KR20130128404A - Fviii peptides for immune tolerance induction and immunodiagnostics - Google Patents

Abstract

본 발명은, 예를 들어 A형 혈우병 환자에서 FVIII에 대한 면역 반응을 감소시키거나 또는 인간 FVIII에 대한 관용을 유도하기 위하여 사용될 수 있는 펩타이드에 관한 것이다. 더 나아가, 펩타이드는 FVIII-특이적 CD4⁺ T 세포를 검출하기 위한 면역진단적 목적을 위하여 사용되어 대체 치료 동안 및 면역 관용 유도 치료 동안 A형 혈우병 환자를 모니터링할 수 있다.The present invention relates to peptides that can be used to reduce the immune response to FVIII or induce tolerance for human FVIII, for example in patients with hemophilia A. Furthermore, peptides can be used for immunodiagnostic purposes to detect FVIII-specific CD4 ⁺ T cells to monitor hemophilia A patients during alternative therapy and during immune tolerance induction therapy.

Description

면역 관용 유도 및 면역진단을 위한 ＦＶＩＩＩ 펩타이드{FVIII PEPTIDES FOR IMMUNE TOLERANCE INDUCTION AND IMMUNODIAGNOSTICS}FVIII PEPTIDES FOR IMMUNE TOLERANCE INDUCTION AND IMMUNODIAGNOSTICS}

관련출원과의 상호참조Cross reference to related application

본 출원은 2010년 10월 27일 출원된 미국 가특허 출원 제61/407,402호, 2011년 3월 25일 출원된 미국 가특허 출원 제61/467,894호 및 2011년 6월 29일 출원된 미국 가특허 출원 제61/502,476호의 우선권을 주장하며, 이들 기초 출원은 본 명세서에 그들의 전문이 모든 목적을 위하여 참조로서 포함된다.This application is directed to US Provisional Patent Application No. 61 / 407,402, filed Oct. 27, 2010, US Provisional Patent Application No. 61 / 467,894, filed March 25, 2011, and US Provisional Patent Application, June 29, 2011. Claiming priority of application 61 / 502,476, these basic applications are incorporated herein by reference in their entirety for all purposes.

연방정부 지원된 연구 또는 개발하에 만들어진 발명에 대한 권리로서의 언급Reference as a right to an invention made under federally funded research or development

해당 없음.Not applicable.

"서열목록", 표 또는 컴팩트 디스크 상에서 제출된 컴퓨터 프로그램 목록 부록에 대한 언급Reference to the "Sequence List", Table, or Appendix of Computer Program Lists Submitted on Compact Discs.

해당 없음.Not applicable.

인자 VIII(FVIII)는 혈액 응고를 야기하는 반응의 캐스케이드에서 보조인자로서 작용하는 혈장에서 발견되는 단백질이다. A형 혈우병은 기능성 FVIII 단백질의 감소 또는 결핍에 의해 야기되며, 5000명 내지 10000명의 사람 중에서 약 1명에게 영향을 미치는 가장 흔한 출혈 장애이다. 혈우병의 임상적 증상은 빈번한 근육 및 관절 출혈이며, 외상은 심지어 생명을 위협하는 상황에 이를 수 있다. 현재 혈우병에 대한 효과적인 치료는 재조합 또는 혈장 유래 FVIII 생성물의 정맥내 적용을 사용하여 결여된 FVIII 단백질을 대체하는 것을 포함한다. 이러한 제제는 일반적으로 출혈 에피소드(온-디맨드(on-demand) 치료)에 반응하거나 또는 빈번하게, 정기적 간격으로 투여되어 제어되지 않은 출혈을 방지한다(예방). 불행하게도, 중화 항-FVIII 항체의 출현은 FVIII 생성물에 의한 대체 치료 동안의 주된 합병증이다. 치료를 받는 대략 25%의 환자는 FVIII 단백질에 대해 이런 면역이 발생하였고, 따라서 출혈의 제어를 매우 어렵게 만든다.Factor VIII (FVIII) is a protein found in plasma that acts as a cofactor in the cascade of responses that cause blood coagulation. Hemophilia A is caused by a decrease or deficiency in functional FVIII protein and is the most common bleeding disorder affecting about 1 out of 5000-10000 humans. Clinical symptoms of hemophilia are frequent muscle and joint bleeding, and trauma can even lead to life-threatening situations. Current effective treatments for hemophilia include replacement of the missing FVIII protein using intravenous application of recombinant or plasma derived FVIII products. Such agents generally respond to bleeding episodes (on-demand treatment) or are frequently administered at regular intervals to prevent uncontrolled bleeding (prevention). Unfortunately, the appearance of neutralizing anti-FVIII antibodies is a major complication during alternative treatment with FVIII products. Approximately 25% of patients undergoing treatment have developed this immunity to the FVIII protein, thus making control of bleeding very difficult.

FVIII 단백질에 대한 이 면역 반응의 원인은 완전히 밝혀지지 않았지만, 환자의 면역 시스템의 상세한 특성은 치료에 대한 그들의 반응에 영향을 미칠 수 있다. 보통, 면역 시스템은 특정 항원, 예를 들어 "자기"항원에 대한 관용(tolerance)을 만든다. 이 특징은 중요한데, 자기 항원이 외래 항원으로서 인식된다면, 다르게는 자가면역질병을 초래하기 때문이다. 특히 A형 혈우병 환자는 그들의 FVIII 유전자에서 유전적 결함을 가지는데, 이는 면역계가 "자기" 항원으로서 투여된 FVIII 단백질을 인식하지 못하는 것에 대한 원인이 된다. 따라서, FVIII 단백질이 응고 인자 대체 치료 동안 투여될 때, 환자의 면역계는 외래 항원으로서 또는 변경된 자기 단백질로서 FVIII 단백질을 인식하며, 따라서 항-FVIII 항체를 발생시킨다.The cause of this immune response to the FVIII protein is not fully understood, but the detailed characteristics of the patient's immune system can affect their response to treatment. Usually, the immune system makes a tolerance to certain antigens, for example "self" antigens. This feature is important because if the self antigen is recognized as a foreign antigen, otherwise it results in an autoimmune disease. In particular, patients with hemophilia A have a genetic defect in their FVIII gene, which causes the immune system to not recognize the FVIII protein administered as a "self" antigen. Thus, when FVIII protein is administered during coagulation factor replacement therapy, the patient's immune system recognizes the FVIII protein as a foreign antigen or as an altered magnetic protein, thus generating anti-FVIII antibodies.

FVIII 억제제, 즉, 항-FVIII 항체는 FVIII 특이적 B 세포로부터 유래된 혈장 세포에 의해 생성된다. B 세포는 활성화된 CD4⁺ T-세포를 증식시키고, 혈장 세포를 생성하는 항-FVIII 항체로 분화시키는데 도움을 필요로 한다. 예를 들어, FVIII 단백질은 상이한 방법으로 B 및 T 림프구에 의해 인식된다. 항-FVIII 항체의 유도는 T 헬퍼 세포 의존적이다. B 세포는 그것의 특이적 B 세포 수용체를 통해 전체 단백질 에피토프를 인식한다. 다른 한편으로, T 세포는 항원 존재 세포의 표면상에 존재하는 MHC 클래스 II 분자와 복합체화된 처리된 펩타이드의 형태로 단백질을 인식한다. 각각의 CD4⁺ T-세포는 단지 하나의 특이적 펩타이드-MHC 복합체를 인식한다. T-세포에 펩타이드를 제공하기 위하여, MHC 클래스 II 분자는 다양한 길이의 펩타이드가 세포 표면에 맞도록 하며, 세포 표면상에 제공되는 개방 결합 그루브를 가진다. 게다가, MHC 클래스 II 단백질은 다양한 단상형(haplotype)과 상이한 4개의 결합 포켓을 함유한다(Jones et al ., Nature Rev . Immunol . 6:271-282 (2006)). 특이적 아미노산만이 이들 결합 포켓에 꼭 들어맞으며, 결합 펩타이드의 최소 크기는 9개의 아미노산이다. 특히, 상이한 MHC 클래스 II 단상형은 상이한 펩타이드가 존재할 수 있다. 따라서, 환자의 MHC 클래스 II 단상형은 항-FVIII 항체의 발생 위험에 영향을 미칠 가능성이 있다. 게다가, 몇몇 연구는 항-FVIII 항체 발생의 증가된 위험과 인간 MHC 클래스 II 단상형 HLA-DRB1*1501의 상호관련이 있다는 것을 나타내었다(Pavlova et al ., J. Thromb . Haemost . 7:2006-2015 (2009); Oldenburg et al., Thromb . Haemost . 77:238-242 (1997); Hay et al ., Thromb . Haemost . 77:234-237 (1997)).FVIII inhibitors, ie anti-FVIII antibodies, are produced by plasma cells derived from FVIII specific B cells. B cells need help to proliferate activated CD4 ⁺ T-cells and differentiate into anti-FVIII antibodies that produce plasma cells. For example, FVIII protein is recognized by B and T lymphocytes in different ways. Induction of anti-FVIII antibodies is T helper cell dependent. A B cell recognizes the entire protein epitope through its specific B cell receptor. On the other hand, T cells recognize proteins in the form of treated peptides complexed with MHC class II molecules present on the surface of antigen presenting cells. Each CD4 ⁺ T-cell recognizes only one specific peptide-MHC complex. To provide peptides to T-cells, MHC class II molecules allow peptides of various lengths to fit the cell surface and have open binding grooves provided on the cell surface. In addition, MHC class II proteins contain four binding pockets that differ from the various haplotypes (Jones et. al ., Nature Rev. Immunol . 6: 271-282 (2006). Only specific amino acids fit into these binding pockets and the minimum size of the binding peptide is 9 amino acids. In particular, different MHC class II single phases may have different peptides. Thus, the MHC class II single phase of a patient is likely to affect the risk of developing anti-FVIII antibodies. In addition, several studies have shown that there is a correlation between increased risk of anti-FVIII antibody development and human MHC class II single-phase HLA-DRB1 * 1501 (Pavlova meat al ., J. Thromb . Haemost . 7: 2006-2015 (2009); Oldenburg et al., Thromb . Haemost . 77: 238-242 (1997); Hay et al ., Thromb . Haemost . 77: 234-237 (1997).

특정 접근은 FVIII 단백질의 투여에 의해 혈우병을 처리하는 것과 관련된 시험감염을 처리하기 위하여 탐구되었다. 예를 들어, WO 03/087161은 변형된 FVIII 단백질을 개시하는데, 여기서 FVIII 단백질의 면역 특징은 단백질 상에 존재하는 잠재적인 T-세포 에피토프의 수를 감소시키거나 또는 제거함으로써 변형된다. FVIII 단백질을 따라 T-세포 에피토프를 포함하는 다수의 영역은 예를 들어 FVIII^2030-2044를 포함하여 확인되었다. 개시내용에 따라, 이러한 영역의 제거는 항-FVIII 항체의 생성을 유도하지 않는 기능성 FVIII 단백질을 제공하기 위하여 사용될 수 있었다. 또한 WO 09/071886은, 예를 들어 FVIII^{475 -495}, FVIII^{542 -562}, FVIII^{1785 -1805} 및 FVIII^{2158 -2178}과 같이 환자의 면역 반응에 수반된 HLA-DR2 결합 펩타이드를 생기게 하는 것으로 예측되는 FVIII 단백질의 특이적 영역을 개시한다. 펩타이드는 환자에서 면역 관용(immune tolerance)을 유도하는 것에 가능한 용도에 대해 확인되었다.Specific approaches have been explored to address challenge associated with the treatment of hemophilia by administration of FVIII protein. For example, WO 03/087161 discloses modified FVIII proteins, wherein the immune characteristics of the FVIII proteins are modified by reducing or eliminating the number of potential T-cell epitopes present on the protein. Multiple regions comprising T-cell epitopes along the FVIII protein have been identified including, for example, FVIII ^2030-2044 . According to the disclosure, removal of this region could be used to provide a functional FVIII protein that does not induce the production of anti-FVIII antibodies. Also WO 09/071886, for example, ^{475 -495} FVIII, FVIII ^{542 -562, 1785 -1805} FVIII and FVIII FVIII that are forecasted for causing a HLA-DR2 binding peptides involved in the immune response of the patient, such as ^2158-2178 Initiate specific regions of a protein. Peptides have been identified for possible use in inducing immune tolerance in patients.

면역 반응에 수반된 FVIII 단백질의 영역을 확인하는 것에서 진보가 있었지만, 예를 들어 A형 혈우병 환자를 치료하는데 사용될 수 있는 다른 치료적 펩타이드 및 방법을 개발하기 위하여 사용될 수 있는 FVIII 단백질의 다른 영역을 확인할 필요는 여전히 존재한다.Although advances have been made in identifying the region of the FVIII protein involved in the immune response, for example, other regions of the FVIII protein that can be used to develop other therapeutic peptides and methods that can be used to treat hemophilia A patients are identified. The need still exists.

본 발명은 FVIII 분자에 대한 면역 반응에 관련된 FVIII 단백질 영역의 확인에 기반한다. 더 구체적으로는, FVIII 단백질의 영역을 포함하는 FVIII 펩타이드는, 예를 들어 A형 혈우병 환자에서 인간 FVIII에 대해 관용을 유도하기 위하여 사용될 수 있다. 더 나아가, FVIII 펩타이드는 대체치료 동안 및 면역 관용 유도치료 동안 A형 혈우병 환자를 모니터링하기 위한 면역진단적 목적을 위하여 사용될 수 있다.The present invention is based on the identification of FVIII protein regions involved in the immune response to FVIII molecules. More specifically, FVIII peptides comprising regions of the FVIII protein can be used to induce tolerance for human FVIII, for example in patients with type A hemophilia. Furthermore, FVIII peptides can be used for immunodiagnostic purposes to monitor hemophilia A patients during alternative therapy and during immunotolerance induction therapy.

한 양태에서, 본 발명은 치료가 필요한 피험체에서 FVIII에 대해 면역 관용을 유도하는 방법을 제공하며, 해당 방법은 (R¹)_x-P-(R²)_y로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 치료적 유효량을 피험체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 식 중, P는 서열번호 10, 68, 344 및 740으로부터 선택된 서열의 적어도 9개의 연속적 아미노산과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이며; R¹은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; R²는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.In one aspect, the peptides of this invention provides a method of treatment induces immune tolerance against FVIII in need a subject, the method comprising the amino acid sequence consisting of _{^{y (R 1) x -P- (}} R 2) Administering to the subject a therapeutically effective amount, wherein P is an amino acid sequence having at least 85% identity with at least 9 consecutive amino acids of a sequence selected from SEQ ID NOs: 10, 68, 344, and 740; R ¹ is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids; R ² is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids; Each x and y is independently 0 or 1.

상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, P는 서열번호 10의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.In one embodiment of the methods provided above, P is an amino acid sequence having at least 90% identity with the sequence of at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO.

상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, P는 서열번호 10의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 동일한 아미노산 서열이다.In one embodiment of the methods provided above, P is an amino acid sequence identical to the sequence of at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 10.

상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, P는 서열번호 68의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.In one embodiment of the methods provided above, P is an amino acid sequence having at least 90% identity with the sequence of at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 68.

상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, P는 서열번호 68의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.In one embodiment of the methods provided above, P is an amino acid sequence having at least 95% identity with the sequence of at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 68.

상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, P는 서열번호 68의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 동일한 아미노산 서열이다.In one embodiment of the methods provided above, P is an amino acid sequence identical to the sequence of at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 68.

상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, P는 서열번호 344의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.In one embodiment of the methods provided above, P is an amino acid sequence having at least 85% identity with the sequence of at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 344.

상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, P는 서열번호 344의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.In one embodiment of the methods provided above, P is an amino acid sequence having at least 90% identity with the sequence of at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 344.

상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, P는 서열번호 344의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.In one embodiment of the methods provided above, P is an amino acid sequence having at least 95% identity with the sequence of at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 344.

상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, P는 서열번호 344의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 동일한 아미노산 서열이다.In one embodiment of the methods provided above, P is an amino acid sequence identical to the sequence of at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 344.

상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, P는 서열번호 740의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.In one embodiment of the methods provided above, P is an amino acid sequence having at least 85% identity with the sequence of at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 740.

상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, P는 서열번호 740의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.In one embodiment of the methods provided above, P is an amino acid sequence having at least 90% identity with the sequence of at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 740.

상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, P는 서열번호 740의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.In one embodiment of the methods provided above, P is an amino acid sequence having at least 95% identity with the sequence of at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 740.

상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, P는 서열번호 740의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 동일한 아미노산 서열이다.In one embodiment of the methods provided above, P is an amino acid sequence identical to the sequence of at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 740.

상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0이다.In one embodiment of the method provided above, x and y are both zero.

상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, x는 1이고, y는 0이다.In one embodiment of the method provided above, x is 1 and y is 0.

상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, x는 0이고 y는 1이다.In one embodiment of the method provided above, x is 0 and y is 1.

상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0이다.In one embodiment of the method provided above, x and y are both zero.

상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다.In one embodiment of the methods provided above, the peptide consists of 9 to 100 amino acids.

상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다.In one embodiment of the methods provided above, the peptide consists of 9 to 50 amino acids.

상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다.In one embodiment of the methods provided above, the peptide consists of 9-25 amino acids.

상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, 약제학적 조성물의 투여는 피험체에서 항-FVIII 항체의 발생을 방지한다.In one embodiment of the methods provided above, administration of the pharmaceutical composition prevents the development of anti-FVIII antibodies in the subject.

상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, 약제학적 조성물의 투여는 피험체에서 존재하는 항-FVIII 항체의 양을 감소시킨다.In one embodiment of the methods provided above, administration of the pharmaceutical composition reduces the amount of anti-FVIII antibody present in the subject.

한 양태에서, 본 발명은 아미노산 서열 (R¹)_x-P-(R²)_y로 이루어진 펩타이드를 제공하되, 상기 식 중, P는 서열번호 10, 68, 159, 250, 344, 477, 568, 659 및 740으로부터 선택된 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이며; R¹은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; R²는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.In one aspect, the invention provides a peptide consisting of the amino acid sequence (R ¹ ) _x -P- (R ² ) _y , wherein P is SEQ ID NO: 10, 68, 159, 250, 344, 477, 568 An amino acid sequence having at least 85% identity with the sequence of at least 9 consecutive amino acids selected from 659 and 740; R ¹ is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids; R ² is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids; Each x and y is independently 0 or 1.

상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, P는 서열번호 10의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.In one embodiment of the peptides provided above, P is an amino acid sequence having at least 90% identity with the sequence of at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 10.

상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, P는 서열번호 10의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 동일한 아미노산 서열이다.In one embodiment of the peptides provided above, P is an amino acid sequence identical to the sequence of at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 10.

상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, P는 서열번호 68의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.In one embodiment of the peptides provided above, P is an amino acid sequence having at least 90% identity with the sequence of at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 68.

상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, P는 서열번호 68의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.In one embodiment of the peptides provided above, P is an amino acid sequence having at least 95% identity with the sequence of at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 68.

상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, P는 서열번호 68의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 동일한 아미노산 서열이다.In one embodiment of the peptides provided above, P is an amino acid sequence identical to the sequence of at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 68.

상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, P는 서열번호 344의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.In one embodiment of the peptides provided above, P is an amino acid sequence having at least 85% identity with the sequence of at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 344.

상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, P는 서열번호 344의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.In one embodiment of the peptides provided above, P is an amino acid sequence having at least 90% identity with the sequence of at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 344.

상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, P는 서열번호 344의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.In one embodiment of the peptides provided above, P is an amino acid sequence having at least 95% identity with the sequence of at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 344.

상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, P는 서열번호 344의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 동일한 아미노산 서열이다.In one embodiment of the peptides provided above, P is an amino acid sequence identical to the sequence of at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 344.

상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, P는 서열번호 740의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.In one embodiment of the peptides provided above, P is an amino acid sequence having at least 85% identity with the sequence of at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 740.

상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, P는 서열번호 740의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.In one embodiment of the peptides provided above, P is an amino acid sequence having at least 90% identity with the sequence of at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 740.

상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, P는 서열번호 740의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.In one embodiment of the peptides provided above, P is an amino acid sequence having at least 95% identity with the sequence of at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 740.

상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, P는 서열번호 740의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 동일한 아미노산 서열이다.In one embodiment of the peptides provided above, P is an amino acid sequence identical to the sequence of at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 740.

상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0이다. In one embodiment of the peptide provided above, both x and y are zero.

상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, x는 1이고, y는 0이다. In one embodiment of the peptide provided above, x is 1 and y is 0.

상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, x는 0이고, y는 1이다. In one embodiment of the peptide provided above, x is 0 and y is 1.

상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0이다. In one embodiment of the peptide provided above, both x and y are zero.

상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다.In one embodiment of the peptide provided above, the peptide consists of 9 to 100 amino acids.

상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다.In one embodiment of the peptide provided above, the peptide consists of 9 to 50 amino acids.

상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다.In one embodiment of the peptides provided above, the peptide consists of 9-25 amino acids.

한 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다.In one aspect, the invention provides a composition comprising a peptide as described herein.

상기 제공된 조성물의 한 실시형태에서, 조성물은 약제학적 투여를 위해 조제된다.In one embodiment of the provided compositions, the compositions are formulated for pharmaceutical administration.

상기 제공된 조성물의 한 실시형태에서, 조성물은 제2 폴리펩타이드를 추가로 포함하되, 제2 폴리펩타이드는 아미노산 서열 (R¹)_x-P-(R²)_y로 이루어지고, 상기 식 중, P는 서열번호 10, 68, 159, 250, 477, 568, 659 및 740으로부터 선택된 서열의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이며; R¹은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; R²는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.In one embodiment of the provided compositions, the composition further comprises a second polypeptide, wherein the second polypeptide consists of the amino acid sequence (R ¹ ) _x -P- (R ² ) _y , wherein P Is an amino acid sequence having at least 85% identity with the sequence of at least 9 consecutive amino acids of the sequence selected from SEQ ID NOs: 10, 68, 159, 250, 477, 568, 659 and 740; R ¹ is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids; R ² is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids; Each x and y is independently 0 or 1.

한 양태에서, 본 발명은 FVIII 펩타이드의 제조방법을 제공하며, 해당 방법은: a) 제24항 내지 제41항 중 어느 한 항의 FVIII 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포의 배양물을 제공하는 단계; 및 b) 세포 배양물에서 펩타이드를 발현시키는 단계를 포함한다.In one aspect, the present invention provides a method of preparing a FVIII peptide, the method comprising: a) providing a culture of cells comprising a polynucleotide encoding the FVIII peptide of any one of claims 24-41. step; And b) expressing the peptide in cell culture.

한 양태에서, 본 발명은 FVIII 펩타이드-특이적 T 세포를 확인하기 위한 방법을 제공하며, 해당 방법은: a) MHC 클래스 II 멀티머(multimer)와 복합체화된 펩타이드와 다수의 CD4+ T 세포를 조합하는 단계; 및 b) MHC 클래스 II 멀티머와 복합체화된 펩타이드에 특이적인 다수의 CD4+ T 세포의 구성원 중 적어도 하나를 확인하는 단계를 포함하되, 해당 펩타이드는 제24항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 FVIII 펩타이드이다.In one aspect, the invention provides a method for identifying FVIII peptide-specific T cells, the method comprising: a) combining a plurality of CD4 + T cells with a peptide complexed with an MHC class II multimer Making; And b) identifying at least one member of the plurality of CD4 + T cells specific for the peptide complexed with the MHC class II multimer, wherein the peptide is according to any one of claims 24 to 41. FVIII peptide.

상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, MHC 클래스 II 멀티머는 MHC 클래스 II 테트라머이다.In one embodiment of the methods provided above, the MHC Class II multimer is an MHC Class II tetramer.

상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, 펩타이드 또는 MHC 클래스 II 멀티머는 검출가능한 모이어티(moiety)를 추가로 포함한다.In one embodiment of the methods provided above, the peptide or MHC class II multimer further comprises a detectable moiety.

상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, 해당 방법은 펩타이드에 특이적인 적어도 하나의 CD4+ T 세포를 분리시키는 단계를 추가로 포함한다.In one embodiment of the methods provided above, the method further comprises isolating at least one CD4 + T cell specific for the peptide.

상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, CD4+ T 세포는 유세포 분석기를 사용하여 분리된다.In one embodiment of the methods provided above, CD4 + T cells are isolated using a flow cytometer.

한 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 제공된 바와 같은 FVIII 펩타이드 및 제2 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.In one aspect, the invention provides a fusion protein comprising a FVIII peptide and a second peptide as provided herein.

상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, 제2 펩타이드는 리포터 펩타이드(reporter peptide)이다.In one embodiment of the provided method, the second peptide is a reporter peptide.

상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, 융합 단백질은 핵산에 의해 암호화된다.In one embodiment of the methods provided above, the fusion protein is encoded by a nucleic acid.

상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 제2 펩타이드에 화학적으로 연결된다.In one embodiment of the methods provided above, the FVIII peptide is chemically linked to a second peptide.

한 양태에서, 본 명세서에 제공된 FVIII 펩타이드는 FVIII 억제제 발생의 방지를 위한 인간 FVIII에 대해 면역 관용을 유도하기 위하여 사용된다.In one embodiment, the FVIII peptides provided herein are used to induce immune tolerance against human FVIII for the prevention of FVIII inhibitor development.

한 양태에서, 본 명세서에 제공된 FVIII 펩타이드는 확립된 FVIII 억제제로 환자의 치료를 위해 인간에 대해 FVIII에 대한 관용을 유도하기 위하여 사용된다.In one embodiment, the FVIII peptides provided herein are used to induce tolerance for FVIII to humans for the treatment of patients with established FVIII inhibitors.

한 양태에서, 본 명세서에 제공된 FVIII 펩타이드는 대체 치료 동안 또는 면역 관용 유도 치료 동안 환자의 면역 모니터링에서 FVIII 특이적 T 세포(예를 들어 MHC 클래스 II 멀티머 또는 MHC 클래스 II 테트라머)의 직접적 염색에 적합한 시약을 만들기 위해 사용된다.In one embodiment, the FVIII peptides provided herein are used for direct staining of FVIII specific T cells (eg, MHC class II multimers or MHC class II tetramers) in immune monitoring of patients during alternative therapy or during immunotolerance induction therapy. Used to make suitable reagents.

