KR20140005843A

KR20140005843A - 기도 감염의 치료를 위한 방법 및 약학 조성물

Info

Publication number: KR20140005843A
Application number: KR1020137001996A
Authority: KR
Inventors: 쟝-끌로드 시라르; 호세 아. 차발고이띠
Original assignee: 인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔); 엥스티튀 파스퇴르 드 릴레
Priority date: 2010-06-25
Filing date: 2010-06-25
Publication date: 2014-01-15
Also published as: KR101768118B1; US10426816B2; US20130150286A1; JP2013530982A; CA2800206C; CN103037887B; EP2585094B1; BR112012033121B1; JP5746761B2; BR112012033121A2; CN103037887A; WO2011161491A1; ES2690760T3; EP2585094A1; US20140206601A1; CA2800206A1

Abstract

본 발명은 기도 감염의 치료를 위한 방법 및 약학 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 기도 감염의 치료 방법에 사용하기 위한 TLR5 아고니스트에 관한 것이다.

Description

기도 감염의 치료를 위한 방법 및 약학 조성물{METHODS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF RESPIRATORY TRACT INFECTIONS}

본 발명은 기도 감염의 치료를 위한 방법 및 약학 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 기도 감염의 치료 방법에 사용하기 위한 TLR5 아고니스트(agonist)에 관한 것이다.

기도(respiratory tract) 감염은 상기도(예를 들어, 코, 귀, 동(sinuses) 및 목) 및 하기도(예를 들어, 기관, 기관지 및 폐)의 흔한 감염이다. 상기도 감염의 증상에는 콧물 또는 코막힘, 초조함, 불안함, 식욕 상실, 감소된 활성 수준, 기침 및 열이 포함된다.

바이러스 기도 감염은 인후염, 감기, 크루프(croup) 및 독감을 야기하고/야기하거나 이와 연관된다. 상기도 및 하기도 감염을 일으키는 바이러스의 예에는 리노바이러스 및 인플루엔자 바이러스 A 및 B가 포함된다.

흔한 호흡기 박테리아 감염은, 예를 들어 백일해 및 패혈성 인두염을 일으키고/일으키거나 이와 연관된다. 상기도 및 하기도 감염을 일으키는 박테리아의 예는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)이다. 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)(폐렴연쇄구균)는 전세계적으로 유아 및 노인에서 기도 감염을 야기한다. 캡슐 다당류는 주요 독성 인자이고, 이의 조성은 폐렴연쇄구균의 91개 혈청형들을 정의한다. 특정 혈청형은 인간 비인두를 자각증상 없이 콜로니화하여, 박테리아의 개체간의 전염을 위한 저장소를 나타낸다. 몇몇 개인에서 콜로니화는 폐렴연쇄구균 폐렴 및 침습성 질환으로 진행될 수 있다. 반대로, 혈청형 1과 같은 혈청형은 콜로니화와 거의 연관되지 않으나 침습성 감염을 야기한다.

기도 감염에 대한 현행 요법에는 각각 바이러스, 박테리아 및 진균 기도 감염의 치료, 예방 또는 경감을 위한 항-바이러스제, 항-박테리아제 및 항진균제의 투여가 포함된다. 불행하게도, 특정 감염과 관련되어서는, 이용가능한 요법이 없고, 감염이 요법에 난치성인 것으로 입증되거나, 부작용의 발생이 대상에 대한 요법의 투여의 이득을 넘어선다. 박테리아 기도 감염의 치료를 위한 항-박테리아제의 사용은 또한 부작용을 산출하거나 내성 박테리아 균주를 야기할 수 있다. 항진균제의 투여는 신부전 또는 골수 기능장애를 일으킬 수 있고, 억제된 면역계를 가진 대상에서 진균 감염에 대해서는 효과적이지 않을 수 있다. 부가적으로, 감염을 야기하는 미생물(예를 들어, 바이러스, 박테리아 또는 진균)은 투여된 치료제 또는 치료제의 조합에 대해 내성이거나 내성이 발달될 수 있다. 실제로, 투여된 치료제에 대한 내성이 발달하는 미생물은 종종 다면발현성 약물 또는 멀티약물 내성, 즉 투여된 작용제의 메커니즘과 상이한 메커니즘에 의해 작용하는 치료제에 대한 내성을 발달시킨다. 따라서, 약물 내성의 결과로서, 다수의 감염들이 많은 표준 치료 프로토콜들에 대해 난치성인 것이 입증되었다.

그러므로, 기도 감염 및 이의 증상의 치료, 예방, 조절 및/또는 경감을 위한 신규한 요법이 필요하다.

선천적 방어의 활성화는 폐렴연쇄구균 감염의 조절에 필수적이다. 톨-유사 수용체 2(TLR2: Toll-like receptor 2), TLR4 및 TLR9 뿐만 아니라 어댑터 MyD88은 폐에서 폐렴연쇄구균의 초기 검출 및 소거에 참여한다. 시토졸 수용체 뉴클레오티드-결합 올리고머화 도메인 (Nod) 함유 Nod1 및 Nod2가 또한 폐렴연쇄구균의 인지에 관여한다. TLR 신호화는 다형핵 호중구(PMN) 및 대식세포와 같은 식세포의 모집 및 살균제의 생성에 이르는 점막 선천적 반응을 활성화시킨다. 상기 과정은 식균작용 뿐만 아니라 세포외 살해에 의해 병원균을 급속히 제거한다. MyD88-결핍 동물에서, S. 뉴모니아에(S. pneumoniae)는 기도 내로의 PMN 모집을 본질적으로 유발할 수 없으며, 동물은 폐렴에 대한 감수성이 증가된다. 인간에서 TLR 신호화의 기여는 일부 MyD88 다형태가 폐렴연쇄구균 감염에 대한 감수성 증가에 연관되어 있음을 보여주는 최근 연구에서 강조되었다.

선천적 수용체의 활성에 의한 면역력 조절은 감염에 대항하는 보호 반응을 도출하기 위한 최근의 개념이다. 그 근거는 병원체 그 자체에 의해 유발되는 선천적 반응을 규모적, 양적 및 동적으로 크게 초과하는 선천적 반응들을 촉진시키는 것이다. 감염성 질환의 치료를 위한 TLR 아고니스트의 유효성은 기도 감염 모델을 비롯해 여러 동물 모델들에서 입증되었다(Brown, K. L., C. Cosseau, J. L. Gardy and R. E. Hancock 2007. Complexities of targeting innate immunity to treat infection. Trends Immunol 28:260-266.; Lembo, A., M. Pelletier, R. Iyer, M. Timko, J. C. Dudda, T. E. West, C. B. Wilson, A. M. Hajjar, and S. J. Skerrett. 2008. Administration of a synthetic TLR4 agonist protects mice from pneumonic tularemia. J Immunol 180:7574-7581; Romagne, F. 2007. Current and future drugs targeting one class of innate immunity receptors: the Toll-like receptors. Drug Discov Today 12:80-87). TLR5는 편모의 주요 구성성분인 박테리아 플라겔린을 감지한다. 표피 세포를 포함하는 폐관의 다양한 세포들이 TLR5를 발현하지만, TLR5 신호화 경로의 조절은 아직까지 기도 감염의 치료에 대해 연구되지 않았다.

스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)는 유아 및 노인에서 폐렴의 주요인이다. 선천적 방어는 폐렴연쇄구균 감염의 통제에 필수적이며, 결핍 반응은 감염되기 쉬운 개인에서 질환을 유발할 수 있다. 여기서, 본 출원인은 플라겔린이 선천적 면역력을 국부적으로 활성화시켜 급성 폐렴에 대한 내성을 증가시킬 수 있다는 것을 제시하였다. 플라겔린 점막 처리는 폐에서 S. 뉴모니아에(S. pneumoniae) 소거를 개선하였고 감염에 대한 생존 증가를 촉진하였다. 또한, 폐 구조는 감염된 마우스의 치료 후 완전히 복구되어, 플라겔린이 정상 상태 조건의 재-구축을 가능하게 하였다는 것을 나타낸다. TLR5를 통해 신호할 수 없는 플라겔린 돌연변이를 사용하여, 본 출원인은 TLR5 신호가 보호에 필수적이라는 점을 수립하였다. 기도에서, 플라겔린은 기도 내로의 호중구 침윤을 유도하였으며, IL-6, TNF-α, CXCL1, CXCL2 및 CCL20에 대한 코딩 유전자의 발현을 상향조절하였다. 감손 항체를 사용하여, 본 출원인은 호중구가 보호에 대한 주요 효과기라는 점을 증명하였다. 또한, 본 출원인은 B 및 T 세포-결핍 SCID 마우스가 면역적격 동물과 동일한 범위로 S. 뉴모니아에(S. pneumoniae) 유발접종을 소거시키는 것을 발견하여, 상기 세포 집단이 플라겔린-유도 보호에 필요하지 않다는 것을 제시하였다. 결국, 상기 결과는 S. 뉴모니아에(S. pneumoniae)에 의해 자연적으로 참여하지 않는 TLR에 의한 선천적 면역력의 점막 자극이 폐렴연쇄구균 폐렴을 치유하는 잠재력을 증가시킬 수 있다는 것을 강조한다. 더욱이 어떠한 특정 이론에 구속되지 않고, 본 출원인은 TLR5에 의한 선천적 면역력의 점막 자극이 또한 기도 감염의 치료를 위한 적절한 방식을 나타낸다고 믿는다. 예를 들어, 호흡 경로에 의해 선천적 면역력을 자극하는 것으로 알려진 비-피막형(non-typeable) 하에모필러스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae) 용해물과 같은 미생물 생성물은 S. 뉴모니아에 감염(Clement CG, Evans SE, Evans CM, Hawke D, Kobayashi R, Reynolds PR, Moghaddam SJ, Scott BL, Melicoff E, Adachi R, Dickey BF, Tuvim MJ. Stimulation of lung innate immunity protects against lethal pneumococcal pneumonia in mice. Am J Respir Crit Care Med. 2008 ;177:1322-30)을 비롯한 다양한 호흡성 감염들에 대항하여 보호할 수 있다(Evans SE, Scott BL, Clement CG, Larson DT, Kontoyiannis D, Lewis RE, Lasala PR, Pawlik J, Peterson JW, Chopra AK, Klimpel G, Bowden G, Hook M, Xu Y, Tuvim MJ, Dickey BF. Stimulated innate resistance of lung epithelium protects mice broadly against bacteria and fungi. Am J Respir Cell Mol Biol. 2010 ;42:40-50). 이러한 호흡성 감염에는 박테리아, 바이러스 및 진균에 의해 유도되는 질환들이 포함된다.

따라서, 본 발명은 기도 감염의 치료 방법에 사용하기 위한 TLR5 아고니스트에 관한 것이다.

용어 "기도 감염(respiratory tract infection)"은 당업계에서 이의 일반적인 의미를 갖고, 살아 있는 미생물에 의해 유도된 상기도(예를 들어, 코, 귀, 동(sinuses) 및 목) 및 하기도(예를 들어, 기관, 기관지, 및 폐)의 지정된 감염들을 나타내는 것으로 의도된다.

바이러스 감염을 야기하는 바이러스의 예에는 레트로바이러스(예를 들어, 인간 T-세포 림프영양성 바이러스(HTLV) 유형 I 및 II 및 인간 면역결핍 바이러스(HIV)), 헤르페스 바이러스(예를 들어, 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 유형 I 및 II, 엡스테인-바르(Epstein-Barr) 바이러스, HHV6-HHV8, 및 사이토메갈로바이러스), 아레나바이러스(예를 들어, 라사 열 바이러스), 파라믹소바이러스(예를 들어, 홍역바이러스 바이러스, 인간 호흡기 세포융합 바이러스, 볼거리, hMPV, 및 폐렴바이러스), 아데노바이러스, 버냐바이러스(예를 들어, 한타바이러스), 코마바이러스, 필로바이러스(예를 들어, 에볼라 바이러스), 플라비바이러스(예를 들어, C형 간염 바이러스(HCV), 황열병 바이러스, 및 일본 뇌염 바이러스), 헤파드나바이러스(예를 들어, B형 간염 바이러스(HBV)), 오르토마이오바이러스(예를 들어, 인플루엔자 바이러스 A, B 및 C 및 PIV), 파포바바이러스(예를 들어, 파필로마바이러스), 피코르나바이러스(예를 들어, 리노바이러스, 엔테로바이러스 및 A형 간염 바이러스), 폭스바이러스, 레오바이러스(예를 들어, 로타바이러스), 토가바이러스(예를 들어, 풍진 바이러스), 및 랍도바이러스(예를 들어, 광견병 바이러스)가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

