KR20130125686A

KR20130125686A - 전기화학적 검출을 위한 전기영동칩

Info

Publication number: KR20130125686A
Application number: KR1020120049387A
Authority: KR
Inventors: 정택동; 강충무
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2012-05-09
Filing date: 2012-05-09
Publication date: 2013-11-19
Also published as: KR101409065B1

Abstract

본 발명은 전기화학적 검출을 위한 전기영동칩 및 이를 이용하여 전기장의 간섭없이 전기화학적 신호를 모니터링하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 전기영동칩은 유체채널 내의 일 지점에 유체 분석물질의 전기화학적 특성을 검출하기 위한 작업전극이 구비되어 있고, 채널의 적어도 일 벽면에 상기 작업전극과 전기적으로 연결된 등전위구조물이 구비되고, 상기 등전위구조물을 통로로 하여 유체채널과 인접해 있는 채널 외부에 지지전해질 용액으로 채위지고 상기 등전위구조물에 의해 형성된 등전위공간에 상대전극이 구비되어 작업전극과 상대전극 사이에 발생하는 전기화학적 신호를 검출하는 것을 특징으로 한다. 또한 전기장이 인가된 유체채널 내의 일 지점에 구비된 작업전극을 통해 상기 전기장의 간섭없이 전기화학적 신호를 모니터링하는 방법으로서, 상기 작업전극과 상대전극 사이의 전기화학적 신호를 측정하는 단계를 포함하며, 이때 상기 유체채널의 적어도 일 벽면에 형성되고 상기 작업전극과 전기적으로 연결되어 있는 등전위구조물에 의해 등전위공간이 형성되고, 상기 상대전극은 상기 등전위구조물에 의해 채널과 분리된 등전위공간에 배치되어 있는 것이 특징인 방법에 관한 것이다.

Description

전기화학적 검출을 위한 전기영동칩{An electrophoresis chip for electrochemical detection}

마이크로칩 전기영동법(microchip electrophoresis; MCE)은 지난 십수년에 걸쳐 소형화된 시스템을 사용하는 화학적 및 생물학적 분석을 위한 방법으로 대두되고 있다. 비전문가들이 언제 어디서나 분석을 수행할 수 있도록 하기 위하여 최근에는 미세유체 칩-기반 분석도구를 응용하여 시료 전처리, 분리 및 검출 등의 복수의 단위 공정을 하나의 칩에 집적시키는 경향이 있다. 휴대용 시스템을 위한 필수적인 요소로는 낮은 검출한계, 빠른 분석, 높은 효율, 낮은 비용, 일회성 및 휴대가능성을 갖춘 고성능 분리-기반 시스템을 위한 검출기법이 중요하다. 실제적으로 소형화된 검출기는 칩-기반 분석도구에 상당한 이점을 제공할 수 있다.

적외선 흡수 스펙트럼의 푸리에 전환(Fourier transformation of infrared light absorption spectra; FT-IR), 라만산란(Raman scattering), 핵자기공명(nuclear magnetic resonance; NMR), 굴절률(refractive index; RI), 열렌즈 현미경관찰법(thermal lens microscopy; TLM), 마이크로플라즈마-광학 방출 분광법(microplasma-optical emission spectroscopy; OES), 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance; SPR), 전기화학적 분석법(electrochemical analysis; EC), 화학발광법(chemiluminescence; CL), 질량분석법(mass spectrometry; MS), UV-vis 흡광법(UV-vis), 및 레이저 유도 형광법(laser induced fluorescence; LIF)과 같은 검출방법을 전기영동 장치에 통합시키려는 시도가 진행되어 오고 있다. 특히, 검출의 질의 현저한 손실 없는 모세관 전기영동법(capillary electrophoresis; CE)과의 호환성으로 인해 MS, LIF, UV-vis 및 EC에 관심이 집중되고 있다. 시판되고 있는 CE 기기의 대부분이 UV-vis 흡광법을 이용하고 있음에도 불구하고, 상기 검출법은 본질적으로 열악한 검출한계로 인해 나노몰 또는 나노몰 미만의 농도 범위의 미량의 화학종 분석에는 부적합하다. MS 검출법은 MCE와 결합하여 높은 효율을 제공하는 것으로 보고되고 있으나, 고가의 장비를 요구하며 일반적으로 휴대할 수 없다는 단점이 있다. LIF는 MCE와 결합하여 극도로 민감한 검출을 허용하는 보편적인 검출방법이다. 하지만, LIF법을 수행할 수 있도록 분석물질을 형광체로 유도체합성하거나 자연적 형광 화합물을 분석물질로 선택해야만 한다. EC 검출법은 매우 단순한 기기와 마이크로칩 상에 집적시킨 마이크로 스케일의 전극으로 구성되면서도 탁월한 민감도와 선택성을 가진다. 따라서, 미세유체 온-칩(on-chip) 분리 시스템을 위한 이상적인 검출방법으로 널리 사용되고 있다. 이러한 EC 검출법에 있어서 가장 큰 문제점은 CE를 위해 기본적으로 인가되는 높은 CE 전압과 그로 인해 검출기가 받게 되는 강한 전기장의 영향이다. 이로 인해, 심한 노이즈가 유발되고 전기화학적 검출을 불가능하게 할 수 있다. 또한, 전기적 급증(electrical surge)이 EC 검출기에 심각한 손상을 야기할 수 있다.

