KR20140027129A - Ｈｉｖ 입체 구조 인식 항체 유도 펩티드 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, HIV에 대하여 보다 우수한, 혹은, 새로운 중화 항체를 유도할 수 있는 펩티드를 제공하고, 그것에 의하여, HIV 감염증의 예방·치료, 혹은, 그 선택지의 풍부화를 도모하는 것을 목적으로 한다.
해결 방법으로서, 3개의 등가인 링커 구조를 갖는 C3 대칭성을 갖는 템플레이트 화합물을 통해, HIV 입자의 막 관통 단백질 gp41의 C 말단측의 헬릭스 영역 C34 펩티드의 유도체가 3분자 결합해 있는 것을 특징으로 하는 C34의 3량체 영역을 인식하는 HIV 입체 구조 인식 항체 유도 펩티드를 사용하는 것을 특징으로 한다.
해결 방법으로서, 3개의 등가인 링커 구조를 갖는 C3 대칭성을 갖는 템플레이트 화합물을 통해, HIV 입자의 막 관통 단백질 gp41의 C 말단측의 헬릭스 영역 C34 펩티드의 유도체가 3분자 결합해 있는 것을 특징으로 하는 C34의 3량체 영역을 인식하는 HIV 입체 구조 인식 항체 유도 펩티드를 사용하는 것을 특징으로 한다.
Description
본 발명은, HIV(인간 면역 부전 바이러스 : Human Immunodeficiency Virus)의 입체 구조를 인식하는 항체를 유도하는 펩티드, 그 합성 방법, 및 당해 펩티드에 의해 유도된 HIV 입체 구조 인식 항체 또는 당해 펩티드를 유효 성분으로 하는 HIV 감염증의 예방 및/또는 치료제에 관한 것이다. 특히, HIV의 표적 세포 내에의 침입 기구인 HIV 백신의 HIV 입자의 막 관통 단백질 gp41의 C 말단측의 헬릭스 영역 C34와 N36에 의한 6량체의 형성에 대하여, 헬릭스 영역 C34의 3량체 영역에의 작용에 의해, 당해 gp41의 C34와 N36에 의한 6량체 형성을 저해하여, HIV의 표적 세포에의 침입을 저지하는 HIV 입체 구조를 인식하는 항체 유도 펩티드, 그 합성 방법, 및 당해 펩티드에 의해 유도된 HIV 입체 구조 인식 항체 또는 당해 펩티드를 유효 성분으로 하는 HIV 감염증의 예방 및/또는 치료제에 관한 것이다.
후천성 면역 부전 증후군(acquired immunodeficiency syndrome; AIDS)은 1983년 Montagnier L들에 의해 단리·발견된 인간 면역 부전 바이러스(Human Immunodeficiency Virus; HIV)에 의해 야기되는 질환이다(비특허문헌 1 참조). HIV의 기원은, 영장류를 자연 숙주로 하는 원숭이 면역 부전 바이러스(Simian Immunodeficiency Virus; SIV)가, 돌연변이에 의해 인간에의 감염 능력을 획득한 것에 의한 것으로 생각되고 있다. HIV는 공기 감염이 아닌, 주로 성적 감염, 혈액 감염, 모자 감염의 3개의 경로에 의해 감염한다. 성적 감염은 성 분비액이 접촉하는 것이 최대의 원인으로 여겨지고 있고, 혈액 감염은 수혈, 상처, 주사 바늘의 재사용 등이 원인으로 감염이 일어난다. 그 때문에, 윤리적 관점에서의 감염 예방이 필요한 것으로 여겨지고 있다. 또한, 모자 감염은, 출산 시의 산도에 있어서의 체액의 접촉, 모친의 수유, 임신 중에 있어서의 태반을 통한 바이러스의 이동 등이 원인으로 여겨지고 있다.
HIV는, 레트로 바이러스의 일종이며, 특히 인간 CD4 양성 T 세포를 표적으로 하여 감염하는 외래성 바이러스이다(비특허문헌 1 참조). HIV는, 인간 CD4 양성 T 세포에 감염한 후, 비교적 긴 잠복 기간을 거쳐서 활성화하며, 상기한 T 세포를 파괴한다. T 세포는 면역계에 있어서 중요한 역할을 수행하고 있기 때문에, T 세포의 파괴에 의하여, 체내의 면역 능력이 현저하게 저하한다. 그 결과, 정상인 상태이면 간단히 배제할 수 있는 병원체에 대해서도, 충분한 저항력을 발휘할 수 없어져, 만성적인 면역 부전 상태, 즉, 「AIDS 발증」이라 불리는 상태에 빠진다.
전세계의 HIV 감염자 수는, 증가 속도가 완만해지기는 했지만, 이미 3300만 명에 달해 있으며, 2007년의 신규 HIV 감염자 수는 240만명, HIV에 관련된 사망자 수는 200만명이었다(비특허문헌 2 참조). 특히, 세계 최대의 인구를 갖는 아시아에서는, HIV의 감염 확대가 급속하다. 일본도 그 예외가 아니며, 선진국 중에서는 이례적이지만, 증가의 일로를 걷고 있다. 구체적으로는, 2007년에는 AIDS 환자 수가 418명, HIV 감염자 수가 1082명으로 되어, 처음으로 1000명을 초과하여 현재도 제동이 걸리지 않은 것이 일본의 현상황이다(비특허문헌 3 참조). 그러나, HIV는 그 발견 당시부터 왕성하게 연구가 행해져, 현재에 이르기까지 25년 동안에, 감염증의 진단법의 확립, 또한 치료법에 대해서도, 다른 감염증과 비교하여 압도적인 진보를 보이고 있다(비특허문헌 4 및 5 참조). 치료약에 관한 그 정력적인 연구 개발에 의하여, AIDS는 직접 죽음에 이르는 병이 아니게 되었다. 그러나, 근본적인 치료법은 아직 확립되어 있지 않으며, 새로운 문제점도 출현하고 있다. 그 때문에 신규인 치료약이 요망되고 있다.
HIV는, 표적 세포에 결합하기 위하여 필요한 gp120, gp41이라 불리는 외피 단백질을, 숙주 세포 유래의 바이러스막 위에 갖고 있다. 바이러스막의 내부에는 보강 단백질로서 매트릭스(Matrix) 단백질이 존재하며, 이에 따라 HIV의 구조가 유지되어 있다. 또한, HIV의 핵양체(核樣體)는 캡시드(Capsid) 단백질에 둘러싸인 정12면체 구조를 하고 있으며, 그 내부에 RNA 게놈, 인테그라제(integrase; IN), 프로테아제(protease; PR), 역전사 효소(reverse transcriptase; RT)를 포함하고 있다(도 1). HIV의 RNA 게놈은, 약 9000bp이며, 그 유전자군은 말단 반복 서열(long terminal repeat; LTR)이라 불리는 구조에 끼워져서 존재하고 있다. 이 유전자에 코드되는 수십 종류의 바이러스 단백질이 복잡한 복제를 제어하고 있다(비특허문헌 4 및 5 참조).
HIV의 표적 세포에의 침입으로부터 출아까지의 일련의 증식 사이클을 라이프사이클이라 한다. 이 라이프사이클은 이하의 [1]∼[6]의 각 단계, 즉, [1]바이러스의 세포막에의 흡착·막 융합, [2]RNA 게놈의 역전사, [3]바이러스 DNA의 숙주 염색체에의 도입과 복제, [4]바이러스 구성 단백질의 프로세싱, [5]바이러스 입자의 구축, [6]출아의 과정으로 나뉘어지며, HIV는 이들 과정을 거쳐서 증식해 간다(도 2 참조)(비특허문헌 4∼7 참조).
1985년에 최초의 항(抵)HIV약으로서 개발된 아지드티미딘(AZT)은, 역전사 효소의 경합 저해약이며, 상기한 라이프사이클을 저해함에 의해, HIV의 증식을 억제하는 약제이다. 이 AZT가 개발된 이후, HIV의 라이프사이클이 보다 상세히 밝혀졌으며, 항HIV약의 개발도 비약적으로 진행되어 왔다(비특허문헌 8 및 9 참조). 그 결과, 현재에는 임상 응용되고 있는 항HIV약은 15종류 이상에 달하며, 작용기서(作用機序)가 다른 항HIV약을 병용하는 고효능 항레트로바이러스 치료요법(Highly Active Anti Retroviral Therapy; HAART)가 가능해졌다. 이 HAART는, 현재, HIV 감염자 및 AIDS 환자 치료의 주류로 되어 있으며, 일정한 효과를 거두고 있다. 그러나, 체내 바이러스량을 계속해서 극력 억제하기 위해서는, 장기에 걸친 약제의 투여가 필요해지며, 그 결과 약제 내성주(耐性株)의 출현, 중대한 부작용, 또한 고액인 치료 비용이 필요하다는 문제점도 있다. 특히 약제 내성 바이러스의 출현은 심각하다. 약제 내성 바이러스의 출현의 원인으로서는, 약제의 장기 복용 외, HIV는 DNA 폴리머라제와 같은 DNA의 수복 기구를 갖지 않기 때문에, 변이를 일으키기 매우 쉬운(이변이성(易變異性)) 것을 들 수 있다.
그래서, 치료비의 부담이 가벼우며, 또한 내성 HIV 바이러스에도 유효한 HIV 감염증의 예방제·치료제의 개발이 요망되고 있다. 전술한 HIV의 라이프사이클의 [1]「바이러스의 세포막에의 흡착·막 융합」에 착안한 HIV 감염증의 예방·치료제의 후보로서, HIV의 외피 단백질인 gp120이나 gp41을 타깃으로 한 것의 개발이 진척되어 있다. gp120이나 gp41은, HIV가 숙주 세포에 침입할 때의 막 융합에 관여한다. 감염 전에는 gp41은 그 대부분이 gp120에 의해 뒤덮여 있지만(도 3의 좌측 도면 참조), 감염 시에는 노출한다(도 3의 우측 도면 참조). gp41의 N 말단측 영역은 N36, C 말단측 영역은 C34라 불리며, N36과 C34는 각각 3량체 구조를 형성하고 있다. HIV의 숙주 세포와의 막 융합의 기구를 도 4에 나타낸다. HIV는 숙주 세포에 침입할 때, 우선, gp120이 숙주 세포의 CD4에 결합하고, 다음으로 코리셉터(Coreceptor)와 결합한다. 그 후, gp41이 숙주 세포에 박혀, 입체 구조 변화를 일으킨다. 그리고 3개의 N36을 3개의 C34가 외측으로부터 둘러싸도록 결합하여, 합계 6개의 펩티드쇄가 회합한 6-헬릭스 다발(6-helical bundle)을 형성함에 의해, HIV 막과 숙주 세포의 막이 접근하여, 막 융합이 성립한다(도 4 참조).
HIV의 이러한 침입 기구에 의거하여, gp120이나 gp41을 표적으로 하며, 또한 항HIV 활성을 갖는 항체가 몇 가지 유도되어 있다. 현재, gp41에 대한 항체로서 2F5 항체(비특허문헌 10∼13)와 4E10 항체(비특허문헌 12∼14) 등이, 또한 gp120에 대한 항체로서 2G12 항체(비특허문헌 15)와 b12 항체(비특허문헌 16) 등이, 비교적 강한 항HIV 활성(HIV 중화 활성)을 나타내는 인간 모노클로널 항체로서 발견되어 있다. 또한, 특허문헌 1에는, gp120에 대한 항체를, HIV의 감염을 저지하기 위해서나, HIV의 라이프사이클에 필수인 단계를 불활성화시키기 위하여 사용하는 것이 기재되어 있다. 그러나, HIV 게놈은 현저하게 이변이성인 때문인지, 전술한 항체는 어느 특정의 HIV주(株)에 대하여 항HIV 활성을 나타냈지만, 그 이외의 주에 대해서는 그다지 항HIV 활성을 나타내지 못했으므로, 현재의 시점에서 임상 응용에까지는 이르러 있지 못하다.
또한, 본 발명자들은, 지금까지, gp41의 C34 펩티드와 상호 작용하는 N36 펩티드의 3량체 구조를 특이적으로 인식하는 중화 항체를 유도하는 펩티드 항원의 합성에 성공해 있다(특허문헌 2). 이 펩티드 항원은, 3개의 등가인 링커 구조를 갖는 C3 대칭성을 갖는 템플레이트 화합물의 각각의 링커 구조에, N36 펩티드의 유도체가 1개씩 결합한 항원 분자이다. 이 N36 펩티드 3량체 항원을 사용하여 유도한 중화 항체는, N36 펩티드 단량체를 사용하여 유도한 중화 항체와 비교해서, N36 펩티드 3량체에 대한 특이성이 높고, 항HIV 활성도 3배 높았다. 전술한 특허문헌 2에 있어서의 N36 펩티드 3량체 항원에 의해 유도된 항체는, N36 펩티드의 3량체에 특이적으로 결합하여, N36 펩티드와 C34 펩티드에 의한 6-헬릭스 다발 형성을 저해함에 의해, HIV 막 융합을 저해하는 것으로 생각된다. 또한, 임상 시험이 행해진 기지(旣知)의 항HIV 활성 펩티드로서, C34 펩티드 유도체 단량체 퓨전(fuzeon)(T-20/DP178)이 알려져 있다(비특허문헌 17).