박테리아 기도 감염을 야기하는 박테리아의 예에는 아쿠아스필릴룸(Aquaspirillum) 과, 아조스피릴룸(Azospirillum) 과, 아조토박테라세아에(Azotobacteraceae) 과, 박테로이다세아에(Bacteroidaceae) 과, 바르토넬라(Bartonella) 종, 브델로비브리오(Bdellovibrio) 과, 캄필로박테르(Campylobacter) 종, 클라마이디아(Chlamydia) 종(예를 들어, 클라마이디아 뉴모니아에(Chlamydia pneumoniae)), 클로스트리듐(Clostridium), 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 과(예를 들어, 시트로박테르(Citrobacter) 종, 에드워드시엘라(Edwardsiella), 엔테로박테르 아에로게네스(Enterobacter aerogenes), 에르비니아(Erwinia) 종, 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 하프니아(Hafnia) 종, 클렙시엘라(Klebsiella) 종, 모르가넬라(Morganella) 종, 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 프로비덴시아(Providencia), 살모넬라(Salmonella) 종, 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 및 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri)), 가르디넬라(Gardinella) 과, 하에모필러스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 할로박테리아세아에(Halobacteriaceae) 과, 헬리코박테르(Helicobacter) 과, 레지오날라세아에(Legionallaceae) 과, 리스테리아(Listeria) 종, 메틸로코카세아에(Methylococcaceae) 과, 마이코박테리아(예를 들어, 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)), 네이세리아세아에(Neisseriaceae) 과, 오세아노스피릴룸(Oceanospirillum) 과, 파스퉤렐라세아에(Pasteurellaceae) 과, 뉴모코쿠스(Pneumococcus) 종, 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 리조비아세아에(Rhizobiaceae) 과, 스필릴룸(Spirillum) 과, 스피로소마세아에(Spirosomaceae) 과, 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들어, 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 스타필로코쿠스 피로게네스(Staphylococcus pyrogenes)), 스트렙토코쿠스(Streptococcus)(예를 들어, 스트렙토코쿠스 엔테리티디스(Streptococcus enteritidis), 스트렙토코쿠스 파시아에(Streptococcus Fasciae), 및 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)), 밤피로비브르 헬리코박테르(Vampirovibr Helicobacter) 과, 및 밤피로비브리오(Vampirovibrio) 과가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

진균 감염을 일으키는 진균의 예에는 압시디아(Absidia) 종(예를 들어, 압시디아 코림비페라(Absidia corymbifera) 및 압시디아 라모사(Absidia ramosa)), 아스페르길루스(Aspergillus) 종(예를 들어, 아스페르길루스 피아부스(Aspergillus fiavus), 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger), 및 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus)), 블라스토마이세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 칸디다(Candida) 종(예를 들어, 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 글라브랄라(Candida glabrala), 칸디다 케르(Candida kerr), 칸디다 크루세이(Candida krusei), 칸디다 파랍실로시스(Candida parapsilosis), 칸디다 슈도트로피칼리스(Candida pseudotropicalis), 칸디다 퀼레르몬디이(Candida quillermondii), 칸디다 루고사(Candida rugosa), 칸디다 스텔라토이데아(Candida stellatoidea), 및 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)), 코시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis), 코니디오볼루스(Conidiobolus) 종, 크립토코쿠스 네오포름스(Cryptococcus neoforms), 쿤닝하멜라(Cunninghamella) 종, 히스토플라즈마 캅술라툼(Histoplasma capsulatum), 무코르푸실루스(Mucorpusillus), 파라코시디오이데스 브라실리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis), 슈달레쉐리아 보이디이(Pseudallescheria boydii), 뉴모시스티스 카리니이(Pneumocystis carinii), 리조푸스(Rhizopus) 종(예를 들어, 리조푸스 아리주스(Rhizopus arrhizus), 리조푸스 오리자에(Rhizopus oryzae), 및 리조푸스 마이크로스포레스(Rhizopus Microspores)), 사카로마이세스(Saccharomyces) 종, 및 스포로트릭스 쉔키이(Sporothrix schenckii)가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

특정 구현예에서, 본 발명에 따른 기도 감염은 박테리아 기도 감염, 특히 편모를 갖지 않은 박테리아로부터 야기되는 기도 감염이다. 통상적으로, 편모를 갖지 않고 기도 감염을 일으키는 박테리아에는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 하에모필러스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis), 또는 마이코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae)가 포함된다. 더욱 더 바람직하게는, 본 발명에 따른 기도 감염은 폐렴연쇄구균 감염이다.

본원에 사용되는 용어 "톨-유사 수용체 5(toll-like receptor 5)" 또는 "TLR5"는 당업계의 이의 일반적인 의미를 가지며, 임의 종의 톨-유사 수용체 5, 바람직하게는 인간 톨-유사 수용체 5를 의미하는 것으로 의도된다. 활성화시에, TLR5는 세포 표면으로부터 핵까지 일련의 신호 분자를 통해 전파되는 세포내 신호를 전달함으로써 세포 반응을 유도한다. 통상적으로, TLR5의 세포내 도메인은 어댑터 단백질인 MyD88을 모집하고, 이는 세린/트레오닌 키나아제 IRAK(IRAK-1 및 IRAK-4)를 모집한다. IRAK는 TRAF6과 복합체를 형성하고, 이것은 그 후 TLR 신호 전달에 참여하는 다양한 분자들과 상호작용한다. 상기 분자 및 기타 TLR5 신호 전달 경로 성분들은 fos, jun 및 NF-kB와 같은 전사 인자들의 활성, 및 fos-, jun- 및 NF-kB-조절 유전자, 예컨대 IL-6, TNF-α, CXCL1, CXCL2 및 CCL20의 유전자 생성물들의 상응하는 유도를 자극한다.

본원에 사용되는 용어 "TLR5 아고니스트(agonist)"는 TLR5를 통해 정상 신호 전달을 선택적으로 활성화시키거나 증가시키는 화합물(천연적이거나 그렇지 않음)을 말한다. TLR5 아고니스트는, 예를 들어 TLR5 또는 TLR5 리간드의 고유의 형태를 개질 또는 변경함으로써, 간접적으로 TLR5를 통한 정상 신호 전달을 활성화 또는 증가시킬 수 있다. TLR5 신호를 매개하는 신호화 분자 뿐만 아니라 TLR5 활성화의 결과로서 생성된 분자의 활성은 관찰되거나 측정될 수 있는 TLR5 활성이다. 따라서, TLR5 활성에는 세포내 신호화 분자의 모집 뿐만 아니라 전사 인자 활성화 및 면역조절성 분자의 생성과 같은 TLR5 활성화에서 기인하는 다운스트림 사건이 포함된다. TLR5-발현 세포에 의해 방출되는 사이토카인은 대상에서 면역 반응을 촉진하기 위해 다른 면역계 세포들을 조절하기 때문에, TLR5 세포 반응은 대상체에서 선천적 면역계 반응을 매개한다. 그러므로, 본원에서 사용되는 용어 "TLR5-매개 반응"은 TLR5-매개 세포 반응을 유도하는 TLR5 아고니스트의 능력을 의미하는 것으로 의도된다. 예시적인 TLR5-매개 세포 반응에는 fos, jun 및 NF-kB와 같은 전사 인자의 활성화, IL-6, TNF-α, CXCL1, CXCL2 및 CCL20과 같은 사이토카인 및 케모카인의 생성, 및 대상에서의 면역 반응의 자극이 포함된다.

일구현예에서, 본 발명에 따른 TLR5 아고니스트는 저분자량 아고니스트, 예를 들어 소형 유기 분자이다. 용어 "소형 유기 분자(small organic molecule)"는 약제학에서 일반적으로 사용되는 상기 유기 분자들과 비슷한 크기의 분자를 말한다. 상기 용어는 생물학적 거대분자(예를 들어, 단백질, 핵산 등)를 배제한다. 바람직한 소형 유기 분자는 크기가 약 5000Da 이하, 더욱 바람직하게는 2000Da 이하, 가장 바람직하게는 약 1000Da 이하의 범위이다.

대안적으로는, 본 발명에 따른 TLR5 아고니스트는 항체(이는 "항체 분절(fragment)"을 포함함)로 이루어질 수 있다. 특히, TLR5 아고니스트는 상기 항체가 수용체를 활성화시키는 방식으로, TLR5에 대항하는 항체로 이루어질 수 있다.

항체는 예를 들어 그 중에서도 돼지, 소, 말, 토끼, 염소, 양 및 마우스로부터 선택되는 숙주 동물에 적합한 항원 또는 에피토프를 투여함으로써 공지된 방법에 따라 발생될 수 있다. 당업계에 공지된 다양한 아쥬반트들은 항체 생성을 향상시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 실시에 유용한 항체는 폴리클론일 수 있으나, 단일클론 항체가 바람직하다. 단일클론 항체는 배양중인 지속적인 세포주에 의해 항체 분자의 생성을 제공하는 임의의 기술을 사용하여 제조되고 단리될 수 있다. 제조 및 단리 기술에는 하이브리도마 기술; 인간 B-세포 하이브리도마 기술; 및 EBV-하이브리도마 기술이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 대안적으로는, 단일 사슬 항체의 제조를 위해 개시된 기술(예를 들어, 미국 특허 번호 4,946,778 참조)이 항-TLR5 단일 사슬 항체를 생성하기 위해 적용될 수 있다.

본 발명의 실시에 유용한 TLR5 아고니스트에는 또한 항-TLR5 항체 분절이 포함되며, 여기에는 F(ab')2 분절(이는 미손상 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생성될 수 있음) 및 Fab 분절(이는 F(ab')2 분절의 디술피드 가교의 환원에 의해 생성될 수 있음)이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 대안적으로는, Fab 및/또는 scFv 발현 라이브러리는 TLR5에 대해 원하는 특이성을 갖는 분절의 빠른 확인을 가능하게 하도록 구축될 수 있다.

인간화 항체 및 이의 항체 분절은 또한 공지된 기술에 따라 제조될 수 있다. "인간화 항체"는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 비-인간(예를 들어, 설치류) 키메라 항체의 형태이다. 대부분, 인간화 항체는 수용자의 과가변 영역(CDR)으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및 수용력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종(기증자 항체)의 과가변 영역으로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화된 항체는 수용자 항체 또는 기증자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 상기 개질은 항체 성능을 추가로 개선하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 실질적으로 하나 이상의, 통상적으로 둘 이상의 가변 도메인 모두를 포함할 것이고, 이 중 모든 또는 실질적으로 모든 과가변 루프들은 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 또한, 인간화 항체는 통상적으로 인간 면역글로불린의 것인, 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 임의적으로 포함할 것이다. 인간화된 항체의 제조 방법은 예를 들어 Winter(미국 특허 번호 5,225,539) 및 Boss(Celltech, 미국 특허 번호 4,816,397)에 개시된다.

상기 기재된 바와 같이 항체를 발생시킨 후, 당업자는 TLR5 아고니스트를 쉽게 선택할 수 있다.

또다른 구현예에서, TLR5 아고니스트는 앱타머(aptamer)이다. 앱타머는 분자 인식에 있어 항체에 대한 대안을 나타내는 분자 계열이다. 앱타머는 높은 친화성과 특이성을 가진 임의 계열의 표적 분자들을 사실상 인식하는 수용력이 있는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고펩티드 서열이다. 이러한 리간드는 [Tuerk C. and Gold L., 1990]에 기재된 바와 같이, 랜덤 서열 라이브러리의 Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment(SELEX)를 통해 단리될 수 있다. 랜덤 서열 라이브러리는 DNA의 조합적 화학 합성에 의해 수득가능하다. 상기 라이브러리에서, 각각의 일원은 결국 화학적으로 개질된 특정 서열의 선형 올리고머이다. 상기 계열의 분자의 가능한 개질, 용도 및 장점은 [Jayasena S.D., 1999]에 검토되어 있다. 펩티드 앱타머는 2개의 하이브리드 방법에 의해 조합 라이브러리에서 선택되는 E. 콜라이 티오레독신(Thioredoxin) A와 같은 플랫폼 단백질에 의해 나타나는 형태적으로 제한된 항체 가변 영역으로 이루어진다.

상기 기재된 바와 같이 TLR5에 대항하는 앱타머를 발생시킨 후, 당업자는 TLR5 아고니스트인 것을 쉽게 선택할 수 있다.

또다른 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 TLR5 아고니스트는 폴리펩티드, 특히 플라겔린 폴리펩티드이다.

본원에 사용되는 용어 "플라겔린(flagellin)"은 다양한 그람-양성 또는 그람-음성 박테리아 종에 함유된 플라겔린을 의미하는 것으로 의도된다. 플라겔린의 비제한적인 기원에는 에스케리챠(Escherichia), 예를 들어 E. 콜라이(E. coli), 엔테로박테르(Enterobacter), 에르비니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어 살모넬라 엔테리카 세로바르 티피무리움(Salmonella enterica serovar Typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 및 쉬겔라(Shigella), 뿐만 아니라 바실리(Bacilli), 예컨대 B. 서브틸리스(B. subtilis) 및 B. 리케니포르미스(B. licheniformis), 슈도모나스(Pseudomonas), 예컨대 P. 아에루기노사(P. aeruginosa), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 예는 제한적이라기보다는 예증적이다. 플라겔린의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열은 NCBI Genbank에서 공개적으로 이용가능하고, 예를 들어 접근 번호 AAL20871, NP_310689, BAB58984, AAO85383, AAA27090, NP_461698, AAK58560, YP_001217666, YP_002151351, YP_001250079, AAA99807, CAL35450, AAN74969, 및 BAC44986을 참조한다. 상기 종들과 다른 종들로부터의 플라겔린 서열은 본원에 사용된 용어 플라겔린에 의해 포함되는 것으로 의도된다. 그러므로, 종 간의 서열 차이는 상기 용어의 의미 내에 포함된다.