전류 측정에 의한 검출방법은 마이크로채널 내의 작업전극의 위치에 따라 엔드-채널형과 인-채널형으로 분류된다. 엔드-채널 검출법은 CE 전압과 전류의 영향을 감소시켜 분석물로부터 산화환원 전류를 측정하는 손쉬운 방법이다. Woolley 등은 전기영동장(capillary electrophoresis field; CE field)의 간섭을 최소화하기 위해 작업전극 직전에서 점차적으로 넓어지는 분리 채널 말단에 위치한 작업전극을 이용하는 마이크로칩 상에서의 엔드-채널 검출법을 제안하였다. 그러나, 채널의 배출구 근처에서 전기화학적 전류를 측정하는 것은 산화환원종의 반파전위 이동을 유발시켜 전기영동장 하에서 작업전극과 채널 배출구의 상대적인 위치에 대한 민감도로 인해 재현성을 저하시킬 수 있다. Wang 등은 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 분리채널과 작업전극 간에 특정한 거리를 유지하는 "wall-jet"이라 명명한 엔드-채널 검출방법을 개발하였다. 그러나, 수직으로 존재하는 검출 스트립에 연결된 분리채널의 구조는 마이크로칩의 소형화와 다양성을 제한한다. 엔드-채널 검출법이 전기영동장 하에서 EC 전류를 측정할 수 있는 방법을 제공할 수 있으나, 피크 넓어짐을 야기하고 분리효율에 영향을 주는 시료 플러그 분산을 포함하여 몇 가지 실질적인 문제점을 여전히 가지고 있다. Ertl 등은 마이크로 채널 상에서 외피유동(sheath-flow)을 이용하여 시료 플러그의 분산을 방지함으로써 엔드-채널 검출법을 개선하였다. 그러나, 외피유동 채널의 형성은 채널 디자인의 복잡성을 증가시킨다. 분리채널 내의 분석물질로부터 산화환원 전류를 측정하기 위한 몇몇 이론적 및 실험적 전략이 보고되고 있다. Martin 등은 분리채널의 최말단에 배열된 그러나 여전히 내부에 존재하는 작업전극을 갖는 디자인을 제시하였다. 그러나, 상기 인-채널 배열은 반파전위의 이동과 전기화학적 노이즈를 최소화하기 위하여 분리채널 내에서 작업전극의 정확한 배열을 요구한다. Chen 등은 이중채널 배치(dual-channel configuration)를 이용하여 전위이동을 제거할 수 있는 인-채널 검출법을 제안하였으나, 이때 작업전극 및 기준전극은 iR 강하를 최소화하기 위하여 채널 배출구에 위치한 상대전극에 가능한 가까이 위치해야만 한다. 더불어, 상기 검출법에 있어서 이중채널은 칩 패턴의 단순화를 저해하고 동일한 칩 상에 다른 요소의 집적을 곤란하게 하는 복잡한 채널 디자인을 요구한다.

감결합 접근법(decoupling approach)은 전기영동장으로부터 전류측정에 의한 신호를 분리하고 엔드-채널법에서 관찰되는 확산성 띠-넓어짐을 제거하기 위한 또 다른 방법이다. Rossier와 동업자들은 분리채널에 수직하게 위치한 마이크로홀 어레이로 구성되는 감결합기를 집적시켰다. Chen 등은 수소 버블을 효과적으로 제거하기 위하여 감결합기로서 팔라듐 금속전극을 사용하였다. 상기 인-채널 검출을 위한 감결합법이 분리장(separation field)으로부터 EC 검출기를 분리시킬 수 있고 엔드-채널법의 특징인 띠 넓어짐을 억제할 수 있는 또 다른 효과적인 방법을 제공함에도 불구하고, 감결합기와 작업전극 간의 전기장 세기의 빠른 감소로 인한 띠 분산은 여전히 존재한다. 양극성 전기화학을 이용하는 또 다른 접근법은 감결합기를 사용하지 않는 인-채널 검출방법이다. 그러나, 양극성 전극 크기, 전극 간격 또는 전기장 세기를 조절함으로써 작업전극의 전위를 조절하는, 전류측정에 의한 검출방법-기반 양극성 전기화학은 개개의 산화환원-활성 분석물질에 따라 달라지는 고유 산화환원 전위의 다양성으로 인해 산화환원-활성 분석물질의 검출에는 적합하지 않다.