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HIV 백신의 개발에 있어서는 지금까지의 감염증에 대하여 유효했던 약독화(弱毒化) 백신, 생(生)백신과 같은 방법이 HIV의 이변이성으로 인해 위험시된 경우도 있어 사용할 수 없다는 문제가 있고, 또한 통상 항체 유도를 행할 때에는, 그 단백질에 있어서의 부분 서열을 합성하고 그 서열 특이적인 항체를 유도하는 것을 목적으로 하고 있지만, 부분 서열을 사용하여 유도된 항체는 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있지만, 중화 표적의 입체 구조에 대한 특이성이나 결합 활성이 대체로 낮다는 문제가 있다. 이렇게 변이가 심한 HIV에 대해서도 문제를 일으키지 않고 사용할 수 있으며, 또한, HIV의 표적 세포에의 침입 기구로서의 중화 표적의 입체 구조에 대한 특이성이나 결합 활성에 있어서도 우수한 특이성 및 결합 활성을 갖는 항체, 혹은 백신 등의 HIV 감염증의 예방·치료제의 개발에 유효한 HIV 항체 유도 펩티드가 요구되고 있다. 이러한 펩티드로서, 본 발명자들은, 지금까지, HIV의 gp41의 N36 펩티드의 3량체 구조를 특이적으로 인식하는 중화 항체를 유도하는 펩티드 항원의 개발을 행했다(특허문헌 2 참조).
그러나, HIV에 대하여 보다 우수한, 혹은, 새로운 중화 항체를 유도할 수 있는 펩티드가, HIV 감염증의 예방·치료를 위하여, 혹은, 예방·치료의 선택지의 풍부화를 위하여 요구되고 있다.
본 발명자는, 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 검토하던 중에, gp41의 헬릭스 영역 중에서도 중요한 C34라 불리는 부분의 3량체를 화학 합성하여, HIV 입체 구조 인식 항체 유도 펩티드로서 사용함에 의해, 항HIV 활성이나 HIV 감염에 대한 중화 활성이 우수한 항체를 유도할 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은, [1]HIV 입자의 막 관통 단백질 gp41의 C 말단측의 헬릭스 영역 C34 펩티드의 유도체를 합성하는 공정, 및 3개의 등가인 링커 구조를 갖는 C3 대칭성을 갖는 템플레이트 화합물과, 전술한 C34 펩티드의 유도체를 결합함에 의해, C34 펩티드의 유도체의 3량체를 합성하는 공정으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 C34의 3량체 영역을 인식하는 HIV 입체 구조 인식 항체 유도 펩티드의 합성 방법이나, [2]HIV 입자의 막 관통 단백질 gp41의 C 말단측의 헬릭스 영역 C34 펩티드의 유도체를 합성하는 공정에 있어서의 C34 펩티드의 유도체가, C34의 천연의 서열인 C34 펩티드의 C 말단측에, 템플레이트 화합물과 결합하기 위하여 필요한 라이게이션 부위를 도입하고, 당해 C34 펩티드의 서열과 당해 라이게이션 부위와의 사이에는 입체 장해에 의한 반응성의 경감을 방지하기 위하여 스페이서 아미노산 잔기를 도입한 것임을 특징으로 하는 상기 [1]에 기재된 HIV 입체 구조 인식 항체 유도 펩티드의 합성 방법이나, [3]3개의 등가인 링커 구조를 갖는 C3 대칭성을 갖는 템플레이트 화합물로서, 하기 일반식(1)으로 표시되는 화합물 또는 그 염을 사용하는 것을 특징으로 하는 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 HIV 입체 구조 인식 항체 유도 펩티드의 합성 방법이나,
(식 중, X는 양의 정수를 나타냄)
[4]3개의 등가인 링커 구조를 갖는 C3 대칭성을 갖는 템플레이트 화합물로서, 하기 일반식(2)으로 표시되는 화합물 또는 그 염을 사용하는 것을 특징으로 하는 상기 [3]에 기재된 HIV 입체 구조 인식 항체 유도 펩티드의 합성 방법이나,
[5]HIV 입자의 막 관통 단백질 gp41의 C 말단측의 헬릭스 영역 C34 펩티드의 유도체를 합성하는 공정에 있어서의 C34 펩티드의 유도체가, C34 펩티드의 C 말단측에 친수성 아미노산 잔기를 부여하고, 또한, 그 C 말단측에 라이게이션 부위를 도입하고, 당해 친수성 아미노산 잔기와 당해 라이게이션 부위와의 사이에는 입체 장해에 의한 반응성의 경감을 방지하기 위하여 스페이서 아미노산 잔기를 도입한 것임을 특징으로 하는 상기 [1]에 기재된 HIV 입체 구조 인식 항체 유도 펩티드의 합성 방법이나, [6]HIV 입자의 막 관통 단백질 gp41의 C 말단측의 헬릭스 영역 C34 펩티드의 유도체를 합성하는 공정에 있어서의 C34 펩티드의 유도체가, 하기 일반식(3)으로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 상기 [5]에 기재된 HIV 입체 구조 인식 항체 유도 펩티드의 합성 방법이나,
[7]3개의 등가인 링커 구조를 갖는 C3 대칭성을 갖는 템플레이트 화합물과, 전술한 C34 펩티드의 유도체를 결합함에 의해, C34 펩티드의 유도체의 3량체를 합성하는 공정이, 3개의 등가인 링커 구조를 갖는 C3 대칭성을 갖는 템플레이트 화합물과, C34 펩티드의 유도체를, 완충액 중에서 교반함에 의해, 3개의 등가인 링커 구조를 갖는 C3 대칭성을 갖는 템플레이트 화합물과, 전술한 C34 펩티드의 유도체를 결합시켜서, C34 펩티드의 유도체의 3량체를 합성하는 것을 특징으로 하는 상기 [1]∼[6] 중 어느 하나에 기재된 HIV 입체 구조 인식 항체 유도 펩티드의 합성 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, [8]상기 [1]∼[7] 중 어느 하나에 기재된 합성 방법에 의해 합성되는 것을 특징으로 하는 HIV 입자의 막 관통 단백질 gp41의 C 말단측의 헬릭스 영역 C34의 3량체 영역을 인식하는 HIV 입체 구조 인식 항체 유도 펩티드나, [9]3개의 등가인 링커 구조를 갖는 C3 대칭성을 갖는 템플레이트 화합물을 통해, HIV 입자의 막 관통 단백질 gp41의 C 말단측의 헬릭스 영역 C34 펩티드의 유도체가 3분자 결합해 있는 것을 특징으로 하는 C34의 3량체 영역을 인식하는 HIV 입체 구조 인식 항체 유도 펩티드나, [10]하기 일반식(4)으로 표시되는 화합물 또는 그 염으로 이루어지는 상기 [8] 또는 [9]에 기재된 HIV 입체 구조 인식 항체 유도 펩티드
(식 중, X는 양의 정수를 나타내고, 단량체는 하기 일반식(5)으로 표시되는 화합물을 나타냄).
에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, [11]상기 [8]∼[10] 중 어느 하나에 기재된 C34의 3량체 영역을 인식하는 HIV 입체 구조 인식 항체 유도 펩티드를 사용하여 숙주 동물을 감작(感作)하여, 당해 펩티드에 대한 항체를 유도하는 것을 특징으로 하는 C34의 3량체 영역을 인식하는 HIV 입체 구조 인식 항체의 유도 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, [12]상기 [8]∼[10] 중 어느 하나에 기재된 펩티드의 C34의 3량체 영역을 인식하는 HIV 입체 구조 인식 항체, 또는, 상기 [8]∼[10] 중 어느 하나에 기재된 펩티드를 유효 성분으로 하는, HIV 감염증의 예방 및/또는 치료제나, [13]HIV 감염증의 예방 및/또는 치료가, 상기 [8]∼[10] 중 어느 하나에 기재된 펩티드의 항HIV 활성에 의한 것임을 특징으로 하는 상기 [12]에 기재된 HIV 감염증의 예방 및/또는 치료제나, [14]HIV 감염증의 예방 및/또는 치료가, HIV 입체 구조 인식 항체의, HIV 입자의 막 관통 단백질 gp41의 C 말단측의 헬릭스 영역 C34의 3량체 영역에의 작용에 의하여, gp41의 C34와 N36에 의한 6량체 형성을 저해해서, HIV의 표적 세포에의 침입을 저지하는 것임을 특징으로 하는 상기 [12]에 기재된 HIV 감염증의 예방 및/또는 치료제나, [15]상기 [8]∼[10] 중 어느 하나에 기재된 펩티드를 유효 성분으로 하는 HIV 감염증의 예방 및/또는 치료용 백신인 것을 특징으로 하는 상기 [12]에 기재된 HIV 감염증의 예방 및/또는 치료제에 관한 것이다.
본 발명에 의하여, HIV의 표적 세포에의 침입 기구로서의 중화 표적의 입체 구조에 대하여 우수한 특이성 및 결합 활성을 갖는 항체 혹은 백신의 개발에 유효한 HIV 항체 유도 펩티드를 제공할 수 있다. 당해 HIV 항체 유도 펩티드의 제공에 의하여, HIV 입체 구조 인식 항체나 백신의 제조가 가능해져, 당해 펩티드, 당해 백신 혹은 HIV 입체 구조 인식 항체를 유효 성분으로 하는 HIV 감염증의 예방 및/또는 치료제를 제공할 수 있다. HIV 백신의 개발에 있어서는 지금까지의 감염증에 대하여 유효했던 약독화 백신, 생백신과 같은 방법이 HIV의 이변이성으로 인하여 위험시된 경우도 있어 사용할 수 없다는 문제가 있었지만, 본 발명의 HIV 항체 유도 펩티드는, 변이가 심한 HIV를 표적으로 하는 아미노산 서열뿐만 아니라, HIV의 표적 세포에의 침입 기구로서의 중화 표적의 입체 구조에 대한 특이성이나 결합 활성을 갖는 항체 혹은 백신의 개발에 유효한 HIV 항체 유도 펩티드를 제공하는 것이므로, 상기와 같은 종래의 HIV 백신의 개발에 있어서의 문제를 해결해서, HIV 감염증에 대하여, 안전하며 또한 유효한 HIV 항체나 HIV 백신을 제공할 수 있고, HIV 감염증에 대하여, 안전하며 또한 유효한 HIV 감염증의 예방 및/또는 치료제를 제공할 수 있다.
또한, 특허문헌 2에 있어서의 N36 펩티드 유도체의 경우, 그 3량체의 항HIV 활성은, 그 단량체에 비하여 3배 높은 정도인 것에 대하여, 본 발명에 있어서의 C34 펩티드 유도체의 경우, 그 3량체의 항HIV 활성은, 그 단량체에 비하여 20배∼100배나 향상한다. 따라서, 본 발명의 HIV 항체 유도 펩티드를 유효 성분으로 하는 HIV 감염증의 예방 및/또는 치료제는, 펩티드 그 자체가 높은 항HIV 활성을 나타내므로, 항체 유도를 통하지 않은 상황, 예를 들면 항체가 유도되기 전부터, 그 효과를 발휘할 수 있다.
도 1은 HIV의 모식도를 나타내는 도면.
도 2는 HIV의 라이프사이클을 나타내는 도면.
도 3은 HIV의 외피 단백질을 나타내는 도면.
도 4는 HIV 막 융합의 기구를 나타내는 도면.
도 5는 네이티브 케미칼 라이게이션 반응의 개요를 나타내는 도면.
도 6은 C34 펩티드 유도체 3량체(C34 Trimer)의 형성 기구를 나타내는 도면.
도 7은 C34 펩티드 유도체 3량체(C34 Trimer)의 디자인을 나타내는 도면.
도 8은 C34 펩티드 유도체 1(C34 유도체 1)의 합성에 관한 도면.
도 9는 C34 펩티드 유도체 2(C34 유도체 2)의 합성에 관한 도면.
도 10은 템플레이트 화합물의 합성에 관한 도면.
도 11은 템플레이트 화합물의 합성 스킴을 나타내는 도면.
도 12는 C34 펩티드 유도체 3량체(C34 Trimer) 형성의 반응 경과를 나타내는 도면.
도 13은 C34 펩티드 유도체 3량체(C34 Trimer)의 합성에 관한 도면.