용어 "플라겔린 폴리펩티드"는 TLR5에 결합하고 이를 활성화시키는 능력을 보유한 플라겔린 또는 이의 분절로 의도된다. 통상적으로, 본 발명에 따른 플라겔린 폴리펩티드는 TLR5 신호에 관여하는 플라겔린의 도메인을 포함한다. 용어 "플라겔린의 도메인"에는 플라겔린의 자연 발생적 도메인 및 이의 기능 보존적 변이체가 포함된다. "기능 보존적 변이체(function conservative variants)"는 단백질 또는 효소 중에서 특정 아미노산 잔기가 유사한 특성(예컨대, 극성, 수소 결합 전위, 산성, 염기성, 소수성, 방향족 등)을 갖는 것으로 대체되는 것을 포함하나 이에 제한되지 않는, 폴리펩티드의 전반적인 형태 및 기능을 변경하지 않으면서 변화된 것이다. 보존되는 것으로 표시된 것 이외의 아미노산은 단백질 사이에서 상이할 수 있어, 기능이 유사한 임의의 2개 단백질 사이의 % 단백질 또는 아미노산 서열 일치성은 가변될 수 있고, 이는 유사성이 MEGALIGN 알고리즘에 기반하는 luster Method에 의한 정렬 계획에 따라 측정된 바와 같이 예를 들어 70% 내지 99%일 수 있다. "기능-보존적 변이체"에는 또한 BLAST 또는 FASTA 알고리즘에 의해 측정되는 것과 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 아미노산 일치성을 갖고, 이것을 비교하는 고유의 또는 모체 단백질과 특성 또는 기능이 동일하거나 실질적으로 유사한 폴리펩티드가 포함된다. TLR5 신호화에 포함된 플라겔린의 도메인은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 [Smith et al. (2003) Nat. Immunol. 4: 1247-1253]을 참조한다(예컨대, S. 티피뮤리움(S. typhimurium) 플라겔린의 아미노산 78-129, 135-173 및 394-444, 또는 이의 상동 또는 개질된 형태).

플라겔린 폴리펩티드의 예에는 참조로서 인용된 미국 특허 번호 6,585,980; 6,130,082; 5,888,810; 5,618,533; 및 4,886,748; 미국 특허 공개 번호 US 2003/0044429 A1; 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2008097016 및 WO 2009156405에 기재된 것이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

예시적인 E. 콜라이(E. coli) O157 : H7 플라겔린은 SEQD ID NO:1이다. 예시적인 S. 티피뮤리움(S. typhimurium) 플라겔린은 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3이다. SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3과 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 일치하는 아미노산 서열이 본 발명에 따른 플라겔린 폴리펩티드로서 사용될 수 있다.

또다른 특정 구현예에서, 본 출원은 전체가 참조로서 인용된 국제 특허 출원 번호 WO 2009156405에 기재된 플라겔린 재조합 단백질의 사용을 포함한다. 따라서, 본 발명의 플라겔린 폴리펩티드는: a) SEQ ID NO:3의 위치 1에 위치하는 아미노산 잔기로부터 시작하여 SEQ ID NO:3의 위치 99 내지 173에 위치하는 아미노산 잔기 중 임의의 하나로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에서 종결되는 아미노산 서열과 적어도 90% 아미노산 일치성을 갖는 N-말단 펩티드; 및 b) SEQ ID NO:3의 위치 401 내지 406에 위치하는 아미노산 잔기 중 임의의 하나로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에서 시작하고 SEQ ID NO:3의 위치 494에 위치하는 아미노산 잔기에서 종결되는 아미노산 서열과 적어도 90% 아미노산 일치성을 갖는 C-말단 펩티드를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 N-말단 펩티드는 상기 C-말단 펩티드에 직접 연결되거나, 또는 상기 N-말단 펩티드 및 상기 C-말단 펩티드는 스페이서(spacer) 사슬을 통해, 서로 간접적으로 연결된다. 또다른 특정 구현예에서, 상기 N-말단 펩티드는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열 1-99, 1-137, 1-160 및 1-173으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또다른 구현예에서, 상기 C-말단 펩티드는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열 401-494 및 406-494로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또다른 구현예에서, 상기 N-말단 및 C-말단 펩티드는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열 1-173 및 401-494로 각각 이루어진다. 또다른 구현예에서, 상기 N-말단 및 C-말단 펩티드는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열 1-160 및 406-494로 각각 이루어진다. 또다른 구현예에서, 상기 N-말단 및 C-말단 펩티드는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열 1-137 및 406-494로 각각 이루어진다. 또다른 구현예에서, 상기 N-말단 펩티드 및 상기 C-말단 펩티드는 NH2-Gly-Ala-Ala-Gly-COOH(SEQ ID NO:4) 펩티드 서열로 이루어진 중간 스페이서 사슬을 통해, 서로 간접적으로 연결된다. 또다른 구현예에서, SEQ ID NO:3의 위치 488에 위치한 아스파라긴 아미노산 잔기는 세린으로 대체된다. 또다른 구현예에서, 상기 기재된 바와 같은 플라겔린 폴리펩티드는 N-말단 말미에 부가적인 메티오닌 잔기를 포함한다.

본 발명에 따른 플라겔린 폴리펩티드는 이의 아미노산 서열을 코딩하고 트랜스펙션된 세포 내에서 이의 효과적인 생성을 가능하게 하는 핵산으로 트랜스펙션된 재조합 세포에 의해 재조합적으로 생성될 수 있다.

본 발명의 플라겔린 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은, 클로닝(DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능한 벡터 내에 삽입될 수 있다. 다양한 벡터들이 공개적으로 이용가능하다. 벡터는 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자, 또는 파지의 형태일 수 있다. 적합한 핵산 서열은 다양한 절차에 의해 벡터 내로 삽입될 수 있다. 일반적으로, DNA는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 적합한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들) 내로 삽입된다.

벡터 구성성분에는 일반적으로 서열이 분비되는 경우 하나 이상의 신호 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 하나 이상의 상기 성분을 함유하는 적합한 벡터의 구축은 당업자에게 공지된 표준 라이게이션 기술을 사용한다.

본 발명의 플라겔린 폴리펩티드는 직접적으로 제조될 수 있을 뿐만 아니라 성숙 단백질 또는 펩티드의 N-말단에 특이적 분할 부위를 갖는 신호 서열 또는 다른 폴리펩티드일 수 있는 이종 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 재조합적으로 제조될 수 있다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 구성성분일 수 있거나, 또는 이것은 벡터 내에 삽입된 관심대상인 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 일부일 수 있다. 신호 서열은 예를 들어 알칼리 포스파타아제, 페니실리나아제, Ipp, 또는 열-안정성 장독소 I1 리더의 군으로부터 선택된 원핵생물 신호 서열일 수 있다. 효모 분비의 경우 신호 서열은 예를 들어 효모 자당효소 리더, 알파 인자 리더(이는 사카로마이세스(Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces).알파.-인자 리더를 포함함, 후자는 미국 특허 번호 5,010,182에 기재됨), 또는 산 포스파타아제 리더, C. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라아제 리더, 또는 WO 90/13646에 기재된 신호일 수 있다. 포유류 세포 발현에서, 포유류 신호 서열은 단백질의 직접 분비, 예컨대 동일한 또는 관련된 종의 분비된 폴리펩티드로부터의 신호 서열 뿐만 아니라 바이러스 분비 리더에 사용될 수 있다.

발현 및 클로닝 벡터 모두는 벡터를 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제될 수 있게 하는 핵산 서열을 함유한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대해 잘 알려져 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기원은 대부분의 그람-음성 박테리아에 적합하고, 2.mu. 플라스미드 기원은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기원(SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유류 세포 내의 클로닝 벡터에 유용하다.

발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로 선별가능 마커라고도 불리는 선별 유전자를 함유할 것이다. 통상적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 중요 영양소를 공급하는(예를 들어, 바실리(Bacilli)에 대한 D-알라닌 라세마아제를 코딩하는 유전자) 단백질을 코딩한다.

포유류 세포에 적합한 선별가능 마커의 예는 본 발명의 플라겔린 폴리펩티드, 예컨대 DHFR 또는 티미딘 키나아제를 코딩하는 핵산을 받아들이기 위해 적격화된 세포를 확인할 수 있게 하는 것들이다. 야생형 DHFR이 사용되는 경우의 적합한 숙주 세포는 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)]에 기재된 바와 같이 제조되고 전파되는, DHFR 활성이 결핍된 CHO 세포주이다. 효모에서 사용하기에 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp 1 유전자이다. [Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7: 141 (1979); Tschemper et al, Gene, 10: 157 (1980)]. 상기 trp1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력이 결핍된 효모의 돌연변이 균주에 대한 선별 마커를 제공한다, 예를 들어 [ATCC No. 44076 또는 PEP4-1. Jones, Genetics, 85: 12 (1977)].

발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로 mRNA 합성을 지시하는 플라겔린 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 다양한 잠재적인 숙주 세포들에 의해 인지되는 프로모터는 잘 알려져 있다. 원핵생물 숙주와의 사용에 적합한 프로모터에는 베타-락타마아제 및 락토오스 프로모터 시스템(Chang et al., Nature, 275: 615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281 : 544 (1979)), 알칼리 포스파타아제, 트립토판(trp) 프로모터 시스템(Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776), 및 잡종 프로모터, 예컨대 tac 프로모터(deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983))가 포함된다. 박테리아 시스템에서 사용하기 위한 프로모터는 또한 본 발명의 플라겔린 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노(Shine-Dalgarno(S.D.)) 서열을 함유할 것이다.

효모 숙주와 사용하기에 적합한 촉진 서열의 예에는 3-포스포글리세레이트 키나아제(Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980)) 또는 기타 당분해 효소(Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 (1968); Holland, Biochemistry, 17: 4900 (1978)), 예컨대 에놀라아제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나아제, 헥소키나아제, 피루베이트 디카르복실라아제, 포스포프룩토키나아제, 글루코오스-6-포스페이트 이소머라아제, 3-포스포글리세레이트 뮤타아제, 피루베이트 키나아제, 트리오스포스페이트 이소머라아제, 포스포글루코오스 이소머라아제, 및 글루코키나아제에 대한 프로모터가 포함된다.

성장 조건에 의해 조절되는 전사의 부가적인 장점을 갖는 유도성 프로모터인 다른 효모 프로모터들은 알코올 디히드로게나아제 2, 이소사이토크롬 C, 산 포스파타아제, 질소 대사와 연관된 분해성 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디히드로게나아제, 및 말토오스 및 갈락토오스 이용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 추가로 기재되어 있다. 포유류 숙주 세포에서 벡터 유래의 관심대상인 전사의 핵산은, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스(UK 2,211,504, 1989년 7월 5일 공개됨), 아데노바이러스(예컨대 아데노바이러스 2), 소 파필로마 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 및 원숭이 바이러스 40(SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터 수득된 프로모터에 의해 조절되거나; 이종 포유류 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터에 의해 조절되거나; 및 열-쇼크 프로모터에 의해, 단 이러한 프로모터가 숙주 세포 시스템과 상용될 수 있다는 조건하에 조절된다.

고차 진핵생물에 의한 본 발명의 플라겔린 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사는 벡터 내에 인핸서 서열을 삽입함으로써 증가될 수 있다. 인핸서는 이의 전사를 증가시키기 위해 프로모터에 작용하는, 통상 약 10 내지 300 bp인 DNA의 시스-작용 요소이다. 다수의 인핸서 서열들은 포유류 유전자(글로빈, 엘라스타아제, 알부민, 알파.-페토단백질 및 인슐린)로부터 공지된다. 그러나, 통상적으로는 진핵생물 세포 바이러스 유래의 인핸서를 사용할 것이다. 그 예에는 복제 기원의 후기 측면 상의 SV40 인핸서(bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기원의 마지막 측면 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서가 포함된다. 인핸서는 관심대상인 폴리펩티드에 대한 코딩 서열에 대해 위치 5' 또는 3'에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있으나, 바람직하게는 프로모터로부터 부위 5'에 위치한다.

진핵 숙주 세포(효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 세포)에서 사용되는 발현 벡터는 또한 전사 종결 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 진핵생물 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및, 가끔은 3', 미번역 영역으로부터 통상적으로 이용가능하다. 상기 영역은 본 발명의 플라겔린 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 미번역된 부분 내의 폴리아데닐화 분절로서 전사된 뉴클레오티드 분절을 함유한다.

재조합 척추동물 세포 배양 중 본 발명의 플라겔린 폴리펩티드의 합성에 적응시키기에 적합한 또다른 방법, 벡터 및 숙주세포는 [Gething et al., Nature, 293: 620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281: 40-46 (1979); EP 117,060; 및 EP 117,058]에 기재되어 있다.

숙주 세포의 선별 및 형질전환 숙주 세포는 플라겔린 폴리펩티드 생성에 대해 본원에 기재된 발현 또는 클로닝 벡터로 트랜스펙션되거나 형질전환되고, 프로모터 유도, 형질전환체 선택, 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자 증폭에 적합한 것으로 개질된 통상적인 영양 배지에서 배양된다.

배양 조건, 예컨대 배지, 온도, pH 등은 과도한 실험 없이 당업자에 의해 선택될 수 있다. 일반적으로, 세포 배양물의 생산성을 최대화하기 위한 원리, 프로토콜 및 실시 기술은 [Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed.(IRL Press, 1991)]에서 찾을 수 있다.