이에 본 발명자들은 강한 전기영동장의 영향을 최소화시켜 재현성있는 전기화학적 측정을 가능하게 할 수 있는 방법을 예의 연구노력한 결과, 유체채널의 일 벽면에 등전위구조물로서 유체채널 내의 작업전극과 전기적으로 연결된 고분자 전해질 겔 염다리(polyelectrolytic gel salt bridge; PGSB)를 도입함으로써 유사기준전극으로 작용하도록 하여 작업전극과 기준전극이 동일한 전위차를 경험하도록 하는 효과를 유발하여 전기영동장의 영향을 받지 않고 마이크로채널 상의 어디서나 인-채널 검출을 가능하게 하는 신규한 모세관 전기영동을 위한 마이크로칩 및 이를 이용한 검출방법을 확인하고 본 발명을 완성하였다. 상기 인-채널법은 다음의 이유로 특히 MCE에 적합하다: (i) 감결합기(decoupler) 없이 인-채널 검출을 쉽게 수행할 수 있다. (ii) UV 노출에 의한 PGSB의 생성은 매우 간편하며 따라서, PGSB를 분리채널 내 어느 곳에도 위치시킬 수 있다. (iii) 전기적으로 분리된 검출기(detector)는 전자장치에 대한 손상을 제거할 수 있으므로 작업전극에서 전위변동(potential fluctuation)을 최소화할 수 있다. (iv) 분리채널 내에 작업전극을 위치시킴으로 엔드-채널 검출법을 사용할 때 관찰되는 띠-넓어짐을 제거하여 높은 분리효율을 얻을 수 있다. (v) 작업전극과 기준전극을 등전위면 상에 위치시킴으로써 반파전위 이동을 감소시키고, 고분자 전해질 염다리 영역의 급격한 저항감소로 인해 바탕 노이즈를 실질적으로 감소시킨다; 따라서, 변화하는(varying) 그리고 변동가능한(possibly fluctuating) 전기영동장 하에서도 작업전극에 일정한 전위를 적용할 수 있다.

본 발명의 목적은 양단부 사이에 전압이 걸려있고 상기 전압에 의해 시료 중 분석물질들이 이동하면서 이동속도 차이에 의해 분석물질을 분리하는 유체채널을 구비하는 전기영동칩에 있어서, 유체채널 내의 일 지점에 분석물질의 전기화학적 특성을 검출하기 위한 작업전극이 구비되어 있고, 채널의 적어도 일 벽면에 상기 작업전극과 전기적으로 연결된 등전위구조물이 구비되고, 상기 등전위구조물을 통로로 하여 유체채널과 인접해 있는 채널 외부에 지지전해질 용액으로 채위지고 상기 등전위구조물에 의해 형성된 등전위공간에 상대전극이 구비되어 작업전극과 상대전극 사이의 전기화학적 신호를 측정하는 것이 특징인 전기영동칩을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 전기장이 인가된 유체채널 내의 일 지점에 구비된 작업전극을 통해 상기 전기장의 간섭없이 전기화학적 신호를 모니터링하는 방법으로서, 상기 작업전극과 상대전극 사이의 전기화학적 신호를 측정하는 단계를 포함하며, 이때, 상기 유체채널의 적어도 일 벽면에 형성되고 상기 작업전극과 전기적으로 연결되어 있는 등전위구조물에 의해 등전위공간이 형성되고, 상기 상대전극은 상기 등전위구조물에 의해 채널과 분리된 등전위공간에 배치되어 있는 것이 특징인 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서 본 발명은 양단부에 사이에 전압이 걸려있고 상기 전압에 의해 시료 중 분석물질들이 이동하면서 이동속도 차이에 의해 분석물질을 분리하는 유체채널을 구비하는 전기영동칩에 있어서, 유체채널 내의 일 지점에 분석물질의 전기화학적 특성을 검출하기 위한 작업전극이 구비되어 있고, 채널의 적어도 일 벽면에 상기 작업전극과 전기적으로 연결된 등전위구조물이 구비되고, 상기 등전위구조물을 통로로 하여 유체채널과 인접해 있는 채널 외부에 지지전해질 용액으로 채위지고 상기 등전위구조물에 의해 형성된 등전위공간에 상대전극이 구비되어 작업전극과 상대전극 사이의 전기화학적 신호를 측정하는 것이 특징인 전기영동칩을 제공한다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 전기장이 인가된 유체채널 내의 일 지점에 구비된 작업전극을 통해 상기 전기장의 간섭없이 전기화학적 신호를 모니터링하는 방법으로서, 상기 작업전극과 상대전극 사이의 전기화학적 신호를 측정하는 단계를 포함하며, 이때, 상기 유체채널의 적어도 일 벽면에 형성되고 상기 작업전극과 전기적으로 연결되어 있는 등전위구조물에 의해 등전위공간이 형성되고, 상기 상대전극은 상기 등전위구조물에 의해 채널과 분리된 등전위공간에 배치되어 있는 것이 특징인 방법을 제공한다.

