KR20130136759A - 동애등에 장 내 미생물 유래의 신규 베타-글루코시다제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 동애등에 장 내 미생물 유래의 신규 베타-글루코시다제, 상기 베타-글루코시다제를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다. 본 발명에 의한 재조합 베타-글루코시다제를 대량 생산하여 농업, 식품, 바이오연료 산업에 실질적으로 이용함으로써 경제성을 제고시킬 수 있다.

Description

동애등에 장 내 미생물 유래의 신규 베타-글루코시다제{Novel β-glucosidases derived from microbial in intestinal of blacksoldier fly}

본 발명은 동애등에(Blacksoldier fly: BSF) 장 내 미생물 유래의 신규 베타-글루코시다제, 상기 베타-글루코시다제 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다.

셀룰로오스(cellulose)는 지구상에 존재하는 가장 풍부한 유기물질로 석탄이나 석유처럼 고갈에 대하여 걱정할 필요가 없는 재생 가능한 자원이다. 또한 이들 자원은 농산 폐기물이 범람하는 현재에 있어 주요한 환경 오염원으로 작용하고 있다. 그러므로 이들 다당류에 대한 효율적인 당화공정의 개발은 식량, 에너지 환경문제에 큰 도움이 될 것으로 판단된다. 따라서 오랫동안 셀룰로오스를 당화시키기 위한 연구가 이루어져 왔으며, 이중 특히 당화효소의 개발에 초점을 맞추어 많은 연구가 이루어져 왔다. 그 결과 현재에는 많은 당화효소의 용도가 다양하게 개발되어 섬유, 세제, 사료사업 등에서 상업화가 이루어졌고 새로운 응용분야에 대한 연구도 활발하게 이루어지고 있다.

셀룰라아제는 복합효소로서 기질에 따른 가수분해 특성에 따라 엔도글루카나아제(endoglucanase， EG)， 엑소글루카나아제(exoglucanase， CBH) 및 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)의 3종으로 분류되는데， 섬유소의 분해에는 이들 세 종류의 효소가 관여한다고 얄려져 있다.

엔도글루카나아제는 셀룰로오스를 무작위로 공격하여 비환원성 말단기를 만드는데， 저분자량의 수용성 섬유소， 인산 가수분해된 섬유소 등은 쉽게 분해하나， 결정성 섬유소를 단독으로 분해하지는 못한다. 엑소글루카나아제는 섬유소 사슬의 비환원성 말단기를 공격하여 셀로비오스(cellobiose)를 생성시키며， 특히 기질이 결정상으로 존재할 때 이 효소의 존재는 커다란 의미를 갖는다. 즉，셀룰로오스의 분자는 많은 글루코오스가 탈수축합하여 셀로비오스 모양으로 결합하여 생긴 고분자로 추정되는데 이와 같은 결 합을 β-1，4-글루코시드 결합이라 한다. 마지막으로 베타-글루코시다아제는 저 분자량의 수용성 섬유소를 분해하여 글루코오스(glucose)를 생성한다. 셀룰라아제의 이러한 특성 때문에, 이를 이용하고자 다양한 생물체로부터 분리된 셀룰라아제 및 그 유전자가 보고되고 있다. 지금까지 셀룰라아제 및 그 유전자는 주로 세균과 곰팡이 등의 미생물로부터 분리된 것들이 많이 알려져 왔다

한국특허공개 제2004-0079249호

본 발명은 동애등에 장 내 미생물 유래의 신규 베타-글루코시다제, 상기 베타-글루코시다제를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명은 서열번호 3의 아미노산서열로 표시되는 베타-글루코시다제 단백질, 서열번호 4의 아미노산서열로 표시되는 베타-글루코시다제 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 핵산서열로 표시되는 베타-글루코시다제 유전자, 서열번호 2의 핵산서열로 표시되는 베타-글루코시다제 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 서열번호 2의 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명은 동애등에 장 내 미생물 유래의 메타게놈 유전자은행으로부터 종래의 기술로 배양하기 힘든 동애등에 장 내 미생물 유래의 신규 베타-글루코시다제 유전자를 발현할 경우에 수용성 베타-글루코시다제 효소의 생산성이 탁월하여 대량생산이 가능하며, 일부는 배양액으로 분비되는 특성이 있으므로 농업, 식품. 바이오 연료 등의 다양한 분야에서 상업적인 용도로 활용이 가능하다.

도 1은 DDGL7 글루코시다제의 아미노산 핵산서열과 BlastP 검색에서 유의성을 가진 것으로 보인 글루코시다제 계열 효소들과의 계통분석을 나타낸 것이다. 각 branch에 있는 숫자는 Bootstrap 분석치(1,000 resampling)이다(Bar, 0.2 substitutions per amino acid position).
도 2는 단백질 과발현용 신규 베타글루시코다제의 재조합 플라스미드(pEGL7과 pEGD7)의 제작도이다.
도 3(A)은 pEGL7과 pEGD7의 대장균에서의 이종 대량발현 및 정제 결과, 84 kDa의 목적단백질인 베타 글루코시다제가 과다 발현된 것을 나타낸 것이다. 도 3(B)는 시그날펩타이드가 제거된 pEGD7의 세포외 발현(배지내로 분비)을 확인한 것이다.
도 4는 pEGD7 발현 베타 글루코시다제의 최적 온도 및 pH 분석을 나타낸 것이다.
도 5(A)는 pEGD7 발현 DDGL7효소의 기질특이성을 나타낸 것이고, 도 5(B)는 pEGD7 발현 DDGL7효소의 금속이온, 유기용매, 여러 케미칼에 대한 pNPG 분해활성을 나타낸 것이다.
도 6은 pEGD7의 단백질 발현 및 Ni-NTA affinity 칼럼에 의한 신규 베타 글루코시다제 정제, 효소활성 및 생산성 분석 (LB배지 배양액 250ml 기준)을 나타낸 것이다.

본 발명은 동애등에 장 내 미생물 유래의 베타-글루코시다제 단백질을 코딩하는 유전자에 관한 것이다. 본 발명의 유전자는 베타-글루코시다제 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 핵산서열을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 베타-글루코시다제 유전자는 총 2319bp의 뉴클레오티드를 포함하며, 총 772개의 아미노산을 코딩하고 있다. 또한 본 발명에 따른 베타-글루코시다제 코딩 유전자의 아미노산 서열을 기존의 유전자 데이터베이스와 BlastP 검색한 결과, 본 발명의 유전자는 기존의 보고된 글루코시다제와 아미노산 수준에서 최대 72%의 상동성을 보여 신규 유전자로 밝혀졌다. 이 유전자를 'DDGL7'이라 명명하였다.

또한 상기 핵산서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로 상기 유전자는 서열번호 1의 핵산서열과 각각 70%이상, 80%이상, 90% 이상, 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 핵산서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 동애등에 장 내 미생물 유래의 베타-글루코시다제 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 베타-글루코시다제 단백질을 코딩하는 게놈DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 본 발명의 유전자는 서열번호 2로 표시되는 핵산서열을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 베타-글루코시다제 유전자는 이 효소의 N말단부 20개의 아미노산으로 이루어진 signal peptide를 코딩하는 부분을 제거한 총 2259bp의 뉴클레오티드로 구성되어 있으며, 총 752개의 아미노산을 코딩하고 있다. 이 유전자를 'DDGD7'이라고 명명하였다.

