 중복 측정들로부터의 평균 데이터. 8A - 60℃에서 산화; 8B - 40℃에서 산화.
도 9: 40℃에서 산화반응이 촉진되는 균등 Tween40 에멀젼 및 참치오일 인조 오일 바디 에멀젼으로부터 추출된 오일들의 퍼옥사이드 값(PV).
도 10: 올레오신, Isolexx 및 소듐 카제이네이트 각각에 의해 안정화된 참치 오일 에멀젼의 촉진된 저장(40℃, 공기)중 트랜스,트랜스,2,4-헵타디에날의 발달.
도 11: 2차 계면활성제로서 모노아실글리세롤(MAG)과 조합한 올레오신, Tween40(Tween) 및 소듐 스테아로일 락틸레이트(SSL)를 사용하여 제조된 참치 오일 에멀젼의 촉진된 저장(40℃, 공기)중 트랜스, 트랜스, 2,4-헵타디에날의 발달.
서열목록에 대한 요지
서열 번호() 1: 브라시카 나푸스 올레오신 (Brassica napus oleosin) (CAA57545.1)
서열 번호 2: 브라시카 나푸스 올레오신 (Brassica napus oleosin) S1-1 (ACG69504.1)
서열 번호 3: 브라시카 나푸스 올레오신 (Brassica napus oleosin) S2-1 (ACG69503.1)
서열 번호 4: 브라시카 나푸스 올레오신 (Brassica napus oleosin) S3-1 (ACG69513.1)
서열 번호 5: 브라시카 나푸스 올레오신 (Brassica napus oleosin) S4-1 (ACG69507.1)
서열 번호 6: 브라시카 나푸스 올레오신 (Brassica napus oleosin) S5-1 (ACG69511.1)
서열 번호 7: 아라키스 하이포개아 올레오신 (Arachis hypogaea oleosin) 1 (AAZ20276.1)
서열 번호 8: 아라키스 하이포개아 올레오신 (Arachis hypogaea oleosin) 2 (AAU21500.1)
서열 번호 9: 아라키스 하이포개아 올레오신 (Arachis hypogaea oleosin) 3 (AAU21501.1)
서열 번호 10: 아라키스 하이포개아 올레오신 (Arachis hypogaea oleosin) 5 (ABC96763.1)
서열 번호 11: 리시누스 콤뮤니스 올레오신 (Ricinus communis oleosin) 1 (EEF40948.1)
서열 번호 12: 리시누스 콤뮤니스 올레오신 (Ricinus communis oleosin) 2 (EEF51616.1)
서열 번호 13: 글리신 맥스 올레오신 이소폼 (Glycine max oleosin isoform) a (P29530.2)
서열 번호 14: 글리신 맥스 올레오신 이소폼 (Glycine max oleosin isoform) b (P29531.1)
서열 번호 15: 리눔 우시타티스시뮴 올레오신 (Linum usitatissimum oleosin) 저분자량 이소폼 (ABB01622.1)
서열 번호 16: 리눔 우시타티스시뮴 올레오신 (Linum usitatissimum oleosin) 고분자량 이소폼 (ABB01624.1)
서열 번호 17: 헬리안투스 안누우스 올레오신 (Helianthus annuus oleosin) (CAA44224.1)
서열 번호 18: 제아 메이스 올레오신 (Zea mays oleosin) (NP_001105338.1)
서열 번호 19: 브라시카 나푸스 스테롤레오신 (Brassica napus steroleosin) (ABM30178.1)
서열 번호 20: 브라시카 나푸스 스테롤레오신 (Brassica napus steroleosin) SLO1-1 (ACG69522.1)
서열 번호 21: 브라시카 나푸스 스테롤레오신 (Brassica napus steroleosin) SLO2-1 (ACG69525.1)
서열 번호 22: 세사뮴 인디쿰 스테롤레오신 (Sesamum indicum steroleosin) (AAL13315.1)
서열 번호 23: 제아 메이스 스테롤레오신 (Zea mays steroleosin) (NP_001152614.1)
서열 번호 24: 브라시카 나푸스 칼레오신 (Brassica napus caleosin) CLO-1 (ACG69529.1)
서열 번호 25: 브라시카 나푸스 칼레오신 (Brassica napus caleosin) CLO-3 (ACG69527.1)
서열 번호 26: 세사뮴 인디쿰 칼레오신 (Sesamum indicum caleosin) (AAF13743.1)
서열 번호 27: 제아 메이스 칼레오신 (Zea mays caleosin) (NP_001151906.1)

일반적인 기술 및 정의들

특별히 다르게 지시하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술용어 및 과학용어들은 당 분야(예를 들면, 액체 화학, 분자 유전학, 화학 및 생화학)에 통상의 기술을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가지는 것으로 간주된다.

다르게 지시되지 않는 한, 본 발명에 사용된 재조합 단백질, 세포 배양액 및 면역학 기술은 당 분야에 통상의 기술을 가진 자들에게 잘 알려진 표준 기술들이다. 상기 기술들은 J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), and F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, 현재까지의 모든 업데이트들을 포함)와 같은 참고문헌을 통해 기술 및 설명되어 있다.

“및/또는”, 예를 들면 “X 및/또는 Y”라는 용어는 “X 및 Y” 또는 “X 또는 Y”를 의미하는 것으로 이해되어야 하며, 두 의미 또는 그 중 한 의미에 대하여 분명한 지지를 제공하는 것으로 간주되어야 한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 반대로 기술하지 않는한, ‘약’이라는 용어는 지정된 값의 +/- 20%, 보다 바람직하게는 +/- 10%, 보다 더 바람직하게는, +/- 5%를 의미한다.

본 명세서 전체에 걸쳐, “포함하는”이라는 용어, 또는 “포함한다” 또는 “포함하는”과 같은 변형어들은 설명된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계들의 그룹을 포함하고, 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계들의 그룹은 배제하지 않음을 의미하는 것으로 이해될 것이다.

오일 및 지방산

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 “지방산”은 포화 또는 불포화인, 길이가 적어도 8개의 탄소원자들의 긴 지방족 꼬리를 갖는 카르복시산을 의미한다. 전형적으로, 지방산은 길이가 적어도 12개의 탄소들의 탄소-탄소 결합된 사슬을 가진다. 가장 자연적으로 발생하는 지방산들은, 이들의 생합성이 2개의 탄소원자들을 갖는 아세테이트를 포함하기 때문에, 짝수개의 탄소원자들을 가진다. 지방산은 자유 상태(비-에스테르화), 또는 TAG, DAG, MAG, 아실-CoA(티오-에스테르) 결합의 일부와 같은 에스테르화 형태, 또는 다른 공유결합 형태일 수 있다. 에스테르화 형태로 공유결합되는 경우, 지방산은 본 명세서에서 “아실”기라고 한다. 포화 지방산은 어느 이중결합들도, 또는 사슬에 따른 다른 관능기들을 포함하지 않는다. 용어 “포화”는 모든 탄소들(카르복실산[-COOH]기 제외)이 가능한 많은 수소들을 함유한다는 점에서 수소를 의미한다. 즉, 오메가(ω) 말단은 3개의 수소들(CH3-)을 함유하며, 사슬내 각 탄소는 2개의 수소들(-CH2-)을 함유한다. 불포화 지방산은 1개 또는 그 이상의 알켄 관능기들이 사슬을 따라 존재하는 것 외에는, 포화 지방산과 유사한 형태를 가지며, 각 알켄은 사슬의 단일-결합된 “-CH2-CH2-” 부분을 이중-결합된 “-CH=CH-” 부분(즉, 다른 탄소에 이중결합된 탄소)으로 치환한다. 이중결합의 다른 쪽에 결합된 사슬내 2개의 다음 탄소원자들은 시스 또는 트랜스 배열로 발생할 수 있다. 이중결합외에, 지방산의 아실 사슬은 당 분야에 공지된 메틸 또는 에틸기, 하이드록실기 또는 다른 변형기들과 같은, 삼중결합의 아실 측부 사슬들을 가질 수 있다. 본 발명의 인조 오일 바디는 스테아르산, 팔미트산, 올레산, 리놀레산, α-리놀레산, 또는 둘 또는 그 이상의 이들의 조합과 같은 지방산을 포함하며, 이들에 제한되지 않는다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어들 “다중불포화 지방산” 또는 “PUFA”는 그의 탄소사슬내에 적어도 18개의 탄소원자들, 및 적어도 3개, 보다 바람직하게는 적어도 4개의 알켄기들(탄소-탄소 이중결합들)을 포함하는 지방산을 의미한다. 본 발명의 한 측면은 4개 또는 그 이상의 이중결합들을 갖는 다중불포화 지방산들(PUFA)을 포함하는 인조 오일 바디에 관한 것이다. 상기 PUFA의 예로는 스테아리돈산(SDA, 18:4Δ6,9,12,15, ω3), 아라키돈산(ARA, 20:4Δ5,8,11,14; ω6), 에이코사테트라에노산(ETA, 20:4Δ8,11,14,17, ω3), 에이코사펜타에노산(EPA, 20:5Δ5,8,11,14,17; ω3), 도코사펜타에노산(DPA, 22:5Δ7,10,13,16,19, ω3), 도코사헥사에노산(DHA, 22:6Δ4,7,10,13,16,19, ω3)뿐만 아니라, 이들의 둘 또는 그 이상의 혼합물이 포함되며, 여기에 제한되지 않는다. 인조 오일 바디는 메틸기, 하이드록실기 및/또는 에폭사이드기와 같은 둘 또는 그 이하의 이중결합, 삼중결합, 측부 사슬들을 갖는 상기와 같은, 다른 지방산들을 추가로 포함할 수 있다.

지방산은 트리글리세라이드, 디아실글리세라이드, 모노아실글리세라이드, 아실-CoA 결합 또는 다른 결합형태의 일부, 또는 둘 또는 그 이상의 이들의 혼합물들과 같은, 에스테르화 형태, 또는 자유 상태(비-에스테르화)로 존재할 수 있다. 지방산은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨 또는 디포스파티딜글리세롤 형태와 같은 인지질로서 에스테르화될 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 “글리세라이드”는 트리글리세라이드, 디글리세라이드, 모노글리세라이드, 포스포글리세라이드 및 이들의 조합들로 구성된 그룹으로부터 선택된 지질들을 포함한다. 보다 바람직하게는, 글리세라이드는 트리글리세라이드 및 디글리세라이드로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 글리세라이드는 트리글리세라이드 오일이다.

“트리아실글리세롤” 또는 (TAG)는 글리세롤이 3개의 지방산들로 에스테르화되는 글리세라이드이다. TAG 합성의 케네디(Kennedy) 경로에서, 전구체 sn - 글리세롤-3-포스페이트는 위치 sn-1에서 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제에 의해 촉매된 반응에서 지방산 조효소 A 에스테르에 의해 에스테르화되어, 라이소포스페티드산(LPA)을 형성하며, 이는 위치 sn-2에서 아실글리세로포스페이트 아실트랜스퍼라제에 의해 차례로 아실화되어, 포스페티드산을 형성한다. 포스페이트기는 효소 포스페티딕 포스포하이드롤라제에 의해 제거되며, 얻어진 1,2-디아실-sn-글리세롤은 아실화되어, 트리아실-sn-글리세롤을 형성한다.

한 구체예에서, 오일의 글리세라이드(바람직하게는, TAG) 함량은 모든(예를 들면, 적어도 75%, 또는 적어도 90% 또는 적어도 95%) 지방산들을 반드시 포함한다.

