KR20130142424A - 괭생이 모자반 유래 크로멘 화합물을 함유하는 광노화 억제용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 괭생이 모자반(Sargassum horneri)으로부터 유래된 크로멘(chromenes) 화합물을 유효성분으로 하는 피부세포에 대한 광노화 억제 효과에 관한 것으로서, 자세하게는 갈조류인 괭생이 모자반으로부터 분리된 사가크로마놀 D 및 사가크로마놀 E 화합물이 MMPs 저해 활성을 보이며, UV-A 처리된 섬유아세포 내에서의 프로콜라겐 및 타입 Ⅰ 콜라겐과 같은 콜라겐 합성 마커의 발현을 증대시키고, 또한 엘라스타제 활성 조절에 의한 엘라스틴을 증대시키는 효과를 확인하였다. 이를 통해 본 발명의 괭생이 모자반 유래 크로멘 화합물이 피부세포 광노화를 억제함으로써, UV에 의한 주름 개선 효과가 있는 피부 주름 개선 및 예방용 소재 및 화장료의 용도로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 괭생이 모자반 유래 크로멘 화합물을 함유하는 광노화 억제용 조성물 및 이를 포함하는 피부주름 개선 및 예방용 화장료에 관한 것이다.
모든 생명체는 나이를 먹으면서 노화되며 피부에서도 마찬가지로 노화의 과정을 거치게 된다. 피부의 노화는 그 요인에 따라 크게 두 가지로 구분할 수 있다. 그 중 하나인 자연적인 노화(Intrinsic aging)는 피부의 구조와 생리적인 기능이 나이를 먹으면서 계속적인 감퇴를 일으키는 것이고, 다른 하나인 외적 노화(Extrinsic aging)는 태양광선 등 누적된 외부 스트레스로 인해 발생하는 것이다. 특히 태양광의 자외선은 잘 알려진 노화 원인의 하나로, 장시간 자외선에 노출된 피부는 각질층이 두꺼워지고 피부의 주요 구성요소인 콜라겐과 엘라스틴이 변성되어 피부의 탄력성을 잃어 주름이 생기게 된다.
이처럼 피부의 노화현상은 여러 가지 기능적, 구조적 변화를 수반한다. 우선 노화에 따른 피부의 구조적 변화를 살펴보면, 피부의 구성성분인 표피, 진피 및 피하조직의 두께가 얇아진다. 또한, 피부의 탄력과 인장을 담당하는 진피 조직의 세포외 기질(ECM; extracelluar matrix) 성분이 변화하게 된다. 세포외 기질은 크게 두 가지 성분으로 구성되어 있다. 하나는 ECM 전체의 약 2~4%를 차지하는 탄력섬유(elastic fiber)이며, 또 다른 하나는 ECM 전체의 약 70~80%를 차지하고 있는 콜라겐이다. 노화가 진행됨에 따라 피부의 탄력성이 크게 감소되는데 이는 콜라겐과 엘라스틴의 감소에 기인한다. 이러한 콜라겐과 엘라스틴은 여러 가지 요인에 의해서 조절되는데, 콜라게나아제(collagenase)와 엘라스테아제(elastase) 같은 기질 메탈로 프로테아제(matrix metallo protease)의 발현으로 인하여 생성된 콜라겐과 엘라스틴이 분해되어 결과적으로 피부 내의 콜라겐 함량이 줄어드는 현상이 나타나게 된다. 진피에서 콜라겐과 엘라스틴이 줄어들면, 피부의 표피는 거칠어지며 노화현상인 탄력감소가 나타나고 이에 따라 주름이 늘어나게 된다. 이러한 탄력감소의 원인이 되는 콜라겐 및 엘라스틴의 감소를 효과적으로 억제하기 위한 방안에 대한 여러 가지 연구가 진행되어 오고 있다.
현재까지 가장 효과적으로 알려져 있는 방안은 레티놀과 레티노익산을 이용한 방안이다. 이러한 레티놀과 레티노익산 등의 레티노이드의 주름개선 또는 탄력개선 효과는 문헌을 통하여 잘 알려져 있다(Dermatology therapy, 1998, 16, 357~364). 하지만 이들 레티노이드는 주름개선 또는 탄력개선이라는 긍정적인 효과와 더불어, 소량만을 피부에 적용하여도 자극이 나타난다는 단점을 가지며, 또한 불안정성으로 인하여 공기 중에 노출되면 쉽게 산화 변질되기 때문에 사용하는데 많은 제약이 있다. 이에 레티노이드를 안정화하기 위한 연구는 계속해서 진행되고 있으나, 아직까지 피부에 대한 자극 즉 안전성의 문제는 해결되지 않고 있는 실정이다.
이를 대신할 수 있는 방안으로 제시되고 있는 것이 콜라겐과 엘라스틴을 분해하는 효소의 활성을 억제하는 것이며, 이러한 효소들의 활성을 억제할 수 있는 저해제들에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 최근 들어 콜라겐을 분해할 수 있는 효소인 콜라게나아제 및 기질 메탈로프로테아제의 활성도의 현격한 증가가 피부 주름 생성 요인 중의 하나로 밝혀짐에 따라 이에 대한 피부 주름 개선의 타겟으로서 관심이 높아지고 있다.
본 발명자들은 UV 광에 의해 유발된 주름 개선효과를 나타내면서 동시에 인체 피부에 대한 안전성을 갖춘 새로운 광노화 방지용 유효물질을 제공하고자 한다. 이에, 괭생이 모자반(Sargassum horneri) 유래의 크로멘 화합물이 콜라겐 합성을 촉진하고 콜라겐 분해를 억제하는 효과를 보일뿐만 아니라, 자외선에 의해 유도되는 주름의 개선 효과는 물론 인체 피부에 대해 우수한 안전성을 지니고 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 유효성분으로서 괭생이 모자반(Sargassum horneri) 유래의 크로멘 화합물을 함유하여 부작용 없이 우수한 주름 개선 효과가 있는 피부 주름 개선 및 예방용 화장료를 제공하는 것이다.
본 발명자들은 괭생이 모자반(Sargassum horneri)으로부터 분리된 크로멘 화합물의 광노화 방지에 대한 효과를 확인하기 위해 UV-A를 조사한 인간 피부진피 섬유아세포(HDF)에서 ROS 생산, 사이토카인 분비 및 발현된 노화 관련 유전자 발현을 측정하여 조사하였다. 기존의 많은 연구에서 MMPs (matrix metalloproteinases)의 활성이 광노화 과정에 관여한다고 설명하고 있지만, in vitro 피부의 진피에서 UV 매개 변화에 대한 직접적 영향을 입증한 연구는 거의 없었다. 그 결과, 본 발명의 괭생이 모자반(Sargassum horneri) 유래의 크로멘 화합물을 처치하면 UV-A에 의한 피부주름과 같은 광노화를 억제할 수 있음을 확인하였다.
일 예에서, 상기 크로멘 화합물은 콜라겐 합성을 촉진하고 콜라겐 분해를 억제함을 확인하였다. 구체적으로, 상기 3종의 크로멘 화합물이 콜라겐이 MMPs, MMP-1, MMP-2, MMP-3 및 MMP-9 발현으로 분해되는 것을 억제하는 것을 밝혔다. 또한, 이러한 억제가 TIMP-1 및 TIMP-2 유전자의 발현 증가에 의한 것이라는 점도 확인하였다. 나아가, UV-A 가 조사된 진피 섬유아세포에 본 발명의 크로멘 화합물을 처치하면 프로콜라겐 및 타입 I 콜라겐 같은 콜라겐 합성 마커의 발현이 촉진된다는 것도 확인하였다.
또 하나의 예에서, 상기 크로멘 화합물은 진피 섬유아세포에서 콜라게나아제, 엘라스테아제 및 기질 메탈로프로테아제(Matrix metalloproteinases)의 저해 활성을 나타낸다. 구체적으로 크로멘은 이들 분해효소들의 활성을 제어함으로써 콜라겐과 엘라스틴 발현을 촉진한다.
한편, 히알루로난이 세포증식을 조절하는 것으로 알려져 있기 때문에, 히알루로난 합성효소(HASs)의 발현에 대한 UV-A의 효과를 시험하였다. 배양된 인간 진피 섬유아세포에 UV-A 단일조사 후 HAS1, HAS2 및 HAS3 mRNA 는 대부분이 발현증가 되었다. 배양 배지에의 히알루로난 축적 증가는 HAS1, HAS2 및 HAS3의 mRNA 레벨에서의 UV-A 유도된 증가에 비례한다. 이는 UV-A-조사된 섬유아세포는 HAS 1, HAS2 및 HAS3 유전자의 up-regulation를 통해 히알루로난 생산을 촉진하여 항상성을 유지하는 것으로 판단된다. 더욱이, 우리는 AP-1 및 TGF-β/Smad signaling cascade의 UV-A 유도된 전사가 UV-A 조사된 진피 섬유아세포에서 크로멘 처치로 제어되었다는 것을 확인하였다.
일 예에서, 본 발명의 크로멘 화합물은 괭생이 모자반(Sargassum horneri)의 메탄올 조추출물의 유기용매 분획물로부터 얻을 수 있다.
일 예에서, 상기 크로멘 화합물은 바람직하게는 사가크로메놀(sargachromenol) D일 수 있다.
일 예에서, 본 발명의 광노화 억제용 조성물은 피부 주름 개선 및 예방용 화장료로 이용될 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 괭생이 모자반(Sargassum horneri) 유래의 크로멘 화합물들은 콜라겐 합성을 촉진하고 콜라겐 분해를 억제하며, 콜라게나아제, 엘라스테아제 및 기질 메탈로프로테아제(Matrix metalloproteinases)의 저해 활성을 나타냄으로써 UV-A에 의한 피부주름을 개선시킨다. 따라서, 본 발명의 조성물은 UV 광에 의한 노화를 방지하는데 사용될 수 있으며, 구체적으로는 광노화의 예방 또는 치료용 조성물, 식품, 식품 첨가제, 화장품 첨가물의 용도로 사용될 수 있다. 특히 괭생이 모자반은 천연물질로서 식용 가능하므로 이로부터 유래한 화합물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 장기간 사용에도 안전한 이점을 가진다.
도 1은 괭생이 모자반(Sargassum horneri)으로부터 추출물 및 분획물을 얻는 과정의 모식도이다.
도 2는 괭생이 모자반(Sargassum horneri)의 85% aq. MeOH 분획으로부터 3종의 크로멘 화합물을 분리하는 과정의 모식도이다.
도 3은 진피 섬유아세포의 생존율을 서로 다른 양의 UV-A 조사 (2-10 J/cm2)에 노출시켜 측정한 그래프이다.