트랜스펙션 방법은 당업자에게 알려져 있다(예를 들어, CaPO4 처리 및 전기천공). 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 이러한 세포에 적합한 표준 기술을 사용하여 수행된다. [Sambrook et al., supra]에 기재된 바와 같이 염화칼슘을 사용하는 칼슘 처리, 또는 전기천공은 일반적으로 실질적인 세포-벽 장벽을 함유하는 원핵생물 또는 다른 세포에 대해 사용된다. 이러한 세포벽이 없는 포유류 세포의 경우, [Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)]의 칼슘 포스페이트 침전법이 사용될 수 있다. 포유류 세포 숙주 시스템 형질전환의 일반적인 양상은 미국 특허 번호 4,399,216에 기재되어 있다. 효모 내로의 형질전환은 통상적으로 [Van Solingen et al., J. Bact, 130: 946 (1977) 및 Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76: 3829 (1979)]의 방법에 따라 실시된다. 그러나, 예컨대 핵 마이크로주사, 전기천공, 미손상 세포와의 박테리아 원형질 융합, 또는 폴리양이온, 예를 들어 폴리브렌 또는 폴리오르니틴에 의한 DNA를 세포 내로 도입하기 위한 다른 방법이 또한 사용될 수 있다. 포유류 세포를 형질전환하기 위한 다양한 기술에 대해 [Keown et al., Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990) 및 Mansour et al., Nature, 336: 348-352 (1988)]를 참조한다.

본 발명에서 벡터 내 DNA의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포에는 원핵생물, 효모, 또는 고차 진핵생물 세포가 포함된다.

적합한 원핵생물에는 유박테리아, 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 예컨대 E. 콜라이(E. coli)가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 다양한 E. 콜라이 균주, 예컨대 E. 콜라이 K12 균주 MM294(ATCC 31 ,446); E. 콜라이 X1776(ATCC 31,537); E. 콜라이 균주 W3110(ATCC 27,325); 및 K5772 (ATCC 53,635)가 공개적으로 이용가능하다. 다른 적합한 원핵생물 숙주 세포에는 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 예컨대 에스케리챠(Escherichia), 예를 들어 E. 콜라이(E. coli), 엔테로박테르(Enterobacter), 에르비니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 및 쉬겔라(Shigella), 뿐만 아니라 바실리(Bacilli), 예컨대 B. 서브틸리스(B. subtilis) 및 B. 리케니포르미스(B. licheniformis)(예를 들어, 1989년 4월 12일에 공개된 DD 266,710에 기재된 B. 리케니포르미스(B. licheniformis) 41 P), 슈도모나스(Pseudomonas), 예컨대 P. 아에루기노사(P. aeruginosa), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)가 포함된다. 상기 예는 제한적이지 않고 예시이다.

살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)의 균주 SIN41(fliC fljB)은 특히 본 발명의 플라겔린 폴리펩티드의 제조를 위해 흥미로우며, 그 이유는 상기 원핵생물 숙주 세포가 어떠한 플라겔린도 분비하지 않기 때문이다(Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 ;98:13722-7). 그러나 플라겔린은 소위 "유형 III 분비 시스템"이라고 지칭되는 구체화된 분비 시스템을 통해 분비된다. 흥미롭게도, 균주 SIN41은 최적의 플라겔린 분비에 필요한 유형 III 분비 시스템의 모든 구성성분들을 생성한다. fliC 프로모터 하에서 신규한 플라겔린 펩티드를 코딩하는 클로닝 서열은 균주 SIN41에서 관심대상인 플라겔린 폴리펩티드의 다량 분비를 가능하게 한다.

균주 W3110이 또한 흥미로우며, 그 이유는 재조합 DNA 생성물 발효를 위한 통상의 숙주 균주이기 때문이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 최소 양의 단백질분해 효소를 분비한다. 예를 들어, 균주 W3110은 숙주에 내생적인 단백질을 코딩하는 유전자 중의 유전적 돌연변이에 영향을 주도록 개질될 수 있고, 이러한 숙주의 예에는 완전한 유전자형 tonA를 갖는 E. 콜라이 W3110 균주 1A2; 완전한 유전자형 tonA ptr3을 갖는 E. 콜라이 W3110 균주 9E4; 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT kan.sup.r을 갖는 E. 콜라이 W31 10 균주 27C7(ATCC 55,244); 완전한 유전자형 tona ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan.sup.r을 갖는 E. 콜라이 W31 10 균주 37D6; 비-카나마이신 내성 degP 결실 돌연변이를 가진 균주 37D6인 E. 콜라이 W31 10 균주 40B4; 및 1990년 8월 7일에 발행된 미국 특허 번호 4,946,783에 기재된 돌연변이 주변세포질 프로테아제를 갖는 E. 콜라이 균주가 포함된다. E. 콜라이 균주 MG1655, MG1655 AfimA-H 또는 MKS12, fliD- 및 -f/m>A-/-/-결실 MG1655 균주는 또한 분비된 단백질로서 재조합 플라겔린의 생성을 위한 흥미로운 후보자이다(Nat Biotechnol. 2005; (4):475-81). 대안적으로는, 클로닝의 시험관내 방법, 예를 들어 PCR 또는 기타 핵산 폴리머라아제 반응이 적합하다.

원핵생물 외에, 진핵 미생물, 예컨대 사상 진균 또는 효모는 본 발명에 따른 플라겔린 폴리펩티드를 코딩하는 벡터에 대해 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)는 통상적으로 사용되는 저급 진핵 숙주 미생물이다.

다른 것에는 스퀴조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; 1985년 5월 2일 공개된 EP 139,383); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주(미국 특허 번호 4,943,529; Fleer et al., Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)), 예를 들어 K. 락티스(K. lactis)(MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacterid., 737 [1983]), K. 프라길리스(K. fragilis)(ATCC 12,424), K. 불가리쿠스(K. bulgaricus)(ATCC 16,045), K. 위케라미이(K. wickeramii)(ATCC 24,178), K. 발티이(K. waltii)(ATCC 56,500), K. 드로소필라룸(K. drosophilarum)(ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. 테르모톨레란스(K. thermotolerans), 및 K. 마르시아누스(K. marxianus); 야로비아(yarrowia)(EP 402,226); 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)(EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28: 265-278 [1988]); 칸디다(Candida); 트리코데르마 레시아(Trichoderma reesia)(EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)(Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]); 쉬반니오마이세스(Schwanniomyces), 예컨대 쉬반니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis)(1990년 10월 31일에 공개된 EP 394,538); 및 사상 진균, 예를 들어 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium)(1991년 1월 10일에 공개된 WO 91/00357), 및 아스페르길루스(Aspergillus) 숙주, 예컨대 A. 니둘란스(A. nidulans)(Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) 및 A. 니게르(A. niger)(Kelly and Hynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985])가 포함된다. 메탄올요구성(Methylotropic) 효모가 본원에 적합하고, 한세눌라(Hansenula), 칸디다(Candida), 클로에케라(Kloeckera), 피치아(Pichia), 사카로마이세스(Saccharomyces), 토룰롭시스(Torulopsis), 및 로도토룰라(Rhodotorula)로 이루어진 속으로부터 선택된 메탄올에서 성장할 수 있는 효모가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 플라겔린 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예에는 드로소필라(Drosophila) S2 및 스포돕테라(Spodoptera) Sf9와 같은 곤충 세포, 뿐만 아니라 식물 세포가 포함된다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예에는 중국 햄스터 난소(CHO) 및 COS 세포가 포함된다. 더욱 특이적인 예에는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 주(293 또는 현탁 배양에서 성장하기 위해 서브클로닝된 293 세포, Graham et al., J. Gen. Virol., 36: 59 (1977)); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR(CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); 마우스 세르톨리(Sertoli) 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 및 마우스 유선 종양(MMT 060562, ATCC CCL51)이 포함된다. 적합한 숙주 세포의 선택은 당업계의 기술 범주 내에 있는 것으로 간주된다.

본 발명의 플라겔린 폴리펩티드는 배양 배지로부터 또는 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수 있다. 막-결합된 경우, 이것은 적합한 세제 용액(예를 들어, TRITON-XTM. 100)을 사용하여 또는 효소 분할에 의해 막으로부터 방출될 수 있다.

본 발명의 플라겔린 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 발현에 사용된 세포는 다양한 물리적 또는 화학적 수단, 예컨대 동결-해동 사이클링, 초음파분쇄, 기계적 파괴, 또는 세포-용해제에 의해 파괴될 수 있다. 재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 관심대상인 폴리펩티드를 정제하는 것이 바람직할 수 있다. 하기 절차는 적합한 정제 절차의 예시이다: 이온-교환 컬럼 상의 분획화; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 또는 DEAE와 같은 양이온-교환 수지 상의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 암모늄 술페이트 침전; 예를 들어, Sephadex G-75를 사용하는 겔 여과; IgG와 같은 오염물을 제거하기 위한 단백질 A Sepharose 컬럼; 및 본 발명의 플라겔린 폴리펩티드의 에피토프-태그된 형태에 결합하는 금속 킬레이트 컬럼.

다양한 단백질 정제 방법들이 사용될 수 있고 이러한 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 [Deutscher, Methods in Enzymology, 182(1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice(Springer-Verlag: New York, 1982)]에 기재된다. 선택된 정제 단계(들)은 예를 들어 사용된 제조 공정 및 제조된 특정 플라겔린 폴리펩티드의 특징에 따라 다를 것이다.

바람직한 구현예에서, 플라겔린 폴리펩티드는 [Nempont et al.(Nempont, C. C., D.; Rumbo, M.; Bompard, C.; Villeret, V.; Sirard, J.C. 2008. Deletion of flagellin's hypervariable region abrogates antibody-mediated neutralization and systemic activation of TLR5-dependent immunity. J Immunol 181:2036-2043)]에 기재된 바와 같이 재조합 S. 티피뮤리움(S. typhimurium) SIN41(fliC fljB)의 상청액으로부터 정제된다. 특히, 살모넬라(Salmonella)를 루리아-베르타니(Luria-Bertani(LB)) 브로스 중에 6-18시간 동안 37℃에서 진탕하면서 성장시켰다. 상청액을 여과하고 60% 암모늄 술페이트(Sigma Aldrich, USA)로 포화시켰다. 침전된 물질을 원심분리, 20mM Tris/HCl pH7.5 중의 가용성 및 이후 투석에 의해 회수하였다. 단백질을 히드록시아파타이트, 양이온 교환, 및 크기 배제 크로마토그래피(Bio-Rad Laboratories, USA; GE Healthcare, Sweden)의 연속 실행에 의해 추가로 정제하였다. 마지막으로, 폴리믹신 B 컬럼(Pierce, USA)을 사용하여 단백질에서 지다당류 (LPS)를 감소시켰다. 리물러스(Limulus) 어세이(Associates of Cape Cod Inc., USA)를 사용하여, 잔류 LPS 농도를 ㎍ 재조합 플라겔린 당 30pg LPS 미만이 되게 측정하였다.

추가의 구현예에서, 본 발명에 따른 플라겔린 폴리펩티드는 면역친화성 크로마토그래피 기질 상의 분리에 의해 정제될 수 있다.

상기 면역친화성 크로마토그래피 기질은 그 위에 고정된 항-플라겔린 항체를 포함한다. 본원에서 "항-플라겔린" 항체라는 것은 본 발명에 의해 포함되는 것들을 비롯하여 고유의 플라겔린 또는 과가변 영역-결실 플라겔린에 결합하는 항체를 의도한다.

바람직하게는, 항-플라겔린 항체는 마우스 항-플라겔린 항체를 포함하는 단일클론 항체로 이루어진다.

특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 통상적인 화학적 펩티드 합성 기술을 통해 합성될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 플라겔린 폴리펩티드 서열은 고상(solid-phase) 기술을 사용하는 직접 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다.

시험관내 단백질 합성은 수동 기술을 사용하여 또는 자동화에 의해 수행될 수 있다. 자동화 합성은 예를 들어 제조자의 지침을 사용하는 [Applied Biosystems Peptide Synthesizer(Foster City, Calif.)]로 달성될 수 있다.

관심대상인 폴리펩티드의 다양한 부분은 관심대상인 전장 펩티드를 제조하기 위한 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 개별적으로 화학적으로 합성되고 조합될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 TLR5 아고니스트를 포함하는 기도 감염의 치료 방법에 사용하기 위한 약학 조성물에 관한 것이다.

통상적으로, 본 발명에 따른 TLR5 아고니스트는 약학적으로 허용가능한 부형제, 및 임의로 생분해성 중합체와 같은 서방성 매트리스와 조합되어, 치료 조성물을 형성할 수 있다. "약학적으로" 또는 "약학적으로 허용가능한"은 포유류, 특히 인간에 투여되는 경우 역반응, 알러지 또는 다른 원치않는 반응을 일으키지 않는 분자 실체 및 조성물을 말한다. 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제는 임의 유형의 무독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 제형 보조제를 말한다.

