KR20130138822A

KR20130138822A - 신규 재조합 항균 폴리펩타이드 약물의 제조방법

Info

Publication number: KR20130138822A
Application number: KR1020137026054A
Authority: KR
Inventors: 샤오칭 추; 롱퀴 리; 시앙리 장; 시아오펭 장
Original assignee: 크리에이티브 트리오 바이오테크 (베이징) 컴퍼니, 리미티드
Priority date: 2011-03-04
Filing date: 2012-03-01
Publication date: 2013-12-19
Also published as: EA201300884A1; NZ614593A; AP2013007193A0; CA2828998A1; AU2012225088B2; BR112013022333A2; KR101566331B1; EP2682474A4; CO6771436A2; ZA201306575B; EP2682474A1; EP2682474B1; CL2013002534A1; JP5916769B2; EA201300884A8; TW201239092A; MY169503A; US20160304927A1; TWI541351B; AU2012225088A1

Abstract

본 발명은 신규 항균 폴리펩타이드 약물의 제조방법을 제공하고, 주로 항균 폴리펩타이드의 대규모생산에 적합한 액체 생산 배지의 배합방법과 확대배양 파리미터의 최적화에 관한 것이다.

Description

신규 재조합 항균 폴리펩타이드 약물의 제조방법{PREPARATION METHOD OF NEW RECOMBINANT ANTIBACTERIAL POLYPEPTIDE MEDICINE}

본 발명은 항생제 약물의 생산공법에 관한 것으로서, 특히, 신규 재조합 항균 폴리펩타이드 약물의 제조방법에 관한 것이다.

사람들은 줄곧 신규 항생제의 개발에 주력해 왔고, 세균의 세포막에 이온통로를 직접 형성함으로써 세균의 사망을 유도하는 것은 비교적 전망이 밝은 항생제 개발 방향 중의 하나이다. 자연계에서 적지 않은 세균 독소가 바로 이러한 메커니즘을 통하여 세균을 죽이는데, 이의 기준 표본은 대장균(Escherichia coli)이 콜리신(colicin)이라는 독소 단백질을 분비하는 것이다. 1946년, 페니실린의 발명자인 H. Florey (British J. of Experimental Pathology. 1946 (27), 378~390.) 등은 콜리신의 항균 활성 및 안전성, 독성학에 대하여 상세한 평가를 진행한 적이 있다. 그들의 발견에 의하면, 콜리신은 항균 활성이 극히 강하여 추출물을 수백만 배로 희석하여도 매우 효과적인 항균효과가 있다는 것이다. 하지만 항균 스펙트럼(antimicrobial spectrum)이 특이하여 대장균 및 계통상 밀접한 그람 음성세균(gram-negative bacterium)에만 적용된다. 1953년, Jacob 등은 콜리신 Ia가 pH 6-7에서 강력한 살균기능을 가진다는 것을 발견하였다. 1978년 Finkelstein 등은 이온통로를 형성할 수 있는 콜리신 K가 인공 지질의 이분자막(bimolecular film) 상에서 전압 의존성 이온통로를 형성할 수 있다는 것을 발견하였다. 이에 의해, 근본적으로 세균 독소의 항균 메커니즘을 게시하였는 바, 즉 표적 세포막에 치명적인 이온통로를 형성하는 것이다. 1996년 Qiu와 Finkelstein은 콜리신 Ia가 인공 지질의 이분자막에서 형성되는 이온통로의 개방 및 밀폐 시의 막관통 입체구조를 게시함으로써 분자수준에서 신규의 항생제를 설계하고 제조하기 위한 이론적 기초를 마련하였다. 2001년 Qiu는 콜리신을 황색 포도상 구균 페로몬과 융합시켜 약제내성의 황색 포도상 구균에 대한 항균 조작 폴리펩타이드 약물을 제조하였다. 체내 및 체외 실험에 의하면, 상기 폴리펩타이드는 살균 활성 및 살균 선택성을 구비함을 증명할 수 있다. 동일한 방법에 따라, Qiu는 반코마이신 내성 장알균(vancomycin-resistant enterococci)과 페니실린 내성 폐렴 구균 각각에 대한 항균 조작 폴리펩타이드를 구축하였고, 체내 및 체외 실험에서 이러한 폴리펩타이드는 기존의 항생제로 대처하기 어려운 병원균에 대하여 특이적이고 안정적이며 빠른 살균효과를 나타냈고, 또한 이들의 약효는 반코마이신, 옥사실린(oxacillin), 페니실린 등 기존의 항생제에 비하여 수십배 심지어 수천 배에 달하는 약효를 나타냈다. 상응한 연구결과는 논문의 형식으로 <Nature Biotechnology> (21(12):1480-85, 2003), <Antimicrobial Agents and Chemotherapy> (49(3):1184-1189, 2005)등 국제학술지에 발표되었다.

