KR20140026335A

KR20140026335A - 표적 세포(세포주) 선택을 위한 신속법

Info

Publication number: KR20140026335A
Application number: KR1020137013441A
Authority: KR
Inventors: 디트마르 랑; 일레인 비. 마틴; 게리 에이. 몬테규; 크리스토퍼 제이. 오'말리; 트레이시 에스. 루트; 캐럴 엠. 트림; 제인 에프. 포베이; 크리스토퍼 엠. 스말레스; 앤드류 제이. 레이쳐
Original assignee: 론자 바이올로직스 피엘씨
Priority date: 2010-10-27
Filing date: 2011-10-27
Publication date: 2014-03-05
Also published as: CN103189744B; HK1181849A1; US10139418B2; JP2013545449A; EP2633313A1; CN103189744A; US20170242029A1; ES2535608T3; EP2447717A1; CA2814697A1; TW201231661A; EP2633313B1; AU2011322921A1; WO2012055554A1; EP2447717B1; SG189087A1; EP2447717A9; ES2434737T3; JP5746768B2; US20130295596A1

Abstract

본 발명은 샘플 세포의 세포 배양 성능 데이터의 예측을 위한 처리방법, 상기 세포의 분리방법 및 샘플 세포의 세포 배양 성능 데이터의 예측을 위한 장치에 관한 것이다.

Description

표적 세포(세포주) 선택을 위한 신속법 {Rapid method for targeted cell(line) selection}

본 발명은 샘플 세포의 세포 배양 성능 데이터의 예측을 위한 방법, 상기 세포의 분리방법 및 샘플 세포의 세포 배양 성능 데이터의 예측을 위한 장치에 관한 것이다.

종래 기술에 따라 원하는 제조 특성을 갖는 재조합 포유동물의 세포주를 분리하는 방법은 원하는 특징의 특이적 조합을 분리하는 소스(source) 및 능력의 양면에서 비효율적이다.

예를 들면, Adrichem et al.(Anal. Chem., 1998, 70, 923-930)은 매트릭스-지원형 레이져 탈착/이온화 질량 분광분석법(MALDI 질량 분광분석법)에 의한 배양 상청액 내 단백질 패턴 및 포유동물 세포의 연구를 개시하고 있다. 상기 MALDI 질량 분광분석법은 배지에 분비되거나 또는 세포 용해물에 존재하는 단백질을 모니터함으로써 단백질 프로파일에 사용될 수 있다. MALDI 질량 분광분석법에 의해 검출된 질량은 16000 내지 수십만 달톤, 바람직하게는 수백 내지 수천 달톤의 범위이다. 이에 따라 얻어진 결과는 표준 SDS-PAGE 전기영동과 상보적이다. 따라서, 이러한 방법은 예를 들면, IgG 타입의 항체를 발현하는 하이브리도마 세포의 대규모 배양을 모니터하는데 사용될 수 있다.

Zhang et al.(J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2006, 17, 490-499)은 MALDI-TOF 및 LC-ESI-MS/MS 질량 분광분석법을 사용하는 포유동물 세포주의 동정을 개시하고 있다. MALDI-TOF 질량 분광분석법은 단일 세포로부터의 직접 펩티드 프로파일에 효과적이라고 기술되어 있다. LC-ESI-MS/MS 분석은 샘플 세포의 트립신에 의한 소화 후 유용한 서열 정보를 제공할 수 있다. 그것은 측정된 상이한 세포주를 동정하고 구별하는 핑거프린트(fingerprint)로서 사용될 수 있는 독특하고 재생 가능한 MALDI-MS 패턴을 생성한다는 것이 밝혀졌다. 그러나, 얻어진 MS 스펙트럼은 3개의 다른 포유동물 세포 타입을 구별하도록 선명하게 보이는 MS 피크에 기초하여 시각적으로 비교되었다. 대안으로서, Zhang et al.은 다른 기술-샘플을 소화하는데 필수적인 전기분무 이온화 및 탠덤(tandem) 질량 분광학(LC-ESI MS/MS)에 이은 액체 크로마토그래피의 조합-이 프로테옴(proteome) 프로파일 차이를 해결하는데 또한 유용하다는 것을 증명하고 있다.

Feng et al.(Rapid Commun. Mass Spectrom., 2010, 24, 1226-1230)은 매트릭스-지원형 레이져 탈착/이온화 타임-오브-라이트(time-of-light)(MALDI-TOF)를 사용하는 고/저 생산자(high/low producer) CHO 세포의 신속한 특성화를 개시하고 있다. 그것에 개시된 방법은 MALDI-TOF 스펙트럼을 분석하기 위한 2개의 통계적 방법 즉, 주성분분석(PCA) 및 선형부분최소자승법(PLS)을 적용함으로써 동일한 규모에서 동일한 배양 내에서 생성되는 경우 고 생산자 세포 및 저 생산자 세포를 구별할 수 있다. 특히, Feng et al.에 따른 방법은 동일한 규모 즉, 저규모에서 성장된 재조합 단백질 IFN-감마를 생성하는 상이한 세포주로부터 생산성 데이터간에 구별을 가능하게 한다. Feng et al.에 따르면 이러한 접근은 잠재적으로 세포 생산성을 예측하는데 사용될 수 있다. 사용되는 선형 PLS는 주어진 범위에서 세포주 서브패밀리를 발견하는 것과 관련하여 많은 변수를 갖는 데이터를 분석하는 능력으로부터 그것의 유용성을 끌어낸다.

상기 언급된 바와 같이 종래 기술, 특히 Feng et al.에 따른 방법은 단지 통계적 프로그램만, 즉, PLS 및 PCA에 의해 분석되는 MALDI-TOF 데이터는 주어진 배양 범위에서 저 생산자와 고 생산자를 구별하기 위해 사용될 수 있다는 것만을 시사한다.

그러나, 업-스케일링(up-scaling) 후기, 특히 큰 부피의 생물반응기(생물반응기)에서, 공지되지 않은 세포는 여전히 적은 부피를 갖는 배지에서 배양되는 반면, 종래 기술은 이러한 세포의 세포 특징을 예측하는 방법을 시사하지 못한다. 특히, PCA 및 PLS의 공지된 통계적 프로그램은 업-스케일링 후기 세포 특징의 정확하고 신뢰할 수 있는 예측을 위한 기초로서 사용되는데 불충분한 데이터를 생성한다.

단백질의 특이적 밸런스(balance)를 발현하는 초기의 세포주는 이 단계에서 예를 들면 고 생산성을 나타낼 수 있지만, 생물반응기에 대한 업-스케일링 단계 후에는 다른 요소, 그 중에서도 전단력(shear force), 부피 효과, 다른 발효조(fermenter) 타입 또는 형식, 배양 파라미터, 예를 들면 pH 및 기체-조절된 세포 밀도 차이에 기인하여 이러한 생산성이 더 나빠질 수 있다.

따라서, 큰 부피 범위를 의미하는 주어진 원하는 배양 범위 즉, 생물반응기 범위에서 상기 세포주의 성장 및 특이적 생성 특징, 예를 들어 증가된 부피 생산성을 예측할 수 있는, 세포주 발달 초기의 작은 부피에서만 배양된 많은 수의 세포주를 신속하게 스크리닝하는 능력을 갖는 방법이 필요하다.

따라서, 본 발명의 근간을 이루는 기술적 문제는 상기 확인된 문제를 극복하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 특히, 큰 부피 범위 배양 및/또는 고 생산성 조건 하, 특히 생물반응기 범위에서, 상기 수행을 위해 추가적으로 시간이 절약되고 비용은 적게 들지만 높은 예측 정확성을 갖는, 특히 업-스케일링의 초기 상태에서 세포 배양, 특히 생물반응기, 공지되지 않은 세포 특징을 갖는 세포 성능의 예측 방법을 제공하는 것이다.

이러한 문제는 본 발명의 독립항에 의해 해결된다.

따라서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 하나 이상의 샘플 세포의 세포 배양 성능 데이터 예측을 위한 방법, 바람직하게는 인 비트로(in vitro) 처리방법을 제공한다:

a) 바람직하게는 적은 부피의 배지에서 배양된 하나 이상의 샘플 세포의 프로브(probe), 표준 세포로부터의 세포 배양 성능 데이터 및 표준 세포로부터의 미가공 표준 MS(질량 분광분석법) 데이터를 제공하는 단계;

b) 하나 이상의 샘플 세포의 프로브를 MS 분석하여 미가공 샘플의 MS 데이터를 얻는 단계;

c) 미가공 표준 및 미가공 샘플 MS 데이터를 하나 이상의 1차 MS 신호처리방법에 적용하여 전-처리된 표준 및 샘플 MS 프로파일을 얻는 단계, 및

d) a) 단계로부터의 표준 세포로부터의 세포 배양 성능 데이터 및 c) 단계에서 얻은 전-처리된 샘플 및 표준 MS 프로파일을, 바람직하게는 PLS-DA(부분최소자승판별분석) 기반의 비교 평가를 포함하는 데이터 분석을 포함하는 2차 MS 신호처리방법에 적용하여 하나 이상의 샘플 세포의 세포 배양 성능 데이터를 예측하는 단계.

그러므로 본 발명은 공지되지 않은 세포 배양, 바람직하게는 생물반응기, 성능 데이터를 갖는 하나 이상의 샘플 세포의, 세포 배양, 바람직하게는 생물반응기, 성능 데이터의 정확하고 믿을 수 있는, 유리한 예측 방법을 제공하는데, 이는 특정 세포 배양, 바람직하게는 생물반응기, 세포의 생산성과 같은 성능 데이터의 예측 시간 및 비용을 절약할 수 있도록 해준다. 본 발명은 이러한 유리한 방법을 제공할 뿐만 아니라, 특히 상기 방법에 의해 제조, 및 특히 분리된 세포를 제공하는데, 여기서 상기 세포는 특히 원하는 세포 배양, 바람직하게는 생물반응기, 고 생산성과 같은 성능 데이터에 의해 특징지어진다. 나아가, 본 발명은 본 발명의 방법을 수행할 수 있는, 세포 배양 성능 데이터의 예측을 위한 장치를 제공한다.

보통 96 웰 플레이트로부터 1차 24 웰 플레이트, 그 다음 셰이크 플라스크, 최종적으로 생물반응기 범위로 업-스케일링하는 종래 기술과 대조적으로, 본 발명은 24 웰 플레이트 및 셰이크 플라스크 내에서의 배양 단계를 배제한다. 적은 부피, 예를 들면 96 웰 플레이트 내에서 배양된 하나 이상의 샘플 세포의 세포 배양, 바람직하게는 생물반응기, 성능 데이터의 예측 직 후, 생물반응기 내 배양이 수행될 수 있다.

본 발명에 따라서, PLS-DA는 하나의 변수에 기초한 관찰의 매우 특이적 클래스를 분리할 수 있도록 하여, PLS-DA의 사용으로 세포주에 대한 생산성 분류의 문제가 극복되고 그것의 세포 배양, 바람직하게는 생물반응기, 다른 범위에서의 성능이 예측될 수 있다.

본 발명의 내용에서 세포 배양 성능 데이터는 바람직하게 생물반응기 성능 데이터이다.

본 발명의 내용에서 용어 "하나 이상의 샘플 세포의 프로브"는 용어 "하나 이상의 샘플 세포의 샘플"과 동일한 의미를 갖는다.

본 발명의 내용에서 용어 "생물반응기 성능 데이터"는 세포가 큰 부피 조건 및/또는 고 생산성 조건, 특히 생물반응기 하에서 배양되거나 또는 재생되는 경우, 상기 세포의 행동 및 특징에 대한 데이터를 의미하는 것으로 이해된다. 생물반응기 성능 데이터는 바람직하게는 특이적 세포 생성물, 예를 들면 단백질, 특히 항체, 항체 단편 또는 융합된 항체, 항생물질에 대한 개개의 특이적인 세포 생산성, 상기 세포의 배양조건 또는 생존기간에 대한 데이터이다. 바람직한 구체예에서, 세포 생성물은 단백질, 특히 항체, 펩티드, 프로테오글리칸, 글리코단백질, 탄수화물, 지질, 항생물질 또는 호르몬이다.

용어 "표준 세포"는 주어진 범위, 바람직하게는 큰 부피 범위 및/또는 고 생산성 조건, 특히 생물반응기 범위에서 공지된 세포 배양 성능 데이터, 특히 공지된 특징 및 행동을 갖는 세포를 의미한다. 이러한 공지된 특징은 기술의 상태에 따른 방법에 의해 측정되고 분석되었다. 예를 들면, 세포 생산성은 ELISA (효소-연결면역흡수어세이)에 의해 결정될 수 있다.