본 발명의 약학 조성물은 이의 의도된 투여 경로에 상용되도록 제형화된다. 투여 경로의 예에는 비경구, 예를 들어 정맥, 피내, 피하, 경구, 비강내(예를 들어, 흡입), 경피(예를 들어, 국소), 경점막, 및 직장 투여가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적인 구현예에서, 조성물은 인간에게 정맥, 피하, 근육내, 구강, 비강내, 또는 국소 투여를 위해 조정된 약학 조성물로서 정규 절차에 따라 제형화된다. 통상적으로, 정맥 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 가용화제 및 주사 부위에 통증을 경감시키는 국부 마취제를 포함할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 약학 조성물은 국소적으로(즉, 대상의 기도로) 투여된다. 그러므로, 조성물은 연고, 크림, 경피 패치, 로션, 젤, 스프레이, 에어로졸, 용액, 에멀젼의 형태, 또는 당업자에게 잘 알려진 다른 형태로 제형화될 수 있다. 비-스프레이형 국소 투여 형태의 경우, 국소 적용에 적합한 담체 또는 하나 이상의 부형제를 포함하고 바람직하게는 물보다 큰 동점성을 갖는 점성 내지 반-고체 또는 고체 형태가 통상적으로 사용된다. 적합한 제형에는 용액, 현탁액, 에멀젼, 크림, 연고, 분말, 도포제, 연고 등이 제한 없이 포함되고, 이것은 원하는 경우, 멸균되거나 예를 들어 삼투압과 같은 다양한 특성에 영향을 주기 위해 보조제(예를 들어, 보존제, 안정화제, 습윤제, 완충제 또는 염)와 혼합된다. 다른 적합한 국소 투여 형태에는 활성 성분이 바람직하게는 고체 또는 액체 비활성 담체와 조합으로, 가압 휘발물질(예를 들어, 기체 추진제, 예컨대 프레온)과의 혼합물로 또는 짜내는 용기에 패킹되는 스프레이형 에어로졸 제제가 포함된다. 습윤제 또는 휴멕턴트도 또한 원한다면 약학 조성물 및 투여 형태에 첨가될 수 있다. 이러한 부가적인 성분의 예는 당업계에 잘 알려져 있다.

본 발명의 방법이 조성물의 비강내 투여를 포함하는 경우, 조성물은 에어로졸 형태, 스프레이, 미스트 또는 액적 형태로 제형화될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 사용을 위한 예방 또는 치료제는 적합한 추진제(예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체)의 사용으로, 가압된 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이 제시 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투여량 단위는 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 측정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한 캡슐 및 카트리지(예를 들어, 젤라틴으로 구성됨)는 화합물의 분말 믹스 및 적합한 분말 기재, 예컨대 락토오스 또는 전분을 함유하여 제형화될 수 있다.

본 발명의 방법은 에어로졸화제로 제형화된 조성물의, 예를 들어, 흡입기 또는 분무기의 사용에 의한 폐 투여를 포함할 수 있다. 예컨대, 각각 그 전체가 참조로서 본원에 인용된 미국 특허 번호 6,019,968, 5,985,320, 5,985,309, 5,934,272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290,540, 및 4,880,078; 및 PCT 공개 번호 WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, 및 WO 99/66903을 참조한다. 구체적인 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물은 Alkermes AIR™ 폐 약물 전달 기술(Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.)을 사용하여 투여된다.

따라서, 본 발명은 치료학적 유효량의 TLR5 아고니스트를 기도 감염 또는 이의 하나 이상의 증상의 예방, 치료, 관리 또는 경감을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 기도 감염 또는 이의 하나 이상의 증상의 예방, 치료, 관리 또는 경감 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 치료되는 "대상" 또는 "개체"라는 용어는 암에 걸린 또는 암에 걸리기 쉬운 인간 또는 비-인간 포유류(예컨대 설치류(마우스, 래트), 고양이, 개 또는 영장류)를 의도한다. 바람직하게는, 대상은 인간이다.

용어 "치료적 유효량"은 임의의 의료적 치료에 적용하기 쉬운 타당한 이익/위험 비로, 암을 치료하기 위한 충분한 양의 폴리펩티드 또는 핵산을 의미한다. 그러나, 본 발명의 폴리펩티드 및 약학 조성물의 총 일일 사용량은 건전한 의료적 판단 범주 내에서 주치의에 의해 결정될 수 있다는 것으로 이해될 것이다. 임의의 특정 대상에 대한 구체적인 치료적 유효 투여량 수준은 치료되는 질환 및 질환의 경중도; 사용된 폴리펩티드의 활성; 사용된 특정 조성물, 대상의 연령, 체중, 일반적인 건강상태, 성별 및 식이상태; 투여 시간, 투여 경로, 치료 기간; 사용되는 특이적 폴리펩티드와 조합으로 또는 동시에 사용되는 약물; 및 의료계에 잘 알려진 비슷한 인자를 포함하는 다양한 인자들에 따라 다를 것이다.

본 발명은 하기 도면 및 실시예에 의해 추가로 예증될 것이다. 그러나, 하기 실시예 및 도면이 본 발명의 범주를 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

도 1: 플라겔린은 BALB /c 마우스를 S. 뉴모니 아에( S. pneumoniae )의 치사적 호흡기 유발접종(challenge)에 대해 보호한다: BALB/c 마우스(n=8)에 식염수 단독의(검은색 사각형), 또는 1㎍ 플라겔린(FliC, 검은색 원)이 보충된, 또는 1㎍ 트립신-소화된 플라겔린(FliC/T, 흰색 원)이 보충된, 4×10⁵CFU의 S. 뉴모니아에(S. pneumoniae) (Sp) 혈청형 1로 i.n. 감염시켰다. (A) 마우스 생존을 매일 모니터링하였다. FliC-처리군에 대한 생존은 식염수 군 또는 FliC/T-처리군과 비교하여 통계적으로 유의적이었다. 결과는 3개 실험 중 1개의 대표값이다. (B) 유발접종 24h 후 마우스를 희생시켜, 폐에서 콜로니 형성 단위(CFU)의 수를 측정하였다. 군들 간의 유의적인 차이는 별표로 표시한다; P<0.05(*). 결과는 3개 실험 중 1개의 대표값이다. 오차 막대는 평균의 평균 ± 표준 편차(SEM)를 나타낸다.
도 2: TLR5 신호는 S. 뉴모니 아에 ( S. pneumoniae ) 감염에 대항한 플라겔린 -매개 보호에 필요하다: BALB/c 마우스(n=8)에 식염수 단독의(검은색 사각형), 또는 1㎍ FliCΔ174-400(검은색 원) 또는 1㎍ TLR5-신호 모티프 결핍 FliC_{Δ174-400/89-96*}(흰색 원)이 보충된, 4×10⁵CFU의 S. 뉴모니아에(S. pneumoniae)(Sp) 혈청형 1로 i.n. 감염시켰다. 마우스 생존을 매일 기록하였다. FliCΔ174-400-처리군에 대한 생존은 미처리군 또는 FliC_{Δ174-400/89-96*}-처리군에 비해 통계적으로 유의적이었다(P<0.05). 결과는 2개 실험 중 1개의 대표값이다.

재료 및 방법

박테리아 제제: 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae) 혈청형 1(임상 단리물 E1586)을 우루과이 국립 표준 연구소-보건부(National Reference Laboratory - Ministry of Health, Uruguay)에서 입수하였다(39). 작업 저장액을 하기와 같이 제조하였다. Todd Hewitt Yeast Broth(THYB)(Sigma-Aldrich, St. Louis-MO, USA)를 혈액-아가 플레이트에서 성장하는 S. 뉴모니아에(S. pneumoniae)의 신선한 콜로니로 접종하고, 배양물이 0.7-0.9 단위의 OD_600nm에 도달할 때까지 37℃에서 인큐베이션하였다. 배양물을 3개월까지 THYB + 글리세롤 12%(v/v) 중의 -80℃에 저장하였다. 마우스 감염의 경우, 작업 저장액을 동결하고 멸균 생리학적 식염수 용액(식염수)로 세정하고, 적합한 농도로 희석하였다. 저장액 중의 박테리아의 수는 혈액 아가 플레이트 상에 연속 희석액을 플레이팅함으로써 확인하였다.

단백질: 살모넬라 엔테리카 세로바르 티피무리움(Salmonella enterica serovar Typhimurium) SIN22로부터의 고유의 플라겔린(FliC), 또는 재조합 플라겔린(FliC_Δ174-400 및 FliC_{Δ174-400/89-96*})을 이전에 기재된 바와 같이 제조하였다(27). FliC_{Δ174-400/89-96*}는 TLR5 신호를 방해하는 아미노산 치환(89-96)을 갖는다. 모든 단백질들은 적은 LPS 양(㎍ 당 30pg LPS 미만, Limulus 어세이로 측정됨)을 함유하였다. 일부 실험에서, 트립신-가수분해 FliC(FliC/T)를 대조군으로서 사용하였다. 고유의 FliC를, 단백질이 대부분 단량체라는 것을 확인하기 위해 사용 전에 65℃에서 5분 동안 가열하였다. 달리 특정되지 않는 경우, 1㎍ FliC, FliC/T, FliC_Δ174-400 또는 FliC_{Δ174-400/89-96*}를 S. 뉴모니아에(S. pneumoniae) 현탁액과 함께 i.n. 공동 투여하였다. 박테리아 생존력에 대한 플라겔린의 임의의 직접적인 효과를 배제하기 위해, 생체내 어세이에 사용된 동일한 농도의 플라겔린으로 S. 뉴모니아에(S. pneumoniae)의 인큐베이션 전 후에 생존 계수를 측정하였다. 대조군 조건과 비교하여 플라겔린으로 인큐베이션한 후 회수된 박테리아의 수에 유의적인 차이가 없었다.

동물 감염: 암컷 BALB/c, C57BL/6J 및 이계교배 NMRI 균주(6-8주령)를 National Division of Veterinary Laboratories(Uruguay) 또는 Janvier laboratories(France)로부터 입수하였다. 암컷 SCID 마우스(C.B-17 SCID)는 Institut Pasteur de Lille 사육 설비로부터 입수하였다. 상기 마우스는 B 및 T 림프구의 결핍 및 무감마글로불린혈증을 특징으로 한다. 동물을 개별적으로 환기되는 우리에 유지하고, 감염을 위해 수직판 흐름 캐비넷(클래스 II A2, ESCO, Pensylvania-USA)에서 취급하였다. 모든 실험들은 현행 국가 및 기관 규제 및 윤리 지침(CHEA-Universidad de la Republica, Uruguay and #A59107-Institut Pasteur de Lille)을 준수하였다. 마우스를 총 부피 200㎕ 중에 2.2mg 케타민(Richmond-Vet Pharma, Bs. As.-Argentina)과 0.11mg 자일라진(Portinco, Montevideo-Uruguay)의 복강내(i.p.) 주사에 의해 또는 마취 비-재호흡 시스템(DRE-Compact 150, DRE Veterinary, Louisville-US)을 사용하여 이소플루란(Belamont, SAS, France)의 흡입에 의해 마취하였다. 박테리아 및 플라겔린을 20 내지 50㎕의 식염수 중에 마우스의 콧구멍으로 투여하였다. 마우스 생존을 매일 기록하였다.

과립구의 감손을 위해, 100㎍의 항-Gr-1(RB6-8C5) 또는 이소형 대조군(HB152)을 S. 뉴모니아에(S. pneumoniae)의 i.n. 유발접종 24h 전에 i.p. 투여하였다(24). 항-Gr1 주사는 플라겔린 비강내 처리 후 기관지폐포 세척(BAL)에서 96.8±1.2% PMN이 감손되는 것으로 밝혀졌다.

폐 및 비장 내의 박테리아 적재량의 측정: 비강내 유발접종 후 선택된 시점에서 폐 및 비장을 수집하고 UltraTurrax 호모게나이저(IKA-Werke, Staufen-Germany)로 균질화시켰다. 생존 계수를 혈액 아가 플레이트 상에 연속 희석액을 플레이팅함으로써 측정하였다.

정량 RT - PCR ( qRT - PCR ): 폐를 UltraTurrax 호모게나이저로 Trizol 시약(Invitrogen, California-USA)으로 균질화하고, -80℃에서 저장하였다. RNA 추출을 제조자의 지침에 따라 수행하였다. cDNA 합성 전에, 1㎍ 총 RNA를 DNAse-I(Invitrogen)로 처리하고, 첫번째 가닥 상보적 DNA(cDNA) 합성을 랜덤 프라이머(Invitrogen) 및 M-MLV 역전사효소(Invitrogen)를 사용하여 실시하였다. 실시간 PCR을 하기 프로토콜에 따라 Rotor-Gene 6000(Corbett, Sydney-Australia)에서 QuantiTect® SYBR® Green PCR 키트(Qiagen, Hilden-Germany)를 사용하여 수행하였다: 95℃에서 15분 후 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분 동안의 40회 사이클. 프라이머를 0.9μM의 최종 농도로 사용하였다. 관심대상인 유전자의 발현은 하우스키핑 유전자로서 β-액틴을 사용하여 표준화하였다. 결과는 식염수-처리군에 비해 mRNA 수준의 배 증가로서 제시된다.

기도 및 폐 내로의 PMN 침윤의 측정: 기관지폐포 세척(BAL) 샘플링을 위해, 기관에 캐뉼라를 삽입하고, 1ml의 PBS + 1mM EDTA를 6회 점적하고, 부드러운 흡인에 의해 회수하였다; 상기 과정을 2회 반복하였다. 세포를 FACS-EDTA 완충액(PBS, 0.1% 아지드, 1% 소 혈청 알부민(Sigma-Aldrich)과 5mM EDTA)에 현탁하였다. 폐 세포를 이전에 기재된 바와 같이(34) 콜라게나아제/DNAse 처리 후 단리하고, 40μm 세포 거름망을 통해 여과하였다. 면역 세포를 2층 Percoll(Sigma-Aldrich) 구배에서 분리하였다. 요약하면, 세포를 35% 등장성 Percoll 용액에 현탁하고, 조심스럽게 70% 등장성 Percoll 용액의 상부에 두고, 30분 2600g 및 RT에서 중단 없이 원심분리하였다. 대부분 상피 세포에 상응하는 세포의 상부 고리를 폐기하고, 면역 세포는 70% Percoll 층에 가장 가까운 세포의 고리로부터 회수하였다. 세포를 100μm 세포 거름망을 사용하여 여과하고, 세정하고, FACS 분석을 위해 염색하였다. 호중구를 PE- 또는 Alexa Fluor 647-공액 항-Ly-6G(클론 1A8), PerCP-Cy5.5-공액 항-Ly-6C(클론 HK1.4) 또는 PE-공액 항-CD11b(클론 M1/70)(BD Biosciences 또는 BioLegend, California-USA 사제)에 대한 FSC-SSC 및 양성 염색에 의해 확인하였다. PFA 4%로 고정시킨 후, 유세포측정 데이터 습득을 CellQuest 3.3 소프트웨어(BD Biosciences)에 의해 FACS Calibur Cytometer 상에서 수행하였다.