도 4는 UV-A 조사량에 따른 진피 섬유아세포 몰폴로지에 대한 사진이다.
도 5는 UV-A를 조사한 진피 섬유아세포에서 사이토카인 분비물인 TNF-α 농도 변화를 ELISA assay로 시간에 따라 측정한 그래프이다.
도 6는 UV-A를 조사한 진피 섬유아세포에서 사이토카인 분비물인 IL-1β의 농도 변화를 ELISA assay로 시간에 따라 측정한 그래프이다.
도 7은 UV-A 조사한 진피 섬유아세포에서 사이토카인 분비물인 IL-6 의 농도 변화를 ELISA assay로 시간에 따라 측정한 그래프이다.
도 8은 UV-A 조사한 진피 섬유아세포에서 MMPs 및 사이토카인 유전자 발현, 즉 MMP-1, MMP-2, MMP-9, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 농도 변화를 웨스턴블롯 분석으로 시간에 따라 측정한 것이다.
도 9는 인간 진피 섬유아세포의 생존율에 대한 크로멘 화합물의 효과를 MTT 분석으로 시험한 결과이다.
도 10은 UV-A 조사 후 HDF 세포의 생존율에 대한 크로멘 화합물의 효과를 MTT 분석한 결과를 나타낸다(Bl: UV-A 노출 없음, Con: UV-A 노출만 있음, 이하 같다).
도 11은 UV-A 조사 전에 다양한 농도의 크로멘 화합물로 선-배양한 HDF 세포의 광독성에 대한 효과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 UV-A 조사로 유도된 세포내 ROS 발생에 대한 화합물 A 의 효과를 다양한 농도의 화합물 A로 처치한 후 DCF-DA의 형광강도로 측정한 그래프이다.
도 13은 UV-A 조사로 유도된 세포내 ROS 발생에 대한 다양한 농도의 화합물 B 로 처치한 후 DCF-DA의 형광강도를 측정한 그래프이다.
도 14는 UV-A 조사로 유도된 세포내 ROS 발생에 대한 다양한 농도의 화합물 C 로 처치한 후 DCF-DA의 형광강도를 측정한 그래프이다.
도 15는 진피 섬유아세포에서 UV-A 조사 후 세포막 단백질 산화에 대한 크로멘 화합물들의 금지능을 나타낸 그래프이다.
도 16은 UV-A 조사에 의해 세포막 지질과산화에 대한 본 발명의 화합물들의 효과를 DPPP(diphenyl-1-pyrenylphosphine) 형광프로브를 이용하여 측정한 나타낸 그래프이다.
도 17은 티올 염료로서 mBBr을 이용하여 λexcitation=360 nm 및 λemission=465 nm에서의 mBBr-GSH 형광강도를 측정한 텍스트에 기재된 방법에 따라 측정한 세포적 GSH 수준을 나타낸 그래프이다.
도 18은 UV-A 조사된 HDF세포에서 TNF-α 생산에 대한 본 발명의 화합물들의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 19는 UV-A 조사된 HDF세포에서 IL-1β 생산에 대한 본 발명의 화합물들의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 20은 UV-A 조사된 HDF세포에서 IL-6 생산에 대한 본 발명의 화합물들의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 21은 UV-A 를 조사한 진피 섬유아세포에서 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 mRNA 발현 수준에 대한 본 발명의 화합물들의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 22는 UV-A 조사된 진피 섬유아세포에서 본 발명의 화합물들에 의한 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 등의 사이토카인 발현의 금지 효과를 나타낸 그래프이다(RA: 레티노익산).
도 23은 UV-A 조사된 배양 섬유아세포에서 히알루로난 분비의 시간의존적 변화를 나타낸 그래프이다.
도 24는 배양된 섬유아세포에 있어서 UV-A 유발 히알루로난 분비에 대한 본 발명의 화합물들의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 25는 UV-A를 조사한 진피 섬유아세포에 있어서 HAS1, HAS2 및 HAS3의 mRNA 발현 수준에 대한 본 발명의 화합물들의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 26은 인간 진피 섬유아세포에서 UV-A 조사에 의한 콜라겐을 분해하는 MMP-1분비에 대한 본 발명의 화합물의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 27은 인간 진피 섬유아세포에서 UV-A 조사에 의한 콜라겐을 분해하는 MMP-13 분비에 대한 본 발명의 화합물의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 28은 UV-A 조사한 인간 진피 섬유아세포에서 콜라겐 합성효소에 대한 본 발명의 화합물들의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 29는 UV-A를 조사한 진피 섬유아세포에서 MMP-1, MMP-2, MMP-3 및 MMP-9의 mRNA 발현 수준에 대한 본 발명의 화합물들의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 30은 UV-A를 조사한 진피 섬유아세포에서 TIMP-1 및 TIMP-2의 mRNA 발현 수준에 대한 본 발명의 화합물의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 31은 UV-A를 조사한 진피 섬유아세포에서 MMP-1, MMP-2 및 MMP-9 의 단백질 발현에 대한 본 발명의 화합물의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 32는 UV-A를 조사한 진피 섬유아세포에서 TIMP-1 및 TIMP-2 의 단백질 발현에 대한 본 발명의 화합물의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 33는 UV-A를 조사한 진피 섬유아세포에서 엘라스틴 및 콜라겐의 mRNA 발현 수준에 대한 본 발명의 화합물의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 34는 UV-A를 조사한 진피 섬유아세포에서 프로콜라겐, 콜라겐 타입 I, 및 엘라스틴의 단백질 발현에 대한 본 발명의 화합물의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 35는 콜라겐 분해에 있어서 10 μM 의 농도에서 본 발명의 화합물의 효과를 UV-A 미조사된 (Blank) 및 UV-A 만 조사한 세포 (대조군) 사이의 차이점을 통해 나타낸 그래프이다.
도 36는 10 μM 의 농도에서 UV-A에 의한 세포외 기질 성분에 대한 본 발명의 화합물의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 37은 10 μM 의 농도에서 UV-A 조사된 진피 섬유아세포에 의한 히알루로난 합성효소 1에 대한 본발명의 화합물의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 38은 UV-A 조사된 섬유아세포에서 AP-1 신호 cascade에 대한 본 발명의 화합물들의 효과를 나타낸 것이다.
도 39은 UV-A 조사에 의한 섬유아세포에서 TGF-β/Smad 신호 cascade 에 대한 본 발명의 화합물들의 영향을 나타낸 그래프이다.
도 40는 AP-1 (A) 및 TGF-β/Samd (B) 시그널에 대한 UV-A 미처치군과 UV-A 처치군과 대비한 크로멘 화합물의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 괭생이 모자반(Sargassum horneri)의 85% aq. MeOH 분획으로부터 3종의 크로멘 화합물을 분리하는 과정의 모식도이다.
도 3은 진피 섬유아세포의 생존율을 서로 다른 양의 UV-A 조사 (2-10 J/cm2)에 노출시켜 측정한 그래프이다.
도 4는 UV-A 조사량에 따른 진피 섬유아세포 몰폴로지에 대한 사진이다.
도 5는 UV-A를 조사한 진피 섬유아세포에서 사이토카인 분비물인 TNF-α 농도 변화를 ELISA assay로 시간에 따라 측정한 그래프이다.
도 6는 UV-A를 조사한 진피 섬유아세포에서 사이토카인 분비물인 IL-1β의 농도 변화를 ELISA assay로 시간에 따라 측정한 그래프이다.
도 7은 UV-A 조사한 진피 섬유아세포에서 사이토카인 분비물인 IL-6 의 농도 변화를 ELISA assay로 시간에 따라 측정한 그래프이다.
도 8은 UV-A 조사한 진피 섬유아세포에서 MMPs 및 사이토카인 유전자 발현, 즉 MMP-1, MMP-2, MMP-9, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 농도 변화를 웨스턴블롯 분석으로 시간에 따라 측정한 것이다.
도 9는 인간 진피 섬유아세포의 생존율에 대한 크로멘 화합물의 효과를 MTT 분석으로 시험한 결과이다.
도 10은 UV-A 조사 후 HDF 세포의 생존율에 대한 크로멘 화합물의 효과를 MTT 분석한 결과를 나타낸다(Bl: UV-A 노출 없음, Con: UV-A 노출만 있음, 이하 같다).
도 11은 UV-A 조사 전에 다양한 농도의 크로멘 화합물로 선-배양한 HDF 세포의 광독성에 대한 효과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 UV-A 조사로 유도된 세포내 ROS 발생에 대한 화합물 A 의 효과를 다양한 농도의 화합물 A로 처치한 후 DCF-DA의 형광강도로 측정한 그래프이다.
도 13은 UV-A 조사로 유도된 세포내 ROS 발생에 대한 다양한 농도의 화합물 B 로 처치한 후 DCF-DA의 형광강도를 측정한 그래프이다.
도 14는 UV-A 조사로 유도된 세포내 ROS 발생에 대한 다양한 농도의 화합물 C 로 처치한 후 DCF-DA의 형광강도를 측정한 그래프이다.
도 15는 진피 섬유아세포에서 UV-A 조사 후 세포막 단백질 산화에 대한 크로멘 화합물들의 금지능을 나타낸 그래프이다.
도 16은 UV-A 조사에 의해 세포막 지질과산화에 대한 본 발명의 화합물들의 효과를 DPPP(diphenyl-1-pyrenylphosphine) 형광프로브를 이용하여 측정한 나타낸 그래프이다.
도 17은 티올 염료로서 mBBr을 이용하여 λexcitation=360 nm 및 λemission=465 nm에서의 mBBr-GSH 형광강도를 측정한 텍스트에 기재된 방법에 따라 측정한 세포적 GSH 수준을 나타낸 그래프이다.
도 18은 UV-A 조사된 HDF세포에서 TNF-α 생산에 대한 본 발명의 화합물들의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 19는 UV-A 조사된 HDF세포에서 IL-1β 생산에 대한 본 발명의 화합물들의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 20은 UV-A 조사된 HDF세포에서 IL-6 생산에 대한 본 발명의 화합물들의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 21은 UV-A 를 조사한 진피 섬유아세포에서 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 mRNA 발현 수준에 대한 본 발명의 화합물들의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 22는 UV-A 조사된 진피 섬유아세포에서 본 발명의 화합물들에 의한 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 등의 사이토카인 발현의 금지 효과를 나타낸 그래프이다(RA: 레티노익산).
도 23은 UV-A 조사된 배양 섬유아세포에서 히알루로난 분비의 시간의존적 변화를 나타낸 그래프이다.