도 14는 C34 펩티드 유도체 3량체(C34 Trimer)의 2차 구조 해석의 결과를 나타내는 도면. 도 14의 (A) 중의 실선은, C34 펩티드 유도체 3량체의 CD 스펙트럼을 나타내고, 도 14의 (A) 중의 파선은, C34 펩티드 유도체 단량체의 CD 스펙트럼을 나타낸다. 도 14의 (B) 중의 파선은, C34 펩티드 유도체 단량체와 N36 펩티드 유도체 단량체와의 혼합물의 CD 스펙트럼을 나타내고, 도 14의 (B) 중의 실선은, C34 펩티드 유도체 3량체와 N36 펩티드 유도체 단량체와의 혼합물의 CD 스펙트럼을 나타내고, 도 14의 (B) 중의 점선은, N36 펩티드 유도체 단량체의 CD 스펙트럼을 나타낸다.
도 15는 C34 펩티드 유도체 3량체(C34 Trimer) 등을 면역해서 얻어진 혈청의 항체값을 나타내는 도면. 도 15의 (A)에는, 마이크로 플레이트에 C34 펩티드 유도체 단량체를 코팅했을 경우의 결과를 나타내고, 도 15의 (B)에는, 마이크로 플레이트에 C34 펩티드 유도체 3량체를 코팅했을 경우의 결과를 나타낸다. 또한, 도 15의 (A) 및 (B)의 그래프 중의 검은 네모는, C34 펩티드 유도체 단량체로 유도해서 얻어진 혈청을 사용했을 경우의 결과를 나타내고, 검은 동그라미는, C34 펩티드 유도체 3량체로 유도해서 얻어진 혈청을 사용했을 경우의 결과를 나타낸다.
도 16은 C34 펩티드 유도체 3량체로 유도된 항혈청의 HIV 감염에 대한 중화 활성을 나타내는 도면. "uninf."는, 비감염 세포의 경우의 결과를 나타내고, "cr1"∼"cr3"은, 면역하기 1주일 전의 혈청(컨트롤)을 사용했을 경우의 결과를 나타내고, "m1"∼"m3"은, C34 펩티드 유도체 단량체로 유도된 혈청을 사용했을 경우의 결과를 나타내고, "t1"∼"t3"은, C34 펩티드 유도체 3량체로 유도된 혈청을 사용했을 경우의 결과를 나타낸다.
도 17은 C34 펩티드 유도체 3량체의 HIV 감염에 대한 항HIV 활성을 나타내는 도면. "C34"는, C34천연 펩티드 단량체를 사용했을 경우의 결과를 나타내고, "C34 REG"는, C34 펩티드 유도체 단량체를 사용했을 경우의 결과를 나타내고, "triC34 e"는, C34 펩티드 유도체 3량체를 사용했을 경우의 결과를 나타낸다. 가로축은, 각 펩티드의 농도(μM)를 나타내고, 세로축은 각 경우에 있어서의 p24량(ng/㎖)을 나타낸다.
도 2는 HIV의 라이프사이클을 나타내는 도면.
도 3은 HIV의 외피 단백질을 나타내는 도면.
도 4는 HIV 막 융합의 기구를 나타내는 도면.
도 5는 네이티브 케미칼 라이게이션 반응의 개요를 나타내는 도면.
도 6은 C34 펩티드 유도체 3량체(C34 Trimer)의 형성 기구를 나타내는 도면.
도 7은 C34 펩티드 유도체 3량체(C34 Trimer)의 디자인을 나타내는 도면.
도 8은 C34 펩티드 유도체 1(C34 유도체 1)의 합성에 관한 도면.
도 9는 C34 펩티드 유도체 2(C34 유도체 2)의 합성에 관한 도면.
도 10은 템플레이트 화합물의 합성에 관한 도면.
도 11은 템플레이트 화합물의 합성 스킴을 나타내는 도면.
도 12는 C34 펩티드 유도체 3량체(C34 Trimer) 형성의 반응 경과를 나타내는 도면.
도 13은 C34 펩티드 유도체 3량체(C34 Trimer)의 합성에 관한 도면.
도 14는 C34 펩티드 유도체 3량체(C34 Trimer)의 2차 구조 해석의 결과를 나타내는 도면. 도 14의 (A) 중의 실선은, C34 펩티드 유도체 3량체의 CD 스펙트럼을 나타내고, 도 14의 (A) 중의 파선은, C34 펩티드 유도체 단량체의 CD 스펙트럼을 나타낸다. 도 14의 (B) 중의 파선은, C34 펩티드 유도체 단량체와 N36 펩티드 유도체 단량체와의 혼합물의 CD 스펙트럼을 나타내고, 도 14의 (B) 중의 실선은, C34 펩티드 유도체 3량체와 N36 펩티드 유도체 단량체와의 혼합물의 CD 스펙트럼을 나타내고, 도 14의 (B) 중의 점선은, N36 펩티드 유도체 단량체의 CD 스펙트럼을 나타낸다.
도 15는 C34 펩티드 유도체 3량체(C34 Trimer) 등을 면역해서 얻어진 혈청의 항체값을 나타내는 도면. 도 15의 (A)에는, 마이크로 플레이트에 C34 펩티드 유도체 단량체를 코팅했을 경우의 결과를 나타내고, 도 15의 (B)에는, 마이크로 플레이트에 C34 펩티드 유도체 3량체를 코팅했을 경우의 결과를 나타낸다. 또한, 도 15의 (A) 및 (B)의 그래프 중의 검은 네모는, C34 펩티드 유도체 단량체로 유도해서 얻어진 혈청을 사용했을 경우의 결과를 나타내고, 검은 동그라미는, C34 펩티드 유도체 3량체로 유도해서 얻어진 혈청을 사용했을 경우의 결과를 나타낸다.
도 16은 C34 펩티드 유도체 3량체로 유도된 항혈청의 HIV 감염에 대한 중화 활성을 나타내는 도면. "uninf."는, 비감염 세포의 경우의 결과를 나타내고, "cr1"∼"cr3"은, 면역하기 1주일 전의 혈청(컨트롤)을 사용했을 경우의 결과를 나타내고, "m1"∼"m3"은, C34 펩티드 유도체 단량체로 유도된 혈청을 사용했을 경우의 결과를 나타내고, "t1"∼"t3"은, C34 펩티드 유도체 3량체로 유도된 혈청을 사용했을 경우의 결과를 나타낸다.
도 17은 C34 펩티드 유도체 3량체의 HIV 감염에 대한 항HIV 활성을 나타내는 도면. "C34"는, C34천연 펩티드 단량체를 사용했을 경우의 결과를 나타내고, "C34 REG"는, C34 펩티드 유도체 단량체를 사용했을 경우의 결과를 나타내고, "triC34 e"는, C34 펩티드 유도체 3량체를 사용했을 경우의 결과를 나타낸다. 가로축은, 각 펩티드의 농도(μM)를 나타내고, 세로축은 각 경우에 있어서의 p24량(ng/㎖)을 나타낸다.
1. HIV 입체 구조 인식 항체 유도 펩티드의 합성 방법
본 발명의 HIV 입체 구조 인식 항체 유도 펩티드의 합성 방법(이하, 간단히 「본 발명의 펩티드의 합성 방법」이라고도 표시함)은, HIV 입자의 막 관통 단백질 gp41의 C 말단측의 헬릭스 영역 C34 펩티드의 유도체(이하, 간단히 「C34 펩티드 유도체」라고도 표시함)을 합성하는 공정, 및 3개의 등가인 링커 구조를 갖는 C3 대칭성을 갖는 템플레이트 화합물(이하, 간단히 「본 발명에 있어서의 템플레이트 화합물」이라고도 표시함)과, 전술한 C34 펩티드 유도체를 결합함에 의해, C34 펩티드 유도체의 3량체를 합성하는 공정으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 C34의 3량체 영역을 인식하는 HIV 입체 구조 인식 항체 유도 펩티드를 합성하는 방법으로 이루어진다.
본 발명에 있어서의 C34 펩티드 유도체란, C34 펩티드의 아미노산 서열(서열 번호 1)에 있어서, 1 또는 2개 이상(바람직하게는 2∼15개, 보다 바람직하게는 2∼10개, 더 바람직하게는 2∼5개)의 아미노산이 치환, 결실(缺失), 삽입된 아미노산 서열로 이루어지며, 또한, HIV 입체 구조 인식 항체 유도 펩티드의 합성에 사용할 수 있는 펩티드를 의미한다. 이러한 C34 펩티드 유도체로서는, C34 펩티드의 C 말단측에, 본 발명에 있어서의 템플레이트 화합물과 라이게이션할 수 있는 라이게이션 부위(호적(好適)하게는 티오에스테르기)를 배치한 펩티드를 호적하게 예시할 수 있으며, 그 중에서도, C34 펩티드의 서열과 C 말단측과 라이게이션 부위와의 사이에, 입체 장해에 의한 반응성의 경감을 방지하기 위한 스페이서 아미노산 잔기(호적하게는 Gly 잔기)를 1∼20 아미노산 잔기(호적하게는 1∼10 아미노산 잔기, 보다 호적하게는 1∼5 아미노산 잔기, 특히 호적하게는 1 아미노산 잔기) 도입한 펩티드나, C34 펩티드의 서열과 C 말단측과 라이게이션 부위와의 사이에, 수용성을 증강하기 위한 친수성 아미노산 잔기(호적하게는 Arg 잔기, Glu 잔기)를 1∼20 아미노산 잔기(호적하게는 2∼18 아미노산 잔기, 보다 호적하게는 3∼12 아미노산 잔기, 특히 호적하게는 6 아미노산 잔기) 도입한 펩티드를 보다 호적하게 예시할 수 있으며, 그 중에서도, 상기한 스페이서 아미노산 잔기 및 친수성 아미노산 잔기를 함께 도입한 펩티드를 더 호적하게 예시할 수 있으며, 그 중에서도, C34 펩티드의 서열, 친수성 아미노산 잔기, 스페이서 아미노산 잔기, 라이게이션 부위를 N 말단측으로부터 이 순서로 배치한 펩티드를 보다 호적하게 예시할 수 있으며, 그 중에서도, 하기의 일반식(3)으로 표시되는 화합물을 특히 호적하게 예시할 수 있다.
또, 어느 특정의 C34 펩티드 유도체가, HIV 입체 구조 인식 항체 유도 펩티드의 합성에 사용할 수 있는 펩티드인지의 여부는, 그 펩티드가 C34의 3량체 영역을 인식하는 HIV 입체 구조 인식 항체를 유도할 수 있는지의 여부를 조사함에 의해 확인할 수 있다.
본 발명의 펩티드의 합성 방법에 있어서, C34 펩티드 유도체를 합성하는 공정에 있어서, C34 펩티드 유도체를 합성하기 위해서는, Fmoc 고상 펩티드 합성(solid-phase peptide synthesis; SPPS)를 사용할 수 있다(Hirokazu Tamamura et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry 6(1998) 1033-1041이나, "Solid phase peptide synthesis - a practical approach" by E Atherton & R C Sheppard IPI PRESS 참조). 즉, 고상 합성법에 의하여, 주쇄(主鎖) 아미노기의 보호기인 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)기의 선택적 탈보호(脫保護)와 축합 반응의 조작을 반복하고, 마지막으로 수지로부터의 탈수지(脫樹脂), 탈보호를 행함에 의해, 목적으로 하는 펩티드를 합성할 수 있다.
본 발명에 있어서, C34 펩티드 유도체의 3량체를 합성하는 공정에는, 본 발명에 있어서의 템플레이트 화합물이 사용된다. 본 발명에 있어서의 템플레이트 화합물로서는, 하기 일반식(1)(식 중, X는 양의 정수를 나타냄)으로 표시되는 화합물 또는 그 염을 호적하게 예시할 수 있다.
상기 X로서는, 천연의 gp41 단백질에 있어서의 C34의 3량체의 구조에 보다 가까운, C34 펩티드 유도체의 3량체를 얻는 관점에서, 1∼10의 범위 내의 정수인 것이 바람직하며, 2∼8의 범위 내의 정수인 것이 보다 바람직하고, 2∼6의 범위 내의 정수인 것이 더 바람직하고, 3∼5의 범위 내의 정수인 것이 보다 바람직하고, 4인 것이 특히 바람직하다. 이러한 템플레이트 화합물을 사용하면, C34 펩티드 유도체를 간편하며, 또한, 천연 구조에 유사한 구조로 3량체화할 수 있다. 본 발명에 있어서의 템플레이트 화합물의 말단의 Cys 부분은, C34 펩티드 유도체와의 네이티브 케미칼 라이게이션에 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서의 템플레이트 화합물은, 산 부가 염 또는 염기 부가 염 등의 염의 형태이어도 된다. 예를 들면, 산 부가 염으로서는, 염산염, 인산염, 질산염, 황산염, 아세트산염, 프로피온산염, 부티르산염, 발레르산염, 시트르산염, 푸마르산염, 말레산염, 말산염 등의 무기산염이나, 옥살산염, 혹은 타르타르산염 등의 유기산염을 들 수 있다. 또한, 염기 부가 염으로서는, 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 혹은 칼슘염 등의 금속염이나, 암모늄염, 또는 트리에틸아민염 혹은 에탄올아민염 등의 유기아민염 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서의 템플레이트 화합물은, 본 발명에 사용할 수 있는 한, 1 또는 2개 이상의 임의의 치환기를 갖고 있어도 된다. 2개 이상의 치환기를 가질 경우에는, 그들은 동일해도 달라도 된다. 본 발명에 사용할 수 있는 한, 치환기의 존재 위치는 한정되지 않으며, 치환 가능한 임의의 부위에 존재할 수 있다. 치환기의 종류는 특별히 한정되지 않는다. 본 발명에 있어서의 템플레이트 화합물은, 예를 들면 후술하는 실시예 1의 (3)에 기재된 방법에 의해 제작할 수 있다.