조직학적 분석: 폐를 24h 동안 4% 포르말린(Sigma-Aldrich)에 고정한 다음, 파라핀 내에 포매하였다. 폐 블록을 Leica 마이크로톰(Leica Microsystems, Wetzlar-Germany)을 사용하여 5μm으로 섹션하였고, 실란화된 슬라이드에 부착시켰다. 헤마톡실린/에오신 염색된 섹션을 Nikon Eclipse 80i 현미경 및 Nikon DS-Ri1 디지털 카메라를 사용하여 분석하고, Laboratory Imaging에 의해 NIS-Elements BR 3.0 소프트웨어를 사용하여 처리하였다.

통계적 분석: Log-rank(Mantel-Cox) 시험을 생존 곡선 분석을 위해 수행하였다. 2개 군 사이의 비교를 위해, Mann-Whitney 검정을 수행하였다. 모든 경우에서 P값<0.05를 유의적인 것으로 고려하였다. GraphPad Prism 프로그램(GraphPad Software, San Diego California USA)을 사용하여 통계 분석을 실시하였다.

결과

플라겔린의 비강내 전달은 마우스를 S. 뉴모니 아에( S. pneumoniae )의 치사적인 유발접종에 대항하여 보호한다: 먼저 비강내(i.n.) 투여시 BALB/c 마우스에서 100% 치사율을 야기하는 S. 뉴모니아에(S. pneumoniae)의 최소 투여량을 결정하였다. S. 뉴모니아에(S. pneumoniae) 혈청형 1의 임상적 단리물의 용량을 증가시키면서 동물을 감염시키고, 생존을 매일 평가하였다. 4×10⁵CFU를 72 내지 120h 내에 모든 동물들을 치사시키는 최소 치사적 투여량(MLD)으로서 정의하였다.

이후 폐렴연쇄구균 폐렴을 통제하기 위한 플라겔린의 수용력을 S. 뉴모니아에(S. pneumoniae)로 비강내 유발접종한 마우스의 생존을 플라겔린(FliC) 및 S. 뉴모니아에(S. pneumoniae)로 점적된 마우스와 비교함으로써 평가하였다. 대조군으로서, 마우스를 또한 S. 뉴모니아에(S. pneumoniae) 및 트립신으로 미리 가수분해된 플라겔린(FliC/T)으로 유발접종하였다. 도 1A에 제시되는 바와 같이, FliC-처리된 마우스는 75%의 생존률을 갖는 반면, 미처리된 동물 또는 FliC/T-처리된 동물은 유발접종 후 3 내지 4일 내에 죽었다. 플라겔린에 의해 유도된 보호는 다른 독립적 실험들 사이에서 75 내지 100%의 범위였다. 플라겔린과 S. 뉴모니아에(S. pneumoniae)의 공동-투여는 24h 내에 S. 뉴모니아에(S. pneumoniae) 단독을 받은 동물과 비교하여 폐에서 박테리아 계수의 80배 감소를 야기하였다(도 1B). 또한, 본 출원인은 플라겔린이 감염 전 후에 투여되는 경우 폐렴연쇄구균 감염에 대항하는 보호 반응을 발휘할 수 있을지를 평가하였다. 폐렴연쇄구균 유발접종 12 내지 24h 전에 비강으로 플라겔린을 수용한 모든 동물들은 생존한 반면, 모든 대조군 마우스들은 4일 내에 죽었다. 게다가, 플라겔린이 유발접종 24h 후에 투여된 경우 100% 보호가 달성되었다. 따라서, 플라겔린은 폐렴연쇄구균 폐렴에 예방 및 치료 효과를 보였다.

또한, 보호를 유도하는 플라겔린의 수용력을 C57BL/6 및 이계교배 균주 NMRI에서 평가하였다. S. 뉴모니아에(S. pneumoniae) 혈청형 1의 MLD는 두 균주에 대해 2×10⁶CFU인 것으로 밝혀졌고, 플라겔린-매개 보호를 5xMLD로 평가하였다. 박테리아 유발접종 12h 전 플라겔린의 투여는 C57BL/6 마우스에서 80% 보호를 유도하였다; 유사하게는, NMRI 동물에서 플라겔린이 유발접종 32h 내지 6h 전에 투여된 경우 100% 보호가 달성되었다. 플라겔린은 또한 C57BL/6 및 NMRI 균주에서 S. 뉴모니아에(S. pneumoniae)와 함께 공동-투여하는 경우, 비록 적은 범위지만(40%) 또한 보호적이었다. 모두 함께, 상기 결과들은 상이한 마우스 균주들에서 플라겔린 처리가 보호적이라는 것을 보여준다.

다음으로, 본 출원인은 TLR5 신호가 플라겔린 처리에 의해 도출되는 보호에 필수적인지를 살펴보았다. 이를 위해, 재조합 플라겔린 FliC_Δ174-400 및 FliC_{Δ174-400/89-96*}를 사용하였다(27). FliC_Δ174-400은 고유의 플라겔린과 점막 TLR5 신호를 촉진하는 동일한 수용력을 갖는 반면, FliC_{Δ174-400/89-96*}은 TLR5 신호를 방해하는 돌연변이를 갖는다. FliC_Δ174-400 및 S. 뉴모니아에(S. pneumoniae)를 수용한 모든 마우스들이 유발접종에서 생존한 반면, 돌연변이 FliC_{Δ174-400/89-96*}를 수용한 마우스들은 어느 것도 생존하지 못 하였다(도 2). 상기 결과들은 TLR5 신호가 보호에 필요하다는 것을 강하게 나타내는 것이다.

플라겔린 처리는 전-염증성 유전자 발현을 촉진하고, 폐렴연쇄구균 폐렴 동안 폐 내 일시적인 세포 침윤을 악화시킨다: 이후, 본 출원인은 플라겔린 처리가 폐렴연쇄구균 감염에 대한 폐 전사 반응을 변형시키는지를 분석하였다. 마우스에 이전과 같이 S. 뉴모니아에(S. pneumoniae) 또는 S. 뉴모니아에(S. pneumoniae)와 플라겔린으로 유발접종하였다. 대조군으로서, 또다른 군에는 플라겔린 단독을 주었다. 처리 및 감염 24시간 후, qRT-PCR에 의해 선택된 유전자의 발현을 분석하기 위해 폐를 수확하였다. 플라겔린 단독 또는 S. 뉴모니아에(S. pneumoniae)와의 조합에 의한 투여는 폐렴연쇄구균 유발접종에 비해 Cxcl1, Cxcl2 및 Ccl20 mRNA 수준의 현저한 증가를 유발하였다. 플라겔린 처리는 또한 Tnf의 발현을 증가시켰다; 비록 차이는 일관되었지만, 통계적으로 유의적이지는 않았다. Il6의 발현은 유발접종되고 플라겔린으로 처리된 동물에서 증가되었으나, 플라겔린 또는 S. 뉴모니아에(S. pneumoniae) 단독을 수용한 동물에서는 그렇지 않았으며, 이는 Il6 발현에 대한 플라겔린과 폐렴연쇄구균 감염 사이에 시너지 효과를 암시한다. Tgfb1 , Il17a , Il17f , Il23 및 Il4 유전자의 mRNA 수준은 위형(mock) 동물과 비교하여 모든 군 중에서 변치 않고 남아있었다.

전염증성 유전자의 발현이 염증 및 기도 내로의 세포 침윤과 연관이 있는지를 평가하기 위해, 플라겔린-처리 및 감염 24h 후 수득된 폐 조직의 조직학적 분석을 수행하였다. S. 뉴모니아에(S. pneumoniae)는 특정 세기관지 및 상기 세기관지에 가까운 일부 혈관주위 영역에 제한된 중간의 세포 침윤을 유도하였다. 반대로 플라겔린 처리는(단독 또는 폐렴연쇄구균과 함께) 부종, 및 혈관주위 및 기관지주위 영역 뿐만 아니라 주변 폐 실질의 일부 영역에 영향을 주는 거대한 침윤을 유도하였다. 현저하게, 제7일에, 플라겔린 및 폐렴연쇄구균을 수용한 마우스로부터 유래된 폐는 명백한 세포 침윤 또는 부종이 없는 염증의 완전한 해소를 보였다. 상기 결과는 플라겔린이 폐 형태학 또는 기능의 영구적인 변화를 야기하지 않으면서, 박테리아의 소거를 촉진하는, 강하지만 일시적인 염증 반응을 유도한다는 것을 나타낸다.

플라겔린 -유도 보호는 Gr -1 발현 세포를 필요로 하지만, B 및 T 림프구에 독립적이다: 기도 내로의 호중구 모집은 폐렴연쇄구균 감염 및 비강 플라겔린 처리 모두의 표식이고, 여기서 본 출원인은 유전자의 플라겔린 처리 및 감염 활성화 발현이 호중구 모집에 연관되어 있다는 것을 보여주었다. 따라서, 본 출원인은 S. 뉴모니아에(S. pneumoniae)로 유발접종되고, 플라겔린으로 처리되거나 처리되지 않은 동물 내의 호중구 침윤의 키네틱을 비교하는 것을 목표로 하였다. BAL 및 폐를 유발접종 후 상이한 시점에 수집하고, 항-Ly6G 항체로 염색하였다. 폐렴연쇄구균 유발접종은 모든 동물에서 PMN의 모집을 유도하였다. 그러나, 유발접종 시기에 플라겔린으로 처리된 마우스는 S. 뉴모니아에(S. pneumoniae) 단독으로 유발접종된 마우스와 비교하여 기도 내로의 PMN의 더욱 빠르고 두드러진 침윤을 보여주었다. 24h에, PMN 침윤은 어느 군에서든 피크를 나타냈고, 군 사이의 차이는 최대였다. 그러나, 48시간까지 PMN의 수는 군 사이에서 더이상 유의적으로 다르지 않았다. 따라서, 폐렴연쇄구균과 플라겔린의 공동-투여는 기도 내로의 다수의 호중구들의 빠르고 일시적인 모집을 촉진하였다.

이어서, 본 출원인은 호중구가 플라겔린-매개 생성에 중요한지를 측정하였다. 상기 목적을 위해, 동물에게 유발접종 24h 전에 과립구 수용체-1(Gr-1 또는 Ly6G/Ly6C)에 특이적인 단일클론 항체 또는 이소형 대조군 항체를 i.p. 주사하였다. 이소형 대조군을 받고 FliC로 처리된 동물은 유발접종에 대해 생존하였다. 반대로, 항-Gr-1 처리는 기도로부터 >95% 호중구를 감손시키고, S. 뉴모니아에(S. pneumoniae)에 대항하는 플라겔린-매개 보호를 제거하였다. 상기 결과들은 PMN과 같은 Gr-1 발현 세포가 폐렴연쇄구균 감염에서 플라겔린-유도 보호의 중요한 효과기(effector)라는 것을 보여주었다.

B 및 T 림프구가 폐렴연쇄구균 감염의 초기 상(phase)에 관여되어 있으므로, 플라겔린-유도 보호에서의 이들의 역할을 평가하였다. SCID 마우스(항체, B 및 T 세포에 대해 결핍된 것) 뿐만 아니라 면역적격 BALB/c 마우스를 2×10⁷CFU의 S. 뉴모니아에(S. pneumoniae) 또는 S. 뉴모니아에(S. pneumoniae)와 플라겔린으로 유발접종하였다. 폐 및 비장을 감염 36h 후에 수집하여 박테리아 계수를 측정하였다. 플라겔린 동시-투여는 BALB/c 마우스에서와 유사한 범위로 SCID 마우스의 폐 내 박테리아의 소거를 촉진하였다. 또한, SCID 및 BALB/c 마우스 모두는 플라겔린 처리시 비장내에서 더 적은 박테리아 계수는 국부 감염 뿐만 아니라 전신 감염도 통제할 수 있다는 의미를 보여주었다. SCID 마우스는 BALB/c 마우스와 비교할 때 플라겔린의 적하시 16h에 폐 및 폐포강 내로 유사한 수의 PMN을 모집하였다. 요약하면, 상기 결과는 Gr-1-발현 세포가 플라겔린-유도 보호를 유발하기 위해 B 세포나 T 림프구를 필요로 하지 않는다는 것을 보여준다.