도 24는 배양된 섬유아세포에 있어서 UV-A 유발 히알루로난 분비에 대한 본 발명의 화합물들의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 25는 UV-A를 조사한 진피 섬유아세포에 있어서 HAS1, HAS2 및 HAS3의 mRNA 발현 수준에 대한 본 발명의 화합물들의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 26은 인간 진피 섬유아세포에서 UV-A 조사에 의한 콜라겐을 분해하는 MMP-1분비에 대한 본 발명의 화합물의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 27은 인간 진피 섬유아세포에서 UV-A 조사에 의한 콜라겐을 분해하는 MMP-13 분비에 대한 본 발명의 화합물의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 28은 UV-A 조사한 인간 진피 섬유아세포에서 콜라겐 합성효소에 대한 본 발명의 화합물들의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 29는 UV-A를 조사한 진피 섬유아세포에서 MMP-1, MMP-2, MMP-3 및 MMP-9의 mRNA 발현 수준에 대한 본 발명의 화합물들의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 30은 UV-A를 조사한 진피 섬유아세포에서 TIMP-1 및 TIMP-2의 mRNA 발현 수준에 대한 본 발명의 화합물의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 31은 UV-A를 조사한 진피 섬유아세포에서 MMP-1, MMP-2 및 MMP-9 의 단백질 발현에 대한 본 발명의 화합물의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 32는 UV-A를 조사한 진피 섬유아세포에서 TIMP-1 및 TIMP-2 의 단백질 발현에 대한 본 발명의 화합물의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 33는 UV-A를 조사한 진피 섬유아세포에서 엘라스틴 및 콜라겐의 mRNA 발현 수준에 대한 본 발명의 화합물의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 34는 UV-A를 조사한 진피 섬유아세포에서 프로콜라겐, 콜라겐 타입 I, 및 엘라스틴의 단백질 발현에 대한 본 발명의 화합물의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 35는 콜라겐 분해에 있어서 10 μM 의 농도에서 본 발명의 화합물의 효과를 UV-A 미조사된 (Blank) 및 UV-A 만 조사한 세포 (대조군) 사이의 차이점을 통해 나타낸 그래프이다.
도 36는 10 μM 의 농도에서 UV-A에 의한 세포외 기질 성분에 대한 본 발명의 화합물의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 37은 10 μM 의 농도에서 UV-A 조사된 진피 섬유아세포에 의한 히알루로난 합성효소 1에 대한 본발명의 화합물의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 38은 UV-A 조사된 섬유아세포에서 AP-1 신호 cascade에 대한 본 발명의 화합물들의 효과를 나타낸 것이다.
도 39은 UV-A 조사에 의한 섬유아세포에서 TGF-β/Smad 신호 cascade 에 대한 본 발명의 화합물들의 영향을 나타낸 그래프이다.
도 40는 AP-1 (A) 및 TGF-β/Samd (B) 시그널에 대한 UV-A 미처치군과 UV-A 처치군과 대비한 크로멘 화합물의 효과를 나타낸 그래프이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 하기의 정의를 가지며 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미에 부합된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
용어 “추출물”은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.
용어 “약”이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, “포함하다” 및 “포함하는”이란 말은 제시된 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
피부세포
광노화
억제용 조성물
본 발명의 일 예는 괭생이 모자반(Sargassum horneri)으로부터 분리한 크로멘(chromenes) 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부세포 광노화 억제용 조성물이다. 보다 구체적으로는 갈조류인 괭생이 모자반(Sargassum horneri)의 85% aq. MeOH 분획으로부터 사가크로메놀(화합물 A), 사가크로마놀E(화합물 B), 및 사가크로마놀 D(화합물 C)의 3종의 크로멘 화합물을 분리하였다.
사가크로메놀 (A)
사가크로메놀 E (B)
사가크로메놀
D (C)
크로멘
화합물의 추출방법
상기 추출을 위한 적절한 용매로는 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 물 또는 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등의 탄소수 1 내지 4의 알콜이나, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 디클로로메탄(dichloromethane), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매 또는 이들의 혼합용매일 수 있다.
또한, 상기 용매로 추출한 추출물은 이후, 헥산, 부탄올, 디클로로메탄, 아세톤, 에틸아세테이트, 에틸 에테르, 클로로포름, 물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 분획과정을 더욱 실시할 수 있다. 바람직하게는 상기 분획용매는 바람직하게는 디클로로메탄, 에틸 아세테이트 및 n-부탄올일 수 있다. 상기 분획시 용매는 1종 이상 사용할 수 있다. 본 발명의 괭생이 모자반 추출물은 통상의 해조류 추출물의 제조방법에 따라 제조된 것일 수 있으며, 구체적으로는 냉침추출법, 온침추출법 또는 열수 추출법 등일 수 있으며, 통상의 추출기기, 초음파분쇄 추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다. 또한, 상기 용매로 추출한 추출물은 이후, 여과하거나 농축 또는 건조과정을 수행하여 용매를 제거할 수 있으며, 여과, 농축 및 건조를 모두 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 여과는 여과지를 이용하거나 감압여과기를 이용할 수 있으며, 상기 농축은 감압 농축기, 일예로 회전 증발기를 이용하여 감압 농축할 수 있으며, 상기 건조는 일예로 동결건조법으로 수행할 수 있다. 또한, 상기 수득한 대황 추출물은 사용 시까지 급속 냉동 냉장고(deep freezer)에 보관할 수 있고, 농축 및 동결건조를 통하여 수분을 완전히 제거시킬 수 있으며, 상기 수분을 완전히 제거시킨 대황 추출물은 분말형태로 사용하거나 상기 분말을 증류수 또는 통상의 용매에 녹여 사용할 수 있다.
본 발명의 일예로, 상기 괭생이 모자반 추출물은 괭생이 모자반의 염분 및 불순물을 제거한 후, 건조하여 건조시료를 제조하고, 상기 건조시료에 메탄올을 첨가하여 조추출액을 얻으며, 상기 조추출액을 감압 농축하여 추출물을 제조할 수 있다. 이 때, 상기 괭생이 모자반의 염분 및 불순물의 제거는 유수를 이용하여 씻어내서 수행할 수 있으며, 상기 건조시료는 상기 염분 및 불순물을 제거한 괭생이 모자반을 건조한 후에 분쇄하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 건조시료는 사용 시까지 급속 냉동 냉장고(deep freezer)에 보관할 수 있다. 또한, 상기 추출물은 수득된 추출액을 농축 및 동결건조를 통하여 수분을 완전히 제거시킨 것일 수 있으며, 상기 수분을 완전히 제거시킨 추출물은 분말형태로 사용하거나 상기 분말을 증류수 또는 통상의 용매에 녹여 사용할 수 있다.
크로멘
화합물의 효능
종래 UV 조사로 인해 콜라겐 합성이 감소되고, 진피 섬유아세포에서 콜라겐을 분해시키는 MMPs 발현 수준이 증가한다는 것이 알려져 있다. 이에, 콜라겐 합성이 줄어들고 콜라게나아제 MMPs에 의한 콜라겐의 분해가 증가되는 현상은 주름 형성에 영향을 주고 광손상된 피부에서 콜라겐 결핍과 연관이 있다고 판단된다. 레티노익산은 잘 알려진 항노화 약물이다. 그러나, 레티노익산의 범용적인 사용이 제안되는바, 이는 피부 자극과 돌연변이 유발성(mutagenicity) 때문이다. 이에, 본 발명은 UV-A 조사한 인간 진피 섬유아세포 (HDF)에 있어서, 본 발명의 크로멘 화합물이 콜라겐 합성과 MMPs 에 의한 콜라겐 분해에 대한 영향을 조사하였다.
피부가 UV광에 노출되면 활성산소종(ROS)의 활성화 시스템이 유발된다. ROS 는 일항산소, 과산화물 음이온, 히드록실 라디컬, 및 과산화수소와 같은 활성 및/또는 유리된 라디컬 산소 화합물을 포함한다. 이들 산소종들은 진피 또는 표피에 있는 조직을 공격하여 피부 노화를 일으킨다. 따라서, 자유 라디컬 소거 화합물은 피부 노화를 완화시키는 화장품의 원료로 바람직하게 이용될 수 있다. 이와 관련하여 본 발명의 크로멘 화합물의 자유 라디컬 소거능과 막지질 및 단백질의 산화를 통한 진피 섬유아세포 손상을 평가하였다. 그 결과 본 발명의 크로멘 화합물은 UV-A 조사에 의한 ROS 발생을 감소시키고, 세포막지질 과산화 및 단백질 산화를 감소시킨다는 것을 확인하였다.
주름 형성에 있어서, UV-A 조사는 세포막 분해 효소를 활성화시킴에 의한 피부 진피의 콜라겐 분해와 관련되어 있다. 기질 메탈로프로테아제 는 세포외 기질의 모든 성분에 대한 총괄적 분해능을 갖고, 그것의 활성화는 특정한 MMPs의 조직 저해제(TIMPs)에 의해 엄격히 제어된다. MMPs 중에서, 많은 연구들은 주름 형성에 관련된 광노화와 연관이 있는 겔라티나아제 및 콜라게나아제에 집중되어 있다.
주요 MMP군으로서, MMP-2(gelatinase A or 72 kDa 타입 IV 콜라게나아제) 및 MMP-9(gelatinase B or 92 kDa 타입 IV 콜라게나아제)는 섬유아세포에 의해 생성된 1차 세포막 분해 효소이다. 이들은 피부 진피에서 타입 IV, V, VII 및 X 콜라게나아제, 엘라스틴, 및 변성 콜라겐으로 세분된다. 콜라겐 결핍과 관련하여, 콜라게나아제는 결합조직의 주 성분인 천연 콜라겐 섬유를 분해시킬 수 있다. 콜라게나아제 MMPs는 3/4 N-terminal 및 1/4 C-terminal 분절을 생성하는 특정 영역에서 콜라겐 타입 I, II 및 III로 쪼개지며, 겔라티나아제와 같은 다른 타입의 MMPs에 의한 분해에 취약해진다. UV 조사에 의한 겔라티나아제 및 콜라게나아제의 과발현은 인간 결막이완증 섬유아세포에서 콜라겐 결핍을 유발할 수 있다. UV-A 조사는 콜라게나아제 및 겔라티나아제의 발현을 상향조절하는 반면, 본 발명의 크로멘 화합물 처치에 의해 UV-A 조사된 진피 섬유아세포에서 이들의 발현 수준이 감소된다. 또한, 이러한 MMPs 발현은 TIMP-1 및 TIMP-2 유전자에 의해 억제되는 것이 관찰되었다.