"전기영동"은 전기장 하에서 분석하고자 하는 물질의 이동속도 차이에 의해 물질을 분리하는 방법이다. 분석물질들은 각기 고유의 전하를 띠고 있어 전기장을 적용하면 서로 다른 속도로 이동하게 되는 원리에 근거한 분석 방법이다. 완충용액과 같은 용매 속에서 분자들은 각각 고유의 전하를 띠게 되고(예를 들어 DNA는 일반적으로 음전하를, 단백질은 pH에 따라 음전하, 중성 또는 양전하를 띔) 상기 혼합물에 전기장을 걸어주면 전하에 따라 각기 다른 속도로 이동하게 되므로 분리가 가능하다. 본 발명에서 전기영동은 모세관 전기영동(capillary electrophoresis)인 것이 바람직하다. 상기 모세관 전기영동은 전기영동의 분리 메커니즘과 크로마토그래피의 기기화 및 자동화 개념을 도입한 양이온과 음이온은 물론 중성물질까지도 한번에 분리할 수 있는 분리법이다. 용액 중에 존재하는 분석물질 혼합물에 전기장을 걸어주면, 각 성분들은 각각의 전하와 이동도에 따라 일정한 방향과 속도로 이동한다. 각 성분들은 이동도에 따라 분리되며, 이때, 이동도에 영향을 주는 요소는 입자의 크기, 모양, 평균 전하량 등의 표면전하 특성 및 수용액의 pH, 농도, 온도 등이다. 모세관 전기영동에는 수십 μm 직경의 캐필러리를 이용하며 일반적으로 외부펌프에 의해 발생하는 층상흐름(laminar flow)이나 포물선흐름(parabolic flow)이 아닌 전기영동적 현상인 수직의 전기삼투적 흐름(electro osmotic flow)에 의해 높은 분리효율을 얻을 수 있다. 상기 전기삼투적 흐름의 또 다른 이점은 분석성분의 전하에 관계없이 동일한 방향으로 이동시킨다는 것이다. 이는 전기삼투적 흐름이 음이온이 양극으로 향하려는 힘보다 현저히 크게 작용하기 때문이다. 따라서, 양이온의 전기적 이동력과 전기삼투적 흐름의 합력으로 보다 빠르게 이동하고 중성물질은 전기적 이동력이 아닌 전기삼투적 흐름에 의해 이동하며 음이온은 전기적 이동력 보다 현저히 큰 전기삼투적 흐름에 의해 양극이 아닌 음극으로 이동하나 그 속도는 중성물질보다 느리다.

이러한 모세관 전기영동의 원리는 마이크로칩에 적용될 수 있다. 수 cm 길이와 수십 μm 너비를 갖는 미세유체채널을 갖는 분석칩을 제조하고 그 양말단에 전기장을 걸어주면 상기 모세관 전기영동과 동일한 원리로 미량의 시료를 분리 및/또는 분석할 수 있다. 그러나, 이러한 마이크로칩을 이용하여 전기영동 분리를 하는 경우 시료가 분리될 수 있는 이동 거리가 짧으므로, 분리효율을 높이기 위하여 보다 강한 전기장을 걸어주어야만 한다. 뿐만 아니라, 시료의 주입, 이동, 혼합, 반응, 분리, 검출 또는 사후분석의 과정을 위해서도 강한 전기장이 가해질 수 있다. 그러나, 이러한 강한 전기장은 분석물질의 전기화학적 검출에 영향을 미친다.