본 발명에 있어서의 C34 펩티드 유도체를, 본 발명에 있어서의 템플레이트 화합물과 결합함에 의해, C34 펩티드 유도체의 3량체를 합성하는 공정에 있어서, C34 펩티드 유도체의 3량체를 형성하기 위해서는, 네이티브 케미칼 라이게이션 반응을 사용할 수 있다(Dawson, P. E., Muir, T. W., Clark-Lewis, I., and Kent, S. B. H.(1994) Synthesis of proteins by native chemical ligation. Science 266, 776-779.; Dawson, P. E., Churchill, M. J., Ghadiri, M. R., and Kent, S. B. H.(1997) Modulation of reactivity in native chemical ligation through the use of thiol additives. J. Am. Chem. Soc. 119, 4325-4329.). 즉, 네이티브 케미칼 라이게이션 반응은, C 말단이 티오에스테르화된 펩티드와 Cys가 N 말단에 도입된 펩티드를 사용하여, 2개의 펩티드 세그먼트를 축합시켜, 긴 펩티드쇄를 얻는 방법으로서 범용되고 있다. 우선, C 말단의 티오에스테르가 티오페놀과 에스테르 교환 반응을 일으켜, 보다 반응성이 높은 티오에스테르로 변환된다(도 5의 (a)). 다음으로 N 말단 Cys의 티올기가 활성 에스테르의 카르보닐기에 구핵(求核) 공격하고(도 5의 (b)), 그 후 자발적인 S, N 아실 전위에 의하여, 천연과 같은 부위에 아미드 결합이 형성된다(도 5의 (c) 및 (d)). NCL법에서는, 펩티드의 C 말단을 컨쥬게이션에 이용할 수 있으며, 또한 반응은 중성 부근이라는 완화한 조건에서 행할 수 있으므로, 본 발명의 펩티드의 합성 방법에는 특히 적합하다. 본 발명에 있어서의 C34 펩티드 유도체와, 본 발명에 있어서의 템플레이트 화합물은, 도 6에 나타내는 바와 같은 기구로 반응하여, C34 펩티드 유도체 3량체가 생성된 것으로 생각된다.
상기한 네이티브 케미칼 라이게이션 반응의 방법으로서는, 본 발명에 있어서의 템플레이트 화합물과, 본 발명에서 합성한 C34 펩티드 유도체를, 완충액 중, 보다 바람직하게는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀하이드로클로라이드(TCEP·HCl)(773㎍, 2.67㎛ol) 및 티오페놀(9㎕, 89㎛ol)을 용해한 0.1M 인산나트륨 완충액(60㎕, pH8.5, 6M 요소 및 2mM EDTA를 함유함) 중에서 교반함에 의해, 3개의 등가인 링커 구조를 갖는 C3 대칭성을 갖는 템플레이트 화합물과, 전술한 C34 펩티드의 유도체를 결합시켜서, C34 펩티드의 유도체의 3량체를 합성하는 방법을 호적하게 예시할 수 있다. 이러한 네이티브 케미칼 라이게이션 반응은, C34 펩티드 유도체의 C 말단측의 라이게이션 부위(호적하게는 티오에스테르기)와, 본 발명에 있어서의 템플레이트 화합물의 Cys에 특이적으로 일어나며, 반응의 경과를 HPLC, ESI-TOF-MS를 사용해서 추적하여, 반응 종료를 검지할 수 있다.
2. HIV 입체 구조 인식 항체 유도 펩티드
본 발명의 HIV 입체 구조 인식 항체 유도 펩티드(이하, 간단히 「본 발명의 펩티드」라고도 표시함)로서는, 3개의 등가인 링커 구조를 갖는 C3 대칭성을 갖는 템플레이트 화합물을 통해, HIV 입자의 막 관통 단백질 gp41의 C 말단측의 헬릭스 영역 C34 펩티드의 유도체가 3분자 결합해 있는 것을 특징으로 하는 C34의 3량체 영역을 인식하는 HIV 입체 구조 인식 항체 유도 펩티드인 한 특히 제한되지 않지만, 하기 일반식(4)(식 중, X는 양의 정수를 나타내며, 단량체는 하기 일반식(5)으로 표시되는 화합물을 나타냄)으로 표시되는 펩티드(C34 펩티드 유도체의 3량체)를 호적하게 예시할 수 있다. 또, 단량체는 G의 부분에서, 일반식(4)의 화합물의 단량체 이외의 부분과 결합해 있다.
상기 일반식(4)에 있어서의 X로서는, 천연의 gp41 단백질에 있어서의 C34의 3량체의 구조에 보다 가까운, C34 펩티드 유도체의 3량체를 얻는 관점에서, 1∼10의 범위 내의 정수인 것이 바람직하며, 2∼8의 범위 내의 정수인 것이 보다 바람직하고, 2∼6의 범위 내의 정수인 것이 더 바람직하고, 3∼5의 범위 내의 정수인 것이 보다 바람직하고, 4인 것이 특히 바람직하다.
3. HIV 입체 구조 인식 항체의 유도 방법, 및 HIV 입체 구조 인식 항체
본 발명의 HIV 입체 구조 인식 항체의 유도 방법(이하, 간단히 「본 발명의 유도 방법」이라고도 표시함)으로서는, 본 발명의 펩티드를 사용해서, 숙주 동물을 감작하여, 당해 펩티드에 대한 항체(이하, 간단히 「본 발명의 항체」라고도 표시함)를 유도하는 방법인 한 특히 제한되지 않는다. 펩티드를 사용하여, 그에 대한 항체를 유도하는 방법은, 종래 공지의 방법을 사용할 수 있다. 본 발명의 유도 방법에 의해 유도되는 본 발명에 있어서의 항체는, C34의 3량체 영역을 인식하는 HIV 입체 구조 인식 항체이다. 본 발명의 항체는, 인간 항체를 포함한다. 여기에서 본 발명에 있어서 「인간 항체」란, 인간 유래의 항체 유전자의 발현 산물인 항체를 의미한다. 인간 항체는, 인간 항체 유전자좌(遺傳子座)를 도입하여, 인간 유래 항체를 산생(産生)하는 능력을 갖는 트랜스제닉 동물에 본 발명의 펩티드를 투여함에 의해 얻을 수 있다. 당해 트랜스제닉 동물의 예로서 예를 들면 마우스를 들 수 있다. 인간 항체를 산생할 수 있는 마우스로서, 예를 들면 내재성(內在性) 마우스 이뮤노글로불린(immunoglobulin; Ig) 중쇄(重鎖) 및 마우스 κ경쇄(輕鎖)를 결손하고 있으며, 또한, 인간 Ig중쇄 유전자를 포함하는 14번 염색체 단편(SC20) 및 인간 Igκ쇄 트랜스진(transgene)(KCo5)을 동시에 유지하는 마우스를 들 수 있다. 이 마우스는 인간 Ig중쇄 유전자좌를 갖는 계통 A의 마우스와, 인간 Igκ쇄 트랜스진을 갖는 계통 B의 마우스와의 교배에 의해 제작된다. 계통 A는, 내인성(內因性) Ig중쇄 및 κ경쇄 파괴의 양자에 대하여 호모 접합체이며, 자손 전달 가능한 14번 염색체 단편(SC20)을 유지하는 마우스 계통(Tomizuka. et al., Proc Natl Acad Sci USA., 2000 Vol 97 : 722)이다. 또한, 계통 B는 내재성 마우스 Ig중쇄 및 κ경쇄 결손의 양자에 대하여 호모 접합체이며, 인간 Igκ쇄 트랜스진(KCo5)을 유지하는 마우스 계통(Nat Biotechnol., 1996 Vol14 : 845)이다.
또한, 폴리클로널 항체, 모노클로널 항체 및 그 기능적 단편 중 어느 하나이어도, C34의 3량체 영역을 인식하는 HIV 입체 구조 인식 항체인 한, 본 발명에 있어서의 항체이다. 본 발명의 항체의 기능적 단편이란, 본 발명의 항체가 특이적으로 결합하는 항원에 대하여, 특이적으로 결합하는 항체의 단편을 의미하며, 보다 구체적으로는 F(ab')2, Fab', Fab, Fv, 이황화 결합(disulphide-linked) FV, 단쇄(Single-Chain) FV(scFV) 및 이들의 중합체 등을 들 수 있다(D.J.King, Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies,1998 T.J.International Ltd). 이러한 항체 단편은 관용법, 예를 들면 파파인, 펩신 등의 프로테아제에 의한 항체 분자의 소화, 혹은 공지의 유전자 공학적 방법에 의해 얻을 수 있다.
본 발명의 폴리클로널 항체는, 예를 들면, 이하에 기술하는 방법에 의해 제조할 수 있다. 본 발명의 펩티드를, 필요에 따라서 면역 부활제(Freund's Adjuvant 등)와 함께, 마우스, 토끼, 염소, 말 등의 비인간 포유 동물에 면역함에 의해 얻어진다. 본 발명의 모노클로널 항체는, 면역 감작 동물로부터 얻은 항체 산생 세포와 자기 항체 산생능이 없는 골수종계 세포(미엘로마 세포)로부터 하이브리도마를 조제하고, 하이브리도마를 클론화하여, 면역에 사용한 항원에 대하여 특이적 친화성을 나타내는 모노클로널 항체를 산생하는 클론을 선택함에 의해 취득할 수 있다. 당해 하이브리도마의 조제는, 쾰러 및 밀슈타인들의 방법(Nature,1975 Vol.256 : 495-497) 및 그에 준해서 행할 수 있다. 모노클로널 항체를 산생하는 하이브리도마 클론의 스크리닝은, 하이브리도마를, 예를 들면 마이크로타이터 플레이트(Microtiter plate) 중에서 배양하고, 증식이 보인 웰 중의 배양 상청(上淸)의 면역 항원에 대한 반응성을, 예를 들면 ELISA 등의 효소 면역 측정법, 래디오이뮤노어세이, 형광 항체법 등의 면역학적 방법을 사용하여 측정함에 의해 행할 수 있다.
하이브리도마로부터의 모노클로널 항체의 제조는, 하이브리도마를 인비트로에서 배양하여 배양 상청으로부터 단리할 수 있다. 또한, 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터 또는 토끼 등의 복수(腹水) 중 등에서의 인비보에서 배양하고, 복수로부터 단리할 수도 있다. 또한, 하이브리도마 등의 항체 산생 세포로부터 모노클로널 항체를 코드하는 유전자를 클로닝하며, 적당한 벡터로 도입하고, 이것을 숙주(예를 들면 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 등의 포유류 세포주, 대장균, 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등)에 도입하고, 유전자재조합 기술을 사용하여 재조합형 항체를 조제할 수 있다(P.J.Delves, ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES, 1997 WILEY, P.Shepherd and C.Dean, Monoclonal Antibodies, 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, J.W.Goding, Monoclonal Antibodies : principles and practice, 1993 ACADEMIC PRESS).
또한, 트랜스제닉 동물 제작 기술을 사용하여 목적 항체의 유전자가 내재성 유전자에 도입된 트랜스제닉한 소, 염소, 양 또는 돼지를 제작하고, 그 트랜스제닉 동물의 밀크 중으로부터 그 항체 유전자에 유래하는 항체를 대량으로 취득하는 것도 가능하다.
산생된 항체는, 당해 분야에 있어서 주지의 방법, 예를 들면 프로틴A 칼럼에 의한 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수(疏水) 크로마토그래피, 유안염석법(硫安鹽析法), 겔 여과, 어피니티 크로마토그래피 등을 적의(適宜) 조합시킴에 의해 정제할 수 있다.
4.HIV 감염증의 예방 및/또는 치료제
본 발명의 HIV 감염증의 예방 및/또는 치료제(이하, 간단히 「본 발명의 제(劑)」라고도 표시함)는, 본 발명의 항체 또는 본 발명의 펩티드를 유효 성분으로 하고 있는 한 특히 제한되지 않는다. 본 발명의 펩티드가 유도하는 본 발명의 항체는, 우수한 항HIV 활성이나, HIV 감염에 대한 우수한 중화 활성을 갖고 있기 때문에, 본 발명의 제는, HIV 감염증의 예방 및/또는 치료제로서 호적하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 제에는, 본 발명의 펩티드를 유효 성분으로 하는 HIV 감염증의 예방 및/또는 치료용 백신이 포함된다.
