KR20140048516A

KR20140048516A - Novel beta-agarase producing gene and transformed bacterial strain using thereof

Info

Publication number: KR20140048516A
Application number: KR1020120114555A
Authority: KR
Inventors: 장용근; 지원재; 홍순광; 송재양
Original assignee: 에스케이이노베이션 주식회사; 한국과학기술원
Priority date: 2012-10-16
Filing date: 2012-10-16
Publication date: 2014-04-24
Also published as: KR101929400B1

Abstract

The present invention relates to a novel beta-agarase gene and a producing method of a beta-agarase using the same. The beta-agarase gene according to the present invention has advantages of directly accumulating a beta-agarase at high concentration when introducing double strains which cannot produce a beta-agarase; and economically mass-producing the beta-agarase.

Description

신규한 베타-아가레이즈 유전자 및 이를 이용한 베타-아가레이즈의 생산방법{Novel beta-agarase producing gene and transformed bacterial strain using thereof}Novel beta-agarase gene and transformed bacterial strain using the same

본 발명은 신규한 베타-아가레이즈 유전자 및 이를 이용한 베타-아가레이즈의 생산방법에 관한 것이다.The present invention relates to a novel beta-agarase gene and a method for producing beta-agarase using the same.

최근 경제 발전과 산업화의 진전이 점점 가속화됨에 따라 유래 없는 고유가 시대를 맞이하고, 화석 연료로 인한 환경 오염 및 지구온난화 방지라는 측면까지 부각되면서 전 세계적으로 화석연료를 대체할 에너지에 대한 관심과 수요가 폭발적으로 증가하고 있다. 이에 따라 바이오연료를 개발하기 위한 연구가 세계적으로 활발하게 진행되고 있으며, 바이오연료가 세계경제의 키워드로 부상하였다.As the recent progress in economic development and industrialization is accelerating, the era of unprecedented high oil prices has come to an end, and the environmental pollution caused by fossil fuels and the prevention of global warming have come to the fore. Thus, interest and demand for energy to replace fossil fuels worldwide It is explosively increasing. As a result, researches for the development of biofuels have been actively conducted worldwide, and biofuels have emerged as a keyword of the world economy.

현재까지는 주로 작물, 목재, 천연섬유 등의 식물 셀룰로오스 자원을 보강재로 이용하는 고분자 복합재료 혹은 이들 자원을 이용한 바이오 연료 제조 연구가 주로 많이 진행되고 있으며, 유럽공동체와 북미에서는 실용화도 상당히 이루어진 상태이다. 그러나 상기 전분질, 목질계통의 바이오매스를 이용하는데 여러 문제점들이 대두되어, 이러한 문제점들을 해결하기 위한 다양한 연구와 새로운 천연자원을 찾기 위한 노력이 꾸준하게 진행되고 있는 가운데 최근 해조류에 관심이 집중되고 있다.Up to now, mainly polymer composite materials using plant cellulosic resources such as crops, woods, and natural fibers as a reinforcing material, or research on biofuel production using these resources, have been widely carried out, and in the European Community and North America, practical use has been considerable. However, various problems have arisen in using the starch and lignocellulosic biomass. As a result of various researches and efforts to find new natural resources to solve these problems, there has been a growing interest in seaweeds.

해조류는 일반적으로 이용되는 에너지 곡물에 비해 연료 생산량이 월등히 높으며, 지구온난화의 주범인 이산화탄소 흡수능이 뛰어나고, 태양광 및 비식용수만을 이용하며, 매우 빠른 속도로 성장이 이루어진다는 장점을 가지고 있다.The seaweeds have the advantage that they produce much higher fuel yield than the commonly used energy grains, have excellent carbon dioxide absorbing ability that is the main cause of global warming, utilize only sunlight and non-edible water, and grow very rapidly.

해조류 중에서도 홍조류는 바다 속에 다량 존재하고 있으나 이용률이 높지 않은 수산자원으로 글루칸(glucan) 20%, 갈락탄(galactan) 60%, 단백질 10%, 기타 10%로 구성되어 있으며, 주로 식용 및 화장품에 사용하거나, 정제하여 연구용 아가 (agar) 또는 아가로오스(agarose)로 사용하여 왔다.Among seaweeds, red algae are abundant in the sea, but are not highly utilized as aquatic resources. They are composed of glucan (20%), galactan (60%), protein (10%) and other 10% Or purified and used as research agar or agarose.

홍조류 바이오매스를 기질로 이용하여 에탄올 발효를 수행할 경우, 구성 성분 중 아가로오스를 효율적으로 당화시킬 수 있는 기술 개발이 최우선적으로 필요한 것이 현실이다.When ethanol fermentation is carried out using red algae biomass as a substrate, it is a reality that development of a technology capable of efficiently saccharifying agarose among constituents is a top priority.

아가(Agar)은 70%의 아가로오스(agarose)와 30%의 아가로팩틴(agaropectin)으로 구성되어 있는 것으로 보고되고 있다. 아가로오스는 갈락토오스(D-galactose)와 3,6-anhydro-L-galactose가 β-1, 4 형태로 결합한 단위체인 아가로바이오스(agarobiose)가 반복되어 α-1, 3 결합으로 연결된 직쇄구조로 되어 있어 있으며, 아가로팩틴의 경우 아가로오스와 같은 구조를 가지고 있으나 그 곁가지(side chain)에 황산기나 포스페이트기(phosphate) 등이 결합하고 있어 겔 화력을 약화시키는 것으로 알려져 있다.Agar is reported to be composed of 70% agarose and 30% agaropectin. Agarose is a linear structure in which galactose (D-galactose) and agarobiose, a unit in which 3,6-anhydro-L-galactose is bonded in the form of β-1 and 4, Agaropathin has a structure similar to that of agarose but is known to weaken the gelation power because sulfate group or phosphate group is bonded to the side chain thereof.