지방산을 포함하는 오일은 효모를 포함하는 미생물, 갑각류, 어류, 동물 및 식물을 포함하는 다양한 공급원들로부터 얻어질 수 있다. 생물은 유전적으로 변형되거나 또는 변형되지 않을 수 있다.

한 구체예에서, 시드오일이 인조 오일 바디내에 존재한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “시드오일”은 적어도 60%(w/w) 지질을 포함하는 식물의 시드/곡물로부터 얻어지거나, 또는 시드오일이 시드/곡물내에 여전히 존재하는 경우 시드/곡물로부터 얻어질 수 있는 조성물을 의미한다. 즉, 시드오일은 시드/곡물내에 존재하는 시드오일 또는 그의 일부, 뿐만 아니라 시드/곡물로부터 추출되는 시드오일을 포함한다. 시드오일은 추출된 시드오일인 것이 바람직하다. 시드오일은 전형적으로 실온에서 액체이다. 바람직하게는, 시드오일내 총 지방산(TFA) 함량은 우선적으로(>50%) 길이가 적어도 16개의 탄소들인 지방산들을 포함한다. 보다 바람직하게는, 시드오일내 총 지방산의 적어도 50%는 C18 지방산들, 예를 들면 올레산이다. 지방산은 예를 들면, TAG, DAG, 아실-CoA 또는 인지질과 같은 에스테르화 형태로 되어 있다. 지방산은 유리 지방산 및/또는 에스테르화 형태일 수 있다. 한 구체예에서, 인조 오일 바디내 시드오일은 1개 또는 그 이상의 다른 지질들(인지질 제외), 핵산, 폴리펩타이드들(올레오신 제외), 또는 시드 또는 조추출물내에서 조합되는 다른 오염분자들로부터 분리되는 “실질적으로 정제된” 또는 “정제된” 오일이다. 실질적으로 정제된 시드오일은 시드 또는 추출물내에서 조합되는 다른 성분들로부터 적어도 60% 유리되는, 보다 바람직하게는 75% 유리되는, 및 보다 바람직하게는 적어도 90% 유리되는 것이 바람직하다. 시드오일은 스테롤 및 페놀수지류와 같은 비-지방산 분자들을 추가로 포함할 수 있으며, 여기에 제한되지 않는다. 한 구체예에서, 시드오일은 카놀라 오일(Brassica napus , Brassica rapa ssp.), 머스타드 오일(Brassica juncea), 다른 배추 오일(예를 들면, Brassica napobrassica, Brassica camelina), 해바라기 오일(Helianthus annus), 아마인 오일(Linum usitatissimum), 대두 오일(Glycine max), 홍화 오일(Carthamus tinctorius), 옥수수 오일(Zea mays), 담배 오일(Nicotiana tabacum), 피넛 오일(Arachis hypogaea), 팜 오일(Elaeis guineensis), 무명시드 오일(Gossypium hirsutum), 코코넛 오일(Cocos nucifera), 아보카도 오일(Persea americana), 올리브 오일(Olea europaea), 캐슈 오일(Anacardium occidentale), 마카다미아 오일(Macadamia intergrifolia), 아몬드 오일(Prunus amygdalus), 오트 시드 오일(Avena sativa), 벼 오일(Oryza sativa 또는 Oryza glaberrima) 또는 아라비돕시스 시드 오일(Arabidopsis thaliana)이다. 시드오일은 당 분야에 공지된 특정 방법에 의해 시드/곡물로부터 추출될 수 있다. 이는 일반적으로 시드의 첫번째 파쇄하는 것과 연관된, 디에틸 에테르, 페트롤리움 에테르, 클로로포름/메탄올 또는 부탄올 혼합물과 같은 무극성 용매들에 의한 추출을 포함한다. 곡물내 전분과 연관된 지질들은 물-포화된 부탄올에 의해 추출될 수 있다. 시드오일은 당 분야에 공지된 방법들에 의해 “탈-검되어”, 다당류들을 제거하거나, 또는 다른 방법들로 처리되어, 오염물들을 제거하거나, 순도, 안정성 또는 색상을 개선시킨다. 시드오일내 TAG 및 다른 에스테르들은 가수분해되어, 유리 지방산들, 또는 수소화된, 당 분야에 공지된 화학적으로 또는 효소적으로 처리된 시드오일을 방출한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, “수산 오일”은 염수에 사는 생물체, 특히 해양 미세조류, 어류 또는 갑각류로부터 얻어지는 오일이다. 따라서, 본 발명에 사용하기 위한 오일은 염수 어류로부터 도출되는 어유 및 수산 오일 모두이다.

4개 또는 그 이상의 이중결합들을 갖는 다중불포화 지방산들을 포함하는 오일은 생물들이 4개 또는 그 이상의 이중결합들을 갖는 다중불포화 지방산들을 합성할 수 있게 하는, 외인성 폴리뉴클레오타이드들을 포함하는, 해양 미생물, 갑각류, 어류 또는 트랜스제닉 생물들, 상기 트랜스제닉 식물 또는 효모와 같은 특정 공급원으로부터 얻어질 수 있다. PUFA가 얻어질 수 있는 해양 미생물들의 예로는 암피디늄(Amphidinium), 암포(Amphor), 아스터리오넬라(Asterionella), 비둘피아(Biddulphia), 세라티움(Ceratium), 캐토세로스(Chaetoceros), 클로렐라(Chlorella), 크루모나스(Chroomonas), 코클로디늄(Cochlodinium), 크리스패라(Crisphaera), 크립테코디늄(Crypthecodinium), 크립토모나스(Cryptomonas), 사이클로텔라(Cyclotella), 실린드로테카(Cylindrotheca), 듀니엘라(Duniella), 에밀리아니아(Emiliania), 프라질라리아(Fragilaria), 글레노디늄(Glenodinium), 고니아울락스(Gonyaulax), 기로디늄(Gyrodinium), 해마토코커스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis), 헤테로마스틱스(Heteromastix), 이소크라이시스(Isochrysis), 라우데리아(Lauderia), 모노크라이시스(Monochrysis), 모노두스(Monodus), 모리텔라(Moritella), 모르티에렐라(Mortierella), 나노클로리스(Nannochloris), 나노클로로피스(Nannochloropis), 나비큘라(Navicula), 니츠키아(Nitzschia), 오돈텔라(Odontella), 올리스토디스쿠스(Olisthodiscus), 파블로바(Pavlova), 페리디늄(Peridinium), 패오닥틸룸(Phaeodactylum), 포르피리듐(Porphyridium), 프로로센트룸(Prorocentrum), 슈도페디넬라(Pseudopedinella), 로델라(Rhodella), 로도도마스(Rhododomas), 쉬조키트리움(Schizochytrium), 스켈렌토네마(Skelentonema), 스타우로네이스(Stauroneis), 테트라셀미스(Tetraselmis), 탈라스시오시라(Thalassiosira), 트라우토키트리움(Thrautochytrium), 또는 울케니아(Ulkenia)의 종이 포함되며, 여기에 제한되지 않는다. 본 발명에 사용가능한 어유들의 예로는 참치 오일, 가다랑어 오일, 농어 오일, 넙치 오일, 청새치 오일, 바라쿠다 오일, 대구 오일, 맨헤이든 오일, 정어리(sardine) 오일, 정어리(pilchard) 오일, 안초비 오일, 빙어 오일, 대서양 대구 오일, 대서양 헤링 오일, 대서양 맨헤이든 오일, 연어 오일, 상어 오일, 오징어 오일, 문어 오일, 크릴 오일, 물개 오일, 고래 오일, 등, 및 이들의 혼합물 및 조합물이 포함되며, 여기에 제한되지 않는다. 4개 또는 그 이상의 이중결합들을 갖는 다중불포화 지방산을 생성하는 트랜스제닉 생물들의 예들은 예를 들어, WO 2005/103253, WO 2007/106905, WO 2010/023202, WO 2010/057246 및 WO 2012/000026에 설명되어 있다.

위에 설명된 바와 같이, 당 분야에서 통상적으로 실시되는 기술들은 세포들, 식물들, 시드들 등에 의해 제조되는 오일들을 추출 및 처리하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 오일 추출은 탈검처리(또는 산 처리), 중화(또는 알칼리 처리), 수세척, 표백, 여과, 탈취, 연마 및/또는 냉각(또는 동결방지처리)을 포함한다. 바람직하게는, 정제는 산 처리 및/또는 알칼리 처리(탈검처리 및 중화)를 포함한다. 선택적으로, 정제방법들은 표백 및/또는 탈취를 포함한다. 그러나, 바람직하게 정제는 표백 및/또는 탈취, 및 최선으로 산 및 알칼리 처리를 포함할 것이다.

올레오신

올레오신은 시드의 저장조직들내 오일 바디들의 막내에 존재하는 소수성 단백질이다(예를 들면, Huang, 1996; Lin et al., 2005; Capuano et al., 2007; Lui et al., 2009; Shimada and Hara-Nishimura, 2010참조). 이들은 낮은 MW(15-26,000)을 가지며, 오일시드내에 풍부하다. 각 시드 종류내에, 다른 MW를 갖는 둘 또는 그 이상의 올레오신들이 보통 존재한다. 각 올레오신 분자는 비교적 친수성인 N-말단 도메인(예를 들면, 약 48개의 아미노산 잔기들), 알라닌, 글리신, 류신, 이소류신 및 발린과 같은 지방족 아미노산내에 특히 풍부한 중앙의 전체적으로 소수성인 도메인(예를 들면, 약 70-80개의 아미노산 잔기들), 및 C-말단에 또는 부근의 양친매성 α-나선형 도메인(예를 들면, 약 33개의 아미노산 잔기들)을 함유한다. 일반적으로, 소수성 잔기들의 중앙 신장부(central stretch)는 지질 코어에 삽입되고, 양친매성 N-말단 및/또는 양친매성 C-말단은 오일 바디들의 표면에 위치되어 있으며, 양으로 하전된 잔기는 표면 모노층에 심어지고, 음으로 하전된 잔기들은 외부에 노출되어 있다.

본 명세서에 사용된 용어 “올레오신”은 폴리올레오신 뿐만 아니라, 스테롤과 결합하는 스테롤레오신, 칼슘과 결합하는 칼레오신들을 포함한다(Scott et al., 2010). 그러나, 일반적으로 본 발명의 인조 오일 바디들의 올레오신들 중 전부는 아니지만, 대부분은 칼레오신 및/또는 스테롤레오신이 아닐 것이다. 그리고, 본 명세서에 사용된 용어 “올레오신”은 같은 올레오신 단백질의 균질한 군집 또는, 다른 올레오신 단백질들의 불균일한 군집을 의미한다.

상당수의 올레오신 단백질 서열들 및 그들을 위해 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열들은 대부분의 다른 식물종들로부터 알려져 있다. 그 예로는, 아라비드포시스(Arabidposis), 카놀라, 옥수수, 벼, 땅콩, 캐스터, 대두, 아마, 포도, 양배추, 면, 해바라기, 수수 및 보리로부터의 올레오신들이 포함되며, 이에 제한되지 않는다. 상기 올레오신들의 일부의 예들은 서열목록에 제공되어 있다. 따라서, 한 구체예에서, 올레오신은 하기로부터 선택되는 서열을 포함한다:

a) 서열 번호 1 내지 27 중 어느 하나로 제공되는 아미노산 서열,

b) 서열 번호 1 내지 27 중 어느 하나와 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 96%, 보다 바람직하게는 적어도 97%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열, 및

c) a) 또는 b)의 생물학적으로 활성인 단편.