본 프로젝트에서는, 콜리신과 병원균 항원에 대한 항체 모방체를 융합시킴으로써 항균 조작 폴리펩타이드를 구축하는 새로운 연구방향 및 기술노선을 제출하였고, 또한 항균 조작 폴리펩타이드인 광범위 항생제 페로몬 약물을 성공적으로 제조하였다. 본 발명자는 항균 폴리펩타이드 약물 분야에서 독특한 사고방향 및 이론적 혁신을 개척하였고 관련 특허를 출원하였으며 이와 동시에 소형 항체 모방체의 인공구축방법을 형성하였고 관련 연구결과는 <Nature biotechnology> (25(8):921-929, 2007)에 발표되었다. 본 프로젝트에서 연구 개발된 신규한 고효율의 광범위 항생제 페로몬 약물은 독특한 살균 매커니즘으로 인해 약물내성균에 대하여 양호한 살균효과를 지니며, 다제내성녹농균(MDRPA), 메티실린 내성 황색 포도 구균(MRSA), 반코마이신 내성 장알균(VRE) 등 약물내성균에 대하여 기존 항생제에 비하여 더욱 강력한 항균효력을 나타낸다. 상기 약물의 연구개발과 제조는 날로 심해지는 약물내성균주로 인한 일련의 치료문제 그리고 사람들의 신체건강을 확보하는데 중요한 역할을 발휘할 것이다.

본 프로젝트에서 연구한 광범위 항생제 페로몬 약물과 현재 국내외 학계에서 연구하고 있는 저분자 펩타이드(small peptide)계의 항생제(예컨대, 인간 퍼포린 및 누에 항균 펩티드)는 완전히 다른 두가지 물질이다. 이들의 구별점은, (1) 상기 항균 조작 폴리펩타이드는 그 원형 콜리신과 같이 모노머(monomer)구성으로 작업하는 바, 즉 1개 분자로도 하나의 완전한 작업단위를 구성할 수 있지만, 저분자 펩타이드계의 항생제는 폴리머(polymer)구성으로 작업하는 바, 즉 수십 개의 분자로 하나의 완전한 작업단위를 구성할 수 있다. (2) 상기 항균 조작 폴리펩타이드는 그 원형 콜리신과 같이 혈액순환 및 체내에서 작업할 수 있지만, 저분자 펩타이드계의 항생제는 그럴 수 없다. (3) 상기 항균 조작 폴리펩타이드는 그 원형 콜리신과 같이 표적 세포막에 전압 의존성 이온통로를 형성하는 바, 이의 살균 메커니즘과 효율성은 저분자 펩타이드계의 항생제의 표적 세포막에 통로를 형성하는 것에 비하여 훨씬 높다. 2010년까지의 본 분야의 관련 문헌에 대하여 검색한데 의하면, 동물 체내 실험 시 상기 저분자 항생제는 모두 하나의 치명적인 결함이 존재하는 것이다. 즉, 동물 체내의 단백질 분해효소에 의해 분해된다. 따라서, 저분자 펩타이드 항생제 약물 전구체로부터 개발된 약물이 임상시험에 통과된 사례는 아직 한 건도 없다. 그러나, 본 프로젝트에서 연구개발 및 생산한 항균 조작 폴리펩타이드 신약의 원형 자체는 동물 및 인체의 소화기관 세균과의 공생으로부터 산생된, 구조와 작용 메커니즘이 상기 저분자 펩타이드와 완전히 다른 박테리오신으로서, 8년이란 긴 시간 동안의 체내외 실험 중에서 시종 강력한 살균활성을 나타냈다. 또한 대형 동물(젖소, 젖염소 등)의 질환 모델시험에서 국소주사 및 정맥주사 모두 양호한 살균효과와 치료효과를 나타냈다. 따라서, 본 항균 조작 폴리펩타이드 신약은 상기 저분자 폴리펩타이드와 같이 체내에서 사용하기 어려운 국한성이 존재하지 않는다.