아가로오스(agarose)는 β-1, 4 결합에 작용하는 베타-아가레이즈(β-agarase)를 사용하여 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose)를 거쳐 네오아가로바이오스(neoagarobiose)로 분해되고 계속해서 α-1, 3 결합에 작용하는 알파-네오아가로바이오스 하이드로레이즈(α-neoagarobiose hydrolase)를 사용하여 갈락토오스(D-galactose)와 3,6-anhydro-L-galactose로 분해할 수 있다. 아가로오스를 분해하는 베타-아가레이즈의 경우 아직까지 대량으로 효소를 발현할 수 있는 기술이 충분하지 않은 것이 현실이며, 따라서 우수한 아가레이즈의 유전자원을 확보하고 발현 시스템을 개발하는 것은 매우 가치 있는 일이라고 할 수 있다.Agarose is degraded to neoagarobiose via neoagarotetraose using beta-agarase acting on beta-1, 4 linkage, (D-galactose) and 3,6-anhydro-L-galactose by using α-neoagarobiose hydrolase which acts on α-1,3 bonds. In the case of beta-agarase that degrades agarose, there is not enough technology to express large amounts of enzyme yet. Therefore, it is very valuable to acquire genetic resources of excellent agarase and develop expression system It can be said.

Xiao Ting Fu et al., J microbiology and biotechnology 2009 Mar;19(3):257-64 Xiao Ting Fu et al., J microbiology and biotechnology 2009 Mar; 19 (3): 257-64

본 발명의 목적은 기질로 제공되는 홍조류 바이오매스 내 아가로오스를 효율적으로 당화시킬 수 있는, 신규한 베타-아가레이즈 생산 유전자 및 이를 이용한 베타-아가레이즈의 생산방법을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a novel beta-agarase production gene and a method for producing beta-agarase using the same that can efficiently glycosylate agarose in red algae biomass provided as a substrate.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 베타-아가레이즈를 제공하는 것이다. In order to achieve the above object, the present invention is to provide a beta-agarase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO.

본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 베타-아가레이즈 유전자를 제공하는 것이다.The present invention provides a beta-agarase gene encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.

본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 베타-아가레이즈 유전자 또는 서열번호 3에 기재된 염기서열로 이루어지는 베타-아가레이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.The present invention provides a recombinant vector comprising a beta-agarase gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a beta-agarase gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.

본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 베타-아가레이즈 유전자 또는 서열번호 3에 기재된 염기서열로 이루어지는 베타-아가레이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환 된 형질전환 세포를 제공하는 것이다.The present invention provides a transformed cell transformed with a recombinant vector comprising a beta-agarase gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a beta-agarase gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.

본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 베타-아가레이즈 유전자가 형질전환된 재조합 균주를 배양하는 단계를 포함하는 베타-아가레이즈의 생산방법을 제공하는 것이다. The present invention provides a method for producing beta-agarase, comprising culturing a recombinant strain transformed with a beta-agarase gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

본 발명에 따른 베타-아가레이즈 유전자, 이를 포함하는 재조합 벡터는 베타-아가레이즈를 생산하지 못하는 이종균주의 도입시 베타-아가레이즈를 고농도로 배양액 중에 직접 축적시킬 수 있으며, 베타-아가레이즈를 보다 경제적으로 대량생산할 수 있는 장점이 있다.The beta-agarase gene according to the present invention, the recombinant vector comprising the same can be directly accumulate beta-agarase in a high concentration at the time of introduction of heterologous strains that do not produce beta-agarase in the culture medium, beta-agarase more economical There is an advantage to mass production.

나아가, 이를 이용하여 생산하는 네오아가로바이오스와 네오아가로테트라오스는 이후 완전한 환원당을 얻기 위한 에너지, 의학 및 식품분야에 유용하게 활용될 수 있다.Furthermore, neoagarobios and neoagarotetraoses produced using the same may be usefully used in energy, medicine, and food fields to obtain a complete reducing sugar.

도 1은 알테로모나스(Alteromonas sp.) 균주의 유전자 라이브러리로부터 분리한 아가레이즈 DNA 단편을 도식화한 도면이고,
도 2는 알테로모나스(Alteromonas sp.) 균주의 유전자 라이브러리로부터 분리한 아가레이즈 DNA 단편의 염기서열 보여주는 도면이며,
도 3은 베타-아가레이즈 유전자(AG gene)의 아미노산 서열을 보여주는 도면이고,
도 4는 베타-아가레이즈 유전자(AG gene)의 염기서열을 보여주는 도면이며,
도 5는 베타-아가레이즈 유전자(AG gene)를 포함하고 있는 대장균용 고발현 벡터(pET22b-AG vector)를 도식화한 도면이고,
도 6은 베타-아가레이즈 유전자(AG gene)가 형질전환된 대장균의 배양시 배양온도 및 IPTG 농도에 따른 베타-아가레이즈의 활성을 비교한 결과를 보여주는 도면이며,
도 7은 베타-아가레이즈 유전자(AG gene)가 형질전환된 대장균에서 수득한 베타-아가레이즈를 사용하여 아가로오즈를 분해하고, 이를 TLC(thin-layer chromatography)법을 이용하여 분석한 결과를 보여주는 도면이고,
도 8은 베타-아가레이즈 유전자(AG gene)가 형질전환된 대장균에서 수득한 베타-아가레이즈를 사용하여 아가로오즈를 분해하고, 이를 MS(mass spectrometry)를 이용하여 분석한 결과를 보여주는 도면이다. FIG. 1 is a diagram showing an agarase DNA fragment isolated from a gene library of Alteromonas sp.
2 is a nucleotide sequence of an agarase DNA fragment isolated from a gene library of Alteromonas sp.
FIG. 3 is a view showing an amino acid sequence of a beta-agarase gene (AG gene)
FIG. 4 is a diagram showing the nucleotide sequence of the beta-agarase gene (AG gene)
FIG. 5 is a diagram showing a high expression vector (pET22b-AG vector) for Escherichia coli containing a beta-agarase gene (AG gene)
FIG. 6 is a graph showing the results of comparing the activity of beta-agarase according to the incubation temperature and IPTG concentration in the culture of Escherichia coli transformed with the beta-agarase gene (AG gene)
FIG. 7 shows the results of analysis of agarose by the TLC (thin-layer chromatography) method using beta-agarase obtained in Escherichia coli transformed with the beta-agarase gene (AG gene) FIG.
FIG. 8 is a diagram showing the result of analyzing agarose using beta-agarase obtained from E. coli transformed with a beta-agarase gene (AG gene), and analyzing it using MS (mass spectrometry) .