본 발명의 내용에서 용어 "샘플 세포"는 하나 이상의 공지되지 않은 세포 배양 성능 데이터, 특히 세포 특징을 갖는 세포에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 샘플 세포의 하나 이상의 특징이 공지되어 있다.

본 발명의 내용에서 용어 "작은 부피의 배지"는 바람직하게는 1 ㎕ 내지 100 ℓ,바람직하게는 1 ㎕ 내지 90 ℓ,바람직하게는 1 ㎕ 내지 80 ℓ,바람직하게는 1 ㎕ 내지 70 ℓ,바람직하게는 1 ㎕ 내지 60 ℓ,바람직하게는 1 ㎕ 내지 50 ℓ,바람직하게는 1 ㎕ 내지 40 ℓ,바람직하게는 1 ㎕ 내지 30 ℓ,바람직하게는 1 ㎕ 내지 20 ℓ,바람직하게는 1 ㎕ 내지 10 ℓ,바람직하게는 1 ㎕ 내지 5 ℓ,바람직하게는 1 ㎕ 내지 4 ℓ,바람직하게는 1 ㎕ 내지 3 ℓ,바람직하게는 1 ㎕ 내지 2 ℓ,바람직하게는 1 ㎕ 내지 1 ℓ,바람직하게는 1 ㎕ 내지 0.5 ℓ,바람직하게는 1 ㎕ 내지 0.4 ℓ,바람직하게는 1 ㎕ 내지 0.3 ℓ,바람직하게는 1 ㎕ 내지 0.2 ℓ,바람직하게는 1 ㎕ 내지 0.1 ℓ,바람직하게는 1 ㎕ 내지 90 ㎖,바람직하게는 1 ㎕ 내지 80 ㎖,바람직하게는 1 ㎕ 내지 70 ㎖,바람직하게는 1 ㎕ 내지 60 ㎖,바람직하게는 1 ㎕ 내지 50 ㎖,바람직하게는 1 ㎕ 내지 40 ㎖,바람직하게는 1 ㎕ 내지 30 ㎖,바람직하게는 1 ㎕ 내지 20 ㎖,바람직하게는 1 ㎕ 내지 10 ㎖,바람직하게는 1 ㎕ 내지 5 ㎖,바람직하게는 1 ㎕ 내지 4 ㎖,바람직하게는 1 ㎕ 내지 3 ㎖,바람직하게는 1 ㎕ 내지 2 ㎖,바람직하게는 1 ㎕ 내지 1 ㎖,바람직하게는 1 내지 999 ㎕, 바람직하게는 1 ㎕ 내지 0.5 ㎖,바람직하게는 1 ㎕ 내지 0.4 ㎖,바람직하게는 1 ㎕ 내지 0.3 ㎖,바람직하게는 1 ㎕ 내지 0.2 ㎖,바람직하게는 1 ㎕ 내지 0.1 ㎖,바람직하게는 1 ㎕ 내지 50 ㎕, 바람직하게는 1 ㎕ 내지 40 ㎕, 바람직하게는 1 ㎕ 내지 30 ㎕, 바람직하게는 1 ㎕ 내지 20 ㎕, 바람직하게는 1 ㎕ 내지 10 ㎕, 바람직하게는 20 내지 90 ㎕, 바람직하게는 20 내지 80 ㎕, 바람직하게는 20 내지 70 ㎕, 바람직하게는 20 내지 60 ㎕, 바람직하게는 20 내지 50 ㎕, 바람직하게는 20 내지 40 ㎕, 바람직하게는 20 내지 30 ㎕, 바람직하게는 30 내지 70 ㎕, 바람직하게는 30 내지 60 ㎕, 바람직하게는 30 내지 50 ㎕, 바람직하게는 30 내지 40 ㎕, 바람직하게는 10 내지 100 ㎕, 바람직하게는 10 내지 90 ㎕, 바람직하게는 10 내지 80 ㎕, 바람직하게는 10 내지 70 ㎕, 바람직하게는 10 내지 60 ㎕, 바람직하게는 10 내지 50 ㎕, 바람직하게는 10 내지 40 ㎕, 바람직하게는 10 내지 30 ㎕, 바람직하게는 10 내지 20 ㎕, 바람직하게는 40 내지 60 ㎕, 바람직하게는 40 내지 50 ㎕의 부피를 갖는 배지를 의미한다.

본 발명의 내용에서 용어 "업-스케일링 초기 단계"는 세포가 상기 정의된 바와 같은 작은 부피의 배지 내에서 배양된 시점으로서 이해된다.

본 발명의 내용에서 용어 "생물반응기"는 하나 이상의 원하는 세포 생성물의 생성을 위한 세포를 함유할 수 있고, 바람직하게는 상기 원하는 세포 생성물의 생성 속도 및/또는 양의 관점에서 고 생산성을 가능하게 하는 컨테이너(container)를 의미한다. 특히 바람직한 구체예에서 생물반응기는 생물학적 활성 환경을 지탱하는 장치 또는 시스템이다. 특히 바람직한 구체예에서 본 발명의 생물반응기는 관심 있는 상기 세포 생성물의 산업적 및 상업적 생성에 적합한 컨테이너이다. 특히 바람직한 구체예에서 이러한 컨테이너는 고 생산성을 갖는 관심 있는 세포 생성물의 생성에 적합한 세포 배양 조건을 조성할 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서 생물반응기는 적어도 10 ℓ,적어도 20 ℓ,적어도 50 ℓ,적어도 100 ℓ,적어도 200 ℓ,적어도 300 ℓ,적어도 400 ℓ,적어도 500 ℓ,적어도 600 ℓ,적어도 700 ℓ,적어도 800 ℓ,적어도 900 ℓ,적어도 1000 ℓ,특히 적어도 2000 ℓ,적어도 3000 ℓ 또는 적어도 4000 ℓ 부피의 배지를 함유하고, 여기에서 사용된 바와 같이 "큰 부피" 또는 "큰 부피의 배지"로 불린다.

본 발명의 내용에서 2개의 성분 사이에 사용된 표현 "및/또는"은 상기 용어에 의해 연결된 양 성분이 누적 또는 대체 방식으로 언급됨을 설계하도록 한 것이다. 따라서, 표현 "A 및/또는 B"는, "A, B 또는 둘 다 중 어느 하나"를 의미하는 "A 또는 B" 및 "A 및 B"의 의미를 포괄한다.

따라서, 본 발명은 1단계 a) 적은 부피 및 그 안에 낮은 세포 농도, 바람직하게는 10⁴ 내지 10⁸, 바람직하게는 10⁴ 내지 10⁸ 생존 세포/㎖ 배양 배지를 갖는 배지 내에서 배양된 하나 이상의 샘플 세포의 프로브, 표준 세포의 세포 배양 성능 데이터 및 이의 미가공 표준 MS 데이터를 제공하는 1단계를 제공함으로써 통상의 기술자가 하나 이상의 샘플 세포, 특히 하나 이상의 세포주의 특징을 예측할 수 있게 하는 방법을 제공한다. 그 다음, 2단계에서 하나 이상의 샘플 세포는 질량 분광분석법 방법에 의해 분석된다. 3단계에서 하나 이상의 샘플 세포 및 표준 세포의 미가공 MS 데이터를 MS 신호처리방법으로 처리하여 하나 이상의 샘플 세포 및 표준 세포의 전-처리된 MS 프로파일을 얻는다. 4단계에서 표준 세포로부터의 세포 배양 성능 데이터 및 전-처리된 샘플 및 표준 MS 프로파일에 바람직하게는 PCA와 조합하여 통계적 방법 즉, PLS-DA를 적용한다. 이러한 통계적 프로그램은 표준 세포의 전-처리된 MS 프로파일에 대해 샘플 세포의 전-처리된 MS 프로파일을 비교하고 평가하는데 이용된다.

본 발명의 바람직한 구체예로서 단계 a)에서 하나 이상의 샘플 세포의 샘플이 MS 분석에 적용되도록 제공되어 단계 b)에서 이의 미가공 샘플 MS 데이터를 얻는다..

용어 "하나 이상의 샘플 세포의 프로브" 및 용어 "하나 이상의 샘플 세포의 샘플"은 샘플 세포의 정의된 수 즉, 하나 이상의 샘플 세포를 의미한다.

바람직하게, 샘플은 단계 a)에서 적은 부피의 배지에 제공되고 MS 분석에 적용되어 이의 미가공 샘플 MS 데이터를 얻는다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 배양을 종료한 후 바람직하게 샘플 내 세포의 농도는 10⁴ 내지 10⁸, 10⁵ 내지 10⁷, 특히 10⁶ 내지 10⁷ 생존 세포/㎖ 배양 배지이다.

본 발명은 세포 배양, 바람직하게는 생물반응기, 업-스케일링의 초기 단계에서 배양되는 하나 이상의 샘플 세포의 성능 데이터, 예를 들면 생산성의 예측을 가능하게 한다. 본 발명에 따른 방법은 예를 들면 높은 생산성의 세포주가 신속하게 발달하도록 하여 이에 따라 치료적 단백질 제조의 비용을 감소시키고 약제 개발에 속력을 더한다.

본 방법은 바람직하게는 생성물 발달 사이클의 초기 즉, 바람직하게는 1 내지 999 ㎕의 부피를 갖는 배양 배지가 사용되는 경우의 단계에서, 특히 큰-범위 생물반응기 특히, 10 리터를 이상의 부피에서 배양 배지를 함유하는 생물반응기 내에서, 바람직하게는 원하는 특질, 예를 들면 큰 부피 생산성을 갖는 세포, 세포주를 확인하기 위한 신규한 스크리닝 도구를 제공한다. 또한, 본 발명에 따른 방법은 발달 초기에, 예를 들면 고 생성물 생산성, 바람직하게는 적어도 1 g/ℓ,바람직하게는 적어도 5 g/ℓ 및 가장 바람직하게는 10 g/ℓ를 포함하는 특이적 세포 특징을 갖는 세포, 특히 세포주를 발견할 확률을 개선한다. 가치있는 세포, 바람직하게는 세포주를 확인하는 것뿐만 아니라, 본 방법은 또한 바람직하게는 개선된 특질, 예를 들면 치료적 단백질 제조, 특히 모노클론 항체 제조를 갖는 새로운 숙주 세포, 바람직하게는 세포주를 분리하는데 사용될 수 있다. 특히, PLS-DA의 통계적 방법과 MS 분석의 조합에 의해, 바람직하게는 PCA (주성분분석)와 PLS-DA의 조합에 의해, 본 방법은 다른 생성물 생산성 수준에서 패턴의 확인을 가능하게 하여, 빠르고, 적용 가능하다면, 자동 방식으로 그로부터 다른 범위에서 생산성을 예측하게 한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 세포 특이적 생산성, 바람직하게는 세포의 고 생성물 생산성은 적어도 0.1 g/ℓ/h, 바람직하게는 적어도 1 g/ℓ/h, 바람직하게는 적어도 5 g/ℓ/h, 바람직하게는 적어도 10 g/ℓ/h 및 가장 바람직하게는 10 g/ℓ/h이다.

고 생성 세포, 바람직하게는 세포주를 발견할 높은 확률은, 제조에 적합한 것이 확인되기 전에 스크리닝되어야 하는 세포, 바람직하게는 세포주의 수가 감소할 가능성을 갖는다, 스크리닝된 세포, 바람직하게는 세포주의 수가 감소함으로써, 요구되는 물질도 감소된다. 그 결과, 세포, 바람직하게는 세포주를 형성하는 동안 수반되는 폐기 물질의 발생이 더 적고 더 적은 공급원이 요구될 것이다. 더 높은 생성 세포, 바람직하게는 세포주는 생성물에 대한 시장의 수요를 공급하는데 요구되는 생물반응기 배양의 수를 감소시킬 것이다. 본 방법은 생성 처리 중 미가공 물질에 요구되는 조건, 특히 비용, 특히 미가공 물질, 및 장치의 세척 및 살균 둘 다에 사용되는 물을 감소시킬 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 세포 배양 성능 데이터, 바람직하게는 생물반응기 성능 데이터는 큰 부피에서 세포, 바람직하게는 샘플 세포 및/또는 표준 세포의 성능을 반영한다.

본 발명의 바람직한 구체예로서, 세포 배양, 바람직하게는 생물반응기 성능 데이터는 세포 특이적 생산성, 인테그랄(integral) 생존 세포 계수 또는 세포 생성물 농도, 특히 세포 특이적 생산성, 전 생존 세포 계수 또는 세포 생성물 농도 데이터이다.

특히 바람직한 구체예에서 세포 배양, 바람직하게는 생물반응기, 성능 데이터는 세포 특이적 생산성(qP)이다.

특히 바람직한 구체예에서 세포 배양, 바람직하게는 생물반응기, 성능 데이터는 전 생존 세포 계수 데이터(IVC)이다.