또한 상기 핵산서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로 상기 유전자는 서열번호 2의 핵산서열과 각각 70%이상, 80%이상, 90% 이상, 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 핵산서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

하기 표 1은 서열번호 1 및 2에 관한 것이다.

[표 1]

또한, 본 발명은 동애등에 장 내 미생물 유래의 베타-글루코시다제 단백질을 제공한다. 상기 동애등에 장 내 미생물 유래의 베타-글루코시다제 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명에 따른 베타-글루코시다제 단백질의 범위는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다.

상기 “기능적 동등물”이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 3로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 50%이상, 70%이상, 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 3로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. “실질적으로 동질의 생리활성”이란 생물체 내에서 가수분해 능이 우수한 베타-글루코시다제의 활성을 의미한다.

또한, 본 발명은 동애등에 장 내 미생물 유래의 베타-글루코시다제 단백질을 제공한다. 상기 동애등에 장 내 미생물 유래의 베타-글루코시다제 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명에 따른 베타-글루코시다제 단백질의 범위는 서열번호 4으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. 이는 서열번호 3의 베타-글루코시다제를 코딩하는 것으로 추정되는 유전자에서 세포외 분비와 관련하는 singnal peptide를 코딩하는 하는 부분을 제거하여 총752개의 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다.

상기 “기능적 동등물”이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 50%이상, 70%이상, 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 3로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. “실질적으로 동질의 생리활성”이란 생물체 내에서 가수분해 능이 우수한 베타-글루코시다제의 활성을 의미한다.

하기 표 2는 서열번호 3 및 4에 관한 것이다.

[표 2]

또한, 본 발명은 동애등에 장 내 미생물 유래의 베타-글루코시다제 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 대장균 발현 벡터 또는 효모 발현 벡터일 수 있으나, 이제 제한되지 않는다. 대장균 발현 벡터로는 pET21b 벡터를 예로 들 수 있으며, 효모 발현 벡터로는 pKBN-IFN벡터를 예로 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명은 DDGL7유전자를 단백질 발현벡터인 pET21b에 클로닝하여 재조합 벡터 pEG7을 제조하였다. 또한 본 발명은 DDGD7유전자를 단백질 발현 벡터인 pET21b에 클로닝하여 재조합 벡터 pEGD7을 제조하였다.

용어 “재조합”은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 제도입된 것이다.

용어 ”벡터”는 세포 내로 전달하는 DNA단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 “전달체”는 흔히 “벡터”와 호환하여 사용된다. 용어 “발현벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

본 발명의 유전자는 전형적으로 클로닝 또는 단백질발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한， 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예를 들면， pSC101， ColE1，pBR322， pUC8/9， pHC79， pGEX 시리즈， pET 시리즈 및 pUC19 등)， 파지(예를 들면， λgt4.λB， λ-Charon및 M13 등) 또는 바이러스(예를 들면， SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다. 한편， 본 발명의 유전자가 식물에 최적화된 코돈으로 전환하여, 식물 세포를 숙주로 하는 경우에는 당 업계에서 통용적으로 사용되는 벡터(예를 들면, pBI vectors, pCAMBIA vectors, pSB vectors)를 조작하여 제작될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다. 본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당 업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예를 들면 E. coli JM109， E. coli BL21， E. coli RR1， E. coli LE392， E. coli B， E. coli X 1776， E. coli W3110， 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)， 바실러스 츄런겐시스(Bacillus thuringiensis) 와 같은 바실러스 속 균주， 그리고 살모낼라 티피무리움(Samonella typhimurium)， 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens) 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다. 상기 숙주세포는 바람직하게는 대장균이다.

또한， 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서 효모， 곤충세포， 사람세포 (예컨대， CHO(Chinese hamster ovary) 세포주， W138， BHK， COS-7， 293， HepG2， 3T3， RIN 및 MDCK 세포주) 식물세포 등이 이용될 수 있으며， 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyce cerevisiae)일 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은， 숙주 세포가 원핵 세포인 경우， CaC 방법(Cohen， S.N. et al.， Proc. Natl. Acac. Sci. USA， 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Hanahan， D.， J. Mol. Biol.， 166:557580(1983)) 및 전기천공 방법(Dower， W.J. et al.， Nucleic. Acids Res.， 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시 될 수 있다. 또한， 숙주세포가 진핵세포인 경우에는， 미세주입법(Capecchi， M.R.， Cell， 22:479(1980))， 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham， F.L. et al.， Virology， 52:456(1973))， 전기천공법(Neumann， E. et al.， EMBO J.， 1:841(1982))， 리포좀-매개 형질감염법(Wong， T.K. et al.， Gene， 10:87(1980))， DEAE-텍스트란 처리법 (Gopal， Mol. Cell Biol.， 5:1188-1190(1985))， 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al.， Proc.Natl. Acad. Sci.，87.9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

상기 형질전환체를 이용하여 재조합 베타 글루코시다아제를 생산할 수 있으며， 그 방법은 형질전환체를 공지된 기술을 이용하여 재조합 단백질의 생산에 적합한 배지에서 배양한다. 예를 들어， 세포들은 적합한 배지와 단백질이 발현 또는 분리되는 것을 허용하는 조건 하에 실시된 실험실 또는 산업용 발효기에서 소규모 또는 대규모 발효， 쉐이크 플라스크 배양에 의해서 배양될 수 있다. 배양은 공지기술을 사용하여 탄소，질소원 및 무기염을 포함하는 적합한 배지에서 일어난다. 적합한 배지는 상업적으로 입수하거나 예를 들면， American Type Culture Collection의 카탈로그와 같은 간행물에 기재된 성분 및 조성비에 따라 제조할 수 있다.

상기 베타-글루코시다제는 목적 유전자에 의해 발현된 단백질을 당업계에 공지된 단백질 분리방법을 이용하여 회수할 수 있다. 예를 들어 단백질은 원심분리, 초음파파쇄, 여과, 추출， 분무 건조， 증발 또는 침전을 포함하는 통상적인 방법에 의해서 영양배지로부터 분리될 수 있지만， 이에 제한되는 것은 아니다. 더 나아가 단백질은 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환， 친화성， 소수성 및 크기별 배제), 전기영동， 분별염석(예를 들면 암모늄 설페이트 침전)， SDS-PAGE 또는 추출을 포함하여 공지된 다양한 방법을 통해서 정제될 수 있다.