추가적으로, 엘라스틴은 세포외 기질 단백질이며 결합조직에 탄력을 제공한다. 이는 피부 진피에 탄력섬유를 형성하고, 피부 탄성에 영향을 준다. 엘라스틴 섬유 손상은 피부 탄성을 감소시킨다. 엘라스타아제는 엘라스틴 분해능을 갖는 단백질 분해효소이다. 따라서 엘라스타아제 활성의 억제는 피부 노화를 방지할 수 있는 한 방안이 된다. 이에, 본 발명의 크로멘 화합물은 인간 섬유아세포 엘라스타아제 활성을 억제한다.
한편, 히알루로난은 피부의 주성분이며, 다양한 히알루로난-결합 단백질을 통한 세포부착, 이동 및 분화에 핵심적인 역할을 한다. 염증 과정에서 저분자량 히알루로난에 대한 많은 기능들이 설명하고 있다. 특히 저분자량 히알루로난의 함량 증가는 만성적 염증 조직에서 발견된다. 따라서, 저분자량 화합물의 합성 또는 현존하는 히알루로난의 분화에 의한 분자량이 감소된 히알루로난은 염증과 그 다음의 조직 분해 메커니즘에 중요한 역할을 수행한다. 사이토카인은 히알루로난의 분자량 뿐아니라 함량을 조절하는데 상호작용을 한다고 알려져 있다.
최근 세 개의 인간 히알루로난 합성효소(HAS1, HAS2 및 HAS3) 유전자가 규명되었고, 그 특성이 설명되었다. 이들 효소들은 염증성 사이토카인에 의해 제어됨으로써 복제되고 특징지워진다. 또한 히알루로난 합성효소 1 및 2는 고분자량의 히알루로난을 합성하는 반면 히알루로난 합성효소 3은 저분자량의 히알루로난을 합성한다. 따라서, 히알루로난 바이오합성의 전체 과정 뿐 아니라 개별 단계가 규명되었다. 본 발명의 크로멘 화합물은 배양된 진피 섬유아세포에서 UV-A 조사에 의한 히알루로난 합성효소 mRNA의 발현에 영향을 미치며, UV-A으로 자극받은 염증성 환경 하에서 사이토카인 규제를 분석하였다. 그 결과 히알루로난 합성효소 1, 2 및 3의 mRNA 발현은 UV-A 조사 24시간 후 현저히 촉진되었고, TNF-α 및 IL-1β 발현이 UV-A 조사에 의해 다소 증가하였다. 활성산소종이 히알루로난 저분자화에서 나타났다고 보고되었다. 또한, 히알루로난의 효소적 분해능을 갖는 포유류 히알루로니다아제가 다수 최근에 복제되었고 염증과 관련되어 있는 것으로 보고되었다. 따라서, 히알루로난 축적은 UV-A 조사에 의한 저분자화 및 효소적 분리 및 히알루로난 합성효소 발현의 증가에 의한 히알루로난의 합성의 결과이다. 이에, 활성산소종 및 사이토카인의 상쇄적 효과와 함께 히알루로난 합성효소에 의해 생성된 히알루로난은 상승 작용에 의해 피부 성분의 파괴를 가능하게 할 수 있다. 이러한 효과는 본 발명의 크로멘 화합물 처치에 의해 제어되었다.
다음으로 본 발명의 크로멘 화합물의 탄성 특성에 대한 영향을 평가하였고, 프로콜라겐, 콜라겐 타입 I 및 엘라스틴의 수준을 탄력섬유의 합성 마커로서 시험하였다. 콜라겐 분자는 조골세포 및 섬유아세포에서 합성되고, 프로콜라겐으로서 세포외 공간으로 분비된다. 분비되는 동안, 아미노말단 및 카르복실 말단 단백질이 특정 단백질분해효소에 의해 프로콜라겐 분자로부터 쪼개진다. 29개 타입의 콜라겐이 알려져 있으나, 체내 90% 이상의 콜라겐은 타입 I이다. 특히 콜라겐 타입 I은 피부 진피의 주요 성분이고 인장강도과 안정성을 제공하는 단백질군에 속한다고 알려져 있다. 프로테오글리칸, 엔탁틴, 라미닌, 피브로넥틴, 및 콜라겐과 같은 모든 피부 기저막 구성성분은 기저막 안정성에 원인이 된다. 특히 UV-조사에 의한 콜라겐과 피브로넥틴의 손실은 진피-표피 연결부위에서 기저막 변화를 일으킬 수 있다.
본 발명의 크로멘 화합물 처치로 인해 콜라겐 합성의 증가와 피브로넥틴 분해의 억제로 인해 콜라겐 I 의 손실이 감소되었다. 이러한 결과는 본 발명의 크로멘 화합물이 UV-A 조사된 진피 섬유아세포에서 AP-1 및 TGF-β/smad 신호경로 전사 억제를 통해 기저막 성분 분해를 약화시킨다는 것을 의미한다. 이러한 활성화는 본 발명의 크로멘 화합물에 존재하는 특정 종류의 기능기와 반응할 수 있는 특정 화합물의 이용가능성에 의존적이다.
토코트리에놀을 갖는 본발명의 크로멘 화합물은 갈조류 중에서 종종 발견되며 특히 모자반 속(Sargassum genus)에 풍부하다. 토코트리에놀은 토코페롤군에 속하는 지용성 분자이다. 구조적으로, 토코페놀 및 토코트리에놀은 일반 크로만올 헤드와 C-2 위치에 곁사슬 갖는 구조적 유사성을 공유한다. 그러나, 토코페놀과 토코트리에놀은 곁 사슬에 있어서 차이가 있다. 토코페놀은 포화 피틸(phytyl) 말단을 갖고, 토코트리에놀은 불포화 이소프레노이드 곁사슬을 갖는다. 토코트리에놀은 독특한 기능적 특성을 나타낸다. 특히, 토코트리에놀은 플라즈마 콜레스테롤 수준 뿐 아니라 기타 지질 및 비지질과 관련된 심혈관계 질환의 위험 요소를 감소시키는 것으로 나타났다.
히드록실기 (페놀릭)은 본 발명의 크로멘 화합물의 항산화 활성에 필수적이다. 본 발명의 크로멘 화합물에서 크로마놀 고리 상의 페놀릭 히드록실기는 자유 라디컬과 반응하며, 이는 자동 산화 연쇄반응을 종결시킨다. 이러한 활성은 자유 라디컬 소거능이라고 하며, 지방산 자유라디컬 뿐만 아니라 자유라디컬 종결(quenching)에 대한 페놀릭 수소의 공여에 관련이 있다. 이 과정에서, 미반응 토코페녹실 자유 라디컬이 형성되며, 이는 토코페릴퀴논(tocopherylquinone)으로 전환된다. 상귀 퀴논 형태는 아스코르브산과 같은 환원제에 의해 다시 토코페롤 형태로 환원되고, 이에 크로멘 화합물 분자는 재사용되며 산화제로서의 기능을 반복할 수 있다.
사가크로메놀은 분자 중에 카르복실기를 갖는다. 카르복실산의 탈프로톤화(Deprotonation)는 카르복시산 음이온을 주며, 이는 음전하가 안정성을 증가시키는 산소 원자들 사이에서 비편재화되기 때문에 안정화된 공명이다. 카르복시산 음이온 내 각각의 탄소-산소 결합은 부분적으로 이중 결합의 특성을 갖는다. 사가크로메놀 E 와 사가크로메놀 D는 이소프레노이드 곁 사슬 내에 디올기를 가진다. 이에, 본 발명의 크로멘 화합물 분자의 히드록실기의 디프로톤화가 아연 금속 이온의 킬레이션에 기여하고, 이에 UV 조사에 의한 콜라겐을 분해하는 MMPs 발현수준이 본 발명의 크로멘 화합물에 의해 억제된다고 사료된다.
따라서, UV 노출에 의한 콜라겐 분해하는 MMPs 활성의 증가는 진피-표피 연결부위에서 기저막의 분해를 통해 주름 형성에 관여하고, 이에 따라 탄력섬유와 같은 세포외 기질의 분해가 유발된다. 따라서, 본 발명의 크로멘 화합물은 UV 조사에 의해 유발되는 주름 형성을 방지하는데 효과적으로 이용될 수 있다.
하기 표 1은 본 발명의 크로멘 화합물 3종의 UV 유발 피부 노화의 방지 및 치료 효과와 관련된 시험 결과들을 요약한 결과이다.
피부주름 개선용
화장료
본 발명의 피부 주름 개선용 화장료는 괭생이 모자반(Sargassum horneri) 유래의 사가크로메놀 E, 사가크로메놀 D, 및 이들의 혼합물 중에서 선택되는 크로멘(chromenes) 화합물을 유효성분으로 함유하며 피부학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 이용될 수 있다.
본 발명의 주름 개선 화장료는 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면 영양화장수, 유연화장수, 영양크림, 마사지크림, 팩, 젤, 수렴화장수, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 파우더, 보디로션, 보디크림, 보디오일 및 보디에센스 등의 화장료로 제형화 될 수 있다.
상기 부형제로는 이에 한정되지는 않으나 예를 들어, 피부연화제, 피부 침투 증강제, 착색제, 방향제, 유화제, 농화제 및 용매를 포함할 수 있다. 또한, 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제 및 보습제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 물성개선을 목적으로 점증제, 무기염류, 합성 고분자 물질 등을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 크로멘 화합물을 포함하는 세안제 및 비누를 제조하는 경우에는 통상의 세안제 및 비누 베이스에 크로멘 화합물을 첨가하여 용이하게 제조할 수 있다. 크림을 제조하는 경우에는 일반적인 수중유적형(O/W)의 크림베이스에 크로멘 화합물 또는 이의 염을 첨가하여 제조할 수 있다. 여기에 향료, 킬레이트제, 색소,산화방지제, 방부제 등과 물성개선을 목적으로 한 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 추가로 첨가할 수 있다.