특히 바람직한 구체예에서 세포 배양, 바람직하게는 생물반응기, 성능 데이터는 세포 생성물 농도 데이터이다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 세포 생성물 농도 데이터는 세포 생성물의 역가 데이터이다.

용어 "역가"는 적정에 의해 결정된 배지, 바람직하게는 세포 배양 배지의 농도, 바람직하게는 생물반응기 내 농도를 의미한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 세포의 생성 안정성에 대한 데이터는 세포 배양 성능 데이터로서 이해되지 않는다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 샘플 세포 및/또는 표준 세포는 인간 세포주, 동물 세포주, 식물 세포주, 항체, 진균류의 세포, 박테리아의 세포, 이스트(yeast)의 세포 및 줄기 세포로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 샘플 세포 및 표준 세포 둘 다는 동일한 세포 타입, 특히 세포주 또는 균주로부터 선택된다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 샘플 세포는 CHO 세포주, 바람직하게는 CHO-K1 세포주, 바람직하게는 변형된 CHO-K1 세포주다. 본 발명의 바람직한 구체예에서 표준 세포는 또한 CHO 세포주, 바람직하게는 CHO-K1 세포주(ATCC 번호: CCL-61™), 바람직하게는 변형된 CHO-K1 세포주다.

CHO-K1 세포주는 부모(parental) CHO 세포주의 서브클론(subclone)으로, 다 성장한(adult) 차이니즈 햄스터(Chinese hamster)의 난소로부터 유래하였다. CHO-K1 세포는 글루탐산이 글루타민 γ-세미알데하이드로 전환되는 단계에서 일어나는 생합성 체인에서 블록(block)을 갖는 플로린 합성을 위한 유전자가 부재하여, 플로린을 필요로 한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 하나 이상의 샘플 세포와 비교하여, 표준 세포의 하나 이상의 부분, 바람직하게는 모두가 다른 세포 생성물, 바람직하게는 단백질, 바람직하게는 항체를 발현한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 표준 세포의 하나 이상의 부분, 바람직하게는 모든 세포주 구성은 하나 이상의 샘플 세포의 그것과 다르다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 단계 b)에서 사용되는 MS 분석은 MALDI-TOF, LC-ESI-MS(액체 크로마토그래피 전기분무 이온화 질량 분광분석법) 및 LC-ESI-MS/MS(전기분무 이온화와 함께 텐덤 질량 분광분석법과 짝지어진 액체 크로마토그래피)로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 단계 b)에서 사용되는 MS 분석은 MALDI-TOF이다. MALDI-TOF에 적용되는 샘플 세포는, 예를 들면 트립신에 의해 소화될 필요는 없으나, 세포의 매우 간단한 준비에 의해 온전한 형태의 매트릭스 내로 내장될(embeded) 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 단계 b)에서 사용되는 MS 분석은 LC-ESI-MS이다. LC-ESI-MS 분석은 생산성, 성장 및 다른 바람직한 특징의 관점에서 세포주 사이에 특정한 큰 식별력을 제공한다. LC-ESI-MS 분석은 추가적인 규모의 정보를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 미가공 표준 MS 데이터는 MALDI-TOF, LC-ESI-MS 및 LC-ESI-MS/MS, 바람직하게는 MALDI-TOF로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 MS 분석에 의해 얻어진다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, MALDI-TOF MS 또는 LC-ESI-MS에 사용되는 이온화는 질량 억제(suppression) 및 펄스 이온 추출과 함께 또는 단독으로 기기-특이적(instrument-specific) 파라미터에 따른 최적의, 예를 들면 장치-의존의 음성 또는 양성 반사 모드 또는 양성 또는 음성 선형 모드에서 수행된다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, MALDI-TOF 질량 분광계 기기의 다음과 같이 셋팅(setting)이 본 발명에 따른 방법에 사용된다:

극성: +ve

억제: 1000 Da (달톤)

범위: 1000 내지 50000 Da

본 발명의 바람직한 구체예에서 MALDI-TOF 및 LC-ESI-MS MS 분석 동안 질량 억제는 500 Da미만, 바람직하게는 1000 Da 미만 및 가장 바람직하게는 1500 Da미만이다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 MALDI-TOF 및 LC-ESI-MS MS 분석 동안 질량 억제는 500 Da 이상, 바람직하게는 1000 Da 이상 및 가장 바람직하게는 1500 Da 이상이다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 MALDI-TOF 및 LC-ESI-MS MS 분석 동안 검출되는 범위는 200 내지 100000 Da, 바람직하게는 200 내지 60000 Da, 바람직하게는 500 내지 50000 Da, 바람직하게는 1000 내지 100000 Da, 1000 내지 18000 Da, 바람직하게는 500 내지 10000 Da 및 가장 바람직하게는 200 내지 8000 Da이다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 샘플 세포는 MS 분석, 바람직하게는 MALDI-TOF에 적용되기 전에 세척되고, 바람직하게는 버퍼 용액으로 세척된다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 하나 이상의 샘플 세포는 MS 분석, 바람직하게는 MALDI-TOF에 적용되기 전에, 포스페이트 완충된 살린(PBS) 단독으로 세척되거나 또는 PBS에 이어서 수성 수크로스 용액, 특히 0.2 내지 0.7 M, 바람직하게는 0.3 내지 0.5 M, 바람직하게는 0.35 M 수크로스를 갖는 수성 수크로스 용액에 의한 세척 단계로 세척된다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, MALDI-TOF 분석에 사용되는 매트릭스는 시나핀산(SA)이다. 본 발명에 따라 MALDI-TOF MS 분석에서 매트릭스로서 시나핀산(SA)의 사용은 특정한 넓은 범위의 피크, 바람직하게는 70 kDa 이하의 피크를 갖고 높은 해상도의 유리한 스펙트럼을 제공한다. 본 발명의 추가적인 구체예에서 2,5-디하이드록시벤조산(DHB) 또한 매트릭스로서 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 단계 b)에서 적용되는 하나 이상의 샘플 세포의 프로브는 1 x 10⁶ 세포, 바람직하게는 0.015 x 10⁶ 내지 0.0625 x 10⁶ 세포, 특히 0.03 x 10⁶ 세포 이하를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 MS 프로파일은 낮은 온도, 예를 들면 0 내지 10　℃, 바람직하게는 2 내지 8 ℃, 특히 4 ℃에서, 1 내지 5 시간, 바람직하게는 1 내지 4 시간, 특히 1 내지 3 시간의 적응 후 얻어져, 최상의 재생성 및 노이즈(noise)-함유 질량 스펙트럼에 대한 더 낮은 신호를 야기한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 샘플 세포는 특이적인 성장 시간에 MS 분석에 적용된다. 바람직한 샘플링 시간은 세포 성장의 중기 및/또는 말기 로그 기(log phase)이다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 단계 b)에서 얻어진 미가공 샘플 MS 데이터 및/또는 단계 a)에서 제공된 미가공 표준 MS 데이터는 기저선(baseline) 보정(correction), 표준화(normalisation), 정렬(alignment), 필터링 및 크롭핑(cropping)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 조작에 의해 신호처리된다.

바람직한 구체예에서, 단계 c)에서 사용된 1차 MS 신호처리는 기저선 보정, 표준화, 정렬, 필터링 및 크롭핑으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다

MS 데이터 프로파일은 MALDI 매트릭스 내 화학적 노이즈 및 이온 오버로딩(overloading)과 같은 문제에 기인하여, 전형적으로 다양한 기저선을 나타낸다. 프로파일 간에 유사성을 측정하기 위해 그것의 이용된 거리 매트릭스에 의한 MS 프로파일과 비교하려 데이터 분석 기술을 사용하는 경우, 이는 바람직하지 않다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구체예에서 미가공 샘플 및/또는 표준 MS 데이터는 기저선 보정 조작에 의해 신호처리된다.

MS 프로파일에서 흔히 관찰되는 또 다른 현상은 이온 강도의 진폭에서 편차이다. 이것은 샘플 제조에서 편차와 같은 다수의 요소 또는 기기의 민감도 변화에 의해 일어날 수 있다. 그러므로, 본 발명의 바람직한 구체예에서 미가공 샘플 및/또는 표준 MS 데이터는 표준화의 조작에 의해 신호처리된다.

피크 정렬은 관찰된 M/Z 값 및 실제 비과시간(time of flight) 사이에 편차를 보정하기 위해 사용된다. 이러한 오차는 보통 교정 오차의 결과로서 나타나고 피크간에 대칭 이동으로서 관찰될 수 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구체예에서 미가공 샘플 및/또는 표준 MS 데이터는 피크 정렬 조작에 의해 신호처리된다.

MS 프로파일의 필터링은 신호 바람직하게 Savitzky-Golay 필터에 의해 신호를 스무싱(smoothing) 함으로써 수행된다. 그러므로, 본 발명의 바람직한 구체예에서 미가공 샘플 및/또는 표준 MS 데이터는 필터링 조작에 의해 신호처리된다.

MS 프로파일의 크롭핑은 정보를 거의 또는 전혀 함유하지 않는 신호의 부분을 제거하기 위해 수행된다. 바람직하게는 0 내지 500 m/z 유닛 범위가 MS 스펙트럼으로부터 제거된다. 그러므로, 본 발명의 바람직한 구체예에서 미가공 샘플 및/또는 표준 MS 데이터는 크롭핑 조작에 의해 신호처리된다.

본 발명은 재-샘플화된다. 이러한 특이적 바람직한 처리 단계는 스펙트럼 내에 함유된 정보를 보존하는 중에, 즉, 측정된 다른 데이터 포인트 채널의 양을 변화시키는 중에 오리지널 신호의 업-샘플링(up-sampling) 및 다운-샘플링(down-sampling)을 가능하게 한다. 전형적으로, 재-샘플링은 컴퓨터 메모리의 부족과 같은 컴퓨터의 제약에 기인하여 오리지널의 높은 해상도 MS 신호가 작업에 비실용적인 경우의 상황에 이용된다. 재-샘플링은 다중 스펙트럼의 라이닝 업(lining up)을 촉진하는, 일정한 m/z 범위를 생성하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 하나 이상의 샘플 세포의 샘플은 적어도 50,000까지, 바람직하게는 m/z 벡터에 있어서 약간의 차이까지 업-샘플링된다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 미가공 표준 및 샘플 MS 데이터는 시각적으로 분석된다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 단계 c)에서 얻어진 전-처리된 표준 및 샘플 MS 프로파일은 바람직하게는 가외치(outlier)를 검출하고 보통의 결함 있는 전-처리된 표준 및 샘플 MS 프로파일을 제거하기 위해 광학적으로 분석된다

바람직한 구체예에서, 단계 c)에서 사용된 1차 MS 신호처리방법은 바람직하게는 하기의 순서로, 미가공 표준 및/또는 샘플 MS 데이터의 재샘플링, 기저선 보정, 필터링, 정렬, 시각적 분석 및 표준화 단계를 포함한다

본 발명의 바람직한 구체예에서 단계 d)에서 평가된 예측된 세포 배양, 바람직하게는 생물반응기, 성능 데이터를 갖는 샘플 세포는 세포 배양, 바람직하게는 생물반응기에서 배양되어, 그것의 세포 배양, 바람직하게는 생물반응기, 성능 데이터를 입증한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 단계 b)에서 얻어진 미가공 샘플 MS 프로파일 및 입증된 샘플 세포의 생물반응기 성능 데이터는 단계 a)에서 표준 세포로부터의 표준 MS 데이터 및 생물반응기 성능 데이터로서 사용된다. 더 많은 수의 그것의 공지된 세포 배양, 바람직하게는 생물반응기, 성능 데이터를 갖는 표준 세포로부터의 MS 프로파일을 제공함으로써 예측의 가능성, 바람직하게는 신뢰성이 더욱 정확하고 믿을 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 단계 d)에 따른 PLS-DA 모델은 2개의 다른 정보 세트 즉, x-블록 및 y-블록을 필요로 한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서 x-블록은 처리의 96 DWP (딥(deep) 웰 플레이트) 단계에서 생성되는 전-처리된 샘플 MS 데이터 내로부터의 정보를 함유한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서 각각의 전-처리된 샘플 MS 데이터는 변수로 처리되는 m/z 값의 구체적인 범위를 초과하여 기록된 신호 강도를 갖는, 샘플로서 처리된다. 본 발명의 바람직한 구체예에서 y-블록은 각각의 전-처리된 표준 MS 데이터를 클래스 변수(class variable)에 할당하는 정보를 함유한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서 y-블록은 정보, 바람직하게는 생물반응기 범위에서 세포주 생산성의 특이적 측정과 관련된 정보를 함유하고, 이는 생성물 농도, 특이적 생산성 또는 인테그랄 생존 세포 계수를 의미한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 통계적 프로그램 PLS-DA는 안정한 세포주 및 불안정한 세포주를 구별하는데 적용되지 않는다. 본 발명의 바람직한 구체예에서 통계적 프로그램 PLS-DA는 본 발명에 따른 처리에 사용되는 유일한 통계적 프로그램이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서 통계적 프로그램 PLS-DA 및 PCA는 본 발명에 따른 처리에 사용되는 유일한 통계적 프로그램이다. 바람직하게는, 미가공 표준 및 미가공 샘플 MS 데이터는 단계 d)에서 PLS-DA-기반 비교 평가를 포함하는 2차 MS 신호처리방법에 적용되기 전에, 단계 c)에서 통계적 분석, 바람직하게는 PLS를 사용하지 않고 전-처리되어 하나 이상의 샘플 세포의 세포 배양 성능 데이터를 예측한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 x-블록 데이터를 사용하여, 잠재 변수 공간으로의 원 변수 공간 PLS 맵핑(mapping)이 수행된다. 이것은 오리지널 데이터 내의 가능한 많은 변동을 기술하는 동안 문제의 차원수(dimensionality)를 감소시키는 효과를 갖는다. 본 발명의 바람직한 구체예에서 PLS-DA 알고리즘은 y-블록 내의 정보를 이용하여 y-블록 내에 저장된 클래스 정보 기반의 x-블록 데이터를 잘 분리하는 선형 구별 경계에 적합하게 한다. y-블록 내에 기술된 2개의 클래스만 존재하는 경우, 단일 구별 경계는 충분하다. 3개 이상의 클래스가 존재하는 경우, 클래스 샘플 내부는 각각의 이용 가능한 클래스에 대한 클래스 샘플 외부와 비교되어야 한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 다음의 클래스는 PLS-DA 기반 비교 평가에 사용되어 인테그랄 생존 세포 계수 데이터를 예측한다:

- 고 > 4500 x 10⁶ 세포 x h/㎖,

- 4500 x 10⁶ 세포 x h/㎖ > 중간 > 3250 x 10⁶ 세포 x h/㎖, 및

- 저 < 3250 x 10⁶ 세포 x h/㎖.

본 발명의 바람직한 구체예에서 다음의 클래스는 PLS-DA 기반 비교 평가에 사용되어 세포 특이적 생산성 데이터를 예측한다:

- 고 > 2.35 pg x 세포 x h,

- 2.35 pg x 세포 x h > 중간 >1.75 pg x 세포 x h, 및

- 저 < 1.75 pg x 세포 x h.

본 발명의 바람직한 구체예에서 다음의 클래스는 PLS-DA 기반 비교 평가에 사용되어 세포 생성물 농도 데이터를 예측한다:

- 고 > 4 g/ℓ, 및

- 저 < 4g/ℓ

본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 세포로부터 세포 생성물, 바람직하게는 단백질의 생성을 위한 처리에 관한 것이다:

a) 본 발명의 방법에 따라 세포 배양 성능 데이터를 예측하는 단계,

b) 원하는 세포 배양 성능 데이터를 갖는 샘플 세포를 동정하는 단계,

c) 바람직하게는 큰 부피의 배지에서 단계 b)에서 동정된 상기 샘플 세포를 배양하는 단계, 및

d) 단계 c)에서 배양에 의해 생성된 세포 생성물, 바람직하게는 단백질을 얻는 단계.

바람직하게는, 세포 생성물, 바람직하게는 단백질의 생성을 위한 처리에서, 단계 a)에서 세포 배양 성능 데이터가 예측된 샘플 세포는 큰 부피의 배지에서 배양된다.

또한, 본 발명은 원하는 세포 배양, 바람직하게는 생물반응기, 성능 데이터를 갖는 세포의 제조, 특히 분리를 위한 처리를 제공하고, 여기에서 세포 배양, 바람직하게는 생물반응기, 하나 이상의 샘플 세포의 성능 데이터의 예측을 위한 방법이 수행되고 하나 이상의 원하는 세포가 제조, 바람직하게는 분리된다.

본 발명은 본 발명에 따른 처리에 의해 얻어진, 특히 분리된 세포를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 분리된 세포는 적어도 1 g/ℓ,바람직하게는 적어도 5 g/ℓ,바람직하게는 적어도 6, 7, 8, 9 g/ℓ 또는 바람직하게는 적어도 10 g/ℓ의 단백질 생산성이 특징이다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 분리된 세포는 적어도 0.1 g/ℓ/h, 바람직하게는 적어도 1 g/ℓ/h, 바람직하게는 적어도 5 g/ℓ/h, 바람직하게는 적어도 6, 7, 8, 9 g/ℓ/h 또는 바람직하게는 적어도 10 g/ℓ/h의 단백질 생산성이 특징이다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 분리된 세포는 적어도 0.1 g/ℓ/h/세포, 바람직하게는 적어도 1 g/ℓ/h/세포, 바람직하게는 적어도 5 g/ℓ/h/세포, 바람직하게는 적어도 6, 7, 8, 9 g/ℓ/h/세포 또는 바람직하게는 적어도 10 g/ℓ/h/세포의 단백질 생산성이 특징이다.

또한, 본 발명은 바람직하게는 a) 샘플 세포의 미가공 샘플 MS 데이터를 얻기 위해 MS 분석(질량 분석법)에 적어도 샘플 세포의 프로브를 적용하기 위한 목적에 맞는 수단, (b) 전-처리된 표준 및 샘플 MS 프로파일을 얻기 위해 하나 이상의 1차 MS 신호처리방법에 미가공 표준 및 미가공 샘플 MS 데이터를 적용하기 위한 목적에 맞는 수단 및 (c) 세포 배양, 바람직하게는 생물반응기, 표준 세포 및 전-처리된 샘플의 성능 데이터 및 표준 MS 프로파일을 PLS-DA(부분 최소 제곱 판별 분석) 기반 비교 평가를 포함하는 2차 MS 신호처리방법에 적용하여 샘플 세포의 생물반응기 성능 데이터를 예측하기 위한 목적에 맞는 수단을 포함하는, 바람직하게는 하나 이상의 샘플 세포의 프로브가 공급되는 경우, 세포 배양 성능 데이터의 예측을 제공하는 목적에 맞는, 세포 배양, 바람직하게는 생물반응기, 하나 이상의 샘플 세포의 성능 데이터의 예측을 위한 장치에 의해 그것의 근본적인 문제를 해결한다

더욱 바람직한 구체예는 종속항의 보호 대상이다.

본 발명은 다음의 실시예 및 대응하는 도의 방식으로 추가 기술된다.
도 1a 및 1b는 1000 데이터 포인트로 재-샘플링 전후 전형적인 MS 프로파일을 보여준다.
도 2a 및 2b는 기저선 보정 전후 전형적인 MS 프로파일을 보여준다.
도 3a 및 3b는 표준화 전후 전형적인 MS 프로파일을 보여준다.
도 4a 및 4b는 Savitzky-Golay 스무싱 전후 전형적인 MS 프로파일을 보여준다.
도 5a 및 5b는 정보가 거의 없거나 또는 정보가 없는 스펙트럼 영역의 크롭핑 전후 전형적인 MS 프로파일을 보여준다.
도 6a, 6b 및 38은 전형적 관련 MS 프로파일(6b)을 갖고 미가공 MS 프로파일(6a, 38)을 사용하는 PC1 대 PC2의 스코어 플랏(score plot)을 보여준다.
도 7a, 7b 및 39는 전형적 관련 MS 프로파일(7b)을 갖는 기저선 보정에 적용된 MS 프로파일(7a, 39)을 사용하는 PC1 대 PC2의 스코어 플랏을 보여준다.
도 8a, 8b 및 40은 전형적 관련 MS 프로파일(8b)을 갖는 기저선 보정 및 표준화에 적용된 MS 프로파일(8a, 40)을 사용하는 PC1 대 PC2의 스코어 플랏을 보여준다.
도 9a, 9b 및 41은 전형적 관련 MS 프로파일(9b)을 갖는 기저선 보정, 표준화 및 크롭핑 (9a, 41)에 적용된 MS 프로파일을 사용하는 PC1 대 PC2의 스코어 플랏을 보여준다.
도 10은 PLS_Toolbox(Toolbox)의 PLSDA 분석 플로우 차트를 보여준다.
도 11a 및 11b는 PLS_Toolbox의 PLSDA 임포트 다이알로그 박스(import dialogue box)를 보여준다.
도 12는 PLS_Toolbox의 PLSDA 클래스 그룹 선택 다이알로그 박스를 보여준다.
도 13은 PLS_Toolbox의 PLSDA 데이터 재-처리 옵션을 보여준다.
도 14는 PLS_Toolbox의 PLSDA 교차 검증 다이알로그 박스를 보여준다.
도 15a 내지 15d 및 42 내지 45는 다양한 PLSDA 스코어 플랏을 보여준다: (15a, 42) Bivariate 스코어 플랏, (15b, 43) Hotelling's T2 플랏, (15c, 44) 모델 예측 플랏 및 (15d, 45) 모델 예측 확률 플랏.
도 16a, 16b, 46 및 47은 PLSDA 로딩 플랏을 보여준다: (16a, 46) 잠재적 변수 1 및 (16b, 47) 잠재적 변수 2.
도 17 및 48은 Y예측 클래스 1에 대한 PLSDA 결정 경계 플랏을 보여준다.
도 18 및 49는 Y예측 클래스 1에 대한 PLSDA 확률을 보여준다.
도 19a 및 19b는 항체-생성 세포주 CHO 2, 42 및 52로부터의 LC-ESI-MS 데이터와 비교한 PLSDA 분석을 보여준다.
도 20은 2 g/ℓ 미만 및 2 g/ℓ 이상으로 그룹지어진 샘플을 갖는 7개의 항체-생성 CHO 세포주 (2, 42, 52, 75, 106, 144 및 164)로부터의 LC-ESI-MS 데이터와 비교한 PLSDA 분석을 보여준다.
도 21a 및 21b는 기저선 보정 및 표준화를 포함하는 MS 신호처리방법(21a) 및 재샘플링, 기저선 보정, 필터링, 정렬, 시각 분석 및 표준화를 포함하는 MS 신호처리방법(21b)으로 전-처리된 MS 프로파일을 보여준다.
도 22는 미가공 MS 데이터의 재샘플링, 기저선 보정, 필터링, 정렬, 시각 분석 및 표준화, 및 차후 PLS-DA 모델링을 포함하는 본 발명에 따른 미가공 MS 데이터의 전-처리를 사용하는 세포주 라운드 1 예측에 대한 Y 예측 플랏을 보여준다.
도 23은 본 발명에 따른 전-처리를 사용하는 세포주 라운드 1 예측에 대한 LV1 대 LV2를 보여준다.
도 24는 미가공 MS 데이터의 재샘플링, 기저선 보정, 필터링, 정렬, 시각 분석 및 표준화, 및 차후 PLS-DA 모델링을 포함하는 본 발명에 따른 미가공 MS 데이터의 전-처리를 사용하는 세포주 라운드 2 예측에 대한 Y 예측 플랏을 보여준다.
도 25는 본 발명에 따른 전-처리를 사용하는 세포주 라운드 2 예측에 대한 LV1 대 LV2를 보여준다.
도 26은 미가공 MS 데이터의 재샘플링, 기저선 보정, 필터링, 정렬, 시각 분석 및 표준화, 및 차후 PLS-DA 모델링을 포함하는 본 발명에 따른 미가공 MS 데이터의 전-처리를 사용하는 세포주 라운드 3 예측에 대한 Y 예측 플랏을 보여준다.
도 27은 본 발명에 따른 전-처리를 사용하는 세포주 라운드 3 예측에 대한 LV1 대 LV2를 보여준다.
도 28 미가공 MS 데이터의 재샘플링, 기저선 보정, 필터링, 정렬, 시각 분석 및 표준화, 및 차후 PLS-DA 모델링을 포함하는 본 발명에 따른 미가공 MS 데이터의 전-처리를 사용하는 세포주 라운드 4 예측에 대한 Y 예측 플랏을 보여준다.
도 29는 본 발명에 따른 전-처리를 사용하는 세포주 라운드 4 예측에 대한 LV1 대 LV2를 보여준다.
도 30은 미가공 MS 데이터의 재샘플링, 기저선 보정, 필터링, 정렬, 시각 분석 및 표준화, 및 차후 PLS-DA 모델링을 포함하는 본 발명에 따른 미가공 MS 데이터의 전-처리를 사용하는 세포주 라운드 5 예측에 대한 Y 예측 플랏을 보여준다.
도 31은 본 발명에 따른 전-처리를 사용하는 세포주 라운드 5 예측에 대한 LV1 대 LV2를 보여준다.
도 32는 미가공 MS 데이터의 재샘플링, 기저선 보정, 필터링, 정렬, 시각 분석 및 표준화, 및 차후 PLS-DA 모델링을 포함하는 본 발명에 따른 미가공 MS 데이터의 전-처리를 사용하는 세포주 라운드 3 예측에 대한 IVC Y 예측 플랏을 보여준다.
도 33은 미가공 MS 데이터의 재샘플링, 기저선 보정, 필터링, 정렬, 시각 분석 및 표준화, 및 차후 PLS-DA 모델링을 포함하는 본 발명에 따른 미가공 MS 데이터의 전-처리를 사용하는 세포주 라운드 4 예측에 대한 IVC Y 예측 플랏을 보여준다.
도 34 미가공 MS 데이터의 재샘플링, 기저선 보정, 필터링, 정렬, 시각 분석 및 표준화, 및 차후 PLS-DA 모델링을 포함하는 본 발명에 따른 미가공 MS 데이터의 전-처리를 사용하는 세포주 라운드 5 예측에 대한 IVC Y 예측 플랏을 보여준다.
도 35는 미가공 MS 데이터의 재샘플링, 기저선 보정, 필터링, 정렬, 시각 분석 및 표준화, 및 차후 PLS-DA 모델링을 포함하는 본 발명에 따른 미가공 MS 데이터의 전-처리를 사용하는 세포주 라운드 3 예측에 대한 qP Y 예측 플랏을 보여준다.
도 36은 미가공 MS 데이터의 재샘플링, 기저선 보정, 필터링, 정렬, 시각 분석 및 표준화, 및 차후 PLS-DA 모델링을 포함하는 본 발명에 따른 미가공 MS 데이터의 전-처리를 사용하는 세포주 라운드 4 예측에 대한 qP Y 예측 플랏을 보여준다.
도 37은 미가공 MS 데이터의 재샘플링, 기저선 보정, 필터링, 정렬, 시각 분석 및 표준화, 및 차후 PLS-DA 모델링을 포함하는 본 발명에 따른 미가공 MS 데이터의 전-처리를 사용하는 세포주 라운드 5 예측에 대한 qP Y 예측 플랏을 보여준다.