문헌 검색에 의하면, 현재 국외에서는 콜리신, 세균 신호전달 폴리펩타이드(Bacterial signal transduction peptide), 항체개조 등에 대하여 각각 상응한 연구가 진행된 바가 있지만, 본 프로젝트의 연구방향 및 기술노선과 유사한 연구활동을 그 어느 실험실에서도 진행된 적이 없고, 이와 관련된 유사한 문장의 발표도 발견되지 않았다. 2010년 6월 미국국가의학도서관(www.ncbi.nlm.nih.gov)에 의한 검색에 따르면, 현재 이미 등록된 콜리신(Colicin) 관련 문헌은 2,600여 편, 페로몬(Pheromone) 관련 문헌은 7,300여 편, 항체 개조(Antibody reconstitution) 관련 문헌은 2,100여 편, 면역독소(Immunotoxin) 관련 문헌은 3,800여 편, 항생물질 내성(antibiotic resistance) 관련 연구문헌은 94,000여 편이 있다. 이러한 정보원천으로부터 본 프로젝트의 과학적 구상, 설계이념 및 연구실천과 유사한 관련 보도가 발견되지 않았다. 2010년 6월, 중국 교육부 최신조사작업소(No.1)에 위탁하여 진행된 최신 조사에 의하면, 본 프로젝트 관련 인원의 보도외에, 국내외에서는 표적 세균 페로몬에 결합하는 콜리신 혹은 인공적으로 설계된 표적 세균 항체 모방체를 이용하여 표적 세균에 대한 항균 조작 폴리펩타이드 약물을 구축한다는 관련 보도가 발견되지 않았다. 또한 국내외에서는 본 프로젝트의 표적화된 항균 조작 폴리펩타이드 구축방법에 기반하여 생산된 감염 내성 세균의 인체용, 동물용 약물 및 농약의 관련 보도가 발견되지 않았다.

본 발명자는 이미 광범위 항생제 페로몬 약물을 실제 수요에 따라 동물약물(젖소 유방염의 치료약물) 및 인체약물(항생제)의 개발을 각각 진행하였다. 체내외 항균시험에 의하면, 상기 페로몬은 매우 강한 항균작용을 나타내고, 특히 체내의 항균효력은 체외의 항균효력보다 현저히 우수했다. 2010년 5월, 중국 농업부 수의약안전감독검사시험센터에 위탁하여 진행한 상기 약물의 안전성 평가에 의하면, 독성, 돌연변이 유발성, 기형 유발성 작용이 없음이 증명되었다. 이미 완성한 약물안전평가 결과는 하기와 같다.

① 랫트, 마우스의 급성독성시험결론에 의하면, 상기 약물은 실제상 독성이 없다(보고번호 WTPJ20100003);

② 쥐열병 살모넬라균 역 돌연변이(Ames) 시험결과는 음성으로서, 상기 약물이 돌연변이 유발성이 없음을 설명한다(보고번호 WTPJ20100003(2));

③ 마우스 골수세포 소핵 시험결과는 음성으로서, 돌연변이 유발성 작용이 없다(보고번호 WTPJ20100003(3));

④ 마우스 정자 기형 시험결과는 음성으로서, 마우스의 정자에 대한 기형 작용이 없다(보고번호 WTPJ20100003(4)).

⑤ 재조합 항균 폴리펩타이드 약물이 젖소 유방염 분리 병원균에 대한 체외 억제 및 살균 효과에 대해 시험되었고, 시험결과에 의하면,

A. 재조합 항균 폴리펩타이드 약물은 광범위 항생제 효과를 구비하고, 체외에서 각종 젖소 유방염 병원균에 대하여 양호한 억제 및 살균효과를 가진다.

B. 재조합 항균 폴리펩타이드 약물(발명 출원 명칭:신규 항생제 및 그 뉴클레오시드 서열, 제조방법과 응용, 출원번호 200910157564.5)은 포도상구균(황색 포도상 구균, 표피 포도상구균, 부생성 포도상구균, 스태필로코쿠스 시우리(Staphylococcus sciuri)에 대한 억제 및 살균작용이 가장 훌륭하며, MIC₅₀는 0.125㎍/mL에 달하고, MBC₅₀는 0.25㎍/mL에 달한다. 이와 대조되는 세파로신(2㎍/ml), 옥사실린(4㎍/ml), 페니실린, 암피실린, 린코마이신, 겐타마이신(모두 8 ㎍/ml이상）과 매우 현저한 차이를 보인다. 약물 분자량에 따른 표준화에 의하면, 폴리펩타이드(MW 70,000)는 시험대상 포도상구균에 대한 억제 및 살균작용은 세파로신(MW 523) 작용의 2100배에 달하고, 옥사실린(MW 423) 작용의 5300배에 달한다.

C. 재조합 항균 폴리펩타이드 약물이 연쇄상 구균, 화농성 아카노박테리아균, 대장균 등 장내 세균에 대한 억제 및 살균작용은 기본적으로 비슷하다. 연쇄상 구균(스트렙토코커스 아갈락티아(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 디스갈락티아(Streptococcus dysgalactiae), 스트렙토코커스 우베리스(Streptococcus uberis), 스트렙토코커스 보비스(Streptococcus bovis))에 대한 MIC₅₀은 1.0㎍/ml이고 MBC₅₀은 2.0㎍/ml이며, 화농성 아카노박테리아균에 대한 MIC₅₀은 0.25㎍/ml이고 MBC₅₀은 1.0㎍/ml이고, 대장균 등 장내 세균에 대한 MIC₅₀은 1.0㎍/ml이고 MBC₅₀은 1.0㎍/ml이다.