이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail. Hereinafter, the technical and scientific terms used herein will be understood by those skilled in the art without departing from the scope of the present invention. Descriptions of known functions and configurations that may be unnecessarily blurred are omitted.

본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 베타-아가레이즈를 제공한다. The present invention provides a beta-agarase consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.

본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 베타-아가레이즈 유전자를 제공한다.The present invention provides a beta-agarase gene encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 알테로모나스 (Alteromonas sp.)균주의 유전자 라이브러리를 제작하고, 제작된 라이브러리로부터 베타-아가레이즈 생산에 관여하는 유전자를 분리하였고, 분리된 유전자 중 903bp의 서열번호 3의 염기서열을 갖는 신규한 유전자를 발견하였다. 신규한 유전자는 NCBI에 등재되어 있지 않으며, 기능은 밝혀지지 않았지만 NCBI Blast search를 통해 미생물 유래의 아가레이즈(agarase)들과 높은 상동성을 가지는, 신규한 베타-아가레이즈 유전자였다. According to an embodiment of the present invention, a gene library of Alteromonas sp. Strain was prepared, a gene involved in beta-agarase production was isolated from the prepared library, and a sequence number of 903 bp among the isolated genes. A novel gene with a nucleotide sequence of 3 was found. The novel gene was a novel beta-agarase gene, which is not listed in the NCBI and whose function is unknown but has high homology with microbial agarases through the NCBI Blast search.

본 발명의 일 실시예에 따른 베타-아가레이즈 유전자는 서열번호 3에 기재된 염기서열로 이루어진다. The beta-agarase gene according to an embodiment of the present invention comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3.

본 발명의 일 실시예에 따른 베타-아가레이즈 유전자는 서열번호 3에 기재된 염기서열로 이루어짐에 있어, 유전자 코드의 디제너러시(degeneracy)를 고려하여 서열번호 3에 기재된 염기서열과 80%의 상동성, 바람직하게는 85%의 상동성, 더욱 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 가지는 유전자도 본 발명의 베타-아가레이즈 유전자에 포함된다.The beta-agarase gene according to an embodiment of the present invention comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3. In consideration of the degeneracy of the genetic code, the beta-agarase gene comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 and 80% A gene having homology, preferably 85% homology, more preferably 90% homology, most preferably 95% homology is also included in the beta-agarase gene of the present invention.

본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 베타-아가레이즈 유전자 또는 서열번호 3에 기재된 염기서열로 이루어지는 베타-아가레이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.The present invention provides a recombinant vector comprising a beta-agarase gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a beta-agarase gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 사용가능한 벡터는 특별히 제한되지 않으며, 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 바람직하게는 대장균용 고발현 벡터 pET22b(+) 벡터를 사용할 수 있다. 따라서 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 벡터는 pET22b(+) 벡터에 서열번호 3의 유전자를 삽입시켜 제조한 재조합 pET22b-AG 벡터일 수 있다. According to one embodiment of the present invention, usable vectors are not particularly limited and known expression vectors may be used. Preferably, a high expression vector pET22b (+) vector for Escherichia coli may be used. Therefore, the recombinant vector according to an embodiment of the present invention may be a recombinant pET22b-AG vector prepared by inserting the gene of SEQ ID NO: 3 into the pET22b (+) vector.

본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 벡터에는 발현의 억제 또는 증폭, 또는 유도를 위한 각종의 기능을 가진 발현억제용의 단편이나, 형질전환 세포의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성유전자, 또는, 균체 밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자 등을 또 가진 것도 가능하다.In a recombinant vector according to an embodiment of the present invention, a fragment for inhibiting expression having various functions for inhibiting or amplifying or inducing expression, a gene for resistance to a marker or antibiotic for selection of transformed cells, or It is also possible to have a gene encoding a signal for the purpose of secretion outside the cell.

본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 베타-아가레이즈 유전자 또는 서열번호 3에 기재된 염기서열로 이루어지는 베타-아가레이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환 된 형질전환 균주를 제공한다.The present invention provides a transformed strain transformed with a recombinant vector comprising a beta-agarase gene consisting of a beta-agarase gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 형질전환 균주는 서열번호 3에 기재된 염기서열로 이루어지는 베타-아가레이즈 유전자의 발현을 조절하는 조절 인자의 변형에 의해 또는 유전자의 카피 수의 증가에 의해 그 발현이 증가된 미생물일 수 있다.According to one embodiment of the invention, the transforming strain of the present invention is by modifying a regulatory factor that controls the expression of the beta-agarase gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or by increasing the copy number of the gene It may be a microorganism whose expression is increased.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 형질전환 균주는 알테로모나스 (Alteromonas sp.) 균주로부터 분리된 서열번호 3에 기재된 염기서열로 이루어지는 베타-아가레이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 베타-아가레이즈 생산능을 가지는 미생물일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the transformant of the present invention is transformed with a recombinant vector comprising a beta-agarase gene comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 isolated from Alteromonas sp. May be a microorganism having an ability to produce beta-agarase.

본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환 균주는 대장균, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus sp.), 아스페르길러스 속(Aspergillus sp.), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 속 (Schizosaccharomyces sp.) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)에서 선택되는 1종 이상의 미생물일 수 있다.Transformation strain according to an embodiment of the present invention is E. coli, Bacillus subtilis ( Bacillus subtilis), genus Streptomyces (Streptomyces sp.), Pseudomonas species (Pseudomonas sp.), Proteus Mira Billy's (Proteus such as Staphylococcus sp., Aspergillus sp., Pichia sp. pastoris), Celebi as Saccharomyces My jiae access (Saccharomyces cerevisiae ), Schizosaccharomyces sp., and neurospora crassa .