한 양태에서, 본 명세서에 제공된 FVIII 펩타이드는 항원 특이적 T 세포를 확인하기 위하여 사용된다. 한 실시형태에서, 이들 시약은 시험관내 및 생체밖 세팅에서 FVIII 특이적 T 세포를 추적하기 위하여 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 이들 시약은 FVIII 특이적 T 세포를 분리하고 추가로 특성규명(characterize)하기 위하여 사용될 수 있다. 한 실시형태에서, 형광 활성 세포 분류(fluorescent activated cell sorting, FACS) 또는 단일 세포 PCR이 이들 목적을 위해 사용될 수 있다.In one embodiment, the FVIII peptides provided herein are used to identify antigen specific T cells. In one embodiment, these reagents can be used to track FVIII specific T cells in in vitro and ex vivo settings. In other embodiments, these reagents can be used to isolate and further characterize FVIII specific T cells. In one embodiment, fluorescent activated cell sorting (FACS) or single cell PCR can be used for these purposes.

한 양태에서, 본 명세서에 제공된 FVIII 펩타이드는 면역 관용 유도 치료 동안 FVIII 특이적 T 세포의 면역 모니터링을 위해 사용된다.In one embodiment, the FVIII peptides provided herein are used for immune monitoring of FVIII specific T cells during immune tolerance induction therapy.

한 양태에서, 본 명세서에 제공된 FVIII 펩타이드는 FVIII 처리 동안 FVIII 특이적 T 세포의 면역 모니터링을 위하여 사용된다.In one embodiment, the FVIII peptides provided herein are used for immune monitoring of FVIII specific T cells during FVIII treatment.

한 양태에서, 본 명세서에 제공된 FVIII 펩타이드는 FVIII 억제제 방지를 위한 새로운 면역 조절제의 임상적 개발 동안 FVIII 특이적 T 세포의 면역진단을 위하여 사용된다.In one embodiment, the FVIII peptides provided herein are used for immunodiagnosis of FVIII specific T cells during clinical development of new immunomodulators for preventing FVIII inhibitors.

해당 없음.Not applicable.

I. 도입I. Introduction

본 발명은, 예를 들어 A형 혈우병 환자에서 FVIII 단백질에 대한 관용을 유도하기 위해 사용될 수 있는 인자 VIII(FVIII) 펩타이드에 관한 것이다. 더 나아가, 펩타이드는 대체 치료 동안 및 면역 관용 유도 치료 동안 A형 혈우병 환자에서 FVIII-특이적 T 세포를 모니터링하기 위한 면역진단적 목적을 위해 사용될 수 있다.The present invention relates to factor VIII (FVIII) peptides that can be used to induce tolerance for FVIII protein, for example in patients with hemophilia A. Furthermore, peptides can be used for immunodiagnostic purposes to monitor FVIII-specific T cells in hemophilia A patients during alternative therapy and during immune tolerance induction therapy.

본 발명은 FVIII, 구체적으로는 FVIII^{102 -122}, FVIII^{246 -266} 및 FVIII^{1401 -1424}의 몇몇 영역이 인자 VIII 대체 치료 동안 FVIII 단백질에 대해 시작된 면역 반응에 수반되거나 또는 획득된 혈우병과 관련된다는 발견에 부분적으로 기반한다. 확인된 영역의 아미노산 서열은 각각 TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(서열번호 740), AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(서열번호 68) 및 QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(서열번호 344)이다. 본 발명은 이들 FVIII 단백질 영역 및 FVIII 단백질에 대한 면역 반응에 대한 그것의 관계의 첫 번째 확인을 제공한다.The present invention is the discovery that FVIII, specifically related to the FVIII ^{102 -122, 246 -266} FVIII and FVIII involved in immune responses have been initiated for the FVIII protein some areas the factor VIII replacement therapy during ^1401-1424, or acquired haemophilia Based in part. The amino acid sequences of the identified regions are TVVITLKNMASHPVSLHAVGV (SEQ ID NO: 740), AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG (SEQ ID NO: 68) and QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID NO: 344). The present invention provides the first confirmation of these FVIII protein regions and their relationship to the immune response to FVIII protein.

본 발명의 펩타이드는 환자의 면역 반응에 수반된 T 세포에 의해 인식될 수 있는 T 세포 에피토프를 생성하기 위하여 MHC 클래스 II 분자와 복합체화된 영역 FVIII^102-122, FVIII^{246 -266} 및 FVIII^{1401 -1424}의 적어도 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드는 FVIII^{102 -122}, FVIII^{246 -266} 또는 FVIII1^{401 -1424}에서 9개의 연속적 아미노산에 대응하는 적어도 9개의 연속적 아미노산을 포함한다. 이하에 추가로 기재되는 바와 같이, 본 명세서에 제공된 펩타이드는 또한 길이로 9개 이상의 아미노산의 펩타이드뿐만 아니라 FVIII^{102 -122}, FVIII^{246 -266} 및 FVIII^{1401 -1424} 서열의 변이체를 포함한다. 본 발명의 펩타이드의 이러한 확인은 A형 혈우병과 같은 혈액 응고와 관련된 질병을 치료하기 위하여 설계된 치료적 전략을 개선시키고 진전시키는 것에서 영향을 가질 수 있다.The peptide of the present invention the MHC class II molecule with the complex to produce a T cell epitope that can be recognized by T cells involved in the immune response of the patient screen areas ^102-122 FVIII, FVIII and FVIII ^{246 -266 1401 -1424} It includes at least a part of. In some embodiments, the peptide comprises at least nine contiguous amino acids corresponding to nine contiguous amino acids in the FVIII ^{102 -122, 246 -266} FVIII or FVIII1 ^{401 -1424.} As will be described further below, the peptides provided herein also include variants, as well as peptides of 9 or more amino acids in length FVIII ^{102 -122, 246 -266} FVIII and FVIII sequences ^{1401 -1424.} Such identification of the peptides of the present invention may have an impact in improving and advancing therapeutic strategies designed to treat diseases associated with blood clotting, such as hemophilia A.

II.II. 정의Justice

용어 "인자 VIII 단백질" 또는 "FVIII 단백질"은 B 도메인의 적어도 일부를 갖고, 천연 인간 FVIII 단백질과 관련된 생물학적 활성을 나타내는 임의의 FVIII 분자를 지칭한다. FVIII 분자는 전장 FVIII일 수 있다. FVIII 분자는 또한 천연 FVIII의 상보적으로 변형된 변이체일 수 있다. FVIII 단백질은 인간 혈장으로부터 유래될 수 있거나 또는 재조합 유전자조작 기법에 의해 생성될 수 있다. FVIII 단백질의 추가적인 특징은, 예를 들어 본 명세서에 참조로서 포함되는 미국 특허 제2010/0168018호의 단락 [0042]-[0055]에서 찾을 수 있다.The term “factor VIII protein” or “FVIII protein” refers to any FVIII molecule having at least a portion of the B domain and exhibiting biological activity associated with native human FVIII protein. The FVIII molecule may be full length FVIII. The FVIII molecule may also be a complementary modified variant of native FVIII. FVIII protein may be derived from human plasma or may be produced by recombinant genetic engineering techniques. Additional features of the FVIII protein can be found, for example, in paragraphs [0042]-[0055] of US 2010/0168018, incorporated herein by reference.

용어 "인자 VIII 펩타이드" 또는 "FVIII 펩타이드"는 FVIII에 대한 면역 반응에서 중요한 것으로 발견된 FVIII 단백질의 영역에 대응하는 아미노산 서열을 포함하는 본 명세서에 기재된 펩타이드를 지칭한다. FVIII 펩타이드는 면역 반응에 수반된 T 세포의 제시를 위해 MHC 클래스 II 단백질과 복합체화되는 적어도 9개의 아미노산을 포함한다. 추가적인 아미노산은 펩타이드의 적어도 9개의 아미노산 코어의 양 말단 중 하나에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 천연 인간 FVIII 단백질의 특정 영역과 동일한 서열을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 FVIII 단백질의 상보적으로 변형된 변이체일 수 있다. 본 명세서에 추가로 기재되는 바와 같이, FVIII 펩타이드는 천연 인간 FVIII 단백질 영역의 서열에 대해, 예를 들어 85% 동일한 특정 백분율 동일성에 의해 특성규명될 수 있다.The term “factor VIII peptide” or “FVIII peptide” refers to a peptide described herein comprising an amino acid sequence corresponding to a region of FVIII protein found to be important in the immune response to FVIII. FVIII peptides comprise at least 9 amino acids complexed with MHC class II protein for presentation of T cells involved in immune response. Additional amino acids may be present at either end of at least nine amino acid cores of the peptide. In some embodiments, the FVIII peptide may comprise the same sequence as a particular region of native human FVIII protein. In other embodiments, the FVIII peptide may be a complementary modified variant of the FVIII protein. As further described herein, FVIII peptides can be characterized by specific percentage identity, eg, 85% identical, to sequences of native human FVIII protein regions.

용어 "아미노산"은 자연적으로 발생하는 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 포함하는 자연적으로 발생하는 및 비-천연의 아미노산을 지칭한다. 자연적으로 발생하는 아미노산은 유전자 코드뿐만 아니라 이후에 변형되는 아미노산에 의해 암호화되는 것, 예를 들어 하이드록시프롤린, y-카복시글루타메이트 및 O-포스포세린을 포함한다. 자연적으로 발생하는 아미노산은, 예를 들어 D- 및 L-아미노산을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 아미노산은 또한 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 아미노산 유사체는 자연적으로 발생하는 아미노산과 동일한 염기의 화학적 구조, 즉, 수소, 카복실기, 아미노기 및 R 기, 예를 들어 호모세린, 놀류신, 메티오닌, 설폭사이드 또는 메티오닌 메틸 설포늄에 결합되는 임의의 탄소를 갖는 화합물을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기(예를 들어, 놀류신) 또는 변형된 펩타이드 백본을 가지지만, 자연적으로 발생하는 아미노산과 동일한 염기의 화학적 구조를 보유한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적 화학적 구조와 상이한 구조를 가지지만, 자연적으로 발생하는 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 화학적 화합물을 지칭한다. 아미노산은 그것의 보통 알려진 3글자 기호에 의해 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에 의해 추천되는 1-글자 기호에 의해 본 명세서에서 지칭될 수 있다. 마찬가지로 뉴클레오타이드는 그것의 보통 받아들여지는 1-글자 코드에 의해 지칭될 수 있다.The term “amino acid” refers to naturally occurring and non-natural amino acids, including amino acid analogs and amino acid mimetics that function in a similar manner to naturally occurring amino acids. Naturally occurring amino acids include those encoded by not only the genetic code but also the amino acids which are subsequently modified, for example hydroxyproline, y-carboxyglutamate and O-phosphoserine. Naturally occurring amino acids may include, for example, D- and L-amino acids. As used herein, amino acids may also include non-natural amino acids. Amino acid analogs are any chemical structures of the same base as naturally occurring amino acids, ie hydrogen, carboxyl groups, amino groups and R groups such as homoserine, noleucine, methionine, sulfoxide or methionine methyl sulfonium It refers to a compound having carbon. Such analogues have a modified R group (eg, noleucine) or a modified peptide backbone, but retain the chemical structure of the same base as the naturally occurring amino acid. Amino acid mimetics refer to chemical compounds that have a structure that differs from the general chemical structure of amino acids, but which act in a similar manner to naturally occurring amino acids. Amino acids may be referred to herein by their commonly known three letter symbols or by the one-letter symbols recommended by the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Likewise a nucleotide may be referred to by its usually accepted one-letter code.

"상보적으로 변형된 변이체"는 아미노산과 핵산 서열 둘 다에 적용된다. 특정 핵산 서열에 대해, 상보적으로 변형된 변이체는 동일한 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 해당 핵산, 또는 핵산이 본질적으로 동일한 서열에 대해 아미노산 서열을 암호화하지 않는 경우를 지칭한다. 유전자 코드의 축퇴 때문에, 다수의 기능적으로 동일한 핵산은 임의의 주어진 펩타이드를 암호화한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 암호화한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 구체화되는 모든 위치에서, 코돈은 암호화된 폴리펩타이드를 변경하지 않고 기재된 대응하는 코돈 중 어떤 것으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변형은 "침묵 변형"인데, 이는 상보적으로 변형된 변형의 한 종류이다. 또한 폴리펩타이드를 암호화하는 본 명세서의 모든 핵산 서열은 핵산의 모든 가능한 침묵 변형을 기재한다. 당업자라면 핵산에서 각 코돈(보통 단지 메티오닌에 대한 코돈인 AUG 및 보통 단지 트립토판에 대한 코돈인 TGG를 제외)이 변형되어 기능적으로 동일한 분자를 수득할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 각 침묵 변형은 발현 생성물에 대해 각각 기재된 서열에 내포되지만, 실제 프로브 서열에 대해서는 아니다.“Complementarily modified variants” apply to both amino acid and nucleic acid sequences. For a particular nucleic acid sequence, complementary modified variants refer to those nucleic acids that encode identical or essentially identical amino acid sequences, or where the nucleic acids do not encode amino acid sequences for sequences that are essentially identical. Because of the degeneracy of the genetic code, multiple functionally identical nucleic acids encode any given peptide. For example, codons GCA, GCC, GCG and GCU all encode the amino acid alanine. Thus, at all positions where alanine is specified by a codon, the codon can be changed to any of the corresponding codons described without altering the encoded polypeptide. Such nucleic acid modifications are "silent modifications", which is a type of complementary modification. In addition, every nucleic acid sequence herein that encodes a polypeptide describes all possible silent modifications of the nucleic acid. Those skilled in the art will recognize that in a nucleic acid each codon (except AUG, which is usually only a codon for methionine and TGG, which is usually only a codon for tryptophan) can be modified to yield a functionally identical molecule. Thus, each silent modification of a nucleic acid encoding a polypeptide is implied in the sequence respectively described for the expression product, but not for the actual probe sequence.

아미노산 서열에 대해, 당업자라면 암호화된 서열 내 아미노산의 단일 아미노산 또는 적은 백분율을 변경하고, 첨가하거나 또는 결실시키는 핵산 또는 펩타이드 서열에 대한 개개의 치환, 결실 또는 첨가는, 변경이 화학적으로 유사한 아미노산으로 아미노산의 차환을 초래하는 경우, "상보적으로 변형된 변이체"라는 것을 인식할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 상보적 치환 표는 당업계에 잘 공지되어 있다. 이러한 상보적으로 변형된 변이체가 추가되며, 다형성 변이체, 종간 상동성 및 본 발명의 대립유전자를 제외하지 않는다.For amino acid sequences, those skilled in the art will appreciate that individual substitutions, deletions, or additions to a nucleic acid or peptide sequence that alters, adds, or deletes a single amino acid or a small percentage of amino acids in the encoded sequence, will result in amino acids that are chemically similar in alteration. It will be appreciated that if it results in a refinancing of, it is a “complementary modified variant”. Complementary substitution tables that provide functionally similar amino acids are well known in the art. Such complementary modified variants are added and do not exclude polymorphic variants, interspecies homology and alleles of the invention.

다음의 8개 그룹은 각각 서로 상보적 치환인 아미노산을 함유한다: 1) 알라닌(A), 글라이신(G); 2) 아스팔트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 알기닌(R), 리신(K); 5) 아이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W); 7) 세린(S), 트레오닌(T); 및 8) 시스테인(C), 메티오닌(M). 예를 들어, 문헌[Creighton, Proteins (1984)]을 참조한다.The following eight groups each contain amino acids that are complementary to each other: 1) Alanine (A), Glycine (G); 2) asphalt acid (D), glutamic acid (E); 3) asparagine (N), glutamine (Q); 4) arginine (R), lysine (K); 5) isoleucine (I), leucine (L), methionine (M), valine (V); 6) phenylalanine (F), tyrosine (Y), tryptophan (W); 7) serine (S), threonine (T); And 8) cysteine (C), methionine (M). See, eg, Creighton, Proteins (1984).

2 이상의 핵산 또는 펩타이드 서열의 내용에서 용어 "동일한" 또는 "동일성" 백분율은 이하에 기재되는 디폴트 변수에 의한 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘을 사용하여, 또는 조작 정렬 및 시각적 검사에 의해 측정된 바와 같이 동일하거나 또는 동일한(즉, 비교창 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대 대응도로 비교되고 정렬될 때 특정된 영역에 걸쳐 약 60% 동일성, 바람직하게는 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성) 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 구체화된 백분율을 갖는 2 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다.The term “identical” or “identity” percentages in the context of two or more nucleic acid or peptide sequences is determined using a BLAST or BLAST 2.0 sequence comparison algorithm with default variables described below, or as measured by engineered alignment and visual inspection. About 60% identity, preferably 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, over the specified area when compared or aligned to the same or the same (i.e., comparison window or maximal correspondence over a specified area) 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more identity) 2 or more sequences or subsequences with specified percentages of amino acid residues or nucleotides Refers to.

본 명세서에서 "치료적 유효량 또는 치료적 용량" 또는 "충분량 또는 충분한 용량"은 투여되는 효과를 생성하는 용량을 의미한다. 정확한 용량은 치료 목적에 의존할 것이며, 공지된 기법을 사용하여 당업자에 의해 확인될 수 있다(예를 들어, 문헌[Augsburger & Hoag, Pharmaceutical Dosage Forms(vols. 1-3, 3rd Ed. 2008); Lloyd, The Art , Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(3rd Ed., 2008); Pickar, Dosage Calculations (8th Ed., 2007); 및 Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., 2005, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins] 참조).As used herein, "therapeutically effective amount or therapeutic dose" or "sufficient amount or sufficient dose" means a dose that produces the effect to be administered. The exact dose will depend on the purpose of the treatment and can be ascertained by one skilled in the art using known techniques (eg, Augsburger & Hoag, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 3rd Ed. 2008); Lloyd, The Art , Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (3rd Ed., 2008); Pickar, Dosage Calculations (8th Ed., 2007); And Remington : The Science and Practice of Pharmacy , 21st Ed., 2005, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins.

III.III. FVIII 펩타이드FVIII Peptides

본 발명은 FVIII에 대한 면역 반응에 수반된 FVIII 단백질의 영역에 대응하는 FVIII 펩타이드에 관한 것이다. 한 양태에서, 본 발명은 다음의 아미노산 서열중 하나에서 9개의 연속적 아미노산과 적어도 85% 동일한 9개의 아미노산의 연속적 서열로 이루어진 FVIII 펩타이드를 제공하되: AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(서열번호 68); QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(서열번호 344); 또는 TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(서열번호 740), 해당 펩타이드는 9 내지 180개의 아미노산으로 이루어진다.The present invention relates to FVIII peptides corresponding to regions of the FVIII protein involved in the immune response to FVIII. In one aspect, the invention provides an FVIII peptide consisting of a contiguous sequence of 9 amino acids that is at least 85% identical to 9 contiguous amino acids in one of the following amino acid sequences: AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG (SEQ ID NO: 68); QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID NO: 344); Or TVVITLKNMASHPVSLHAVGV (SEQ ID NO: 740), the peptide consists of 9 to 180 amino acids.

구체적 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 서열 (R¹)_x-P-(R²)_y를 가지며, 상기 식 중, P는 서열번호 68, 344 및 740으로부터 선택된 서열의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R¹은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; R²는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다. 한 실시형태에서, R¹은 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, R²는 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.In a specific embodiment, the FVIII peptide has the sequence (R ¹ ) _x -P- (R ² ) _y , wherein P is a sequence of at least 9 consecutive amino acids of the sequence selected from SEQ ID NOs: 68, 344 and 740; An amino acid sequence having at least 85% identity and R ¹ is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids; R ² is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids; Each x and y is independently 0 or 1. In one embodiment, R ¹ is an amino acid sequence consisting of 1 to 40 amino acids and R ² is an amino acid sequence consisting of 1 to 40 amino acids.

한 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 또 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.In one embodiment, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 80 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 70 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 60 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 50 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 40 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 30 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 20 amino acids. R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 10 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 5 amino acids. In another embodiment, R ¹ and R ² are individually or both 1 to 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 , 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 or 80 amino acids.

한 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 150개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 또는 180개의 아미노산으로 이루어진다.In one embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 150 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 100 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 50 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9-25 amino acids. In yet another embodiment, the FVIII peptides are 9 to 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 , 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 , 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 , 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120 , 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 or 180 amino acids.

일반적으로, 본 발명의 FVIII 펩타이드는 FVIII^{102 -122}, FVIII^{246 -266} 또는 FVIII^1401-1424의 확인된 영역에 존재하는 임의의 아미노산 서열 또는, 예를 들어 FVIII^102-122, FVIII^{246 -266} 또는 FVIII1^{401 -1424}와 유사하거나 도는 동일한 보유 기능을 가질 수 있는 변형된 변이체를 포함할 수 있다. 특히, 본 발명의 FVIII 펩타이드는 T 세포 에피토프를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. FVIII 펩타이드는 아미노산 서열 AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(서열번호 68); QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(서열번호 344); 또는 TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(서열번호 740)에 대해 동일성 백분율의 범위에 있을 수 있는 적어도 9개의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, FVIII 펩타이드는 FVIII^{102 -122}, FVIII^{246 -266} 또는 FVIII^{1401 -1424}에서 9개의 연속적 아미노산 중 어떤 것과 동일하거나 또는 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 85% 동일한 백분율의 9개의 아미노산을 가질 수 있다.In general, peptides of the invention FVIII FVIII ^{102 -122, 246 -266} FVIII or FVIII ^1401-1424 any amino acid present in the identified region or sequence of, for example a FVIII ^{102-122, 246 -266,} or FVIII FVIII1 ^It may include modified variants that may have similar or identical retention functions to ^401-1424 . In particular, the FVIII peptides of the invention comprise an amino acid sequence comprising a T cell epitope. FVIII peptides include the amino acid sequence AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG (SEQ ID NO: 68); QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID NO: 344); Or at least 9 amino acid sequences that may be in the range of percent identity for TVVITLKNMASHPVSLHAVGV (SEQ ID NO: 740). For example, FVIII peptides FVIII ^{102 -122, 246 -266} FVIII or FVIII ^{1401 -1424} from 9 identical or at least 50% to any one of the consecutive amino acids, 60%, 70%, 80% or 85% with the same percentage It may have nine amino acids.

실시형태의 다른 그룹에서, FVIII 펩타이드는 9개 아미노산 초과의 아미노산 서열을 가질 수 있는데, 여기서 아미노산 서열은 FVIII^{102 -122}, FVIII^{246 -266} 또는 FVIII^1401-1424의 연속적 아미노산의 서열과 동일하거나 또는 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 백분율일 수 있는 영역을 포함한다. 당업자라면 알라닌 치환과 같은 공지된 돌연변이유발 기법이 FVIII^{102 -122}, FVIII^{246 -266} 또는 FVIII^{1401 -1424} 영역의 기능을 보유하는 변형된 변이체를 확인하기 위하여 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.In another group of embodiments, FVIII peptides may have an amino acid sequence of nine amino acids in excess, in which amino acid sequence is the same as that of the continuous amino acid sequence of the FVIII ^{102 -122, 246 -266} FVIII or FVIII or at least ^1401-1424 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% Or 99% of the area, which may be the same percentage. Those skilled in the art will recognize that the known mutagenesis techniques, such as the alanine substitutions can be used to determine the modified variant to retain the function of FVIII ^{102 -122, 246 -266} FVIII or FVIII ^{1401 -1424} region.

추가로, FVIII 펩타이드는 상기 논의한 FVIII 펩타이드의 코어 서열의 말단 중 하나 상에서 추가적인 아미노산 서열을 더 포함할 수 있다. 추가적인 서열은 지정된 (R¹)_x 및 (R²)_y이다. 특정 실시형태에서, R¹ 및 R²는 길이로 1 내지 약 80개의 아미노산의 범위에 있을 수 있다. 대안적으로, R¹ 및 R²는 길이로 1 내지 약 40개의 아미노산의 범위에 있을 수 있다. 특정 실시형태에서, 각각의 아래첨자 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다. 일부 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 1일 수 있고, y는 0일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, x는 0일 수 있고, y는 1일 수 있다. 다른 실시형태에서, x와 y는 둘 다 1이다. 양 말단 중 하나 상에서 추가적인 아미노산은 펩타이드의 증가된 안정성, MHC 클래스 II 분자 및/또는 T 세포에 대한 개선된 결합뿐만 아니라 당업자에 의해 인식될 다른 양태를 포함하는 다양한 이유로 첨가될 수 있다.In addition, the FVIII peptide may further comprise an additional amino acid sequence on one of the ends of the core sequence of the FVIII peptide discussed above. Additional sequences are designated (R ¹ ) _x and (R ² ) _y . In certain embodiments, R ¹ and R ² may be in the range of 1 to about 80 amino acids in length. Alternatively, R ¹ and R ² may be in the range of 1 to about 40 amino acids in length. In certain embodiments, each subscript x and y is independently 0 or 1. In some embodiments, both x and y can be zero. In other embodiments, x can be 1 and y can be 0. In yet another embodiment, x can be 0 and y can be 1. In other embodiments, x and y are both 1. Additional amino acids on either end may be added for a variety of reasons, including increased stability of the peptide, improved binding to MHC class II molecules and / or T cells, as well as other embodiments to be recognized by those skilled in the art.

한 실시형태에서, 본 발명은 (R¹)_x-P-(R²)_y를 갖는 폴리펩타이드를 제공하되, 상기 식 중, P는 표 1에서 확인되는 인자 VIII 영역의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R¹은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, R²는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고, 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다. 대안적으로, R¹ 및 R²는 길이로 1 내지 40개의 아미노산의 범위에 있을 수 있다. 한 실시형태에서, P는 표 1에서 확인된 인자 VIII 영역의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, P는 표 1에서 확인된 인자 VIII 영역의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 일부 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 1일 수 있고, y는 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 0일 수 있고, y는 1일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, x와 y는 둘 다 1일 수 있다. 한 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 150개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다.In one embodiment, the invention provides a polypeptide having (R ¹ ) _x -P- (R ² ) _y , wherein P is a composition of at least 9 consecutive amino acids of the region of factor VIII identified in Table 1 An amino acid sequence having at least 85% identity with the sequence, R ¹ is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids, R ² is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids, and each x and y is independently 0 or 1 Alternatively, R ¹ and R ² may be in the range of 1 to 40 amino acids in length. In one embodiment, P is an amino acid sequence having at least 90% identity to the sequence of at least nine consecutive amino acids of the region of factor VIII identified in Table 1. In another embodiment, P is an amino acid sequence having at least 95% identity to the sequence of at least nine consecutive amino acids of the region of factor VIII identified in Table 1. In some embodiments, both x and y can be zero. In other embodiments, x can be 1 and y can be 0. In other embodiments, x can be 0 and y can be 1. In yet another embodiment, both x and y can be one. In one embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 150 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 100 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 50 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9-25 amino acids.