추가의 구체예에서, 올레오신은 하기로부터 선택되는 서열을 포함한다:

a) 서열 번호 1 내지 18 중 어느 하나로 제공되는 아미노산 서열,

b) 서열 번호 1 내지 18 중 어느 하나와 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 96%, 보다 바람직하게는 적어도 97%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열, 및

c) a) 또는 b)의 생물학적으로 활성인 단편.

단백질의 유사성(%)은 GAP(Needleman and Wunsch, 1970) 분석(GCG 프로그램)에 의해 측정되며, 갭 형성 페널티(gap creation penalty)=5 및 갭 확장 페널티(gap extension penalty)=0.3을 가진다. 쿼리 서열은 길이가 적어도 50개의 아미노산들이며, GAP 분석은 적어도 50개의 아미노산들 영역위에 2개의 서열들을 정렬한다. 보다 바람직하게는, 쿼리 서열은 길이가 적어도 100개의 아미노산들이며, GAP 분석은 적어도 100개의 아미노산들 영역위에 2개의 서열들을 정렬한다. 보다 더 바람직하게는, 쿼리 서열은 길이가 적어도 250개의 아미노산들이며, GAP 분석은 적어도 250개의 아미노산들 영역위에 2개의 서열들을 정렬한다. 보다 더 바람직하게는, GAP 분석은 그들의 전체 길이위에 2개의 서열들을 정렬한다.

본 명세서에 사용된 “생물학적으로 활성인” 단편은 본 발명의 인조 오일 바디를 제조하는데 사용될 수 있는 올레오신의 일부이다. 생물학적으로 활성인 단편들은 정해진 활성을 유지하는 한 어느 사이즈나 될 수 있다.

바람직한 구체예에서, 올레오신은 카놀라(브라시카 종, Brassica spp.), 대두(글리신 맥스, Glycine max), 해바라기(헬리안투스 안누스, Helianthus annuus), 오일 팜(엘라에이스 기니이스, Elaeis guineeis), 면실(고시피움 종, Gossypium spp.), 땅콩(아라키스 하이포개아, Arachis hypogaea), 코코넛(코쿠스 누시페라, Cocus nucifera), 캐스터(리시누스 콤뮤니스, Ricinus communis), 홍화(카르타무스 틴토리우스, Carthamus tinctorius), 머스타드(브라시카 종 및 시나피스 알바, Brassica spp . and Sinapis alba), 코리앤더(코리안드룸 사티붐, Coriandrum sativum), 호박(쿠쿠비타 맥시마, Cucurbita maxima), 아마인/아마(리눔 우시타티스시뭄, Linum usitatissimum), 브라질 넛트(버톨레티아 엑셀사, Bertholletia excelsa), 호호바(심몬드시아 키넨시스, Simmondsia chinensis) 또는 옥수수(제아 메이스, Zea mays)와 같은 오일시드로부터 얻어지며, 이에 제한되지 않는다.

올레오신은 천연, 합성, 또는 재조합 공급원으로부터 수득될 수 있다. 유리하게는, 올레오신은 오일추출후 식물 추출물과 같은 천연 공급원, 특히 오일시드의 밀로부터 얻어질 수 있다. 도 1은 카놀라 밀과 같은 식물 밀로부터 올레오신을 추출하는데 사용되는 과정예를 보여준다. 대략 50%의 카놀라 밀 단백질은 pH 6.0-7.0에서 침전하는 것으로 보고되어 있다(Manamperi et al., 2010). 카놀라 밀은 주로 시드 세포 단백질로부터 유도된 40% 이하의 단백질을 함유한다. 용매 추출후 기계적 추출의 상업용 오일 추출과정들은 카놀라 오일 바디구조를 방해하여, 비교적 보다 풍부한 세포 단백질의 혼합물에 올레오신을 방출한다. 카놀라 올레오신의 등전점은 6.5이기 때문에, pH 범위 6.0-7.0에서 침전되는 단백질은 세포 단백질에 더해, 올레오신을 함유한다.

올레오신은 올레오신 제조수준을 개선시키는 올레오신을 인코딩하는 외래유전자(들) 또는 재조합 효모와 같이, 올레오신을 자연적으로 제조하지 않는 외래생물로부터 얻어질 수도 있다. 올레오신을 제조하고, 개선된 수준의 올레오신을 갖는 재조합 생물의 제조는 당 분야에 통상의 기술을 가진 자들의 능력내에 있다(예를 들면, Roux et al., 2004; Abenes et al., 1997; Bhatla et al., 2010 참조).

자연발생 올레오신들의 아미노산 서열 돌연변이체들은 적당한 뉴클레오타이드 변화들을 올레오신으로 인코딩하는 핵산으로 도입함으로써, 또는 목적하는 단백질의 시험관내 합성에 의해 제조될 수 있다. 상기 돌연변이체들은 아미노산 서열내에 잔기들의 예를 들면, 결실, 삽입 또는 치환하는 것을 포함한다. 최종 단백질 생성물이 원하는 특성들을 가진다는 가정하에, 결실, 삽입 및 치환의 조합은 최종 구조물에 도달하게 할 수 있다. 자연발생 올레오신의 기능적인 돌연변이체들의 제조 및 확인도 또한, 당 분야에 통상의 기술을 가진 자들의 능력내에 있다.

바이오틴일화, 벤질화, 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지 보호/블록팅 기들에 의한 유도체화, 단백질분해 제거, 항체분자 또는 다른 세포 리간드와의 결합 등에 의해, 합성 중에 또는 후에 별도로 변형되는 단백질들은 본 발명의 범주내에 포함된다.

올레오신들은 본 발명의 방법을 사용하거나, 또는 당 분야에 공지된 기술들을 사용하여 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 올레오신들은 하기 단계들에 의해 조 추출물로서 제조된다:

1) 추출물의 pH를 적어도 약 11.5의 pH로 조정하는 단계,

3) 액체 상의 pH를 감소시켜, 단백질을 침전시키는 단계,

5) 캐리어 내에 고체 상을 분산시키는 단계.

대체 구체예에서, 여과 방법들은 식물 재료로부터 올레오신을 적어도 부분적으로 정제하기 위해 사용된다.

계면활성제

본 발명의 인조 오일 바디는 1개 또는 그 이상의 계면활성제들을 포함한다.

계면활성제는 비-이온성 또는 음이온성 계면활성제, 또는 이들의 둘 또는 그 이상의 조합이다. 보다 특히, 계면활성제는 음이온성, 양이온성, 쌍성이온성 또는 이들의 둘 또는 그 이상의 조합이다. 예를 들면, 계면활성제는 이에 제한하지는 않지만 인지질, 모노글리세라이드, 퍼플루오로옥타노에이트(PFOA 또는 PFO), 퍼플루오로옥탄설포네이트(PFOS), 소듐 도데실 설페이트(SDS), 암모늄 라우릴 설페이트 및 다른 알킬 설페이트 염들, 소듐 라우릴 에테르 설페이트(SLES)라고도 알려져 있는 소듐 라우레트 설페이트, 알킬 벤젠 설포네이트, 소프들 또는 지방산염들, 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB), 헥사데실 트리메틸 암모늄 브로마이드 및 다른 알킬트리메틸암모늄염, 세틸피리디늄 클로라이드(CPC), 폴리에톡실화 탈로우 아민(POEA), 벤즈알코늄 클로라이드(BAC), 벤즈에토늄 클로라이드(BZT), 도데실 베타인, 코카미도프로필 베타인, 코코 암포 글리시네이트, 알킬 폴리(에틸렌 옥사이드), 알킬페놀 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(에틸렌 옥사이드) 및 폴리(프로필렌 옥사이드)의 코폴리머(상업용으로, 폴록사머 또는 폴록사민이라고 불리움), 옥틸 글루코시드를 포함하는 알킬 폴리글루코시드, 데실 말토시드, 지방산 알코올, 세틸 알코올 CA), 폴리(비닐 알코올)(PVA), 올레일 알코올, 코카미드 MEA, 코카미드 DEA, 폴리소르베이트, 예를 들면 Tween 20, Tween 40, Tween 80, 및 도데실 디메틸아민 옥사이드로 구성된 그룹에서 선택될 수 있다.

한 구체예에서, 계면활성제는 인지질이다. 그러나, 지방산이, 적어도 4개의 이중결합들을 갖는 다중불포화 지방산이 아닌 경우, 바람직한 구체예는 인조 오일 바디가 인지질을 포함하지 않거나, 또는 인지질이 적어도 하나의 다른 계면활성제와 함께 존재하는 것(예를 들면, 적어도 하나의 다른 계면활성제는 인조 오일 바디내 총 계면활성제의 적어도 5%, 또는 적어도 25%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 90%를 포함함)이다.

인지질은 지질의 종류이며, 지질 2중층을 형성할 수 있으므로 모든 세포막들의 주요 성분이다. 대부분의 인지질은 디글리세라이드, 포스페이트기, 및 콜린과 같은 간단한 유기분자를 함유한다. 한가지 예외는 스핀고미엘린인데, 이는 글리세롤 대신에 스핀고신으로부터 유도된다.

본 발명에 사용가능한 인지질의 예는 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린, 레시틴, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨 및 이들 중 둘 또는 그 이상의 혼합물들을 포함하며, 여기에 제한되지 않는다.

본 발명의 오일 바디들을 제조하기 위한 인지질은 다양한 공급원들, 예를 들면 시드들, 및 더욱 전형적으로 오일시드들로부터 형성된다. 이들은 레시틴 및 라이소-레시틴을 포함한다. 예를 들면, 레시틴은 콩(콩 레시틴) 또는 해바라기(해바라기 레시틴)으로부터 얻어질 수 있다. 또한, 변형된 지방산 조성물을 갖는 인지질이 사용될 수 있다. 상기 인지질은, 예를 들면 효소변형된 콩 인지질일 수 있다. 효소변형된 인지질은 예를 들면, 포스포리파제 A₂에 의한 처리에 의해, 콩 인지질(SLP; 트루 레시틴, Mie, Japan)로부터 제조될 수 있다(Novo Industry, Bagsvaerd, Denmark). 추가로, 변형된 지방산 조성물을 갖는 인지질은 유전적으로 변형되어 변형된 지방산 조성물들을 갖는 인지질을 제조하는 식물 또는 식물시드로부터 얻어질 수 있다. 변형된 지방산 조성물을 갖는 인지질의 예는 변형된 지방산 조성물을 갖는 레시틴이다. 인지질의 지방산 조성물들을 변형시키기 위해 당 분야에 잘 알려져 있는 다른 방법들이 사용될 수도 있다.

오일 바디의 지질 코어를 둘러싸는 계면활성제 층은 보통 단일층이다.

인조 오일 바디를 형성시키는 계면활성제의 농도이면 어느 농도나 사용될 수 있다.

인조 오일 바디

본 명세서에 사용된, 용어 “인조 오일 바디”는 크기가 약 0.1 내지 약 100㎛이며, 올레오신이 계면활성제 층에 심어진 계면활성제 층에 의해 둘러싸여 있는 오일을 포함하는 구조를 의미한다. 본 발명의 오일 바디가 자연에 존재한다는 증거가 없으므로, 이들은 인조라고 칭한다. 그렇더라도, 본 발명의 “인조 오일 바디”는 “오일 바디”라고도 할 수 있다.