상기 본 발명의 피부 주름 개선용 화장료 조성물에 함유되는 사가크로메놀의 함량은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 50 중량% , 바람직하게는 0.001~10 중량% 범위로 함유될 수 있다. 이는 0.001중량% 미만에서는 그 효과를 기대할 수 없고, 10 중량%를 초과하면 안전성 또는 제형상의 제조에 어려움이 있기 때문이다. 또한 보다 효과적인 피부 주름 개선과 제형상 제조의 용이성 향상을 위해서는 조성물 총 중량에 대하여 0.01~5 중량%를 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명의 피부 주름 개선용 화장료는 괭생이 모자반(Sargassum horneri) 유래 크로멘 화합물 외에 본 발명이 목적으로 하는 주름 개선 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 바람직하게는 상기 주름 개선 효과에 상승효과를 줄 수 있는 다른 주름 개선 성분 등을 함유할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 추가적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
약어
- 화합물 A: 사가크로마놀
- 화합물 B: 사가크로마놀 E
- 화합물 C: 사가크로마놀 D
<
실시예
1>
괭생이
모자반 추출물
갈조류 괭생이 모자반(Sargassum horneri )은 2010년 파라제주 (회사)에서 구매하였다. 괭생이 모자반을 응달에서 건조시킨 파우더 형태로 만든 후 해조류 내의 전 성분을 추출하기 위해 메탄올을 이용하여 3회 반복 추출하였다. 500g의 메탄올 추출물을 물 2L에 분산시킨후 디클로로메탄(CH2Cl2)을 2L 첨가 후 물층과 디클로로 메탄층으로 분획한다 (3회반복). 이후 디클로로메탄층은 농축하여 85% MeOH 메탄올(9.73 g)과 n-hexane (8.25 g)으로 다시 분획하였고, 물층은 동량의 n-BuOH을 첨가하여 n-BuOH (3.05 g) 과 물층을 (35.24 g)얻었다 (도 1 참조). 그중 85% MeOH 분획을 C18 역상컬럼을 이용하여 MeOH 과 물을 순차적으로 (50, 60, 70, 80, 90% aq. MeOH and 100% MeOH)첨가하여 분획하고 마지막으로 100% ethyl acetate를 용매로 하여 총 7개의 하부분획으로 나누었다. 그중 5번째 하부분획을 (1.506 g) 역상 중압력 액체크로마토그래피, MPLC (0-100 % MeOH gradient)를 이용하여 총 15개의 분획을 얻었다. 다음으로 고성능 액체크로마토 그래피 HPLC (YMC ODS-A, 87% aq. MeOH, 1 cm × 25 cm, 3 ml/min)를 이용하여 7번과 9번 분획에서 각각 물질 B(9.03 mg) 와 물질 C (5.32 mg)를 얻었다. 14번째 분획물을 고성능 역상 액체크로마토그래피를 이용하여 HPLC (YMC ODS-A column, 83% aq. MeOH, 0.46 cm × 25 cm, 1 ml/min)물질 A (8.25 mg)를 얻었다(도 2 참조).
시험방법
1. 세포배양
3-5 kDa의 키토올리고당(COS)은 Kitto Life Co. (Seoul, Korea)로부 터 입수하였다. 성인 피부의 진피로부터 분리한 인간 진피 섬유아세포(Human dermal fibroblasts; HDF)는 Promo cell (Heidelberg, Germany)로부터 구입하였다.
HDF 세포를 37℃, 5% CO2 대기 습도 하에서 10% 우태아 혈청(FBS), 2 mM 글루타민 및 100 ㎍/ml 페니실린-스트렙토마이신(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA)을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD USA)에 배양하였다. HDF 세포 (passage 2)를 6회의 추가 passage 동안 유지한 후 약 90-95% 밀도로 자랐을 때 트립신-EDTA 용액으로 분리하여 배양하였다.
2.
UV
-A 조사
HDF 세포를 37℃, 5% CO2 대기 습도 하에서 10% FBS, 2 mM 글루타 민 및 100 ㎍/ml 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 DMEM과 함께 1 x 105 cells/well의 밀도로 24-웰 플레이트에 접종하였다. 24시간 동안 배양한 후, 각 웰 의 200 μL 인산염 완충용액 식염수(PBS) 내에서 세포를 6 J/cm2 (365 nm UV-A 광원, Bio-Sun lamp, Vilber Lourmat, Marine, France)에서 UV-A 에너지에 노출시켰다. UV-A 조사 후에, 세포를 무혈청 DMEM에 배양하였다.
3.
MTT
검정
HDF 세포의 생존도 수준을 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸리움 브로마이드 (MTT) 를 불용성 포르마잔 산물로 전환시키는 미토콘드리 아의 능력을 통해 결정하였다. 세포를 1x104 cells/well의 밀도로 96-웰 플레이트에 배양하였다. 24시간 동안 배양한 후, 세포에 UVA조사 (6 J/cm2)한뒤 37 ℃, 5% CO2의 습도 대기 조건 하에서 크로멘 화합물시료와 함께 또는 크로멘 화합물 시료 없이 24시 간 동안 배양하였다. 상층액 배지를 제거하고 100 ㎕의 1 mg/ml MTT 시약을 각 웰에 첨가한 후 4시간 동안 배양하였다. 전환되지 않은 MTT를 제거한 후, DMSO (dimethyl sulfoxide)를 첨가하고 마이크로플레이트 판독기(Tacan Austria GmbH,Salzburg, Austria)를 사용하여 540 nm에서 OD(optical density)를 측정하여 세포 내의 포르마잔 양을 결정하였다. 상대적 세포 생존율을 대조군인 비처리 세포의 생존율에 대한 백분율로 계산하였다.
4.
광독성
측정
HDF 세포에 크로멘 화합물 화합물과 레티노익산을 각각 5, 10, 20 μM 및 1, 2, 5 μM 농도로 첨가후 UV-A를 조사한다. 이후 24 시간 후에 MTT 측정법으로 세포 생존률을 평가한다.
5.
UVA
를 조사한 세포의
세포내
ROS
소거능에
대한
크로멘
화합물의 효과
세포내 ROS 생성 수준을 산화-민감성 염료인 DCFH-DA (2',7'-dichlorofluorescin diacetate)를 사용하여 검출하였다. HDF 세포를 24시간 동안 96-웰 마이크로플레이트에서 배양한 후 UVA(6 J/cm2)에 노출시켰다. 노출된 세포를 크로멘 화합물 시료로 24시간 동안 처리한 후 PBS에 용해된 20 μM DCFH-DA를 처리하고 37℃, 5% CO2의 습도 대기 조건의 암실에서 30분 동안 배양하였다. 최종적으로, 세포를 PBS로 2회 세척하고 PBS에 용해된 DCF의 형광을 형광 마이크로플레이트 판독기(Tacan Austria GmbH, Salzburg, Austria)를 사용하여 485 nm의 여기 파장 및 535 nm 의 방사 파장에서 검출하였다.
6.
UVA
조사에 의한 세포막 단백질 손상
세포막에 있는 카보닐 그룹의 양은 세포막 단백질 손상정도를 측정하는 기준이 된다. HDF세포에 6 J/cm2 의 UV-A를 조사한 뒤 샘플을 처리하고 24시간 동안 세포를 배양한다. 24시간 뒤 세포를 PBS를 이용하여 세번 세척한 뒤 lysis buffer를 (25 mM Tris-HCl, pH 7.8, 2 mM EDTA,180 mM NaCl and 1% Triton X-100)이용하여 세포를 분해한다. 세포용리액을 1.5ml 튜브에 옮긴뒤 20%의trichloroacetic acid 400 μl를 첨가한뒤 3,000 rpm에서 15분간 원심분리 한다. 원심분리후 가라앉은 침전물에 2%의 2,4-dinitrophenylhydrazine 을 첨가한 뒤 상온에서 20분간 방치한다. 그런다음 20% trichloroacetic acid를 첨가하여 펠렛을 가라앉힌 후 가라앉은 펠렛을 ethanol: ethylacetate (1:1 v/v)용액을 이용하여 3회 반복세척한다. 그런 다음 침전물에 6 M guanidin hydrochloride (500 μl)를 첨가한뒤 37℃에서 15분간 방치하고 1,500rpm에서 5분간 원심분리한뒤 상등액을 이용하여 370 nm 에서 흡광도를 측정한다. 흡광도 측정은 GENios fluorescence microplate reader (Tecan Austria GmbH, Salzburg, Austria)를 이용하였다.
7. 세포막 지질과산화 측정
세포내 지질과산화 정도를 형광시약인 diphenyl-1-pyrenylphosphine (DPPP)를 이용하여 측정하였다. HDF세포를 형광을 측정할수 있는 microtiter 96-well 플레이트에 각 웰당 1 × 108 cells/ml 정도의 세포를 접종한 후 80% 정도 성장시킨다. 이후 6 J/cm2 의 UV-A조사 후 다양한 농도의 샘플을 처리하여 24시간 동안 배양한다. 그런 다음 세포를 PBS로 3회 세척후 13 μM DPPP를 (dissolved in DMSO)첨가한뒤 37℃ 에서 24시간동안 빛을 가린 뒤 배양한다. DPPP oxide형광강도는 GENios fluorescence microplate reader (Tecan Austria GmbH, Salzburg, Austria)를 이용하여(excitation wavelength (Ex): 361 nm, emission wavelength (Em): 380 nm) 측정하였다.
8.
세포내
GSH
함량 측정
세포내 글루타티온 (GSH)의 수준은 thiol-staining 시약인 monobromobimane를 이용하여 측정하였다. 세포를 형광을 측정할수 있는 microtiter 96-well plates에 5 × 103 cells/well정도로 세포를 배양한다. 그런다음 세포를 PBS를 이용하여 3회 세척후 6 J/cm2 의 UV-A 를 조사한뒤 샘플을 처리한다. 이후 0.04 mM의 Monobromobimane를 첨가후 37°C 에서 24시간동안 배양후 형광강도를 측정한다. 형광강도는 다음의 조건에서 (excitation and emission: 360 and 465 nm) GENios fluorescence microplate reader (Tecan Austria GmbH, Salzburg, Austria)를 이용하여 측정하였다.
9. 효소면역 정량 (
ELISA
)에 의한
MMP
,
cytokine
(
TNF
-α,
IL
-1β,
IL
-6),
Hyaluronan
,
collagen
농도 정량
UVA 조사후 세포내 다양한 콜라겐 분해 MMP 및 염증성 cytokine, 콜라겐 함량을 정량하기 위해 효소면역 정량법을 이용하였다. HDF 세포를 UV-A 조사 후에 FBS 없이 다양한 농도의 시료와 함께 배양하였다. 24시간 후에, HDF 세포의 상등액을 수집하여 MMP, cytokine, Hyaluronan, collagen 검정에 사용하였다. 이 검정은 Biotrak TM ELISA 키트(Amersham Pharmacia Biosciences), procollagen ELISA kit (TaKara Bio Inc), hyaluronan ELISA kits (R&D system) 를 제조업자의 지시에 따라 사용하였다.