상기 기재한 바와 같이, 본 발명의 FVIII 펩타이드는 FVIII^{1401 -1424}의 확인된 영역에 존재하는 임의의 아미노산 서열 또는 예를 들어 FVIII^{1401 -1424}와 유사하거나 또는 동일한 보유 기능을 가질 수 있는 변형된 변이체를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 펩타이드는 인간 FVIII 단백질의 전체 B-도메인을 다룰 수 있다. 본 발명은 또한 다음의 아미노산 서열 중 어떤 하나에 대해 동일성 백분율의 범위에 있을 수 있는 적어도 9개의 아미노산의 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 다른 FVIII 펩타이드를 포함할 수 있다: GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI(FVIII^{474 -494}; 서열번호 159), PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER(FVIII^{540 -560}; 서열번호 250), EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY(FVIII^1785-1805; 서열번호 477), LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG (FVIII^2025-2045; 서열번호 568), NPPIIARYIRLHPTHYSIRST (FVIII^{2160 -2180}; 서열번호 659), TVVITLKNMASHPVSLHA(FVIII^{102 -119}; 서열번호 10), AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG (FVIII^246-266; 서열번호 68) 및 TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(FVIII^{102 -122}; 서열번호 740).As described above, FVIII polypeptide of the invention is a modified variant can be of any amino acid sequence or for example, similar or identical function as the holding FVIII ^{1401 -1424} present in the identified region of the FVIII ^{1401 -1424} It may include. In certain embodiments, the peptide may handle the entire B-domain of human FVIII protein. The invention may also include other FVIII peptide comprising a peptide having at least nine amino acid sequence of which can be in the range of percentage identity for any of the following amino acid sequence: GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI (FVIII ^{474 -494;} SEQ ID NO: No. ^{159), PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER (FVIII 540 -560} ; SEQ ID NO: 250), EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY (FVIII ^1785-1805; SEQ ID NO: 477), LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG (FVIII ^2025-2045; SEQ ID NO: ^{568), NPPIIARYIRLHPTHYSIRST (FVIII 2160 -2180} ; SEQ ID NO: 659 ), TVVITLKNMASHPVSLHA (FVIII ^{102 -119;} SEQ ID NO: 10), AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG (FVIII ^246-266; SEQ ID NO: 68) and TVVITLKNMASHPVSLHAVGV (FVIII ^{102 -122;} SEQ ID NO: 740).

예를 들어, FVIII 펩타이드는 FVIII^{474 -494}, FVIII^{540 -560}, FVIII1^{785 -1805}, FVIII^2025-2045, FVIII^{2160 -2180}, FVIII^{102 -119}, FVIII^{246 -266} 또는 FVIII^{102 -122} 내 9개의 연속적 아미노산 중 어떤 것과 동일하거나 또는 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 85% 동일한 9개의 아미노산을 가진다. 실시형태의 다른 그룹에서, FVIII 펩타이드는 9개 아미노산 초과의 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 여기서 아미노산 서열은 FVIII^474-494, FVIII^{540 -560,} FVIII^{1785 -1805}, FVIII^{2025 -2045}, FVIII^{2160 -2180}, FVIII^{102 -119}, FVIII^246-266 또는 FVIII^{102 -122} 내 9개의 연속적 아미노산 중 어떤 것과 동일하거나 또는 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99 동일할 수 있다. 당업자라면 알라닌 치환과 같은 공지된 돌연변이유발기법이 FVIII^{474 -494}, FVIII^{540 -560}, FVIII^{1785 -1805}, FVIII^{2025 -2045}, FVIII^{2160 -2180}, FVIII^102-119, FVIII^{246 -266} 또는 FVIII^{102 -122} 영역의 기능을 보유하는 변형된 변이체를 확인하기 위하여 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 본 명세서에 개시된 FVIII 펩타이드는 FVIII^{1401 -1424}에 관한 FVIII 펩타이드에 대해 상기 기재한 방법을 사용하여 만들어질 수 있다.For example, FVIII peptides ^{FVIII 474 -494, FVIII 540 -560,} FVIII1 785 -1805, FVIII 2025-2045, FVIII 2160 -2180, FVIII 102 -119, FVIII 246 -266 ^{102 -122} or FVIII within nine consecutive Have 9 amino acids that are the same or at least 50%, 60%, 70%, 80% or 85% identical to any of the amino acids. In another group of embodiments, FVIII-peptide may have an amino acid sequence of nine amino acids in excess, in which the amino acid sequence ^474-494 FVIII, FVIII ^{540 -560, 1785 -1805} FVIII, FVIII ^{2025 -2045, 2160 -2180} FVIII , ^{102 -119} FVIII, FVIII or FVIII ^{246-266 102 -122} which identical with those of my nine contiguous amino acids, or at least 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% , 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99. Those skilled in the art, the known mutagenesis techniques, such as the alanine substitutions ^{474 -494} FVIII, FVIII ^{540 -560, 1785 -1805} FVIII, FVIII ^{2025 -2045, 2160 -2180} FVIII, FVIII ^{102-119, 246 -266} FVIII or FVIII ^{102 -} It will be appreciated that it can be used to identify modified variants that possess the functionality of the ¹²² region. FVIII peptides disclosed herein may be made using the process as described above for the FVIII polypeptide of the FVIII ^{1401 -1424.}

A.A. 인자 factor VIIIVIII ^{102102 -119-119} 펩타이드Peptides

한 실시형태에서, 본 발명은 서열 (R¹)_x-P-(R²)_y를 갖는 폴리펩타이드를 제공하되, 상기 식 중, P는 서열 TVVITLKNMASHPVSLHA(서열번호 10)을 갖는 인자 VIII^{102 -119} 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R¹은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, R²는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고, 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.In one embodiment, the present invention SEQ ID NO: _{^{(R 1) x -P- (R}} 2) , but provides a polypeptide having the _y, In the formula, P is the factor VIII ^{102 -119} TVVITLKNMASHPVSLHA having the sequence (SEQ ID NO: 10) An amino acid sequence having at least 85% identity with a sequence of at least 9 consecutive amino acids of a peptide, R ¹ is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids, R ² is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids, and each x and y are independently 0 or 1.

한 실시형태에서, P는 서열 TVVITLKNMASHPVSLHA(서열번호 10)을 갖는 인자 VIII^102-119 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 1 내지 55(서열번호 10)로부터 선택된 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 1 내지 55로부터 선택된 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 1 내지 55로부터 선택된 아미노산 서열이다. 일부 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 1일 수 있고, y는 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 0일 수 있고, y는 1일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, x와 y는 둘 다 1일 수 있다.In one embodiment, P is an amino acid sequence having at least 90% identity with at least nine consecutive amino acids of the Factor VIII ^102-119 peptide having the sequence TVVITLKNMASHPVSLHA (SEQ ID NO: 10). In one embodiment, P is an amino acid sequence having at least 85% identity selected from SEQ ID NOs: 1-55 (SEQ ID NO: 10). In one embodiment, P is an amino acid sequence having at least 90% identity selected from SEQ ID NOs: 1-55. In one embodiment, P is an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1-55. In some embodiments, both x and y can be zero. In other embodiments, x can be 1 and y can be 0. In other embodiments, x can be 0 and y can be 1. In yet another embodiment, both x and y can be one.

한 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 또 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80 개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.In one embodiment, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 80 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 70 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 60 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 50 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 40 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 30 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 20 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 10 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 5 amino acids. In another embodiment, R ¹ and R ² are individually or both 1 to 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 , 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 or 80 amino acids.

특정 실시형태에서, R¹은 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고, R²는 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 150개의 아미노산을 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 또는 180개의 아미노산으로 이루어진다.In certain embodiments, R ¹ is an amino acid sequence consisting of 1 to 40 amino acids and R ² is an amino acid sequence consisting of 1 to 40 amino acids. In one embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 150 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 100 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 50 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9-25 amino acids. In yet another embodiment, the FVIII peptides are 9 to 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 , 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 , 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 , 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120 , 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 or 180 amino acids.

B.B. 인자 VIIIFactor VIII ^{246-266246-266} 펩타이드 Peptides

한 실시형태에서, 본 발명은 서열 (R¹)_x-P-(R²)_y를 갖는 폴리펩타이드를 제공하되, 상기 식 중, P는 서열: AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(서열번호 68)을 갖는 인자 VIII^{246 -266} 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R¹은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, R²는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고, 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.In one embodiment, the present invention provides a polypeptide having the sequence (R ¹ ) _x -P- (R ² ) _y , wherein P is the factor VIII ^{246 -} having the sequence: AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG (SEQ ID NO: 68). ^An amino acid sequence having at least 85% identity to the sequence of at least 9 consecutive amino acids of ²⁶⁶ peptides, R ¹ is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids, R ² is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids, Each x and y is independently 0 or 1.

한 실시형태에서, P는 서열: AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(서열번호 68)을 갖는 인자 VIII^{246 -266} 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열: AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(서열번호 68)를 갖는 인자 VIII^{246 -266} 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 56 내지 146으로부터 선택되는 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 56 내지 146으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 56 내지 146으로부터 선택되는 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 56 내지 146으로부터 선택되는 아미노산 서열이다. 일부 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 1일 수 있고, y는 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 0일 수 있고, y는 1일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, x와 y는 둘 다 1일 수 있다.In one embodiment, P is a sequence: AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG an amino acid sequence having at least 90% identity to the sequence of at least nine consecutive amino acids of the factor VIII polypeptide having ^{246 -266} (SEQ ID NO: 68). In one embodiment, P is a sequence: AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG an amino acid sequence having at least 95% identity to the sequence of at least nine consecutive amino acids of the factor VIII polypeptide having ^{246 -266} (SEQ ID NO: 68). In one embodiment, P is an amino acid sequence having at least 85% identity with the sequence selected from SEQ ID NOs: 56-146. In one embodiment, P is an amino acid sequence having at least 90% identity with the sequence selected from SEQ ID NOs: 56-146. In one embodiment, P is an amino acid sequence having at least 95% identity with a sequence selected from SEQ ID NOs: 56-146. In one embodiment, P is an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 56-146. In some embodiments, both x and y can be zero. In other embodiments, x can be 1 and y can be 0. In other embodiments, x can be 0 and y can be 1. In yet another embodiment, both x and y can be one.

한 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 또 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.In one embodiment, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 80 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 70 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 60 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 50 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 40 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 30 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 20 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 10 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 5 amino acids. In another embodiment, R ¹ and R ² are individually or both 1 to 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 , 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 or 80 amino acids.

한 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 150개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 또는 180개의 아미노산으로 이루어진다.In one embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 150 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 100 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 50 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9-25 amino acids. In yet another embodiment, the FVIII peptides are 9 to 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 , 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 , 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 , 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120 , 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 or 180 amino acids.

C.C. 인자 factor VIIIVIII ^{474474 -494-494} 펩타이드Peptides

한 실시형태에서, 본 발명은 서열 (R¹)_x-P-(R²)_y를 갖는 폴리펩타이드를 제공하되, 상기 식 중, P는 서열: GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI(서열번호 159)을 갖는 인자 VIII^{474 -494} 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R¹은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, R²는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고, 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.In one embodiment, the invention provides a polypeptide having the sequence (R ¹ ) _x -P- (R ² ) _y , wherein P is the factor VIII ^{474 -} having the sequence: GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI (SEQ ID NO: 159). ^An amino acid sequence having at least 85% identity with at least 9 consecutive amino acids of the ⁴⁹⁴ peptide, R ¹ is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids, R ² is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids, each x And y is independently 0 or 1.

한 실시형태에서, P는 서열: GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI(서열번호 159)를 갖는 인자 VIII^{474 -494} 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열: GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI(서열번호 159)를 갖는 인자 VIII^{474 -494} 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 147 내지 237로부터 선택된 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 147 내지 237로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 147 내지 237로부터 선택된 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 147 내지 237로부터 선택된 아미노산 서열이다. 일부 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 1일 수 있고, y는 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 0일 수 있고, y는 1일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, x와 y는 둘 다 1일 수 있다.In one embodiment, P is an amino acid sequence having at least 90% identity to at least nine consecutive amino acids of the Factor VIII ^{474 -494} peptide having the sequence: GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI (SEQ ID NO: 159). In one embodiment, P is an amino acid sequence having at least 95% identity to at least nine consecutive amino acids of the Factor VIII ^{474 -494} peptide having the sequence: GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI (SEQ ID NO: 159). In one embodiment, P is an amino acid sequence having at least 85% identity to the sequence selected from SEQ ID NOs: 147-237. In one embodiment, P is an amino acid sequence having at least 90% identity to the sequence selected from SEQ ID NOs: 147-237. In one embodiment, P is an amino acid sequence having at least 95% identity to the sequence selected from SEQ ID NOs: 147-237. In one embodiment, P is an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 147-237. In some embodiments, both x and y can be zero. In other embodiments, x can be 1 and y can be 0. In other embodiments, x can be 0 and y can be 1. In yet another embodiment, both x and y can be one.

특정 실시형태에서, R¹은 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, R²는 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 150개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 또는 180개의 아미노산으로 이루어진다.In certain embodiments, R ¹ is an amino acid sequence consisting of 1 to 40 amino acids and R ² is an amino acid sequence consisting of 1 to 40 amino acids. In one embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 150 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 100 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 50 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9-25 amino acids. In yet another embodiment, the FVIII peptides are 9 to 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 , 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 , 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 , 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120 , 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 or 180 amino acids.

D. 인자 D. Factor VIIIVIII ^{540540 -560-560} 펩타이드Peptides

한 실시형태에서, 본 발명은 서열 (R¹)_x-P-(R²)_y를 갖는 폴리펩타이드를 제공하되, 상기 P는 서열: PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER(서열번호 250)을 갖는 인자 VIII^{540 -560} 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R¹은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고, R²는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, 각각의 x 및 y는 0 또는 1이다.In one embodiment, the present invention provides a polypeptide having the sequence (R ¹ ) _x -P- (R ² ) _y , wherein P is of the Factor VIII ^{540 -560} peptide having the sequence: PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER (SEQ ID NO: 250) An amino acid sequence having at least 85% identity with a sequence of at least 9 consecutive amino acids, R ¹ is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids, R ² is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids, each of x and y is 0 or 1.

한 실시형태에서, P는 서열: PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER(서열번호 250)을 갖는 인자 VIII^{540 -560} 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열: PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER(서열번호 250)을 갖는 인자 VIII^{540 -560} 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 238 내지 328로부터 선택된 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 238 내지 328로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 238 내지 328로부터 선택된 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 238 내지 328로부터 선택된 아미노산 서열이다. 일부 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 1일 수 있고, y는 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 0일 수 있고, y는 1일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, x와 y는 둘 다 1일 수 있다.In one embodiment, P is an amino acid sequence having at least 90% identity to at least nine consecutive amino acids of the Factor VIII ^{540 -560} peptide having the sequence: PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER (SEQ ID NO: 250). In one embodiment, P is an amino acid sequence having at least 95% identity to the sequence of at least 9 consecutive amino acids of the Factor VIII ^{540 -560} peptide having the sequence: PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER (SEQ ID NO: 250). In one embodiment, P is an amino acid sequence having at least 85% identity to the sequence selected from SEQ ID NOs: 238 to 328. In one embodiment, P is an amino acid sequence having at least 90% identity to the sequence selected from SEQ ID NOs: 238 to 328. In one embodiment, P is an amino acid sequence having at least 95% identity to the sequence selected from SEQ ID NOs: 238 to 328. In one embodiment, P is an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 238-328. In some embodiments, both x and y can be zero. In other embodiments, x can be 1 and y can be 0. In other embodiments, x can be 0 and y can be 1. In yet another embodiment, both x and y can be one.

한 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.In one embodiment, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 80 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 70 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 60 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 50 amino acids. In other embodiments, in other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 40 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 30 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 20 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 10 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 5 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both 1 to 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, Amino acid sequence consisting of 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 or 80 amino acids.

한 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 150개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 또는 180개의 아미노산으로 이루어진다.In one embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 150 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 100 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 50 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9-25 amino acids. In yet another embodiment, the FVIII peptides are 9 to 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 , 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 , 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 , 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120 , 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 or 180 amino acids.

E.E. 인자 factor VIIIVIII ^{14011401 -1424-1424} 펩타이드Peptides

한 실시형태에서, 본 발명은 서열 (R¹)_x-P-(R²)_y를 갖는 폴리펩타이드를 제공하되, 상기 식 중, P는 서열: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(서열번호 344)을 갖는 인자 VIII^{1401 -1424} 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R¹은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, R²는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고, 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.In one embodiment, the present invention provides a polypeptide having the sequence (R ¹ ) _x -P- (R ² ) _y , wherein P is the factor VIII ^{1401 -} having the sequence: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID NO: 344). ^An amino acid sequence having at least 85% identity to at least 9 consecutive amino acids of the ¹⁴²⁴ peptide, R ¹ is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids, R ² is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids, and each x and y are independently 0 or 1.

한 실시형태에서, P는 서열: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(서열번호 344)을 갖는 인자 VIII^{1401 -1424} 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(서열번호 344)을 갖는 인자 VIII^{1401 -1424} 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 329 내지 464로부터 선택된 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 329 내지 464로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 329 내지 464로부터 선택된 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 329 내지 464로부터 선택된 아미노산 서열이다. 일부 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 1일 수 있고, y는 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 0일 수 있고, y는 1일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, x와 y는 둘 다 1일 수 있다.In one embodiment, P is a sequence: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT an amino acid sequence having at least 90% identity to at least 9 consecutive amino acids of the factor VIII ^{1401 -1424} peptide with (SEQ ID NO: 344). In one embodiment, P is a sequence: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT an amino acid sequence having at least 95% identity to at least 9 consecutive amino acids of the factor VIII ^{1401 -1424} peptide with (SEQ ID NO: 344). In one embodiment, P is an amino acid sequence having at least 85% identity to the sequence selected from SEQ ID NOs: 329 to 464. In one embodiment, P is an amino acid sequence having at least 90% identity to the sequence selected from SEQ ID NOs: 329 to 464. In one embodiment, P is an amino acid sequence having at least 95% identity to the sequence selected from SEQ ID NOs: 329 to 464. In one embodiment, P is an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 329-464. In some embodiments, both x and y can be zero. In other embodiments, x can be 1 and y can be 0. In other embodiments, x can be 0 and y can be 1. In yet another embodiment, both x and y can be one.

한 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 또 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.In one embodiment, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 80 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 70 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 60 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 50 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 40 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 30 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 20 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 10 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 5 amino acids. In another embodiment, R ¹ and R ² are individually or both 1 to 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 , 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 or 80 amino acids.

한 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 150개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 또는 180개의 아미노산으로 이루어진다.In one embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 150 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 100 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 50 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9-25 amino acids. In yet another embodiment, the FVIII peptides are 9 to 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 , 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 , 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 , 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120 , 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 or 180 amino acids.

F.F. 인자 factor VIIIVIII ^{17851785 -1805-1805} 펩타이드Peptides

한 실시형태에서, 본 발명은 서열 (R¹)_x-P-(R²)_y를 갖는 폴리펩타이드를 제공하되, 상기 식 중, P는 서열: EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY(서열번호 477)을 갖는 인자 VIII^{1785 -1805} 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R¹은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, R²는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고, 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다. 한 실시형태에서, P는 서열: EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY(서열번호 477)을 갖는 인자 VIII^{1785 -1805} 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.In one embodiment, the present invention provides a polypeptide having the sequence (R ¹ ) _x -P- (R ² ) _y , wherein P is the factor VIII ^{1785 -} having the sequence: EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY (SEQ ID NO: 477). ^An amino acid sequence having at least 85% identity to the sequence of at least 9 consecutive amino acids of the ¹⁸⁰⁵ peptide, R ¹ is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids, R ² is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids, Each x and y is independently 0 or 1. In one embodiment, P is a sequence: EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY (SEQ ID NO: 477), factor VIII is a ¹⁷⁸⁵ amino acid sequence having at least 90% identity to the sequence of at least nine consecutive amino acids of the ^-1805 peptide with.

한 실시형태에서, P는 서열: EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY(서열번호 477)을 갖는 인자 VIII^{1785 -1805} 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 465 내지 555로부터 선택된 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 465 내지 555로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 465 내지 555로부터 선택된 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 465 내지 555로부터 선택된 아미노산 서열이다. 일부 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 1일 수 있고, y는 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 0일 수 있고, y는 1일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, x와 y는 둘 다 1일 수 있다.In one embodiment, P is an amino acid sequence having at least 95% identity to at least nine consecutive amino acids of the Factor VIII ^{1785 -1805} peptide having the sequence: EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY (SEQ ID NO: 477). In one embodiment, P is an amino acid sequence having at least 85% identity to the sequence selected from SEQ ID NOs: 465-555. In one embodiment, P is an amino acid sequence having at least 90% identity to the sequence selected from SEQ ID NOs: 465-555. In one embodiment, P is an amino acid sequence having at least 95% identity to the sequence selected from SEQ ID NOs: 465-555. In one embodiment, P is an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 465-555. In some embodiments, both x and y can be zero. In other embodiments, x can be 1 and y can be 0. In other embodiments, x can be 0 and y can be 1. In yet another embodiment, both x and y can be one.

한 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 또 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.In one embodiment, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 80 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 70 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 60 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 50 amino acids. R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 40 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 30 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 20 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 10 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 5 amino acids. In another embodiment, R ¹ and R ² are individually or both 1 to 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 , 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 or 80 amino acids.

한 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 150개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 또는 180개의 아미노산으로 이루어진다.In one embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 150 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 100 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 50 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9-25 amino acids. In yet another embodiment, the FVIII peptides are 9 to 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 , 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 , 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 , 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120 , 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 or 180 amino acids.

G.G. 인자 factor VIIIVIII ^{20252025 -2045-2045} 펩타이드Peptides

한 실시형태에서, 본 발명은 서열 (R¹)_x-P-(R²)_y를 갖는 폴리펩타이드를 제공하되, 상기 식 중, P는 서열: LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG(서열번호 568)를 갖는 인자 VIII^{2025 -2045} 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R¹은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, R²는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고, 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.In one embodiment, the present invention SEQ ID NO: _{^{(R 1) x -P- (R}} 2) , but provides a polypeptide having the _y, In the formula, P is the sequence: factor VIII having LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG ²⁰²⁵ (SEQ ID NO: ^{568) An} amino acid sequence having at least 85% identity to the sequence of at least 9 consecutive amino acids of the ²⁰⁴⁵ peptide, R ¹ is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids, R ² is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids, Each x and y is independently 0 or 1.

한 실시형태에서, P는 서열: LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG(서열번호 568)를 갖는 인자 VIII^{2025 -2045} 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열: LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG(서열번호 568)을 갖는 인자 VIII^{2025 -2045} 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 556 내지 646으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 556 내지 646으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 556 내지 646으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 556 내지 646으로부터 선택된 아미노산 서열이다. 일부 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 1일 수 있고, y는 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 0일 수 있고, y는 1일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, x와 y는 둘 다 1일 수 있다.In one embodiment, P is a sequence: LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG factor VIII ^{2025 -2045} is an amino acid sequence having at least 90% identity to the sequence of at least nine contiguous amino acids of the peptide having a (SEQ ID NO: 568). In one embodiment, P is a sequence: LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG factor VIII ^{2025 -2045} is an amino acid sequence having at least 95% identity to the sequence of at least nine contiguous amino acids of the peptide having a (SEQ ID NO: 568). In one embodiment, P is an amino acid sequence having at least 85% identity to the sequence selected from SEQ ID NOs: 556-646. In one embodiment, P is an amino acid sequence having at least 90% identity to the sequence selected from SEQ ID NOs: 556-646. In one embodiment, P is an amino acid sequence having at least 95% identity to the sequence selected from SEQ ID NOs: 556-646. In one embodiment, P is an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 556-646. In some embodiments, both x and y can be zero. In other embodiments, x can be 1 and y can be 0. In other embodiments, x can be 0 and y can be 1. In yet another embodiment, both x and y can be one.

한 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 또 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.In one embodiment, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 80 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 70 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 60 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 50 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 40 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 30 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 20 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 10 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 5 amino acids. In another embodiment, R ¹ and R ² are individually or both 1 to 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 , 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 or 80 amino acids.

한 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 150개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 또는 180개의 아미노산으로 이루어진다.In one embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 150 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 100 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 50 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9-25 amino acids. In yet another embodiment, the FVIII peptides are 9 to 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 , 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 , 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 , 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120 , 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 or 180 amino acids.

H.H. 인자 factor VIIIVIII ^{21602160 -2180-2180} 펩타이드Peptides

한 실시형태에서, 본 발명은 서열 (R¹)_x-P-(R²)_y를 갖는 폴리펩타이드를 제공하되, 상기 식 중, P는 서열: NPPIIARYIRLHPTHYSIRST(서열번호 659)를 갖는 인자 VIII^{2160 -2180} 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이며, R¹은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고, R²는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.In one embodiment, the present invention provides a polypeptide having the sequence (R ¹ ) _x -P- (R ² ) _y , wherein P is the factor VIII ^{2160 -} having the sequence: NPPIIARYIRLHPTHYSIRST (SEQ ID NO: 659). ^An amino acid sequence having at least 85% identity to the sequence of at least 9 consecutive amino acids of the ²¹⁸⁰ peptide, R ¹ is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids, R ² is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids, Each x and y is independently 0 or 1.

한 실시형태에서, P는 서열: NPPIIARYIRLHPTHYSIRST(서열번호 659)을 갖는 인자 VIII^{2160 -2180} 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열: NPPIIARYIRLHPTHYSIRST(서열번호 659)를 갖는 인자 VIII^{2160 -2180} 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 647 내지 737로부터 선택된 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 647 내지 737로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 647 내지 737로부터 선택된 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 647 내지 737로부터 선택된 아미노산 서열이다. 일부 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 1일 수 있고, y는 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 0일 수 있고, y는 1일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, x와 y는 둘 다 1일 수 있다.In one embodiment, P is a sequence: NPPIIARYIRLHPTHYSIRST an amino acid sequence having at least 90% identity to the sequence of at least nine consecutive amino acids of the factor VIII ^{2160 -2180} peptide with (SEQ ID NO: 659). In one embodiment, P is a sequence: NPPIIARYIRLHPTHYSIRST an amino acid sequence having at least 95% identity to the sequence of at least nine consecutive amino acids of the factor VIII polypeptide having ^{2160 -2180} (SEQ ID NO: 659). In one embodiment, P is an amino acid sequence having at least 85% identity to the sequence selected from SEQ ID NOs: 647 to 737. In one embodiment, P is an amino acid sequence having at least 90% identity to the sequence selected from SEQ ID NOs: 647 to 737. In one embodiment, P is an amino acid sequence having at least 95% identity to the sequence selected from SEQ ID NOs: 647 to 737. In one embodiment, P is an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 647-737. In some embodiments, both x and y can be zero. In other embodiments, x can be 1 and y can be 0. In other embodiments, x can be 0 and y can be 1. In yet another embodiment, both x and y can be one.