실시예 1 - 세포주 생성 (기술 상태에 따름)

모델 마우스-인간 키메릭 IgG4 또는 IgG1 항체(Kalwy et al., Mol. Biotechnol 2006, 34, 151-156) 의 발현을 위한 유전자-최적화된 중쇄 및 경쇄 유전자를 함유하는 GS 발현 벡터(Lonza)를 사용하여 GS-CHO 세포주를 발현하는 재조합 항체를 생성하였다. 표준 전기천공 방법을 사용하여 벡터를 숙주 세포주, CHOK1SV(CHO-K1의 유도체; Lonza) 내로 도입하였고 형질감염 혼합물을 80개의 96-웰 플레이트에 분배하였다. 플레이트를 37℃의 습한 10% CO₂ 대기 중에서 배양하였다. 다음날, 신선한 배지를 플레이트 내의 세포 현탁액에 첨가하였다. 배지 내 MSX (메티오닌 설폭사민) 농도는 각각의 웰의 최종 MSX 농도가 50 μM인 정도로 하였다. 형질감염 대략 3 주 후에 글루타민-비의존성 감염체에 대하여 플레이트를 1차 스크리닝하였다. 전형적 세포주 구성 전략의 모든 평가 단계를 통해 분리된 감염체 콜로니(단일 콜로니를 갖는 웰로부터 유래하는 것으로 각각 동정됨)를 진행하였다.

Vi-세포™자동 세포 생존능력 분석기 (Beckman Coulter)를 사용하여 배양의 세포 농도를 결정하였다. 2.0 x 10⁵ 생존 세포/㎖의 표적 세포농도 및 전형적으로 30 ㎖의 최종 부피를 갖는 125 ㎖ 셰이크-플라스크에서 배양을 설정하였다. 세포주를 4일 체제에 의해 연속적으로 2차 배양하였다. 2차 배양에서 용인될 수 있는 세포 농도에 도달하고 2차 배양간 생존 세포 농도의 임의의 큰 변동이 중단되면, 현탁액 배양 내 수행된 평가 단계를 개시하였다. 1차 현탁액 평가 ("배치")에 따라 세포주를 랭크(rank)한 후, "페드-배치(fed-batch)" 평가를 수행하였다. 페드-배치 평가의 경우, Vi-세포™자동 세포 생존능력 분석기를 사용하여 7일째 및 14일째 배양의 세포 농도를 결정하였다. 3일째에 공급 A를 볼러스(bolus) 첨가하였고 8일째 및 11일째 공급 B를 볼러스 첨가하였다. 항체 농도 결정을 위해 각각 다른 날에 배양 상청액의 샘플을 취하였다. 대체하여, MACSQuant®분석기로 세포 생존능력 분석이 이루어질 수 있다.

실시예 2 - MALDI - TOF 분석을 위한 샘플 세포의 제조

별도로 구체화하지 않는 한, 모든 실험은 실시예 1 (첫 번째 문단)으로 개괄된 동일한 배양 조건하에서 수행하였다. 샘플 프로브 (샘플을 의미함)를 MS 분석에 적용하기 전에 세포를 카운팅(counting)하였고 적절한 수의 세포를 제공하기 위해 필요한 배양을 계산하였다. 처리 전 즉시 인큐베이터(96 웰 플레이트)로부터 세포를 제거하였다. 각 샘플의 필요한 부피를 에펜도르프(Eppendorf) 튜브로 옳기고, 에펜도르프 마이크로퓨지(Eppendorf microfuge) (model 5417c, rotor F-45-30-11) 내에서 960 rcf (3000 rpm)로 5분간 원심분리하였으며 상청액을 제거하였다. 그 다음, 세포를 PBS (포스페이트 완충된 살린) 1 ㎖로 온화하게 피펫팅(gently pipetting)하여 세척한 다음 상기와 같이 원심분리하였다. 별도 명기된 경우, 상기 기술된 바와 같은 우너심분리 후 이어서 세포를 0.35 M 수크로스 1 ㎖로 세척하고 상척액을 분리하였다. 그 시점에 세포 펠릿(pellet)은 추후 핸들링(handling)을 위해 저장될 수 있고 (-80℃) 또는 즉시 MS 분석을 위해 처리될 수 있다. 저장한 경우, 냉동 세포 펠릿은 사용 전 해동 후 실온과의 평형이 요구된다.

포화 용액을 생성하는 매트릭스 버퍼 (40% 아세토니트릴, 60% 0.1% TFA) 내에서 시나핀산 20 mg/㎖ 용액을 제조하였다. 그 다음, 시나핀산 용액을 에펜도르프 마이크로퓨지 (model 5417c, rotor F-45-30-11)에서 5분간 17900 rcf (13000 rpm)로 원심분리하기 전에 15분 동안 초음파 분해 수조에 위치시켰다.

그 다음, 매트릭스 용액 (50 ㎕)을 각 샘플에 첨가하였고 수동으로 용액을 상하 피펫팅하여 세포를 재현탁하였다. 재현탁 후 세포를 수시간 동안 4℃에 위치시켰다. 4℃에서 제거하면, 튜브를 온화하게 탭핑(tapping)하여 세포를 재현탁한 다음 각 샘플 1 ㎕를 384 MTP 그라운드 스틸 MALDI TOF 플레이트 (Bruker)상에 스팟팅(spotting)하였다. MALDI TOF 머신 (Bruker Ultraflex)에 플레이트를 두고 샘플을 분석하기 전에, 샘플dl 공기 중에 건조되도록 하였다.

실시예 3 - Dunn 용균 버퍼를 사용하여 LC - ESI - MS 분석을 위한 샘플 세포의 제조

샘플 수집: 250 ㎖ 현탁액 세포 배양 플라스크에서 CHO 세포주 범위를 성장시켰다. Vi-세포™을 사용하여 세포를 카운팅하였고 필요한 세포 수 (1 x 10⁶ 내지 0.015625 x 10⁶)를 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브로 피펫팅하였으며 에펜도르프 마이크로퓨지 (model 5417c, rotor F-45-30-11)에서 960 rcf로 5분간 원심분리하였고 상청액을 제거하였다. 펠릿을 사용할 때까지 -80℃에 저장하였다.

세포 용균: 펠릿을 완전히 볼텍싱(vortexing)한 Dunn 용균 버퍼 (울트라 퓨어 유레아 9.5 M, CHAPS 2%, DTT 1%) 400 ㎕에서 펠릿을 해동하고 재현탁시켰고 1시간 동안 실온(RT)에서 인큐베이션하였고 인큐베이션 시작 30분 후 짧게 볼텍싱하였다. 그 다음, 샘플을 985.6 g, 바람직하게는 1700 rcf(상대 원심력)에서 1분간 원심분리하여 세포 잔해를 제거하였고 상청액 2 ㎖를 에펜도르프로 피펫팅하였다. 그 다음, 샘플 50 ㎕를 아세톤 침전에 사용하였다.

아세톤 침전: 100% 매우 차가운 아세톤 대 샘플의 4:1 희석액을 1시간 동안 -20℃에서 인큐베이션하였다. 그 다음, 희석된 샘플을 8870.4g, 바람직하게는 17900 rcf (상대 원심력)에서 10분간 원심분리하였고, 상청액을 제거하였으며 펠릿을 짧게 (5분 미만) 공기에서 건조되도록 두었다.

GE healthcare사의 2D 클린-업(clean-up) 키트 (제품 코드 80-6484-51)를 사용하여 용액 트립신 소화전 샘플을 세정하였다. 키트와 함께 제공된 매뉴얼의 절차 A에 의하였다.

용액 내 트립신 소화: 상하로 샘플을 피펫팅하여 8 M 유레아, 0.4 M 암모늄 비카보네이트 (NH₄HCO₃) 50 ㎕ 중에 펠릿을 재현탁시켜 초기 펠릿을 제거한 다음, 짧게 볼텍싱하였다. 37℃ 인큐베이터 내에서 1시간 동안 50 mM NH₄HCO₃에 100 mM 디티오트레이톨 (DTT) 2.5 ㎕를 첨가함으로써 화학적으로 샘플을 감소시켰다. 그 다음, 암중 실온에서 15분 동안 50 mM NH₄HCO₃에 100 mM 아이오도아세트아미드를 첨가하여 샘플을 알킬화하였다. HPLC 그레이드 워터(grade water) 192.5 ㎕을 첨가하여 2 M 미만으로 유레아 농도를 희석한 다음, 0.25 ㎍/ ㎕ 변형 트립신 (Promega) 10 ㎕를 첨가하였다. 그 다음, 37℃ 인큐베이터에서 하룻밤 동안 트립신 소화가 진행되도록 두었다. 그 다음, 낮은 셋팅의 Savant speed vac (SC110A)를 사용하여 샘플을 건조하였고 0.1% 포름산 20 ㎕ 중에 재현탁시켰으며, 8870.4g에서 1분간 워심분리하여 상청액을 제거하였고, 임의로 펠릿을 재현탁하고 8870.4g, 바람직하게는 17900 rcf (상대 원심력)에서 다시 1분간 원심분리한 다음 주입구가 있는 스크류 캡 바이알(screw cap vial)에 피펫팅하였고 LC-ESI-MS에 의해 분석할 때까지 -80℃에서 냉동하였다.

실시예 4 - LC - ESI - MS 에 의한 분석

LC-ESI-MS (HPLC (Donex 또는 Agilent)와 연결된 ESI-MS (Bruker 또는 Waters))에 의한 분석을 사용된 HPLC 방법을 적절한 MS 스펙트럼 결과인 표 1에 나타내었다.

그 다음, LC-ESI-MS에 의해 생성된 파일을 관리 파일 형식 (Bruker 또는 Waters)에서 세계 표준 (mzXml) (즉, CompassExport 사용)으로 전환하였고 생성된 파일 및 데이터를 비닝(binning) 절차에 적용하였다. 이러한 MS 데이터 타입의 분석을 위한 표준인 비닝 어프로치는, 그것을 정렬함으로써 상이한 (또는 동일한) 샘플로부터 다중 ESI-MS 데이터세트를 비교하도록 하고, 예를 들면 60초의 보존 시간 빈(bin) 및 빈당 1 m/z 단위의 질량 대 전하 빈을 사용하여 보존 시간 (LC 시스템으로부터 용출시간) 및 m/z 범위 (ESI-MS에서 검출되는 것으로서 이온의 질량 대 전하 비)를 균등한 공간 간격으로 나누는 것을 수반한다.

실시예 5 - 데이터 분석 프로토콜 방법 2

5.1 데이터 처리 및 소프트웨어 개발

MS 기반 세포주 스크리닝 및 생성에 대한 본 실시예에서, 신속하게 하는 소프트웨어 툴 - 인터페이스를 통한 실시 - 및 세포주 생산성의 교차 범위 예측을 사용하였다. PLS_Toolbox (www.eigenvetor.com)뿐만 아니라 MATLAB 생물정보학 및 통계적 툴박스를 사용하여 MATLAB (발행 2008b, 참고)에 컴파일하였다.