논의:

선천적 면역력은 S. 뉴모니아에(S. pneumoniae)에 의한 기도의 초기 콜로니화를 방지하기 위해 TLR 뿐만 아니라 MyD88 필요성에 의해 제시되는 바와 같이 폐렴연쇄구균 감염을 조절하기 위해 필수적이다(Albiger, B., Sandgren A., Katsuragi H., Meyer-Hoffert U., Beiter K., Wartha F., Hornef M., Normark S. and Normark B. H. 2005. Myeloid differentiation factor 88-dependent signalling controls bacterial growth during colonization and systemic pneumococcal disease in mice. Cell Microbiol 7:1603-1615.; Khan, A. Q., Q. Chen, Z.-Q. Wu, J. C. Paton, and C. M. Snapper. 2005. Both innate immunity and type 1 humoral immunity to Streptococcus pneumoniae are mediated by MyD88 but differ in their relative levels of dependence on Toll-Like Receptor 2. Infect. Immun. 73:298-307). 기도 폐렴연쇄구균 감염에 대한 면역 반응은 폐 내로의 호중구의 크고 활발한 모집을 특징으로 하고, PMN에 의한 폐렴연쇄구균의 식균작용 살해가 주요 방어 메커니즘으로 고려된다. 그럼에도 불구하고, S. 뉴모니아에(S. pneumoniae)는 식세포의 보체 침전 및 호흡 폭발을 억제하거나 지연시킴으로써 숙주의 선천적 방어를 회피할 수 있다. 따라서, 혈청형-특이적 항체가 생성되고 보체 침전 억제 향상 옵소닌-식균작용을 우회할 때까지, 호중구 유입은 감염을 소거하는데 종종 효과가 없다. 본 연구에서, 본 출원인은 S. 뉴모니아에(S. pneumoniae)에 의해 자연적으로 관여되지 않은 TLR의 아고니스트의 외생 투여(즉, TLR5 아고니스트 플라겔린)가 급성 호흡기 폐렴연쇄구균 감염을 조절하기 위해 선천적 면역력을 강화시킬 수 있는지를 평가하였다. 플라겔린의 국부 투여가 국부적 및 전신적 박테리아 소거를 향상시킴으로써 치사적 투여량의 S. 뉴모니아에(S. pneumoniae) 혈청형 1로 유발접종된 마우스의 생존을 촉진하였다는 것을 발견하였다. 플라겔린 처리는, BALB/c, C57BL/6 및 NMRI 마우스 내의 감염 성립 전, 동안 및 후에 수행되는 경우 효과적이었다.

플라겔린의 생체 내 투여가 전염증성 사이토카인의 발현을 상향조절한다는 것이 입증되었다. 여기서, S. 뉴모니아에(S. pneumoniae) 유발접종시에 플라겔린의 동시-투여가 또한 폐에서의 PMN-특이적 케모카인/활성제 유전자 Cxcl1 및 Cxcl2 및 또한 Tnf 및 Ccl20의 발현을 상향조절하는 반면, S. 뉴모니아에(S. pneumoniae) 단독은 상기 유전자를 열악하게 유도하였다는 것을 보여준다. 케모카인 및 사이토카인 발현 프로파일과 일치하게, 폐 조직 섹션의 분석은 감염된 비-처리된 동물에서보다 플라겔린-처리된 동물의 폐에서 더욱 두드러진 기관지주위 및 혈관주위 영역 내의 세포의 방대한 침윤을 보여주었다. 현저하게는, 두드러진 염증 반응이 플라겔린에 의해 유도되었음에도 불구하고, 폐 조직은 제7일에 완전히 회복되었던 반면, 미처리된 동물은 감염으로 죽었다. BAL 샘플의 분석은 폐렴연쇄구균 유발접종시 TLR5 아고니스트의 투여가 가속화되고 더욱 두드러진 PMN 모집을 유도하였다는 것을 암시하였다. PMN 침윤은 일시적이었고, 24h에 피크를 나타냈고, 40h에 정상 상태 수준으로 회귀하였다. Gr-1-발현 세포(아마도 PMN)의 감손은 보호를 없애, 상기 세포가 폐렴연쇄구균 폐 감염의 조절에 필요하다는 것을 입증한다. 플라겔린-매개 염증 반응의 자가-제한 특성은, 악화된 염증이 폐 장벽 및 기능의 실패에 연관될 수 있으므로 매우 적절한 발견이다. TLR5 반응을 조절하는 분자 메커니즘은 전-염증 유전자를 상향조절할 뿐만 아니라 반응 종결을 유발한다. 따라서, 플라겔린 점막 처리는 임상 시험에서 추가 평가할 가치가 있는 폐렴연쇄구균 폐렴 향상 호중구 침윤에 대항한 요법 및 염증의 동시 제한으로서 간주될 수 있다.

PMN 외에도, 여러 연구들이 또한 T 및 B 림프구 뿐만 아니라 자연적 항체가 폐렴연쇄구균 폐렴의 초기 조절에 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 보고하였다. T 림프구가 면역 반응의 초기 단계에 기관지주위 염증 구역에 축적되고 CD4⁺ T 세포가 결핍된 MHC 계열 II-결핍 마우스가 이들의 야생형 대응부에 비해 감염에 더욱 취약하므로 폐렴연쇄구균에 대한 방어에 관여한다는 것이 제시되었다. B1a 세포 및 천연 항체 생성의 손상된 발달을 갖는 CD19-결핍 마우스가 폐렴연쇄구균 감염에 대한 민감성이 증가하였다는 것이 제시되었다. 그러나, 본원에 제시된 결과는 T 또는 B 세포 중 어느 것도 박테리아의 플라겔린-유도 국부 및 전신 소거에 필요하지 않다는 것을 보여준다. 함께 취합하면, 본 결과는 PMN 동역학의 변화가 심지어 B 및 T 림프구의 부재 하에서도, 폐렴연쇄구균의 효과적인 치사를 야기한다는 것을 강하게 나타낸다.

본 결과는 또한 TLR5 신호가 플라겔린에 의해 유도되는 보호에 필요하다는 것을 제시한다. 기도에서, TLR5는 폐포 대식세포 및 상피 세포에 의해 발현되어, 상기 상주 세포가 플라겔린 처리시 S. 뉴모니아에(S. pneumoniae)에 대항하여 보호적 선천 방어의 유도에 핵심적인 참가자일 수 있다는 것을 암시한다. 이와 함께, 최근의 연구는 기도 상피가 편모 박테리아에 반응하여 케모카인 생성 및 PMN 모집에 관여하는 TLR5-활성화 조직이라는 것을 암시한다. 한편 쥣과 호중구는 TLR5를 발현하고, 이에 따라 TLR5 신호는 또한 PMN을 직접 활성화시키고 이들의 S. 뉴모니아에(S. pneumoniae) 치사 능력을 향상시킬 수 있다. 유사한 방식으로, 가열 치사된 하에모필러스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae)가 Nod1-의존성 방식으로 폐렴연쇄구균을 치사시키는 PMN 수용력을 특이적으로 증가시킬 수 있다는 것이 이미 성립되었다.

S. 뉴모니아에(S. pneumoniae) 감염의 예방 및 치료를 위한 현행 요법은 폐렴연쇄구균 질환의 예방 또는 치유에 제한을 가지므로, 면역-개입의 신규한 전략이 여전히 필요하다. 여러 보고에서 박테리아 용해물 및 전체 가열 치사된 박테리아의 투여가 감염에 대항하는 보호 반응을 자극한다는 것이 제시되었다. 그러나, 상기 제제의 확실하지 않은 특성은 주로 인간 용도를 위한 약물을 디자인할 때 문제가 된다. 본 결과는 단일한, 잘 특징화된 분자, 구체적으로 플라겔린으로의 국부 자극은, 폐 선천적 면역 방어 증대 및 폐렴연쇄구균 폐렴 통제에 충분하다는 것을 보여주어, 항균제 요법 개발을 위한 근거로서 Microbe-Associated Molecular Patterns을 사용하는 장점을 강조하였다.

참조문헌:

본 출원을 통틀어, 다양한 참조문헌들이 본 발명이 속하는 최신 기술을 기술하고 있다. 상기 참조문헌들의 기재는 본 명세서 내에 참조로서 인용된다.

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Thr Glu Tyr Thr Ile Ala Lys Ala Thr Pro Ala Thr Thr Thr Pro 355 360 365 Val Ala Pro Leu Ile Pro Gly Gly Ile Thr Tyr Gln Ala Thr Val Ser 370 375 380 Lys Asp Val Val Leu Ser Glu Thr Lys Ala Ala Ala Ala Thr Ser Ser 385 390 395 400 Ile Thr Phe Asn Ser Gly Val Leu Ser Lys Thr Ile Gly Phe Thr Ala 405 410 415 Gly Glu Ser Ser Asp Ala Ala Lys Ser Tyr Val Asp Asp Lys Gly Gly 420 425 430 Ile Thr Asn Val Ala Asp Tyr Thr Val Ser Tyr Ser Val Asn Lys Asp 435 440 445 Asn Gly Ser Val Thr Val Ala Gly Tyr Ala Ser Ala Thr Asp Thr Asn 450 455 460 Lys Asp Tyr Ala Pro Ala Ile Gly Thr Ala Val Asn Val Asn Ser Ala 465 470 475 480 Gly Lys Ile Thr Thr Glu Thr Thr Ser Ala Gly Ser Ala Thr Thr Asn 485 490 495 Pro Leu Ala Ala Leu Asp Asp Ala Ile Ser Ser Ile Asp Lys Phe Arg 500 505 510 Ser Ser Leu Gly Ala Ile Gln Asn Arg Leu Asp Ser Ala Val Thr Asn 515 520 525 Leu Asn Asn Thr Thr Thr Asn Leu Ser Glu Ala Gln Ser Arg Ile Gln 530 535 540 Asp Ala Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser Asn Met Ser Lys Ala Gln Ile 545 550 555 560 Ile Gln Gln Ala Gly Asn Ser Val Leu Ala Lys Ala Asn Gln Val Pro 565 570 575 Gln Gln Val Leu Ser Leu Leu Gln Gly 580 585 <210> 2 <211> 495 <212> PRT <213> Salmonella typhimurium <400> 2 Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn 1 5 10 15 Asn Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ala Leu Gly Thr Ala Ile Glu Arg Leu 20 25 30 Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln 35 40 45 Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ala Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala 50 55 60 Ser Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly 65 70 75 80 Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala 85 90 95 Val Gln Ser Ala Asn Ser Thr Asn Ser Gln Ser Asp Leu Asp Ser Ile 100 105 110 Gln Ala Glu Ile Thr Gln Arg Leu Asn Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly 115 120 125 Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Lys Val Leu Ala Gln Asp Asn Thr Leu 130 135 140 Thr Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly Glu Thr Ile Asp Ile Asp Leu 145 150 155 160 Lys Gln Ile Asn Ser Gln Thr Leu Gly Leu Asp Thr Leu Asn Val Gln 165 170 175 Gln Lys Tyr Lys Val Ser Asp Thr Ala Ala Thr Val Thr Gly Tyr Ala 180 185 190 Asp Thr Thr Ile Ala Leu Asp Asn Ser Thr Phe Lys Ala Ser Ala Thr 195 200 205 Gly Leu Gly Gly Thr Asp Gln Lys Ile Asp Gly Asp Leu Lys Phe Asp 210 215 220 Asp Thr Thr Gly Lys Tyr Tyr Ala Lys Val Thr Val Thr Gly Gly Thr 225 230 235 240 Gly Lys Asp Gly Tyr Tyr Glu Val Ser Val Asp Lys Thr Asn Gly Glu 245 250 255 Val Thr Leu Ala Gly Gly Ala Thr Ser Pro Leu Thr Gly Gly Leu Pro 260 265 270 Ala Thr Ala Thr Glu Asp Val Lys Asn Val Gln Val Ala Asn Ala Asp 275 280 285 Leu Thr Glu Ala Lys Ala Ala Leu Thr Ala Ala Gly Val Thr Gly Thr 290 295 300 Ala Ser Val Val Lys Met Ser Tyr Thr Asp Asn Asn Gly Lys Thr Ile 305 310 315 320 Asp Gly Gly Leu Ala Val Lys Val Gly Asp Asp Tyr Tyr Ser Ala Thr 325 330 335 Gln Asn Lys Asp Gly Ser Ile Ser Ile Asn Thr Thr Lys Tyr Thr Ala 340 345 350 Asp Asp Gly Thr Ser Lys Thr Ala Leu Asn Lys Leu Gly Gly Ala Asp 355 360 365 Gly Lys Thr Glu Val Val Ser Ile Gly Gly Lys Thr Tyr Ala Ala Ser 370 375 380 Lys Ala Glu Gly His Asn Phe Lys Ala Gln Pro Asp Leu Ala Glu Ala 385 390 395 400 Ala Ala Thr Thr Thr Glu Asn Pro Leu Gln Lys Ile Asp Ala Ala Leu 405 410 415 Ala Gln Val Asp Thr Leu Arg Ser Asp Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg 420 425 430 Phe Asn Ser Ala Ile Thr Asn Leu Gly Asn Thr Val Asn Asn Leu Thr 435 440 445 Ser Ala Arg Ser Arg Ile Glu Asp Ser Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser 450 455 460 Asn Met Ser Arg Ala Gln Ile Leu Gln Gln Ala Gly Thr Ser Val Leu 465 470 475 480 Ala Gln Ala Asn Gln Val Pro Gln Asn Val Leu Ser Leu Leu Arg 485 490 495 <210> 3 <211> 494 <212> PRT <213> Salmonella typhimurium <400> 3 Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn Asn 1 5 10 15 Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ala Leu Gly Thr Ala Ile Glu Arg Leu Ser 20 25 30 Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln Ala 35 40 45 Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ala Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala Ser 50 55 60 Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ala 65 70 75 80 Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala Val 85 90 95 Gln Ser Ala Asn Ser Thr Asn Ser Gln Ser Asp Leu Asp Ser Ile Gln 100 105 110 Ala Glu Ile Thr Gln Arg Leu Asn Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly Gln 115 120 125 Thr Gln Phe Asn Gly Val Lys Val Leu Ala Gln Asp Asn Thr Leu Thr 130 135 140 Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly Glu Thr Ile Asp Ile Asp Leu Lys 145 150 155 160 Gln Ile Asn Ser Gln Thr Leu Gly Leu Asp Thr Leu Asn Val Gln Gln 165 170 175 Lys Tyr Lys Val Ser Asp Thr Ala Ala Thr Val Thr Gly Tyr Ala Asp 180 185 190 Thr Thr Ile Ala Leu Asp Asn Ser Thr Phe Lys Ala Ser Ala Thr Gly 195 200 205 Leu Gly Gly Thr Asp Gln Lys Ile Asp Gly Asp Leu Lys Phe Asp Asp 210 215 220 Thr Thr Gly Lys Tyr Tyr Ala Lys Val Thr Val Thr Gly Gly Thr Gly 225 230 235 240 Lys Asp Gly Tyr Tyr Glu Val Ser Val Asp Lys Thr Asn Gly Glu Val 245 250 255 Thr Leu Ala Gly Gly Ala Thr Ser Pro Leu Thr Gly Gly Leu Pro Ala 260 265 270 Thr Ala Thr Glu Asp Val Lys Asn Val Gln Val Ala Asn Ala Asp Leu 275 280 285 Thr Glu Ala Lys Ala Ala Leu Thr Ala Ala Gly Val Thr Gly Thr Ala 290 295 300 Ser Val Val Lys Met Ser Tyr Thr Asp Asn Asn Gly Lys Thr Ile Asp 305 310 315 320 Gly Gly Leu Ala Val Lys Val Gly Asp Asp Tyr Tyr Ser Ala Thr Gln 325 330 335 Asn Lys Asp Gly Ser Ile Ser Ile Asn Thr Thr Lys Tyr Thr Ala Asp 340 345 350 Asp Gly Thr Ser Lys Thr Ala Leu Asn Lys Leu Gly Gly Ala Asp Gly 355 360 365 Lys Thr Glu Val Val Ser Ile Gly Gly Lys Thr Tyr Ala Ala Ser Lys 370 375 380 Ala Glu Gly His Asn Phe Lys Ala Gln Pro Asp Leu Ala Glu Ala Ala 385 390 395 400 Ala Thr Thr Thr Glu Asn Pro Leu Gln Lys Ile Asp Ala Ala Leu Ala 405 410 415 Gln Val Asp Thr Leu Arg Ser Asp Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg Phe 420 425 430 Asn Ser Ala Ile Thr Asn Leu Gly Asn Thr Val Asn Asn Leu Thr Ser 435 440 445 Ala Arg Ser Arg Ile Glu Asp Ser Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser Asn 450 455 460 Met Ser Arg Ala Gln Ile Leu Gln Gln Ala Gly Thr Ser Val Leu Ala 465 470 475 480 Gln Ala Asn Gln Val Pro Gln Asn Val Leu Ser Leu Leu Arg 485 490 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> linker <400> 4 Gly Ala Ala Gly 1