10.
elastase
활성측정
Elastase 활성은 엘라스테이즈 기질인 STANA (N-succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide) 를 이용하여 측정하였다. 세포로부터 엘라스테이즈 효소의 분리를 위해 세포가 80% 이상 자랐을 때 phosphate-buffered saline (PBS)용액으로 세척하고, 스크래퍼를 이용하여 세포를 모은뒤 4°C, 1,000 rpm에서 5 분간 원심분리를 실시한다. 세포 침전에 0.1% Triton-X 100 이 첨가된 0.1 M TrisHCl (pH 7.6)버퍼를 첨가한뒤 5분동안 초음파 분쇄를 실시한다. 이후 2,000 rpm, 10 분간 원심분리 한후 상등액을 엘라스테이즈 효소 용액으로 한다. 간단히 100 μl의 엘라스테이즈 효소를 96-well plate에 옮긴뒤 15분간 37°C에 방치한다. 이후 2 μl의 62.5 mM STANA를 첨가하고 1시간동안 37°C에서 더 방치한다. 효소반응으로 생성된 p-nitroaniline 의 흡광도를 410 nm 에서 측정하고 효소활성은 unit/mg 단백질로 표시한다.
11. 면역염색법
면역염색법(immunostaining)은 여러 단백질의 혼합물로부터 어떤 특정단백질을 찾아내는 기법으로서 찾고자 하는 단백질에 대한 항체를 사용하여 항원-항체 반응을 일으킴으로써 특정단백질의 존재여부를 밝혀낸다. HDF 세포에 자외선 A 조사후 다양한 농도의 시료를 처리하고 24시간동안 배양한다. 배양된 세포에 2-3 두께로 4% formaldehyde를 첨가하고 15분간 실온에서 방치한다. 그런다음 PBS로 3회 세척하고 각각의 1차 표적항체를 이용하여 4°C에서 12시간동안 방치한다. 1차 항체 제거후 Hoechest 33342 (Sigma-Aldrich Co. MO, USA)과 fluorochrome-conjugated 2차 항체를 이용하여 2시간동안 실온에서 방치한다 (빛 차단). 세포의 형광이미지는 Leica invented microscopy (DM IRB)를 이용하여 40 X 배율로 디지털 CCD 카메라(CTR 6000, Leica, Wetzlar, Germany)를 이용하여 분석하였다.
12.
RT
-
PCR
분석
총 세포의 RNA를 Trizol 시약(Invitrogen Co., CA, USA)을 사용하여 분리하였다. 2 ㎍의 분리된 RNA를 올리고-(dT) 프라이머(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 표적 cDNA를 포워드 및 리버스 프라이머 서열을 사용하여 증폭시켰다. 그런 다음, 95℃에서 45초, 60℃에서 50초 및 72℃에서 60초의 사이클 30사이클 수행하여 증폭을 실시하였다. 증폭 단계 후에, 72℃에서 5분 동안 연속적으로 연장 단계를 실행하였다. PCR 산물을 100V에서 10분 동안 1.5% 아가로스겔 상에서 전기영동하여 분리하였다. 겔을 1 mg/ml의 EtBr로 염색한 후 AlphaEase겔 이미지 분석 소프트웨어 (Alpha Innotech., San Leandro, CA, USA)를 사용하여 UV 조명 하에서 사진 촬영하였다.
13.
웨스턴
블롯
분석
총 세포를 RIPA 완충용액(Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, USA)에 용균시켰다. 원심분리 후에, 세포 용균물의 총 단백질량을 Lowry method (BioRad Laboratories, Hercules, CA)을 사용하여 측정하였다. 동량의 단백질(15 ㎍)을 함 유하는 분취량의 상청액을 10% 또는 12% SDS-PAGE 겔에 전기영동하고 니트로셀룰로 스막 (Amersham Pharmacia Biotech., England, UK)으로 옮긴 후, 0.1% Tween 20 (TBS-T)을 함유하는 TBS에 용해된 5% 스킴밀크로 적어도 1시간 동안 차단시키고 일차 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc., CA, USA)와 혼성화시켰다. 모든 일차 모노클로날 항체를 1:1000 비율로 TBS-T로 희석시켰다. 결합된 항체를 실온에서 1시간 동안 호스래디쉬 퍼옥시다아제-결합 이차 항체로 검출하고 면역반응성 단백질을화학형광 ECL 검정 키트(Amersham Pharmacia Biosciences, England, UK)를 제조업자의 지시사항에 따라 사용하여 검출하였다. 웨스턴 블롯 밴드를 LAS3000 발광 이미지 분석(Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)을 사용하여 시각화하였다.
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실험예
1>
UV
-A 조사량 최적화
UV-A 조사에 대한 최적 에너지 레벨을 찾기 위해, 배양된 인간 진피 섬유아세포에 다양한 범위의 UVA를 조사하였다.
도 3에 나타난 것과 같이, 세포생존율 분석은 24시간 배양한 후 UV-A 를 조사한 세포가 현저히 손상되었다. 따라서, 배양시간은 24시간이 최적인 것으로 결정하였고, 그 보다 짧은 시간에서는 세포손상이 개시되지 않았고 반면에 48시간 배양한 경우에는 세포 손실이 발생한다. UV-A 조사량의 경우 세포생존율 분석은 6 J/cm2 이 최적 에너지 수치인 것으로 나타났다. 조사량이 6 J/cm2 보다 세포손상이 개시되지 않는 반면, 8 및 10 J/cm2조사시에는 최적 조사량에 비해 세포손상이 높아지고, 이에 현저한 세포손실이 없는 세포손상이 시작된다.
도 4는 진피 섬유아세포의 크기와 형태의 변화가 위상차 현미경으로 관찰한 것이다. UV-A 조사 후, 진피 섬유아세포를 혈청이 없는 DMEM 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 진피 섬유아세포의 몰폴로지 변화를 위상차 현미경 하에서 촬영하였다.배양된 진피 섬유아세포는 섬유아세포의 전형적인 몰폴로지인 연장된 형태(elongate shape)를 나타낸다. 상기 진피 섬유아세포는 정상 단일층 배양형을 나타내며, 접촉저지의 특성을 갖는다. 배양시간을 24 h로 하고, 몰폴로지 관찰 분석은 MTT assay의 결과를 더욱 지지하였다. 세포에 24시간 동안 연속적으로 UV-A 조사하고 몰폴로지의 변화를 기록하였다. 앞서의 결과와 마찬가지로 6 J/cm2 보다 적은 조사량에서는 소망하는 몰폴로지 변화가 유도되지 않았고, 8 및 10 J/cm2 에서는 예상보다 몰폴로지의 손상이 발생했다. 따라서, 6 J/cm2 이 최적의 UV-A 조사량이라고 결정하였다.
UV-A 조사에 의한 세포활성은 TNF-α, IL-1β 및 IL-6등의 사이토카인의 분비가 증가되는 결과를 나타낸다. 이에, 세포의 UV-A 조사 활성에 대한 최적 배양시간인 24시간 동안 앞서 언급한 사이토카인을 ELISA로 측정하였다. 세포에 6 J/cm2 의 양으로 지속적으로 UV-A 를 조사한 결과, 24시간 인큐베이션 전에는 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 분비량에 있어서 현저한 변화가 나타나지 않았다(도 5-7 참조). 그러나, 24시간 배양시 세포활성이 개시되면서 사이트코인이 분비되었다. 또한, UV-A 매개 유전자 발현에 있어서 최적의 시간을 결정하기 위해, MMPs 발현양을 웨스턴블롯 분석으로 시간의존적으로 비교하였다. UV-A 조사가 MMP 발현을 증가시키는 것으로 보고되었기 때문이다. 도 8에 나타난 것과 같이, MMP-1의 발현수치는 UV-A 조사 시간에 따라 점차적으로 증가하였다. 따라서, UV-A 조사에 의해 24시간 동안 활성화된 세포는 세포내 MMP 관찰의 최적 시간인 것을 알 수 있다.
이에, 본 실험에서는 UV-A 조사량을 6 J/cm2 로 하여 24시간 동안 배양하는 것이 분석에 최적 조건으로 판단하고 이하 별도의 언급이 없는한 동 조건으로 시험하였다.
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실험예
2>
UV
-A 유도된 진피 섬유아세포 생존율에 대한
크로멘
화합물의 보호효과
도 9에 나타난 것과 같이, 현저한 세포독성을 나타낸 화합물은 없었다. MTT 분석 결과를 통해 Sargassum horne에서 분리한 크로멘 화합물들이 in vitro 실험에 안전하다는 것을 확인하였다. 또한, UV-A 유도된 세포손상에 대한 화합물의 보호효과를 체크하였다. 그 결과 도 10에 나타난 것과 같이, 본 발명의 화합물들로 처리된 세포는 농도의존적으로 세포손상이 크게 보호되었음을 알 수 있다.
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실험예
3>
크로멘
화합물의
광독성
효과
크로멘 화합물들이 광독성 효과를 갖는지 여부를 확인하기 위해, 진피 섬유아세포의 세포 생존율을 MTT로 평가하였다. 도 11에 나타난 것과 같이, 어떤 화합물도 현저한 광독성을 나타내지 않은 반면, 레티노익산은 5 μM 의 농도에서 약간의 광독성을 나타냈다. 따라서, 1 μM 농도의 레티노익산을 이후 실험에서 양성 대조군으로 하였다.
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실험예
4>
크로멘
화합물의
UV
-A 조사로 발생한
세포내
ROS
생성의 금지 효과
크로멘 화합물의 세포내 라디컬 소거능을 시간과 농도 의존적으로 DCFH-DA 를 사용하여 측정하였다 (도 12-14). 배양시간 150 분까지 DCF 세포내 ROS 발생으로 인한 형광 강도의 점진적 증가가 관찰되었다. 본 발명의 크로멘 화합물 처치는 DCF 형광강도의 현저한 감소를 가져왔으며, 이는 세포내 ROS 형성에 대항한 소거능이 증가되었기 때문이다 (p<0.05). 크로멘 화합물들 중에서, UV-A 유도된 ROS 발생의 억제효능은 대조군 (UV-A 단독 처치군)에 비해 화합물 C가 가장 우수한 것으로 나타났다. 따라서, 크로멘 화합물로 인해 UV-A 조사에 의한 ROS 발생이 현저히 감소되었음을 알 수 있다.
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실험예
5>
세포막 단백질 산화 금지효능
산소 라디컬과 다른 활성산소종들은 단백질의 아미노산 변형에 의해 생겨나며, 이는 대체로 구조적 또는 효소적 단백질의 기능 변화에서 기인한다. 단백질 카르보닐은 단백질의 산화적 분해 또는 리신, 아르기닌, 프롤린, 및 트레오닌 잔류물의 직접적 산화에 의해 형성된다. 또한, 카르보닐기는 지질 과산화 동안 생성된 알데하이드(4-히드록시-2-노네날, malondialdehyde) 또는 환원당 반응의 결과로 발생한 반응성 카르보닐 유도체 또는 단백질의 리신 잔류물과의 산화물과의 반응에 의해 단백질로 도입될 수 있다. 카르보닐 잔류물은 2,4-DNPH (dinitrophenylhydrazine)과 반응하여 디니트로페닐히드라존을 발생시킴으로써 쉽게 관찰될 수 있다. 피부에서의 카르보닐기의 관찰은 반응성 산소-매개된 단백질 산화의 마커로 이용된다. UV-A 노출은 항산화 억제를 고갈시키고, 진피 섬유아세포에서 단백질 산화를 유도한다고 가정한다.