한 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 또 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.In one embodiment, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 80 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 70 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 60 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 50 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 40 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 30 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 20 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 10 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 5 amino acids. In another embodiment, R ¹ and R ² are individually or both 1 to 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 , 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 or 80 amino acids.

한 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 150개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 또는 180개의 아미노산으로 이루어진다.In one embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 150 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 100 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 50 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9-25 amino acids. In yet another embodiment, the FVIII peptides are 9 to 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 , 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 , 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 , 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120 , 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 or 180 amino acids.

I.I. 인자 factor VIIIVIII ^{102102 -122-122} 펩타이드Peptides

한 실시형태에서, 본 발명은 서열 (R¹)_x-P-(R²)_y를 갖는 폴리펩타이드를 제공하되, 상기 식 중, P는 서열: TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(서열번호 740)을 갖는 인자 VIII^{102 -122} 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R¹은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, R²는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고, 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.In one embodiment, the invention provides a polypeptide having the sequence (R ¹ ) _x -P- (R ² ) _y wherein P is the factor VIII ^{102 -} having the sequence: TVVITLKNMASHPVSLHAVGV (SEQ ID NO: 740). ^An amino acid sequence having at least 85% identity to at least 9 consecutive amino acids of a ¹²² peptide, R ¹ is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids, R ² is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids, and each x and y are independently 0 or 1.

한 실시형태에서, P는 서열: TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(서열번호 740)를 갖는 인자 VIII^{102 -122} 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열: TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(서열번호 740)를 갖는 인자 VIII^{102 -122} 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.In one embodiment, P is a sequence: TVVITLKNMASHPVSLHAVGV an amino acid sequence having at least 90% identity to at least 9 consecutive amino acids of the factor VIII polypeptide having ^{102 -122} (SEQ ID NO: 740). In one embodiment, P is a sequence: TVVITLKNMASHPVSLHAVGV an amino acid sequence having at least 95% identity to at least 9 consecutive amino acids of the factor VIII polypeptide having ^{102 -122} (SEQ ID NO: 740).

본 발명의 내용에서, FVIII^{102 -122} 펩타이드는 또한 FVIII^{102 -119} 펩타이드를 포함한다. 따라서, 한 실시형태에서, P는 서열번호 1 내지 55 및 738 내지 773으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 1 내지 55 및 738 내지 773으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 가지는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 1 내지 55 및 738 내지 773으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 가지는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 1 내지 55 및 738 내지 773으로부터 선택된 아미노산 서열이다. 일부 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 1일 수 있고, y는 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 0일 수 있고, y는 1일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, x와 y는 둘 다 1일 수 있다.In the context of the present invention, FVIII peptides ^{102 -122 102 -119} also includes a FVIII polypeptide. Thus, in one embodiment, P is an amino acid sequence having at least 85% identity to the sequence selected from SEQ ID NOs: 1-55 and 738-773. In one embodiment, P is an amino acid sequence having at least 90% identity to the sequence selected from SEQ ID NOs: 1-55 and 738-773. In one embodiment, P is an amino acid sequence having at least 95% identity to the sequence selected from SEQ ID NOs: 1-55 and 738-773. In one embodiment, P is an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1-55 and 738-773. In some embodiments, both x and y can be zero. In other embodiments, x can be 1 and y can be 0. In other embodiments, x can be 0 and y can be 1. In yet another embodiment, both x and y can be one.

한 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 또 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.In one embodiment, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 80 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 70 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 60 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 50 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 40 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 30 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 20 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 10 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 5 amino acids. In another embodiment, R ¹ and R ² are individually or both 1 to 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 , 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 or 80 amino acids.

한 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 150개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 또는 180개의 아미노산으로 이루어진다.In one embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 150 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 100 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 50 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9-25 amino acids. In yet another embodiment, the FVIII peptides are 9 to 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 , 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 , 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 , 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120 , 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 or 180 amino acids.

IVIV .. FVIIIFVIII 펩타이드의Of peptide 생성방법 How to create

다른 양태에서, 본 발명은 추가로 FVIII 펩타이드의 생성 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 FVIII 펩타이드는 당업계에 일반적으로 공지된 고체상(예를 들어, Fmoc 또는 t-Boc) 또는 액체상 합성 기법을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Chan & White, Eds., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (Oxford University Press, 2000); Benoiton, Chemistry of Peptide Synthesis (CRC Press, 2005); Howl, Peptide Synthesis and Applications (Humana Press, 2010)]을 참조한다.In another aspect, the invention further relates to a method of producing a FVIII peptide. In some embodiments, FVIII peptides of the invention can be produced using solid phase (eg, Fmoc or t- Boc) or liquid phase synthesis techniques generally known in the art. See, eg, Chan & White, Eds., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (Oxford University Press, 2000); Benoiton, Chemistry of Peptide Synthesis (CRC Press, 2005); Howl, Peptide Synthesis and Applications (Humana Press, 2010).

한 실시형태에서, 본 발명은 a) 고체상 또는 액체상 합성 기법을 사용하여 펩타이드를 합성하는 단계를 포함하는 FVIII 펩타이드의 제조 방법을 포함하며, FVIII 펩타이드는 서열: (R¹)_x-P-(R²)_y를 가지되, 상기 식 중, P는 서열번호 68, 344 및 740으로부터 선택된 서열의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다. 한 실시형태에서, R¹은 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고, R²는 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 특정 실시형태에서, 펩타이드는 인간 FVIII 단백질의 전체 B-도메인을 다룰 수 있다.In one embodiment, the present invention includes a method of making a FVIII peptide comprising a) synthesizing a peptide using solid or liquid phase synthesis techniques, wherein the FVIII peptide comprises the sequence: (R ¹ ) _x -P- (R ² ) having _y , wherein P is an amino acid sequence having at least 85% identity to the sequence of at least 9 consecutive amino acids of the sequence selected from SEQ ID NOs: 68, 344, and 740, and R 1 is 1 to 80 amino acids An amino acid sequence consisting of; R2 is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids; Each x and y is independently 0 or 1. In one embodiment, R ¹ is an amino acid sequence consisting of 1 to 40 amino acids and R ² is an amino acid sequence consisting of 1 to 40 amino acids. In certain embodiments, the peptide may handle the entire B-domain of human FVIII protein.

한 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 또 다른 실시형태에서, 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.In one embodiment, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 80 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 70 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 60 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 50 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 40 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 30 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 20 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 10 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 5 amino acids. In another embodiment, in other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both 1 to 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, Amino acid sequence consisting of 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 or 80 amino acids.

다른 실시형태에서, 펩타이드는 재조합 기법을 사용하여 생성될 수 있다. 한 실시형태에서, 본 발명은 하기의 a) FVIII 펩타이드를 암호화하는 벡터를 포함하는 세포 배양물을 제공하는 단계를 포함하는 FVIII 펩타이드의 제조 방법을 포함하며, FVIII 펩타이드는 서열: (R¹)_x-P-(R²)_y를 가지되, 상기 식 중, P는 서열번호 68, 344 및 740으로부터 선택된 서열의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다. 한 실시형태에서, R¹은 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고, R²는 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 특정 실시형태에서, 펩타이드는 인간 FVIII 단백질의 전체 B-도메인을 다룰 수 있다.In other embodiments, the peptides can be produced using recombinant techniques. In one embodiment, the invention comprises a method of making a FVIII peptide comprising the steps of: a) providing a cell culture comprising a vector encoding a FVIII peptide, wherein the FVIII peptide comprises the sequence: (R ¹ ) _x -P- (R ² ) _y wherein P is an amino acid sequence having at least 85% identity to the sequence of at least 9 consecutive amino acids of the sequence selected from SEQ ID NOs: 68, 344 and 740, and R 1 is An amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids; R2 is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids; Each x and y is independently 0 or 1. In one embodiment, R ¹ is an amino acid sequence consisting of 1 to 40 amino acids and R ² is an amino acid sequence consisting of 1 to 40 amino acids. In certain embodiments, the peptide may handle the entire B-domain of human FVIII protein.

한 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 또 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.In one embodiment, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 80 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 70 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 60 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 50 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 40 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 30 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 20 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 10 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 5 amino acids. In another embodiment, R ¹ and R ² are individually or both 1 to 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 , 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 or 80 amino acids.

한 실시형태에서, 본 발명은 a) FVIII 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포의 배양물을 제공하는 단계, 및 b) 세포 배양물에서 펩타이드를 발현시키는 단계를 포함하는 FVIII 펩타이드의 제조방법을 제공하되, 펩타이드는 서열: (R¹)_x-P-(R²)_y를 가지되, 상기 식 중, P는 서열번호 10, 68, 159, 250, 344, 477, 568, 659 및 740으로부터 선택된 서열의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이며, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.In one embodiment, the invention provides a method of making a FVIII peptide comprising a) providing a culture of cells comprising a polynucleotide encoding a FVIII peptide, and b) expressing the peptide in a cell culture. Provided that the peptide has the sequence: (R ¹ ) _x -P- (R ² ) _y , wherein P is from SEQ ID NOs: 10, 68, 159, 250, 344, 477, 568, 659 and 740 An amino acid sequence having at least 85% identity to the sequence of at least 9 consecutive amino acids of the selected sequence, R 1 is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids; R2 is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids; Each x and y is independently 0 or 1.

한 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 또 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.In one embodiment, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 80 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 70 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 60 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 50 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 40 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both consisting of 1 to 30 amino acids. Amino acid sequence. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 20 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 10 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 5 amino acids. In another embodiment, R ¹ and R ² are individually or both 1 to 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 , 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 or 80 amino acids.

FVIII 펩타이드의 생성을 위한 방법의 한 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 150개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 또는 180개의 아미노산으로 이루어진다.In one embodiment of the method for the production of FVIII peptide, the FVIII peptide consists of 9 to 150 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 100 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 50 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9-25 amino acids. In yet another embodiment, the FVIII peptides are 9 to 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 , 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 , 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 , 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120 , 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 or 180 amino acids.

본 발명의 FVIII 펩타이드는 적합한 원핵 또는 진핵 숙주 시스템에서 발현에 의해 생성될 수 있다. 진핵 세포의 예는, 제한 없이, 포유류 세포, 예컨대 CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep 및 HepG2; 곤충 세포, 예를 들어 SF9 세포, SF21 세포, S2 세포 및 하이 파이브(High Five) 세포; 및 효모 세포, 예를 들어 사카로마이세스(Saccharomyces) 또는 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 세포를 포함한다. 한 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 조류 세포, 포유류 세포 등에서 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 펩타이드는 인간 세포주, 햄스터 세포주 또는 뮤린 세포주에서 발현될 수 있다. 하나의 특정 실시형태에서, 세포주는 CHO, BHK 또는 HEK 세포주이다.FVIII peptides of the invention can be produced by expression in a suitable prokaryotic or eukaryotic host system. Examples of eukaryotic cells include, but are not limited to, mammalian cells such as CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep and HepG2; Insect cells such as SF9 cells, SF21 cells, S2 cells and High Five cells; And yeast cells, such as Saccharomyces or Schizosaccharomyces cells. In one embodiment, the FVIII peptides can be expressed in bacterial cells, yeast cells, insect cells, avian cells, mammalian cells, and the like. In some embodiments, the peptides can be expressed in human cell lines, hamster cell lines or murine cell lines. In one specific embodiment, the cell line is a CHO, BHK or HEK cell line.

매우 다양한 벡터가 FVIII 펩타이드의 발현을 위해 사용될 수 있고, 진핵 및 원핵 발현 벡터로부터 선택될 수 있다. 벡터는 본 명세서에 개시된 FVIII 펩타이드 중 적어도 하나의 발현에 필요한 뉴클레오타이드 서열을 포함할 것이다. 원핵세포 발현에 대한 벡터의 예는 pRSET, pET, pBAD 등과 같은 플라스미드를 포함하되, 원핵세포 발현 벡터에 사용된 프로모터는 lac, trc, trp, recA, araBAD 등을 포함한다. 진핵세포 발현을 위한 벡터의 예는 (i) 효모에서 발현에 대해, AOX1, GAP, GAL1, AUG1 등과 같은 프로모터를 사용하는 pAO, pPIC, pYES, pMET와 같은 벡터; (ii) 곤충 세포에서 발현에 대해, PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh 등과 같은 프로모터를 사용하여 pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC와 같은 벡터, 및 (iii) 포유류 세포에서 발현에 대해, CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV 및 β-액틴과 같은 프로모터를 사용하는, pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV 등과 같은 벡터, 및 백시니아 바이러스, 아데노-연관 바이러스, 포진 바이러스, 레트로바이러스 등과 같은 바이러스 시스템으로부터 유래된 벡터를 포함한다.A wide variety of vectors can be used for the expression of FVIII peptides and can be selected from eukaryotic and prokaryotic expression vectors. The vector will comprise the nucleotide sequence required for the expression of at least one of the FVIII peptides disclosed herein. Examples of vectors for prokaryotic expression include plasmids such as pRSET, pET, pBAD and the like, while promoters used in prokaryotic expression vectors include lac, trc, trp, recA, araBAD and the like. Examples of vectors for eukaryotic expression include (i) vectors for expression in yeast, such as pAO, pPIC, pYES, pMET, using promoters such as AOX1, GAP, GAL1, AUG1, etc .; (ii) for expression in insect cells, using promoters such as PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh and the like, vectors such as pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC, and (iii) expression in mammalian cells For vectors such as pSVL, pCMV, pRc / RSV, pcDNA3, pBPV, etc., using promoters such as CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV and β-actin, and vaccinia virus, adeno Include vectors derived from viral systems such as associated viruses, herpes viruses, retroviruses, and the like.

본 발명의 일부 실시형태에서, FVIII 펩타이드를 생성하기 위한 핵산 서열은 단백질의 제어된 발현에 적합한 다른 서열, 예컨대 프로모터 서열, 인핸서, TATA 박스, 전사 개시 부위, 폴리링커, 제한부위, 폴리-A-서열, 단백질 처리 서열, 선택 마커 등을 추가로 포함하며, 이들은 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다.In some embodiments of the invention, the nucleic acid sequence for producing the FVIII peptide is selected from other sequences suitable for controlled expression of the protein, such as promoter sequences, enhancers, TATAs. Boxes, transcription initiation sites, polylinkers, restriction sites, poly-A-sequences, protein processing sequences, selection markers, and the like, which are generally known to those skilled in the art.

FVIII 펩타이드를 생성하는 세포에 대해 사용되는 배양 배지는 당업계에 잘 공지된 적합한 기본 배지, 예를 들어, DMEM, 함스 F12(Ham's F12), 배지 199(Medium 199), 맥코이(McCoy) 또는 RPMI에 기반할 수 있다. 기본 배지는 아미노산, 비타민, 유기 및 무기염 및 탄수화물 공급원을 포함하는 다수의 성분을 포함할 수 있다. 각 성분은 세포 배양을 지탱하는 양으로 존재할 수 있으며, 이러한 양은 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다. 배지는 완충 물질, 예를 들어 탄산수소나트륨, 항산화제, 기계적 응력에 대응하는 안정제 또는 프로테아제 억제제와 같은 보조 물질을 포함할 수 있다. 필요하다면, 비-이온성 계면활성제, 예컨대 공중합체 및/또는 폴리에틸렌 글라이콜과 폴리프로필렌 글라이콜의 혼합물이 첨가될 수 있다.The culture medium used for the cells producing the FVIII peptides may be prepared in a suitable base medium well known in the art, such as DMEM, Ham's F12, Medium 199, McCoy or RPMI. Can be based. The basal medium may comprise a number of components including amino acids, vitamins, organic and inorganic salts, and carbohydrate sources. Each component may be present in an amount that supports cell culture, and such amounts are generally known to those skilled in the art. The medium may comprise auxiliary substances such as buffer substances, for example sodium bicarbonate, antioxidants, stabilizers or mechanical protease inhibitors corresponding to mechanical stress. If desired, non-ionic surfactants can be added, such as copolymers and / or mixtures of polyethylene glycol and polypropylene glycol.

일부 실시형태에서, 배양 배지는 외인성으로 첨가된 단백질이 없다. "단백질이 없는" 및 관련된 용어는 성장하는 동안 단백질이 자연적으로 없어지는 배양물 내 세포에 대해 또는 배양물 내 세포 이외의 외인성 공급원으로부터 유래된 단백질을 지칭한다. 다른 실시형태에서, 배양배지는 폴리펩타이드가 없다. 다른 실시형태에서, 배양 배지는 혈청이 없다. 다른 실시형태에서 배양 배지는 동물 단백질이 없다. 다른 실시형태에서 배양 배지는 동물 성분이 없다. 다른 실시형태에서,배양 배지는 단백질, 예를 들어, 우태아혈청과 같은 혈청으로부터의 동물 단백질을 함유한다. 다른 실시형태에서, 배양물은 외인성으로 첨가된 재조합 단백질을 가진다. 다른 실시형태에서, 단백질은 증명된 병원체가 없는 동물로부터 유래된다.In some embodiments, the culture medium is free of exogenous protein. "Protein free" and related terms refer to proteins derived from exogenous sources other than cells in culture or for cells in culture in which proteins naturally disappear during growth. In another embodiment, the culture medium is free of polypeptides. In another embodiment, the culture medium is serum free. In another embodiment the culture medium is free of animal protein. In other embodiments the culture medium is free of animal components. In another embodiment, the culture medium contains a protein, eg, animal protein from serum, such as fetal bovine serum. In another embodiment, the culture has a recombinant protein added exogenously. In other embodiments, the protein is from an animal free of proven pathogens.

동물 단백질이 없고, 화학적으로 한정된 배양 배지의 제조방법은 당업계, 예를 들어 미국 특허 2008/0009040호 및 미국 특허 2007/0212770호에서 공지되며, 이는 둘 다 모든 목적을 위해 본 명세서에 포함된다. 한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에서 사용되는 배양 배지는 단백질이 없거나 또는 올리고펩타이드가 없는 배지이다. 특정 실시형태에서, 배양배지는 화학적으로 한정될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "화학적으로 한정된"은, 배지가 예를 들어 동물 성분, 기관, 선, 식물 또는 효모와 같은 임의의 한정되지 않은 보충물을 포함하지 않는다는 것을 의미한다. 따라서, 화학적으로 한정된 배지의 각 성분은 정확하게 정해진다.Methods of making animal media free, chemically defined culture media are known in the art, for example in US 2008/0009040 and US 2007/0212770, both of which are incorporated herein for all purposes. In one embodiment, the culture medium used in the methods described herein is a medium free of protein or oligopeptide. In certain embodiments, the culture medium may be chemically defined. As used herein, the term “chemically defined” means that the medium does not include any undefined supplement, such as, for example, animal components, organs, glands, plants or yeasts. Thus, each component of the chemically defined medium is precisely defined.

특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은, 예를 들어 배치(batch)-방식, 반-배치 방식, 유가식 배치 방식 또는 연속적 방식으로 작동되는 세포-배양 시스템의 사용을 포함할 수 있다. 배치 배양물은 세포 접종물이 탱크 또는 발효기에서 최대 밀도로 배양되고, 배치로서 채취되며 처리되는 대규모 세포 배양물일 수 있다. 유가식 배치 배양물은 신선한 영양분(예를 들어 성장-제한 물질) 또는 첨가물(예를 들어 생성물에 대한 전구체) 중 하나와 함께 공급된 배치 배양물일 수 있다. 유가식-배치 배양물은 신선한 영양분(예를 들어, 성장-제한 물질) 또는 첨가물(예를 들어, 생성물에 대한 전구체) 중 하나와 함께 공급된 배치 배양물일 수 있다. 연속적 배양물은 신선한 배지의 유입에 의해 영양분과 함께 연속적으로 공급된 현탁 배양물일 수 있되, 배양물 용적은 보통 일정하다. 유사하게, 연속적 발효는 세포 또는 미생물 유기체가 생물반응기로부터 세포 현탁액의 제거에 의해 정확하게 균형 잡히는 신선한 배지의 연속적 첨가에 의한 기하급수적 성장단계로 배양물에서 유지되는 과정을 지칭한다. 더 나아가, 교반-탱크 반응기 시스템은 현탁액, 관류, 물질환경조절장치(chemostatic) 및/또는 마이크로담체 배양물에 대해 사용될 수 있다. 일반적으로, 교반-탱크 반응기 시스템은 러쉬튼(Rushton), 수중날개(hydrofoil), 경사 블레이트 또는 마린(marine)과 같은 교반기 중 어떤 형태와 함께 임의의 통상적인 교반-탱크 반응기로서 작동될 수 있다.In certain embodiments, the methods of the present invention may include the use of a cell-culture system operated, for example, in a batch-, semi-batch, fed-batch batch or continuous mode. Batch cultures can be large-scale cell cultures in which cell inoculum is cultured to maximum density in a tank or fermentor, taken as a batch and processed. The fed batch batch culture may be a batch culture fed with either fresh nutrients (eg growth-limiting substances) or additives (eg precursors to products). The fed-batch culture may be a batch culture fed with either fresh nutrients (eg, growth-limiting substances) or additives (eg, precursors to the product). Continuous cultures may be suspension cultures fed continuously with nutrients by the inflow of fresh medium, but the culture volume is usually constant. Similarly, continuous fermentation refers to the process by which cells or microbial organisms are maintained in culture in an exponential growth stage by successive addition of fresh medium that is precisely balanced by removal of cell suspensions from the bioreactor. Furthermore, stirred-tank reactor systems can be used for suspension, perfusion, chemostatic and / or microcarrier cultures. In general, the stirred-tank reactor system can be operated as any conventional stirred-tank reactor with any form of stirrer such as Rushton, hydrofoil, warp bleed or marine. .

특정 실시형태에서, 본 발명의 세포 배양 방법은 마이크로담체의 사용을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 실시형태의 고용적-특이적 배양물 표면적을 제공하기에 적합한 조건 하에서 거대 생물반응기 내에서 수행되어 세포-배양물은 높은 세포 밀도 및 단백질 발현을 달성할 수 있다. 이러한 성장 조건을 제공하기 위한 한 수단은 교반 탱크 생물반응기 내 세포 배양물에 대해 마이크로담체를 사용하는 것이다. 마이크로담체 상에서 세포성장의 개념은 반 베즐(van Wezel)(van Wezel, A.L., Nature 216:64-5 (1967))에 의해 처음으로 기재되었으며, 이는 성장 배지에서 현탁된 작은 고체 입자의 표면 상에 세포를 부착시킨다. 이 방법은 고표면-대-용적 비를 제공하며, 따라서 영영분 이용을 효율적으로 하게 한다. 더 나아게, 진핵 세포주에서 분비된 단백질의 발현에 대해, 증가된 표면-대-용적비는 더 높은 분비 수준을 허용하고, 따라서 배양물의 상청액에서 더 높은 단백질 수율을 허용한다. 최종적으로, 이들 방법은 진핵 세포 발현 배양물을 용이하게 정률증가시킨다.In certain embodiments, the cell culture methods of the present invention may include the use of microcarriers. In some embodiments, the cell-culture may be performed in a large bioreactor under conditions suitable to provide high volume-specific culture surface areas of embodiments so that the cell-culture can achieve high cell density and protein expression. One means to provide such growth conditions is to use microcarriers for cell culture in stirred tank bioreactors. The concept of cell growth on microcarriers is described by van Wezel (van Wezel, AL, Nature). 216: 64-5 (1967)), which attaches cells on the surface of small solid particles suspended in growth medium. This method provides a high surface-to-volume ratio, thus making efficient use of soils. Further, for expression of secreted proteins in eukaryotic cell lines, increased surface-to-volume ratio allows higher secretion levels and thus higher protein yield in the supernatant of culture. Finally, these methods easily scale up eukaryotic cell expression cultures.

FVIII 펩타이드를 발현시키는 세포는 세포 배양물 성장 동안 구형 또는 다공성 마이크로담체에 결합될 수 있다. 마이크로담체는 덱스트란, 콜라겐, 플라스틱, 젤라틴 및 셀룰로스 및 기타에 기반한 마이크로담체의 군으로부터 선택된 마이크로담체일 수 있다. 또한 그것들이 최종 발효기 바이오매스에 도달되었을 때 및 다공성 마이크로담체 상에서 발현된 단백질의 생성 전 또는 그 반대로 구형 마이크로담체 및 계대배양(subculture) 상의 바이오매스에 대해 세포를 성장시키는 것이 가능하다. 적합한 구형 마이크로담체는 Cytodex(상표명) 1, Cytodex(상표명) 2 및 Cytodex(상표명) 3(GE Healthcare)와 같은 평활 표면 마이크로담체 및 Cytopore(상표명) 1, Cytopore(상표명) 2, Cytoline(상표명) 1 및 Cytoline(상표명) 2(GE Healthcare)와 같은 거대다공성 마이크로담체를 포함할 수 있다.Cells expressing FVIII peptides can bind to spherical or porous microcarriers during cell culture growth. The microcarrier can be a microcarrier selected from the group of microcarriers based on dextran, collagen, plastics, gelatin and cellulose and others. It is also possible for them to grow cells when they reach the final fermentor biomass and before the production of proteins expressed on the porous microcarriers and vice versa for biomass on spherical microcarriers and subcultures. Suitable spherical microcarriers include smooth surface microcarriers such as Cytodex® 1, Cytodex® 2, and Cytodex® 3 (GE Healthcare) and Cytopore® 1, Cytopore® 2, Cytoline® 1 And macroporous microcarriers such as Cytoline ™ 2 (GE Healthcare).

당업자라면 상기 기재한 합성 및/또는 재조합 방법에 의해 생성된 FVIII 펩타이드가 천연 및/또는 비-천연 아미노산, 예를 들어 아미노산 유사체 및/또는 아미노산 모방체를 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다.Those skilled in the art will appreciate that the FVIII peptides produced by the synthetic and / or recombinant methods described above may include natural and / or non-natural amino acids, such as amino acid analogs and / or amino acid mimetics.