이하， 본 발명을 실시 예에 의해 상세히 설명한다. 단，하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

1. 동애등에 메타게놈 은행 구축

동애등에의 유충은 국립농업과학원 곤충산업과에서 분양 받았다. 1,000여 마리 이상 유충으로부터 유충을 고정한 뒤 핀셋으로 장을 분리하였다. 분리한 장에서 장내 미생물을 분리하기 위하여 조직을 막자 사발에서 적절하게 파쇄한 뒤 percoll gradient 방식을 통하여 미생물을 분리하였다(Current Protocols in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratories Ed.). 분리한 동애등에 유충 장내 미생물로부터 메타게놈 라이브러리를 제작하기 위하여, 분리 정제한 전체 DNA를 1% Low-melting-point agarose gel에 CHEF DR-III전기영동 장치(Biorad사)에 6V/cm로 14℃, 120° 각도로 11초간 ramping 하여 13시간 전기영동하고 SybrGreen Gold Dye로 염색한 후 UV illuminator 상에서 확인하고 40 kb 이상의 DNA를 포함하는 agarose block 만을 자른 다음 agarase 효소를 넣어 1시간 동안 반응시킨 후 70℃에서 10분간 agarase를 비활성화시켰다. 여기에 에탄올로 침전, 세척하여 순수한 DNA를 분리하여 준비하였다. Fosmid library 제작은 정제한 장내 미생물 DNA 25 μl (5 μg)에 5 unit의 T4 polymerase (Takara Co.)와 2 unit T4 polynucleotide kinase (Takara Co.) 그리고 6 units의 Klenow fragment (Takara Co.)를 가한 후 반응액량을 50 μl로 조절한 후 37℃에서 30분간 반응시켜 DNA 말단을 평활화하여 제작하였다. 반응이 끝난 후 동량의 phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1,v/v/v)을 첨가하여 섞은 다음 10분간 원심분리하고 상등액을 모아서 동량의 chloroform/isoamylalchohol(24:1, v/v)을 첨가하여 혼합한 후에 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액만을 취하고 2.5배의 100% 에탄올을 넣어 1시간 동안 상온에서 방치한 다음 원심분리하여 상등액은 버리고 70% 에탄올로 DNA를 세척하여 DNA를 준비하였다. EpiFOS fosmid vector (pCC1/2, Epicentre, USA)에 end-repaired DNA를 첨가하여 16℃에서 16시간 ligation 반응시켰다.

In vitro packaging을 위해 16℃에서 16시간 반응한 시료들을 70℃에서 10분간 열처리하여 ligase 효소를 불활성화시켰다. Ligation한 반응액 7.5 μl에 MAX lambda packaging extracts kit (Epicentre, USA)의 extracts 25 μl를 넣어 pipette을 사용해 공기방울이 생기지 않게 조심스레 섞어 준 다음 30℃에서 1시간 30분간 반응시켰다. 여기에 다시 extracts 25 μl를 넣어 pipette을 사용해 공기방울이 생기지 않게 조심스레 섞어 준 다음 30℃에서 1시간 30분간 반응시켜 in vitro packaging을 수행하였다. SM 완충용액을 1 ml 첨가하여 위아래로 잘 섞어 준 다음 여기에 25 μl의 chloroform을 넣어 다시 packaging 되지 않은 물질들을 불활성화 시켰다. 원심분리를 조심스럽게 하여 정치한 다음 4℃에 보관하였고 상등액을 대장균에 형질전환하여 library로 사용하였다. 대장균에 클로닝된 유전자 형태로 구축한 메타게놈 유전자은행은 LB-Chloramphenicol-glycerol 배지를 기본배지로 하여 384-well plate에 개별 클론으로 접종하여 메타게놈 유전자은행을 작성하고 -70℃에 장기 보존하였다.

2. 동애등에 메타게놈 라이브러리 에서 베타글루코시다제 유전자 선발 및 신규성 분석

동애등에 장내 미생물 메타게놈 라이브러리로부터 셀루라아제 분해 클론을 선발하기 위해 선별 agar 배지(LB+0.5% carboxymethylcellulose)에서 28℃에서 5일간 배양하여 0.1% Congo red액에 10분간 염색시키고 이어서 1M NaCl로 수 차례 세척하여 콜로니 주변에 환이 생긴 즉 셀루라아제를 외부로 분비하는 클론을 선발하고 이로부터 Fosmid를 분리해 삽입단편을 확인하였다. 음성 반응 대조군으로 메타게놈 유전자은행을 구축한 대장균 숙주(host)에 fosmid 벡터만 들어간 것을 사용하여 동일한 조건에서 배양하여 background 시그널을 확인하였다.

상기 1의 제작된 메타게놈을 당 분해효소 유전자를 가진 것으로 추정되는 DDHC3클론을 기질이용 선택배지로 최종 선발하였으며, 이들에서 삽입 DNA단편(약 36kb)에 대한 염기서열 분석을 수행하였다. 양성을 보인 클론들에서 pUC-universal primer과 BigDye system을 사용하여 염기서열을 결정하여 분석하였다. Sequencing은 ABI BigDye-terminator (ver. 3.1)로 반응하였고, 사용한 PCR primer는 각 벡터에서 제공되는 5‘- 또는 3’-end universal primer를 사용하였다 (EpiCentre, USA). Sequencing PCR 반응은 DNA 4μl, BigDye 0.5μl, primer 3pmol, 5XBuffer 1.75μl, Sterile water 3.45μl를 넣고 94℃, 4min→[96℃, 10sec→50℃, 6 sec→60℃, 4min] X 25 cycle→4℃, Hold 방식으로 수행하였다. Dye peak가 분명하게 분리되는 약 500bp partial sequence를 이용하여 GenBank(National Center for Biotechnology Information)의 BlastX 알고리즘을 사용하여 가장 유사성이 높은 유전자를 검색하였다. 전체 염기서열은 VectorNTI 프로그램을 통하여 contig으로 작성하여 가수분해 효소 역할을 수행하는 ORF를 검출하였다. 검출된 ORF는 GenBank의 BlastX 알고리즘으로 검색하여 기능을 추정하였다.

이들 결과로부터 베타 글루코시다제로 추정되는 2319bp의 전사해독프레임 ORF(Open Reading Frame)을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이 전사해독 프레임을 DDGL7이라 명명하였다. 또한 GenBank의 BlastX 알고리즘으로 검색하여 기능을 추정하였다. 유연관계 분석은 Blast P검색을 사용하여 기존 보고된 베타 글루코시다제의 아미노산 배열에서 본 글루코시다제와 상동성이 높은 자료를 모으고 이를 MEGA 5.1과 ClustalX program으로 분석하였다. N-J법(neighbor-joining tree, NJ)으로 tree작성을 실시하여 비교하였으며, 분류군의 가지에 대한 Bootstrap 분석은 1,000회 반복법으로 실시하였다. 본 발명의 베타 글루코시다제는 비교적 독립된 클러스트에 위치함을 보여준다(도 1). 따라서DDGL7 이나 DDGD7글루코시다제가 아미노산 수준에서 최대 72%의 상동성을 보여 기존의 보고된 글루코시다제와는 다른 아직까지 전혀 알려지지 않은 미생물에서 유래한 신규한 글루코시다제임을 보여준다.

3. 베타 글루코시다제 유전자의 과다발현을 위한 형질전환체의 제조

본 발명의 베타-글루코시다제를 발현하는데 있어서, 상기 2의 DDGL7(핵산서열: 서열번호 1) 핵산서열에서 signal peptide가 포함된 원래유전자 DDGL7와 DDGL7의 N말단에서 signal peptide에 해당되는 20개의 아미노산이 결실된 DDGD7을 아래와 같이 프라이머를 디자인하여 중합효소 증폭반응을 통해 증폭하였다. 각각의 ORF만을 증폭하기 위하여 PCR primer를 제작하였고, fosmid/cosmid DNA를 template로 하여 HighPrime Taq polymerase (Takara, Japan)을 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 증폭된 산물은 각 ORF의 reading-frame에 따라 Hig-Tag을 가진 대장균 발현 벡터인 pET21b 에 frame 별로 directional in-fusion 하였다 (In-Fusion cloning kit, Clone Tech, USA). PCR 증폭산물이 발현벡터에 적절하게 삽입된 것은 junction 부위의 염기서열을 결정하여 확인하였다.