도 15에 나타난 것과 같이, 진피 섬유아세포막을 포함하는 반응 혼합물에 크로멘 화합물을 처치한 후 카르보닐기의 명백한 감소가 관찰되었다. 단백질 산화에 대한 금지능이 농도의존적 패턴으로 높게 나타났다. 크로멘 화합물들 중, 화합물 C가 UV-A 조사에 의해 유도된 세포막 단백질 산화 방지에 효과적인 것으로 나타났다.
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실험예
6>
크로멘
화합물의
UV
-A 조사로 유발된 세포막 지질과산화에 대한 보호효과.
크로멘 화합물의 존재 및 비존재에 따른 지질과산화 수치를 특정한 형광프로브인 DPPP를 이용하여 측정하였다(도 16). When the DPPP-부착된 섬유아세포에 UV-A 조사하였을 때, UV-A 매개된 세포막 지질과산화에 의해 DPPP 산화물로부터 유래한 형광 강도가 꾸준히 증가한다. 크로멘 화합물의 처치를 통해 형광강도의 농도의존적 감소가 나타났다. 이러한 형광강도의 감소를 UV-A 조사를 하지 않은 대조군(blank)과 비교한 결과, 크로멘 화합물이 세포막 지질의 산화에 대항하는 실질적 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 본 발명의 크로멘 화합물 중 화합물 A 및 C는 UV-A 조사에 의한 세포막 지질과산화 금지에 있어서 유사한 효과를 나타낸다.
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실험예
7>
크로멘
화합물에 의한
UV
-A 조사된 진피 섬유아세포에서
GSH
수준 증가
GSH 는 포유류 세포 내에 존재하는 가장 풍부한 저분자량 티올이고, 글루타티온 레벨은 세포내 산화환원 변화를 직접적으로 반영한다. 증가된 ROS와 세포내 항산화물질의 수치 사이의 관계를 조사하기 위해, 상기 세포내 GSH 수준을 측정하였다(도 17). 도 17에 나타난 바와 같이, 세포내 GSH 수준이 UV-A 조사된 것에 비해 본 발명의 화합물들이 존재하는 경우 현저히 증가하였다. 또한 레타노익산을 처치한 경우보다 본 발명의 크로멘 화합물의 GSH 수준이 더 높게 나타났다. 더욱이, GSH 이 크로멘 화합물의 처치에 의해 농도의존적으로 UV-A를 조사하지 않은 대조군(blank)의 수준에 도달하는 것으로 나타났다. 1 μM 농도의 레티노익산은 만족할만한 수준의 GSH 증가를 나타내지 않았다.
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실험예
8>
크로멘
화합물의
UV
-A 에 의한 염증성 사이토카인 생산 금지
UV-A 조사된 진피 섬유아세포에서 사이토카인 생산에 대한 크로멘 화합물이 효과를 조사하기 위해, 염증성 사이토카인 생산을 ELISA 를 이용하여 분석하였다 (도 18-20). 진피 섬유아세포의 UV-A 활성은 TNF-α, IL-1β 및 IL-6를 포함한 프로-염증성 사이토카인의 분비를 유도한다. 그러나, 크로멘 화합물로 처치함으로써 UV-A만을 조사한 군과 레티노익산을 처치한 군에 비해 분비수준이 감소되었다. 본 발명의 모든 화합물들은 대조군에 비해 상승된 사이토카인 분비를 감소시키는 효과를 나타냈다. 3종의 화합물들 중 화합물 C가 양성 대조군인 레티노익산에 비해 가장 활성이 우수하였다. 시험된 모든 사이토카인인, TNF-α, IL-1β 및 IL-6에 있어서, 화합물 C는 레티노익산과 유사한 효과를 나타냈다. 그러나, 화합물 C는 10 μM의 농도에서는 동일한 효과를 나타낸 반면, 레티노익산은 2 μM 의 농도에서 동일한 수준에서 사이토카인 분비가 감소되었다. 화합물 A 및 B는 사이토카인 분비가 약간 감소되었고, 화합물 C는 농도의존적으로 TNF-α 및 IL-1β의 분비를 현저한 수준으로 금지시켰다. 화합물 C는 10 μM의 농도에서 TNF-α 및 IL-6의 분비가 감소되었고, 이는 미처치군과 미조사군(blank)보다 낮은 수준이었다. 또한, 1 μM 의 화합물 C를 처치한 경우 증가된 IL-6 수준이 135 ρg/ml에서 115 ρg/ml으로 낮아진 반면, 레티노익산은 동일 농도에서 119 pg/ml 로 낮아졌다. 이 결과는 본 발명의 크로멘 화합물의 존재는 피부섬유아세포에 대해 UV-A 조사로 인한 염증성 사이토카인의 분비를 효과적으로 약화시킨다는 것을 의미한다.
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실험예
9>
크로멘
화합물에 의한 염증 반응 유전자 및 단백질 발현의 금지
UV-A 조사된 진피 섬유아세포에서 크로멘 화합물이 염증 반응 사이토카인 mRNA 전사 및 단백질 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해, 염증 유전자 및 단백질 수준을 각각 RT-PCR 및 Western blot 분석으로 측정하였다 (도 21, 22). TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 mRNA 전사 및 단백질 수준이 본 발명의 크로멘 화합물 처치로 인해 감소되었고, 이는 사이토카인 분비를 분석한 결과와 일치하며, 화합물 C가 가장 효과적인 것으로 나타났다. 다만, 화합물 A 및 B는 IL-1β 및 IL-6 발현 저해에 있어서는 화합물 C와 유사한 효과를 나타냈지만, TNF-α 의 발현은 저해하지 못하는 것으로 나타났다. 10 μM 의 화합물 C 의 유전자 및 단백질 발현의 저해 효과는 가장 높은 농도인 1 μM 레티노익산을 처치한 것과 유사하게 나타났다.
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실험예
10>
크로멘
화합물에 의한
UV
-A 유도된
히알루로난
분비의 금지
히알루로난 (또는 히알루론산, 히알루로네이트)은 세포외 기질의 주요 성분이고, 주로 조직 보수에 관련되어 있다. 히알루로난 분해는 피부가 과량의 UV 빛에 노출되었을 때 시작되며, 염증(화상, sunburn)이 생기며 피부 내 세포는 히알루로난 생산은 줄어들고 분해율은 증가한다
도 23에 나타난 바와 같이, 히알루로난 분비가 시간의존적으로 지속적으로 증가되었다. 또한 히알루로난 분비가 24시간을 지나면서 매우 크게 증가하였음을 확인하였다. 도 24에는 히알루로난 분비가 UV-A 조사에 의해 증가되는 것을 나타내는 한편, 그 수치는 본 발명의 크로멘 화합물 처치에 의해 감소되었음을 알 수 있다. 양성 대조군인 레티오닉산 1 μM 을 처치한 경우에도 히알루로난의 분비가 저지되었다. 따라서, 본 발명의 크로멘 화합물들이 UV-A 유발 히알루로난 분해를 방지하는데 효과적으로 이용될 수 있음을 알 수 있다.
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실험예
11>
크로멘
화합물의
UV
-A 조사로 유도된
히알루로난
합성효소의
mRNA
발현 저지 효과
히알루로난은 HAS1, HAS2 및 HAS3 등의 히알루로난 합성효소 (HASs)이라고 하는 막관통 단백질(integral membrane protein)군에 의해 합성된다. 히알루로난 합성효소의 저지는 UV-A 조사에 의한 피부손상을 방지하는데 효과적이라는 것이 알려져 있다 (Kakizaki et al., 2008).
도 25에 나타난 바와 같이, UV-A 조사 24 h 후 히알루로난 합성효소(HAS1, HAS2, HAS3)의 mRNA 발현수준은 현저하게 증가되었다. 이를 통해 진피 섬유아세포에서 크로멘 화합물의 처치로 히알루로난 합성효소의 mRNA 발현 수준이 저하되었다는 것을 알 수 있다. 또한, 히알루로난 합성효소의 제어를 통해 UV-A 조사에 의해 유도된 염증성 세포 손상을 방지하는 효과도 나타낸다.
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실험예
12>
크로멘
화합물에 의한 엘라스타아제의 저지
UV-A 조사에 의한 피부 엘라스틴의 손실은 주름을 만든다. 따라서, 본 발명의 크로멘 화합물들이 항-엘라스타아제 활성을 갖는지 여부를 조사하기 위해, N-Succ-(Ala)3-p-nitroanilide를 엘라스타아제 기질로 하고 p-nitroaniline 배출로 410 nm에서 흡수를 나타내는지 모니터링함으로써 저지능을 시험하였다. 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다. 본 발명의 화합물들 중, 화합물 C가 가장 우수한 엘라스타아제 저지능 (IC50 6.78 μM)을 나타냈으며, 이는 다른 두 화합물의 거의 두 배에 해당하는 값이고, 레티노익산의 경우에는 IC50 1.04 μM를 나타냈다.
| 엘라스타아제 억제 IC50 (μM ±SD) | |
| 화합물 A | 11.28 ± 0.13 |
| 화합물 B | 13.77 ± 0.13 |
| 화합물 C | 6.78 ± 0.12 |
| 레티노익산 | 1.04 ± 0.10 |
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실험예
13>
크로멘
화합물의
UVA
-유도 콜라겐 분해
MMP
분비의
저지능
콜라겐은 피부의 주요 성분으로서, 콜라게나아제 MMPs에 의해 분해된다는 것이 알려져 있다. MMPs 중에서 MMP-1, MMP-8 및 MMP-13는 콜라게나아제 군이고, triple-helical 섬유성 콜라겐을 분해할 수 있다. 피부 콜라겐의 손실은 주름 형성을 유발한다.
콜라겐을 분해하는 MMP 분비의 저지능에 대한 본 발명의 크로멘 화합물들의 효능을 조사한 결과가 도 26 및 27에 나타나 있다. 이들 도면에 따르면, MMP-1 및 MMP-13의 분비가 본 발명의 크로멘 화합물의 존재로 인해 감소하였다. 양성 대조군 레티노익산과 비교하여 세 화합물들 중 화합물 C의 활성이 가장 우수하게 나타났다. 화합물 A 및 B도 MMP-1 및 MMP-13 분비를 용량 의존적으로 현저히 감소시켰다. 더욱이, 화합물 C는 UV를 조사하지 않은 음성 대조군(blank)의 수준까지 MMP-1 및 MMP-13 분비를 저지시켰다. 이러한 결과를 통해 본 발명의 크로멘 화합물이 UV-A 조사에 의한 콜라겐 분해를 효과적으로 금지시킬 수 있음을 알 수 있다.