전형적으로, 본 발명의 인조 오일 바디는 약 90% 내지 약 98.5% 글리세라이드, 약 0.2% 내지 약 5% 계면활성제 및 약 0.5% 내지 약 5% 단백질을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 전형적인 인조 오일 바디는 대략 97.5/1.0/1.5의 오일/계면활성제/올레오신 비율을 포함한다. 본 명세서에 보여지는 바와 같이, 올레오신의 농도를 감소시킴으로써 오일 바디의 크기를 증가시킨다.

한 구체예에서, 지방산의 적어도 10%, 보다 바람직하게는 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 30%는 4개 또는 그 이상의 이중결합들을 갖는 다중불포화 지방산이다. 예를 들면, Numega제 Hi-DHA 참치 오일은 약 37% PUFA를 갖는 반면, Martek제 해조 오일 DHASCO는 약 61% PUFA를 가진다.

다른 구체예에서, 지방산의 적어도 10%, 보다 바람직하게는 적어도 20%는 DHA이다. 예를 들면, Numega제 Hi-DHA 참치 오일은 약 26% DHA를 갖는 반면, Martek제 해조 오일 DHASCO는 약 40% DHA를 가진다.

오일 바디는 (예를 들면) 800rpm에서 30분간 동작하는 자동 교반기를 사용하여, 오일, 계면활성제 및 올레오신을 물과 혼합하여 프리-에멀젼을 제조함으로써 얻어질 수 있다. 유리하게는, 올레오신은 본 발명의 방법을 사용하여 얻어지는 식물로부터 단백질 추출물로서 제공될 수 있다. 한 구체예에서, 올레오신은 본 발명의 방법에 사용되기 전에, 동결건조에 의해 제조되는 것과 같은, 분말로서 저장된다.

본 발명의 인조 오일 바디는 산화적으로 안정적이다. 예를 들면, 오일 바디들을 40℃에서 15일간 저장할 때, 인조 오일 바디내에서, EPA 및 DHA의 총 농도와 같은, 지방산의 40% 미만, 보다 바람직하게는 30% 미만, 보다 바람직하게는 20% 미만, 및 보다 더 바람직하게는 15% 미만이 결실된다. 다른 예에서, 40℃에서 15일간 저장한 후, 오일 바디들은 6 미만, 보다 바람직하게는 5 미만, 및 보다 더 바람직하게는 4㎍/㎖ 미만의 트랜스,트랜스-2,4-헵타디에날을 포함한다. 또 다른 예에서, 90meq/㎏ 오일 미만, 보다 바람직하게는 50meq/㎏ 오일 미만, 보다 바람직하게는 25meq/㎏ 오일 미만의 하이드로퍼옥사이드들이 40℃에서 5일후 제조된다.

인조 오일 바디들을 포함하는 제품들 및 이들의 사용방법

오일 바디는 매우 다양한 제품들에 사용될 수 있다. 상기 제품들의 예로는 식품 또는 사료제품, 음료제품, 개인생활용품, 약품 또는 공산품이 포함되며, 여기에 제한되지 않는다. 상기 제품들을 제조하는 방법들은 당 분야에 잘 알려져 있다.

한 바람직한 구체예에서, 본 발명은 동물 및/또는 사람들에 의해 섭취될 수 있는 제품들에 관한 것이다. 이들 조성물들은 섭취될 수 있으므로, 식품 등급 품질을 가져야 한다. 그러나, 오일 바디들이 적용된 특정 제품 및 특정 형태는 크게 중요하지 않으며, 원하는대로 될 수 있다. 식품, 사료 또는 음료제품의 예로는, 비-유제품 치환물, 비-유제품 치즈, 비-유제품 요거트, 마가린, 마요네즈, 비네그레트, 아이싱, 크림, 수프, 아이스크림(예를 들면, 안정화제로서), 샐러드 드레싱, 머스타드, 캔디, 베샤멜 소스, 츄잉 검, 푸딩, 제과제품, 조미료, 주스(예를 들면, 자연 클라우딩제로서), 베이비 포뮬라, 풍미 캐리어, 텍스쳐제, 어류 식품, 애완식품 및 가축 사료가 포함되며, 여기에 제한되지는 않는다.

개인생활용품의 예로는, 비누, 화장품, 피부크림, 페이셜 크림, 치약, 립스틱, 향수, 메이크-업, 파운데이션, 블러셔, 마스카라, 아이섀도우, 선스크린 로션 및 헤어 케어 제품이 포함되며, 여기에 제한되지 않는다.

약품의 예로는 치료제, 진단제 및 전달제가 포함되며, 여기에 제한되지 않는다.

치료제 또는 진단제는 숙주에 전달하고자 하는 분자가 될 수 있다. 한 구체예에서, 유효성분은 치료적 또는 진단적 가치를 갖는 단백질 또는 펩타이드이다. 상기 펩타이드들은 항원(백신 제제에 대한), 항체 또는 항체-관련 분자들, 사이토카인, 혈액응고인자 및 성장호르몬을 포함한다.

공산품의 예로는 페인트, 코팅제, 윤활제, 필름, 겔, 드릴링 액, 페이퍼 사이징, 라텍스, 빌딩 또는 길 구조재료, 잉크, 염료, 왁스, 연마 및 농약 제제를 포함하며, 여기에 제한되지 않는다.

본 발명의 인조 오일 바디는 본 발명의 오일 바디내 지방산의 잘 알려진 잇점들로 인해, 질병들을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 지방산들로부터 유용되는, 질환, 특히 4개 또는 그 이상의 이중결합들을 갖는 다중불포화 지방산들로부터 유용되는, 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 질환을 갖는 대상에게 본 발명의 1개 또는 그 이상의 오일 바디들 및/또는 본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 상기 질환들의 예로는, 심부정맥, 혈관성형술, 염증, 천식, 건선, 골다공증, 신장 결석, AIDS, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 크론병, 정신분열증, 암, 태아 알콜증후군, 주의력결핍 과잉행동장애, 낭포성 섬유증, 페닐케톤뇨증, 단극성 우울증, 공격적 적대감, 부신백색질장애, 관상동맥 심질환, 고혈압, 당뇨병, 비만, 알츠하이머병, 만성 폐쇄성 폐질환, 궤양성 대장염, 혈관성형술후 재협착, 습진, 고혈압, 혈소판 응집, 위장관 출혈, 자궁내막증, 월경전 증후군, 근육통성 뇌수막염, 바이러스 감염후 만성피로 또는 안과 질환이 있으며, 여기에 제한되지 않는다.

한 구체예에서, 오일 바디들 또는 조성물은 경구 투여에 의해 제공된다. 전형적으로, 오일 바디들은 투여때마다 오메가-3 PUFA와 같은 지방산을 적어도 10mg 전달하기에 충분한 양으로 투여된다. 보다 바람직하게는, 오메가-3 PUFA와 같은 지방산을 적어도 30㎎, 보다 더 바람직하게는 적어도 50㎎ 및 가장 바람직하게는 적어도 100㎎이 투여때마다 전달된다.

본 발명은 포유동물과 같은 동물들을 치료하기 위해 사용되기에 적당하다고 이해될 것이다. 가장 바람직하게는, 본 발명은 사람을 치료하는데 사용된다.

바람직한 구체예에서, 제품은 수중유적형 에멀젼이거나, 또는 수중유적형 에멀젼을 포함한다. 본 발명의 상기 에멀젼은 물리적으로 및 산화적으로 안정적이며, 경시 합병(coalesce on standing)되지 않는다.

오일 바디들은 당 분야에 공지된 기술들을 사용하여 에멀젼으로 배합될 수 있다. 바람직하게는, 적어도 하나의 추가 성분이 오일 바디 제조에 첨가된다. 추가의 성분은 용액, 현탁액, 겔 또는 고체로서 첨가될 수 있으며, 추가 성분의 정량은 배합물에 따라 달라질 것이다. 추가 성분은 배합시에 오일 바디와 연관되며, 용액내에 현탁된채로 남아있거나, 또는 오일 바디들이 분산된 현탁액을 형성할 수 있다. 상기 성분은 또한, 오일 바디를 둘러싼 계면활성제 층을 침투할 수 있다. 오일 바디를 침투할 수 있는 성분들은 오일, 왁스 및 착색제 나일 레드(Nile Red)를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 추가 성분은 액체 상이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 액체 상은 물이다.

물은 직접 첨가될 수 있거나, 또는 다른 성분과 연합한 수분을 통해 첨가될 수 있다. 물의 최종량은, 성분들을 혼합할 때 안정한 에멀젼이 형성되는한, 그다지 중요하지 않다. 일반적으로, 농도는 적어도 1%의 물 및 99% 이하의 물을 함유할 것이다. 보통, 적당한 에멀젼을 제공하기 위해서는 혼합이 필요할 것이며, 열 또는 압력을 가할 필요가 있을 수도 있다.

다른 바람직한 구체예에서, 추가의 성분은 오일 또는 왁스이다. 오일 또는 왁스는 오일 바디내에서 분할하며, 이 방법에서 지용성 비타민과 같은 지용성 성분들은 오일 바디에 전달될 수 있다. 오일 또는 왁스들이 첨가성분들을 포함하는 곳에서, 오일 바디들은 친유성 상에 현탁된 채로 있거나, 이중 에멀젼이 형성될 수 있다.

최종 조성물은 고체 또는 액체 형태일 수 있거나, 또는 다른 원하는 점성도를 가질 수 있다. 에멀젼은 2중량% 미만의 농도로 존재하는, 겔화제, 예를 들면 셀룰로스 및 유도체, 카보폴 및 유도체, 캐럽, 카라기난 및 유도체, 크산테인 검, 스클러레인 검, 장쇄 알칸올아미드, 및 벤톤 및 유도체를 사용하여, 농후해질 수 있다.

에멀젼은 선택된 재료를 습윤, 포밍, 침투, 유화, 가용화 및 또는 분산시키기 위해 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 소듐 코코넛 모노글리세라이드 설포네이트와 같은 음이온성 계면활성제, 라우릴 트리메틸 암모늄 클로라이드, 세틸 피리디늄 클로라이드 및 트리메틸암모늄 브로마이드와 같은 양이온성 계면활성제, 플루로닉, 알킬 페놀의 폴리에틸렌 옥사이드 축합물을 포함하는 비이온성 계면활성제 및 지방족 4차암모늄, 포스모뮴 및 설포늄 화합물의 유도체와 같은 양쪽이온성 계면활성제들이 모두 필요에 따라 첨가될 것이다.

타르타르산, EDTA, 시트르산, 알칼리금속 시트레이트, 파이로포스페이트염 또는 음이온성 폴리머 폴리카르복실레이트와 같은 금속이온들을 결합시킬 수 있는 킬레이트제들은 또한, 목적에 따라 에멀젼 배합물내에 포함될 수도 있다.

보통, 박테리아, 균류, 마이코플라스마, 바이러스 등에 의한 오염, 또는 산화반응과 같은 원치않는 화학반응이 예방되도록 에멀젼 배합물이 처리될 것이다. 바람직한 구체예에서, 이는 소듐 메타바이설파이트 또는 다른 화학첨가제와 같은 방부제들을 첨가함으로써, 또는 코발트-60 또는 세슘-137 조사와 같은 이온화 조사, 또는 자외선 조사와 같은 조사에 의해 이루어진다.