D 재조합 항균 폴리펩타이드 약물은 세균민감 균주와 내약 균주에 대한 억제 및 살균작용에서 현저한 차이가 없고, 각종 내약물성을 가지는 포도상구균, 연쇄상 구균 및 대장균에 대한 매우 효과적인 억제 및 살균작용을 가진다.

앞단계의 대형동물치료시험(젖소 유방염 실험성 치료시험)에서 112마리가 치유되었고 완치율은 95%에 달한다. 국가수의약안전평가센터의 검측에 의하면, 본 약물은 무독성 약물에 속하고, 동물에 대하여 독성 및 불량의 영향을 미치지 않으며, 아울러 상기 약물은 분해가능 페로몬 물질에 속하므로 가축질환치료 후 체내에 잔류하는 통상의 항생제의 폐단을 극복할 수 있다. 북경시 유제품풀질감독검사소의 검측에 의하면, 상기 약물을 통하여 치료된 젖소가 생산한 우유에 잔류의 항생제가 없다(검측보고번호 A2009-249).

하지만 상기 재조합 항생제의 생산에 있어서, 발명자의 앞서 제출된 출원번호가 200910157564.5이고 명칭이 "신규 항생제 및 그 뉴클레오시드 서열, 제조방법과 응용"인 발명 출원 명세서의 실시예 1에서 공개된 상기 항균 폴리펩타이드의 완정한 제조공법에 따르면, 재조합 플라스미드를 획득하고 적격세포(competent cell)로 형질전환시킨 후의 증균을 통하여 재조합 단백질을 발현유도하는 단계에서, 비교적 통상적인 증균공법을 사용하였다. 실험단계에서는 생산적 효율성 및 제조량에 대한 요구가 높지 않다. 하지만 이런 재조합 항생제는 임상시험, 동물시험 및 안전평가를 거침에 따라 이런 재조합 항균 폴리펩타이드의 의용가치가 확인되었고, 상기 발명출원 중의 제조공법을 사용할 경우 원가가 높을 뿐더러 또한 대량의 고순도의 재조합 단백질 발현물을 획득하기 어렵다. 따라서, 효과적인 규모화 개발 및 생산이 상기 약물의 실제적 응용에서 반드시 해결되어야 하는 문제로 되고 있다.

본 발명은 상기 분야의 공백 및 시급한 요구에 따라 상기 재조합 항균 폴리펩타이드의 제조방법을 제공한다.

재조합 플라스미드(plasmid)를 함유하는 대장균 균종을 제조하고 냉동 저장하는 단계(1)와,

액체 생산 배지를 사용하여 균종에 대하여 확대 배양시키는 단계(2)와,

균종을 유도하여 재조합 항균 폴리펩타이드를 발현하는 단계(3)을 포함하는 신규 재조합 항균 폴리펩타이드 약물의 제조방법에 있어서,

상기 액체 생산 배지의 배합방법에서, 각 성분의 최종 용액에서의 질량체적비는 인산수소이나트륨 0.4%-0.7%, 인산이수소칼륨 0.1%-0.6%, 염화암모늄 0.05%-0.2%, 염화칼슘 0.0005%-0.001%, 황산마그네슘 0.5%-2.5%, 펩톤 1%-3%, 효모분말 0.5%-1%, 포도당 0.1%-0.5%, 염화나트륨 0.2%-0.8%, 나머지는 물인 것을 특징으로 한다.

상기 액체 생산 배지의 배합방법에서, 각 성분의 최종 용액에서의 질량체적비는 인산수소이나트륨 0.68%, 인산이수소칼륨 0.3%, 염화암모늄 0.1%, 염화칼슘 0.001%, 황산마그네슘 0.02%, 펩톤 2.5%, 효모분말 0.75%, 포도당0.2%, 염화나트륨0.6%, 나머지는 물이다.

상기 균종에 대하여 진행되는 확대배양은 3개 단계의 확대배양으로 구분되고, 각 단계의 확대배양의 파라미터는 220rpm, 37℃, 3~8시간이다.

상기 균종을 유도하여 재조합 항균 폴리펩타이드를 발현시키는 것은, 단계(2)를 통하여 획득한 균액에 대하여 하기와 같은 처리, 즉 교반속도 220 rpm, 최대 산소함유량, 30℃, 2~4시간; 42℃, 0.5시간; 37℃, 1~2시간을 거쳐, 42℃에 도달할 시, 0.5mM의 최종 농도의 IPTG를 첨가하는 것을 의미한다.