* pEGL7 (' With' the leader sequence , without TAA stop codon at the 3'- end )

Forward (SalI site included);

TCGAGCTCCGTCGACATGAAAAAAACGGTATTATTAATGG

Reverse (XhoI site included) ;

GTGGTGGTGCTCGAGCAAAACCGTGATAACCGTCT

* pEGD7 (' Without' the leader sequence , without TAA stop codon at the 3'- end )

Forward (SalI site included);

TCGAGCTCCGTCGACCAAACCAACAACGATATGAA

Reverse (XhoI site included);

GTGGTGGTGCTCGAGCAAAACCGTGATAACCGTCT

증폭된 단편들을 제한효소 SalI과 XhoI으로 절단한 후, 이와 동일한 효소로 절단된 pET21b벡터에 삽입, DDGL7과 DDGD7의 ORF(Open Reading Frame)를 pET21b(Novagene, USA)에 각각 클로닝하여 E. coli DH5알파의 competent cell에 형질전환하여 엠피실린이 함유된 배지(100ug/ml)에서 선발하고 이로부터 재조합 플라스미드(pEGL7 과 pEGD7)를 분리하였다. 이 플라스미드는 단백질과 발현 숙주세포인 E. coli BL21(DE3)에 재형질전환하고 이를 한국농용미생물센타에 기탁하여(2012. 5. 10일) KACC95119P(pEGL7)와 KACC95118P(pEGD7) 기탁번호를 부여 받았다. 이 균주는 글루코시다아제의 대량 발현 및 정제를 위한 균주로 사용하였다.

4. 재조합단백질(신규 베타-글루코시다제)의 발현 및 정제

pEGL7 및 pEGD7을 형질전환 시킨 E. coli BL21(DE3)를 250ml LB(Luria-Bertani, Gibco-BRL사) 액체 배지에 ampicillin(100 μg/mL)과 함께 접종하여, OD600nm값 0.6에서 0.5 mM IPTG(이소프로필-B-D-티오갈락토피라노시드)를 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 발현시킨 다음, 6,000 rpm, 10분간 원심분리후 cell pellet을 회수하였다. 여기서 효소가 균체 외로 분비되는가를 보기 위해 균체가 제거된 배양액은 암모늄설페이트 분말을 포화되도록(700g/리터) 서서히 실온에서 첨가하여 혼합해준다. 포화된 용액은 원심분리하여(6,000rpm, 10분) 그 침전물을 멸균증류수로 5ml 녹인 뒤 투석막(분자량 6,000 cut-off, 스펙트럼사) 에 넣고 증류수로 여러 차례 투석하고 그것을 활성 분석또는 SDS-PAGE의 시료로 사용하였다. 원심분리로 세포침전물을 제거한 cell lysate를 nickel-nitrotriacetic acid (Ni-NTA) agarose resin(Qiagen, Germany)에 binding 시킨 후, 동일한 완충액으로 2회 세척 하고, 100~250mM imidazole 함유 elution buffer로 6His-tagged protein을 용출하였다. 용출한 단백질은 dialysis buffer [20 mM Tris-HCl, pH 7.5]로 충분히 투석하여 사용하였다.

한편 회수된 균체는 Lysis buffer(20%(W/V) sucrose, 30mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0) 25ml로 현탁시키고 초음파로 파쇄(Pulse on 15초, Pulse off 30초, 3회 실시)하여 다시 원심분리(13,000×rpm, 10 min)하여 회수한 상등액을 조효소액으로 사용하고 이를 정제하기 위해서 Ni-NTA(Qiagen, Germany)10ml로 충진된 칼럼에 로딩하여 결합시키고 10 volume의 washing buffer (50mM NaH₂PO₄ (pH8.0), 300mM NaCl, 20mM Imidazole)로 씻어주고 단백질을 마지막으로 5 volume의 elutioin buffer(50mM NaH₂PO₄ (pH8.0), 300mM NaCl, 100mM Imidazole)로 용출시켜 순수 분리하였다(Qiagen U.S.A). 이들 분획은 분자량 10kDa 이상을 농축할 수 있는 Centrifugal filter(Amicon Ultracell -10K, Millipore Co.)을 이용하여 정제하였다. 최종 정제된 단백질은 활성 분석 또는 SDS-PAGE의 시료로 사용하였다.

효소활성은 50mM sodium phosphate buffer(pH 7.0)에 p-nitrophenyl-β-D-glucoside 를 10 mM이 되도록 각각 제조한 후, 10 μL의 기질용액에 조효소액이나 Ni-NTA칼럼으로 분획한 정제액을 각각 100배 희석한 시료10μL씩 첨가하여 55℃에서 60분간 반응시킨 후 1M Na₂CO₃ 용액 100 μL를 첨가하여 반응을 중지시켜 유리된 ρ-nitrophenol(pNP, Sigma, USA)의 양을 405 nm에서 흡광도로 측정하였다. 효소활성 단위는 1분 동안에 1 mole의 pNP를 유리시키는데 필요한 효소량을 1 unit로 정의하였다.

발현된 단백질은 SDS-PAGE(Lamni 법)에 의해 확인하였다. 상기의 분석 결과 pEGL7, pEGD7의 대장균에서 발현된 단백질은 SDS-PAGE(Lamni 법)에 의해 확인하였다. 상기의 분석 결과 pEGL7, pEGD7의 84 및 83kDa 크기의 재조합 단백질이 발현되었음을 확인할 수 있었다 (도 3: lane3, lane6). 또한, 이들 유전자의 발현 균주 배양액으로부터 암모늄설페이트 침전물을 비교하였다(도 3의 lane 4, lane 7). 83kDa 크기의 재조합 단백질이 발현되었음을 확인할 수 있었다(도 3: lane3, lane6). 또한, 제작된 발현벡터 pEGL7과 pEGD7를 대장균에 형질전환 유도 후, 암모늄설페이트 침전물을 비교하였다(도 3의 lane 4, lane 7). 그 결과 20 아미노산의 signal sequence를 제거한 pEGD7형질전환 대장균이 pEGL7형질전환주와 달리 세포외로 베타 글루코시다제를 분비함을 확인하였다. 즉, DDHC3 클론 내 베타 글루코시다제를 코딩하는 것으로 추정되는 유전자에서 세포외 분비와 관련하는 signal peptide 존재가 확인되었다. 상세하게는 예측한 베타-글루코시다제의 N말단 부위 약 20 아미노산의 signal sequence의 제거가 오히려 세포외 분비에 중요한 역할을 하고 있음을 확인시켜주는 것으로 판단된다. 균체의 경우에도 단지 초음파 처리에서도 DDGD-글루코시다제가 예측된 분자량 위치에 단백질 밴드가 진하게 나타나고 강한 활성을 보임으로서 이들이 과 발현에서 흔히 나타나는 불용성 단백질체(인글루전바디)가 전혀 형성되지 않은 매우 수용성이 높은 글루코시다제가 다량으로 발현됨을 확인하였다.