V.V. 면역 관용을 유도하기 위한 인자 Factors to Induce Immune Tolerance FVIIIFVIII 펩타이드Peptides 조성물 Composition

다른 양태에서, 본 명세서에 기재된 FVIII 펩타이드는 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 한 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 인자 VIII^246-266 펩타이드, 인자 VIII^{1401 -1424} 펩타이드 또는 인자 VIII^{102 -122} 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.In other embodiments, the FVIII peptides described herein can be included in pharmaceutical compositions. In one embodiment, the invention provides a pharmaceutical composition comprising a factor VIII peptide ^246-266, factor VIII or factor VIII peptides ^{1401 -1424 102 -122} peptide as described herein.

한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 인자 VIII^246-266을 포함한다. 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 FVIII^{474 -494} 펩타이드, FVIII^{540 -560} 펩타이드, FVIII1^{785 -1805} 펩타이드, FVIII^2025-2045 펩타이드, FVIII^{2160 -2180} 펩타이드, FVIII^{102 -119} 펩타이드, FVIII^{1401 -1424} 펩타이드, FVIII^{102 -122} 펩타이드 또는 제2 FVIII^{246 -266} 펩타이드를 추가로 포함한다.In one embodiment, the pharmaceutical composition comprises Factor VIII ^246-266 as described herein. In another embodiment, the pharmaceutical composition is ^{474 -494} FVIII peptides, FVIII, as described herein, peptide ^540-560, peptide FVIII1 ^{785 -1805,} FVIII peptides ^{2025-2045, 2160 -2180} FVIII peptides, FVIII ^{102 -119} peptide , further it includes a FVIII peptides ^{1401 -1424, -122} peptides ¹⁰² FVIII or FVIII 2 ^{246 -266} peptide.

[다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 인자 VIII^1401-1424 펩타이드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 FVIII^{474 -494} 펩타이드, FVIII^{540 -560} 펩타이드, FVIII^{1785 -1805} 펩타이드, FVIII^{2025 -2045} 펩타이드, FVIII^{2160 -2180} 펩타이드, FVIII^{102 -119} 펩타이드, FVIII^246-266 펩타이드, FVIII^{102 -122} 펩타이드 또는 제2 FVIII1401-1424 펩타이드를 추가로 포함한다.[In another embodiment, the pharmaceutical composition comprises Factor VIII ^1401-1424 peptide as described herein. In another embodiment, the pharmaceutical composition FVIII peptide ^{474 -494, 540 -560} peptide FVIII, FVIII peptides ^{1785 -1805, 2025 -2045} peptide FVIII, FVIII peptides ^{2160 -2180, 102 -119} FVIII peptides, as described herein , FVIII further comprises a peptide ^{246-266, 102 -122} FVIII peptides or claim 2 FVIII1401-1424 peptide.

다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 인자 VIII^102-122 펩타이드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 FVIII^{474 -494} 펩타이드, FVIII^{540 -560} 펩타이드, FVIII1^{785 -1805} 펩타이드, FVIII^{2025 -2045} 펩타이드, FVIII^{2160 -2180} 펩타이드, FVIII^{102 -119} 펩타이드, FVIII^246-266 펩타이드, FVIII^{1401 -1424} 펩타이드 또는 제2 FVIII^{102 -122} 펩타이드를 추가로 포함한다.In another embodiment, the pharmaceutical composition comprises Factor VIII ^102-122 peptide as described herein. In another embodiment, the pharmaceutical composition FVIII peptide ^{474 -494, 540 -560} FVIII peptides, peptide FVIII1 ^{785 -1805, 2025 -2045} peptide FVIII, FVIII peptides ^{2160 -2180, 102 -119} FVIII peptides, as described herein , FVIII further comprises a peptide ^{246-266, 1401 -1424} FVIII peptides or claim 2 FVIII ^{102 -122} peptide.

구체적 실시형태에서, 본 발명은 서열: (R¹)_x-P-(R²)_y를 갖는 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하되, 상기 식 중, P는 서열번호 68, 344 및 740으로부터 선택된 서열의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R¹은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; R²는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다. 한 실시형태에서, R¹은 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, R²는 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.In a specific embodiment, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising a peptide having the sequence: (R ¹ ) _x -P- (R ² ) _y , wherein P is from SEQ ID NOs: 68, 344 and 740 An amino acid sequence having at least 85% identity to the sequence of at least 9 consecutive amino acids of the selected sequence, R ¹ is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids; R ² is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids; Each x and y is independently 0 or 1. In one embodiment, R ¹ is an amino acid sequence consisting of 1 to 40 amino acids and R ² is an amino acid sequence consisting of 1 to 40 amino acids.

한 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 또 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.In one embodiment, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 80 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 70 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 60 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 50 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 40 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 30 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 20 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 10 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 5 amino acids. In another embodiment, R ¹ and R ² are individually or both 1 to 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 , 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 or 80 amino acids.

한 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 150개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 또는 180개의 아미노산으로 이루어진다.In one embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 150 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 100 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 50 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9-25 amino acids. In yet another embodiment, the FVIII peptides are 9 to 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 , 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 , 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 , 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120 , 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 or 180 amino acids.

구체적 실시형태에서, 약제학적 조성물은 제2 폴리펩타이드를 추가로 포함하되, 제2 폴리펩타이드는 서열: (R¹)_x-P-(R²)_y를 가지며, 상기 식 중, P는 서열번호 10, 68, 159, 250, 344, 477, 568, 659 및 740으로부터 선택된 서열의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R¹은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; R²는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다. 한 실시형태에서, R¹은 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고, R²는 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.In specific embodiments, the pharmaceutical composition further comprises a second polypeptide, wherein the second polypeptide has the sequence: (R ¹ ) _x -P- (R ² ) _y , wherein P is SEQ ID NO: An amino acid sequence having at least 85% identity to the sequence of at least 9 consecutive amino acids of the sequence selected from 10, 68, 159, 250, 344, 477, 568, 659, and 740, R ¹ consists of 1 to 80 amino acids Amino acid sequence; R ² is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids; Each x and y is independently 0 or 1. In one embodiment, R ¹ is an amino acid sequence consisting of 1 to 40 amino acids and R ² is an amino acid sequence consisting of 1 to 40 amino acids.

한 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 또 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.In one embodiment, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 80 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 70 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 60 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 50 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 40 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 30 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 20 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 10 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 5 amino acids. In another embodiment, R ¹ and R ² are individually or both 1 to 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 , 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 or 80 amino acids.

한 실시형태에서, 제2 FVIII 펩타이드는 9 내지 150개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, 제2 FVIII 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, 제2 FVIII 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, 제2 FVIII 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, 제2 FVIII 펩타이드는 9 내지 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 또는 180개의 아미노산으로 이루어진다.In one embodiment, the second FVIII peptide consists of 9 to 150 amino acids. In another embodiment, the second FVIII peptide consists of 9 to 100 amino acids. In another embodiment, the second FVIII peptide consists of 9 to 50 amino acids. In another embodiment, the second FVIII peptide consists of 9-25 amino acids. In another embodiment, the second FVIII peptide is 9-10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 , 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 , 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 , 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115 , 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 or 180 amino acids.

A.A. 투여administration

인간 또는 시험 동물에 대해 조성물을 투여하기 위하여, 한 양태에서, 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 어구 "약제학적으로" 또는 "약리학적으로"는 안정하고, 응집 및 절단 생성물과 같이 단백질 또는 펩타이드 분해를 억제하며, 추가로 이하에 기재하는 바와 같이 잘-공지된 당업계의 경로를 사용하여 투여될 때 알레르기 또는 다른 부작용을 생성하지 않는 허용가능한 분자 독립체 및 조성물을 지칭한다. "약제학적으로 허용가능한 담체"는 임의의 및 모든 임상적으로 유용한 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장제 및 흡착 지연제 등을 포함한다.To administer the composition to a human or test animal, in one embodiment, the composition may comprise one or more pharmaceutically acceptable carriers. The phrase "pharmaceutically" or "pharmacologically" is stable and inhibits protein or peptide degradation, such as aggregation and cleavage products, and is further administered using well-known routes of art as described below. Refers to acceptable molecular entities and compositions that do not produce allergies or other side effects when used. "Pharmaceutically acceptable carrier" includes any and all clinically useful solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption delaying agents, and the like.

약제학적 조성물은 경구로, 국소적으로, 경피적으로, 비경구로, 흡입 스프레이, 질, 직장으로 또는 두개내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 용어 비경구는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 낭내 주사 또는 인퓨전 기법을 포함한다. 정맥내, 피내, 근육내, 유방내, 복강내, 척추강내, 안구후부, 폐내 주사 또는 특정 자리에 수술적 이식에 의한 투여가 마찬가지로 고려된다. 일반적으로, 조성물은 본질적으로 파이로젠(pyrogen)뿐만 아니라 수용인에게 해로울 수 있는 다른 불순물이 없다.The pharmaceutical composition can be administered orally, topically, percutaneously, parenterally, by inhalation spray, vaginal, rectal or intracranial injection. As used herein, the term parenteral includes subcutaneous injection, intravenous, intramuscular, intraocular injection or infusion techniques. Intravenous, intradermal, intramuscular, intramammary, intraperitoneal, spinal cavity, posterior ocular, intrapulmonary injections, or administration by surgical implantation into a particular site are likewise contemplated. In general, the composition is essentially free of pyrogen as well as other impurities that may be harmful to the recipient.

투약량 및 투여빈도는, 예를 들어 환자 혈우병의 중증도 및/또는 면역 관용이 더 많은 또는 더 적은 용량을 사용하여 효과적으로 유도되는지 여부를 포함하여 당업자에 의해 일반적으로 인식되는 다양한 인자에 의존할 것이다. 전형적인 1일 용량은 약 0.01 내지 100㎎/㎏의 범위에 있을 수 있다. 더 높은 매주의 용량이 적절할 수 있고/있거나 잘 관용될 수 있지만, 1주당 0.07 내지 700㎎ FVIII 펩타이드 범위의 용량이 효과적일 수 있고, 잘 관용될 수 있다. 적절한 용량을 정하는 것에서 인자를 결정하는 원칙은 특정 내용에서 치료적으로 효과적으로 되는데 필요한 특정 FVIII 펩타이드의 양이다. 더 긴 지속적 면역 관용을 달성하기 위하여 반복된 투여가 필요할 수 있다. 조성물의 1회 또는 다회 투여는 치료하는 의사에 의해 선택된 용량 수준 및 패턴에 의해 수행될 수 있다.Dosage and frequency will depend on various factors commonly recognized by those of skill in the art, including, for example, whether the severity and / or immune tolerance of the patient's hemophilia is effectively induced using higher or lower doses. Typical daily doses may range from about 0.01 to 100 mg / kg. Higher weekly doses may be appropriate and / or well tolerated, but doses ranging from 0.07 to 700 mg FVIII peptide per week may be effective and well tolerated. In determining the appropriate dose, the principle of determining factors is the amount of specific FVIII peptide needed to be therapeutically effective in a particular context. Repeated administration may be necessary to achieve longer sustained immune tolerance. Single or multiple administrations of the composition may be carried out by the dose level and pattern selected by the treating physician.

한 양태에서, 본 발명의 조성물은 볼루스에 의해 투여될 수 있다. 다른 예로서, FVIII 펩타이드는 1회 용량으로서 투여될 수 있다. 당업자라면 양호한 의학적 실행 및 개개의 환자의 임상적 상태에 의해 결정되는 유효 투약량 및 투여 섭생을 용이하게 최적화할 것이다. 투약 빈도는 투여 경로에 의존한다. 최적의 약제학적 조성물은 투여 경로 및 원하는 투약량에 의존하여 당업자에 의해 결정된다. 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Remington the Science and Practice of Pharmacy), 21st Ed. (2005, Lippincott Williams & Wilkins)]을 참조하며, 이것의 개시는 본 명세서에 참조로서 포함된다. 이러한 조성물은 투여되는 작용제(agent)의 생리적 상태, 안정성, 생체내 방출률 및 생체내 클리어런스(clearance)률에 영향을 미친다. 투여경로에 의존하여, 적합한 용량은 체중, 체표면적 또는 기관 크기에 따라 계산된다. 적합한 투약량은 적절한 용량-반응 데이터와 함께 혈액 수준 투약량을 결정하기 위한 확립된 분석의 사용을 통해 확인될 수 있다. 최종 투약량 섭생은 약물의 작용을 변형시키는 다양한 인자, 예를 들어 약물의 특이적 활성, 손상의 중등도 및 환자의 반응, 환자의 연령, 상태, 체중, 성별 및 식이요법, 임의의 감염의 중증도, 투여 시간 및 다른 임상적 인자를 고려하여 담당의사에 의해 결정된다. In one aspect, the compositions of the present invention can be administered by bolus. As another example, the FVIII peptide can be administered as a single dose. Those skilled in the art will readily optimize effective dosages and dosing regimens as determined by good medical practice and the clinical condition of the individual patient. Dosing frequency depends on the route of administration. The optimal pharmaceutical composition is determined by one skilled in the art depending on the route of administration and the desired dosage. See, eg, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Remington the Science and Practice of Pharmacy), 21st Ed. (2005, Lippincott Williams & Wilkins), the disclosure of which is incorporated herein by reference. Such compositions affect the physiological state, stability, in vivo release rate and in vivo clearance rate of the agent administered. Depending on the route of administration, suitable dosages are calculated based on body weight, body surface area or organ size. Appropriate dosages can be ascertained through the use of established assays to determine blood level dosages with appropriate dose-response data. The final dosage regimen can vary a variety of factors that modify the action of the drug, such as the specific activity of the drug, the severity of the injury and the patient's response, the patient's age, condition, weight, sex and diet, the severity of any infection, administration Determined by the attending physician, taking into account time and other clinical factors.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 FVIII 펩타이드를 포함하는 조성물은 투여 전 동결건조된다. 동결건조는 당업계에서 흔한 기법을 사용하여 수행되며, 예를 들어 문헌[Tang et al ., Pharm Res . 21:191-200, (2004) 및 Chang et al ., Pharm Res . 13:243-9 (1996)]에 기재된 바와 같이 개발된 조성물에 대해 최적화되어야 한다. 약제학적 조성물의 제조 방법은 다음의 단계 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 동결건조 전 혼합물에 안정화제를 첨가하는 단계, 동결건조 전 혼합물에 증량제(bulking agent), 삼투 조절제 및 계면활성제로부터 선택된 적어도 하나의 작용제를 첨가하는 단계. 한 양태에서, 동결건조된 조제물은 하나 이상의 완충제, 증량제 및 안정제이다. 이 양태에서, 동결건조 단계 동안 또는 재구성 동안 응집이 문제가 되는 경우 계면활성제의 이용성은 평가되고 선택된다. 적절한 완충제가 포함되어 동결건조 동안 pH의 안정한 구역 내에서 조제물을 유지한다.In some embodiments, a composition comprising a FVIII peptide disclosed herein is lyophilized prior to administration. Lyophilization is carried out using techniques common in the art, see for example Tang et al. al . , Pharm Res . 21: 191-200, (2004) and Chang et al . , Pharm Res . 13: 243-9 (1996), which should be optimized for the composition developed. The method of preparing the pharmaceutical composition may comprise one or more of the following steps: adding a stabilizer to the mixture before lyophilization, at least one selected from bulking agents, osmotic modifiers and surfactants in the mixture before lyophilization Adding one agent. In one embodiment, the lyophilized preparation is one or more buffers, extenders and stabilizers. In this embodiment, the availability of the surfactant is evaluated and selected when aggregation is a problem during the lyophilization step or during reconstitution. Appropriate buffers are included to maintain the formulation in a stable zone of pH during lyophilization.

항박테리아제의 희석 용액이 때때로 비경구 투여를 위한 약제의 생성에서 사용되지만, 동결건조 물질에 대한 표준 재구성 실행은 순수(pure water) 또는 멸균 주사용 수(water for injection, WFI)의 용적을 다시 첨가하는 것이다(전형적으로 동결건조 동안 제거된 용적과 동일). 따라서, 동결건조된 FVIII 펩타이드 조성물에 희석물을 첨가하는 단계를 포함하는, 재구성된 FVIII 펩타이드 조성물의 제조를 위한 방법이 제공된다.Diluted solutions of antibacterial agents are sometimes used in the production of medicaments for parenteral administration, but standard reconstitution runs on lyophilized materials rebuild the volume of pure water or sterile water for injection (WFI). Addition (typically the same volume removed during lyophilization). Thus, a method is provided for the preparation of a reconstituted FVIII peptide composition comprising adding a diluent to the lyophilized FVIII peptide composition.

일부 실시형태에서, 동결건조된 물질은 수용액으로서 재구성될 수 있다. 다수의 수성 담체, 예를 들어 멸균 주사용 수, 다회 투약 사용을 위해 보존제가 있는 물, 또는 적절한 양의 계면활성제가 있는 물(예를 들어, 수성 현탁액의 제조에 적합한 부형제와 혼합된 활성 화합물을 함유하는 수성 현탁액). 다양한 양태에서, 이러한 부형제는 현탁제, 예를 들어 제한 없이, 카복시메틸셀룰로스나트륨, 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 알긴산나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 트래거캔스 검 및 아카시아 검이며; 분산제 또는 습윤제는 자연적으로-발생하는 포스파타이드, 예를 들어 및 제한 없이, 레시틴, 또는 알킬렌 산화물과 지방산의 축합 생성물, 예를 들어 및 제한 없이, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 또는 에틸렌 옥사이드와 장쇄 지방족 알코올의 축합 생성물, 예를 들어 및 제한 없이, 헵타데카에틸렌옥시세탄올, 또는 지방산과 헥시톨로부터 유래된 부분적 에스터와 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물, 예컨대 폴리옥시에틸렌 솔비톨 모노올레이트, 또는 지방산과 헥시톨 무수물로부터 유래된 부분적 에스터와 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물, 예를 들어 및 제한 없이, 폴리에틸렌 솔비탄 모노올레이트이다. 다양한 양태에서, 수성 현탁액은 또한 하나 이상의 보존제, 예를 들어 및 제한 없이, 에틸 또는 n-프로필, p-하이드록시벤조에이트를 함유한다.In some embodiments, the lyophilized material may be reconstituted as an aqueous solution. Active compounds in admixture with a number of aqueous carriers, for example sterile injectable water, water with a preservative for multiple dosage use, or water with an appropriate amount of surfactant (e.g., excipients suitable for the preparation of aqueous suspensions) Aqueous suspension). In various embodiments, such excipients include, but are not limited to, suspending agents, for example, sodium carboxymethylcellulose, carboxymethylcellulose, methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, sodium alginate, polyvinylpyrrolidone, tragacanth gum, and acacia gum. Is; Dispersants or wetting agents are naturally-occurring phosphides, for example and without limitation, condensation products of lecithin, or alkylene oxides and fatty acids, such as, without limitation, long chains with polyoxyethylene stearate, or ethylene oxide Condensation products of aliphatic alcohols, for example and without limitation, heptadecaethyleneoxycetanol, or condensation products of partial esters and ethylene oxides derived from fatty acids and hexitol, such as polyoxyethylene sorbitol monooleate, or fatty acids and hex Condensation products of partial esters and ethylene oxide derived from tall anhydrides, for example and without limitation, polyethylene sorbitan monooleate. In various embodiments, the aqueous suspension also contains one or more preservatives, for example and without limitation, ethyl or n-propyl, p-hydroxybenzoate.

VIVI .. 치료 방법Treatment method

본 발명은 추가로 A형 혈우병 또는 후천성 혈우병과 같은 FVIII 단백질과 연관된 질병을 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 본 명세서에 개시된 FVIII 펩타이드 중 적어도 하나의 투여를 포함할 수 있다. 특히, FVIII 펩타이드 중 적어도 하나를 포함하는 약제학적 조성물은 환자에서 FVIII 단백질에 대한 면역 관용을 유도하기 위하여 투여될 수 있다.The invention further relates to a method of treating a patient with a disease associated with FVIII protein, such as hemophilia A or acquired hemophilia. Such methods may comprise the administration of at least one of the FVIII peptides disclosed herein. In particular, pharmaceutical compositions comprising at least one of the FVIII peptides can be administered to induce immune tolerance against FVIII protein in a patient.

일부 실시형태에서, FVIII에 대해 면역 관용을 유도하기 위한 방법은 FVIII의 투여 후 FVIII 억제제 발생을 방지하는 단계를 포함할 수 있다. 용어 "방지하는"는 FVIII에 대해 실질적으로 검출가능한 면역 반응이 허용되지 않는 것을 지칭한다. 예를 들어, FVIII 단백질의 투여 전 환자는 임의의 검출가능한 항-FVIII 항체를 가질 수 있다. 그러나, FVIII 단백질로 치료 후, FVIII 펩타이드가 투여되어 면역 관용을 유도하지 않는다면, 검출가능한 항-FVIII 항체의 수준은 증가될 수 있다. 본 명세서에 개시된 FVIII 펩타이드의 투여는 면역 관용을 유도할 수 있고, 이에 의해 혈우병이 있는 환자를 치료할 수 있다.In some embodiments, the method for inducing immune tolerance against FVIII may comprise preventing the development of FVIII inhibitors after administration of FVIII. The term "preventing" refers to the fact that a substantially detectable immune response to FVIII is not allowed. For example, prior to administration of the FVIII protein the patient may have any detectable anti-FVIII antibody. However, after treatment with FVIII protein, if the FVIII peptide is not administered to induce immune tolerance, the level of detectable anti-FVIII antibody may be increased. Administration of the FVIII peptides disclosed herein can induce immune tolerance, thereby treating patients with hemophilia.

다른 실시형태에서, FVIII 단백질에 대해 면역 관용을 유도하기 위한 방법은 확립된 FVIII 억제제를 이미 갖는 환자를 치료하는 단계를 포함할 수 있다. 이들 실시형태에서, FVIII 펩타이드의 투여는 항-FVIII 항체의 존재를 감소시키거나 또는 제거할 수 있다. 용어 "감소한다"는 FVIII 단백질에 대한 면역 반응의 부분적 감소를 의미한다. 특정 실시형태에서, 면역 반응을 감소시키는 것은 FVIII 펩타이드의 투여 전 환자에서 면역반응 수준과 비교하여 면역 반응의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 감소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 환원%는 존재하는 FVIII 항체의 양을 결정하기 위한 표준 방법을 사용하여 FVIII 펩타이드의 투여 전 및 투여 후 혈액 내 존재하는 항-FVIII 항체의 양을 측정함으로써 분석될 수 있다. 다른 실시형태에서, 면역 반응의 감소는 FVIII 항체 또는 모두 3가지, 즉, T 세포, B 세포 및 항-FVIII 항체의 조합을 분비하는 FVIII에 특이적인 CD4⁺ T 세포 또는 FVIII 특이적 B 세포의 감소된 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 면역 세포, 예컨대 FVIII에 대해 특이적인 T 세포 및 B 세포는 당업계에 일반적으로 공지된 방법을 사용하여 분리될 수 있다.In another embodiment, a method for inducing immune tolerance against FVIII protein may comprise treating a patient already having an established FVIII inhibitor. In these embodiments, administration of FVIII peptides may reduce or eliminate the presence of anti-FVIII antibodies. The term "reduce" means a partial reduction in the immune response to the FVIII protein. In certain embodiments, reducing the immune response is 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% of the immune response compared to the immune response level in the patient prior to administration of the FVIII peptide. Or 90% reduction. For example, the percent reduction can be analyzed by measuring the amount of anti-FVIII antibody present in the blood before and after administration of the FVIII peptide using standard methods for determining the amount of FVIII antibody present. In other embodiments, the reduction in immune response is a reduction in CD4 ⁺ T cells or FVIII specific B cells specific for FVIII secreting a combination of FVIII antibodies or all three, ie, combinations of T cells, B cells and anti-FVIII antibodies. Measuring the level may be included. Immune cells, such as T cells and B cells specific for FVIII, can be isolated using methods generally known in the art.

한 양태에서, 본 발명은 피험체에서 FVIII에 대한 면역 관용을 유도하는 방법을 포함하되, 해당 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 FVIII 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 피험체에게 투여하는 단계를 포함한다. 구체적 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 인자 VIII^{246 -266} 펩타이드, 인자 VIII^{1401 -1424} 펩타이드, 또는 인자 VIII^{102 -122} 펩타이드이다.In one aspect, the invention includes a method of inducing immune tolerance against FVIII in a subject, the method comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising a FVIII peptide as described herein Steps. In a specific embodiment, FVIII polypeptide is a factor VIII peptide ^{246 -266, 1401 -1424} peptide factor VIII, or factor VIII ^{102 -122} peptide as described herein.

한 실시형태에서, 해당 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 인자 VIII^{246 -266} 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 피험체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 FVIII^{474 -494} 펩타이드, FVIII^{540 -560} 펩타이드, FVIII^{1785 -1805} 펩타이드, FVIII^{2025 -2045} 펩타이드, FVIII^{2160 -2180} 펩타이드, FVIII^{102 -119} 펩타이드, FVIII^{1401 -1424} 펩타이드, FVIII^102-122 펩타이드, 또는 제2 FVIII_{246 -266} 펩타이드를 추가로 포함한다.In one embodiment, the method comprises administering a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition containing factor VIII, such as ^{246 -266} peptides described herein to a subject. In another embodiment, the pharmaceutical composition FVIII peptide ^{474 -494, 540 -560} peptide FVIII, FVIII peptides ^{1785 -1805, 2025 -2045} peptide FVIII, FVIII peptides ^{2160 -2180, 102 -119} FVIII peptides, as described herein , further it includes a FVIII ^{-1424 1401} peptide, peptide ^102-122 FVIII, FVIII or claim 2 _{246 -266} peptide.