상기 "전기장"은 단위길이당 인가되는 전압으로 표현되는 것으로, 일반적으로 상용화된 모세관 전기영동 시스템에서 최대 30 kV까지 인가될 수 있으나, 예외적으로 60 kV 또는 그 이상의 고전압이 인가되는 경우도 있고, 상기 30 kV의 전압이 30 cm 모세관에 가해지는 경우 약 1000 V/cm의 전기장이 인가된다. 그러나 상기 전기영동을 위해 적용되는 전압은 분석물질 및 분리효율 등을 고려하여 선택될 수 있다. 효율적인 분석물질의 분리 및 전기화학적 검출을 위하여 바람직하게는 0 V/cm 내지 1000 V/cm의 전기장이 인가될 수 있으며, 보다 바람직하게는 0 V/cm 내지 500 V/cm의 전기장이 인가될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 10 μm의 폭을 갖는 작업전극을 이용하여 500 V/cm의 전기장 하에서도 상기 전기장의 간섭없이 전기화학적 검출이 가능하였다. 그러나, 상기 작업전극의 폭을 1 μm까지 줄인다면 이론적으로 8000 V/cm의 전기장 하에서도 전기화학적 검출이 가능하다.

따라서, 본 발명에서는 마이크로칩을 이용한 전기영동 분석의 전기화학적 검출에서 상기 전기영동을 위한 강한 전기장의 영향을 배제하기 위하여 분리 채널 내에 위치한 분석물질의 전기화학적 검출을 위한 작업전극과 전기적으로 연결된 등전위구조물을 도입하여 등전위공간을 형성할 수 있도록 하는 것이 특징이다. 한편, 상기 등전위공간은 일례로 등전위구조물로서 고분자 전해질 겔 염다리를 도입하여 형성할 수 있다. 상기 등전위구조물을 도입함으로써 작업전극과 기준전극 사이에 전기영동을 위한 전기장으로 인해 발생할 수 있는 전압구배를 제거하고 상기 양 전극이 동일한 전위 상에 존재할 수 있도록 한다. 상기 등전위구조물은 등전위면을 3차원적인 공간으로 확장시키기 위해 도입된 구조물을 지칭할 수 있다.

상기 전기화학적 신호는 분석물질의 전기적 신호 또는 전극을 통하여 전기적 신호로 변환된 화학적 신호를 포함할 수 있으며, 전류, 전도도 또는 전위차일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 전기화학적 신호의 검출을 위해 분석칩 상에 도입되는 전극은 분리채널 내의 일 벽면(인-채널 또는 오프-채널 검출법)에 또는 그 말단(엔드-채널 검출법)에 구비될 수 있다. 인-채널 검출법 즉, 채널 내 검출법 수행을 위한 작업전극은 바람직하게는 분리채널 내의 일 벽면에 분리채널과 수직하게 즉, 전기영동장과 평행하게 구비될 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 위치 또한 분리채널 상이기만 하면 제한없이 도입될 수 있다.

전기화학적 검출을 위한 전극 시스템은 2전극 시스템 또는 3전극 시스템일 수 있다. 2전극 시스템은 분석물질의 검출을 위한 작업전극 및 상대전극을 포함하는 반면, 3전극 시스템은 추가적으로 기준전극을 더 포함한다. 일반적으로 3전극 시스템이 널리 사용되고 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 2전극 시스템에서는 상대전극이 기준전극의 역할을 겸한다. 따라서, 본 발명에서 용어 "기준전극"은 2전극 시스템의 경우에는 기준전극의 역할을 겸하는 상대전극을 3전극 시스템인 경우에는 상대전극과 별도로 구비된 기준전극을 지칭할 수 있다. 상기 고분자 전해질 겔 염다리와 같은 등전위구조물에 의해 채널과 분리된 지지전해질 용액으로 채워진 등전위공간에는 상대전극 및 선택적으로 기준전극을 구비할 수 있다. 이때, 상기 등전위구조물은 유사기준전극으로 작용한다.

본 발명에서 "등전위면(equipotential surface)"은 사전적 의미로 전기장 안에서 전위가 같은 점들로 이루어진 면을 의미한다. 마이크로칩 상에 형성된 분리채널은 수 cm의 짧은 거리를 가지며 상기 짧은 거리 내에서 분리를 위하여 강한 전기장(예를 들어, 수 십 내지 수 백 V/cm)이 가해지므로 전기화학적 검출을 위한 작업전극과 기준전극 사이의 물리적인 거리는 채널 내 용액 상에서의 큰 전위차로 인해 검출 신호에 있어서 오차를 발생시키게 된다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에서는 전기영동용 마이크로칩의 채널 내에 존재하는 전기화학적 검출을 위한 작업전극과 등전위면 상에 등전위구조물로서 고분자 전해질 겔 염다리를 도입하여 상기 등전위구조물에 의해 채널과 분리된 공간이 상기 작업전극과 동일한 전위를 갖는 등전위공간을 형성하였다.