5. 신규 베타- 글루코시다제의 최적활성 조건과 열 안정성 분석

pH별 활성 측정에 사용된 버퍼는 pH 4~6, Sodium acetate; pH 6~7.5, Potasium phosphate; pH 7.5~9, Tris.Cl buffer를 사용하였다. 발현단백질을 pNP-베타-D-glucoside를 기질로 사용하여 각 온도와 pH별로 글루코시다제 활성을 측정하였다. pEGD7의 산물인 DDGD7 베타-D-글루코시다제는 55℃와 pH 7.0에서 최적 활성을 나타내었으며(도 4), 특이하게도 pH 9.0에서도 70% 이상의 활성을 유지하였다. 이 효소는 70℃이상의 고온과 산성 조건(pH 5이하)에서는 활성이 급속히 감소하였다.

또한 발현단백질을 pNP-베타-1,4-D-glucoside를 기질로 사용하여 각 온도(25℃, 35℃, 45℃, 55℃, 65℃)로 1시간 처리 후, DDGD7베타-D-글루코시다제는 55℃와 pH 7.0에서 시간별로 활성을 측정하였다. 이 효소는 35℃까지 열 안정성이 있으나 55℃에서는 급격히 열안정성이 감소됨을 보여주었다. 또한 35℃에서 시간별로 효소의 안정성 분석을 하였고, 이 분석의 조건은 55℃. pH 7.0에서 60분 반응 후 기질 pNPG에 대한 효소활성을 최적조건을 100으로 하고 상대적 활성을 나타내었다. 시간별로 효소안정성을 분석한 결과 이 효소는 14시간 반응에도 효소활성이 80%이상 유지하였으므로 이는 비교적 열에 안정함으로 비교적 산업적 응용에 유리한 것으로 기대된다(도 4).

6. 신규 베타글루코시다제의 기질 특이성 및 다양한 화합물에 대한 활성 영향 분석

상기 4에서 설명한 방법대로 이들 발현된 유전자의 산물인 효소의 활성과 기질특이성을 검정한 결과는 도 5에서 보는 바와 같다. 핵산서열 분석 상 글루코시다제로 추정되는 유전자(pEGD7)의 발현단백질의 활성 검정에서, 재조합단백질은 예상한대로 주 활성이 베타-1,4 D-글루코시다제 임이 최종 확인되었으며 이것이 베타-D-cellobiose, -cellotriose,-cellopentose의 베타 1,4 글루코시드결합과 sorphorose의 베타 1,2 글루코시드결합을 절단하여 이들을 글루코오즈로 분해하는 활성이 있음도 확인하였다. 그리고 천연 셀루비오즈계열이나 아릴 글루코시드 화합물의 활성은 환원당을 정량하는 Dinitrosalicylate (DNS) assay방법에 준해 행하였다. 먼저 환원당 정량에 사용될 DNS 시약은 NaOH (16g/L), 3,5-dinitrosalicylate (10g/L), sodium potassium tartarate (300g/L)을 함유하도록 제조하였다. 먼저 glucose solution을 이용하여 그린 표준곡선을 이용하여 정량분석 하였다. substrate 10mM, 정제된 DDGD-글루코시다제 17.7ug을 55℃에서 1시간 반응시킨다. 반응액 100ul와 DNS reagent 1,000ul을 혼합한 후 100℃에서 10분 동안 boiling한다. 10분 뒤 ice에서 즉각 냉각시킨 후, 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 상대활성은 셀루비오스를 100으로 하여 상대치를 나타냈다.

또한, 금속이온은 10mM, 기타 케미칼은 3%, 그리고 유기용매는 실온에서 1시간 노출 후 55℃. pH 7.0에서 60분 반응 후 기질pNPG에 대한 효소활성을 무처리를 대조구로 하여 상대적 활성을 분석하였다.

다양한 금속이온에 대한 이 효소의 활성도를 분석한 결과, 니켈, 구리, 철은 심각하게 활성을 저해하였고 마그네슘이나 망간은 오히려 10%정도 활성을 증가시켰다. 한편 유기용매나 다양한 케미칼에 대한 본 효소의 활성에 대한 영향을 분석한 결과, isopropanol에서 1시간 노출 시, 또는 3%의, DTT, urea 조건에서 오히려 활성이 약간 증가경향이 있는 반면에, 메탄올, 트윈계, 트리톤X-100, SDS, EDTA, 글리세롤에서는 심각한 활성 저해가 보였다. 보다 특기할 사항은 본 효소가 10mM글루코오즈에 의해 활성이 경쟁적으로 저해받지만 10mM 만노오즈에는 오히려 활성을 최대 60%까지 증가되는 사실을 관찰할 수 있었다. 이와 같이 본 발명의 신규 글루코시다제는 기존 보고된 것과는 매우 다른 생화학적 특성을 보이고 있다(도 5).

이외에도 화장품의 미백제로 사용되는 알부틴에 있는 글루코오사이드 결합도 절단함을 확인하였다(도 5). 본 발명의 베타 글루코시다제는 단지 글루코시드 결합에만 작용하는 기질특이성을 가지고 천연-글리코시드나 천연 아릴-글리코시드 화합물에도 우수한 활성을 보여 산업적 응용의 가치가 매우 기대된다고 할 수 있다. 또한 정제된 효소의 비활성(specific activity)은 약 180unit/단백질mg 이었다.

7. DDGD7 -베타 글루코시다제의 생산성 분석 및 경제적 가치

대장균(KACC95118P)에 의한 DDGD7-글루코시다제의 생산량과 총 효소활성을 보기 위해 250ml의 LB 배지에 OD600nm에서 0.6되도록 배양한 뒤 1mM IPTG로 4시간 동안 유전자를 발현유도하고, 그것의 세포잔사를 모은 뒤 Lysis buffer(20%(W/V) sucrose, 30mM Tris-HCl,1mM EDTA, pH 8.0) 15ml로 현탁시키고 초음파로 파쇄 (Pulse on 15초, Pulse off 30초 , 3회)하여 원심분리하였다. 그 상층을 단백질 정량하고 이를 Ni-NTA affinity column으로 결합시킨 뒤 20-100mM imidazole 완충액으로 용출하여 각 분획의 단백질 양과 효소활성을 분석하였다(도 6).

한편 단백질의 양을 측정하기 위해서 Bradford 분석법을 이용하였다. BSA(bovine serum albumin, New Englnad BioLab)를 표준품으로 이용하여 표준검량곡선을 작성한 후 측정하였다. 1:5 비율로 dilution한 protein assay dye reagent(Bio-Rad) 1ml에 시료 10ul를 상온에서 5분 동안 incubation 시킨 후, 595nm에서 흡광도를 측정하였다.

초음파처리로 파쇄된 수용성 단백질 총량에 목표된 효소의 정제도는 60%이상 이었으며 이를 정제한 분획(정제도 98%)에서는 specific 효소활성도가 180 unit/단백질mg 정도였다. 이는 통상적인 배양조건에도 리터당 정제 효소가 적어도 120mg, 총 20,000unit이상 생산되는 것으로 산정된다. 이는 대장균에서 기존의 어떠한 재조합 글루코시다제 보다도 탁월한 생산성을 보인 것이며 특히 숙주인 대장균에서 세포 외로도 수용성 효소를 분비하였기 때문에 생산단가를 획기적으로 절감할 수 있을 것이다. 이 효소는 식품 및 의약 산업의 적용 외에도 셀루로오즈로부터 에탄올의 생산에서 주요 3단계의 마지막 단계인 cellobiose에서 글루코오즈로 분해하는 핵심효소이므로 바이오연료의 실용화를 앞당기는데 기여할 것이다.