본 발명의 제에 함유되는 본 발명의 항체나 본 발명의 펩티드를 유효 성분으로 해서 HIV 감염증의 예방 및/또는 치료제를 조제할 경우에는, 펩티드나 항체를 유효 성분으로 한 감염증의 예방 및/또는 치료제에 있어서 통상 채용되는 제제(製劑) 형태를 채용할 수 있다. 예를 들면, 펩티드나 항체를 유효 성분으로 한 감염증의 예방 및/또는 치료제 혹은 백신에 있어서 통상 채용되는 제제의 형태, 혹은, 보조제, 첨가제를 사용할 수 있다.
본 발명의 제 중의 본 발명의 항체나 본 발명의 펩티드의 함유량으로서는, 소망의 HIV 감염증의 예방 효과나 치료 효과가 얻어지는 한 특히 제한되지 않지만, 예를 들면, 제의 전량에 대하여 0.00001∼90질량%, 바람직하게는 0.0001∼70질량%, 보다 바람직하게는 0.001∼50질량%로 할 수 있다.
본 발명의 제의 투여 방법으로서는, 소망의 HIV 감염증의 예방 효과나 치료 효과가 얻어지는 한 특히 제한되지 않지만, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 등을 예시할 수 있다. 또한 본 발명의 제의 투여량이나 투여 회수나 투여 농도는, 투여 대상의 체중 등에 따라, 적의 조절할 수 있다.
본 발명에 있어서의 HIV 감염증이란, HIV에 감염된 상태인 한, 그 증상의 유무나 정도는 특히 제한되지 않으며, 급성기의 상태, 무증후기(無症候期)의 상태, AIDS의 상태가 모두 포함된다. 또한, 본 발명의 제가 갖는 HIV 감염증의 예방 효과에는, HIV의 감염 자체를 예방하는 효과, 및 AIDS의 발병을 예방하는 효과가 모두 포함되고, 본 발명의 제가 갖는 HIV 감염증의 치료 효과에는, HIV 감염에 유래하는 증상을 경감하는 효과가 포함되며, 그 중에서도, AIDS의 증상을 경감하는 효과를 호적하게 포함한다.
또한, 본 발명의 제의 투여 대상으로 되는 포유 동물로서는, 특히 제한되지 않지만, 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트, 소, 돼지, 말, 토끼, 양, 염소, 고양이, 개 등을 호적하게 예시할 수 있으며, 그 중에서도 인간을 보다 호적하게 예시할 수 있다.
또, 본 발명의 다른 태양으로서, HIV 감염증의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 펩티드나, 본 발명의 항체 또는 펩티드를 HIV 감염증의 예방 및/또는 치료에 사용하는 방법이나, 본 발명의 항체 또는 펩티드를 대상에 투여함에 의해, HIV 감염증을 예방 및/또는 치료하는 방법도 예시할 수 있다. 이들 발명에 있어서의 문언의 내용이나 그 바람직한 태양은, 전술한 바와 같다.
이하, 본 발명을 참고예나 실시예에 의해 더 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 하기의 실시예의 범위로 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
[C34 펩티드 유도체 3량체의 설계·합성]
(1) C34 펩티드 유도체 3량체의 설계
목적으로 하는 항원 분자인 C34 펩티드 유도체 3량체는, C34 펩티드를 모방한 펩티드(C34 펩티드 유도체)와, 그것을 3개 배치시키는 템플레이트 화합물로 나누어 합성하고, 그들을 컨쥬게이션시킨 디자인으로 했다(도 7). C34 펩티드는 N36 펩티드와 6 헬릭스 다발(6-helical bundle)을 형성할 때에, C34 펩티드의 N 말단측으로부터 N36 펩티드에 상호 작용해 가는 것으로 생각되고 있다. 따라서, 보다 조기의 단계에서 HIV의 막 융합을 저해하는 항체를 유도하기 위해서는, C34 펩티드의 N 말단측 영역을 인식하는 항체 쪽이 중요한 것으로 추정했다. 그래서, C34 펩티드의 N 말단측 영역을 보다 천연에 가까운 상태로 유지하기 위하여, C34의 C 말단측을 C3 대칭성 템플레이트 화합물과의 컨쥬게이션 부위로 했다(도 7).
(2) C34 펩티드 유도체의 설계·합성
C34 펩티드 유도체 3량체의 구성 프래그먼트용의 C34 펩티드 유도체로서 C34 펩티드 유도체 1(C34 유도체 1)을 설계하고(도 8), C34 펩티드 단량체를 모방한 비교예용 항원 분자로서 C34 펩티드 유도체 2(C34 유도체 2)를 설계했다(도 9). C34 유도체 1에 대해서는, 수용성을 향상시키기 위하여, 친수성 아미노산인 Arg(R)와 Glu(E)의 반복 서열을, C34 천연 아미노산 서열의 C 말단측에 부여했다. 또한, 템플레이트 화합물과의 컨쥬게이션 시의 입체 장해 경감을 위하여, 스페이서로서 Gly(G)를, 친수성 아미노산의 반복 서열의 C 말단에 도입했다. 또한, C3 대칭성 템플레이트와의 컨쥬게이션에 필요한 라이게이션 부위를 도입하기 위하여, C 말단을 티오에스테르화한 설계로 했다(도 8). 한편, C34 유도체 2에 대해서는, 템플레이트 화합물과의 컨쥬게이션을 행하지 않기 때문에, C34 유도체 1에 있어서, 라이게이션 부위를 도입하지 않은 서열로 했다(도 9).
C34 유도체 1 및 C34 유도체 2의 합성 및 동정(同定)은, 구체적으로는, 이하와 같은 방법으로 행했다. 펩티드 합성용으로서 Fmoc 보호 아미노산을 함유하는 화학 시약을 Novabiochem사, 고쿠산가가쿠 가부시키가이샤, 및 와타나베가가쿠고교 가부시키가이샤로부터 구입하고, NovaSyn(등록상표) TGR 수지(0.23mmol/g, 0.20mmol 스케일)를 사용하여, C34 관련 펩티드를 합성했다. 다음으로, 메뉴얼에 따라서 고상 펩티드를 합성했다. 또한, 측쇄 보호 아미노산으로서는, Lys에 대하여 Boc를 사용하고, Arg에 대하여 Pbf를 사용하고, Asp 및 Glu에 대하여 OBut를 사용하고, Asn 및 Gln에 대하여 Trt를 사용하고, Ser, Thr 및 Tyr에 대하여 But를 사용했다. 펩티드는 모두 Fmoc-화학법에 의해 조제했다. 각 사이클은, (ⅰ)탈보호(20% 피페리딘/DMF) 15분간과, (ⅱ)DMF 중, 5당량의 Fmoc-아미노산(Fmoc-AA-OH), HOBt 및 DIPCI와의 커플링 90분간으로 이루어진다. 카이저 닌히드린(Kaiser ninhydrin) 시험에 의하여 커플링 효율을 조사한 결과가 음성이었으므로, 유리(遊離) 아미노기의 존재량이 0.05% 미만인 것이 시사되었다. 카이저 시험의 결과가 약(弱) 양성인 경우에는, Fmoc 아미노산(3당량), HOBt(3당량), DIPEA(6당량) 및 HBTU(2.9당량)으로 이루어지는 혼합물을 사용하여 커플링 스텝을 반복했다(더블 커플링). 보호 펩티드의 구축 완료 후, 수지를 충분히 세정하고(DMF 및 MeOH), 6시간 진공 건조시켰다.
[C34 유도체 2] C34 유도체 2를 합성하기 위하여, TFA, 티오아니솔, 에탄디티올, m-크레졸, H2O 및 트리이소프로필실란의 혼합액(10/0.75/0.75/0.25/0.25/0.1, v/v)(40㎖)을 사용하여, 실온에서 90분간 처리함에 의해, 수지로부터 합성 펩티드를 잘라냈다. 이 반응 혼합액을 여과하고, 수지를 TFA로 세정했다(50㎖×3회). 여과액 및 세정액을 진공 증발시켜, 펩티드를 침전시키고 차가운 Et2O로 3회 세정했다. 얻어진 조(粗)펩티드를 역상 HPLC로 정제하여, C34 유도체 2를 얻었다.
[C34 유도체 1] C34 유도체 1을 합성하기 위하여, TFE, 아세트산 및 디클로로메탄의 혼합액(1/1/3, v/v)(67㎖)을 사용하여, 실온에서 120분간 처리함에 의해, 수지로부터 합성 펩티드를 잘라냈다. 이 반응 혼합액을 여과하고, 수지를 디클로로메탄으로 3회 세정했다. 여과액 및 세정액을 진공 증발시켜, 펩티드를 고체로서 침전시켰다. 미정제의 보호 펩티드(522㎎)를, DMF(1.5㎖) 중, 에틸3-메르캅토프로피온산(20당량), HOBt·H2O(10당량), 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드(EDCI·HCl)(10당량)에 의하여, 0℃에서 1.5시간, 티오에스테르화했다. 이 반응 혼합액을 실온에서 하룻밤 교반하고, 감압 하에서 농축했다. 이 잔류물에 H2O(50㎖)를 가하고, 얻어진 침전물을 H2O로 3회 세정했다. 얻어진 펩티드(692㎎)를, TFA/티오아니솔/m-크레졸/H2O/트리이소프로필실란(TIS)(8.81/0.50/0.32/0.32/0.05, v/v)(30㎖)에 의하여, 실온에서 2시간 처리했다. 진공 증발을 행하고, 미정제의 펩티드-티오에스테르를 차가운 Et2O(50㎖)에서 침전시키고, 차가운 Et2O로 3회 세정하고, 역상 HPLC에 의해 정제하여, C34 유도체 1을 얻었다.
정제한 C34 유도체 1 및 C34 유도체 2의 양 펩티드를 동결 건조시키고, ESI-TOF-MS에 의해 동정을 시도했다. ESI-TOF-MS는 이하와 같이 행했다. 1H NMR 스펙트럼은 Bruker AV500 분광계를 사용하여 기록했다. 화학 쉬프트는, 내부 표준으로서의 Me4Si(CDCl3 중)에 대한 δ(ppm)로 나타냈다. JMS-T1000LC AccuTOF, 및 Brucker Daltonics micro TOF-2focus를 사용하여, 저분해능 및 고분해능의 질량 스펙트럼을 포지티브 및 네가티브 검출 모드로 기록했다. 플래시 크로마토그래피에는, Wakogel C-200(와코쥰야쿠고교 가부시키가이샤제) 및 실리카겔 60 N(간토가가쿠 가부시키가이샤제)을 사용했다. 분석용 HPLC으로서, Cosmosil 5C18-ARII 칼럼(4.6×250㎜, 나카라이테스크 가부시키가이샤제)을, JASCO PU-2089 plus(니혼분코 가부시키가이샤(영문 명칭 JASCO제) 위, 0.1%(v/v) TFA를 함유하는 CH3CN의 직선 구배를 유속 1㎤/min-1로 사용하고, 그 용출물(溶出物)을 220㎚의 자외선으로 검출했다. 분취 HPLC로서, Cosmosil 5C18-AR Ⅱ 칼럼(10×250㎚, 나카라이테스크 가부시키가이샤제)을, JASCO PU-2089 plus(JASCO사제) 위, 0.1%(v/v) TFA를 함유하는 CH3CN의 적절한 구배 모드를 유속 3㎤/min-1로 사용했다. 이러한 조건에서, C34 유도체 1 및 C34 유도체 2에 대하여 ESI-TOF-MS 해석한 결과를 이하에 나타낸다. C34 유도체 2 : C219H341N66O77S[M+H]+의 m/z 계산값 5159.5, 실측값 5160.1(5.3㎎, 수율 1%). C34 유도체 1 : C224H349N66O78S2[M+H]+의 m/z 계산값 5275.5, 실측값 5275.6(11.3㎎, 수율 1%). 이렇게, C34 유도체 2, C34 유도체 1 모두, 수율 1%로 얻어졌다.
(3) 템플레이트 화합물의 설계·합성
템플레이트 화합물은 C34 펩티드의 C 말단에 도입하는 것으로 했다. 템플레이트 화합물은, 천연의 C34 펩티드 3량체 구조를 높게 반영할 수 있도록, C3 대칭성의 특징을 갖게 했다. 또한, 이 템플레이트 화합물의 링커에는, 수용성 향상을 위하여 폴리에틸렌글리콜(PEG)기를 도입하고, 또한, C34 유도체 1의 C 말단 티오에스테르와의 축합에 필요한 Cys를 도입했다(도 10). 이 템플레이트 화합물의 합성을, 도 11에 나타낸 스킴으로 행했다. 구체적으로는, 이하와 같은 방법으로 행했다.