상기 등전위구조물인 고분자 전해질 겔 염다리는 바람직하게 이온전도성 고분자이며, 이에 따라 분리채널과 기준전극과 상대전극이 존재하는 공간 사이에서 이온의 자유로운 이동은 허용하면서 이온 이외의 다른 성분 예컨대 분리채널의 완충용액이 상기 고분자 전해질 겔 염다리로 분리된 외부채널에 채워진 지지전해질(supporting electrolyte) 용액과 혼합되는 것은 차단하는 기능을 할 수 있다. 즉, 상기 등전위구조물은 이온의 자유로운 이동은 허용하지만, 고농도의 지지전해질로의 분석용 완충용액의 누수는 방지할 수 있다. 상기 이온전도성 고분자로 형성된 등전위구조물은 매우 낮은 저항을 가지므로 그 폭이 제한되지 않으나, 이온의 이동은 허용하고 용액의 출입은 차단할 수 있는 기능을 가지는 한 얇게 형성되는 것이 바람직하다. 예를 들어 형성되는 고분자 전해질 겔 염다리는 수십 nm 내지 수백 μm 폭으로 제조될 수 있다.

바람직하게 상기 등전위구조물에 의해 형성되는 등전위공간은 유체채널의 너비가 A, 등전위구조물에 의해 형성된 등전위공간으로 향하는 통로 길이 및 분리채널 너비를 포함하는 분리채널 외벽으로부터 기준전극까지의 수직거리가 B이고 등전위 공간으로 향하는 통로의 너비가 C일 때, 상기 분리채널 외벽으로부터 기준전극까지의 수직 거리 B는 유체채널의 너비인 A의 1.5배 이상일 수 있다. 상기 통로의 길이는 수 μm 내지 수백 μm일 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 50 μm일 수 있고, 보다 바람직하게는 3 내지 10 μm일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때, 상기 통로의 폭 C는 수 μm 내지 수백 μm일 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 10 μm일 수 있으며, 이에 의해 채널로부터 분리된 상대전극 및/또는 기준전극이 존재하는 등전위공간의 너비 D는 C의 1 내지 10배 또는 1 내지 100배 일 수 있으나, 마이크로칩의 기재를 벗어나지 않는 한 제한되지 않는다(도 11). 등전위공간의 폭 또한 마이크로칩을 벗어나지 않는 한 제한되지 않는다. 상기 통로를 통해 채널로부터 분리된 등전위공간의 형태는 원형 또는 사각형일 수 있으나, 전기화학적 신호 검출을 위한 상대전극 및/또는 기준전극을 수용할 수 있는 한 이에 제한되지 않으며, 상기 등전위공간의 너비는 통로가 존재하는 면 또는 이와 대향하는 면 사이의 최대거리를, 폭은 상기 면들과 수직하는 즉, 통로와 평행한 면 사이의 최대거리를 의미한다. 그러나, 상기 제시한 채널 및 구조물의 규모는 실시예에 제시된 마이크로칩의 크기를 고려하여 작성된 값일 뿐 마이크로칩 자체의 크기에 따라 조절될 수 있다. 즉, 나노미터 수준 또는 센티미터 수준의 분석칩으로 제작되는 경우 이에 준하는 수준으로 조절될 수 있다.

상기 고분자 전해질 겔 염다리는 고분자 단량체(monomer) 또는 이량체 내지 십량체를 채널 내에 주입하고 등전위면을 형성하고자 하는 위치 즉, 작업전극과 동일한 위치 상에 포토마스크를 이용하여 국부적으로 빛을 조사하여 겔 형태로 경화시킴으로 제조될 수 있다. 광조사에 의한 경화를 유도하기 위해 상기 고분자 단량체 또는 중합체는 광개시제가 결합된 물질을 사용하거나 추가적으로 별도의 광개시제를 첨가하여 반응시킬 수 있다. 바람직하게 고분자 단량체로는 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판술폰산(2-acrylamido-2-methyl-1-propanesulfonic acid; AMPSA) 또는 염화 디알릴디메틸암모늄(diallyldimethylammonium chloride; DADMAC)를, 광개시제로는 2-히드록시-4'-(2-히드록시에톡시)-2-메틸프로피오페논(2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone)를 사용할 수 있으나, 경화되어 겔을 형성하였을 때 전해질 이온의 자유로운 출입을 허용할 수 있고 빛을 조사하여 경화시킬 수 있는 전도성 고분자를 형성할 수 있는 물질은 제한없이 사용될 수 있다. 또한, 제조된 고분자 전해질 겔 염다리의 구조를 안정화시켜 보다 견고한 구조물을 형성하기 위하여 가교제를 추가로 첨가할 수 있다. 일 제조예로 가교제로는 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드(N,N'-methylenebisacrylamide)를 사용할 수 있으나, 상기 제조된 고분자 염다리 구조를 안정화시킬 수 있는 물질이면 제한없이 사용될 수 있다.