<110> Foundation of Agri.Tech. Commercialization & Transfer <120> Novel beta-glucosidases derived from microbial in intestinal of blacksoldier fly <130> p120283 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2319 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DDGL7 <400> 1 atgaaaaaaa cggtattatt aatggcagca actctcggca ttgcatcggg cggacaagct 60 caaaccaaca acgatatgaa caaacaagct atcgagatag tctctaaaat gacattgtcc 120 gagaaaatcg gtcaaatggc tcaggtaagt atagatgcag tctgcaaagg tgaggataca 180 cctccaacca gtactttaca actcgatatg gataaactgc gggatgtaat agtcaactac 240 cacgtaggat ctcttttgaa ttcgcccaat acacgtgcac gcactgctga atggtggaca 300 aatgttatca gccagattca ggacgtagca ttgaacgaaa ctcgtaccaa aatacccgta 360 atatacggac tcgatcaaat tcacggggca acttatacag caggatcaac tatgtttccg 420 caggagattg cattagctgc cacatggaat ccttcccatg ctaagaaaat gggagaaatc 480 acagcctatg aaacccgtgc gagtaatgtg ccttggaatt tttcaccggt acttgatctg 540 ggtatcgatc cacgctttcc tcgtcaatat gagggattcg gcgaagatcc ttatatcggg 600 tcggtattcg ggtatcaact aatcaaaggg tatgagggcg atgataataa cgtaggcaat 660 cccaataaat tggctgcttg catgaaacat tttatcggtt actctgctcc aatcagcggt 720 aaagaccgca cacctgctta tatacctcaa tcggctttaa tggaatacca tgtacctgct 780 ttcaaagctg ctattgatgc aggagtgcat acggtaatga ttaattcggg tattatcaac 840 ggagagcccg tacatgccag ttacgacctt ttgacaaaac tgcttcgtaa cgatttaggt 900 tttgacggga tgatcgttac cgattgggaa gacatcaaca aattatactc gcgtgaccgc 960 atggttccaa acatcaaaga ggctattaag gtgagtataa atgcaggagt cgatatgtcg 1020 atgattcctt acgattacaa agaattctgc actctattga cggagttggt aaacgaagga 1080 caagtgccca tgtcacgcat cgacgatgct gcacgaaggg tcgtattatt gaagctgcaa 1140 ctcgacttgt tcgatacacc taatacatat cgcaaagact atcctcaatt cggatctaaa 1200 gaatttcaac aggcttcgta tgatgcggcg gcagatgcta ttacgctgct gaaaaatgac 1260 aataatatac ttcctctcca gaaaggtgct aaaatattgg tatcgggtcc taatgctgtc 1320 agcaaaagat cgctaaacgg aggatggaca ttctcttggc aaggtgaaaa aattgatgaa 1380 ttcgcaagtg aatatagtaa cctgctggac gctattaccc atacgtatgg caaagaaaat 1440 gtttcatatg ttccgggtgt aagctatacg gcggcaactg aatatgcaac ggaacataaa 1500 gaccgttttg atgaagctat tgaggctgct aaaaatgcag attatattat cttatgcttg 1560 ggtgaaaatt cgtattgcga aaaaccagga gacttggatg acttgtattt aaatgatctt 1620 caaacagaac tggctaaaga gttcctcaaa acaggcaaaa aagtaattct tgttttgagt 1680 gaaggaagac ctcgtgtgat ctctaaaata tcttctcagg tagatgctat cgttcaaacc 1740 tatcttccgg gaatttttgg tgcggatgct ttggcggatg tattggttgg caaagtaaat 1800 ccttcgggaa aattacctta tacataccct gcattcccta actcattggt gccttattat 1860 cataaacatt cggaagagca aaagagaagc gaaggtgttt acaattacga aggagacttc 1920 aaccccgaat accacttcgg ctttggattg agttatacga cattcgatat atcgaacctg 1980 aaaataaaca aaacgtcttt tgccaataat ccgaaagagg aaattattgt ttcggtagat 2040 gtaaagaaca caggaaatgt agaaggtaaa gaagtaattc aactttattc gagcgattta 2100 tttgcaagcc ttgttcctga tgtgaaaaga ttgcgtcgat tcgagaaagt atctcttaaa 2160 gcaggtgagt ctaaaaccgt aacattcaag ttgacattgg atgatctggc tttctacaat 2220 ctgaaaagtg agagagtaat cgaagccgga gattttgagc tgcaagtagg ttcatcatcc 2280 aatgatatta aagaaaagac ggttatcacg gttttgtaa 2319 <210> 2 <211> 2259 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DDGD7 <400> 2 caaaccaaca acgatatgaa caaacaagct atcgagatag tctctaaaat gacattgtcc 60 gagaaaatcg gtcaaatggc tcaggtaagt atagatgcag tctgcaaagg tgaggataca 120 cctccaacca gtactttaca actcgatatg gataaactgc gggatgtaat agtcaactac 180 cacgtaggat ctcttttgaa ttcgcccaat acacgtgcac gcactgctga atggtggaca 240 aatgttatca gccagattca ggacgtagca ttgaacgaaa ctcgtaccaa aatacccgta 300 atatacggac tcgatcaaat tcacggggca acttatacag caggatcaac tatgtttccg 360 caggagattg cattagctgc cacatggaat ccttcccatg ctaagaaaat gggagaaatc 420 acagcctatg aaacccgtgc gagtaatgtg ccttggaatt tttcaccggt acttgatctg 480 ggtatcgatc cacgctttcc tcgtcaatat gagggattcg gcgaagatcc ttatatcggg 540 tcggtattcg ggtatcaact aatcaaaggg tatgagggcg atgataataa cgtaggcaat 600 cccaataaat tggctgcttg catgaaacat tttatcggtt actctgctcc aatcagcggt 660 aaagaccgca cacctgctta tatacctcaa tcggctttaa tggaatacca tgtacctgct 720 ttcaaagctg ctattgatgc aggagtgcat acggtaatga ttaattcggg tattatcaac 780 ggagagcccg tacatgccag ttacgacctt ttgacaaaac tgcttcgtaa cgatttaggt 840 tttgacggga tgatcgttac cgattgggaa gacatcaaca aattatactc gcgtgaccgc 900 atggttccaa acatcaaaga ggctattaag gtgagtataa atgcaggagt cgatatgtcg 960 atgattcctt acgattacaa agaattctgc actctattga cggagttggt aaacgaagga 1020 caagtgccca tgtcacgcat cgacgatgct gcacgaaggg tcgtattatt gaagctgcaa 1080 ctcgacttgt tcgatacacc taatacatat cgcaaagact atcctcaatt cggatctaaa 1140 gaatttcaac aggcttcgta tgatgcggcg gcagatgcta ttacgctgct gaaaaatgac 1200 aataatatac ttcctctcca gaaaggtgct aaaatattgg tatcgggtcc