상기 단계(2) 전에 균종에 대하여 하기와 같은 처리를 진행한다. 즉,

(1) 4℃에서 균종을 해동시키고, 220rpm, 37℃에서 50㎍/ml의 AMP를 함유하는 LB 액체 배지에서 밤새 회복시킨 후, LB 고체 배지에 도포하여 단일 콜로니(single colony)를 배양하고,

(2) 단일 콜로니를 선별하여 1.5ml의 LB액체 배지에서 220rpm, 37℃에서 5~8시간 동안 배양한 후, 100ml의 LB액체 배지로 옮겨 220rpm, 37℃에서 5~8시간 동안 배양하며,

상기 LB 배지의 성분 및 각 성분의 질량체적비는 염화나트륨 1%, 펩톤 1%, 효모 0.5%, 한천 0.8~1%, 나머지가 물이다.

상기 대장균은 재조합 플라스미드 pBHC-SA1, pBHC-SA2, pBHC-SA3, pBHC-SA4, pBHC-SE 혹은 pBHC-PA를 함유하는 조작된 대장균 BL-21을 의미한다.

발명자가 앞서 획득한 일련의 재조합 항균 폴리펩타이드에 기반하여, 본 발명은 재조합 항생제의 제조방법, 특히, 고순도의 재조합 항균 폴리펩타이드의 대규모 제조방법을 제공한다. 기존의 방법은 대규모 생산에 적합하지 않고, 대규모 생산 시 순도 혹은 생산량이 만족스럽지 못한 결함이 존재한다. 이는 발명자가 앞서 획득한 재조합 항균 폴리펩타이드를 임상응용과정에 추진시키는 과정에서 반드시 극복해야 하는 난제이다. 본 발명은 배지 성분에 대한 선택 및 최적화 조합을 통하여 대장균의 외부 유전자의 발현에 가장 적합한 배지 배합방법을 제공하였고, 가장 적합한 확대배양 파라미터를 선택함으로써 전체 제조과정이 밀접하게 연결되도록 하고, 또한 대규모 생산하에 재조합 항균 폴리펩타이드의 순도와 생산량의 모순을 완화시켰다. 이로써 발명자가 앞서 획득한 재조합 항균 폴리펩타이드의 대규모, 산업화 생산을 위하여 기초를 마련하였다.

도 1은 본 발명의 방법에 따라 제조한 항균 펩타이드와 AMP의 대조결과이다.
왼쪽에서 오른쪽으로 가는 순서에 따라:
CON: 3시간 후부터 혼탁하기 시작함.
AMP: 4시간 후부터 혼탁하기 시작함.
실시예 1에 따라 제조된 샘플: 194차수 단백질과 198차수 단백질은 27시간 후에도 여전히 맑음.
도 2는 다른 차수의 항균 조작 폴리펩타이드 순도시험이다.
스트립 1은 대조 마커(Marker)이고, 스트립 2는 120차수이며, 스트립 3은 122차수이고, 스트립 4는 126차수이며, 스트립 5는 246차수이고, 스트립 6은 247차수이며, 스트립 7은 248차수이고, 스트립 8은 250차수이며, 스트립 9는 252차수이다. 여기서, 120, 122, 126차수의 생산방법은 기존의 방법을 사용한 것이고, 246, 247, 249, 250, 252차수는 본 발명에 따른 새로운 방법을 사용하여 생산한 것이다.
도 3은 다른 생산규모하의 수율의 비교도이다.
왼쪽에서 오른쪽으로: 10차수의 연속 생산한 진탕 플라스크, 42L발효탱크, 200L발효탱크의 수율.

하기 일부 구체적인 재조합 항균 펩타이드로 본 발명의 제조공법에 대하여 설명하지만, 본 발명은 하기 재조합 항균 펩타이드의 제조에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 항대장균, 항황색 포도상 구균, 항표피 포도상구균, 항녹농균 항균 펩타이드의 제조공법

본 발명에 사용되는 배지:

(1) LB 액체 배지

100ml 염화나트륨 1g, 펩톤 1g, 효모 0.5g, 각종 시약을 취하여 250ml의 플라스크에 넣고, 100ml의 물을 첨가하여 시약이 용해되도록 한다. 고압 살균기 내에서 120℃로 8분 동안 살균한다.

(2) LB 고체 배지

100ml염화나트륨 0.5~1.5g, 펩톤 0.5~2g, 효모 0.3~1g, 한천 0.8~3g을 250ml의 플라스크에 넣고, 100ml의 물을 첨가하여 용해시키고, 8분 동안 120℃에서 고압살균시킨다. LB 고체 배지는 균종 회복 후 플레이트 배양에 사용된다.