본 발명의 일 구체예에 따르면, 베타-아가레이즈 생산능을 가지는 미생물은 서열번호 서열번호 3에 기재된 염기서열로 이루어지는 베타-아가레이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 예를 들면 pET22b-AG 벡터로 통상적인 열충격(heat shock) 방법을 이용하여 형질전환 되고, 선별마커인 항생제 암피실린(ampicillin)을 포함하는 배지에서 배양하여 선별될 수 있다. According to one embodiment of the invention, the microorganism having the beta-agarase production ability is conventionally a recombinant vector comprising a beta-agarase gene consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3, for example, pET22b-AG vector It may be transformed using a heat shock method and cultured in a medium containing antibiotic ampicillin, which is a selection marker, and may be selected.

본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 베타-아가레이즈 유전자가 형질전환된 재조합 균주를 배양하는 단계를 포함하는 베타-아가레이즈의 생산방법을 제공한다. The present invention provides a method for producing beta-agarase comprising culturing a recombinant strain transformed with a beta-agarase gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

본 발명의 일 실시예에 따른 베타-아가레이즈의 생산방법은 서열번호 3의 신규한 유전자의 발현이 증가된 베타 베타-아가레이즈 생산능을 갖는 미생물을 배양하는 단계 및 배양액으로부터 베타-아가레이즈를 분리하는 단계를 포함한다.Method for producing beta-agarase according to an embodiment of the present invention comprises the steps of culturing a microorganism having a beta beta-agarase production capacity increased expression of the novel gene of SEQ ID NO: 3 and the beta-agarase from the culture medium Separating.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 미생물은 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지에서 호기성 조건하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양된다. 탄소원으로서는 글루코오스, 프럭토오스, 살균된 전처리 당밀, 즉, 환원당으로 전환된 당밀 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있고, 질소원으로서는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄과 같은 각종 무기질소원 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크, 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 무기화합물로는 인산1수소칼륨, 인산2수소칼륨, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 이외에 필요에 따라 비타민 및 영양요구성 염기 등이 첨가될 수 있다. 배양은 호기적 조건하에서 예를 들면, 진탕배양 또는 통기교반배양에 의해, 10 내지 40℃의 온도 보다 바람직하게는 15 내지 25℃에서 수행될 수 있다. 배지의 pH는 배양하는 동안 pH 6 내지8에서 유지하는 것이 바람직하며, 배양은 0.5 내지 2일 동안 수행할 수 있다.According to one embodiment of the invention, the microorganism is cultured under aerobic conditions in a conventional medium containing a suitable carbon source, nitrogen source, amino acids, vitamins and the like while controlling the temperature, pH and the like. Examples of the carbon source include glucose, fructose, sterilized pretreated molasses, i.e., carbohydrates such as molasses converted to reducing sugar, and nitrogen sources include various inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, and peptones such as NZ- An organic substance such as an extract, a yeast extract, a corn steep liquor, a casein hydrolyzate, a fish or its decomposition product, a defatted soybean cake, or a decomposition product thereof may be used. As the inorganic compound, potassium monohydrogenphosphate, potassium dihydrogenphosphate, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate, calcium carbonate and the like may be used. In addition, vitamins and nutritional essential bases may be added if necessary. The cultivation can be carried out under aerobic conditions, for example, by shaking culturing or aeration agitation culture at a temperature of from 10 to 40 째 C, preferably from 15 to 25 째 C. The pH of the medium is preferably maintained at pH 6 to 8 during the culturing, the culturing can be carried out for 0.5 to 2 days.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are only for illustrating the present invention, the present invention is not limited by these examples.

[[ 실시예Example 1] One] 알테로모나스Alteromonas 균주( Strain AlteromonasAlteromonas spsp .)의 유전자라이브러리 작성.) Genetic library creation

그람 음성(Gram negative)균의 경우에는 유전자 자신의 프로모터로 대장균(E. coli) 내에서 발현 될 수 있는 특성이 있다. 이러한 특성을 이용하여 알테로모나스(Alteromonas sp.) 발현 라이브러리(expression library)를 제작하였다. 균주를 액체배지에서 지수적 증식(exponential growth)까지 키운 후, 균체만을 회수하여 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하였다. 게놈 DNA는 제한효소 HindⅢ를 사용하여 절단하고, 절단된 게놈 DNA는 같은 제한효소로 절단된 pBluescriptⅡ KS plasmid 에 라이게이션(ligation) 하였다. 벡터인 pBluescriptⅡ KS는 분리 후에 제한효소로 자른 후 CIAP(calf intestinal alkaline phosphatase)로 5'인산기(5' phosphate group)를 제거하여 게놈 DNA와의 라이게이션 효율을 높였다. ligation mixture는 E. coli JM109에 형질전환하여 암피실린(ampicillin)이 함유된 LB plate에 도말한 후 37℃에서 하루동안 배양하였다. 콜로니(colony)들 중에서 화이트 콜로니(white colony)만을 새로운 고체배지에 계대하여 유전자라이브러리를 구축하였다.
In the case of Gram negative bacteria, the gene can be expressed in E. coli as a promoter of its own. Using these properties, an expression library of Alteromonas sp. Was constructed. The strain was grown from liquid medium to exponential growth, and only the cells were recovered to extract genomic DNA. Genomic DNA was digested with restriction enzyme Hind III and the digested genomic DNA was ligated to pBluescript II KS plasmid digested with the same restriction enzyme. The vector, pBluescriptII KS, was cut with restriction enzymes after separation, and then removed with 5 'phosphate group (CIAP) using cal intestinal alkaline phosphatase (CIAP) to increase ligation efficiency with genomic DNA. The ligation mixture was transformed into E. coli JM109, plated on LB plate containing ampicillin, and cultured at 37 ° C for one day. A gene library was constructed from only the white colonies in the new solid medium among the colonies.