taatgctgtc 1260 agcaaaagat cgctaaacgg aggatggaca ttctcttggc aaggtgaaaa aattgatgaa 1320 ttcgcaagtg aatatagtaa cctgctggac gctattaccc atacgtatgg caaagaaaat 1380 gtttcatatg ttccgggtgt aagctatacg gcggcaactg aatatgcaac ggaacataaa 1440 gaccgttttg atgaagctat tgaggctgct aaaaatgcag attatattat cttatgcttg 1500 ggtgaaaatt cgtattgcga aaaaccagga gacttggatg acttgtattt aaatgatctt 1560 caaacagaac tggctaaaga gttcctcaaa acaggcaaaa aagtaattct tgttttgagt 1620 gaaggaagac ctcgtgtgat ctctaaaata tcttctcagg tagatgctat cgttcaaacc 1680 tatcttccgg gaatttttgg tgcggatgct ttggcggatg tattggttgg caaagtaaat 1740 ccttcgggaa aattacctta tacataccct gcattcccta actcattggt gccttattat 1800 cataaacatt cggaagagca aaagagaagc gaaggtgttt acaattacga aggagacttc 1860 aaccccgaat accacttcgg ctttggattg agttatacga cattcgatat atcgaacctg 1920 aaaataaaca aaacgtcttt tgccaataat ccgaaagagg aaattattgt ttcggtagat 1980 gtaaagaaca caggaaatgt agaaggtaaa gaagtaattc aactttattc gagcgattta 2040 tttgcaagcc ttgttcctga tgtgaaaaga ttgcgtcgat tcgagaaagt atctcttaaa 2100 gcaggtgagt ctaaaaccgt aacattcaag ttgacattgg atgatctggc tttctacaat 2160 ctgaaaagtg agagagtaat cgaagccgga gattttgagc tgcaagtagg ttcatcatcc 2220 aatgatatta aagaaaagac ggttatcacg gttttgtaa 2259 <210> 3 <211> 772 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DDGL7 <400> 3 Met Lys Lys Thr Val Leu Leu Met Ala Ala Thr Leu Gly Ile Ala Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gln Ala Gln Thr Asn Asn Asp Met Asn Lys Gln Ala Ile Glu 20 25 30 Ile Val Ser Lys Met Thr Leu Ser Glu Lys Ile Gly Gln Met Ala Gln 35 40 45 Val Ser Ile Asp Ala Val Cys Lys Gly Glu Asp Thr Pro Pro Thr Ser 50 55 60 Thr Leu Gln Leu Asp Met Asp Lys Leu Arg Asp Val Ile Val Asn Tyr 65 70 75 80 His Val Gly Ser Leu Leu Asn Ser Pro Asn Thr Arg Ala Arg Thr Ala 85 90 95 Glu Trp Trp Thr Asn Val Ile Ser Gln Ile Gln Asp Val Ala Leu Asn 100 105 110 Glu Thr Arg Thr Lys Ile Pro Val Ile Tyr Gly Leu Asp Gln Ile His 115 120 125 Gly Ala Thr Tyr Thr Ala Gly Ser Thr Met Phe Pro Gln Glu Ile Ala 130 135 140 Leu Ala Ala Thr Trp Asn Pro Ser His Ala Lys Lys Met Gly Glu Ile 145 150 155 160 Thr Ala Tyr Glu Thr Arg Ala Ser Asn Val Pro Trp Asn Phe Ser Pro 165 170 175 Val Leu Asp Leu Gly Ile Asp Pro Arg Phe Pro Arg Gln Tyr Glu Gly 180 185 190 Phe Gly Glu Asp Pro Tyr Ile Gly Ser Val Phe Gly Tyr Gln Leu Ile 195 200 205 Lys Gly Tyr Glu Gly Asp Asp Asn Asn Val Gly Asn Pro Asn Lys Leu 210 215 220 Ala Ala Cys Met Lys His Phe Ile Gly Tyr Ser Ala Pro Ile Ser Gly 225 230 235 240 Lys Asp Arg Thr Pro Ala Tyr Ile Pro Gln Ser Ala Leu Met Glu Tyr 245 250 255 His Val Pro Ala Phe Lys Ala Ala Ile Asp Ala Gly Val His Thr Val 260 265 270 Met Ile Asn Ser Gly Ile Ile Asn Gly Glu Pro Val His Ala Ser Tyr 275 280 285 Asp Leu Leu Thr Lys Leu Leu Arg Asn Asp Leu Gly Phe Asp Gly Met 290 295 300 Ile Val Thr Asp Trp Glu Asp Ile Asn Lys Leu Tyr Ser Arg Asp Arg 305 310 315 320 Met Val Pro Asn Ile Lys Glu Ala Ile Lys Val Ser Ile Asn Ala Gly 325 330 335 Val Asp Met Ser Met Ile Pro Tyr Asp Tyr Lys Glu Phe Cys Thr Leu 340 345 350 Leu Thr Glu Leu Val Asn Glu Gly Gln Val Pro Met Ser Arg Ile Asp 355 360 365 Asp Ala Ala Arg Arg Val Val Leu Leu Lys Leu Gln Leu Asp Leu Phe 370 375 380 Asp Thr Pro Asn Thr Tyr Arg Lys Asp Tyr Pro Gln Phe Gly Ser Lys 385 390 395 400 Glu Phe Gln Gln Ala Ser Tyr Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ile Thr Leu 405 410 415 Leu Lys Asn Asp Asn Asn Ile Leu Pro Leu Gln Lys Gly Ala Lys Ile 420 425 430 Leu Val Ser Gly Pro Asn Ala Val Ser Lys Arg Ser Leu Asn Gly Gly 435 440 445 Trp Thr Phe Ser Trp Gln Gly Glu Lys Ile Asp Glu Phe Ala Ser Glu 450 455 460 Tyr Ser Asn Leu Leu Asp Ala Ile Thr His Thr Tyr Gly Lys Glu Asn 465 470 475 480 Val Ser Tyr Val Pro Gly Val Ser Tyr Thr Ala Ala Thr Glu Tyr Ala 485 490 495 Thr Glu His Lys Asp Arg Phe Asp Glu Ala Ile Glu Ala Ala Lys Asn 500 505 510 Ala Asp Tyr Ile Ile Leu Cys Leu Gly Glu Asn Ser Tyr Cys Glu Lys 515 520 525 Pro Gly Asp Leu Asp Asp Leu Tyr Leu Asn Asp Leu Gln Thr Glu Leu 530 535 540 Ala Lys Glu Phe Leu Lys Thr Gly Lys Lys Val Ile Leu Val Leu Ser 545 550 555 560 Glu Gly Arg Pro Arg Val Ile Ser Lys Ile Ser Ser Gln Val Asp Ala 565 570 575 Ile Val Gln Thr Tyr Leu Pro Gly Ile Phe Gly Ala Asp Ala Leu Ala 580 585 590 Asp Val Leu Val Gly Lys Val Asn Pro Ser Gly Lys Leu Pro Tyr Thr 595 600 605 Tyr Pro Ala Phe Pro Asn Ser Leu Val Pro Tyr Tyr His Lys His Ser 610 615 620 Glu Glu Gln Lys Arg Ser Glu Gly Val Tyr Asn Tyr Glu Gly Asp Phe 625 630 635 640 Asn Pro Glu Tyr His Phe Gly Phe Gly Leu Ser Tyr Thr Thr Phe Asp 645 650 655 Ile Ser Asn Leu Lys Ile Asn Lys Thr Ser Phe Ala Asn Asn Pro Lys 660 665 670 Glu Glu