그리고, 활성제가 첨가될 수 있다. 예를 들면, 화장료 조성물들은 기존의 에멀젼 배합물 및 비타민들을 사용하여 안정적인 현탁액으로서 배합될 수 있으며, 피부 크림에 보습제가 포함될 수 있다. 본 발명의 에멀젼내에 유효성분이 포함될 수 있는 특히 유리한 한가지 방법은 WO96/21029에 설명된 바와 같이, 올리오신 유전자 융합의 구조를 통한 방법이다. 이러한 융합단백질들은 올레오신을 인코딩하는 유전자를, 주된 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 유전자에 유전적으로 결합시킴으로써 생성된다. 오일시드 식물에서 융합 유전자의 발현은 본 발명의 인조 오일 바디들을 제조하는데 사용되는 융합단백질을 합성시킨다. 본래, 원하는 단백질 또는 펩타이드는 이 기술을 사용하여 제조될 수 있으며, 이 기술은 극성 어류 동결방지 펩타이드들 또는 치료용 단백질이 올레오신 융합으로서 생성되는 단계를 포함한다.

막형성 특성들을 갖는 에멀젼도 또한 배합될 수 있다. 상기 에멀젼은 표면에 적용되고 건조될 때, 코팅을 형성한다. 코팅된 오일 바디 필름이 도포되는 에멀젼의 예는 어류식품에 첨가되며, 여기에서 오일 바디들(예를 들면, 미세조류 오일로부터 생성됨)은 어류식품에 적용되어 음식물가를 개선시킨다. 막형성 에멀젼은 특히 본 발명의 구체예에서 유용하며, 여기에서 유효성분의 조절된 방출은 향수와 같은 휘발물질 또는 약품의 전달에 바람직하다. 에멀젼의 필름으로부터 활성제가 방출하는 시간은 다른 요소들 중에서도 막의 두께에 따라 다르며, 이는 건조중에 일어난다. 더 두꺼운 코팅이 도포될 때, 건조시간이 길어질수록 활성제의 방출은 더 느려질 것이다. 변형된 배합물들에서는, 막이 건조할 때만 제제의 방출이 일어난다.

에멀젼의 조성, 및 활성제의 타입 및 농도와 같은 다른 요소들은 또한 방출특성들을 결정한다. 예를 들면, 에탄올과 같은 공용매들이 배합물에 포함되어, 방출시간에 영향을 끼친다. 유효성분의 방출은 또한, 식품 용도에 바람직하며, 이때 에멀젼내에 포함된 향은 소모시에 방출된다. 에멀젼의 정확한 배합에 의존하는 향의 방출은 갑작스런 강렬한 느낌 또는 향 및 에센스의 보다 미묘한 혼합을 이끌어낼 수 있다.

에멀젼 배합은 스프레이 및 에어로졸에 사용될 수도 있다. 알코올 및 향료와 같은 휘발물질들은 상기 스프레이에 포함될 수 있다. 이러한 타입의 에멀젼들은 또한 포테이토 칩과 같은 건조식품 제조물 및 건조비누의 표면상에 분무될 수도 있다. 에멀젼은 향료를 포함하고, 방부제 가치를 부가하거나, 또는 식품의 적당한 수분 수준을 유지하는데 도움이 된다.

본 발명의 에멀젼 배합물의 안정성은 산 에멀젼의 배합물에 이용될 수 있다. 예를 들면, 마요네즈-유사 식품을 제조하는데 에멀젼 배합물이 사용될 수 있으며, 게다가 오일 바디 제조물은 원한다면, 식물성 오일, 머스타드, 식초 및 난황을 포함한다.

샐러드 드레싱과 같은 주입식 에멀젼들은 식초의 절대량을 증가시킴에 의해, 및/또는 물을 첨가하여 제조될 수 있다.

분명한 유해한 효과없이, 열이 가해지는 용도의 예는 초콜렛 소스와 같은 달콤한 소스에 또는 베사멜 소스와 같은 풍미있는 소스를 제조하는 용도이다. 이러한 용도에서, 오일 바디 제조는 튀김 대용으로 사용된다. 베사멜 소스를 제조하기 위해서는, 가열된 오일 바디 제조물 1부(w/w)에 밀가루 1부(w/w)를 첨가하고, 농후한 현탁액이 형성될때까지 이를 교반한다. 원하는 점도를 갖는 소스가 얻어질때까지, 적당한 열에서, 우유를 점진적으로 첨가한다.

에멀젼 배합물은 또한, 버터 대용물로 사용될 수 있다. 이 용도에서, 원하는 점도가 얻어질때까지, 예를 들면 10% 미만의 소량의 물이 오일 바디 제조물에 첨가된다. 천연 버터향료와 딕크너(thickener)가 원할 때 첨가될 수 있다. 버터 대용물은 스위트 콘, 빵, 케? 믹스 또는 빵 제조에 사용될 수 있다. 향에 기여하고, 방부제로서 역할을 하는 소금은 약 2.5%(wt/vol)의 수준으로 통상적으로 첨가된다. 원하는 만큼 색상을 좀더 진하게 하기 위해, 예를 들면, 아나토 시드 또는 카로틴의 추출물과 같은 착색제가 첨가된다. 이러한 용도의 잇점은 오일 바디계 버터가 바람직한 농도를 얻기 위해 마가린 등의 배합물에 사용되고, 심혈관계 질환들과 연관된 수소화 지방산을 포함하지 않는다는 점이다. 크림 및 거품을 원하는 경우 믹스에 쇼트닝이 첨가될 수 있다. 이러한 믹스들은 아이싱, 합성 크림, 아이스크림 및 케이크 반죽을 포함한다.

모조 과일쥬스는 인조 또는 천연 향료 및 영양분으로부터 제조될 수 있다. 상기 모조 쥬스들은 정확한 외관을 갖지 않으며, 투명도 때문에 약해지거나 희석되어 보인다. 소량, 예를 들면, 0.1 내지 1%(v/v)의 오일 바디 제조물 ?는 그의 에멀젼을 첨가하여, 클라우딩을 일으켜, 주스에 풍부한 외관을 제공한다. 따라서, 본 발명의 오일 바디 제조물은 클라우딩제로서 사용될 수 있다. 주스를 포함하는 다른 적용예에서, 오일 바디 제조물 또는 그의 에멀젼이 토마토 쥬스와 같은, 침강성 고체를 갖는 주스들에 첨가될 수 있다.

예를 들면 0.1 내지 1%(v/v)와 같은 소량의 오일 바디 제조물을 첨가함으로써, 주스내 고체의 침강속도를 감소시키고, 풍부한 외관을 유지하는 것을 도와줄 수 있다.

본 발명의 오일 바디 제조물의 전형적인 용도도 또한 조사된다. 이 구체예에서, 에멀젼은 피부과용으로 허용되는 에멀젼으로서 배합되며, 얼굴 및/또는, 손톱 및 입술을 포함한 바디 피부를 보습하기 위해, 사용될 수 있으며, 피부의 노화, 여드름, 색소침착, 탈모를 막거나, 또는 제모를 촉진하거나, 상처치료를 용이하게 하고 및/또는 피부조직을 재건하는 특성들을 가질 수 있다. 오일 바디 제조물은 바람직하게는 1-99중량%의 최종 조성물을 나타낸다.

본 발명의 화장품 조성물은 식물, 동물, 미네랄 또는 합성 오일 또는 왁스 또는 그의 혼합물들과 같은 추가의 탄화수소 화합물들을 포함할 수 있다. 이들은 파라핀, 페트롤라튬, 퍼하이드로스쿠알렌, 아라라 오일, 아몬드 오일, 칼로필럼 오일, 참기름, 캐스터유, 호호바유, 올리브유 또는 곡물배아유를 포함한다.

에스테르는 라놀산, 올레산, 라우르산, 스테아르산, 미리스트산의 에스테르들을 포함한다. 또한, 예를 들면 올레일, 알코올, 리놀레일 알코올 또는 리놀레닐 알코올, 이소스테아릴 알코올 또는 옥틸 도데카놀, 알코올 또는 폴리알코올과 같은 알코올들을 포함할 수도 있다.

포함될 수 있는 또 다른 탄화수소들로는 옥타노에이트, 데카노에이트, 리시놀레이트, 카프릴/카프르산 트리글리세리드 또는 C10-C22 지방산 트리글리세리드가 포함된다. 이러한 제제들을 첨가하면 이중 에멀젼들이 형성된다.

25℃에서 고체인 수소화 오일, 예를 들면, 수소화 캐스터 오일, 팜 오일 또는 코코넛 오일 또는 수소화 탈로우; 모노-, 디-, 트리- 또는 수크로글리세라이드; 라놀린; 및 25℃에서 고체인 지방산도 또한 본 발명의 화장품 배합물에 포함될 수 있다. 그중에서, 밀랍과 같은 동물성 왁스; 카르나우바 왁스, 칸델릴라 왁스, 우리커리 왁스, 재팬 왁스 또는 코르크 섬유 또는 당 케인으로부터의 왁스와 같은 식물성 왁스; 미네랄 왁스, 예를 들면 파라핀 왁스, 갈탄 왁스, 미세결정질 왁스 또는 지랍 및 합성 확스가 포함될 수 있다.

색소들도 포함될 수 있으며, 백색 또는 컬러색, 무기 또는 유기 및/또는 진주광택이다. 이러한 색소들은 티타늄 다이옥사이드, 징크 옥사이드, 지리코늄, 다이옥사이드, 블랙, 옐로우, 레드 및 브라운 산화철, 이산화 세륨, 산화크롬, 블루 철, 카본 블랙, 바륨, 스트론튬, 칼슘 및 알루미늄 레이크 및, 이산화티탄 코팅된 마이카 또는 비스무스 옥사이드 코팅된 마이카를 포함한다.

화장품 및/또는 피부과 조성물에, 비타민, 예를 들면 비타민 A 또는 C와 같은 피부 크림 및 시트르산, 글리콜산, 락트산 및 타르타르산과 같은 알파 하이드록시산에 통상적으로 사용되는 유효성분들이 포함될 수 있다. 예를 들면, US 5,602,183에는 비타민 C 또는 아스코르브산이 특히 피부내 연결조직의 성장을 촉진시키고, 담배 및 UV 조사와 같은 외부 공격에 대하여 피부를 강화시킨다고 개시하고 있다. 피부 크림 및 화장품내에 포함될 수 있는 보습제들은 미네랄 오일 및 우레아이다. 자연발생 토코페롤 및 폴리페놀 또는 부틸화 하이드록시톨루엔 및 하이드록시아니솔과 같은 항산화제들도 첨가될 수 있다. 옥틸 메톡시신나메이트(Parsol MCX), 3-벤조페논(Uvinul M40) 및 뷰틸메톡시디벤조일메테인(Parsol 1789)과 같은 선스크린들이 선탠 로션 제조하는데 사용될 수 있다. 화장품 조성물을 배합하는데 사용될 수 있는 약학적 유효성분들은 예를 들어, 항생제, 살균제 및 항-염증제를 포함한다.

최종 화장품 제품은 유리형, 주입식 또는 컴팩트 파우더(파운데이션, 블러셔, 또는 아이섀도우), 립스틱, 마스카라, 또는 바디 또는 페이스용 오일 또는 로션과 같은 비교적 지성인 제품의 형태를 가질 수 있다.

오일 바디 제조물은 실리카, 계면활성제, 킬레이트제, 플루오라이드, 농후제, 감미료, 향료를, 예를 들면 페퍼민트의 오일, 효소 및 살균제로서 추가로 포함할 수 있는 치약내 경구허용가능한 캐리어로서 제공하기 위해 사용될 수도 있다.