상기 고분자 전해질 겔 염다리를 기판에 접착시키기 위하여 추가적으로 3-(트리메톡시실릴)프로필메타아크릴리에트(3-(trimethoxysilyl)propylmethacrylate; TMSMA)를 제조된 분석칩의 채널 내에 일정시간 채웠다가 알코올로 세척해 내는 방법으로 유체채널 내벽에 코팅할 수 있다.

상기한 방법으로 제조된 전기화학적 검출을 위한 전기영동용 마이크로칩의 개략도를 도 3에 나타내었다.

본 발명의 전기영동칩은 바람직하게, 유리, 석영 또는 실리콘 재질의 기판 상에 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 폴리디메틸실록산(poly(dimethylsiloxane); PDMS), 폴리메틸메타아크릴레이트(poly(methyl methacrylate); PMMA), 폴리카보네이트(polycarbonate; PC), 폴리스티렌(polystyrene), 셀룰로스아세테이트(cellulose acetate) 및 폴리에틸렌테레프탈레이트(poly(ethylene terephthalate; PETP) 등의 고분자가 사용될 수 있으며, 나노 리소그라피 등의 공지의 방법으로 미세유체채널을 형성할 수 있는 것이면 제한없이 사용될 수 있다. 또한 상판과 하판을 각기 다른 재질을 선택하여 둘 또는 세가지 다른 재질의 접합체 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에서 바람직하게 작업전극으로는 금, 백금, 탄소, ITO(indium tin oxide) 등의 금속성 물질 또는 반도체성 물질로 이루어진 미세띠 전극을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 미세띠 전극은 공지의 반도체 공정을 통하여 기판 상에 패턴화될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 전기영동칩은 작업전극이 형성된 제1기판과 미세유로가 형성된 제2기판을 별도로 준비하여 접착시켜 제조할 수 있다. 바람직하게 상기 기판을 접착시키는 물질로는 UV 에폭시를 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따라, 도 2에 나타낸 바와 같이 전극 및 미세유체채널 패턴이 고안된 필름 포토-마스크를 이용하여 기존에 보고된 바와 같이 사진평판술 과정을 통해 각각 유리기질 상에 전극과 미세유체채널이 패턴화된 제1기판과 제2기판을 제조한다. 이후 전극이 패턴화된 제1기판 상에 UV 에폭시 즉, UV 경화 수지(UV curing resin)를 스핀코팅하고 전극을 원하는 위치에 놓이도록 제1기판과 제2기판을 각각 패턴화된 면이 접하도록 정렬한 후 UV에 노출시켜 접착시킨다. 추가적으로 채널을 유기용매로 세척하고 산용액을 이용하여 전위를 순환시켜 채널 및 전극 상에 남아있을 오염물질을 제거하는 과정을 포함할 수 있다. 바람직하게 상기 유기용매로는 아세톤, 산용액으로는 황산용액이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이후 염다리를 제조하기 위하여 접착물질로서 TMSMA를 유체채널 내벽에 코팅한 후 광개시제가 결합된 또는 순수한 고분자 단량체 또는 이량체 내지 십량체 및/또는 별도의 광개시제를 포함하는 혼합물을 유체채널에 채우고 미리 고안한 포토마스크를 이용하여 선별적으로 노광시킴으로 원하는 위치에 고분자 전해질 겔 염다리를 형성하고 여분의 할 수 있다. 상기 혼합물은 추가적으로 가교제를 포함할 수 있다. 경화되지 않은 여분의 혼합물을 제거하고 황산용액을 이용한 전기화학적 세척방법으로 채널 및 전극을 세척하였다.

상기 UV 에폭시를 이용하여 기판을 접착시킴으로 마이크로칩을 제작하는 방법은 비교적 간편하게 수행될 수 있다는 장점이 있다. 그러나, 이와 같이 UV 에폭시를 이용하여 칩을 제작하는 경우 여분의 UV 에폭시가 전극 상에 남아 센서로서의 기능을 저해할 수 있다는 단점이 있다. 따라서, 전극으로부터 여분의 UV 에폭시를 제거하기 위하여 특정용매를 사용하여 세척하는 방법이 널리 이용되고 있으나, 상기 용매의 사용으로 전극 자체가 손상될 수 있다. 이에 본 발명에서는 미량의 산성용액을 채널에 주입하고 전위를 순환시킴으로 전기화학적으로 세척하는 방법을 이용할 수 있다.