[ [ 실시예Example 2] 2] 아가레이즈Agarase 유전자의 확보 Securing genes

실시예 1에서 선택된 콜로니들은 루골요오드 용액(Lugol's Iodine solution)으로 염색하여 콜로니 주변에 아가 분해환을 관찰하였다. 환을 형성한 콜로니 만을 선택하여 액체배양 한 후, 플라스미드 DNA(plasmid DNA)를 회수하였다. 회수된 DNA는 여러 종류의 제한효소로 절단 후 제한효소 지도(restriction mapping)로 분석하는 방법을 이용하여 동일한 클론의 유무를 확인하였다. 최종적으로 확보된 DNA 단편내 염기서열분석을 통하여 아가레이즈(agarase) 코드 유전자의 정보를 확인하였다. Colonies selected in Example 1 were stained with Lugol's Iodine solution to observe agar decomposed rings around the colonies. Only the colonies in which the rings were formed were selected and cultured in liquid. Plasmid DNA was recovered. The recovered DNA was digested with several kinds of restriction enzymes and then analyzed by restriction mapping to confirm the presence of the same clone. The information on the agarase coding gene was confirmed through sequencing in the final DNA fragment.

도 1에 도시한 바와 같이, DNA 단편은 총 5062 bp의 크기로 세 개의 ORF를 포함하고 있었다(서열번호 1). 각각 ORF1, ORF2, ORF3로 명명하였다. As shown in FIG. 1, the DNA fragment contained three ORFs with a total size of 5062 bp (SEQ ID NO: 1). Were named ORF1, ORF2, and ORF3, respectively.

ORF1은 도 3에 도시한 바와 같이, 301개의 아미노산을 코드하고 있으며(서열번호 2), 아미노산을 이용하여 NCBI Blast search 검색결과 미생물유래 아가레이즈(agarase)들과 높은 상동성을 나타냈다. ORF2는 Tetratricopeptide repeat family 단백질과 상동성을 보였다. ORF3는 HindⅢ 제한효소에 의해서 잘린 상태로 클로닝 되었는데, 밝혀진 염기서열을 이용하여 추정된 아미노산 서열의 상동성을 검색한 결과 미생물유래의 아가레이즈(agarase)들과 높은 상동성을 나타냈다. As shown in FIG. 3, ORF1 encodes 301 amino acids (SEQ ID NO: 2) and showed high homology with microorganism-derived agarases as a result of NCBI Blast search using amino acids. ORF2 was homologous with the Tetratricopeptide repeat family protein. ORF3 exhibited high homology with Agarase (agarase) of the results derived from a microorganism which was cloned into a truncated state by the restriction enzyme Hind Ⅲ, search for homology with the amino acid sequence estimated using the identified sequences.

따라서 확보된 클론은 온전한 1개의 아가레이즈(ORF1, 이후 AG로 명명함)를 포함하고 있으며, AG(아가레이즈 효소)가 실시예 1의 형질전환체에 대한 아가분해활성에 관여한 것을 확인할 수 있었다.
Thus, it was confirmed that the obtained clone contained one full agarase (ORF1, hereinafter referred to as AG), and AG (agarase enzyme) was involved in the agarase activity of the transformant of Example 1 .

[[ 실시예Example 3] 3] pET22bpET22b -- AGAG 재조합 발현 벡터의 제작 Production of Recombinant Expression Vector

AG 유전자를 클로닝 하기 위하여, 실시예 2의 결과로부터 프라이머를 디자인하여 PCR을 사용하여 베타-아가레이즈 유전자를 확보하였다.In order to clone the AG gene, a primer was designed from the results of Example 2 and PCR was used to obtain a beta-agarase gene.

확보한 한 다음, 제한효소 NdeI과 HindⅢ를 사용하여 37℃에서 1시간 동안 반응한 후 0.7% 아가로스 젤에 전기영동 하여 회수하였다.After securing, the cells were reacted with restriction enzymes Nde I and Hind III at 37 ° C for 1 hour, and recovered by electrophoresis on 0.7% agarose gel.

대장균용 고발현 벡터 pET22b(+)를 역시 제한효소 NdeI과 HindⅢ를 사용하여 37℃에서 1시간 동안 반응한 후, 0.7% 아가로스 젤에 전기영동하여 회수하였다.The high expression vector pET22b (+) for Escherichia coli was also reacted with restriction enzymes Nde I and Hind III at 37 ° C for 1 hour and then recovered by electrophoresis on 0.7% agarose gel.

상기 회수된 유전자 단편들을 T4 DNA ligase로 4℃에서 12시간 이상 처리하여 재조합 발현 벡터를 제작하였다. The recovered gene fragments were treated with T4 DNA ligase at 4 DEG C for at least 12 hours to prepare a recombinant expression vector.

도 4에 도시한 바와 같이, 재조합 발현 벡터 pET22b-AG를 대장균 DH5α에 열충격(heat shock) 방법을 이용하여 형질전환 하였으며, 형질전환된 대장균을 LBA 배지에 접종하여 37℃에서 12시간 이상 배양하였다.As shown in FIG. 4, the recombinant expression vector pET22b-AG was transformed into E. coli DH5α using heat shock method. The transformed E. coli was inoculated on LBA medium and cultured at 37 ° C. for 12 hours or more.

배양된 배양물로부터 균체를 회수한 후, 플라스미드 회수 키트를 사용하여 플라스미드를 회수하고, 최종적으로 제작된 재조합 발현 벡터를 확인하였다.
After recovering the microbial cells from the cultured cultures, the plasmid was recovered using a plasmid recovery kit to confirm the finally produced recombinant expression vector.

[[ 실시예Example 4] 4] 아가레이즈Agarase 생산 유전자의 대장균 Escherichia coli BL21BL21 로의 도입Introduction

실시예 3에서 얻은 베타-아가레이즈 생산 재조합 발현 벡터 pET22b-AG를 대장균 BL21에 열충격(heat shock) 방법을 이용하여 형질전환 하였다. 형질전환된 대장균을 LBA 고체 배지에 접종하여 37℃에서 12시간 이상 배양한 후, 1 mM의 IPTG를 넣어 베타-아가레이즈의 발현을 확인하였다.
The β-agarase-producing recombinant expression vector pET22b-AG obtained in Example 3 was transformed into E. coli BL21 using a heat shock method. The transformed Escherichia coli was inoculated in LBA solid medium and cultured at 37 ° C. for 12 hours or more. Then, 1 mM IPTG was added to confirm the expression of β-agarase.