Ile Ile Val Ser Val Asp Val Lys Asn Thr Gly Asn Val Glu 675 680 685 Gly Lys Glu Val Ile Gln Leu Tyr Ser Ser Asp Leu Phe Ala Ser Leu 690 695 700 Val Pro Asp Val Lys Arg Leu Arg Arg Phe Glu Lys Val Ser Leu Lys 705 710 715 720 Ala Gly Glu Ser Lys Thr Val Thr Phe Lys Leu Thr Leu Asp Asp Leu 725 730 735 Ala Phe Tyr Asn Leu Lys Ser Glu Arg Val Ile Glu Ala Gly Asp Phe 740 745 750 Glu Leu Gln Val Gly Ser Ser Ser Asn Asp Ile Lys Glu Lys Thr Val 755 760 765 Ile Thr Val Leu 770 <210> 4 <211> 752 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DDGD7 <400> 4 Gln Thr Asn Asn Asp Met Asn Lys Gln Ala Ile Glu Ile Val Ser Lys 1 5 10 15 Met Thr Leu Ser Glu Lys Ile Gly Gln Met Ala Gln Val Ser Ile Asp 20 25 30 Ala Val Cys Lys Gly Glu Asp Thr Pro Pro Thr Ser Thr Leu Gln Leu 35 40 45 Asp Met Asp Lys Leu Arg Asp Val Ile Val Asn Tyr His Val Gly Ser 50 55 60 Leu Leu Asn Ser Pro Asn Thr Arg Ala Arg Thr Ala Glu Trp Trp Thr 65 70 75 80 Asn Val Ile Ser Gln Ile Gln Asp Val Ala Leu Asn Glu Thr Arg Thr 85 90 95 Lys Ile Pro Val Ile Tyr Gly Leu Asp Gln Ile His Gly Ala Thr Tyr 100 105 110 Thr Ala Gly Ser Thr Met Phe Pro Gln Glu Ile Ala Leu Ala Ala Thr 115 120 125 Trp Asn Pro Ser His Ala Lys Lys Met Gly Glu Ile Thr Ala Tyr Glu 130 135 140 Thr Arg Ala Ser Asn Val Pro Trp Asn Phe Ser Pro Val Leu Asp Leu 145 150 155 160 Gly Ile Asp Pro Arg Phe Pro Arg Gln Tyr Glu Gly Phe Gly Glu Asp 165 170 175 Pro Tyr Ile Gly Ser Val Phe Gly Tyr Gln Leu Ile Lys Gly Tyr Glu 180 185 190 Gly Asp Asp Asn Asn Val Gly Asn Pro Asn Lys Leu Ala Ala Cys Met 195 200 205 Lys His Phe Ile Gly Tyr Ser Ala Pro Ile Ser Gly Lys Asp Arg Thr 210 215 220 Pro Ala Tyr Ile Pro Gln Ser Ala Leu Met Glu Tyr His Val Pro Ala 225 230 235 240 Phe Lys Ala Ala Ile Asp Ala Gly Val His Thr Val Met Ile Asn Ser 245 250 255 Gly Ile Ile Asn Gly Glu Pro Val His Ala Ser Tyr Asp Leu Leu Thr 260 265 270 Lys Leu Leu Arg Asn Asp Leu Gly Phe Asp Gly Met Ile Val Thr Asp 275 280 285 Trp Glu Asp Ile Asn Lys Leu Tyr Ser Arg Asp Arg Met Val Pro Asn 290 295 300 Ile Lys Glu Ala Ile Lys Val Ser Ile Asn Ala Gly Val Asp Met Ser 305 310 315 320 Met Ile Pro Tyr Asp Tyr Lys Glu Phe Cys Thr Leu Leu Thr Glu Leu 325 330 335 Val Asn Glu Gly Gln Val Pro Met Ser Arg Ile Asp Asp Ala Ala Arg 340 345 350 Arg Val Val Leu Leu Lys Leu Gln Leu Asp Leu Phe Asp Thr Pro Asn 355 360 365 Thr Tyr Arg Lys Asp Tyr Pro Gln Phe Gly Ser Lys Glu Phe Gln Gln 370 375 380 Ala Ser Tyr Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ile Thr Leu Leu Lys Asn Asp 385 390 395 400 Asn Asn Ile Leu Pro Leu Gln Lys Gly Ala Lys Ile Leu Val Ser Gly 405 410 415 Pro Asn Ala Val Ser Lys Arg Ser Leu Asn Gly Gly Trp Thr Phe Ser 420 425 430 Trp Gln Gly Glu Lys Ile Asp Glu Phe Ala Ser Glu Tyr Ser Asn Leu 435 440 445 Leu Asp Ala Ile Thr His Thr Tyr Gly Lys Glu Asn Val Ser Tyr Val 450 455 460 Pro Gly Val Ser Tyr Thr Ala Ala Thr Glu Tyr Ala Thr Glu His Lys 465 470 475 480 Asp Arg Phe Asp Glu Ala Ile Glu Ala Ala Lys Asn Ala Asp Tyr Ile 485 490 495 Ile Leu Cys Leu Gly Glu Asn Ser Tyr Cys Glu Lys Pro Gly Asp Leu 500 505 510 Asp Asp Leu Tyr Leu Asn Asp Leu Gln Thr Glu Leu Ala Lys Glu Phe 515 520 525 Leu Lys Thr Gly Lys Lys Val Ile Leu Val Leu Ser Glu Gly Arg Pro 530 535 540 Arg Val Ile Ser Lys Ile Ser Ser Gln Val Asp Ala Ile Val Gln Thr 545 550 555 560 Tyr Leu Pro Gly Ile Phe Gly Ala Asp Ala Leu Ala Asp Val Leu Val 565 570 575 Gly Lys Val Asn Pro Ser Gly Lys Leu Pro Tyr Thr Tyr Pro Ala Phe 580 585 590 Pro Asn Ser Leu Val Pro Tyr Tyr His Lys His Ser Glu Glu Gln Lys 595 600 605 Arg Ser Glu Gly Val Tyr Asn Tyr Glu Gly Asp Phe Asn Pro Glu Tyr 610 615 620 His Phe Gly Phe Gly Leu Ser Tyr Thr Thr Phe Asp Ile Ser Asn Leu 625 630 635 640 Lys Ile Asn Lys Thr Ser Phe Ala Asn Asn Pro Lys Glu Glu Ile Ile 645 650 655 Val Ser Val Asp Val Lys Asn Thr Gly Asn Val Glu Gly Lys Glu Val 660 665 670 Ile Gln Leu Tyr Ser Ser Asp Leu Phe Ala Ser Leu Val Pro Asp Val 675 680 685 Lys Arg Leu Arg Arg Phe Glu Lys Val Ser Leu Lys Ala Gly Glu Ser 690 695 700 Lys Thr Val Thr Phe Lys Leu Thr Leu Asp Asp Leu Ala Phe Tyr Asn 705 710 715 720 Leu Lys Ser Glu Arg Val Ile Glu Ala Gly Asp Phe Glu Leu Gln Val 725 730 735 Gly Ser Ser Ser Asn Asp Ile Lys Glu Lys Thr Val Ile Thr Val Leu 740 745 750

Claims (7)

1. 서열번호 3의 아미노산서열로 표시되는 베타-글루코시다제 단백질.
2. 서열번호 4의 아미노산서열로 표시되는 베타-글루코시다제 단백질.
3. 서열번호 1의 핵산서열로 표시되는 베타-글루코시다제 유전자.
4. 서열번호 2의 핵산서열로 표시되는 베타-글루코시다제 유전자.
5. 제3항 또는 제4항에 따른 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
6. 제5항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
7. 제 6항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균인 형질전환체.
   
   
   

Images