(3) 생산 전용 배지(700 ml 20L 100L 200L)

각 성분의 최종 용액에서의 질량체적비는 인산수소이나트륨 0.4%~0.7%, 인산이수소칼륨 0.1%~0.6%, 염화암모늄 0.05%~0.2%, 염화칼슘 0.0005%~0.001%, 황산마그네슘 0.5%~2.5%, 펩톤1%~3%, 효모분말 0.5%~1%, 포도당 0.1%~0.5%, 염화나트륨 0.2%~0.8%, 나머지는 물이다.

본 발명의 바람직한 배합방법은 표1과 같다.

배지에 상응량의 물을 첨가한 후, 121℃에서 8분 동안 고온살균한다.

(4) 붕산 완충액 : 붕산 0.04M, NaCl 0.01M, 테트라붕산나트륨 0.04M, EDTA 2mM

배합 제조방법: 붕산 완충액 5L= A액 1L + B액 4L

A액(1L): 붕산 12.368g (0.2M), NaCl 2.925g (0.05M)

B액(4L): 테트라붕산나트륨 76.27g (0.05M),

A액 1L + B액 4L혼합, EDTA 2.9225g 추가, 최종농도는 2mM

단계1. 재조합 돌연변이 플라스미드 제조

출원번호가 "200910157564.5"이고, 명칭이 "신규 항생제 및 그 뉴클레오시드 서열, 제조방법과 응용"인 발명 출원 명세서의 실시예 1에 대한 기재내용을 참조하여, 재조합 돌연변이 플라스미드 pBHC-SA1, pBHC-SA2, pBHC-SA3, pBHC-SA4, pBHC-SE, pBHC-PA를 제조하여 획득한다.

단계 2. 적격세포 형질전환

6가지의 재조합 돌연변이 플라스미드 100 ng를 제조된 BL-21 조작 박테리아 적격세포 40 ㎕와 각각 5분간 냉처리한 후 42℃에서 30초 동안 열충격을 인가한다. 다음, 얼음 속에 2분 동안 방치하고, SOC배지 160 ㎕를 첨가하며, 220 rpm 및 37℃에서 1시간 동안 흔들어 플랭킹(planking)한다(LB배지에 1%한천, 50 ㎍/ml의 암피실린을 추가하고, 37℃에서 밤새 배양한다). 단일클론 클로니를 선별하여 증균함으로써 균종을 획득하고, 저온에서 균종을 보존한다.

단계 3. 균종 회복

1. 균종 회복

보존한 균종을 꺼내어 4℃에서 해동하고, 1.5ml를 취하여 10ml의 LB배지(AMP 50 ㎍/ml를 포함)에 첨가한다. 220rpm, 37℃에서 5~8시간 동안 배양한다.

2. 단일클론 클로니 접종

회복 후의 균액을 10⁴ 혹은 10⁵배로 희석한다. 희석 후의 균액 10㎕를 제조된 LB 고체 배지(AMP 50㎍/ml) 플레이트에 추가하여 플레이트를 도포한다. 습식박스에 넣고, 37℃ 항온 인큐베이터 내에서 10~12시간 동안 배양한다. 배지 표면에 원형의 단일 클로니가 생장한다.

3. 클로니 선별 및 클로니 확대

(1) 살균한 이쑤시개 혹은 클로니 접종용 루프를 사용하여 플레이트 상에서 규칙적인 원형을 구비하고 가장자리가 매끈한 단일 클로니를 선택하여 1.5ml의 LB배지에 넣어 진탕 배양하되, 220rpm, 37℃에서 5~8시간 동안 배양한다.

(2) 1.5ml의 LB균액을 100ml의 LB배지에 넣어 진탕 배양하되, 220rpm, 37℃에서 5~8시간 동안 배양한다.

(3) 1차 확대배양: 상기 단계의 100ml균액을 700ml의 생산전용 배지에 넣어 진탕 배양하되, 220rpm, 37℃에서 5~8시간 동안 배양한다.

(4) 2차 확대배양: 상기 단계의 700ml균액을 6×700ml의 생산전용 배지에 넣어 진탕 배양하되, 220rpm, 37℃에서 5~8시간 동안 배양한다.

(5) 3차 확대배양: 상기 단계의 6×700ml균액을 20L의 생산전용 배지에 넣어 발효탱크 내에서 배양하되, 교반속도220rpm, 최대 산소함유량, 37℃에서 3~5시간 동안 배양한다.

(6) 조작 박테리아 발효 및 단백질의 유도 발현: 상기 단계의 20L균액을 200L의 생산전용 배지에 넣어 발효탱크 내에서 배양하여 단백질을 유도 및 발현하되, 교반속도220rpm, 최대 산소함유량, 30℃에서 2~4시간 동안 배양하고, 42℃에서 0.5시간 동안 배양하며, 37℃에서 1~2시간 동안 배양한다. 주의: 온도가 42℃에 도달할 시, 0.5mM의 최종농도로 IPTG를 첨가한다.