[[ 실시예Example 5] 5] 아가레이즈Agarase 형질전환 대장균으로부터 From the transformed E. coli 아가레이즈Agarase 발현 최적화 Expression Optimization

실시예 4에서 대장균 BL21에 형질전환한 형질전환체를 LBA 액체 배지, 37℃에서 12시간 정도 시드(seed) 배양을 한 뒤, 플라스크에 배양액을 1% 접종하여 본배양을 실시하였다. In Example 4, the transformant transformed into E. coli BL21 was cultured in an LBA liquid medium at 37 占 폚 for 12 hours, and the culture was inoculated with 1% of the culture solution in the flask.

1차 실험에서 동일한 IPTG 처리시 배양 온도에 따른 아가레이즈 활성을 조사하였다. 본배양 3시간 후에 발현을 위하여 1 mM IPTG를 접종한 이후 플라스크를 각각 18℃, 25℃, 30℃, 37℃에서 6시간 동안 배양한 후 원심분리 하여 세포와 배양액을 분리하였다. 세포는 세척 한 후, 세포 파쇄기(Cell homogenizer)를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 배양액과 세포 파쇄액은 50 mM Tris-Cl(pH 7.0) 버퍼에 0.2% 아가로오스를 녹인 후 1/40을 첨가하여 10분간 40℃에서 반응시킨 후, DNS 용액을 1:1 비율로 섞어 10분간 열처리하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여, 아가레이즈 활성을 측정하였다. In the first experiment, the agarase activity was investigated according to the incubation temperature during the same IPTG treatment. After 3 hours of incubation, 1 mM IPTG was inoculated for expression, and the flask was incubated at 18 ° C, 25 ° C, 30 ° C, and 37 ° C for 6 hours, and then centrifuged to separate the cells and the culture medium. After washing the cells, the cells were disrupted using a cell homogenizer. The culture broth and cell lysate were dissolved in 0.2% agarose in 50 mM Tris-Cl (pH 7.0) buffer, added with 1/40, and incubated for 10 minutes at 40 ° C. The DNS solution was mixed at a ratio of 1: 1 And the absorbance was measured at 540 nm to measure the agarase activity.

또한, 2차 배양에서 IPTG 농도별 처리에 따른 아가레이즈의 활성을 조사하였다. 본배양 3시간 후에 발현을 위하여 각각 1 mM, 0.5 mM, 0.2 mM, 0.1 mM의 IPTG를 첨가한 후 18℃에서 6시간 동안 배양하였다. In addition, the activity of agarase by IPTG treatment was investigated in the secondary culture. After 3 hours of incubation, 1 mM, 0.5 mM, 0.2 mM and 0.1 mM of IPTG were added for expression, respectively, and then cultured at 18 ° C for 6 hours.

도 6에 도시한 바와 같이, 18℃에서 배양한 플라스크에서 가장 높은 아가레이즈 활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다.As shown in FIG. 6, it was confirmed that the highest agarase activity was observed in the flask cultured at 18 ° C.

또한, 0.1 mM IPTG를 첨가한 플라스크에서 가장 높은 아가레이즈 활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
In addition, it was confirmed that the highest agarase activity was observed in the flask containing 0.1 mM IPTG.

[[ 실시예Example 6] 베타- 6] Beta- 아가레이즈를Agarase 사용한 Used 아가로오스의Agarose 분해 decomposition

실시예 5에서 수득된 아가레이즈를 사용하여 아가로오스를 분해하고, 그 분해산물을 분석하였다. The agarase obtained in Example 5 was used to degrade agarose and the degradation product was analyzed.

50 mM Tris-Cl(pH 7.0) 버퍼 400 ml에 1%의 아가로오스를 끓여서 녹인 후, 베타-아가레이즈가 첨가된 배양액을 100 ml 첨가하여 40℃에서 12시간 동안 배양한 후 그 분해 산물을 TLC(thin-layer chromatography)를 이용하여 분석하였다.Agarose was dissolved in 400 ml of 50 mM Tris-Cl (pH 7.0) buffer and incubated at 40 ° C for 12 hours. After the addition of 100 ml of the β-agarase-containing culture solution, TLC (thin-layer chromatography).

도 7에 도시한 바와 같이, 표준샘플로 이용한 갈락토오스와 갈락토바이오스와 비슷한 위치에 분해산물이 보이는 것을 확인할 수 있었다. As shown in Fig. 7, it was confirmed that the degradation product was observed at a position similar to that of galactose and galactobiose used as a standard sample.

이를 다시 MS(mass spectrometry)로 분석하였다.This was again analyzed by mass spectrometry (MS).

도 8에 도시한 바와 같이, 네오아가로바이오스 (neoagarobiose)와 네오아가로테트라오스 (neoagarotetraose)의 분자량과 같은 위치에서 피크가 보임을 확인할 수 있었다. TLC 상에서는 갈락토오스와 네오아가로바이오스의 점이 같은 위치에 보이고, 갈락토바이오스와 네오아가로테트라오스의 점이 같은 위치에 보이는 것으로 보고된 내용을 미루어보아, 실시예 5에서 수득한 베타-아가레이즈의 경우 아가로오스를 분해하여 네오아가로바이오스와 네오아가로테트라오스를 생산하는 것을 확인할 수 있었다. As shown in Figure 8, it can be seen that the peak is seen at the same position as the molecular weight of neoagarobiose (neoagarobiose) and neoagarotetraose (neoagarotetraose). In the case of beta-agarase obtained in Example 5, the TLC shows that the points of galactose and neoagarobiose are shown in the same position, and that the points of galactose and neoagarotetraose are shown in the same position. Decomposing agarose was confirmed to produce neoagarobiose and neoagarotetraose.