1) 화합물 2의 합성
도 11에 있어서의 화합물 2의 합성은 이하와 같이 행했다. 트리스-[3-{2-(비스-[2-에톡시])-에타노일}-프로필옥시]-니트로메탄(439㎎, 0.69mmol)을 함유하는 건조 THF 용액(4㎖)을, NaH(미네랄 오일 중 60% 분산물 208㎎, 5.21mmol)를 함유하는 건조 THF(2㎖)에, 0℃에서 10분간에 걸쳐서 첨가했다. 이 혼합액을 0℃에서 10분간 교반했다. 이 반응 혼합액에, (3-브로모-프로필)-카르밤산tert-부틸에스테르(992㎎, 4.17mmol)를 함유하는 건조 THF 용액(1.5㎖)을 0℃에서 10분간에 걸쳐서 첨가했다. 이 반응 혼합액을 실온에서 하룻밤 교반하고, 셀라이트 패드로 여과했다. 이 여과 용액을 감압 하에서 농축하고, CHCl3-MeOH(50/1)을 사용하여 실리카겔 상에서 크로마토그래피에 부쳐서, 표제의 화합물 2를 무색유(無色油)로서 얻었다(425㎎, 수율 88%).
1H-NMR(400㎒, CDCl3) δ=1.44(s, 27H), 1.48(m, 6H), 1.76(q, 6H), 1.95-1.99(m, 6H), 3.22-3.25(m, 6H), 3.44(t, 6H), 3.52-3.66(m, 42H); 13C-NMR(400㎒) δ=156.0(3C), 94.1, 78.7(3C), 70.6(3C), 70.5(3C), 70.5(3C), 70.1(3C), 70.1(3C), 69.5(3C), 66.5(3C), 38.5(3C), 32.2(3C), 29.6(3C), 28.4(9C), 24.0(3C), 22.2(3C); C52H102N4NaO20[M+Na]+의 HRMS(ESI)m/z 계산값 1125.6985, 실측값 1125.6980
2) 화합물 3의 합성
도 11에 있어서의 화합물 3의 합성은 이하와 같이 행했다. 4M의 HCl/1,4-디옥산(1㎖)에 화합물 2(118㎎, 0.11mmol)를 가한 용액을 실온에서 5시간 교반했다. 감압 하에서 농축하고, 조화합물(粗化合物) 3을 무색유로서 얻어(104㎎), 정제하지 않고 다음 스텝에 제공했다.
3) 화합물 4의 합성
도 11에 있어서의 화합물 4의 합성은 이하와 같이 행했다. 건조 DMF(0.45㎖)에 화합물 3(95.9㎎, 0.12mmol) 및 트리에틸아민(0.17㎖, 1.18mmol)을 가한 혼합액을 실온에서 10분간 교반하고, 이 반응 혼합액에, Boc-Cys(Trt)-OH(183㎎, 0.39mmol) 및 HOBt·H2O(60.3㎎, 0.39mmol)을 함유하는 건조 DMF 용액(0.40㎖)을 첨가하고, 실온에서 10분간 교반했다. 이 혼합액에, EDCI·HCl(75.5㎎, 0.39mmol)을 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반했다. 얻어진 혼합액을 아세트산에틸로 희석한 후, 포화 수성 NaHCO3 및 염수로 세정하고, Na2SO4 상에서 건조했다. 감압 하에서 농축하고, CHCl3-MeOH(30/1)를 사용하여 실리카겔 상에서 크로마토그래피에 부쳐서, 화합물 4를 무색유로서 얻었다(147㎎, 수율 58%).
1H-NMR(400㎒, CDCl3) δ=1.45-1.49(m, 6H), 1.57-1.60(m, 6H), 1.73(q, 6H), 1.92-1.96(m, 6H), 3.29(m, 6H), 3.43(t, 6H), 3.52-3.62(m, 42H), 4.98(s, 3H), 7.19-7.41(m, 45H); 13C-NMR(400㎒) δ=170.2(3C), 144.5(3C), 129.6(27C), 128.0(18C), 126.8(9C), 94.1, 80.1(3C), 70.7(3C), 70.6(3C), 70.5(6C), 70.5(6C), 70.2(3C), 69.4(3C), 67.0(3C), 37.5(3C), 34.3(3C), 32.2(3C), 29.0(9C), 28.3(3C), 24.0(3C); C118H159N7NaO23S3[M+Na]+의 HRMS(ESI)m/z 계산값 2161.0547, 실측값 21621.0543
4) 화합물 5의 합성
도 11에 있어서의 화합물 5(목적으로 하는 템플레이트 화합물)의 합성은 이하와 같이 행했다. TFA, H2O, 에탄디티올 및 트리이소프로필실란(90/5/2.5/2.5, v/v)의 혼합액에, 화합물 4(103㎎, 0.048mmol)를 가한 용액을 실온에서 3시간 교반하고, 감압 하에서 농축했다. 잔류물에 Et2O(15㎖)을 첨가했다. 얻어진 침전물을 원심 분리에 의해 회수하고, 상청을 제거했다. 그 후, 침전물을 Et2O로 3회 세정했다. 분취 HPLC로 정제하여, 화합물 5(목적으로 하는 템플레이트 화합물)를 무색유로서 얻었다(28.8㎎, 수율 54%).
1H-NMR(400㎒, CDCl3) δ=1.41(s, 27H), 1.44-1.48(m, 6H), 1.76(q, 6H), 1.95-1.97(m, 6H), 2.94-3.04(m, 6H), 3.19-3.36(m, 6H), 3.48-3.63(m, 48H), 4.07(t, 3H); 13C-NMR(400㎒) δ=167.7(3C), 70.3, 69.6(15C), 69.4(3C), 69.2(3C), 68.3(3C), 54.6(3C), 36.7(3C), 31.6(3C), 28.2(3C), 24.8(3C), 23.1(3C); C46H94N7O17S3[M+H]+의 HRMS(ESI)m/z 계산값 1112.5868, 실측값 1112.5858
(4) C34 펩티드 유도체 3량체의 합성
상기한 실시예 1의 (2)에 있어서 합성한 C34 유도체 1과, 상기한 실시예 1의 (3)에 있어서 합성한 템플레이트 화합물을 준비하고, 다음으로, C34 유도체 1과 템플레이트 화합물과의 컨쥬게이트를 행했다. 컨쥬게이트에는, 네이티브 케미칼 라이게이션(Native Chemical Ligation; NCL)법(Dawson, P. E., Muir, T. W., Clark-Lewis, I., and Kent, S. B. H.(1994) Synthesis of proteins by native chemical ligation. Science 266, 776-779.; Dawson, P. E., Churchill, M. J., Ghadiri, M. R., and Kent, S. B. H.(1997) Modulation of reactivity in native chemical ligation through the use of thiol additives. J. Am. Chem. Soc.119, 4325-4329.)을 선택했다. NCL법의 개요는 도 5에 나타낸 바와 같다. 합성한 템플레이트 화합물과 C34 유도체 1은, 도 6에 나타내는 바와 같은 기구로 반응하여, C34 펩티드 유도체 3량체(C34 Trimer)가 생성된 것으로 생각된다.
C34 펩티드 유도체 3량체의 합성 및 동정은, 구체적으로는, 이하와 같은 방법으로 행했다. TCEP·HCl(773㎍, 2.67㎛ol) 및 티오페놀(9㎕, 89㎛ol)을, 0.1M 인산나트륨 완충액(60㎕, pH 8.5, 6M 요소 및 2mM EDTA를 함유함)에 질소 분위기 하에서 용해하고, 거기에, 화합물 5인 템플레이트 화합물(100㎍, 0.090㎛ol), C34 유도체 1(1.77㎎, 0.30㎛ol) 및 아세토니트릴 20㎕을 가했다. 37℃에서 5시간, 교반 하에서 반응을 행하여, 반응 경과를 HPLC로 관찰했다. 반응 개시로부터 3시간 경과 후의 HPLC 차트를 도 12에 나타낸다. C34 펩티드 유도체 3량체를 단일 피크로서 분리했다. 또한, 역상 HPLC에 의하여, C34 펩티드 유도체 3량체의 정제를 행했다. 역상 HPLC에서는, 아세토니트릴(0.1% TFA)의 33∼43% 직선 구배를 사용하는 용출을 40분간 행했다. 그 HPLC 차트 등을 도 13에 나타낸다. 정제 C34 펩티드 유도체 3량체를 수율 17%로 얻었다. 이 정제 C34 펩티드 유도체 3량체를 ESI-TOF-MS로 동정했다.
C703H1108N205O245S6[M+H]+의 m/z 계산값 16533.9, 실측값 16542.6
시스테인 잔기의 티올기를 캡하기 위하여, 요오도아세트아미드(777㎍, 4.2㎛ol)를 함유하는 0.1M 인산나트륨 완충액(74㎕, pH 7.8, 6M 요소 및 5mM EDTA를 함유함)에 의해, C34 펩티드 유도체 3량체(368㎍, 0.02㎛ol)를 실온에서 처리했다. 그러나, HPLC 및 ESI-TOF-MS 분석에 있어서 반응은 관찰되지 않아, 시스테인 잔기의 티올기가 비반응성인 것이 시사되었다. 2량체 또는 올리고머의 형성이, C34 펩티드 유도체 3량체의 시스테인 잔기 사이의 디설피드 가교에 의한 것인지의 여부를 조사하기 위하여, C34 펩티드 유도체 3량체의 분자량을 환원 조건 및 비환원 조건에서 측정했다. 그 결과, 완충액 조건에서는, C34 펩티드 유도체 3량체의 대부분이 단량체(단일의 C34 펩티드 유도체 3량체)로서 존재해 있는 것이 시사되었다.
[실시예 2]
[C34 펩티드 유도체 3량체의 2차 구조 해석]
C34 펩티드 유도체 3량체의 2차 구조 해석을 행하기 위하여, 원편광(圓偏光) 이색성(CD) 스펙트럼의 측정을 행했다. 구체적으로는 이하와 같은 방법으로 행했다. 상기한 실시예 1에서 얻어진 C34 펩티드 유도체 3량체(최종 농도 2μM)를 PBS(50mM 인산나트륨, 150mM NaCl, pH 7.2)에 용해했다. 써모 레귤레이터를 구비한 J-720 원편광 이색성 분광계(JASCO사제)에 이 용해액을 세팅하고, 그 몰 타원율[θ]의 파장 의존성을, 25℃ 하, 195∼250㎚에서 관찰했다. 또한, C34 펩티드 유도체 3량체(최종 농도 2μM) 대신에, 상기한 실시예 1에서 얻어진 C34 펩티드 유도체 단량체(C34 유도체 2)(최종 농도 6μM)를 사용하여, 마찬가지의 방법으로 CD 스펙트럼을 측정했다. 그 결과를 도 14의 (A)에 나타낸다.
C34 펩티드 유도체 3량체의 CD 스펙트럼(도 14의 (A) 중의 실선), 및 C34 펩티드 유도체 단량체의 CD 스펙트럼(도 14의 (A) 중의 파선) 모두 약 200㎚에서 극소값을 나타냈다. 약 200㎚ 부근의 부(負)의 극대는, 랜덤 코일 구조의 특징이므로, C34 펩티드 유도체 3량체나 C34 펩티드 유도체 단량체는 랜덤 코일 구조를 형성하고 있는 것이 시사되었다. 이전의 문헌에서는, N36의 단량체(N36RE), 및 N36의 3량체(triN36e)가 고도한 α-헬리시티를 형성하고, 헬릭스 함량은, N36RE보다도 triN36e 쪽이 많았던 것이 보고되어 있다(Nakahara, T., Nomura, W., Ohba, K., Ohya, A., Tanaka, T., Hashimoto, C., Narumi, T., Murakami, T., Yamamoto, N., and Tamamura, H.(2010) Remodeling of dynamic structures of HIV-1 envelope proteins leads to synthetic antigen molecules inducing neutralizing antibodies. Bioconjugate Chem.21, 709-714.; Chan, D. C., Chutkowski, C. T., and Kim, P. S.(1998) Evidence that a prominent cavity in the coiled coil of HIV type 1 gp41 is an attractive drug target. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 15613-15617.). 이들의 결과로부터, C34에 유래하는 단량체 펩티드 및 3량체 펩티드는, N36 유래 펩티드에 비하여, 랜덤 코일 구조를 형성하는 경향이 있는 것이 시사되었다.
또한, C34 펩티드 유도체 3량체와 N36 펩티드와의 상호 작용을 평가하기 위하여, N36 유래 펩티드인 N36 펩티드 유도체 단량체(이하의 N36RE 참조)와, C34 펩티드 유도체(3량체 또는 단량체)와의 혼합물에 있어서의 CD 스펙트럼을 측정했다.