다른 배양 조건 및 범위하에서 성장한 표준 세포주 및 샘플로부터의 MS 프로파일 이용가능성으로 소프트웨어 적용을 시작하였다. 신호처리 툴을 MS 프로파일에 적용하여 생성물 생성 세포주의 다른 수준의 독특한 MS 데이터 패턴 표시를 추출하였다.

5.2 MS 프로파일 재-샘플링

MATLAB 생물정보학 툴박스 (http://tinyurl.com/msresample)의 'msre' 샘플 기능을 사용하여 MS 프로파일의 재-샘플링을 수행하였다. 이것은 오리지널 신호의 업-샘플링 및 다운-샘플링을 가능하게 하는 반면, 스펙트럼 내에 함유된 정보를 보존한다. 도 1a 및 1b는 재-샘플링 적용 전후 전형적인 96DWP 스펙트럼을 보여준다.

전형적으로 재-샘플링은 오리지널 높은 해상도 MS 신호가 컴퓨터 메모리 부족과 같은 컴퓨터상 제약에 기인하여 작업에 실용적이지 않다고 생각되는 경우와 같은 상황에서 이용된다. 또한, 재-샘플링은 다중 스펙트럼 라이닝 업(lining up)을 촉진하는 일정한 m/z 범위를 형성하는데 사용될 수 있다. MS 프로파일을 재-샘플링하는 경우 재-샘플된 유닛의 수를 너무 낮게 셋팅하지 않도록 주의해야만 한다. 이는 신호가 해상도를 잃게 하여 피쳐(feature)의 손실을 일으킬 수 있다.

5.3 MS 프로파일의 기저선 보정

MS 데이터 프로파일은 전형적으로 MALDI 매트릭스에서 화학적 노이즈 및 이온 오버로딩과 같은 문제에 기인하여 다양한 기저선을 나타낸다. 그것은 프로파일간에 유사성을 측정하는 거리 지표를 이용하므로, 이것은 MS 프로파일을 비교하는 데이터 분석 기술을 사용하는 경우 바람직하지 않을 수 있다. 그러므로 신호의 비교 분석의 임의 형태에 앞서 이러한 영향을 제거하는 것이 바람직하다. 이것은 MATLAB 생물정보학 툴박스 (http://tinyurl.com/msbackadj)에서 'msbackadj' 기능을 사용하여 수행하였다. 도 2a 및 2b는 기저선 보정의 적용 전후 전형적인 96DWP 스펙트럼의 선택을 보여준다.

일련의 수많은 스펙트럼 전-처리를 적용하는 경우, 노이즈 존재가 결과에 영향을 끼칠 것이므로, 기저선 보정은 다운-샘플링 후 및 칼리브레이션(calibration) 보정 전에 사용되어야 한다.

5.4 표준화

MS 프로파일에서 일반적으로 관찰되는 또 다른 현상은 이온 강도의 진폭에 있어서 변형이다. 이것은 수많은 요소, 예를 들면, 샘플 제조에서 변형 또는 장치의 민감도에서 변화에 의해 발생할 수 있다. 이러한 변형을 처리하기 위한 표준 절차는 MS 곡선 아래 영역을 그것의 그룹 평균으로 표준화하는 것이다 (전형적으로 평균 또는 중간값이 사용된다). 이는 MATLAB 생물정보학 툴박스 (http://tinyurl.com/msnormal)의 'msnorm' 기능을 사용하여 수행하였다. 도 3a 및 3b는 곡선 아래 영역의 표준화 전후의 전형적 96DWP 스펙트럼의 선택을 보여준다.

일련의 수많은 스펙트럼 전-처리를 적용하는 경우, 결정화 매트릭스에 의해 도입된 노이즈 요소가 결과에 영향을 줄 수 있으므로, 샘플의 표준화는 기저선을 뺀 후 수행되어야 한다.

5.5 MS 정렬

관찰된 m/z 값 및 실제 비과시간 사이에 변형을 보정하기 위해 피크 정렬을 사용하였다. 이러한 오류는 보통 칼리브레이션 오류에 의한 결과로서 나타나고 피크 사이에 시스템적 이동으로서 관찰될 수 있다. 이러한 불일치의 보정은 MATLAB 생물정보학 툴박스 (http://tinyurl.com/msalign)의 'msalign' 기능을 사용하여 수행될 수 있다.

스펙트럼을 정렬하는 하나의 방법은 알려진 스펙트럼 프로파일을 갖는 물질과 샘플을 섞고, 이것을 기반으로 샘플을 정렬하는 것이다. 그러나, 샘플이 섞이지 않은 경우의 상황에는, 스펙트럼 평균 프로파일과 같은 레퍼런스 스펙트럼에 상대적으로 샘플을 정렬할 수 있다.

5.6 MS 프로파일의 필터링

전형적인 MS 프로파일은 신호 및 노이즈 둘 다의 혼합물을 함유한다. Savitzky-Golay 필터를 사용하여 신호를 스무싱하는 것은 차후 처리하는 동안에 신호의 노이즈 성분의 영향을 감소시키는데 도움이 될 수 있다. Savitzky-Golay 필터는 전형적으로 MS 신호에 적용되는데, 그것이 고차 다항식을 사용하여 곡선을 피팅(fitting) 하기 때문이다. 이것은 신호의 피쳐, 예를 들면 피크 높이를 잘 보존하게 한다. 이러한 처리는 MATLAB 생물정보학 툴박스 (http://tinyurl.com/mssgolay)dml 'mssgolay'기능을 사용하여 수행하였다. 도 4a 및 4b는 Savitzky-Golay 필터링의 적용 전후 전형적 96DWP 스펙트럼의 선택을 보여준다.

5.7 MS 프로파일의 크롭핑

MS 프로파일의 크롭핑은 정보가 거의 없거나 또는 없는 신호의 부분을 제거하기 위해 수행된다. 또한 그것은 스펙트럼이 서브섹션으로 나누어지도록 한다. 이것은 전체 스펙트럼보다는 MS 프로파일의 특이적 위치가 분석되도록 한다. 도 5a 및 5b는 0 내지 500 m/z 범위 신호의 크롭핑 전후 전형적 96DWP 스펙트럼의 선택을 보여준다.

5.8 전-처리의 효과 비교

MS 데이터에 신호처리 기술을 적용하는 것의 효과를 증명하기 위해, 118개 세포주 그룹(복제시 측정)을 주성분 분석 (PCA)을 사용하여 분석하였다. 도 6a, 6b 및 38은 PC1 대 PC2의 주성분 스코어 프랏을 보여준다. 이 플랏은 데이터 세트에서 2개의 변형의 주요 소스를 기술한다.

미가공 MS 프로파일에 대한 기저선 보정의 적용은 1차 및 2차 주성분에서 관찰되는 스캐터(scatter)의 양을 감소시킨다. 이것은 도 7a, 7b 및 39에서 관찰될 수 있다.

기저선 보정은 단지 MALDI 매트릭스에 기인한 신호에서 노이즈를 대상으로 한다. 표준화를 사용하여 신호 진폭에서의 변형을 제거하는 것이 바람직하다. 도 8a, 8b 및 40은 스펙트럼 그룹에 대한 표준화 적용의 효과를 보여준다. 그것은 PC1, 변형의 주요 소스에서 관찰된 변형의 감소를 분명하게 보여준다.

최종 수행되는 신호처리 단계 유용한 정보를 함유하지 않는다고 알려진 신호의 부부을 제거하는 것이다. 도 9a, 9b 및 41은 0 내지 500 m/z 유닛 범위 밖의 MS 프로파일에서 데이터 포인트를 제거하는 효과를 보여주고, 이는 MALDI가 이 범위 내에서 강도를 기록하지 않은 세트였기 때문이다. 도 8a 8b 및 40에서 관찰된 것과 동일하기 때문에, 이 데이터를 제거함으로써 아무런 효과도 없다는 것이 스코어 플랏으로부터 분명하다.

단계 c)에서 다음의 미가공 표준 및/또는 샘플 MS 데이터의 재샘플링, 기저선 보정, 필터링, 정렬, 시각적 분석 및 표준화 단계를 포함하는 1차 신호처리방법을 사용하여, 본 방법의 기저선 보정 및 표준화 단계로 간단히 전처리된 MS 프로파일에 비해 표준 및 샘플 MS 프로파일은 더 스무싱되고 피크는 세포주쪽으로 더욱 일정하게 정렬한다 (도 21a 및 21b). 또한, 동일한 샘플로부터의 MS 분석에 적용하기 위해 2 또는 3 세포 펠릿을 제조한 경우, 상기 방법은 생물학적 복제에 대한 더욱 일정한 MS 프로파일을 생성하였다. 바람직하게는, 이러한 개선은 샘플을 처리하는데 필요한 시간 증가의 비용을 가져오나(대략 400 스펙트럼에 대해 대략 2시간), 모델링 어프로치 및 세포주 구성 처리시 그러한 관심 세포주를 예측/선택하는데 필요한 시간의 관점에서 이것은 바람직하게는 금지된다.

실시예 6 - 신호처리방법 2

6.1 산성 지표(metrics)의 PLSDA 모델링

PLSDA는 예측 분류를 위해 특이적으로 만들어진 다변수의 최소 제곱법 모델링의 적용이다. 실시예에서 이용되는 개발된 MS 핑거프린팅 어프로치는 Eigenvector Research, Inc. (EVRI)에서 발행된 PLSDA의 PLS_Toolbox 실행을 이용한다 (www.eigenvetor.com).

6.2 PLSDA 모델 트레이닝(training)

PLSDA를 트레이닝하기 위해, 정보의 2개의 다른 세트가 필요하다; x-블록 및 y-블록. 새로운 세포주 구성을 수행하기 위한 개괄된 어프로치에서, x-블록은 처리의 96DWP 단계에서 생성된 스펙트럼 프로파일로부터의 정보를 함유한다. 각각의 프로파일은 변수로 처리된 m/z 값의 특이적 범위 밖에 기록된 신호 강도를 갖는 샘플로 처리된다. y-블록은 각각의 트레이닝 샘플을 클래스 변수에 할당하는 정보를 함유한다. 이 실시예에서 y-블록은 생물반응기 범위에 세포주 생산성의 특이적 세포 배양 데이터, 즉, 생성물 농도, 특이적 생산성 또는 인테그랄 생존 세포 계수와 관련된 정보를 함유한다.

x-블록 데이터를 사용하여, 오리지널 변수의 잠재 변수 공간으로의 PLS 맵핑을 수행하였다. 오리지널 데이터에서 가능한 많은 변동성을 나타내는 반면, 이것은 문제의 차원수를 감소시키는 효과를 갖는다. PLSDA 알고리즘은 y-블록의 정보를 이용하여 y-블록에 저장된 클래스 정보를 기반으로 x-블록 데이터를 최상으로 분리하는 선형 구별 경계를 피팅한다. y-블록에 기술된 2개의 클래스만 있는 경우, 단일 구별 경계가 충분하고; 3개 이상의 클래스가 존재하는 경우, 클래스 내 샘플은 각 이용 가능한 클래스에 대한 클래스 샘플 외의 것과 비교되어야 한다.

6.3 분석 플로우차트

도 10은 MATLAB PLS_Toolbox에서 발견되는 알고리즘의 그래픽 실행을 사용하는 PLSDA 모델을 만드는데 피리요한 조작의 플로우차트를 보여준다.

1. 로드(load) X 데이터 - 이 버튼은 사용자가 x-블록 데이터를 소프트웨어로 옮기는 것을 신속하게 처리한다. 핑거프린팅 소프트웨어, ms_preproc,는 신호처리 및 분석 기술 사이의 인터페이스로서 작용하도록 디자인되고, PLS_Toolbox로 작업하도록 MS 데이터를 필요한 형식으로 자동 전환하며, 변수 'X블록'으로서 MATLAB 작업공간에 변수를 저장한다 (도 11a 및 11b).

2. 로드 클래스 (임의) - 이 버튼은 y-블록 데이터를 소프트웨어로 옮기는데 사용된다. 그러나, 클래스 정보 또한 'X블록' 변수에 저장될 수 있다 (더 자세한 것은 http://wiki.eigenvector.com/index.php?title=DataSet_Object 참조). ms_preproc 소프트웨어는 클래스 정보를 'X블록' 변수로 내장하여; 이 단계는 임의적이다.

3. 셀렉트(Select) 클래스 그룹 - 이 버튼은 사용자에게 모델을 만드는 클래스 그룹을 선택하는 옵션을 제공한다. 도 12는 3개의 클래스에 의한 전형적 실시예를 보여준다 (고, 중, 저). 모델은 우측 칼럼에 첨부된 클래스에 대한 결정 경계를 계산할 것이다.