<110> SK Innovation Co., Ltd. Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Novel beta-agarase producing gene and transformed bacterial strain using thereof <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5062 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Alteromonas sp. DNA fragment <400> 1 aagcttttcg acgaaagaat gacgtgtgta tttacgcaaa ggtaggcggg tgataatgag 60 ttctatgaaa aaaatggtct atatatttgt ggctgtttca acagctgttg cagcgattcc 120 tttcatcagc aaggccactg aaaaaagttt tgatgttgat gaagcaagcc cattaatgcc 180 atcgtttgtc gcattcgaag atacaacgcc cgccggtatg acatggcaaa aagttgaagc 240 tctttccgat gagtttaatc agtcgtggga cgcgtctaaa tggaaaagat caaattggaa 300 ttattctgac actcctgtga atatggttga tacaaactca ggggtggaga atggctacct 360 ttggattagt gctacgctgg atgattcaac agaagaaagc tggtttaaaa cttcacgggt 420 acattctaaa gcgaaaatta gctttcctat gtacacagaa acacgtttga aagttgcaca 480 catagcggct tataacacat tttggttgaa taatggtgat gcagataatc gagatgaaat 540 tgatattatt gagattaatt ctgatccaac ttgtggggag aatgatgaat atccttggca 600 gatgaattct cagtatttta ttgttaaaaa tggagaaaca gagcgtaata aagggccttg 660 gagcacgaaa aaattatcgg atgccaacac ccgtaaaggc gtgacgtgga accaggacta 720 tcatgtattt ggcgcatggt ggaaagatga acacaatgta cagttttacc tgaatgggga 780 accggcgggt catgtagtga gcagtcagcc tttcacgtta cagcaggagc tgatttggga 840 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180 185 190 Gly Glu Thr Glu Arg Asn Lys Gly Pro Trp Ser Thr Lys Lys Leu Ser 195 200 205 Asp Ala Asn Thr Arg Lys Gly Val Thr Trp Asn Gln Asp Tyr His Val 210 215 220 Phe Gly Ala Trp Trp Lys Asp Glu His Asn Val Gln Phe Tyr Leu Asn 225 230 235 240 Gly Glu Pro Ala Gly His Val Val Ser Ser Gln Pro Phe Thr Leu Gln 245 250 255 Gln Glu Leu Ile Trp Asp Leu Trp Thr Gln Asp Ser Ser Trp Val Cys 260 265 270 Gly Leu Pro Glu Lys Glu Asp Leu Leu Asp His Lys Arg Asn Thr Met 275 280 285 Lys Val Asp Trp Val Arg Thr Trp Lys Leu Val Ser Lys 290 295 300 <210> 3 <211> 906 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> AG gene sequence <400> 3 atgagttcta tgaaaaaaat ggtctatata tttgtggctg tttcaacagc tgttgcagcg 60 attcctttca tcagcaaggc cactgaaaaa agttttgatg ttgatgaagc aagcccatta 120 atgccatcgt ttgtcgcatt cgaagataca acgcccgccg gtatgacatg gcaaaaagtt 180 gaagctcttt ccgatgagtt taatcagtcg tgggacgcgt ctaaatggaa aagatcaaat 240 tggaattatt ctgacactcc tgtgaatatg gttgatacaa actcaggggt ggagaatggc 300 tacctttgga ttagtgctac gctggatgat tcaacagaag aaagctggtt taaaacttca 360 cgggtacatt ctaaagcgaa aattagcttt cctatgtaca cagaaacacg tttgaaagtt 420 gcacacatag cggcttataa cacattttgg ttgaataatg gtgatgcaga taatcgagat 480 gaaattgata ttattgagat taattctgat ccaacttgtg gggagaatga tgaatatcct 540 tggcagatga attctcagta ttttattgtt aaaaatggag aaacagagcg taataaaggg 600 ccttggagca cgaaaaaatt atcggatgcc aacacccgta aaggcgtgac gtggaaccag 660 gactatcatg tatttggcgc atggtggaaa gatgaacaca atgtacagtt ttacctgaat 720 ggggaaccgg cgggtcatgt agtgagcagt cagcctttca cgttacagca ggagctgatt 780 tgggatctct ggacgcaaga cagttcttgg gtttgcggcc tgccagaaaa agaagactta 840 ctagaccata agcgcaatac aatgaaggtt gactgggtta ggacatggaa gttagtgtcc 900 aaataa 906 <110> SK Innovation Co., Ltd. Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Novel beta-agarase producing gene and transformed bacterial strain using <160> 3 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 5062 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Alteromonas sp. DNA fragment <400> 1 aagcttttcg acgaaagaat gacgtgtgta tttacgcaaa ggtaggcggg tgataatgag 60 ttctatgaaa aaaatggtct atatatttgt ggctgtttca acagctgttg cagcgattcc 120 tttcatcagc aaggccactg aaaaaagttt tgatgttgat gaagcaagcc cattaatgcc 180 atcgtttgtc gcattcgaag atacaacgcc cgccggtatg acatggcaaa aagttgaagc 240 tctttccgat gagtttaatc agtcgtggga cgcgtctaaa tggaaaagat caaattggaa 300 ttattctgac actcctgtga atatggttga tacaaactca ggggtggaga atggctacct 360 ttggattagt gctacgctgg atgattcaac agaagaaagc tggtttaaaa cttcacgggt 420 acattctaaa gcgaaaatta gctttcctat gtacacagaa acacgtttga aagttgcaca 480 catagcggct tataacacat tttggttgaa taatggtgat gcagataatc gagatgaaat 540 tgatattatt gagattaatt ctgatccaac ttgtggggag aatgatgaat atccttggca 600 gatgaattct cagtatttta ttgttaaaaa tggagaaaca gagcgtaata aagggccttg 660 gagcacgaaa aaattatcgg atgccaacac ccgtaaaggc gtgacgtgga accaggacta 720 tcatgtattt ggcgcatggt ggaaagatga acacaatgta cagttttacc tgaatgggga 780 accggcgggt catgtagtga gcagtcagcc tttcacgtta cagcaggagc tgatttggga 840 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caaccgaact taggtcaagc tt 5062 <210> 2 <211> 301 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> AG gene amino acid <400> 2 Met Ser Ser Met Lys Lys Met Val Tyr Ile Phe Val Ala Val Ser Thr 1 5 10 15 Ala Val Ala Ile Pro Phe Ile Ser Lys Ala Thr Glu Lys Ser Phe 20 25 30 Asp Val Asp Glu Ala Ser Pro Leu Met Pro Ser Phe Val Ala Phe Glu 35 40 45 Asp Thr Thr Pro Ala Gly Met Thr Trp Gln Lys Val Glu Ala Leu Ser 50 55 60 Asp Glu Phe Asn Gln Ser Trp Asp Ala Ser Lys Trp Lys Arg Ser Asn 65 70 75 80 Trp Asn Tyr Ser Asp Thr Pro Val Asn Met Val Asp Thr Asn Ser Gly 85 90 95 Val Glu Asn Gly Tyr Leu Trp Ile Ser Ala Thr Leu Asp Asp Ser Thr 100 105 110 Glu Glu Ser Trp Phe Lys Thr Ser Arg Val His Ser Lys Ala Lys Ile 115 120 125 Ser Phe Pro Met Tyr Thr Glu Thr Arg Leu Lys Val Ala His Ile Ala 130 135 140 Ala Tyr Asn Thr Phe Trp Leu Asn Asn Gly Asp Ala Asp Asn Arg Asp 145 150 155 160 Glu Ile Asp Ile Ile Glu Ile Asn Ser Asp Pro Thr Cys Gly Glu Asn 165 170 175 Asp Glu Tyr Pro Trp Gln Met Asn Ser Gln Tyr Phe Ile Val Lys Asn 180 185 190 Gly Glu Thr Glu Arg Asn Lys Gly Pro Trp Ser Thr Lys Lys Leu Ser 195 200 205 Asp Ala Asn Thr Arg Lys Gly Val Thr Trp Asn Gln Asp Tyr His Val 210 215 220 Phe Gly Ala Trp Trp Lys Asp Glu His Asn Val Gln Phe Tyr Leu Asn 225 230 235 240 Gly Glu Pro Ala Gly His Val Val Ser Ser Gln Pro Phe Thr Leu Gln 245 250 255 Gln Glu Leu Ile Trp Asp Leu Trp Thr Gln Asp Ser Ser Trp Val Cys 260 265 270 Gly Leu Pro Glu Lys Glu Asp Leu Leu Asp His Lys Arg Asn Thr Met 275 280 285 Lys Val Asp Trp Val Arg Thr Trp Lys Leu Val Ser Lys 290 295 300 <210> 3 <211> 906 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> AG gene sequence <400> 3 atgagttcta tgaaaaaaat ggtctatata tttgtggctg tttcaacagc tgttgcagcg 60 attcctttca tcagcaaggc cactgaaaaa agttttgatg ttgatgaagc aagcccatta 120 atgccatcgt ttgtcgcatt cgaagataca acgcccgccg gtatgacatg gcaaaaagtt 180 gaagctcttt ccgatgagtt taatcagtcg tgggacgcgt ctaaatggaa aagatcaaat 240 tggaattatt ctgacactcc tgtgaatatg gttgatacaa actcaggggt ggagaatggc 300 tacctttgga ttagtgctac gctggatgat tcaacagaag aaagctggtt taaaacttca 360 cgggtacatt ctaaagcgaa aattagcttt cctatgtaca cagaaacacg tttgaaagtt 420 gcacacatag cggcttataa cacattttgg ttgaataatg gtgatgcaga taatcgagat 480 gaaattgata ttattgagat taattctgat ccaacttgtg gggagaatga tgaatatcct 540 tggcagatga attctcagta ttttattgtt aaaaatggag aaacagagcg taataaaggg 600 ccttggagca cgaaaaaatt atcggatgcc aacacccgta aaggcgtgac gtggaaccag 660 gactatcatg tatttggcgc atggtggaaa gatgaacaca atgtacagtt ttacctgaat 720 ggggaaccgg cgggtcatgt agtgagcagt cagcctttca cgttacagca ggagctgatt 780 tgggatctct ggacgcaaga cagttcttgg gtttgcggcc tgccagaaaa agaagactta 840 ctagaccata agcgcaatac aatgaaggtt gactgggtta ggacatggaa gttagtgtcc 900 aaataa 906