다른 실시형태에서, 해당 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 인자 VIII^1401-1424 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 피험체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 FVIII^{474 -494} 펩타이드, FVIII^{540 -560} 펩타이드, FVIII^{1785 -1805} 펩타이드, FVIII^2025-2045 펩타이드, FVIII^{2160 -2180} 펩타이드, FVIII^{102 -119} 펩타이드, FVIII^{246 -266} 펩타이드, FVIII^{102 -122} 펩타이드, 또는 제2 FVIII^{1401 -1424} 펩타이드를 추가로 포함한다.In another embodiment, the method comprises administering to the subject a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising a Factor VIII ^1401-1424 peptide as described herein. In another embodiment, the pharmaceutical composition is ^{474 -494} FVIII peptides, FVIII, as described herein the peptide ^{540-560, 1785 -1805} FVIII peptides, peptide ^2025-2045 FVIII, FVIII peptides ^{2160 -2180, -119} peptides FVIII ¹⁰² , further it includes a FVIII peptide ^{246 -266, 102 -122} FVIII peptides, or peptide 2 FVIII ^{1401 -1424.}

다른 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 인자 VIII^{102 -122} 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 피험체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 FVIII^{474 -494} 펩타이드, FVIII^{540 -560} 펩타이드, FVIII^{1785 -1805} 펩타이드, FVIII^{2025 -2045} 펩타이드, FVIII^{2160 -2180} 펩타이드, FVIII^{102 -119} 펩타이드, FVIII^{246 -266} 펩타이드, FVIII^{1401 -1424} 펩타이드, 또는 제2 FVIII^{102 -122} 펩타이드를 추가로 포함한다.In another embodiment, the invention comprises the step of administering a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition containing factor VIII, such as ^{102 -122} peptides described herein to a subject. In another embodiment, the pharmaceutical composition FVIII peptide ^{474 -494, 540 -560} peptide FVIII, FVIII peptides ^{1785 -1805, 2025 -2045} peptide FVIII, FVIII peptides ^{2160 -2180, 102 -119} FVIII peptides, as described herein , further includes a FVIII peptide ^{246 -266, 1401 -1424} FVIII peptides, or claim 2 FVIII ^{102 -122} peptide.

한 실시형태에서, 본 발명은 FVIII 단백질에 대해 면역 관용을 유도하기 위한 방법을 제공하되, 해당 방법은 서열: (R¹)_x-P-(R²)_y를 갖는 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 피험체에게 투여하는 단계; 이에 의해 피험체에서 FVIII 단백질에 대한 면역 관용을 유도하는 단계를 포함하고, 상기 식 중, P는 서열번호 68, 344 및 740으로부터 선택된 서열의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R¹은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; R²는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다. 특정 실시형태에서, R¹은 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, R²는 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.In one embodiment, the invention provides a method for inducing immune tolerance against FVIII protein, wherein the method comprises a peptide having the sequence: (R ¹ ) _x -P- (R ² ) _y . Administering a therapeutically effective amount of to a subject; Thereby inducing immune tolerance for the FVIII protein in the subject, wherein P is at least 85% identity to the sequence of at least 9 consecutive amino acids of the sequence selected from SEQ ID NOs: 68, 344, and 740 Having an amino acid sequence, R ¹ is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids; R ² is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids; Each x and y is independently 0 or 1. In certain embodiments, R ¹ is an amino acid sequence consisting of 1 to 40 amino acids and R ² is an amino acid sequence consisting of 1 to 40 amino acids.

한 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 또 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.In one embodiment, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 80 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 70 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 60 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 50 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 40 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 30 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 20 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 10 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 5 amino acids. In another embodiment, R ¹ and R ² are individually or both 1 to 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 , 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 or 80 amino acids.

한 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 150개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 또는 180개의 아미노산으로 이루어진다.In one embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 150 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 100 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 50 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9-25 amino acids. In yet another embodiment, the FVIII peptides are 9 to 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 , 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 , 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 , 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120 , 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 or 180 amino acids.

면역 관용을 유도하는 방법은 몇몇 펩타이드가 투여되어 면역 관용을 유도할 수 있는 조합 치료를 추가로 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, 면역 관용을 유도하는 방법은 서열: (R¹)_x-P-(R²)_y를 갖는 적어도 제2 펩타이드의 치료적 유효량을 추가로 포함하고, 이에 의해 피험체에서 FVIII 단백질에 대해 면역 관용을 유도하되, 상기 식 중, P는 서열번호 10, 68, 159, 250, 344, 477, 568, 659 및 740으로부터 선택된 서열의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R¹은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; R²는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다. 특정 실시형태에서, R¹은 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고, R²는 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 특정 실시형태에서, 제2 펩타이드는 9 내지 80개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 특정 실시형태에서, 제2 펩타이드 내 임의의 추가적인 아미노산은 천연 아미노산이다. 다른 특정 실시형태에서, 제2 펩타이드는 길이로 9 내지 40개의 아미노산으로 이루어진다. 구체적 실시형태에서, 제2 펩타이드는 길이로 9 내지 80개의 아미노산으로 이루어지고, 제2 펩타이드 내 임의의 추가적인 아미노산은 천연 아미노산이다.The method of inducing immune tolerance may further comprise a combination therapy in which several peptides may be administered to induce immune tolerance. In one embodiment, the method of inducing immune tolerance further comprises a therapeutically effective amount of at least a second peptide having the sequence: (R ¹ ) _x -P- (R ² ) _y , whereby the FVIII protein in the subject Inducing immune tolerance wherein P is at least 85% identity to the sequence of at least 9 consecutive amino acids of the sequence selected from SEQ ID NOs: 10, 68, 159, 250, 344, 477, 568, 659 and 740 Is an amino acid sequence having R ¹ is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids; R ² is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids; Each x and y is independently 0 or 1. In certain embodiments, R ¹ is an amino acid sequence consisting of 1 to 40 amino acids and R ² is an amino acid sequence consisting of 1 to 40 amino acids. In certain embodiments, the second peptide consists of 9 to 80 amino acids. In another particular embodiment, any additional amino acid in the second peptide is a natural amino acid. In another specific embodiment, the second peptide consists of 9-40 amino acids in length. In specific embodiments, the second peptide consists of 9 to 80 amino acids in length, and any additional amino acid in the second peptide is a natural amino acid.

한 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 또 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.In one embodiment, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 80 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 70 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 60 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 50 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 40 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 30 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 20 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 10 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 5 amino acids. In another embodiment, R ¹ and R ² are individually or both 1 to 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 , 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 or 80 amino acids.

한 실시형태에서, 제2 FVIII 펩타이드는 9 내지 150개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 또는 180개의 아미노산으로 이루어진다.In one embodiment, the second FVIII peptide consists of 9 to 150 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 100 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9 to 50 amino acids. In another embodiment, the FVIII peptide consists of 9-25 amino acids. In yet another embodiment, the FVIII peptides are 9 to 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 , 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 , 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 , 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120 , 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 or 180 amino acids.

면역 관용을 유도하기 위한 방법의 구체적 실시형태에서, 투여된 약제학적 조성물은 펩타이드를 포함하며, P는 서열번호 68, 344 또는 740의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, 조성물은 제2 폴리펩타이드를 추가로 포함하며, 제2 폴리펩타이드는 서열: (R¹)_x-P-(R²)_y를 가지고, 상기 식 중, P는 서열번호 10, 68, 159, 250, 344, 477, 568, 659 및 740으로부터 선택된 서열의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이며, R¹은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; R²는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.In a specific embodiment of the method for inducing immune tolerance, the administered pharmaceutical composition comprises a peptide, wherein P is an amino acid having at least 85% identity to the sequence of at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 68, 344 or 740 Sequence, the composition further comprises a second polypeptide, wherein the second polypeptide has the sequence: (R ¹ ) _x -P- (R ² ) _y , wherein P is SEQ ID NOs: 10, 68, An amino acid sequence having at least 85% identity to the sequence of at least 9 consecutive amino acids of the sequence selected from 159, 250, 344, 477, 568, 659, and 740, R ¹ is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids; R ² is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids; Each x and y is independently 0 or 1.

한 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 또 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.In one embodiment, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 80 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 70 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 60 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 50 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 40 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 30 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 20 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 10 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 5 amino acids. In another embodiment, R ¹ and R ² are individually or both 1 to 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 , 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 or 80 amino acids.

한 양태에서, 본 발명은 FVIII 대체 치료에 대해 만들어진 면역반응의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 FVIII 펩타이드의 용도를 제공한다. 구체적 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 FVIII^1401-1424 펩타이드이다. 관련된 양태에서, 본 발명은 FVIII 대체 치료에 대해 만들어진 면역반응의 방지를 위한 의약의 제조를 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 FVIII 펩타이드의 용도를 제공한다. 구체적 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 FVIII^1401-1424 펩타이드이다.In one aspect, the invention provides the use of a FVIII peptide as described herein for the manufacture of a medicament for the treatment of an immune response made against FVIII replacement therapy. In specific embodiments, the FVIII peptide is a FVIII ^1401-1424 peptide. In a related aspect, the present invention provides the use of a FVIII peptide as described herein for the manufacture of a medicament for the prevention of an immune response made against FVIII replacement therapy. In specific embodiments, the FVIII peptide is a FVIII ^1401-1424 peptide.

한 양태에서, 본 발명은 의약으로서 용도를 위한 FVIII 펩타이드를 제공한다. 구체적 실시형태에서, 본 발명은 의약으로서 용도를 위한 서열 (R¹)_x-P-(R²)_y를 갖는 폴리펩타이드를 제공하되, 상기 식 중, P는 서열: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(서열번호 344)을 갖는 인자 VIII^1401-1424 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R¹은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, R²는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.In one aspect, the invention provides an FVIII peptide for use as a medicament. In a specific embodiment, the invention provides a polypeptide having the sequence (R ¹ ) _x -P- (R ² ) _y for use as a medicament, wherein P is the sequence: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID NO: 344) An amino acid sequence having at least 85% identity to the sequence of at least 9 consecutive amino acids of the Factor VIII ^1401-1424 peptide having R ¹ is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids, and R ² is 1 to 80 amino acids Amino acid sequence, wherein each of x and y is independently 0 or 1.

한 양태에서, 본 발명은 FVIII 대체 치료에 대해 만들어진 면역 반응의 치료를 위한 FVIII 펩타이드를 제공한다. 구체적 실시형태에서, 본 발명은 FVIII 대체 치료에 대해 만들어진 면역 반응의 치료를 위한 서열 (R¹)_x-P-(R²)_y를 갖는 폴리펩타이드를 제공하되, 상기 식 중, P는 서열: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(서열번호 344)을 갖는 인자 VIII^1401-1424 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R¹은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, R²는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고, 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.In one aspect, the invention provides FVIII peptides for the treatment of immune responses made against FVIII replacement therapy. In a specific embodiment, the invention provides a polypeptide having the sequence (R ¹ ) _x -P- (R ² ) _y for the treatment of an immune response made against FVIII replacement therapy, wherein P is a sequence: An amino acid sequence having at least 85% identity to the sequence of at least 9 consecutive amino acids of the Factor VIII ^1401-1424 peptide with QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID NO: 344), R ¹ is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids, R ² Is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids, and each of x and y is independently 0 or 1.

한 양태에서, 본 발명은 FVIII 대체 치료에 대해 만들어진 면역 반응의 방지를 위한 FVIII 펩타이드를 제공한다. 구체적 실시형태에서, 본 발명은 FVIII 대체 치료에 대해 만들어진 면역 반응의 방지를 위한 서열 (R¹)_x-P-(R²)_y를 갖는 폴리펩타이드를 제공하되, 상기 식 중, P는 서열: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(서열번호 344)을 갖는 인자 VIII^1401-1424 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R¹은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, R²는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고, 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.In one aspect, the invention provides FVIII peptides for the prevention of immune responses made against FVIII replacement therapy. In a specific embodiment, the present invention provides a polypeptide having the sequence (R ¹ ) _x -P- (R ² ) _y for the prevention of an immune response made for FVIII replacement therapy, wherein P is the sequence: An amino acid sequence having at least 85% identity to the sequence of at least 9 consecutive amino acids of the Factor VIII ^1401-1424 peptide with QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID NO: 344), R ¹ is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids, R ² Is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids, and each of x and y is independently 0 or 1.

VII.VII. 면역진단Immune diagnosis

한 양태에서, 본 발명은 피험체로부터 취한 생물학적 샘플 내 FVIII에 대해 특이적인 FVIII 억제 항체 또는 CD4+ T 세포의 존재 또는 수준을 확인함으로써 치료가 필요한 피험체에서 FVIII 대체 치료 또는 FVIII 면역 관용 유도 치료를 모니터링하기 위한 방법을 제공한다.In one embodiment, the present invention monitors FVIII replacement therapy or FVIII immune tolerance induction therapy in a subject in need of such treatment by identifying the presence or level of FVIII inhibitory antibody or CD4 + T cells specific for FVIII in a biological sample taken from the subject. It provides a method for doing so.

한 실시형태에서, 해당 방법은 치료가 필요한 피험체에서 FVIII 대체 치료를 모니터링하기 위한 방법을 포함하되, 해당 방법은 피험체로부터의 생물학적 샘플을 본 명세서에 기재된 바와 같은 FVIII^{246 -266} 펩타이드, FVIII^{1401 -1424} 펩타이드 또는 FVIII^102-122 펩타이드와 접촉시키는 단계; 및 샘플 내 존재하는 FVIII 펩타이드와 FVIII 억제 항체 사이에 형성된 복합체를 검출하는 단계를 포함한다. 한 실시형태에서, 해당 방법은 샘플 내 FVIII 억제 항체의 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 해당 방법은 상이한 시간에 피험체로부터 취한 적어도 2개의 샘플 내 FVIII 억제 항체의 수준을 결정하는 단계 및 2개의 샘플 사이에 FVIII 억제 항체의 수준을 비교하는 단계를 포함하되, 시간에 따른 항체 수준의 증가는 FVIII 대체 치료의 과정 동안 피험체에게 투여된 FVIII에 대한 면역 반응의 형성을 표시한다.In one embodiment, the method comprising a method for monitoring the FVIII replacement therapy in a subject in need of such treatment, the method ^{246 -266} FVIII peptides such as a biological sample from the body piheom described herein, FVIII ^{1401 Contacting with a -1424} peptide or a FVIII ^102-122 peptide; And detecting the complex formed between the FVIII peptide present in the sample and the FVIII inhibitory antibody. In one embodiment, the method comprises determining the level of FVIII inhibitory antibody in the sample. In another embodiment, the method comprises determining a level of FVIII inhibitory antibody in at least two samples taken from a subject at different times and comparing the level of FVIII inhibitory antibody between the two samples, wherein Increasing antibody levels in response to indicates the formation of an immune response to FVIII administered to the subject during the course of FVIII replacement therapy.

다른 실시형태에서, 해당 방법은 치료가 필요한 피험체에서 FVIII 면역 관용 유도 치료를 모니터링하기 위한 방법을 포함하되, 해당 방법은 피험체로부터의 생물학적 샘플을 본 명세서에 기재된 바와 같은 FVIII^{246 -266} 펩타이드, FVIII^{1401 -1424} 펩타이드 또는 FVIII^{102 -122} 펩타이드와 접촉시키는 단계; 및 샘플 내 존재하는 FVIII 펩타이드와 FVIII 억제 항체 사이에 형성된 복합체를 검출하는 단계를 포함한다. 한 실시형태에서, 해당 방법은 샘플 내 FVIII 억제 항체의 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 해당 방법은 상이한 시간에 피험체로부터 취한 적어도 2개의 샘플 내 FVIII 억제 항체의 수준을 결정하는 단계 및 2개의 샘플 사이에 FVIII 억제 항체의 수준을 비교하는 단계를 포함하되, 시간에 따른 항체 수준의 감소는 피험체에서 FVIII 단백질에 대한 면역 관용의 형성을 표시한다.In another embodiment, the method comprising: a method for the treatment to monitor the FVIII immune tolerance induction therapy in the required subject, the method ^{246 -266} FVIII peptides such as a biological sample from the body piheom described herein, contacting the peptide or FVIII FVIII ^{1401 -1424 102 -122} peptides; And detecting the complex formed between the FVIII peptide present in the sample and the FVIII inhibitory antibody. In one embodiment, the method comprises determining the level of FVIII inhibitory antibody in the sample. In another embodiment, the method comprises determining a level of FVIII inhibitory antibody in at least two samples taken from a subject at different times and comparing the level of FVIII inhibitory antibody between the two samples, wherein Reduction of antibody levels in response to indicates the formation of immune tolerance to FVIII protein in the subject.

한 실시형태에서, 해당 방법은 치료가 필요한 피험체에서 FVIII 대체 치료를 모니터링하기 위한 방법을 포함하되, 해당 방법은 본 피험체로부터의 생물학적 샘플을 명세서에 기재된 바와 같은 FVIII^{246 -266} 펩타이드, FVIII^{1401 -1424} 펩타이드 또는 FVIII^102-122 펩타이드와 접촉시키는 단계; 및 FVIII 펩타이드와 샘플 내 존재하는 FVIII에 특이적인 CD4+ T 세포 사이에 형성된 복합체를 검출하는 단계를 포함한다. 한 실시형태에서, 해당 방법은 샘플 내 FVIII에 대해 특이적인 CD4+ T 세포의 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 해당 방법은 상이한 시간에 피험체로부터 취한 적어도 2개의 샘플 내 FVIII에 대해 특이적인 CD4+ T 세포의 수준을 결정하는 단계, 및 2개의 샘플 사이의 FVIII에 대해 특이적인 CD4+ T 세포의 수준을 비교하는 단계를 포함하되, 시간에 따른 항체 수준의 증가는 FVIII 대체 치료 과정 동안 피험체에게 투여된 FVIII에 대한 면역 반응의 형성을 표시한다. 구체적 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 MHC 클래스 II 멀티머와 복합체화된다.In one embodiment, the method comprising a method for monitoring the FVIII replacement therapy in a subject in need of such treatment, the method ^{246 -266} FVIII peptides such as those described in the biological sample from the body piheom herein, FVIII ^{1401 Contacting with a -1424} peptide or a FVIII ^102-122 peptide; And detecting the complex formed between the FVIII peptide and CD4 + T cells specific for FVIII present in the sample. In one embodiment, the method comprises determining the level of CD4 + T cells specific for FVIII in the sample. In another embodiment, the method comprises determining a level of CD4 + T cells specific for FVIII in at least two samples taken from a subject at different times, and CD4 + T cells specific for FVIII between the two samples Comparing the levels of, wherein the increase in antibody levels over time indicates the formation of an immune response to FVIII administered to the subject during the course of FVIII replacement therapy. In a specific embodiment, the FVIII peptide is complexed with an MHC class II multimer.

다른 실시형태에서, 해당 방법은 치료가 필요한 피험체에서 FVIII 면역 관용 유도 치료를 모니터링하기 위한 방법을 포함하되, 해당 방법은 피험체로부터의 생물학적 샘플을 본 명세서에 기재된 바와 같은 FVIII^{246 -266} 펩타이드, FVIII^{1401 -1424} 펩타이드 또는 FVIII^{102 -122} 펩타이드와 접촉시키는 단계; 및 FVIII 펩타이드와 샘플 내 존재하는 FVIII에 특이적인 CD4+ T 세포 사이에 형성된 복합체를 검출하는 단계를 포함한다. 한 실시형태에서, 해당 방법은 샘플 내 FVIII에 대해 특이적인 CD4+ T 세포의 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 해당 방법은 상이한 시간에 피험체로부터 취한 적어도 2개의 샘플 내 FVIII에 대해 특이적인 CD4+ T 세포의 수준을 결정하는 단계, 및 2개의 샘플 사이의 FVIII에 대해 특이적인 CD4+ T 세포의 수준을 비교하는 단계를 포함하되, 시간에 따른 항체 수준의 감소는 피험체에서 FVIII 단백질에 대한 면역 관용의 형성을 표시한다. 구체적 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 MHC 클래스 II 멀티머와 복합체화된다.In another embodiment, the method comprising: a method for the treatment to monitor the FVIII immune tolerance induction therapy in the required subject, the method ^{246 -266} FVIII peptides such as a biological sample from the body piheom described herein, contacting the peptide or FVIII FVIII ^{1401 -1424 102 -122} peptides; And detecting the complex formed between the FVIII peptide and CD4 + T cells specific for FVIII present in the sample. In one embodiment, the method comprises determining the level of CD4 + T cells specific for FVIII in the sample. In another embodiment, the method includes determining a level of CD4 + T cells specific for FVIII in at least two samples taken from a subject at different times, and CD4 + T cells specific for FVIII between the two samples Comparing the levels of, wherein the decrease in antibody levels over time indicates the formation of immune tolerance to FVIII protein in the subject. In a specific embodiment, the FVIII peptide is complexed with an MHC class II multimer.

당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 면역 모니터링은, 예를 들어 혈우병이 있는 환자의 치료를 가능하게 하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역 모니터링은 본 발명의 펩타이드 및/또는 조성물의 투여가 FVIII 생성물에 대한 면역 반응을 방지하거나 또는 감소시키는지 여부를 확인하기 위하여 사용될 수 있다. 투약량 및/또는 투약 간격은 면역 모니터링에 의해 최적화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여 투약량은 항-FVIII 항체의 방지 또는 감소의 면역 모니터링으로부터의 결과에 구체적으로 기반하여 맞춰질 수 있다. 추가로, 투약 간격뿐만 아니라 투약량은 특정 환자 또는 환자 그룹에 대해 결정될 수 있다.As will be appreciated by those skilled in the art, immune monitoring can be used, for example, to enable the treatment of patients with hemophilia. For example, immune monitoring can be used to determine whether administration of the peptides and / or compositions of the invention prevents or reduces the immune response to the FVIII product. Dosage and / or dosing interval may be optimized by immune monitoring. In some embodiments, the dosage administered may be tailored based specifically on results from immune monitoring of the prevention or reduction of anti-FVIII antibodies. In addition, dosages as well as dosage intervals can be determined for a particular patient or group of patients.

A.A. FVIII-특이적 T 세포의 확인 방법How to identify FVIII-specific T cells

다른 양태에서, 본 발명은 항원-특이적 T 세포, 더 구체적으로는 본 명세서에 기재된 FVIII 단백질 및 FVIII 펩타이드에 특이적인 T 세포의 확인 방법을 포함한다. 이러한 방법은, 예를 들어 환자의 면역 모니터링과 같은 면역진단을 위해 사용될 수 있다. 한 실시형태에서, 본 발명은 FVIII 펩타이드-특이적 T 세포를 확인하는 방법을 포함하되, 해당 방법은 a) MHC 클래스 II 멀티머와 복합체화된 FVIII 펩타이드와 다수의 CD4⁺ T 세포를 조합하는 단계, 및 b) MHC 클래스 II 멀티머와 복합체화된 펩타이드에 대해 특이적인 다수의 CD4⁺ T 세포의 구성원 중 적어도 하나를 확인하는 단계를 포함하되, FVIII 펩타이드는 서열: (R¹)_x-P-(R²)_y를 가지며, 상기 식 중, P는 서열번호 68, 344 및 740으로부터 선택된 서열의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R¹은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; R²는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다. 일부 실시형태에서, R¹은 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, R²는 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.In another aspect, the invention includes a method for identifying antigen-specific T cells, more specifically T cells specific for the FVIII proteins and FVIII peptides described herein. Such methods can be used for immunodiagnosis, such as, for example, immune monitoring of a patient. In one embodiment, the invention includes a method of identifying FVIII peptide-specific T cells, the method comprising the steps of: a) combining a plurality of CD4 ⁺ T cells with an FVIII peptide complexed with an MHC class II multimer. And b) identifying at least one member of the plurality of CD4 ⁺ T cells specific for the peptide complexed with the MHC class II multimer, wherein the FVIII peptide comprises the sequence: (R ¹ ) _x -P- (R ² ) _y , wherein P is an amino acid sequence having at least 85% identity to the sequence of at least 9 consecutive amino acids of the sequence selected from SEQ ID NOs: 68, 344, and 740, and R ¹ is 1 to 80 Amino acid sequence consisting of four amino acids; R ² is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids; Each x and y is independently 0 or 1. In some embodiments, R ¹ is an amino acid sequence consisting of 1 to 40 amino acids and R ² is an amino acid sequence consisting of 1 to 40 amino acids.

특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 FVIII 펩타이드는 FVIII 특이적 T 세포의 직접 염색에 적합한 시약을 만들기 위하야 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 FVIII 펩타이드가 존재하는 MHC 클래스 II 멀티머는 다양한 형태, 예컨대 MHC 클래스 II 테트라머를 포함할 수 있다. 이들 MHC 클래스 II 분자는 진단제를 포함하기 위하여 추가로 변형될 수 있다. 대안적으로, MHC 클래스 II 멀티머와 복합체화된 FVIII 펩타이드는 진단제를 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 진단제(즉, 검출가능한 모이어티)는 면역 모니터링을 위해 당업계에 일반적으로 공지된 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, FVIII-특이적 T 세포는 MHC 클래스 II 테트라머에 의해 제공되는 본 명세서에 기재된 FVIII 펩타이드와 연관된 진단제의 검출에 기반하여 확인되고/되거나 분리될 수 있다. 적합한 진단제는 형광제, 화학발광제, 방사성활성제, 조영제 등을 포함할 수 있다. 적합한 형광제는 유세포 분석기에서 전형적으로 사용된 것을 포함하고, 이에 제한되는 것은 아니지만, 플루오레세인 아이소티오시아네이트, R-피코에리트린, 텍사스 레드(Texas Red), Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7 및 이들의 유도체를 포함할 수 있다.In certain embodiments, the FVIII peptides disclosed herein can be used to make reagents suitable for direct staining of FVIII specific T cells. For example, MHC class II multimers in which the FVIII peptides of the present invention are present may comprise various forms, such as MHC class II tetramers. These MHC class II molecules can be further modified to include diagnostic agents. Alternatively, the FVIII peptide complexed with MHC class II multimers may comprise a diagnostic agent. Diagnostic agents (ie, detectable moieties) used in the present invention may include those generally known in the art for immune monitoring. For example, FVIII-specific T cells can be identified and / or isolated based on the detection of a diagnostic agent associated with the FVIII peptides described herein provided by MHC Class II tetramers. Suitable diagnostic agents may include fluorescent agents, chemiluminescent agents, radioactive agents, contrast agents, and the like. Suitable fluorescent agents include, but are not limited to, those typically used in flow cytometry, fluorescein isothiocyanate, R-phycoerythrin, Texas Red, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7 and derivatives thereof.

특정 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 시험관내 CD4⁺ FVIII-특이적 T 세포를 재자극하기 위하여 사용될 수 있다. 이들 실시형태에서, T 세포의 재자극은 증식의 검출, 사이토카인 또는 케모카인의 분리 또는 당업자에게 공지된 특정 활성 마커의 상향- 또는 하향-조절에 의해 모니터링될 수 있다.In certain embodiments, FVIII peptides can be used to restimulate CD4 ⁺ FVIII-specific T cells in vitro. In these embodiments, restimulation of T cells can be monitored by detection of proliferation, isolation of cytokines or chemokines or up- or down-regulation of certain activity markers known to those of skill in the art.