4. 추즈(Choose) 전-처리 - 이 버튼은 스펙트럼 파일에 대한 다양한 전-처리 기술을 적용하는데 사용될 수 있다 (도 13). 이 단계가 생물정보학 툴박스의 스펙트럼 전-처리 툴을 사용하여 수행되는 경우, 이 단계의 상당부분이 임의적이다. 그러나, 또한 데이터의 전-처리과 관련하여 트레이닝 중 할당된 사전의 확률의 문제가 있다. 디폴트(default)에 의해 알고리즘은 각 클래스가 선택되는 동등한 확률을 가정한다. ?로는 이것은 그 경우가 아니라, 실제 확률을 반영하도록 값이 조정되어야 한다. 이것은 '편집' 메뉴의 '옵션' 섹션하의 '방법 옵션 (PLSDA)'의 전환에 의해 수행된다.

5. 추즈(Choose) 교차-검증 - 이 버튼은 사용자가 트레이닝 처리중 교차 검증하게 한다. 이러한 처리는 종종 결과의 개선된 신뢰도를 제공하는데 사용되고 분류기 성능의 교차-체크를 제공한다. 표준 어프로치는 트레이닝 데이터 일부를 보존하는 것 및 데이터 분류기의 성능을 테스트하는데 이것을 사용하는 것이다. 전형적으로, 이러한 처리는 그 다음 보존된 데이터의 다른 일부와 함께 반복된다. 도 14는 PLS_Toolbox를 사용하여 데이터를 나누는데 이용 가능한 방법을 보여준다 (http://wiki.eigenvector.com/index.php?title=Using_Cross-Validation).

6. 빌드(Build) 모델 - 이 버튼은 PLS 잠재 변수를 계산하고 구별 경계의 최적 위치를 위치시켜 트레이닝 데이터 세트 내 수많은 적절한 분류를 최대화한다.

7. 추즈 컴포넌츠(Choose Components) - 이 버튼은 일단 PLSDA 모델이 계산되는 것이 이용 가능하게 한다. 그것은 사용자가 PLSDA 모델에 보존하기 위한 잠재 변수의 수를 선택하는 것을 돕는 그래프를 생성한다. 이것을 달성하기 위한 또 다른 방법은 y-블록과 비교하여 상대적으로 설명되는 변형이 70-80%의 위치에 있도록 하여 모델을 과-피팅하지 않게 하여야 한다고 가정하는 것이다.

8. 리뷰 스코어즈(Review Scores) - 이 버튼은 잠재 변수 스코어와 관련된 수많은 플랏에 접근하도록 한다. 이것은 모델 성능을 분석하는데 사용될 수 있다. 도 15a 내지 15d 및 42 내지 45는 가장 유용한 그래프중 일부를 보여준다; (a) 이변수(Bivariate) 로딩 플랏, (b) Hotelling's T2 플랏, (c) 모델 예측 플랏 및 (d) 모델 예측 플랏에 대한 관련 확률.

9. 리뷰 로딩스(Review Loadings) - 이 버튼은 잠재 변수 로딩과 관련된 수많은 플랏에 접근하도록 한다. 이것은 각 잠재 변수에 가장 큰 영향을 미치는 변수를 식별하는데 사용될 수 있다. 이것은 구별에 가장 영향을 줄 스펙트럼 신호의 영역을 식별하는데 유용할 수 있다.

10. 로드 테스트 데이터 - 일단 모델이 만들어지면, 다음의 단계는 보이지 않는 데이터에 대한 예측을 위하여 모델을 이용하는 것이다. 이 버튼은의 클릭은 11a/b에서 처럼 동일한 다이알로그 박스를 사용자에게 나타낸다. 테스트 데이터는 또한 단계 1의 오리지널 x-블록 데이터로 로딩될 수 있고 샘플에 클래스 변수를 할당하는 것에 의하지 않는다. 단계 2에서 우리의 ms_preproc 소프트웨어에 의해 클래스가 할당되지 않은 임의의 샘플은 자동적으로 테스트 데이터로 간주된다. 이것은 도 16a, 16b, 46 및 47에 알려지지 않은 클래스화된 샘플로서 나타날 수 있다.

11. 어플라이(Apply) 모델 - 버튼은 테스트 데이터를 트레이닝된 PLSDA 모델에 피팅한다. 그것은 사용자가 알려지지 않은 샘플이 속할 가장 개연성 있는 클래스를 결정하도록한다.

실시예 7 - MALDI - TOF 및 그것의 통계적 모델링에 적용된 MS 프로파일

예시된 문단은 새로운 세포주 생성 처리중 MS 분석 데이터의 모델링으로부터 얻어진 결과에 초점을 맞추었다. 도 48, 49, 17 및 18은 BNCD 모델에 대한 얻어진 결과를 보여준다 (데이터를 포함된 복제샘플과 함께 기저선 보정, 표준화 및 크롭핑하였다). 삼각형 (도 17 및 18) 및 별 (도 48 및 49)은 "고" 클래스 (> 4000 mg/L)를 보여주고, 별 (도 17 및 18) 및 삼각형 (도 48 및 49)는 "저" 클래스 (= 3999 mg/L)에 대한 트레이닝 샘플을 보여주며, 세포주 ID 번호가 없는 흑색 점 (도 17 및 18) 및 크로스 (도 48 및 49)는 클래스 데이터가 알려지지 않은 샘플을 나타내고, 세포주 ID 번호가 있는 점은 상기 분류 경계에 포함되는 샘플을 나타낸다 (상부 회색 점선).

세포주 구성 처리 (i)의 처리된 정보를 사용하여 세포주 생성 처리중에 생성된 수백가지 MS 데이터를 포함하여 예측 모델이 만들어질 수 있다. 모델을 기반으로 다른 양의 MAb (> 4000mg/L; = 3999 mg/L)를 생산하는 것으로 예측되었던 세포주의 목록을 수집하였다. 표 2는 도 48, 49, 17 및 18에서 동정될 수 있는 일부 세포주를 하일라이트하였다. 본 예측 방법의 성능을 측정하기 위해 기록된 그것의 역가 값으로 세포주를 배양하였다 (표 2).

표 2. 예측된 고/저 생산 세포주 대 관찰된 생산성

검증 실시의 결과는 세포주 생성의 처리에서 예측 세포주 선택의 성공적인 적용을 증명하여, 초기발달 단계에서 수집된 개별 세포주의 MS 프로파일은 말기 생산 범위에서 그것의 행동을 반영한다.

실시예 8 - LC - ESI - MS 에 적용된 MS 프로파일의 통계적 모델링 후 결과

LC-ESI-MS에 의해 얻는 미가공 MS 프로파일을 신호처리방법 I(실시예 5) 및 신호처리방법 II(실시예 6)에 의해 신호처리하였다. 결과는 도 19a/b 및 20에 나타내었다.

<2 g/L 및 >2 g/L로 그룹핑된 경우, 도 19a/b는 PLSDA 분석을 사용하는 3개의 다른 재조합 CHO 세포주의 분리를 보여주고 (도 19a/b는 LV1 대 LV3를 보여준다) 도 20은 PLSDA 분석 후 7개의 다른 재조합 CHO 세포주의 분리를 보여준다. 데이터는 각 재조합 세포주 그룹의 2개의 샘플 및 PLSDA 알고리즘이 다른 그룹에 속하는 세포주 간을 식별할 수 있다는 것을 보여준다. 본 어프로치는 원하는 특징 (예를 들면, 생산성)을 기초로 하여 재조합 세포주 핑거프린팅에 적합하다.

표 3은 24 웰 플레이트, 배치, 페드 배치 및 생물반응기에서 배양된 CHO 세포주 2, 42, 52, 75, 106, 144 및 164의 생성물 농도를 나타낸다. 특히, LC-ESI-MS 데이터를 사용하는 PLS-DA 분석에 의해 생물반응기 범위의 생성물 농도를 정확히 예측하였다 (도 20).

실시예 9 - 예측의 정확도 개선

9.1 생물반응기 라운드 1

이 1번째 라운드에서, 별도로 구체화되지 않는 한 첫번째 문단 실시예 1에서 개괄된 바와 같은 배양 조건 하에서 항체 IgG XXX 항 인슐린 세포주 생성을 수행하였다

그 다음, 상기 세포주를 MS 분석에 적용하여 이의 미가공 샘플 MS 데이터를 얻었고, 그 뒤에, 업-샘플링, 기저선 보정, 필터링, 정렬 및 표준화 단계를 포함하는 하나 이상의 1차 MS 신호처리방법에 미가공 샘플 MS 데이터를 적용하여 전-처리된 샘플 MS 프로파일을 얻은 다음, PLS-DA 기반 비교 평가를 포함하는 2차 데이터 분석에 전-처리된 샘플 MS 프로파일을 적용하여 세포주의 생물반응기 내 역가 데이터를 예측하였다.

전-처리된 표준 MS 프로파일로서, 항체 IgG CB72.3 생성 세포주의 MS 데이터 및 기저선 보정, 표준화 및 크롭핑에 의해 전-처리된, 특히 표 2 (실시예 7)의 세포주의 전처리된 MS 프로파일을 사용하였다. 표준 세포로부터의 역가 데이터로서, 항체 IgG CB72.3 생성 세포주로부터의 역가 데이터, 특히 표 2 (실시예 7)에 열거된 역가 데이터를 사용하였다.

상기 방법에 의해 얻어진 Y 예측 플랏은 생물반응기 평가에 대상이되는 세포주의 세트를 보여준다(도 22). 또한, 모든 세포주의 역가를 정확하게 예측하기 위한 모델 내 데이터 공간의 충분한 커버리지(coverage)가 부재할 수 있다는 것을 나타내는 잠재 변수 플랏상 검증 데이터의 중요한 테일 오프(tail off)가 있다(도 23).

이 후, 예측된 역가 데이터를 갖는 세포주는 생물반응기 내 그것의 역가 데이터를 입증하기 위해 세포 배양 내에서 배양하였다. 생물반응기 배양은 종래의 방식으로 수행하였다.

생물반응기 배양 15일째에 다른 세포주의 샘플을 취하였다.

표 4는 생물반응기의 1 번째 라운드에서 실제 실시한 세포주의 역가 결과를 보여준다.

용어 "reps"는 MS 분석이 적용될 하나의 세포주 제조의 반복을 의미한다.

용어 "x/3 reps > 4mg/㎖" (x는 0, 1, 2 또는 3일 수 있다)는 하나의 세포주의 3개의 제조물 중 x개 경우에서 PLS-DA 기반 비교 평가가 4 mg/㎖ 초과하는 데이터를 예측한다는 것으로 이해된다.

9.2 생물반응기 라운드 2

생물반응기 라운드 2를 실시예 9.1에서 구체화된 바와 동일한 방식으로 수행하였다. 그러나, 표준 전-처리된 MS 프로파일로서 생물반응기 라운드 1의 전-처리된 표준 MS 프로파일, 및 생물반응기의 1차 실시에서 역가 데이터를 측정하였던 세포주의 MS 프로파일 및 그것의 측정된 역가 데이터와 함께 통계적 프로그램에 포함시켰다.

상기 방법에 의해 얻어진 Y 예측 플랏은 도 22에 비해 생물반응기 배양의 대상이되는 세포주의 다른 세트를 보여준다(도 24). 도 23에 비해 잠재 변수 플랏상 검증 데이터 내의 테일 오프는 덜 현저하였다(도 25). 그러나, 그것은 여전히 현저하였고 본 방법은 많은 수의 세포주가 고 생산자일 것이라 시사한다.

표 5는 생물반응기의 2 번째 라운드에서 실제 실시한 세포주의 역가 결과를 보여준다.

9.3 생물반응기 라운드 3

생물반응기 라운드 3를 실시예 9.1에서 구체화된 바와 동일한 방식으로 수행하였다. 그러나, 표준 전-처리된 MS 프로파일로서 생물반응기 라운드 1의 전-처리된 표준 MS 프로파일, 및 생물반응기의 1차 및 2차 실시에서 역가 데이터를 측정하였던 세포주의 MS 프로파일 및 그것의 측정된 역가 데이터와 함께 통계적 프로그램에 포함시켰다.

상기 방법에 의해 얻어진 Y 예측 플랏은 더 적은 세포주가 고 생산이자 일것으로 예측한다(도 26). 잠재 변수 플랏에 나타난 검증 데이터 내의 테일 오프 (도 27)는 도 25에 비해 상당히 감소하였다. 예측 정확도는 이전의 2개 라운드보다 더 신뢰할 수 있고 본 방법이 이전의 것보다 더 잘 데이터 공간을 피팅한다는 것을 시사한다.

표 6은 생물반응기의 3 번째 라운드에서 실제 실시한 세포주의 역가 결과를 보여준다.