배합될 수 있는 산업용 제품의 예는 페인트이며, 여기에서 실리콘타입 화합물, 아크릴 화합물, 폴리에스테르, 알키드, 불소, 에폭시, 폴리우레테인에 기초항 수지와 같은 주요 수지는 본 발명의 오일 바디 제조에 의해 일부 또는 전체 대체될 수 있다. 색소, 염료, 유리 플레이크 및 알루미늄 플레이크, 색소 분산제, 농후제, 레벨링제, 경화촉매, 디오이소시아네이트와 같은 경화제, 경화촉매, 겔화 억제제, 자외선 흡수제, 자유 라디칼 퀸칭제 등과 같은 추가 첨가제들이 필요에 따라 페인트 조성물에 배합될 수 있다.

오일 바디 제조는 또한, 윤활제를 배합하는 것이다. 예를 들면, 오일 바디 제조는 동물성 오일, 식물성 오일, 페트롤륨 윤활오일, 합성 윤활오일과 같은 윤활오일, 또는 리튬 그리스, 우레아 그리스 및 칼슘 그리스와 같은 윤활 그리스를 일부 또는 전부 대체하기 위해 사용될 수 있다. 윤활 배합물에 사용되는 다른 조성물은 항산화제, 세제 분산제, 유성 제제, 마찰 조정제, 점도지수 개선제, 주입점 강하제, 고체 윤활재료, 녹 억제제 및 소포제를 포함한다.

본 발명의 오일 바디 제조물을 사용하여 왁스를 제조할 수도 있다. 이들은 자동차 및 다른 보호 코팅재 위에 안정한 소수성 막-마감재를 제공하는 타입과 같은 린스-왁스 타입을 포함한다. 왁스를 제조하는데 사용되는 다른 조성물은 계면활성제, 미네랄 오일, 예를 들면 혼합 파라핀 및 방향족/나프텐 오일, 향수, 살균제, 착색제를 포함하며, 이는 목적에 따라 호환되는 양으로 첨가될 수 있다.

실시예

실시예1 - 재료 및 방법들

재료들

카놀라(브라시카 나푸스(Brassica napus)) 시드, 오일 및 곡류(meal)는 Cargill Australia제 제품이었다. 상기 곡류는 용매추출후 통상적인 산업용 기계적 배출방법에 의한 카놀라 오일 추출후 잔여물이었다. 도착시에, 시드들을 체쳐서, 짚과 다른 비-시드 재료를 제거하고, 필요할때까지 4℃에서 저장하였다. 시드들은 LECO® FP-2000 분석에 의해 측정된, 38.0% 오일(Cargill, Ltd.에 의한 정보) 및 25.2% 단백질을 함유하였다. 카놀라 오일을 정제하고, 표백하고, 그레이드를 탈취하고, 첨가된 TBHQ(200ppm) 항산화제를 가졌다. 동결방지처리된 참치 오일(HT303-4)은 LYSIHF(Reykjavik, Iceland)로부터 얻었다.

오일 카놀라 바디들의 추출

천연 오일 바디들은 최종 헥세인 세척단계가 생략된 것을 제외하고는, Tzen(1993)의 방법에 따라 카놀라 시드로부터 추출되었다. 요컨대, 시드들을 소듐 포스페이트 버퍼(pH 7.5)에 밤새 담구고, 키친 블렌더(Sunbeam Multiblender, 650W)를 사용하여, 분산매질(50ml당 건조시드 10g)에 의해 40초동안 균질화하였다. 분산매질은 0.6M 수크로스 및 10mM 소듐 포스페이트 버퍼(pH 7.5)를 함유하였다. 3층의 치즈크로스를 통해 균질액을 여과하였다. 여과물을 원심분리 튜브에 넣고, 균등량의 부유매질(0.6M 수크로스 대신에 0.4M 함유하는 분산매질)을 탑위에 층을 이루고, 그 튜브를 스윙-버킷 로터(Beckman J6-HC)에서 10℃에서 5,000g으로 60분간 원심분리하였다.

상부에 수집된 오일 바디들을 0.1%Tween-20, 0.2M 수크로스 및 5mM 소듐 포스페이트 버퍼 pH 7.5를 함유하는, 2배 용량의 분산세척용액에 재현탁시켰다. 재-현탁액을 원심분리튜브의 바닥부에 넣고, 10mM 소듐 포스페이트 버퍼 pH 7.5를 1:1의 비율로 상부에 적층시키고, 튜브를 원심분리하였다. 상부에 오일 바디들이 수집되고, 2배 용량의 이온성 용출버퍼(2M NaCl을 추가로 함유하는 분산매질)에 재현탁시켰다. 현탁액을 원심분리튜브의 바닥부에 넣고, 부유 매질(2M NaCl 및, 0.6M 수크로스 대신에 0.25M 수크로스를 함유하는 분산매질)을 상부에 적층하고(비율 1:1), 그 튜브를 원심분리하였다. 상부에 오일 바디들이 수집되고, 그용량의 9M 우레아에 재현탁시켰다. 재현탁액을 실온에서 10분간 격렬하게 셰이킹한후, 원심분리튜브의 바닥부에 넣고, 10M 소듐 포스페이트 버퍼 pH 7.5를 상부에 적층시키고(비율 1:1); 및 그 튜브를 원심분리하였다. 상부 오일 바디들이 수집되고, 그 용량의 분산매질 재현탁시켰다. 재현탁액을 원심분리튜브의 바닥부에 넣고, 부유배질을 상부에 적층시키고(비율 1:1), 및 튜브를 원심분리하였다. 상부에 오일 바디들이 수집되고, 분산매질과 함께 재현탁하여, 약 100g/ml의 농도를 제공하였다.

카놀라 오일 바디들로부터 올레오신의 분리

정제된 카놀라 OB로부터 올레오신을 추출하여, 14%(w/w) 함수량으로 건조시켰다. 오일 바디 제조물을 탈염수와 에탄올(60% 에탄올)내에 재현탁시키고, 1시간동안 교반하고, 회전 증발기(BUCHI Rotavapor R-124)를 사용하여 에탄올을 제거하였다. 그후, 에멀젼을 20℃의 스윙버킷 로터(Beckman J6-HC)에서 5,000g으로 30분간 원심분리하였다. 물과 미량의 에탄올을 함유하는 상부층을 제거하고, 단백질을 100g/L의 농도로 탈염수내에 재분산시켰다. 이 수성 단백질 분산액은 필요해질때까지 -18℃에서 저장하였다.

단백질 특성화

카놀라 오일 바디(COB)로부터 분리된 단백질들을 전기영동에 의한 분자량에 따라 특성화하였다. 공급사의 권장사항에 따라, NuPAGE® 겔 4-12% BT 1.0 겔 (NuPAGE® invitrogen)을 사용하여 정기영동을 수행하였다. 요컨대, 단백질 샘플의 농도를 1mg/ml로 조정하고, 25㎕를 에펜도르프 튜브에 넣었다. 그후, NuPAGE® LDS 샘플버퍼(4X) 10㎕ 및 NuPAGE® 환원제(10x) 5㎕를 각각 첨가하고, 70℃로 10분간 가열하기 전에, 그 튜브를 실온에서 14,000으로 3초간 원심분리하였다(에펜도르프 원심분리 5415C). 농도를 조정하지 않은 것외에 같은 방법으로 마커들(Mark 12™ Unstained Standards)을 제조하였다. 마지막으로, 마커와 샘플의 두 양 10㎕를 겔에 첨가하여, NuPAGE® 러닝 버퍼 및 항산화제를 함유하는 전기영동 셀(Novex Mini-Cell, Invitrogen)에 넣었다. 200Volts 및 400mA로 설정된 발전기(BIORAD Power Pac 300)에 상기 셀을 35분간 연결하였다.

전기영동이 1회 완료되면, 겔을 탈염수로 3회 세척하고, SimplyBlue™ SafeStain (Invitrogen)을 갖춘 플라스틱 용기에 42rpm(RATEK Platform Mixer model OM6) 2시간동안 느리게 교반하면서 두었다. 그후, 겔을 탈염수로 2회 더 세척하고, 비-단백질 결합 스테인을 제거하기 위해, 2시간동안 탈염수안에 넣었고, G:BOX (SYNGENE) 및 GeneSnap 7.07 소프트웨어 (SYNGENE)로 촬영했다.

카놀라 밀로부터 올레오신의 추출

Ghodsvali et al.(2005)의 과정의 변형예에 따라, 카놀라 밀로부터 올레오신을 추출하였다. 요컨대, 카놀라 밀(1.0kg)을 탈염수(10.0L)에 담구고, 수성 수산화나트륨(5%, w/w)으로 pH를 12.0으로 조정하고, Ultraturax 믹서를 사용하여 10분간 혼합하였다. 10분간 그대로 둔후, 내용물을 추가로 10분동안 혼합하였다. 얻은 슬러리를 20℃의 스윙-버킷 로터에서 30분간 4,000g으로 원심분리하였다(Beckman J6-HC). 단백질 침전이 발생했을 때, 조단백질을 함유하는 상층액의 pH를 pH 6.5(올레오신의 등전점)으로 조정하였다. 상층액 및 침전물이 회수되었을때, 4,000g로 원심분리하기 전에 추가 30분동안 교반을 계속하였다. Ultraturax를 사용하여 침전물을 pH 6.5 물로 세척하고, 4,000g으로 30분간 다시 원심분리하였다. 세척된 침전물을 페이스트로서 회수하고, 필요해질때까지 -18℃에서 습한 형태로 저장하였다.

인조 오일 바디의 건조( construction )

초기 실험에서, 인지질의 존재 및 부재하에서, 카놀라 밀로부터 다양하게 얻은 올레오신 추출물들을 사용하여, 카놀라 오일 및 참치 오일을 함유하는 인조 오일 바디 분산액을 각각 제조하였다. 먼저, 800rpm에서 30분간 동작하는 자동 교반기(Heidolph제 RZR 2051 Control)를 사용하여, 단백질을 함유하는 오일과 물을 혼합함으로써 프리-에멀젼을 제조하였다. 인지질이 포함되었을 경우, 이들은 유화전에 오일내에 용해되었다. 사용된 성분들의 중량비는 천연 카놀라 OB내 비율과 유사했다. 따라서, 0.5 내지 2㎛의 입자크기를 얻고, 단백질 및 인지질에 의해 잘 피복된 오일 소적들을 얻기 위해, 프리에멀젼은 필요하다면, 1.5%의 단백질, 1%의 인지질 및 10%의 오일을 함유하였다. 프리에멀젼을 500bars에서 3회 균질화하였다(RATEK Pilot Lab 균질화기).

이후 실험에서, 카놀라 밀로부터 다양하게 얻은 올레오신 추출물 및 계면활성제를 사용하여, 카놀라 오일 및 참치 오일을 각각 함유하는 인조 오일 바디 분산액을 제조하였다. 인지질 또는 다른 계면활성제가 포함된 경우, 이들을 유화시키기 전에 오일과 혼합하였다. 먼저, Ultraturax 혼합하면서, 40% 수성 수산화나트륨을 적상첨가하여, 올레오신 추출물의 pH를 약 8.0으로 조정하였다. 오일(10g), 올레오신 추출물(1.5g), 계면활성제(다양함), 및 탈염수(87.5g)를 유리 비이커에 넣고, 산화를 최소화하기 위해 질소블랭킷하에 Silverson 믹서를 사용하여 2분간 혼합하기 전에 수조(60℃)에서 데웠다. 혼합물을 질소하에 1000bar에서 2회 균질화하였다(EmulsiFlex C5). 사용된 성분들의 중량비는 천연 카놀라 OB내 비율과 유사했다. 따라서, 프리에멀젼은 1.5%의 단백질, 1%의 계면활성제, 필요하다면, 및 10%의 오일을 함유하였다.