일부 실시형태에서, 진단제는 본 명세서에 개시된 FVIII 펩타이드에 특이적인 T 세포를 확인하고/하거나 분리하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 시약(예를 들어, 펩타이드, MHC 클래스 II 테트라머 및 진단제)는 시험관내 또는 생체밖에서 FVIII-특이적 T 세포를 추적하기 위하여 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 당업계에 일반적으로 공지된 다양한 기법, 예컨대 유세포 분석기, 예를 들어 형광 활성 세포 분류(FACS) 및/또는 PCR, 예를 들어 단일 세포 PCR을 사용하여 추가로 분리되고 특성규명될 수 있다.In some embodiments, a diagnostic agent can be used to identify and / or isolate T cells specific for the FVIII peptides disclosed herein. For example, such reagents (eg, peptides, MHC class II tetramers and diagnostic agents) can be used to track FVIII-specific T cells in vitro or ex vivo. In certain embodiments, various techniques commonly known in the art can be further isolated and characterized using flow cytometers such as fluorescence activated cell sorting (FACS) and / or PCR, such as single cell PCR. Can be.

면역 모니터링 분석을 수행하기 위하여, FVIII 펩타이드-MHC 클래스 II 멀티머 복합체와 결합하는 T 세포는 CD4⁺ T 세포를 포함하고, 당업계에 일반적으로 공지된 다양한 방법을 사용하여 환자로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 환자의 혈액, 기관 또는 다른 조직으로부터 분리되고 정제될 수 있다. FVIII 특이적 T 세포의 분리 및 정제는 다양한 면역진단적 용도를 위하여 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, FVIII 펩타이드 또는 연관된 시약은 새로운 FVIII 생성물의 임상적 개발 동안 FVIII-특이적 T 세포의 면역 모니터링을 위하여 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 면역 관용 유도 치료 동안 FVIII-특이적 T 세포의 면역 모니터링을 위하여 사용될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 FVIII 처리 동안 FVIII-특이적 T 세포의 면역 모니터링을 위하여 사용될 수 있다.To perform immune monitoring assays, T cells that bind to FVIII peptide-MHC class II multimer complexes include CD4 ⁺ T cells and can be isolated from patients using a variety of methods generally known in the art. For example, T cells can be isolated and purified from the patient's blood, organs or other tissues. Isolation and purification of FVIII specific T cells can be used for a variety of immunodiagnostic uses. In certain embodiments, FVIII peptides or associated reagents can be used for immune monitoring of FVIII-specific T cells during clinical development of new FVIII products. In other embodiments, the FVIII peptides can be used for immune monitoring of FVIII-specific T cells during immune tolerance induction therapy. In another embodiment, the FVIII peptides can be used for immune monitoring of FVIII-specific T cells during FVIII treatment.

VIII.VIII. 본 발명의 키트Kit of the invention

본 발명은 또한 본 발명에 의해 제공되는 조성물의 사용을 용이하게 하고/하거나 표준화할 뿐만 아니라 본 발명의 방법을 가능하게 하기 위한 키트를 제공한다. 이들 다양한 방법을 수행하기 위한 물질 및 시약은 본 방법의 실행을 가능하게 하기 위한 키트 내에서 제공될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "키트"는 처리, 검사, 분석 또는 조작을 가능하게 하는 물품의 조합에 대해 사용될 수 있다.The invention also provides kits for facilitating and / or standardizing the use of the compositions provided by the invention as well as enabling the methods of the invention. Materials and reagents for carrying out these various methods can be provided in kits to enable the implementation of the methods. The term "kit" as used herein may be used for a combination of articles that allow for processing, inspection, analysis or manipulation.

키트는 화학적 시약(예를 들어, FVIII 펩타이드 또는 FVIII 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)뿐만 아니라 다른 성분을 함유할 수 있다. 추가로, 본 발명의 키트는 또한, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만, 샘플 수집 및/또는 정제, 생성물 수집 및/또는 정제를 위한 장치 및 시약, 박테리아 세포 형질전환을 위한 시약, 진핵세포 트랜스펙션을 위한 시약, 이전에 형질전환되거나 또는 트랜스펙션된 숙주 세포, 샘플 튜브, 홀더, 트레이, 랙(rack), 디쉬, 플레이트, 키트 사용자에 대한 설명서, 용액, 완충제 또는 다른 화학적 시약, 표준화, 정상화를 위하 사용되는 적합한 샘플 및/또는 제어 샘플을 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 편리한 저장 및 안정한 선적을 위하여, 예를 들어 리드(lid)를 갖는 박스 내에 포장될 수 있다.The kit may contain chemical reagents (eg, FVIII peptide or polynucleotides encoding FVIII peptide) as well as other components. In addition, the kits of the present invention may also be, for example, but not limited to, sample collection and / or purification, devices and reagents for product collection and / or purification, reagents for bacterial cell transformation, eukaryotic transfection Reagents for selection, instructions for previously transformed or transfected host cells, sample tubes, holders, trays, racks, dishes, plates, kit users, solutions, buffers or other chemical reagents, standardization, Suitable samples and / or control samples used for normalization may be included. The kit of the invention can also be packaged in a box with a lid, for example for convenient storage and stable shipment.

일부 실시형태에서, 예를 들어 본 발명의 키트는 본 발명의 FVIII 펩타이드, 본 발명의 FVIII 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 벡터(예를 들어, 플라스미드), 벡터를 전파하는데 적합한 박테리아 세포 균주 및 발현된 융합 단백질의 정제를 위한 시약을 제공할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 키트는 FVIII 펩타이드의 보존적으로 변형된 변이체를 만들기 위하여 FVIII 펩타이드의 돌연변이유발을 수행하는데 필요한 시약을 제공할 수 있다.In some embodiments, for example, a kit of the invention may comprise a FVIII peptide of the invention, a polynucleotide vector (eg, a plasmid) encoding a FVIII peptide of the invention, a bacterial cell strain suitable for propagating the vector and expressed fusions. Reagents for the purification of proteins can be provided. Alternatively, the kits of the present invention may provide the reagents necessary to carry out mutagenesis of the FVIII peptide to make conservatively modified variants of the FVIII peptide.

키트는 본 발명의 하나 이상의 조성물, 예를 들어 하나 또는 다수의 FVIII 펩타이드 또는 FVIII 펩타이드를 암호화하는 하나 또는 다수의 폴리뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 대안적으로, 키트는 환자의 면역 모니터링을 수행하기 위한 시약(예를 들어, 펩타이드, MHC 클래스 II 테트라머 및 진단제)을 함유할 수 있다.The kit may contain one or more compositions of the invention, for example one or multiple FVIII peptides or one or multiple polynucleotides encoding FVIII peptides. Alternatively, the kit may contain reagents (eg, peptides, MHC class II tetramers and diagnostic agents) for performing immune monitoring of the patient.

본 발명의 키트는 하나 또는 다수의 재조합 핵산 분자를 함유할 수 있는데, 이는 FVIII 펩타이드를 암호화하며, 동일 또는 상이할 수 있고, 예를 들어 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위 또는 재조합효소 인식 부위 또는 관심의 임의의 폴리뉴클레오타이드를 함유하거나 또는 암호화하는 작동가능하게 연결된 제2 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있다. 추가로, 키트는 키트의 구성성분, 특히 키트 내 함유된 본 발명의 조성물을 사용하기 위한 설명서를 함유할 수 있다.Kits of the invention may contain one or multiple recombinant nucleic acid molecules, which encode FVIII peptides, which may be identical or different, for example, restriction endonuclease recognition sites or recombinase recognition sites or of interest. It may further comprise an operably linked second polynucleotide that contains or encodes any polynucleotide. In addition, the kit may contain components of the kit, in particular instructions for using the compositions of the invention contained in the kit.

IX.IX. 특이적 실시형태Specific Embodiment

한 실시형태에서, 본 발명은 다음의 아미노산 서열: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(서열번호 344)에서 9개의 연속적 아미노산에 대해 적어도 85% 동일한 9개 아미노산의 연속적 서열로 이루어진 FVIII 펩타이드를 제공하며, 해당 펩타이드는 식 (R1)x-펩타이드-(R2)y를 가지고, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; 각각의 아래첨자 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.In one embodiment, the invention provides an FVIII peptide consisting of a contiguous sequence of 9 amino acids that is at least 85% identical to 9 contiguous amino acids in the following amino acid sequence: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID NO: 344), wherein the peptide is of formula (R1) ) x-peptide- (R2) y, R1 is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids; R2 is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids; Each subscript x and y is independently 0 or 1.

한 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 또 다른 실시형태에서, R¹ 및 R²는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.In one embodiment, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 80 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 70 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 60 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 50 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 40 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 30 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 20 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 10 amino acids. In other embodiments, R ¹ and R ² are individually or both amino acid sequences consisting of 1 to 5 amino acids. In another embodiment, R ¹ and R ² are individually or both 1 to 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 , 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 or 80 amino acids.

상기 기재된 펩타이드의 구체적 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0이다. In specific embodiments of the peptides described above, x and y are both zero.

상기 기재된 펩타이드의 구체적 실시형태에서, x는 1이고, y는 0이다. In specific embodiments of the peptides described above, x is 1 and y is 0.

상기 기재된 펩타이드의 구체적 실시형태에서, x는 0이고, y는 1이다. In specific embodiments of the peptides described above, x is 0 and y is 1.

상기 기재된 펩타이드의 구체적 실시형태에서, x 및 y는 둘 다 1이다.In specific embodiments of the peptides described above, x and y are both one.

상기 기재된 펩타이드의 구체적 실시형태에서, 9개의 아미노산의 연속적 서열은 아미노산 서열: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(서열번호 344) 내 9개의 연속적 아미노산과 동일하다.In specific embodiments of the peptides described above, the contiguous sequence of nine amino acids is identical to nine contiguous amino acids in the amino acid sequence: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID NO: 344).

한 실시형태에서, 본 발명은 다음의 아미노산 서열: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(서열번호 344) 에서 9개의 연속적 아미노산에 대해 적어도 85% 동일한 9개의 아미노산의 연속적 서열로 이루어진 FVIII 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하며, 해당 펩타이드는 식 (R1)x-펩타이드-(R2)y를 가지고, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; 각각의 아래첨자 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다. In one embodiment, the invention provides a pharmaceutical composition comprising a FVIII peptide consisting of a contiguous sequence of 9 amino acids at least 85% identical to 9 consecutive amino acids in the following amino acid sequence: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID NO: 344), The peptide of interest has the formula (R1) x-peptide- (R2) y, wherein R1 is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids; R2 is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids; Each subscript x and y is independently 0 or 1.

상기 기재된 조성물의 구체적 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0이다. In specific embodiments of the compositions described above, x and y are both zero.

상기 기재된 조성물의 구체적 실시형태에서, x는 1이고, y는 0이다. In specific embodiments of the compositions described above, x is 1 and y is 0.

상기 기재된 조성물의 구체적 실시형태에서, x는 0이고, y는 1이다. In specific embodiments of the compositions described above, x is 0 and y is 1.

상기 기재된 조성물의 구체적 실시형태에서, x와 y는 둘 다 1이다. In specific embodiments of the compositions described above, x and y are both one.

상기 기재된 조성물의 구체적 실시형태에서, 조성물은 GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI(서열번호 159), PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER(서열번호 250), EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY(서열번호 477), LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG(서열번호 568), NPPIIARYIRLHPTHYSIRST(서열번호 659), TVVITLKNMASHPVSLHA(서열번호 10), AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(서열번호 68) 및 TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(서열번호 740)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 아미노산 서열에서 9개의 연속적 아미노산과 적어도 85% 동일한 9개의 아미노산 서열의 연속적 서열로 이루어진 적어도 하나의 펩타이드를 추가로 포함하되, 적어도 하나의 펩타이드는 길이로 최대 80개의 아미노산이고, 적어도 하나의 펩타이드에서 임의의 추가적인 아미노산은 천연 아미노산이다.In specific embodiments of the compositions described above, the compositions comprise GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI (SEQ ID NO: 159), PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER (SEQ ID NO: 250), EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY (SEQ ID NO: 477), LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG (SEQ ID NO: 568 L, HPVITIRNN) 10), at least one peptide consisting of a contiguous sequence of 9 amino acid sequences at least 85% identical to 9 consecutive amino acids in an amino acid sequence independently selected from the group consisting of AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG (SEQ ID NO: 68) and TVVITLKNMASHPVSLHAVGV (SEQ ID NO: 740) Wherein at least one peptide is up to 80 amino acids in length, and any additional amino acid in the at least one peptide is a natural amino acid.

한 실시형태에서, 본 발명은 피험체에서 FVIII에 대해 면역 관용을 유도하는 방법을 제공하되, 해당 방법은 다음의 아미노산 서열: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(서열번호 344)에서 9개의 연속적 아미노산에 대해 적어도 85% 동일한 9개의 아미노산의 연속적 서열로 이루어진 FVIII 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 피험체에게 투여하고, 이에 의해 피험체에서 FVIII 단백질에 대해 면역 관용을 유도하는 단계를 포함하며, 해당 펩타이드는 식 (R1)x-펩타이드-(R2)y를 가지고, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; 각각의 아래첨자 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.In one embodiment, the invention provides a method of inducing immune tolerance against FVIII in a subject, wherein the method comprises at least 85% identical 9 for 9 consecutive amino acids in the following amino acid sequence: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID NO: 344) Administering to the subject a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising a FVIII peptide consisting of consecutive sequences of four amino acids, thereby inducing immune tolerance for the FVIII protein in the subject, wherein the peptide is R1) x-peptide- (R2) y, R1 is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids; R2 is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids; Each subscript x and y is independently 0 or 1.

상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, 약제학적 조성물은 GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI(서열번호 159), PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER(서열번호 250), EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY(서열번호 477), LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG(서열번호 568), NPPIIARYIRLHPTHYSIRST(서열번호 659), TVVITLKNMASHPVSLHA(서열번호 10), AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(서열번호 68) 및 TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(서열번호 740)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 아미노산 서열에서 9개의 연속적 아미노산에 대해 적어도 85%인 9개의 아미노산의 연속적 서열로 이루어진 적어도 하나의 펩타이드를 추가로 포함하되, 적어도 하나의 펩타이드는 길이로 최대 80개의 아미노산이고, 적어도 하나의 펩타이드 내 임의의 추가적인 아미노산은 천연 아미노산이다.In a specific embodiment of the method described above, the pharmaceutical composition comprises GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI (SEQ ID NO: 159), PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER (SEQ ID NO: 250), EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY (SEQ ID NO: 477), LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG (SEQ ID NO: 568 MH) (SEQ ID NO: 10), at least one consisting of a contiguous sequence of 9 amino acids that is at least 85% to 9 consecutive amino acids in an amino acid sequence independently selected from the group consisting of AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG (SEQ ID NO: 68) and TVVITLKNMASHPVSLHAVGV (SEQ ID NO: 740) Further comprising a peptide, wherein at least one peptide is up to 80 amino acids in length, and any additional amino acid in the at least one peptide is a natural amino acid.

상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, 약제학적 조성물의 투여는 피험체에서 항-FVIII 항체의 발생을 방지한다.In specific embodiments of the methods described above, administration of the pharmaceutical composition prevents the development of anti-FVIII antibodies in the subject.

상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, 약제학적 조성물의 투여는 피험체에서 존재하는 항-FVIII 항체의 양을 감소시킨다.In specific embodiments of the methods described above, administration of the pharmaceutical composition reduces the amount of anti-FVIII antibody present in the subject.

상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0이다.In a specific embodiment of the method described above, x and y are both zero.

상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, x는 1이고, y는 0이다.In a specific embodiment of the method described above, x is 1 and y is 0.

상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, x는 0이고, y는 1이다.In a specific embodiment of the method described above, x is 0 and y is 1.

상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, x와 y는 둘 다 1이다.In a specific embodiment of the method described above, x and y are both one.

한 실시형태에서, 본 발명은 FVIII 펩타이드의 제조방법을 제공하되, 해당 방법은 a) 다음의 아미노산 서열: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(서열번호 344)에서 9개의 연속적 아미노산과 적어도 85% 동일한 9개의 아미노산의 연속적 서열로 이루어진 FVIII 펩타이드를 암호화하는 벡터를 포함하는 세포의 배양물을 제공하는 단계, 및 b) 세포 배양물에서 펩타이드를 발현시키는 단계를 포함하되, 해당 펩타이드는 식 (R1)x-펩타이드-(R2)y를 가지고, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; 각각의 아래첨자 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.In one embodiment, the invention provides a method of preparing a FVIII peptide, the method comprising: a) a contiguous sequence of 9 amino acids at least 85% identical to 9 consecutive amino acids in the following amino acid sequence: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID NO: 344) Providing a culture of cells comprising a vector encoding the FVIII peptide, and b) expressing the peptide in a cell culture, wherein the peptide is formula (R1) x-peptide- (R2) y R 1 is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids; R2 is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids; Each subscript x and y is independently 0 or 1.

상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0이다.In a specific embodiment of the method described above, x and y are both zero.

상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, x는 1이고, y는 0이다.In a specific embodiment of the method described above, x is 1 and y is 0.

상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, x는 0이고, y는 1이다.In a specific embodiment of the method described above, x is 0 and y is 1.

상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, x와 y는 둘 다 1이다.In a specific embodiment of the method described above, x and y are both one.

한 실시형태에서, 본 발명은 a) 고체상 또는 액체상 합성 기법을 사용하여 펩타이드를 합성하는 단계를 포함하는 FVIII 펩타이드의 제조방법을 제공하되, 펩타이드는 다음의 아미노산 서열: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(서열번호 344)에서 9개의 연속적 아미노산과 적어도 85% 동일한 9개의 아미노산의 연속적 서열로 이루어지고, 펩타이드는 식 (R1)x-펩타이드-(R2)y를 가지고, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; 각각의 아래첨자 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.In one embodiment, the present invention provides a method of preparing a FVIII peptide comprising a) synthesizing a peptide using a solid or liquid phase synthesis technique, wherein the peptide comprises 9 in the following amino acid sequence: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID NO: 344). Consisting of a sequence of 9 amino acids at least 85% identical to 9 consecutive amino acids, wherein the peptide has the formula (R1) x-peptide- (R2) y and R1 is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids; R2 is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids; Each subscript x and y is independently 0 or 1.

상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0이다.In a specific embodiment of the method described above, x and y are both zero.

상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, x는 1이고, y는 0이다.In a specific embodiment of the method described above, x is 1 and y is 0.

상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, x는 0이고, y는 1이다.In a specific embodiment of the method described above, x is 0 and y is 1.

상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, x와 y는 둘 다 1이다. In a specific embodiment of the method described above, x and y are both one.

한 실시형태에서, 본 발명은 FVIII 펩타이드-특이적 T 세포를 확인하는 방법을 제공하며, 해당 방법은 a) MHC 클래스 II 멀티머와 복합체화된 FVIII 펩타이드와 다수의 CD4+ T 세포를 조합하는 단계, 및 b) MHC 클래스 II 멀티머와 복합체화된 펩타이드에 특이적인 다수의 CD4+ T 세포의 구성원 중 적어도 하나를 확인하는 단계를 포함하되, FVIII 펩타이드는 다음의 아미노산 서열: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(서열번호 344)에서 9개의 연속적 아미노산과 적어도 85% 동일한 9개의 아미노산의 연속적 서열로 이루어지고, 펩타이드는 식 (R1)x-펩타이드-(R2)y를 가지고, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; 각각의 아래첨자 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.In one embodiment, the invention provides a method of identifying FVIII peptide-specific T cells, the method comprising the steps of: a) combining a plurality of CD4 + T cells with an FVIII peptide complexed with an MHC class II multimer, And b) identifying at least one member of the plurality of CD4 + T cells specific for the peptide complexed with the MHC class II multimer, wherein the FVIII peptide is selected from the following amino acid sequence: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID NO: 344). Consisting of a sequence of 9 amino acids at least 85% identical to 9 consecutive amino acids, wherein the peptide has the formula (R1) x-peptide- (R2) y and R1 is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids; R2 is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids; Each subscript x and y is independently 0 or 1.

상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, MHC 클래스 II 멀티머는 MHC 클래스 II 테트라머이다.In specific embodiments of the methods described above, the MHC Class II multimers are MHC Class II tetramers.

상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, 펩타이드 또는 MHC 클래스 II 멀티머는 진단제를 추가로 포함한다.In specific embodiments of the methods described above, the peptide or MHC class II multimers further comprise a diagnostic agent.

상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, 진단제는 펩타이드에 특이적인 다수의 CD4+ T 세포의 적어도 하나의 구성원을 확인한다.In specific embodiments of the methods described above, the diagnostic agent identifies at least one member of the plurality of CD4 + T cells specific for the peptide.

상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, 해당 방법은 진단제의 검출에 기반하여 펩타이드에 특이적인 다수의 CD4+ T 세포의 적어도 하나의 구성원을 분리시키는 단계를 추가로 포함한다.In specific embodiments of the methods described above, the methods further comprise separating at least one member of the plurality of CD4 + T cells specific for the peptide based on the detection of the diagnostic agent.

상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, 다수의 CD4+ T 세포의 적어도 하나의 구성원은 유세포 분석기에 의해 분리된다.In specific embodiments of the methods described above, at least one member of the plurality of CD4 + T cells is isolated by flow cytometry.

상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0이다. In a specific embodiment of the method described above, x and y are both zero.

상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, x는 1이고, y는 0이다. In a specific embodiment of the method described above, x is 1 and y is 0.

상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, x는 0이고, y는 1이다. In a specific embodiment of the method described above, x is 0 and y is 1.

상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, x와 y는 둘 다 1이다. In a specific embodiment of the method described above, x and y are both one.

본 발명은 이제 다음의 실시예에서 추가로 예시될 것이며, 이것으로 제한되지 않는다.The present invention will now be further illustrated in the following examples, without being limited thereto.

X.X. 실시예Example

실시예 1Example 1

FVIII 펩타이드를 확인하기 위한 인간 MHC 클래스 II 분자를 더 양호하게 모방하기 위하여, 인간 HLA-DRB1*1501 특이적 결합 부위를 운반하는 키메라 MHC 클래스 II 분자로 A형 혈우병에 대한 마우스 모델을 개발하였다. 이 마우스를 모든 뮤린 MHC 클래스 II 유전자의 완전한 녹아웃을 운반하는 마우스에 대해 역교배시켰다(Reipert et al ., J. Thromb . Haemost. 7 Suppl. 1:92-97 (2009)). 이 새로운 유전자이식 마우스 모델에서, 모든 CD4⁺ T 세포 반응은 인간 MHC 클래스 II 분자에 의해 구동된다. 이들 마우스에서 항-FVIII 면역 반응을 구동하는 HLA-DRB1*1501에 의해 제시된 FVIII 펩타이드를 확인하기 위하여 이 마우스 모델을 사용하였다.To better mimic human MHC class II molecules to identify FVIII peptides, mouse models for hemophilia A were developed with chimeric MHC class II molecules carrying human HLA-DRB1 * 1501 specific binding sites. These mice were backcrossed to mice carrying the complete knockout of all murine MHC class II genes (Reipert et al . , J. Thromb . Haemost . 7 Suppl. 1: 92-97 (2009)). In this new transgenic mouse model, all CD4 ⁺ T cell responses are driven by human MHC class II molecules. This mouse model was used to identify the FVIII peptides presented by HLA-DRB1 * 1501 that drive anti-FVIII immune responses in these mice.

물질 및 방법Materials and methods

FVIII: 재조합 인간 FVIII(rFVIII)을 무알부민 벌크 생성물(Baxter Neuchatel) 및 임상적 수크로스 조제된 FVIII 생성물(캘리포니아주 웨스트레이크 빌리지에 소재한 Advate, Baxter)로서 생성하였다.FVIII: Recombinant human FVIII (rFVIII) was generated as albumin bulk product (Baxter Neuchatel) and clinical sucrose formulated FVIII product (Advate, Baxter, Westlake Village, CA).

혈우병에 걸린 HLA-DRB15 E17 마우스: 문헌[Reipert et al ., J. Thromb . Haemost. 7 Suppl . 1:92-97 (2009)]에 기재된 바와 같은 HLA-DRB1*1501^+/- E17^-/- 마우스. 마우스는 모두 수컷이었고 실험의 시작시 8 내지 12주령이었다.HLA-DRB15 E17 mice with hemophilia: Reipert et al ., J. Thromb . Haemost. 7 Suppl . 1: 92-97 (2009)] HLA-DRB1 * 1501 ^+/− E17 ^{− / −} mice. The mice were all male and were 8-12 weeks old at the start of the experiment.

인간 재조합 FVIII에 의한 면역화: HLA-DRB1*1501^+/- E17^-/- 마우스는 1주일 간격으로 0.2 ㎍ 또는 1 ㎍ 인간 rFVIII의 정맥내 또는 피하 용량을 4 내지 8회 받았다. 본래의 조제 완충제 또는 칼슘 및 마그네슘을 함유하는 둘베코 인산염 완충 식염수(DPBS; 미국 미주리주 세인트루이스에 소재한 Sigma Aldrich) 중에서 rFVIII를 희석시켰다.Immunization with Human Recombinant FVIII: HLA-DRB1 * 1501 ^+/− E17 ^{− / −} mice received 4 to 8 intravenous or subcutaneous doses of 0.2 μg or 1 μg human rFVIII at weekly intervals. RFVIII was diluted in native preparation buffer or Dulbecco's phosphate buffered saline containing calcium and magnesium (DPBS; Sigma Aldrich, St. Louis, MO).