구체적으로는, 이하와 같은 방법으로 행했다. C34 펩티드 유도체 단량체(최종 농도 6μM)와, N36 펩티드 유도체 단량체(최종 농도 6μM)를 함유하는 PBS 용해액을 준비하고, 전술한 것과 마찬가지의 방법으로 CD 스펙트럼을 측정했다. 또한, C34 펩티드 유도체 3량체(최종 농도 2μM)와, N36 펩티드 유도체 단량체(최종 농도 6μM)를 함유하는 PBS 용해액에 대해서도, 마찬가지의 방법으로 CD 스펙트럼을 측정했다. 또한, N36 펩티드 유도체 단량체(최종 농도 6μM)만을 함유하는 PBS 용해액에 대해서도, 마찬가지의 방법으로 CD 스펙트럼을 측정했다. 이들의 결과를, 도 14의 (B)에 나타낸다. C34 펩티드 유도체 단량체와, N36 펩티드 유도체 단량체와의 펩티드 혼합물에 있어서의 CD 스펙트럼(도 14의 (B) 중의 파선)이나, C34 펩티드 유도체 3량체와, N36 펩티드 유도체 단량체와의 펩티드 혼합물에 있어서의 CD 스펙트럼(도 14의 (B) 중의 실선)에서는, 어느 경우도, 극소값이 208㎚와 222㎚의 2회 출현했으므로, 양 펩티드 혼합물이 α-헬리시티를 형성하고 있는 것이 나타났다. 또한, 도 14의 (B)의 결과로부터, C34 펩티드 유도체 3량체와, N36 펩티드 유도체 단량체와의 펩티드 혼합물에 있어서의 헬릭스 함량은, C34 펩티드 유도체 단량체와, N36 펩티드 유도체 단량체와의 펩티드 혼합물에 있어서의 헬릭스 함량보다도 적은 것이 나타났다. 이것으로부터, C34 펩티드 유도체 3량체에서는, 3개의 펩티드쇄가 공유 결합에 의해 회합해 있기 때문에, C34 펩티드 유도체 단량체와 비교하여, N36과의 상호 작용이 비교적 곤란한 것이 뒷받침되었다.
[실시예 3]
[C34 펩티드 유도체에 의한 항체 유도 실험]
C34 펩티드 유도체 3량체의 항체 유도능을 확인하기 위하여, C34 펩티드 유도체 3량체나, C34 펩티드 유도체 단량체를 사용하여 항체 유도 실험을 시도했다. 구체적으로는, 이하와 같은 방법으로 행했다. BALB/c 계통의 6주령의 수컷 마우스를 산쿄라보서비스 가부시키가이샤로부터 구입하고, 특정 병원체를 포함하지 않는 조건 하에서 동물 시설에서 사육했다. 프로인트 불완전 아쥬반트 및 PBS는, 와코쥰야쿠고교 가부시키가이샤로부터 구입한 제품을 사용했다. 또한, DMSO(엔도톡신 프리)는, Sigma-Aldrich사로부터 구입한 제품을 사용했다. 이하의 실험 프로토콜은 도쿄이카시카다이가쿠의 윤리 위원회에서 승낙된 것이다.
100㎍의 C34 펩티드 유도체 3량체를 50㎕의 PBS에 용해했다. 이 용액에 프로인트 불완전 아쥬반트 50㎕를 첨가하여 혼합했다. 이 혼합액을, 마취 하의 각 마우스에 0, 7, 14, 21 및 28일째에 피하 주사했다. 채혈은, 면역을 행하기 1주간 전에 행하며, 또한 면역으로부터 5, 12, 19, 26 및 33일째에 행했다. 이들 각 혈액을, 4℃에서 10분간, 원심분리(1500rpm)를 가해서 혈청을 분리했다. 이 혈청을 56℃에서 30분간 가열하여, 보체를 불활화(不活化)시켰다. 각 혈청은, 사용할 때까지 -80℃에서 보존했다. 또한, C34 펩티드 유도체 3량체 대신에, 같은 중량의 C34 펩티드 유도체 단량체를 사용하며, 또한, 50㎕의 PBS에 1㎕의 DMSO로 용해한 것 이외에는 같은 방법으로 혈청을 얻었다.
[실시예 4]
[C34 펩티드 유도체를 면역해서 얻어진 혈청의 항체가(抗體價)의 평가]
상기한 실시예 3에서 얻어진 혈청의 항체가를 평가하기 위한 계(系)로서, ELISA법을 채용했다. 즉, 상기한 실시예 3에서 얻어진, 면역으로부터 33일째의 혈청의 항체가 및 선택성을, 코팅한 합성 항원에 대한 혈청 역가(力價)로 평가했다. 구체적으로는, 이하의 방법으로 행했다.
우선은 시약의 준비를 행했다. Tween-20(폴리옥시에틸렌(20)소르비탄모노라우르산) 및 30질량% 과산화수소는 와코쥰야쿠고교 가부시키가이샤로부터 구입했다. 2,2-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)디암모늄염(ABTS)은 Sigma-Aldrich사로부터 구입했다. 항마우스 IgG(H+L)(염소)-HRP 항체는, EMD Chemicals사(캘리포니아주 샌디에이고)로부터 구입했다. 다음으로, 합성 펩티드(C34 펩티드 유도체 3량체 또는 C34 펩티드 유도체 단량체)를 10㎍/㎖로 함유하는 PBS를 25㎕ 사용하여, 96웰의 마이크로 플레이트를 4℃에서 하룻밤 코팅했다. 코팅한 마이크로 플레이트를 탈이온수로 10회 세정한 후, 150㎕의 블로킹 버퍼(5질량% 스킴 밀크를 함유하는 0.02질량%의 PBST(0.02질량% Tween 20 함유 PBS))를 사용하여, 37℃에서 1시간 블로킹을 행했다. 이 마이크로 플레이트를 탈이온수로 10회 세정했다. 한편, 상기한 실시예 3에서 얻어진 각 마우스 혈청을, 1질량% 스킴 밀크 함유 0.02질량% PBST로 희석하여, 200배에서부터 409600배까지의 2배 희석 계열을 각 혈청에 대하여 제작했다. 이들 각 희석액을 50㎕씩 전술한 마이크로 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 2시간 인큐베이트했다. 다음으로, 이들 마이크로 플레이트를 탈이온수로 10회 세정했다. 다음으로, 0.02질량% PBST로 2000배로 희석한 HRP 결합 항마우스 IgG 항체(2차 항체)용액을 각 웰에 25㎕씩 첨가하고, 45분간 인큐베이트했다. 그리고나서 이 마이크로 플레이트를 10회 세정했다. 다음으로, HRP 염색 완충액 200㎕(0.5M 시트르산 완충액(pH 4.0, 1㎖), H2O2(3㎕) 및 H2O(8.8㎖)의 혼합액)에 10㎎의 ABTS를 용해함에 의해 조제한 HRP 기질 용액을 각 웰에 25㎕씩 첨가했다. 30분간 인큐베이트한 후, 0.5M의 H2SO4을 1웰당 25㎕ 첨가해서 반응을 정지시키고, 405㎚로 그 용액의 흡광도를 측정했다.
이들 조작에 의해, 얻어진 혈청의 항체가를 측정했다. 마이크로 플레이트에 C34 펩티드 유도체 단량체를 코팅했을 경우의 결과를 도 15의 (A)에 나타내고, 마이크로 플레이트에 C34 펩티드 유도체 3량체를 코팅했을 경우의 결과를 도 15의 (B)에 나타낸다. 도 15의 (A) 및 (B)의 그래프 중의 검은 네모는, C34 펩티드 유도체 단량체로 유도해서 얻어진 혈청을 사용했을 경우의 결과를 나타내고, 검은 동그라미는, C34 펩티드 유도체 3량체로 유도해서 얻어진 혈청을 사용했을 경우의 결과를 나타낸다.
C34 펩티드 유도체 단량체로 유도된 항체의 50% 결합 혈청 희석액의 농도는, 코팅한 C34 펩티드 유도체 단량체에 대하여 1.06×10-3, 코팅한 C34 펩티드 유도체 3량체에 대하여 1.30×10-3이며, 전자의 농도에 대한 후자의 농도의 비율은 약 1.2배이었다. 한편, C34 펩티드 유도체 3량체로 유도된 항체의 50% 결합 혈청 희석액의 농도는, 코팅한 C34 펩티드 유도체 3량체에 대하여 3.15×10-4, 코팅한 C34 펩티드 유도체 단량체에 대하여 7.30×10-3이며, 전자의 농도에 대한 후자의 농도의 비율은 약 23배이었다. 본 평가에서는 정제 모노클로널 항체를 사용하지 않았음에도 불구하고, 산생된 항체가, 단량체 또는 3량체의 각 항원에 대한 구조 선택성을 나타낸 것은 특필해야 할 것이다. 이 결과로부터, 입체 구조를 따르는 항원을 합성함에 의해, 구조 특이성을 갖는 항체의 제작을 효율 좋게 할 수 있는 것이 강하게 시사되었다.
[실시예 5]
[C34 펩티드 유도체 3량체 유도 항혈청의 HIV 감염에 대한 중화 활성의 평가]
C34 펩티드 유도체 3량체가 HIV 감염에 대한 중화 활성(저해 활성)을 갖고 있는지의 여부를 조사하기 위하여, 상기한 실시예 3에서 얻어진 혈청에 대하여 p24 어세이를 행했다. p24는 HIV-1의 코어를 구성하는 캡시드 단백질이며, HIV에 감염된 생물 속에서 HIV가 증식하면, 그 생물의 혈청 중의 p24 농도가 상승하는 것이 알려져 있다. p24 어세이를 행할 때에, 우선 HIV-1 바이러스의 조제를 행했다. 구체적으로는 이하와 같은 방법을 사용했다.
HIV-1 분자 클론(molecular clone)인 pNL4-3(clade B; X4-tropic virus)을 준비했다. 다음으로, 10% FBS/DMEM(WAKO사제)을 넣은 직경 6㎝의 디시(dish)에 293FT 세포를 첨가하고, 60% 컨플루엔트로 될 때까지 배양했다. 인산칼슘법에 의하여, 10㎍의 pNL4-3을 293FT 세포에 트랜스펙션했다. 트랜스펙션으로부터 48시간 배양한 후, 배양액의 상청을 회수하고, 그 상청을 직경 0.45㎛의 필터로 여과한 것을 바이러스 용액으로 했다. 이 바이러스 용액을 액체 질소로 급랭한 후, 사용할 때까지 -80℃ 이하에서 보존했다.
p24를 50ng 포함하는 NL4-3 바이러스를, 4℃에서 20분간, 2100g으로 스피노큐레이션(spinoculation)함에 의해 MT-4 세포(5×104 세포/200㎕)에 감염시켰다. 이 MT-4 세포로부터 비결합 바이러스를 세정 제거한 후, MT-4 세포를, 상기한 실시예 3에서 얻어진 각 마우스 혈청 10㎕을 함유하는 배지(培地) 200㎕에 재현탁하고, 다음으로, 배양했다. 배양 시, 배지의 절반을 2∼3일마다 교환했다. 감염으로부터 7일째에, 배양 상청 중의 p24의 양을, p24ELISA 키트(PerkinElmer사제)를 사용하여 측정했다(Ohba, K., Ryo, A., Dewan, M. Z., Nishi, M., Naito, T., Qi, X., Inagaki, Y., Nagashima, Y., Tanaka, Y., Okamoto, T., Terashima, K., and Yamamoto, N.(2009) Follicular dendritic cells activate HIV-1 replication in monocytes/macrophages through a juxtacrine mechanism mediated by P-selectin glycoprotein ligand 1. J. Immunol.183, 524-532.). 측정은, 각 혈청에 대하여 3회씩 행했다.
배양 상청 중의 p24량(pg/㎖)을 도 16에 나타낸다. "uninf."는, 비감염 세포의 경우의 결과를 나타내고, "cr1"∼"cr3"은, 면역하기 1주일 전의 혈청(컨트롤)을 사용했을 경우의 결과를 나타내고, "m1"∼"m3"은, C34 펩티드 유도체 단량체로 유도된 혈청을 사용했을 경우의 결과를 나타내고, "t1"∼"t3"은, C34 펩티드 유도체 3량체로 유도된 혈청을 사용했을 경우의 결과를 나타낸다. C34 펩티드 유도체 단량체로 면역한 마우스의 혈청도 C34 펩티드 유도체 3량체로 면역한 마우스의 혈청도, 바이러스 감염에 대한 같은 정도의 중화 활성을 나타냈다. C34 펩티드 유도체 3량체로 면역하여 얻어진 혈청은, 중화 활성(실시예 5 참조)뿐만 아니라, 구조 특이성(상기 실시예 4 참조)도 갖고 있으므로, C34 펩티드 유도체 단량체로 면역한 마우스의 혈청과 중화 활성은 같은 정도이어도 포함되는 항체군이 질적으로 다르고, 중화의 메커니즘도 질적으로 다를 가능성이 있으며, C34 펩티드 유도체 3량체로 면역해서 얻어지는 구조 특이적 모노클로널 항체 쪽이, gp41의 단순한 아미노산의 차이/변이에 대하여 저항성이 있는 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명자들이 지금까지 발견한 N36 펩티드 유도체 3량체(Nakahara, T., Nomura, W., Ohba, K., Ohya, A., Tanaka, T., Hashimoto, C., Narumi, T., Murakami, T., Yamamoto, N., and Tamamura, H.(2010) Remodeling of dynamic structures of HIV-1 envelope proteins leads to synthetic antigen molecules inducing neutralizing antibodies. Bioconjugate Chem.21,709-714.)와 마찬가지로, C34 펩티드 유도체 3량체는 새로운 분류의 HIV-1 백신으로서 유효하게 기능할 것으로 생각된다.