4. 균체 원심분리 수거

배양액을 4℃에서 20분 동안 6000g에서 원심분리한다. 원심분리 후의 침전물을 수거하고, 50mM의 붕산 완충액(pH9.0)에 첨가하여, 균체가 붕산 완충액 속에서 현탁되도록 한다. 주의: 붕산 완충액 내에 2mM의 페닐메틸 설포닐 불소 세린(PMSF)단백질분해효소억제제를 추가한다. 균체가 현탁된 후의 조작은 반드시 4℃에서 진행해야 한다.

5. 균체 파쇄

균체가 PH9.0의 붕산 완충액 속에서 완전히 현탁된 후, 고압균질기를 사용하여 500~600bar 고압으로 균체를 파쇄한다. 7회 반복 파쇄하고, 매회 파쇄 간격은 3~5분이다.

6. 균체 DNA의 침전

파쇄 후의 균액을 4℃에서 40분 동안 55000g에서 원심분리한다. 상청액을 취하여 황산염 스트렙토 마이신(200ml 액체당, 16병의 100만단위의 황산염 스트렙토 마이신을 첨가)을 첨가하고 자기교반기를 사용하여 1시간 교반한다.

7. 투석

상기 단계의 균액을 4℃에서 20분 동안 55000g에서 원심분리한다. 상청액을 취하여 투석백에 넣고, 이를 붕산 완충액 속에서 8~12시간 동안 투석하며, 4시간마다 투석액을 한번씩 바꾼다.

8. 단백질약물 정제 및 항균 조작 폴리펩타이드 약물의 획득

투석 후의 균액을 4℃에서 20분 동안 55000g에서 원심분리한다. 상청액을 취하여 비커에 넣고, 이온교환법을 사용하여 단백질을 정제시킨다. 상청액을 취하여 CM이온교환칼럼에 샘플링하여 충분히 세척한 후 0.3 M NaCl를 함유하는 50 mM 붕산 완충액으로 용출하면 신규 항균 조작 폴리펩타이드를 획득할 수 있다.

실시예 2. 폴리펩타이드 약물의 세균억제시험

1. 100ml의 삼각플라스크에 10ml의 BM배지(미살균)를 넣고, 고압증기살균기로 121℃에서 8분(min) 동안 살균한다.

2. 무균실험대(clean bench)는 사전에 알콜로 깨끗이 닦아내고, 자외선램프를 사용하여 30분 동안 살균한다.

3. 각 100ml의 삼각플라스크에 3㎕의 밤새 배양된 황색 포도상 구균을 첨가한다.

4. 100ml의 삼각플라스크에 10㎕ 무균생리염수, 1㎕ 1mg/ml의 AMP 및 본 발명의 실시예1에 따른 방법을 사용하여 제조한 0.8mg/ml의 pBHC-SA1 폴리펩타이드 샘플125㎕를 각각 추가하고 표기를 한다.

5. 진동 인큐베이터에 넣어 37℃, 220rmp로 배양한다.

6. 3h, 6h, 9h, 12h, 24h시점에 혼탁상황을 관찰한다.

도 1에 도시된 바와 같이, 공백 대조군과 AMP는 3h 시점에 혼탁되고, 샘플은 9h 시점에 혼탁되지 않는다. 이는 제조된 샘플이 황색 포도상 구균을 효과적으로 억제할 수 있음을 설명한다. 왼쪽에서 오른쪽으로, CON: 3시간 후부터 혼탁하기 시작함; AMP: 4시간 후부터 혼탁하기 시작함; 실시예 1에 따라 제조된 샘플: 194차수 단백질과 198차수 단백질은 27시간 후에도 여전히 맑다.

실시예 2. 본 발명의 제조방법 및 기존 방법에 따라 제조된 항균 펩타이드 비교

본 발명의 실시예 1에 따른 방법과 기존방법(200910157564.5에 의해 공개된 방법)을 사용하여 동일한 생산규모로 제조하여 얻은 다른 차수의 항균 폴리펩타이드 pBHC-SA1을 폴리아크릴아미드겔에서 전기영동, 염색함으로써 산물의 순도를 비교한다. 결과에 의하면, 항균 조작 폴리펩타이드의 분자량은 대략 75000으로서, 실시예 1의 방법에 따라 생산한 폴리펩타이드가 위치한 채널 5, 6, 7, 8의 스트립은 상대적으로 단일하고, 채널 2, 3, 4 내에는 대량의 비교적 작은 분자량의 잡질스트립이 함유된다. 즉, 본 발명의 방법에 따라 생산한 폴리펩타이드의 순도는 현저하게 향상된다.