세포 프레파라트: rFVIII로 최종 면역화 후 3 내지 7일에 비장을 얻었다. 비장 세포를 민싱(mince)하였고, 70 ㎛ 세포 스트레이터(strainer)(뉴저지주 플랭클린 레이크에 소재한 Becton Dickinson)를 통과시켰다. 배양 배지 중에 단일 세포를 수집하였고: RPMI 1640 배지(캘리포니아주 칼스베드에 소재한 Gibco, Invitrogen, Life Technologies)를 10% 사전선택한 우태아혈청(FCS; 유타주 로간에 소재한 Hyclone), 2 mM L-글루타민, 100 U/㎖ 페니실린/스트렙토마이신(둘 다 Gibco) 및 5x10^-5 M 머캅토에탄올(Sigma-Aldrich)로 보충하였다. 적혈구를 0.15 M 염화암모늄, 10 mM 중탄산칼륨(둘 다 독일 다름슈타트에 소재한 Merck제) 및 0.1 mM 에틸렌-다이아민테트라아세트산(Sigma-Aldrich)으로 구성된 저장성 완충제(pH 7.2)를 사용하여 용해시켰다. 세포를 세척하였고, Coulter Counter Z1을 사용하여 계측하였다.Cell Preparat: Spleens were obtained 3-7 days after final immunization with rFVIII. Splenocytes were minced and passed through a 70 μm cell strainer (Becton Dickinson, Franklin Lake, NJ). Single cells were collected in the culture medium: fetal bovine serum (FCS; Hyclone, Logan, Utah), 10% preselected RPMI 1640 medium (Gibco, Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA), 2 mM L-glutamine, Supplemented with 100 U / ml penicillin / streptomycin (both Gibco) and 5 × 10 ⁻⁵ M mercaptoethanol (Sigma-Aldrich). Erythrocytes were lysed using hypotonic buffer (pH 7.2) consisting of 0.15 M ammonium chloride, 10 mM potassium bicarbonate (both from Merck, Darmstadt, Germany) and 0.1 mM ethylene-diaminetetraacetic acid (Sigma-Aldrich). Cells were washed and counted using Coulter Counter Z1.

FVIII 펩타이드의 확인을 위한 T-세포 하이브리도마의 생성Generation of T-Cell Hybridomas for Identification of FVIII Peptides

인간 rFVIII에 의한 비장세포의 시험관내 재자극: 3 또는 10일 동안 1.5×10⁶개 세포/㎖의 농도에서 배양배지 내 20㎍/㎖ 인간 FVIII의 존재에서 비장 세포를 재자극하였다. 10일 동안 배양 배지를 배양시키고, 6일 후 새로 교체하였다.In vitro restimulation of splenocytes by human rFVIII: Splenocytes were restimulated in the presence of 20 μg / ml human FVIII in culture medium at a concentration of 1.5 × 10 ⁶ cells / ml for 3 or 10 days. Culture medium was incubated for 10 days and freshly replaced after 6 days.

BW 세포와 마우스 T 세포의 융합: 시험관내 재자극 비장 세포 배양물 및 BW 세포(α-β-)를 무혈청 배양 배지로 2회 세척한 다음, 1:3 내지 1:10(T 세포:BW 세포)의 비로 조합하였다. BW 세포주는 마우스 AKR/J T 세포 림프종으로부터 유래되었다. 이들 세포는 그것의 표면(α-β-) 상에 T 세포 수용체가 없었고, 따라서 마우스 비장세포와 융합 후 임의의 T 세포 수용체는 융합 상대로부터 유래된다. 제3 세척 단계 후, 상청액을 제거하였다. 융합 조건은 45초 내 1㎖ 폴리에틸렌글라이콜(PEG; 50% HybiMax, Sigma-Aldrich)의 첨가에 의해 달성하였다. 인큐베이션의 다른 45초 후, 후속하여 50㎖ 무혈청 배지를 첨가하여 PEG의 독성 효과를 방지하였다. 5분 동안 1300 rpm에서 세포를 원심분리시켜 파손 없이 매우 단단한 펠렛을 형성하였다. 상청액을 버렸고, 펠렛의 위치를 바꾸지 않기 위한 목적으로 50㎖ 새로은 무혈청 배지를 매우 서서히 첨가하였다. 세포가 재현탁되고 앞에서와 같이 원심분리될 때까지 튜브를 서서히 뒤집었다. 이를 2회 행하여 남아있는 PEG를 제거하였다. 배양배지로 최종 세척 단계를 행하였다. 배양 배지에 대해 최종 세척 단계를 행하였다. 그 다음에 세포를 희석시키고 96웰 플레이트에서 배양시켰다. 48시간 후 선택 배지에 대해 배양 배지를 변화시켰고(HAT 배지 보충물, Sigma Aldrich), 성장 클론을 선택하였다. 선택 배지를 2주 동안 유지시켰고, 그 후에 후속하여 배지를 정상 배양배지로 되돌렸다.Fusion of BW Cells and Mouse T Cells: In vitro restimulated spleen cell cultures and BW cells (α-β-) were washed twice with serum-free culture medium, followed by 1: 3 to 1:10 (T cells: BW). Cells). BW cell lines were derived from mouse AKR / J T cell lymphoma. These cells did not have a T cell receptor on their surface (α-β-), so after fusion with mouse splenocytes any T cell receptor is derived from the fusion partner. After the third wash step, the supernatant was removed. Fusion conditions were achieved by addition of 1 ml polyethylene glycol (PEG; 50% HybiMax, Sigma-Aldrich) in 45 seconds. After another 45 seconds of incubation, 50 ml of serum-free medium was subsequently added to prevent the toxic effects of PEG. The cells were centrifuged at 1300 rpm for 5 minutes to form very hard pellets without breakage. The supernatant was discarded and 50 ml fresh serum-free medium was added very slowly for the purpose of not repositioning the pellets. The tube was slowly flipped over until the cells were resuspended and centrifuged as before. This was done twice to remove the remaining PEG. The final wash step was done with culture medium. The final wash step was performed on the culture medium. Cells were then diluted and incubated in 96 well plates. After 48 hours the culture medium was changed for the selection medium (HAT medium supplement, Sigma Aldrich) and growth clones were selected. The selection medium was maintained for 2 weeks, after which time the medium was returned to normal culture medium.

FVIII-특이적 T 세포 하이브리도마의 펩타이드 특이성: T 세포 하이브리도마를 그것의 항원 특이성에 대해 시험하였다. 이 목적을 위해, 1×10⁵개 세포를 항원 존재 세포와 공동 배양시켰다. 본 발명자들은 5×10⁴개의 가르(Mgar) 세포(HLA-DRB1*1501를 발현시킴) 또는 천연 HLA-DRB1*1501 - E17 마우스로부터 유래된 1×10⁵개 전체 비장 세포 중 하나를 사용하였다. 세포를 37℃, 5% CO₂에서 24시간 동안 10㎍/㎖ 인간 rFVIII 또는 1㎍/㎖ 펩타이드/펩타이드 풀과 함께 인큐베이션시켰다. 상청액을 수집하였고, 제조업자의 프로토콜에 따라 IL-2 ELISA(캘리포니아주 샌디에고에 소재한 BioLegend) 또는 IL-2 Bio-Plex(캘리포니아주 허큘레스에 소재한 Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 배양 상청액 내로 IL-2 방출을 측정하였다. IL-2 방출은 FVIII(또는 펩타이드)의 존재에서 ≥ 20 pg/ml 이지만, FVIII(또는 펩타이드)의 부재하에 양성으로 고려되었고, 또는 대안적으로 FVIII의 부재와 비교하여 FVIII의 존재에서 IL-2 방출의 10배 증가는 양성으로 고려되었다.Peptide Specificity of FVIII-Specific T Cell Hybridomas: T cell hybridomas were tested for their antigen specificity. For this purpose, 1 × 10 ⁵ cells were co-cultured with antigen present cells. We used either 5 × 10 ⁴ Mgar cells (expressing HLA-DRB1 * 1501) or 1 × 10 ⁵ total splenocytes derived from native HLA-DRB1 * 1501 -E17 mice. Cells were incubated with 10 μg / ml human rFVIII or 1 μg / ml peptide / peptide pool at 37 ° C., 5% CO ₂ for 24 hours. Supernatants were collected and IL-2 released into culture supernatants using IL-2 ELISA (BioLegend, San Diego, Calif.) Or IL-2 Bio-Plex (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), according to the manufacturer's protocol. Was measured. IL-2 release is> 20 pg / ml in the presence of FVIII (or peptide), but was considered positive in the absence of FVIII (or peptide), or alternatively IL-2 in the presence of FVIII compared to the absence of FVIII A 10-fold increase in release was considered positive.

T 세포 하이브리도마의 서브클로닝: 각 클론이 T 세포 중 단지 하나를 나타내는 것을 보장하기 위하여, 하이브리도마 모든 클론을 서브클로닝시켰다. 하이브리도마 클론을 0.3 세포/웰의 제한 희석으로 희석시켰고, 200개의 피더(feeder) 세포/웰과 공동-배양시켰다. 융합 상대 세포, BW 세포의 미토마이신 C 처리에 의해 피더 세포를 생성하였다. 2×10⁸개 BW 세포를 인큐베이터 내 5% CO₂에서 실온에서 10분 동안 및 37℃에서 25분 동안 스트렙토마이세스 카이스피토수스(Streptomyces caespitosus)(Sigma Aldrich)로부터 0.1㎎ 미토마이신으로 처리하였다. 클론 당 5개의 성장 서브클론을 선택하였고, 그것의 FVIII 특이성에 대해 시험하였다.Subcloning of T Cell Hybridomas: To ensure that each clone represents only one of the T cells, all clones of the hybridomas were subcloned. Hybridoma clones were diluted to a limiting dilution of 0.3 cells / well and co-cultured with 200 feeder cells / well. Feeder cells were generated by mitomycin C treatment of fusion partner cells, BW cells. 2 × 10 ⁸ BW cells were treated with 0.1 mg mitomycin from Streptomyces caespitosus (Sigma Aldrich) for 10 minutes at room temperature and 25 minutes at 37 ° C. in 5% CO ₂ in incubator. Five growth subclones per clone were selected and tested for their FVIII specificity.

T 세포 하이브리도마의 특이성을 확인하기 위하여 사용한 FVIII 펩타이드 풀: 문헌[Ay et al. (Biopolymers 88:64-75 (2007))]에 기재된 바와 같은 SPOT 합성 방법을 사용하여 FVIII 펩타이드 풀을 생성하였다. 간략하게, 15량체(mer) 펩타이드를 2개의 동일한 셀룰로스 막 상에서 합성하였다. 막을 수직 및 수평 스트라이프로 절단하였다. 펩타이드를 막 스트라이프로부터 방출시켰고, 상기 기재한 바와 같은 특이성 시험에서 펩타이드 풀로서 사용하였다. 펩타이드를 DMSO(Hybrimax, Sigma Aldrich) 중에서 용해시켰고, PBS로 추가로 희석시켰다.FVIII peptide pools used to confirm the specificity of T cell hybridomas: Ay et al. The SPV synthesis method as described in ( Biopolymers 88: 64-75 (2007)) was used to generate FVIII peptide pools. Briefly, 15-mer peptides were synthesized on two identical cellulose membranes. The membrane was cut into vertical and horizontal stripes. Peptides were released from the membrane stripe and used as peptide pools in specificity tests as described above. Peptides were dissolved in DMSO (Hybrimax, Sigma Aldrich) and further diluted with PBS.

결과result

181 FVIII 특이적 클론을 생성하였다. 이들 클론을 전체 인간 FVIII에 걸쳐 펩타이드 라이브러리에 대해 스크리닝하였다. 3개의 아미노산에 의해 15량체 펩타이드 오프셋을 사용하였다. 이 접근을 사용하여, HLA-DRB1*1501에 결합된 펩타이드를 함유한 6개의 상이한 FVIII 영역을 확인하였다. 본 발명자는 인간 FVIII의 A1 도메인 내 2개의 펩타이드, A2 도메인 내 2개의 펩타이드, B 도메인 내 1개, A3 도메인 내 2개 및 C1 도메인 내 1개의 펩타이드 도메인을 발견하였다. FVIII 펩타이드^{1 401 -1424}는 앞서 기재하지 않았다(표 11). 펩타이드 FVIII^{474 -494}, FVIII^{545 -559}, FVIII^1788-1802 및 FVIII^{2161 -2175}는 컴퓨터 예측 프로그램 다음에 T 세포 혼성 기법을 사용한 WO 09/071886에서 이미 확인하였다. 펩타이드 FVIII^{2030 -2044}는 WO 03/087161에서 개시되었다. 펩타이드 FVIII^{2161 -2180}은 문헌[Jacquemin et al., Blood 101(4):1351-8 (2003)]에 의해 이미 공개되었다.181 FVIII specific clones were generated. These clones were screened for peptide libraries across the entire human FVIII. A 15-mer peptide offset was used with three amino acids. This approach was used to identify six different FVIII regions containing peptides bound to HLA-DRB1 * 1501. We have found two peptides in the A1 domain of the human FVIII, two peptides in the A2 domain, one in the B domain, two in the A3 domain and one peptide domain in the C1 domain. FVIII peptides ^1401-1424 was not previously described (Table 11). Peptides FVIII ^{474 -494} , FVIII ^{545 -559} , FVIII ^1788-1802 and FVIII ^{2161 -2175} have already been identified in WO 09/071886 using the T cell hybridization technique following the computer prediction program. FVIII peptides ^{2030 -2044} has been disclosed in WO 03/087161. FVIII peptides ^{2161 -2180} are described in [Jacquemin et al, Blood 101 ( 4):. 1351-8 (2003)] have already been disclosed by the.

T-세포 에피토프를 포함하는 FVIII의 영역Region of FVIII Including T-Cell Epitopes T 세포 에피토프를 포함하는 영역Regions Containing T Cell Epitopes 아미노산 서열Amino acid sequence 개시내용Disclosure FVIII^102-122 FVIII ^102-122 TVVITLKNMASHPVSLHAVGV
(서열번호 740)TVVITLKNMASHPVSLHAVGV
(SEQ ID NO: 740) WO 2003/087161에 개시된 FVIII^{107 -121}
WO/2009/095646에 개시된 FVIII^{100 -118} Disclosed in WO 2003/087161 FVIII ^{107 -121
100 -118} FVIII disclosed in WO / 2009/095646 FVIII^246-266 FVIII ^246-266 AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG
(서열번호 68)AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG
(SEQ ID NO: 68) WO/2009/095646에 개시된 FVIII^{253 -268} FVIII ^{253 -268} disclosed in WO / 2009/095646 FVIII^474-494 FVIII ^474-494 GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI
(서열번호 159)GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI
(SEQ ID NO: 159) WO 2009/071886에 개시된 FVIII^{475 -495}
WO/2009/095646에 개시된 FVIII^{477-495 475 -495} FVIII disclosed in WO 2009/071886
FVIII ^477-495 disclosed in WO / ^2009/095646 FVIII^540-560 FVIII ^540-560 PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER
(서열번호 250)PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER
(SEQ ID NO: 250) WO 2009/071886에 개시된 FVIII ^542-562
WO/2009/095646에 개시된 FVIII^545-569
FVIII ^542-562 disclosed in WO ^2009/071886
FVIII ^545-569 disclosed in WO / ^2009/095646
FVIII^1401-1424 FVIII ^1401-1424 QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT
(서열번호 344)QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT
(SEQ ID NO: 344) 본 발명의 펩타이드Peptides of the Invention FVIII^1785-1805 FVIII ^1785-1805 EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY
(서열번호 477)EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY
(SEQ ID NO: 477) WO 2009/071886에 개시된 FVIII ^1785-1805
WO/2009/095646에 개시된 FVIII^1787-1805 FVIII ^1785-1805 disclosed in WO 2009/071886
FVIII ^1787-1805 disclosed in WO / ^2009/095646 FVIII^2025-2045 FVIII ^2025-2045 LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG
(서열번호 568)LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG
(SEQ ID NO: 568) WO 2003/087161에 개시된 FVIII ^2030-2044 FVIII ^2030-2044 disclosed in WO ^2003/087161 FVIII^2160-2180 FVIII ^2160-2180 NPPIIARYIRLHPTHYSIRST
(서열번호 659)NPPIIARYIRLHPTHYSIRST
(SEQ ID NO: 659) WO 2009/071886에 개시된 FVIII ^2158-2178 및
FVIII ^2161-2180 Jacquemin et al., 상기 참조
WO 2003/087161에 개시된 FVIII ^2164-2183
WO/2009/095646에 개시된 FVIII ^2164-2188 FVIII ^2158-2178 disclosed in WO 2009/071886 and
FVIII ^2161-2180 Jacquemin et al. , See above
FVIII ^2164-2183 disclosed in WO ^2003/087161
FVIII ^2164-2188 disclosed in WO / ^2009/095646

본 명세서에 기재된 실시예 및 실시형태는 단지 예시적 목적을 위한 것이며, 이것에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 시사될 것이고, 본 출원의 정신 및 이해의 범위 및 첨부되는 특허청구범위의 범주 내에 포함될 것이다. 본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 모든 목적을 위하여 그들의 전문이 참조로서 본 명세서에 포함된다.The examples and embodiments described herein are for illustrative purposes only and, in light of this, various modifications or changes will be suggested to those skilled in the art and are intended to be included within the scope of the spirit and understanding of the present application and the appended claims. will be. All publications, patents, and patent applications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety for all purposes.

Claims (40)

피험체에서 FVIII에 대해 면역 관용을 유도하는 방법으로서, 상기 방법은
(R¹)_x-P-(R²)_y로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하되,
상기 식 중,
P는 서열번호 344의 적어도 9개의 연속적 아미노산에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고;
R¹은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며;
R²는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고;
각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1인 것인 방법.A method of inducing immune tolerance against FVIII in a subject, the method
Administering a therapeutically effective amount of a peptide having an amino acid sequence consisting of (R ¹ ) _x -P- (R ² ) _y ,
Wherein,
P is an amino acid sequence having at least 85% identity to at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 344;
R ¹ is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids;
R ² is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids;
Wherein each x and y is independently 0 or 1. 제1항에 있어서, P는 서열번호 344의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열인 것인 방법.The method of claim 1, wherein P is an amino acid sequence having at least 85% identity to the sequence of at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 344. 3. 제1항에 있어서, P는 서열번호 344의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열인 것인 방법.The method of claim 1, wherein P is an amino acid sequence having at least 90% identity to the sequence of at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 344. 3. 제1항에 있어서, P는 서열번호 344의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열인 것인 방법.The method of claim 1, wherein P is an amino acid sequence having at least 95% identity to the sequence of at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 344. 3. 제1항에 있어서, P는 서열번호 344의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 동일한 아미노산 서열인 것인 방법.The method of claim 1, wherein P is an amino acid sequence identical to the sequence of at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 344. 3. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, x와 y는 둘 다 0인 것인 방법.6. The method of claim 1, wherein x and y are both zero. 7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, x는 1이고, y는 0인 것인 방법.6. The method of claim 1, wherein x is 1 and y is 0. 7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, x는 0이고, y는 1인 것인 방법.6. The method of claim 1, wherein x is 0 and y is 1. 7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, x와 y는 둘 다 1인 것인 방법.6. The method of claim 1, wherein x and y are both 1. 7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진 것인 방법.6. The method of claim 1, wherein the peptide consists of 9 to 100 amino acids. 7. 제10항에 있어서, 상기 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 것인 방법.The method of claim 10, wherein the peptide consists of 9 to 50 amino acids. 제10항에 있어서, 상기 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 것인 방법.The method of claim 10, wherein the peptide consists of 9 to 25 amino acids. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은
(R¹)_x-P-(R²)_y로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 제2 펩타이드의 치료적 유효량을 상기 피험체에게 투여하는 단계를 더 포함하되,
상기 식 중,
P는 서열번호 10, 68, 159, 250, 344, 477, 568, 659 및 740으로부터 선택된 서열의 적어도 9개의 연속적 아미노산에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고;
R¹은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며;
R²는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고;
각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1인 것인 방법.The method of any one of claims 1 to 12, wherein the method is
Further comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of a second peptide having an amino acid sequence consisting of (R ¹ ) _x -P- (R ² ) _y ,
Wherein,
P is an amino acid sequence having at least 85% identity to at least 9 consecutive amino acids of the sequence selected from SEQ ID NOs: 10, 68, 159, 250, 344, 477, 568, 659 and 740;
R ¹ is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids;
R ² is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids;
Wherein each x and y is independently 0 or 1. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물의 투여는 상기 피험체에서 항-FVIII 항체의 발생을 방지하는 것인 방법.The method of claim 1, wherein administration of the pharmaceutical composition prevents the development of anti-FVIII antibodies in the subject. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물의 투여는 상기 피험체에서 항-FVIII 항체의 양을 감소시키는 것인 방법.The method of claim 1, wherein administering the pharmaceutical composition reduces the amount of anti-FVIII antibody in the subject. 아미노산 서열: (R¹)_x-P-(R²)_y로 이루어지되,
상기 식 중,
P는 서열번호 344의 적어도 9개의 연속적 아미노산에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고;
R¹은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며;
R²는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고;
각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1인 것인 펩타이드.Amino acid sequence: consisting of (R ¹ ) _x -P- (R ² ) _y ,
Wherein,
P is an amino acid sequence having at least 85% identity to at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 344;
R ¹ is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids;
R ² is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids;
Wherein each of x and y is independently 0 or 1. 제16항에 있어서, P는 서열번호 344의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열인 것인 펩타이드.The peptide of claim 16, wherein P is an amino acid sequence having at least 85% identity to the sequence of at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 344. 18. 제16항에 있어서, P는 서열번호 344의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열인 것인 펩타이드.The peptide of claim 16, wherein P is an amino acid sequence having at least 90% identity to the sequence of at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 344. 18. 제16항에 있어서, P는 서열번호 344의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열인 것인 펩타이드.The peptide of claim 16, wherein P is an amino acid sequence having at least 95% identity to the sequence of at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 344. 18. 제16항에 있어서, P는 서열번호 344의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 동일한 아미노산 서열인 것인 펩타이드.The peptide of claim 16, wherein P is the same amino acid sequence as the sequence of at least 9 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 344. 18. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, x와 y는 둘 다 0인 것인 펩타이드.The peptide of any one of claims 16-20, wherein x and y are both zero. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, x는 1이고, y는 0인 것인 펩타이드.21. The peptide of any one of claims 16-20, wherein x is 1 and y is 0. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, x는 0이고, y는 1인 것인 펩타이드.The peptide of claim 16, wherein x is 0 and y is 1. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, x와 y는 둘 다 1인 것인 펩타이드.The peptide of any one of claims 16-20, wherein x and y are both 1. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진 것인 펩타이드.The peptide of any one of claims 16-20, wherein the peptide consists of 9 to 100 amino acids. 제25항에 있어서, 상기 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 것인 펩타이드.The peptide of claim 25, wherein the peptide consists of 9 to 50 amino acids. 제25항에 있어서, 상기 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 것인 펩타이드.The peptide of claim 25, wherein the peptide consists of 9 to 25 amino acids. 제16항 내지 제27항 중 어느 한 항의 펩타이드를 포함하는 조성물.A composition comprising the peptide of any one of claims 16-27. 제28항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 투여를 위해 조제된 것인 조성물.The composition of claim 28, wherein the composition is formulated for pharmaceutical administration. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 조성물은 제2 폴리펩타이드를 더 포함하고, 상기 제2 폴리펩타이드는 하기 아미노산 서열: (R¹)_x-P-(R²)_y로 이루어지되,
상기 식 중,
P는 서열번호 10, 68, 159, 250, 344, 477, 568, 659 및 740으로부터 선택된 서열의 적어도 9개의 연속적 아미노산에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고;
R¹은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며;
R²는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고;
각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1인 것인 조성물.The composition of claim 28 or 29, wherein the composition further comprises a second polypeptide, wherein the second polypeptide consists of the following amino acid sequence: (R ¹ ) _x -P- (R ² ) _y ,
Wherein,
P is an amino acid sequence having at least 85% identity to at least 9 consecutive amino acids of the sequence selected from SEQ ID NOs: 10, 68, 159, 250, 344, 477, 568, 659 and 740;
R ¹ is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids;
R ² is an amino acid sequence consisting of 1 to 80 amino acids;
Wherein each x and y is independently 0 or 1. FVIII 펩타이드를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
a) 제16항 내지 제27항 중 어느 한 항의 FVIII 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포의 배양물을 제공하는 단계; 및
b) 상기 세포 배양물 내 펩타이드를 발현시키는 단계를 포함하는 것인 방법.A method of preparing an FVIII peptide, the method comprising
a) providing a culture of cells comprising a polynucleotide encoding the FVIII peptide of any one of claims 16-27; And
b) expressing the peptide in said cell culture. FVIII 펩타이드-특이적 T 세포를 확인하는 방법으로서, 상기 방법은
a) MHC 클래스 II 멀티머(multimer)와 복합체화된 펩타이드와 다수의 CD4⁺ T 세포를 조합하는 단계, 및
b) 상기 MHC 클래스 II 멀티머와 복합체화된 상기 펩타이드에 특이적인 다수의 CD4⁺ T 세포의 구성원 중 적어도 하나를 확인하는 단계를 포함하되,
상기 펩타이드는 제16항 내지 제27항 중 어느 한 항의 FVIII 펩타이드인 것인 방법.A method of identifying FVIII peptide-specific T cells, the method comprising
a) combining a plurality of CD4 ⁺ T cells with a peptide complexed with an MHC class II multimer, and
b) identifying at least one member of the plurality of CD4 ⁺ T cells specific for the peptide complexed with the MHC class II multimer,
28. The method of claim 16, wherein the peptide is the FVIII peptide of any one of claims 16-27. 제32항에 있어서, 상기 MHC 클래스 II 멀티머는 MHC 클래스 II 테트라머인 것인 방법.33. The method of claim 32, wherein the MHC class II multimer is an MHC class II tetramer. 제32항 또는 제33항에 있어서, 상기 펩타이드 또는 MHC 클래스 II 멀티머는 검출가능한 모이어티를 더 포함하는 것인 방법.The method of claim 32 or 33, wherein the peptide or MHC class II multimer further comprises a detectable moiety. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드에 특이적인 상기 적어도 하나의 CD4⁺ T 세포를 분리시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.35. The method of any one of claims 32-34, further comprising isolating said at least one CD4 ⁺ T cell specific for said peptide. 제35항에 있어서, 상기 CD4⁺ T 세포는 유세포 분석기를 사용하여 분리되는 것인 방법.36. The method of claim 35, wherein said CD4 ⁺ T cells are isolated using a flow cytometer. 융합 단백질로서,
제16항 내지 제27항 중 어느 한 항의 인자 VIII 펩타이드; 및
제2 펩타이드를 포함하는 것인 융합 단백질.As a fusion protein,
The Factor VIII peptide of any one of claims 16-27; And
A fusion protein comprising a second peptide. 제37항에 있어서, 상기 제2 펩타이드는 리포터 펩타이드(reporter peptide)인 것인 융합 단백질.The fusion protein for use as in claim 37, wherein the second peptide is a reporter peptide. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 융합 단백질은 핵산에 의해 암호화된 것인 융합 단백질.The fusion protein of claim 37, wherein said fusion protein is encoded by a nucleic acid. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 FVIII 펩타이드는 상기 제2 펩타이드에 화학적으로 연결된 것인 융합 단백질.The fusion protein of claim 37 or 38, wherein said FVIII peptide is chemically linked to said second peptide.