[실시예 6]
[C34 펩티드 유도체 3량체의 항HIV 활성의 평가]
C34 펩티드 유도체 3량체가 항HIV 활성을 갖고 있는지의 여부를 조사하기 위하여, TZM-bl 세포를 사용한 바이러스 융합 저해 어세이를 행했다. TZM-bl 세포에는, HIV-1의 LTR(long terminal repeat) 서열에 연결된 루시페라제 유전자가 도입되어 있어, HIV-1의 감염을 루시페라제 시그널에 의거하여 검출할 수 있다. 바이러스 융합 저해 어세이는, 구체적으로는, 이하의 방법으로 행했다. p24을 5ng 포함하는 NL4-3 바이러스, 및 희석 계열 펩티드와 함께, TZM-bl 세포(2×104 세포/100㎕)를 배양했다. 배양 48시간 후, TZM-bl 세포를 용해하고, Steady-Glo 루시페라제 어세이계(Promega사제)를 사용하여 루시페라제 활성을 측정했다(Platt, E. J., Wehrly, K., Kuhmann, S. E., Chesebro, B., and Kabat, D.(1998) Effects of CCR5 and CD4 cell surface concentrations on infection by macrophage tropic isolates of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol.72, 2855-2864.). 루시페라제 활성의 측정값에 의거하여 각 펩티드의 EC50(μM)을 산출했다. 또한, 이 바이러스 융합 저해 어세이에 있어서의, TZM-bl 세포의 생존률의 감소에 의거하여, 각 펩티드의 CC50(μM)을 산출했다. 또, 희석 계열 펩티드의 펩티드로서는, C34 펩티드 유도체 3량체(triC34e), C34 펩티드 유도체 단량체(C34REG) 외, C34 천연 펩티드 단량체(C34)(C34 펩티드 유도체 단량체로부터 RE의 반복 서열과 G 잔기를 제거한 것)도 사용했다.
이 바이러스 융합 저해 어세이로 산출한 EC50(μM) 및 CC50(μM)의 결과를 표 1에 나타낸다. 또, 표 1의 수치는 모두, 적어도 3회 이상 실험을 반복하여 얻어진 데이터의 평균값을 나타낸다.
[표 1]
표 1의 EC50에 나타난 바와 같이, C34 펩티드 유도체 단량체(C34REG)이어도 강력한 항HIV 활성(바이러스 융합 저해 활성)을 나타냈지만, C34 펩티드 유도체 3량체(triC34e)는 그 100배나 더 현저한 항HIV 활성을 나타냈다. 3량체 펩티드 쪽이 각별히 강력한 항HIV 활성을 갖고 있는 것은 특필해야 하며, 3량체 형태가 저해제의 활성 구조로서 중요한 것이 나타났다. 한편, 표 1의 CC50에 나타나는 바와 같이, 15μM의 C34 펩티드 유도체 단량체(C34REG)나, 5μM의 C34 펩티드 유도체 3량체(triC34e)에서는, 세포 독성은 관찰되지 않았다.
[실시예 7]
C34 펩티드 유도체 3량체가 항HIV 활성을 갖고 있는지의 여부를 조사하기 위하여, 상기 실시예 6과 마찬가지의 방법으로 MT-4 세포를 사용한 어세이를 행했다. MT-4 세포(5×10,000cells)에, p24를 1ng 포함하는 NL4-3 바이러스를 감염시켜, 5% CO2 존재 하, 4℃에서 30분간 인큐베이트했다. 원심 침강 후, 배양 상청을 제거하고, 단계 희석한 펩티드 용액을 함유하는 150㎕의 배지를, MT-4 세포에 가했다. 5% CO2 존재 하, 37℃에서 3일간 인큐베이트했다. 인큐베이트 후의 배양 상청 중의 p24 농도(ng/㎖)를 시판의 ELISA 키트(ZeptoMetrix Corp., Buffalo, NY)를 사용하여 측정했다. 그 결과를 도 17 및 표 2에 나타낸다. 도 17로부터 알 수 있는 바와 같이, C34 펩티드 유도체 3량체(C34 tri)를 사용했을 경우에는, C34 천연 펩티드 단량체(C34 peptide)나, C34 펩티드 유도체 단량체(C34 monomer)를 사용했을 경우와 비교해서, p24 농도가 현저하게 저하했다. 이들의 결과로부터 산출한 EC50(μM)을 표 2에 나타낸다. 또, 표 2의 수치는 모두, 적어도 3회 이상 실험을 반복해서 얻어진 데이터의 평균값을 나타낸다. C34 천연 펩티드 단량체(C34)나, C34 펩티드 유도체 단량체(C34 REG)에서는 1μM 이상이었던 것에 대하여, C34 펩티드 유도체 3량체(triC34e)에서는 약 50nM이었다. 이것으로부터, C34 펩티드 유도체 3량체(triC34e)는, C34 천연 펩티드 단량체(C34)나, C34 펩티드 유도체 단량체(C34 REG)에 대하여, 각각 약 30배 또는 약 20배의 우수한 항HIV-1 활성을 갖고 있는 것이 나타났다.
[표 2]
또, 임상 시험이 행해진 기지의 항HIV 활성 펩티드로서, C34 펩티드 유도체 단량체 퓨전(fuzeon)(T-20/DP178)이 알려져 있다(비특허문헌 17). 비특허문헌 17에는, C34천연 펩티드 단량체 및 퓨전(DP178)의 MAGI 어세이에 의한 항HIV 활성측정 결과가 나타나 있으며, EC50값의 비교에 있어서 퓨전은 C34 천연 펩티드 단량체의 약 10배의 활성을 나타내는 것이 보고되어 있다. 이에 대하여 본원 실시예의 실험 결과에 나타나 있는 바와 같이, 본 발명의 C34 펩티드 유도체 3량체는, 어세이법은 다른지만 EC50값의 비교에 있어서, C34 천연 펩티드 단량체에 대하여 약 30배 높은 항HIV 활성을 나타내고 있다. 이들 지견으로부터, 본 발명의 C34 펩티드 유도체 3량체는, 퓨전과 비교해서 우수한 고활성인 항HIV 활성을 갖는 것으로 추정된다.
본 발명은, HIV 감염증의 예방이나 치료의 분야에 특히 유용하다.
SEQUENCE LISTING
<110> National University Corporation Tokyo Medical and Dental University
<120> Peptide inducing antibody recognizing conformation of HIV
<130> P10-040P
<150> JP 2011-082813
<151> 2011-4-4
<160> 1
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Inventor: Tamamura, Hirokazu ; Narumi, Tetsuo
Inventor: Nomura, Wataru ; Hashimoto, Chie
Inventor: Komano, Jun A. ; Miyauchi, Kosuke
<220>
<223> C34 peptide
<400> 1
Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His
1 5 10 15
Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu
20 25 30
Leu Leu
Claims (15)
- HIV 입자의 막 관통 단백질 gp41의 C 말단측의 헬릭스 영역 C34 펩티드의 유도체를 합성하는 공정, 및 3개의 등가인 링커 구조를 갖는 C3 대칭성을 갖는 템플레이트 화합물과, 전술한 C34 펩티드의 유도체를 결합함에 의해, C34 펩티드의 유도체의 3량체를 합성하는 공정으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 C34의 3량체 영역을 인식하는 HIV 입체 구조 인식 항체 유도 펩티드의 합성 방법.
- 제1항에 있어서,
HIV 입자의 막 관통 단백질 gp41의 C 말단측의 헬릭스 영역 C34 펩티드의 유도체를 합성하는 공정에 있어서의 C34 펩티드의 유도체가, C34의 천연의 서열인 C34 펩티드의 C 말단측에, 템플레이트 화합물과 결합하기 위하여 필요한 라이게이션 부위를 도입하고, 당해 C34 펩티드의 서열과 당해 라이게이션 부위와의 사이에는 입체 장해에 의한 반응성의 경감을 방지하기 위하여 스페이서 아미노산 잔기를 도입한 것임을 특징으로 하는 HIV 입체 구조 인식 항체 유도 펩티드의 합성 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
3개의 등가인 링커 구조를 갖는 C3 대칭성을 갖는 템플레이트 화합물로서, 하기 일반식(1)으로 표시되는 화합물 또는 그 염을 사용하는 것을 특징으로 하는 HIV 입체 구조 인식 항체 유도 펩티드의 합성 방법.
(식 중, X는 양의 정수를 나타냄). - 제3항에 있어서,
3개의 등가인 링커 구조를 갖는 C3 대칭성을 갖는 템플레이트 화합물로서, 하기 일반식(2)으로 표시되는 화합물 또는 그 염을 사용하는 것을 특징으로 하는 HIV 입체 구조 인식 항체 유도 펩티드의 합성 방법.
- 제1항에 있어서,
HIV 입자의 막 관통 단백질 gp41의 C 말단측의 헬릭스 영역 C34 펩티드의 유도체를 합성하는 공정에 있어서의 C34 펩티드의 유도체가, C34 펩티드의 C 말단측에 친수성 아미노산 잔기를 부여하고, 또한, 그 C 말단측에 라이게이션 부위를 도입하고, 당해 친수성 아미노산 잔기와 당해 라이게이션 부위와의 사이에는 입체 장해에 의한 반응성의 경감을 방지하기 위하여 스페이서 아미노산 잔기를 도입한 것임을 특징으로 하는 HIV 입체 구조 인식 항체 유도 펩티드의 합성 방법. - 제5항에 있어서,
HIV 입자의 막 관통 단백질 gp41의 C 말단측의 헬릭스 영역 C34 펩티드의 유도체를 합성하는 공정에 있어서의 C34 펩티드의 유도체가, 하기 일반식(3)으로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 HIV 입체 구조 인식 항체 유도 펩티드의 합성 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
3개의 등가인 링커 구조를 갖는 C3 대칭성을 갖는 템플레이트 화합물과, 전술한 C34 펩티드의 유도체를 결합함에 의해, C34 펩티드의 유도체의 3량체를 합성하는 공정이, 3개의 등가인 링커 구조를 갖는 C3 대칭성을 갖는 템플레이트 화합물과, C34 펩티드의 유도체를, 완충액 중에서 교반함에 의해, 3개의 등가인 링커 구조를 갖는 C3 대칭성을 갖는 템플레이트 화합물과, 전술한 C34 펩티드의 유도체를 결합시켜서, C34 펩티드의 유도체의 3량체를 합성하는 것을 특징으로 하는 HIV 입체 구조 인식 항체 유도 펩티드의 합성 방법. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 합성 방법에 의해 합성되는 것을 특징으로 하는 HIV 입자의 막 관통 단백질 gp41의 C 말단측의 헬릭스 영역 C34의 3량체 영역을 인식하는 HIV 입체 구조 인식 항체 유도 펩티드.
- 3개의 등가인 링커 구조를 갖는 C3 대칭성을 갖는 템플레이트 화합물을 통해, HIV 입자의 막 관통 단백질 gp41의 C 말단측의 헬릭스 영역 C34 펩티드의 유도체가 3분자 결합해 있는 것을 특징으로 하는 C34의 3량체 영역을 인식하는 HIV 입체 구조 인식 항체 유도 펩티드.
- 제8항 또는 제9항에 있어서,
하기 일반식(4)으로 표시되는 화합물 또는 그 염으로 이루어지는 HIV 입체 구조 인식 항체 유도 펩티드.
(식 중, X는 양의 정수를 나타내고, 단량체는 하기 일반식(5)으로 표시되는 화합물을 나타냄).
- 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 C34의 3량체 영역을 인식하는 HIV 입체 구조 인식 항체 유도 펩티드를 사용하여 숙주 동물을 감작(感作)하고, 당해 펩티드에 대한 항체를 유도하는 것을 특징으로 하는 C34의 3량체 영역을 인식하는 HIV 입체 구조 인식 항체의 유도 방법.
- 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드의 C34의 3량체 영역을 인식하는 HIV 입체 구조 인식 항체, 또는, 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드를 유효 성분으로 하는, HIV 감염증의 예방 및/또는 치료제.
- 제12항에 있어서,
HIV 감염증의 예방 및/또는 치료가, 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드의 항HIV 활성에 의한 것임을 특징으로 하는 HIV 감염증의 예방 및/또는 치료제. - 제12항에 있어서,
HIV 감염증의 예방 및/또는 치료가, HIV 입체 구조 인식 항체의, HIV 입자의 막 관통 단백질 gp41의 C 말단측의 헬릭스 영역 C34의 3량체 영역에의 작용에 의하여, gp41의 C34와 N36에 의한 6량체 형성을 저해해서, HIV의 표적 세포에의 침입을 저지하는 것임을 특징으로 하는 HIV 감염증의 예방 및/또는 치료제. - 제12항에 있어서,
제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드를 유효 성분으로 하는 HIV 감염증의 예방 및/또는 치료용 백신인 것을 특징으로 하는 HIV 감염증의 예방 및/또는 치료제.
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