카놀라 밀로부터의 올레오신 추출물을 하기와 같이 에멀젼 제조전에 “검사(work up)” 하였다. 저장된 추출물을 해동한후, pH가 8.0에 도달할때까지 수산화나트륨을 적상첨가하면서, Ultraturax 믹서 40%(w/W)를 사용하여 혼합하였다.

Tween40 유화제를 사용한 대조군 에멀젼의 제조

유화제로서, Tween40(6%, w/w)을 사용하여 카놀라 및 참치 오일에 의해 10%(w/w) o/w 에멀젼을 제조하였다. 유화는 위와 같이 수행하였다.

인조 오일 바디의 물리적 특성화

4℃, 주위온도(약 20℃), 45℃ 및 60℃ 각각에서 12일동안 AOB의 물리적 안정성을 연구하였다. 에멀젼의 입자크기는 Hydro 2000g 모듈과 조합된 맬버른 소규모 샘플 프리젠테이션 유닛(Malvern Small Volume Sample Presentation Unit)을 사용하여 MASTERSIZER 2000 (Malvern)으로 측정하였다(입자 RI : 1,456 / 흡수율 : 0.001 / 분산제 RI : 1,330 물). 광학현미경 사진은 컬러뷰 IIIu 카메라에 연결된 광학현미경 Olympus BH-2에 의해 얻고, AnalySIS getIT 5.0 소프트웨어를 사용하여 처리하였다. 소듐 도데실 설페이트(SDS)에 의해 처리하여, 입자들의 응집을 조사하였다. 이는 실온에서 자석교반기를 사용하여 10분간 SDS의 10%(w/w) 용액 1용량과 3용량의 에멀젼을 혼합한후, 재분석하여, 수행하였다.

오일 바디로부터 제조된 수중유적형 에멀젼들의 산화적 안정성

AOB 분산액의 산화적 안정성은 EPA/DHA의 결실 뿐만 아니라 산화촉진조건하에 저장하는동안 생성된 트랜스,트랜스-2,4-헵타디에날의 양 뿐만 아니라 EPA/DHA의 결실로부터 평가하였다. 후자 목적을 위해, 에멀젼의 샘플(2g)을 헤드스페이스 바이알(10ml)에 넣고, 실리콘-라인 알루미늄 캡으로 밀봉하고, 15일동안 어두운 다크 오븐내에서 40℃ 또는 60℃에서 가열하였다. 샘플들을 매일 배출하고, 그즉시 하기와 같이 고체 상 마이크로 추출 및 가스 크로마토그래피-질량 분석법에 의해 2,4-헵타디에날에 대하여 분석하였다.

AOB 에멀젼의 촉진된 산화동안 발생된 산화적 휘발성 화합물들을, DVB/CAR/PDMS 섬유(50/30 μm, Supelco, Sydney, Australia)를 사용하여 헤드 스페이스 고체 상 마이크로 추출(SPME)에 의해 측정하였다. 섬유를 샘플 헤드스페이스로 삽입하고, 바이알을 60℃에서 15분간 배양한후, 빼내어, GC 주입기(스플릿리스 모드에서 동작함)로 옮기고, 7분간 유지시켜, 추출된 휘발성 화합물을 GC 컬럼으로 흡수제 제거하였다(desorb). 전 실험 과정을 Combi PAL 자동 주사기(CTC Analytics, Zwingen, Switzerland)를 사용하여 수행하였다. GC-MS는 VOC 융합 실리커 모세컬럼(60 mm, 0.32mm i.d., 0.18 mm 막두께, Agilent, Melbourne, VIC, Australia)으로 맞춰진 Agilent Model 6890 GC and Model 5973 MSD (Palo Alto, CA)를 사용하여 수행되었다. GC 오븐을 40℃에서 분당 22℃의 속도로 220℃까지 프로그래밍하고, 추가로 14분동안 그 온도에서 유지하였다. 분당 2.0ml의 일정한 유속으로 캐리어 가스로서 헬륨을 사용하였다. 스플릿리스 모드에서 주사기를 초기 동작시키고, 샘플주입후 스플릿모드(1:20) 2분으로 스위칭하였다. 주사기 및 MS 검출기의 온도를 모두 230℃에서 유지하였다. MS를 스캔모드(29-350amu)에서 동작하였다. 켐스테이션(Chemstation) 소프트웨어를 사용하여, 데이터분석을 수행하고, 스펙트럼 라이브러리(Wiley 275)에 대한 참고 뿐만 아니라 스탠다드에 의해 화합물을 확인하였다. 다른 수준의 휘발성 화합물 2,4-헵타디에날(트랜스,트랜스)스탠다드와 함께 첨가된 대응 프레쉬 에멀젼에멀젼으로부터 형성된 보정곡선을 사용하여, 에멀젼내 휘발성 화합물을 정량화하였다.

저장하는 동안 ALA(카놀라) EPA 및 DHA(참치)의 결실은, 모세 가스 크로마토그래피를 사용하여 지방산 분석에 의해 측정하였다. 이 목적을 위해, 이소-프로페인올/헥세인을 사용하여, 상기 저장된 에멀젼으로부터 지질을 추출하고, 트랜스에스테르화 전에 촉매된 수산화칼륨에 의해 메틸 에스테르로 전환시켰다. BPX-70 모세 컬럼상에서 에스테르를 분석하고, 플레임 이온화 검출에 의해 검출하였다.

실시예 2- 카놀라 밀로부터 올레오신의 추출

도 2는 pH 6.5에서의 침전 및 수세척후 알칼리 추출(pH 12)에 의해 카놀라 밀로부터 분리된 단백질에 대한 전기영동 결과를 보여준다. 올레오신의 분자량은 18-20kDa 범위내에 있는 것으로 보고되었으며, 상기 분리물은 올레오신의 존재를 확인하는 분자량 범위내에서 다량의 단백질을 함유하였다. 3.0-12.0 범위의 다른 pH 값들에서의 단백질 침전 및 이후의 전기영동은, 최대 올레오신 회수가 pH 6.5에서 얻어졌음을 보여줬다. 다른 연구원에 의한 종래 연구들은 미리-추출된 오일 바디들을 클로로포름과 메탄올의 혼합물 또는 에탄올의 처리에 의해 와해시킨 후 그로부터 올레오신을 분리하는 것에 집중되어 있었다. 본 정보의 최선을 위해, 수성 추출물에 의해 오일시드 또는 밀로부터 올레오신을 분리하는 시도는 이전에 전혀 없었다. 이는 올레오신들이 pH와 무관하에 물에 불용성이라고 생각하기 때문일 수 있다(Beisson 외 다수, 2001). 건조시에 올레오신이 응집하는 경향의 결과로서, 분명한 불수용성이 얻어질 수 있으며; 한때 물에 올레오신을 용해 또는 분산시키는 것이 어렵게 된다.

초기 실험후, 카놀라 밀로부터 올레오신을 가장 적합하게 추출하는 것이 진행되었다. 최대 올레오신 수득량은 pH 12.0에서 얻어졌으며, pH가 감소함에 따라 매우 낮은 회수율이 얻어졌다(도 3). SDS-PAGE에 의해 도시된 바와 같이, pH 12.0에 가장 순수한 올레오신 추출물이 풍부했다(도 4). pH값이 작아질수록, 대략 12kDa 및 5kDa의 두 저분자량 성분들의 양을 증가시키는 경향이 있다.

실시예 3-인조 오일 바디들의 입자크기

산화속도에 대한 입자크기의 효과를 제거하기 위해, 두 에멀젼들(Tween40 및 올레오신)의 입자크기를 가능한한 멀리 매칭하였다(도 5). 촉진산화연구를 위해 저장하는 동안 입자크기를 비교적 일정하게 유지하고, 분리가 일어나지 않도록 하는 것이 또한 중요하다. Tween40 에멀젼에 의한 AOB 뿐만 아니라 올레오신에 의해 제조된 AOB의 소적크기는 60℃에서 12일동안 저장하는동안 불변한채 남아있다. 높은 온도에서 저장하는동안, 소적크기의 균일도는 헤드스페이스 분석에 기초한 촉진산화연구를 가능하게 하였다.

명확하게는, pH 12-가용성 추출물은 세포단백질로 주로 구성되었다. 또한, 침전된 프랙션은 비교적 다량의 비-올레오신 단백질을 함유하였다. 그러나, 흥미있게도, AOB가 pH 12-가용성 추출물 또는 pH 12에서 재용해된 pH 6.5-침전된 단백질을 사용하여 제조되었을 경우, 올레오신을 자연스럽게 선택하여 오일 바디 표면을 형성할 수 있게 된다(도 6). 이는 AOB를 제조하기 전에 올레오신 함량을 개선시키기 위해, 침전된 단백질을 추가로 정제할 필요가 없다는 잇점이 있을 것이다.

실시예 4- 산화적 안정성

PL의 부재 및 존재하에 재용해된 pH 6.5 침전된 단백질에 의해 제조된 카놀라 및 참치 오일 AOB의 수성 분산액의 산화적 안정성을 대응하는 오일 및 Tween40 유화제에 의해 제조된 균등량의 에멀젼과 비교하였다. 이 목적을 위해, 에멀젼을 높은 온도(60℃)에서 저장하고, 산화수준을 3개의 다른 방법들, 즉 1차 산화생성물(하이드로퍼옥사이드), 2차 산화생성물(트랜스,트랜스-2,4-헵타디에날) 및 불포화 지방산의 결실물(카놀라에 대하여는 리놀레산 및 참치 오일에 대하여는 DHA)에 의해 측정하였다. AOB 에멀젼의 하이드로퍼옥사이드 수준은 시험된 저장기간내내 대응하는 Tween40 에멀젼의 수준보다 매우 낮았으며, 이는 AOB 에멀젼의 산화적 안정성이 커졌음을 보여준다(데이터는 도시되지 않음).

올레오신 추출물에 의해 제조된 참치오일 에멀젼내 2,4-헵타디에날의 농도는 Tween40에 의해 제조된 것보다 매우 낮았으며, 이는 올레오신 에멀젼의 산화적 안정성이 커졌음을 보여준다(도 7). 이는 카놀라 올레오신의 항산화효과가 카놀라 오일에 제한되지 않을 뿐만 아니라, 참치 오일과 같은 어류 오일까지 확장됨을 보여준다. 이에 대한 또 다른 증거는 지방산 데이터에 의해 제시된다. 카놀라 밀로부터 추출된 올레오신에 의해 제조된 참치 오일 에멀젼의 EPA 및 DHA 함량은 Tween40 에멀젼보다 더 느리게 소실되었으며(도 8), Tween40 에멀젼에 대하여 70% 미만과 대조적으로, 60℃에서 5일후 남은 DHA의 90% 이상 소실되었다.