Claims

서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 베타-아가레이즈.Beta-agarase which consists of the amino acid sequence of sequence number 2.

서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 베타-아가레이즈 유전자.A beta-agarase gene encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.

제 2항에 있어서,
상기 베타-아가레이즈 유전자는 서열번호 3에 기재된 염기서열로 이루어지는 유전자.3. The method of claim 2,
The beta-agarase gene is a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.

제 2항 또는 제 3항에 따른 베타-아가레이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터.A recombinant vector comprising the beta-agarase gene according to claim 2.

제 4항에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 균주.A transformed strain transformed with the recombinant vector according to claim 4.

제 5항에 있어서,
상기 형질전환 균주는 대장균, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus sp.), 아스페르길러스 속(Aspergillus sp.), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 속 (Schizosaccharomyces sp.) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)에서 선택되는 1종 이상인 형질전환 균주.6. The method of claim 5,
The transforming strain is Escherichia coli, Bacillus subtilis ( Bacillus subtilis), genus Streptomyces (Streptomyces sp.), Pseudomonas species (Pseudomonas sp.), Proteus Mira Billy's (Proteus such as Staphylococcus sp., Aspergillus sp., Pichia sp. pastoris), Celebi as Saccharomyces My jiae access (Saccharomyces cerevisiae ), Schizosaccharomyces sp. and at least one transgenic strain selected from Neurospora crassa .

서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 베타-아가레이즈 유전자로 형질전환된 재조합 균주를 배양하는 단계를 포함하는 베타-아가레이즈의 생산방법.A method for producing beta-agarase, comprising culturing a recombinant strain transformed with a beta-agarase gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

제 7항에 있어서,
상기 베타-아가레이즈 유전자는 서열번호 3에 기재된 염기서열로 이루어지는 생산방법.8. The method of claim 7,
The beta-agarase gene production method consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.

제 7항에 있어서,
상기 배양은 10 내지 40℃에서 수행하는 생산방법.8. The method of claim 7,
The culturing is carried out at 10 to 40 ℃ production method.