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실험예
14>
크로멘
화합물의 프로콜라겐 수치의 촉진 효과
본 실험에서는 UVA-조사된 배양 진피 섬유아세포에서 타입 I 프로콜라겐의 수준에 대한 본 발명의 크로멘 화합물들이 효과를 조사하였다. 그 결과, 타입 I 프로콜라겐 분비 수준은 농도 1 μM, 5 μM 및 10 μM 의 본 발명의 화합물 C의 존재 하에서 각각 81, 86 및 91 ng/ml를 나타냈다 (도 28). 항노화 특성을 나타내는 레티노익산 1 μM 은 MMP-1 발현을 감소시키고, 타입 I 프로콜라겐 수준을 60 ng/ml까지 증가시켰다. 본 발명의 화합물 C와 레티노익산을 비교하면, 화합물 C가 프로콜라겐 분비에 있어서 레티노익산 보다 더 효과적이었다. 따라서, 크로멘 화합물은 광 손상된 진피 섬유아세포에서 콜라겐 합성효소를 촉진시켜 콜라겐 분해를 보호하는 효과를 갖는다는 것을 알 수 있다.
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실험예
15>
크로멘
화합물의
UV
-A-유도된 콜라겐을 분해하는
MMP
발현에 대한 저지효과
UV-A 조사된 진피 섬유아세포에서 본 발명의 크로멘 화합물의 콜라게나아제 MMPs 발현에 대한 효과를 RT-PCR 및 Western blotting analysis으로 조사하였고, 도 29-32에 나타내었다.
그 결과, MMP-1, MMP-2, MMP-3 및 MMP-9 의 콜라게나아제 MMP 유전자 및 단백질 발현 수준이 본 발명의 크로멘 화합물의 처치로 인해 농도 의존적으로 감소되었다. 더욱이 이러한 콜라게나아제 수준은 TIMPs 유전자에 의해 제어되었다. TIMP-1 및 TIMP-2 유전자의 수준은 UV-A 조사에 의해 감소되지만, TIMPs 유전자의 수준이 본 발명의 크로멘 화합물의 처치로 인해 증가되었다(도 31 및 32 참조). 본 발명의 모든 화합물들이 효과적으로 MMPs 유전자 및 단백질의 발현수준을 감소시켰다. 특히, 화합물 C는 시험된 모든 MMPs 발현, 즉 MMP-1, MMP-2, MMP-3 및 MMP-9에서 레티노익산과 유사한 효과를 나타냈다. 이러한 결과에 따르면, 본 발명의 크로멘 화합물은 MMPs 발현을 저하시킴으로써 UV-A 유발된 콜라겐 분해를 방지할 수 있는 것을 알 수 있다.
<
실험예
16>
본 발명의
크로멘
화합물에 의한
UV
-A 조사된 섬유아세포에서 탄성 섬유의 발현 촉진
UV-A 조사된 진피 섬유아세포에서 탄력섬유 발현에 대한 본 발명의 크로멘 화합물의 영향을 평가하기 위해, 탄력섬유의 합성 마커를 각각 RT-PCR 및 Western blot analysis하였다 (도 33). 타입 I 콜라겐은 UV 노출에 의해 현저하게 분해됨으로써 피부 주름이 생성된다. 본 발명의 크로멘 화합물을 처치함으로써 콜라겐 타입 I 수치가 용량의존적으로 증가하였다. 또한, UV-A 만을 노출한 섬유아세포에서 프로콜라겐의 억제가 감소되었다.
엘라스틴의 발현 수준이 본 발명의 크로멘 화합물 처치로 인해 증가되었다. 또한, 콜라겐 타입 I 및 엘라스틴과 같은 탄력섬유 발현에 있어서 화합물 C 가 가장 우수한 활성을 나타냈다. 이러한 결과를 통해, 본 발명의 크로멘 화합물이 UV-A 유도된 탄력섬유 분해를 감소시킴으로써 엘라스틴 및 콜라겐 발현을 증가시켜 피부 탄력이 줄어드는 것을 방지할 수 있다는 것을 알 수 있다.
<
실험예
17>
본 발명의
크로멘
화합물에 의한
UV
-A에 의해 유발된
세포외
기질 성분의 분해 촉진 효능
UV-A에 노출되면 세포외 기질에서 콜라겐과 피브로넥틴의 분해가 유발됨이 알려져 있다. 이는, UV-A 조사에 의한 히알루로난 합성효소 1 의 수치증가에 기인한 것이다. 세포외 기질 성분의 UV-A 조사에 의한 분해에 대한 효과를 확인하기 위해, 면역 형광법을 수행하였다.
그 결과, 본 발명의 모든 화합물에서 UV-A 조사에 의한 콜라겐 분해가 방지되었다 (도 35). 특히 화합물 C는 가장 높은 방지효과를 나타내어 레티노익산과 대등한 수준이었다. 또한, 콜라겐 라벨링 분석에 따르면, 화합물 C는 피브로넥틴의 분해를 레티노익산과 같은 정도로 방지하였다(도 36). 또한, 히알루로난 합성효소 1의 양이 UV-A 조사에 의해 증가되지만 (도 37), 본 발명의 화합물 A, B 및 C에 의해 히알루로난 합성효소 1의 양이 감소되었다. 결론적으로, 본 발명의 모든 화합물은 콜라겐 및 피브리오넥틴 분해를 방지할 뿐 아니라 히알루로난 합성효소 1의 수준을 감소시킴으로써 UV-A 조사에 의한 세포외 기질의 분해를 방지하는 효과를 나타낸다.
<
실험예
18>
본 발명의
크로멘
화합물의
UV
-A 유도된
AP
-1
신호경로의
금지효능
본 발명의 크로멘 화합물의 노화 방지 프로파일 작용을 이해하기 위해, AP-1 활성을 평가하였다. AP-1는 MMP 전사를 유도함으로써, 프로콜라겐 유전자의 전사를 금지하는 것으로 알려져 있다. 즉, UV-A 조사에 의해 인간 진피 섬유아세포에서 c-Fos 및 c-Jun을 포함한 일부 AP-1 군이 발현된다.
도 57에 나타난 바와 같이, 본 발명의 크로멘 화합물은 UV-A 유도된 AP-1 활성을 억제할 뿐아니라, UV-A 유도된 c-Jun 및 c-Fos 단백질의 제어에 기여하는 것을 알 수 있다. 특히, 화합물 C는 UV-A 유도된 AP-1 활성에 대해 레티노익산과 유사한 효과를 나타낸다.
<
실험예
19>
크로멘
화합물의
UV
-A 조사에 의한
TGF
-β/
Smad
신호의
down
-
regulation
촉진
UV-A 매개된 콜라겐 합성의 저하는 TGF-β과 관련된 신호경로를 통해 일어난다. 주요한 사이토카인인 TGF-β는 콜레겐과 엘라스틴 같은 세포외 기질의 분화, 증식, 및 합성 촉진과 관련된 다양한 세포 작용을 제어하는 것으로 알려져 있다.
도 39에 나타난 바와 같이, TGF-β 발현은 본 발명의 크로멘 화합물의 존재 하에서 농도 의존적으로 현저히 증가되었으며, 이는 레티노익산 처치한 것과 비슷하게 나타났다. 또한, UV-A 노출된 진피 섬유아세포에서 관찰되는 Smads 단백질 발현에 대한 본 발명의 크로멘 화합물의 효과를 레티노익산 처치군과 비교하였다. 웨스턴 블롯 시험을 통해 UV-A 조사된 피부세포에서 본 발명의 크로멘 화합물 처치에 의해 Smad 2 및 Smad 3 단백질 수치가 현저하게 증가되었음을 확인하였다.
<
실험예
20>
본 발명의
크로멘
화합물에 의한
AP
-1 및
TGF
-β/
Samd
신호 경로의
UV
-A 의존적
제어능
앞서 살펴본 결과들은 본 발명의 크로멘 화합물이 노화 관련 유전자 발현의 제어를 통한 섬유아세포 손상을 감소시킨다는 것을 설명한다. 나아가 AP-1 및 TGF-β/smad 신호경로가 UV-A 미조사된 섬유아세포에서 크로멘 화합물에 의해 조절되는지 여부를 체크하였다.
도 40에 나타난 바와 같이, UV-A 노출을 하지 않은 경우에는 c-jun, c-fos, TGF-β, Smad 2 및 Samd 3 의 발현수준은 크로멘 화합물 및 레티노익산의 존재에 현저한 영향을 미치지 않는다. UV-A 조사에 의한된 진피 섬유아세포는 TGF-β/Smad 경로 요소들이 억제된 반면 AP-1 신호는 증가하였다. 그러나, 크로멘 화합물을 처치한 경우 TGF-β/Smad 신호는 증가하고, AP-1 translation은 감소되었다. 본 발명의 화합물들 중 특히 화합물 C가 TGF-β/smad 및 AP-1 관련 요소를 레티노익산보다 효과적인 방법으로 제어하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (8)
- 괭생이 모자반(Sargassum horneri) 유래의 사가크로메놀 E, 사가크로메놀 D, 및 이들의 혼합물 중에서 선택되는 크로멘(chromenes) 화합물을 유효성분으로 하는, 광노화 억제용 조성물.
- 제1항에 있어서,
자외선-A(UV-A)에 의한 피부주름을 개선시키는 것을 특징으로 하는, 광노화 억제용 조성물. - 제1항에 있어서,
콜라겐 합성을 촉진하고 콜라겐 분해를 억제하는 것을 특징으로 하는, 광노화 억제용 조성물. - 제1항에 있어서,
진피 섬유아세포에서 콜라게나아제, 엘라스테아제 및 기질 메탈로프로테아제(Matrix metalloproteinases)의 저해 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는, 광노화 억제용 조성물. - 제1항에 있어서,
AP-1 및 TGF-β/smad 신호경로 전사를 억제하는 것을 특징으로 하는, 광노화 억제용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 크로멘 화합물은 괭생이 모자반(Sargassum horneri)의 메탄올 조추출물의 유기용매 분획물로부터 얻는 것을 특징으로 하는, 광노화 억제용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 크로멘 화합물은 사가크로메놀(sargachromenol) D인 것을 특징으로 하는, 광노화 억제용 조성물. - 제1항에 따른 광노화 억제용 조성물을 포함하는 피부 주름 개선 및 예방용 화장료.
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-
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