Claims

기도 감염의 치료 방법에 사용하기 위한 TLR5 아고니스트.
제1항에 있어서,
소형 유기 분자; 항체, 앱타머 또는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 TLR5 아고니스트.
제1항 또는 제2항에 있어서,
플라겔린 폴리펩티드인 TLR5 아고니스트.
제3항에 있어서,
상기 플라겔린 폴리펩티드는 E. 콜라이(E. coli)와 같은 에스케리챠(Escherichia), 엔테로박테르(Enterobacter), 에르비니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라 엔테리카 세로바르 티피무리움(Salmonella enterica serovar Typhimurium)과 같은 살모넬라(Salmonella), 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans)와 같은 세라티아(Serratia), 쉬겔라(Shigella), B. 서브틸리스(B. subtilis) 및 B. 리케니포르미스(B. licheniformis)와 같은 바실리(Bacilli), P. 아에루기노사(P. aeruginosa)와 같은 슈도모나스(Pseudomonas), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아로부터 단리된 것을 특징으로 하는 TLR5 아고니스트.
제3항 또는 제4항에 있어서,
상기 플라겔린 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, 및 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3과 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상 일치하는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 TLR5 아고니스트.
제3항에 있어서,
상기 플라겔린 폴리펩티드는 a) SEQ ID NO:3의 위치 1에 위치한 아미노산 잔기에서 시작되고 SEQ ID NO:3의 위치 99 내지 173에 위치한 아미노산 잔기들 중 임의의 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에서 종결되는 아미노산 서열과 90% 이상의 아미노산 일치성을 갖는 N-말단 펩티드; 및 b) SEQ ID NO:3의 위치 401 내지 406에 위치한 아미노산 잔기들 중 임의의 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에서 시작되고 SEQ ID NO:3의 위치 494에 위치한 아미노산 잔기에서 종결되는 아미노산 서열과 90% 이상의 아미노산 일치성을 갖는 C-말단 펩티드를 포함하고,
상기 N-말단 펩티드는 상기 C-말단 펩티드에 직접 연결되거나, 또는 상기 N-말단 펩티드와 상기 C-말단 펩티드는 스페이서 사슬을 통해 서로 간접 연결되는 것을 특징으로 하는 TLR5 아고니스트.
제6항에 있어서,
상기 N-말단 펩티드는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열 1-99, 1-137, 1-160 및 1-173으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 TLR5 아고니스트.
제6항 또는 제7항에 있어서,
상기 C-말단 펩티드는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열 401-494 및 406-494로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 TLR5 아고니스트.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 N-말단 펩티드 및 C-말단 펩티드는 각각 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열 1-173 및 401-494로 이루어진 것을 특징으로 하는 TLR5 아고니스트.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 N-말단 펩티드 및 C-말단 펩티드는 각각 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열 1-160 및 406-494로 이루어진 것을 특징으로 하는 TLR5 아고니스트.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 N-말단 펩티드 및 C-말단 펩티드는 각각 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열 1-137 및 406-494로 이루어진 것을 특징으로 하는 TLR5 아고니스트.
제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 N-말단 펩티드와 상기 C-말단 펩티드는 NH2-Gly-Ala-Ala-Gly-COOH(SEQ ID NO:4) 펩티드 서열로 이루어진 중간 스페이서 사슬을 통해 서로 간접 연결되는 것을 특징으로 하는 TLR5 아고니스트.
제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
SEQ ID NO:3의 위치 488에 위치한 아스파라긴 아미노산 잔기가 세린으로 대체된 것을 특징으로 하는 TLR5 아고니스트.
제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 플라겔린 폴리펩티드는 N-말단 말미에 부가적인 메티오닌 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 TLR5 아고니스트.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 기도 감염은 바이러스 감염, 박테리아 감염 또는 진균 감염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 TLR5 아고니스트.
제15항에 있어서,
상기 바이러스 감염은 인간 T-세포 림프영양성 바이러스(HTLV) 유형 I 및 II 및 인간 면역결핍 바이러스(HIV)와 같은 레트로바이러스, 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 유형 I 및 II, 엡스테인-바르(Epstein-Barr) 바이러스, HHV6-HHV8 및 사이토메갈로바이러스와 같은 헤르페스 바이러스, 라사 열 바이러스와 같은 아레나바이러스, 홍역바이러스, 인간 호흡기 세포융합 바이러스, 볼거리, hMPV 및 폐렴바이러스와 같은 파라믹소바이러스, 아데노바이러스, 한타바이러스와 같은 버냐바이러스, 코마바이러스, 에볼라 바이러스와 같은 필로바이러스, C형 간염 바이러스(HCV), 황열병 바이러스 및 일본 뇌염 바이러스와 같은 플라비바이러스, B형 간염 바이러스(HBV)와 같은 헤파드나바이러스, 인플루엔자 바이러스 A, B 및 C 및 PIV와 같은 오르토마이오바이러스, 파필로마바이러스와 같은 파포바바이러스, 리노바이러스, 엔테로바이러스 및 A형 간염 바이러스와 같은 피코르나바이러스, 폭스바이러스, 로타바이러스와 같은 레오바이러스, 풍진 바이러스와 같은 토가바이러스, 및 광견병 바이러스와 같은 랍도바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스에 의해 야기되는 것을 특징으로 하는 TLR5 아고니스트.
제15항에 있어서,
상기 박테리아 감염은 아쿠아스필릴룸(Aquaspirillum) 과, 아조스피릴룸(Azospirillum) 과, 아조토박테라세아에(Azotobacteraceae) 과, 박테로이다세아에(Bacteroidaceae) 과, 바르토넬라(Bartonella) 종, 브델로비브리오(Bdellovibrio) 과, 캄필로박테르(Campylobacter) 종, 클라마이디아 뉴모니아에(Chlamydia pneumoniae)와 같은 클라마이디아(Chlamydia) 종, 클로스트리듐(Clostridium), 시트로박테르(Citrobacter) 종, 에드워드시엘라(Edwardsiella), 엔테로박테르 아에로게네스(Enterobacter aerogenes), 에르비니아(Erwinia) 종, 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 하프니아(Hafnia) 종, 클렙시엘라(Klebsiella) 종, 모르가넬라(Morganella) 종, 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 프로비덴시아(Providencia), 살모넬라(Salmonella) 종, 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 및 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri)와 같은 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 과, 가르디넬라(Gardinella) 과, 하에모필러스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 할로박테리아세아에(Halobacteriaceae) 과, 헬리코박테르(Helicobacter) 과, 레지오날라세아에(Legionallaceae) 과, 리스테리아(Listeria) 종, 메틸로코카세아에(Methylococcaceae) 과, 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)와 같은 마이코박테리아, 네이세리아세아에(Neisseriaceae) 과, 오세아노스피릴룸(Oceanospirillum) 과, 파스퉤렐라세아에(Pasteurellaceae) 과, 폐렴연쇄구균 종, 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 리조비아세아에(Rhizobiaceae) 과, 스필릴룸(Spirillum) 과, 스피로소마세아에(Spirosomaceae) 과, 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 스타필로코쿠스 피로게네스(Staphylococcus pyrogenes)와 같은 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 스트렙토코쿠스 엔테리티디스(Streptococcus enteritidis), 스트렙토코쿠스 파시아에(Streptococcus Fasciae) 및 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)와 같은 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 밤피로비브르 헬리코박테르(Vampirovibr Helicobacter) 과, 및 밤피로비브리오(Vampirovibrio) 과로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아에 의해 야기되는 것을 특징으로 하는 TLR5 아고니스트.
제17항 또는 제18항에 있어서,
상기 박테리아 감염은 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 하에모필러스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis), 또는 마이코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae)와 같이 편모가 없는 박테리아에 의해 야기되는 것을 특징으로 하는 TLR5 아고니스트.
제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 박테리아 감염은 폐렴연쇄구균 감염인 것을 특징으로 하는 TLR5 아고니스트.
제15항에 있어서,
상기 진균 감염은 압시디아 코림비페라(Absidia corymbifera) 및 압시디아 라모사(Absidia ramosa)와 같은 압시디아(Absidia) 종, 아스페르길루스 피아부스(Aspergillus fiavus), 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 및 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus)와 같은 아스페르길루스(Aspergillus) 종, 블라스토마이세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 글라브랄라(Candida glabrala), 칸디다 케르(Candida kerr), 칸디다 크루세이(Candida krusei), 칸디다 파랍실로시스(Candida parapsilosis), 칸디다 슈도트로피칼리스(Candida pseudotropicalis), 칸디다 퀼레르몬디이(Candida quillermondii), 칸디다 루고사(Candida rugosa), 칸디다 스텔라토이데아(Candida stellatoidea) 및 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)와 같은 칸디다(Candida) 종, 코시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis), 코니디오볼루스(Conidiobolus) 종, 크립토코쿠스 네오포름스(Cryptococcus neoforms), 쿤닝하멜라(Cunninghamella) 종, 히스토플라즈마 캅술라툼(Histoplasma capsulatum), 무코르푸실루스(Mucorpusillus), 파라코시디오이데스 브라실리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis), 슈달레쉐리아 보이디이(Pseudallescheria boydii), 뉴모시스티스 카리니이(Pneumocystis carinii), 리조푸스 아리주스(Rhizopus arrhizus), 리조푸스 오리자에(Rhizopus oryzae) 및 리조푸스 마이크로스포레스(Rhizopus Microspores)와 같은 리조푸스(Rhizopus) 종, 사카로마이세스(Saccharomyces) 종, 및 스포로트릭스 쉔키이(Sporothrix schenckii)로 이루어진 군으로부터 선택되는 진균에 의해 야기되는 것을 특징으로 하는 TLR5 아고니스트.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 TLR5 아고니스트를 포함하는, 기도 감염의 치료 방법에 사용하기 위한 약학 조성물.
제21항에 있어서,
비강내 투여 또는 폐 투여와 같은 국소 투여와 상용되도록 제형화된 약학 조성물.
제22항에 있어서,
에어로졸 형태, 스프레이, 미스트 또는 액적 형태로 제형화된 약학 조성물.
치료학적 유효량의 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 TLR5 아고니스트를 기도 감염 또는 이의 하나 이상의 증상의 예방, 치료, 조절 또는 경감을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 기도 감염 또는 이의 하나 이상의 증상의 예방, 치료, 조절 또는 경감 방법.