9.4 생물반응기 라운드 4

생물반응기 라운드 4를 실시예 9.1에서 구체화된 바와 동일한 방식으로 수행하였다. 그러나, 표준 전-처리된 MS 프로파일로서 생물반응기 라운드 1의 전-처리된 표준 MS 프로파일, 및 생물반응기의 1차, 2차 및 3차 실시에서 역가 데이터를 측정하였던 세포주의 MS 프로파일 및 그것의 측정된 역가 데이터와 함께 통계적 프로그램에 포함시켰다.

상기 방법에 의해 얻어진 Y 예측 플랏은 도 26에 비하여 고 생산자일 것으로 예측되는 단지 소수의 세포주를 보여준다 (도 28). 잠재 변수 플랏상의 검증 데이터 내의 테일 오프(tail off) (도 29)는 이미 관찰된 것보다 더 적었다(예를 들면 도 27).

표 7은 생물반응기의 4 번째 라운드에서 실제 실시한 세포주의 역가 결과를 보여준다.

9.5 생물반응기 라운드 5

생물반응기 라운드 5를 실시예 9.1에서 구체화된 바와 동일한 방식으로 수행하였다. 그러나, 표준 전-처리된 MS 프로파일로서 생물반응기 라운드 1의 전-처리된 표준 MS 프로파일, 및 생물반응기의 1차, 2차 및 3차 실시에서 역가 데이터를 측정하였던 세포주의 MS 프로파일 및 그것의 측정된 역가 데이터와 함께 통계적 프로그램에 포함시켰다.

상기 방법에 의해 얻어진 Y 예측 플랏은 고 생산자일 것으로 예측되는 단지 소수의 세포주를 보여준다 (도 30). 잠재 변수 플랏상의 검증 데이터 내의 테일 오프(tail off) (도 31)는 도 29의 그것으로부터 큰 변형을 보여주지 않았다. 이번 라운드에서 실시된 5개의 세포주 중, 고 생산자일 것으로 예측되는 2개의 세포주를 갖는 5개중 5개로 모델을 분류하였다.

표 8은 생물반응기의 5 번째 라운드에서 실제 실시한 세포주의 역가 결과를 보여준다.

실시예 10

실시예 9에서 개괄된 바와 같이 세포주를 제조하였고 배양하였다.

용어 "생물반응기 라운드 X"는 (X는 3, 4 및 5이다)는 실시예 9 및 10 둘 다에 대한 동일한 배양 조건 하에 생물반응기의 동일한 실시를 의미한다.

인테그랄 생존 세포 계수 (IVC) 및 세포 특이적 생산성 (qP) 데이터 둘 다를 사용하여 PLS-DA 기반 비교 평가를 위해 3개의 클래스 PLS-DA 모델을 제작하였다. 두 모델에서 원하는 클래스를 배지 클래스로 하였다. 클래스 경계를 다음과 같이 정의하였다:

IVC 모델:

높음 > 4500 x 10⁶ 세포 x h/㎖

4500 x 10⁶ 세포 x h/㎖ > 중간 > 3250 x 10⁶ 세포 x h/㎖

낮음 < 3250 x 10⁶ 세포 x h/㎖

qP 모델:

높음 > 2.35 pg x 세포 x h

2.35 pg x 세포 x h > 중간 >1.75 pg x 세포 x h

낮음 < 1.75 pg x 세포 x h

상기 언급된 조건 및 셋팅을 기반으로하여 PLS-DA 기반 비교 평가를 수행하여 세포 배양 성능 데이터 즉, 인테그랄 생존 세포 계수 데이터 (IVC) 및 세포 특이적 생산성 데이터 (qP)를 예측하였다.

추가적으로, 세포주를 생물반응기 내에서 배양한 경우 세포주의 IVC 및 qP 데이터를 결정하였다.

10.1 인테그랄 생존 세포 계수 데이터 (IVC)의 예측

항체 IgG CB72.3을 생성하고 기저선 보정, 표준화 및 크롭핑에 의해 전-처리된 세포주의 생물반응기 라운드 3 내지 5 MS 데이터의 예측을 위한 전-처리된 표준 MS 프로파일로서, 특히 표 2의 세포주의 전-처리된 MS 프로파일 (실시예 7)및 생물반응기 라운드 1 및 2에서 배양된 세포주의 전-처리된 MS 프로파일을 사용하였다. 표준 세포로부터의 인테그랄 생존 세포 계수 데이터로서 항체 IgG CB72.3을 생성하는 세포주, 특히 표 2의 세포주(실시예 7)으로부터의 인테그랄 생존 세포 계수 데이터, 및 생물반응기 라운드 1 및 2에서 배양된 세포주의 인테그랄 생존 세포 계수 데이터를 사용하였다.

10.1.1 생물반응기 라운드 3

도 32는 본 발명에 따른 미가공 MS 데이터의 전-처리 및 차후 PLS-DA 모델링을 사용하는 세포주 라운드 3 예측에 대한 IVC Y 예측 플랏을 보여준다.

표 9는 생물반응기의 3번째 라운드에서 실제 실시한 세포주의 관찰된 IVC 값을 보여준다.

용어 "4500 > x/3 reps > 3250"(x는 0, 1, 2 또는 3일 수 있다)는 하나의 세포주의 3개의 제조물 중 x개 경우에서 PLS-DA 기반 비교 평가가 4500 내지 3250 사이의 IVC 데이터를 예측한다는 것으로 이해된다.

10.1.2 생물반응기 라운드 4

도 33은 본 발명에 따른 미가공 MS 데이터의 전-처리 및 차후 PLS-DA 모델링을 사용하는 세포주 라운드 4 예측에 대한 IVC Y 예측 플랏을 보여준다.

표 10은 생물반응기의 4번째 라운드에서 실제 실시한 세포주의 관찰된 IVC 값을 보여준다.

10.1.3 생물반응기 라운드 5

도 34는 본 발명에 따른 미가공 MS 데이터의 전-처리 및 차후 PLS-DA 모델링을 사용하는 세포주 라운드 5 예측에 대한 IVC Y 예측 플랏을 보여준다.

표 11은 생물반응기의 5번째 라운드에서 실제 실시한 세포주의 관찰된 IVC 값을 보여준다.

10.2 세포 특이적 생산성 데이터 (qP)의 예측

항체 IgG CB72.3을 생성하고 기저선 보정, 표준화 및 크롭핑에 의해 전-처리된 세포주의 생물반응기 라운드 3 내지 5 MS 데이터의 예측을 위한 전-처리된 표준 MS 프로파일로서, 특히 표 2의 세포주의 전-처리된 MS 프로파일 (실시예 7)및 생물반응기 라운드 1 및 2에서 배양된 세포주의 전-처리된 MS 프로파일을 사용하였다. 표준 세포로부터의 세포 특이적 생산성 데이터로서 항체 IgG CB72.3을 생성하는 세포주, 특히 표 2의 세포주(실시예 7)으로부터의 세포 특이적 생산성 데이터 및 생물반응기 라운드 1 및 2에서 배양된 세포주의 세포 특이적 생산성 데이터를 사용하였다.

10.2.1 생물반응기 라운드 3

도 35는 본 발명에 따른 미가공 MS 데이터의 전-처리 및 차후 PLS-DA 모델링을 사용하는 세포주 라운드 3 예측에 대한 qP Y 예측 플랏을 보여준다.

표 12는 생물반응기의 3번째 라운드에서 실제 실시한 세포주의 관찰된 qP 값을 보여준다.

용어 "2.35 > x/3 reps > 1.75"(x는 0, 1, 2 또는 3일 수 있다)는 하나의 세포주의 3개의 제조물 중 x개 경우에서 PLS-DA 기반 비교 평가가 2.35 내지 1.75 사이의 qP 데이터를 예측한다는 것으로 이해된다.

10.2.2 생물반응기 라운드 4

도 36은 본 발명에 따른 미가공 MS 데이터의 전-처리 및 차후 PLS-DA 모델링을 사용하는 세포주 라운드 4 예측에 대한 qP Y 예측 플랏을 보여준다.

표 13은 생물반응기의 4번째 라운드에서 실제 실시한 세포주의 관찰된 qP 값을 보여준다.

10.2.3 생물반응기 라운드 5

도 37은 본 발명에 따른 미가공 MS 데이터의 전-처리 및 차후 PLS-DA 모델링을 사용하는 세포주 라운드 5 예측에 대한 qP Y 예측 플랏을 보여준다.

표 14는 생물반응기의 5번째 라운드에서 실제 실시한 세포주의 관찰된 qP 값을 보여준다.

10.3 요약

도 32 내지 37 및 표 9 내지 14는 96 딥 웰 플레이트에서 배양된 세포라인의 IVC 및 qP 생물반응기 성능 데이터가 본 발명에 따른 방법에 의해 정확한 방식으로 예측될 수 있다는 것을 보여준다.

Claims

(a) 하나 이상의 샘플 세포의 샘플, 표준 세포로부터의 세포 배양 성능 데이터 및 표준 세포로부터의 미가공 표준 MS(질량 분광분석법) 데이터를 제공하는 단계;
(b) 하나 이상의 샘플 세포의 샘플을 MS 분석에 적용하여 이의 미가공 샘플 MS 데이터를 얻는 단계;
(c) 미가공 표준 및 미가공 샘플 MS 데이터를 하나 이상의 1차 MS 신호처리방법에 적용하여 전-처리된 표준 및 샘플 MS 프로파일을 얻는 단계, 및
(d) 단계 (a)의 표준 세포로부터의 세포 배양 성능 데이터 및 c) 단계에서 얻은 전-처리된 표준 및 샘플 MS 프로파일을, PLS-DA(부분최소자승판별분석) 기반의 비교 평가를 포함하는 2차 MS 신호처리방법에 적용하여 하나 이상의 샘플 세포의 세포 배양 성능 데이터를 예측하는 단계를 포함하고, 여기에서 세포 배양 성능 데이터는 세포 특이적 생산성, 인테그랄(integral) 생존 세포 계수 또는 세포 생성물 농도 데이터인,
하나 이상의 샘플 세포의 세포 배양 성능 데이터 예측을 위한 방법.
제1항에 있어서, 세포가 인간 세포주, 동물 세포주, 식물 세포주, 진균류의 세포, 박테리아의 세포, 이스트의 세포 및 줄기 세포로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 세포는 CHO 세포주 또는 CHO-K1 세포주인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)의 MS 분석은 MALDI-TOF인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에 적용된 샘플 세포의 샘플은 0.015 x 10⁶개 내지 0.0625 x 10⁶개의 세포를 포함하는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서 얻어진 미가공 샘플 MS 데이터 및 단계 (a)에서 제공된 미가공 표준 MS 데이터가 기저선 보정, 표준화, 정렬, 필터링 및 크롭핑(cropping)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 조작에 의해 신호처리되는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서 얻어진 전-처리된 표준 및 샘플 MS 프로파일이 광학적으로 분석되는 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)에서 평가된 예측된 세포 배양 성능 데이터를 갖는 샘플 세포가 그것의 세포 배양 성능 데이터를 입증하기 위해 세포 배양물에서 배양되는 방법.
제8항에 있어서, 단계 (b)에서 얻어진 미가공 샘플 MS 프로파일 및 샘플 세포의 입증된 세포 배양 성능 데이터가 표준 MS 데이터 및 표준 세포의 세포 배양 성능 데이터로서 단계 (a)에서 사용되는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법이 수행되고 원하는 세포가 분리되는, 원하는 세포 배양 성능 데이터를 갖는 세포의 분리방법.
10 g/ℓ 이상의 단백질 생산성을 특징으로 하는, 제10항에 따른 방법에 의해 분리된 세포.
하기의 기술적 특징을 포함하는 하나 이상의 샘플 세포의 샘플이 공급되는 경우, 세포 배양 성능 데이터 예측을 제공하기에 적합한 장치:
(a) 하나 이상의 샘플 세포의 샘플을 MS (질량 분광분석법) 분석에 적용하여 이의 미가공 샘플 MS 데이터를 얻기에 적합한 수단,
(b) 미가공 표준 및 미가공 샘플 MS 데이터를 하나 이상의 1차 MS 신호처리방법에 적용하여 전-처리된 표준 및 샘플 MS 프로파일을 얻기에 적합한 수단, 및
(c) 표준 세포의 세포 배양 성능 데이터, 및 전-처리된 샘플 및 표준 MS 프로파일을 PLS-DA (부분최소자승판별분석) 기반 비교 평가를 포함하는 2차 MS 신호처리방법에 적용하여 샘플 세포의 세포 배양 성능 데이터를 예측하기에 적합하고, 여기에서 세포 배양 성능 데이터는 세포 특이적 생산성, 인테그랄 생존 세포 계수 또는 세포 생성물 농도 데이터인 수단.