실시예 3. 생산 공법과정 개선

생산공법에 대한 부단한 개선 및 최적화를 거쳐, 생산규모도 끊임없이 확대되고 있다. 도 3에 도시된 바와 같이, 시험성 진탕플라스크 생산(8.4L)에서 42L 발효탱크 생산(25L), 나아가서 지금의 200L 발효탱크 생산(100L)까지, 생산규모의 확대는 수율에 영향을 미치지 않고, 항균 폴리펩타이드의 규모화, 산업화 생산을 위하여 기반을 마련하였다. 진탕플라스크에 의해 연속 생산된 10차수, 42L발효탱크에 의해 연속 생산된 10차수, 200L 발효탱크에 의해 연속 생산된 10차수의 생산량과 수율의 대조상황은 표 2 및 도 3을 참조한다.

표 2. 생산량과 수율

Claims

재조합 플라스미드(plasmid)를 함유하는 대장균 균종을 제조하고 냉동 저장하는 단계(1)과,
액체 생산 배지를 사용하여 균종에 대하여 확대 배양하는 단계(2)와,
균종을 유도하여 재조합 항균 폴리펩타이드를 발현시키고, 재조합 항균 폴리펩타이드를 분리 및 정제하는 단계(3)을 포함하는 신규 재조합 항균 폴리펩타이드 약물의 제조방법에 있어서,
상기 액체 생산 배지의 배합방법에서, 각 성분의 최종 용액에서의 질량체적비는 인산수소이나트륨 0.4%-0.7%, 인산이수소칼륨 0.1%-0.6%, 염화암모늄 0.05%-0.2%, 염화칼슘 0.0005%-0.001%, 황산마그네슘 0.5%-2.5%, 펩톤 1%-3%, 효모분말 0.5%-1%, 포도당 0.1%-0.5%, 염화나트륨 0.2%-0.8%, 나머지는 물인 것을 특징으로 하는 신규 재조합 항균 폴리펩타이드 약물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 액체 생산 배지의 배합방법에서, 각 성분의 최종 용액에서의 질량체적비는 인산수소이나트륨 0.68%, 인산이수소칼륨 0.3%, 염화암모늄 0.1%, 염화칼슘 0.001%, 황산마그네슘 0.02%, 펩톤 2.5%, 효모분말 0.75%, 포도당 0.2%, 염화나트륨 0.6%, 나머지는 물인 것을 특징으로 하는 신규 재조합 항균 폴리펩타이드 약물의 제조방법.
제1항에 있어서,
균종에 대하여 진행되는 확대배양은 3개 단계의 확대배양으로 구분되고, 각 단계의 확대배양의 파라미터는 220rpm, 37℃, 3~8시간인 것을 특징으로 하는 신규 재조합 항균 폴리펩타이드 약물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 균종을 유도하여 재조합 폴리펩타이드를 발현시키는 단계는 단계(2)를 통하여 획득한 균액에 대하여 하기와 같이 처리, 즉 교반속도 220 rpm, 최대 산소함유량, 30℃, 2~4시간; 42℃, 0.5시간; 37℃, 1~2시간을 거쳐, 42℃에 도달할 시, 0.5mM의 최종 농도의 IPTG를 첨가하는 것을 의미함을 특징으로 하는 신규 재조합 항균 폴리펩타이드 약물의 제조방법.
제1항에 있어서,
단계(2)에 따라 확대배양하기 전에 냉동 저장된 균종에 대하여 하기와 같이 처리하고, 즉
(1) 4℃에서 균종을 해동시키고, 최종 농도가 50㎍/ml인 AMP가 첨가된 LB액체 배지에 220rpm, 37℃에서 밤새 회복시킨 후, LB 고체 배지에 도포하여 단일 콜로니(single colony)를 배양하고,
(2) 단일 콜로니를 선별하여 1.5ml의 LB액체 배지에서 220rpm, 37℃에서 5~8시간 동안 배양한 후, 100ml의 LB액체 배지로 옮겨 220rpm, 37℃에서 5~8시간 동안 배양하며,
상기 LB 고체 배지의 성분 및 각 성분의 질량체적비는 염화나트륨 1%, 펩톤 1%, 효모 0.5%, 한천 0.8~1%, 나머지가 물인 것을 특징으로 하는 신규 재조합 항균 폴리펩타이드 약물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 대장균은 재조합 플라스미드 pBHC-SA1, pBHC-SA2, pBHC-SA3, pBHC-SA4, pBHC-SE혹은 pBHC-PA를 함유하는 조작된 대장균 BL-21을 의미하는 것을 특징으로 하는 신규 재조합 항균 폴리펩타이드 약물의 제조방법.