도 9는 올레오신-안정화된 에멀젼들 및 Tween40-안정화된 에멀젼들의 촉진산화(40℃, 공기중에 노출됨)동안 하이드로퍼옥사이드(PV로 나타냄)의 발생속도를 나타낸다. 촉진산화될 경우, Tween40-안정화된 에멀젼은 10일후 120meq/㎏ 오일의 값에 도달하는 분명한 유도기간없이 급격히 올라가며; PV는 이 지점을 지나서 잠차적으로 감소하며, 이는 하이드로퍼옥사이드의 형성속도가 알데하이드 및 케톤과 같은 2차 산화생성물로의 분해속도 이하로 떨어지기 때문인 것으로 설명될 수 있다. 올레오신-안정화 에멀젼의 PV값은 실험이 종결되는 지점에서 가속되는 30일 후에도 Tween 40-안정화 에멀젼(120meq/㎏)의 PV 최대에 도달하지 않았다. 이 결과는 올레오신-안정화 에멀젼의 산화적 안정성이 Tween-40-안정화 에멀젼 이상으로 우수함을 증명한다.

참치 오일 및 올레오신으로부터 제조된 인조 오일 바디(AOB)는 물에 쉽게 분산되어, 수중 참치오일 에멀젼을 형성한다. 사용된 2차 계면활성제(인지질, 모노글리세라이드 또는 소듐 스테아로일 락틸레이트, SSL)와 무관하게 4℃에서 1주일동안 에멀젼을 저장할 때 분리되지 않았다. 이와 대조적으로, 인지질을 포함하는, 및 포함하지 않는 참치오일 및 Isolexx(카놀라 단백질 분리물)로부터 제조된 에멀젼들은 불안정했으며, 제조후 몇시간이내에 분리되었다. 40℃에서, 소듐 카제이네이트 에멀젼은 1주일후 분리를 나타내지 않는, 가장 안정적이었다. 인지질 또는 SSL을 함유하는 올레오신-안정화 에멀젼은 40℃에서 1주일후에도 실제로 분리되지 않았다.

실시예 5 - 다른 단백질 성분들에 대한 올레오신의 유화 및 항산화 효능

캐나다에서 생성된 카놀라 단백질 분리물이고, 식품-등급 유화제로서 촉진되는, “Isolexx” 뿐만 아니라 유화제로서 널리 사용되는, 소듐 카제이네이트와 비교하였다. 하기 배합물들을 물리적 안정성 및 산화적 안정성에 대하여 시험하였다.

1. 참치 오일 + 인지질

2. 참치 오일 + Isolexx(Canada의 BioExx제 카놀라-계 단백질 유화제)

3. 참치 오일 + Isolexx + 인지질

4. 참치 오일 + 소듐 카제이네이트

참치 오일 오메가-3 지방산의 산화적 분해의 마커로서 트랜스,트랜스,2,4-헵타디에날을 사용하여 산화적 안정성을 비교하기 위해, 촉진산화조건(40℃에서 저장, 공기중에 노출)을 사용하였다. 도 10은 저장중 트랜스,트랜스,2,4-헵타디에날의 발달을 보여준다. 올레오신(+인지질)을 제외한 모든 에멀젼들은 18일이내에 최대 산화에 도달했다. 소듐 카제이네이트 및 Isolexx 에멀젼은 9-10일이내에 3.0ppm의 헵타디에날 농도에 도달한 반면, 올레오신 에멀젼은 소듐 카제이네이트 및 이소렉스와 비교되는 올레오신의 우수한 항산화 특성을 입증하는 24일 후까지 같은 산화수준에 도달하지 않았다.

실시예 6 - 인조 오일 바디 안정성에 대한 2차 계면활성제의 역할

이전의 작업에 기초하여, 올레오신에 더해, 인지질의 존재는 저장시에 응고하지 않은 에멀젼을 제조할 필요가 있었다. 본 발명자들은 이하와 같이, Tween40, 모노글리세라이드 및 SSL에 의해 인지질을 대체하는 에멀젼을 제조함으로써, 인조 에멀젼의 안정성에 대한 인지질의 본질을 조사하였다. 인지질, Tween40, MAG, 및 SSL을 같은 수준으로 사용하였다(1중량% w/w의 오일).

a. 참치 오일 + 올레오신 및 인지질

b. 참치 오일 + 올레오신 및 Tween40

c. 참치 오일 + 올레오신 및 모노글리세라이드

d. 참치 오일 + 올레오신 및 소듐 스테아로일락틸레이트(SSL)

참치 오일 오메가-3 지방산의 산화적 분해의 마커로서, 트랜스,트랜스,2,4-헵타디에날을 사용하여 산화적 안정성을 비교하기 위해, 촉진된 산화조건들(40℃에서 저장됨, 공기중에 노출됨)을 사용하였다. 도 11은 저장동안 에멀젼내에 트랜스,트랜스,2,4-헵타디에날이 발달함을 보여준다. Tween 40, 모노글리세라이드 또는 SSL로 인지질을 대체하는 것이 올레오신-계 인조 오일 바디의 산화적 안정성에 역효과를 미치지 않음을 보여주는 다른 에멀젼들 사이의 헵타디에날 발달 속도에 있어서 큰 차이가 없었다.

광범위하게 설명된 바와 같이, 본 발명의 정신 또는 범주로부터 벗어나지 않으면서 특정 구체예에 나타난 바와 같이, 본 발명을 다양하게 변형 및/또는 변경시킬 수 있음은 본 기술 분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 자명할 것이다. 그러므로, 본 구체예들은 모든 측면에서 설명되며, 제한적이지 않는 것으로 간주된다.

본 출원은 2011년 2월 7일 출원된 AU 2011900383에 우선권을 청구하며, 이의 전문은 이후에 참고문헌으로 통합된다.

본 명세서에 논의되고 및/또는 참고된 모든 공보들은 이후에 전문통합된다.

본 명세서에 포함된 문헌들, 실험들, 재료들, 장치들, 물품들 등에 대한 모든 설명은 전적으로 본 발명의 맥락을 제공하기 위한 것이다. 이러한 문제들중 어느 하나 또는 전부 종래 기술의 일부를 형성하거나, 본 발명과 연관된 분야에서 통상적으로 일반적인 지식이 본 출원의 각 청구항의 우선일 이전에 존재한다고 인정되지 않는다.

참고문헌

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Claims

올레오신, 계면활성제, 및 4개 또는 그 이상의 이중결합들을 갖는 다중불포화 지방산을 포함하는 오일을 포함하는 인조 오일 바디.
제1항에 있어서,
상기 계면활성제는 인지질인 것을 특징으로 하는 인조 오일 바디.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 다중불포화 지방산의 적어도 5%가 4개 또는 그 이상의 이중결합들을 갖는 것을 특징으로 하는 인조 오일 바디.
올레오신, 계면활성제, 및 지방산을 포함하는 오일을 포함하는 인조 오일 바디로서,
상기 계면활성제의 적어도 일부는 인지질이 아닌 인조 오일 바디.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 올레오신은 오일시드 올레오신인 것을 특징으로 하는 인조 오일 바디.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 오일은 수산 오일 및/또는 어류 오일인 것을 특징으로 하는 인조 오일 바디.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 지방산의 적어도 50%는 글리세라이드의 형태로 되어 있는 것을 특징으로 하는 인조 오일 바디.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
인조 오일 바디의 건조 중량 중 적어도 80%는 오일인 것을 특징으로 하는 인조 오일 바디.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
1개 또는 그 이상의 다른 분자들을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 인조 오일 바디.
제9항에 있어서,
다른 분자는 생리활성 분자인 것을 특징으로 하는 인조 오일 바디.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
크기가 약 0.1㎛ 내지 약 100㎛인 것을 특징으로 하는 인조 오일 바디.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 1개 또는 그 이상의 인조 오일 바디 및 캐리어를 포함하는 조성물.
지방산으로부터 유용되는, 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서,
상기 방법은 질환을 갖는 대상자에게 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 1개 또는 그 이상의 인조 오일 바디 및/또는 제12항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
지방산으로부터 유용되는, 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제를 제조하기 위해, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 1개 또는 그 이상의 인조 오일 바디 및/또는 제12항의 조성물을 사용하는 방법.
지방산으로부터 유용되는, 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제로서, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 1개 또는 그 이상의 인조 오일 바디 및/또는 제12항의 조성물을 사용하는 방법.
제13항의 방법 또는 제14항 또는 제15항의 사용방법으로서,
상기 지방산은 4개 또는 그 이상의 이중결합들을 갖는 다중불포화 지방산인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 1개 또는 그 이상의 인조 오일 바디 및/또는 제12항의 조성물을 포함하는 제품.
제17항에 있어서,
제품이 식품 또는 사료제품, 음료제품, 개인생활용품, 약품 또는 공산품인 것을 특징으로 하는 제품.
제17항 또는 제18항에 있어서,
수중유적형 에멀젼이거나, 또는 수중유적형 에멀젼을 포함하는 것을 특징으로 하는 제품.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 1개 또는 그 이상의 인조 오일 바디 및/또는 제12항의 조성물을 제품 제조에 사용하는 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 1개 또는 그 이상의 인조 오일 바디 및/또는 제12항의 조성물을 1개 또는 그 이상의 다른 식용성분과 혼합하는 단계를 포함하는, 사료, 식품 또는 음료를 제조하는 방법.
인조 오일 바디의 제조방법으로서,
상기 방법은
ⅰ) 4개 또는 그 이상의 이중결합들을 갖는 다중불포화 지방산들을 포함하는 오일, 계면활성제 및 올레오신을 얻는 단계, 및
ⅱ) 상기 올레오신, 계면활성제 및 오일을 혼합하여, 인조 오일 바디를 제조하는 단계를 포함하는 방법.
인조 오일 바디의 제조방법으로서,
상기 방법은
ⅰ) 올레오신, 계면활성제 및 지방산을 포함하는 오일을 얻는 단계(상기 계면활성제의 적어도 일부는 인지질이 아님), 및
ⅱ) 상기 올레오신, 계면활성제 및 오일을 혼합하여, 인조 오일 바디를 제조하는 단계를 포함하는 방법.
제22항 또는 제23항에 있어서,
ⅲ) 인조 오일 바디들을 선택하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 ⅰ)는:
a) 올레오신을 포함하는 식물 추출물을 얻는 단계, 및
b) 상기 추출물로부터 단백질을 적어도 부분 정제하는 단계(여기에서, 단백질은 올레오신을 포함함)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제25항에 있어서,
단계 b)는:
1) 상기 추출물의 pH를 적어도 약 11.5의 pH로 조정하는 단계,
2) 1)을 분리하여, 고체 및 액체 상을 생성하고, 액체 상을 선별하는 단계,
3) 액체 상의 pH를 감소시켜, 단백질을 침전시키는 단계,
4) 3)을 분리하여, 고체 및 액체 상을 생성하고, 고체 상을 선별하는 단계, 및
5) 상기 고체 상을 캐리어내에 분산시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
식물 추출물로부터 올레오신을 부분 정제하는 방법으로서,
상기 방법은:
1) 추출물의 pH를 적어도 약 11.5의 pH로 조정하는 단계,
2) 1)을 분리하여, 고체 및 액체 상을 생성하고, 액체 상을 선별하는 단계,
3) 상기 액체 상의 pH를 감소시켜, 단백질을 침전시키는 단계,
4) 3)을 분리하여, 고체 및 액체 상을 생성하고, 고체 상을 선별하는 단계, 및
5) 상기 고체 상을 캐리어 내에 분산시키는 단계를 포함하는 방법.
제26항 또는 제27항에 있어서,
단계 3)은 상기 액체 상의 pH를 약 7 미만으로 감소시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
유기 용매를 사용하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 식물은 오일시드인 것을 특징으로 하는 방법.
제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 추출물은 오일을 추출한 후 생성되는 밀인 것을 특징으로 하는 방법.