본 발명은 전기영동법을 이용하여 물질을 분석함에 있어서, 분리 채널 내에 존재하는 전기화학적 검출을 위한 작업전극과 전기적으로 연결된 등전위구조물 예컨대, 고분자 전해질 겔 염다리의 도입에 의해, 등전위공간을 형성하고 상기 등전위공간에 상대전극 및 선택적으로 기준전극을 위치시킴으로 상기 등전위구조물이 유사기준전극으로 작용하여 전기영동을 위한 강한 전기장에 의한 간섭없이 전기화학적 검출이 가능하다.

도 1은 유리 마이크로칩 상에 PGSB를 제조하는 과정을 나타낸 도이다. UV 접착은 빠르고 유리칩에 적용가능하여 전극의 안정성을 보장할 수 있다. PGSB는 접착 후 즉시 UV에 노출시킴으로 형성되었다.
도 2는 전극 및 마이크로 채널의 고안을 나타낸 도이다. (a)는 전극 및 마이크로 채널 패턴을 위한 포토-마스크 디자인을 나타낸 것으로, 규모는 하기와 같다: 주입채널, 시료(및 시료-폐액) 저장소(sample(and sample-waste) reservoir)로부터 이중-T 채널까지 6 mm, 완충액 저장소로부터 이중-T 채널까지 2 mm; 분리채널 길이. 16 mm; 유효 길이, 12 mm; PGSB 채널, 350 μm. (b)는 전극과 마이크로칩 채널의 이미지를 나타낸 도이다. 채널의 너비 80 μm, 깊이 15 μm 이다. 이중-T 채널의 규모는 너비 80 μm, 깊이 15 μm 이며 100 μm의 주입교차점(injection intersection)을 포함한다. PGSB 채널은 120 μm 너비, 15 μml 깊이를 갖는다. Au 전극은 10 또는 20 μm의 폭을 갖는다. (c)는 채널-내 전기화학적 검출을 위한 마이크로칩 사진이다.
도 3은 고분자 전해질 겔 염다리(polyelectrolytic gel salt bridge; PGSB)-집적 마이크로칩 전기영동법(microchip eletrophoresis; MCE)을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 4는 다양한 전기장 하에서 개방회로 전위차를 Au 작업전극과 PGSB의 상대적인 위치의 함수로 나타낸 도이다. Au 작업전극(10 μm 너비)을 삽입도에 나타낸 바와 같이 PGSB로부터 (a) 0 μm, (b) 100 μm, (c) 200 μm, 및 (d) 400 μm 거리에 위치시켰다. 마이크로 채널은 100 mM KNO₃ 용액으로 채웠다.
도 5는 PGSB 영역 근처에서 예측되는 전위 프로필을 나타낸 도이다. PGSB 채널의 Δφ_PGSB는 마이크로채널 내의 어느 곳에서의 전위차보다 훨씬 더 작다.
도 6은 모세관 전기영동장(capillary electrophoresis field; CE field) 하에서 PGSB 전방에 위치한 Au 전극으로부터의 순환 전압전류도이다. 실선은 0 V/cm, 점선은 200 V/cm 그리고 쇄선(dashed line)은 400 V/cm에 대한 그래프이다. 순환 전압전류법은 보조 전해질로 100 mM KNO₃를 포함하는 1 mM K₃Fe(CN)₆ 용액에서 수행되었다. 10 μm 너비의 Au 작업전극을 사용하였고, 기준전극으로는 Ag/AgCl/KCl (3M)을, 상대전극으로는 Pt 선을 사용하였으며 주사 속도는 100 mV/s 이었다.
도 7은 다양한 전기영동장 하에서 PGSB로부터 Au 작업전극까지의 거리의 영향을 나타낸 도이다. (a)는 Au 작업전극이 PGSB로부터 50 μm 거리에 위치할 때, (b)는 150 μm 거리에 위치할 때의 전기영동도이다. Au 작업전극의 너비는 60 μm이며, 100 mM KNO₃를 포함하는 5 mM K₃Fe(CN)₆ 용액에서 50 mV/s의 주사속도로 Ag/AgCl에 대해 0과 +0.5 V 사이의 전위를 순환시킴으로 순환 전압전류법을 수행하였다.
도 8은 PGSB로부터 (a) 0 μm 및 (b) 50 μm에서 검출된 200 μM K₃Fe(CN)₆의 전기영동도이다. 수행 조건은 다음과 같다: 모세관 전기영동장 세기, -150 V/cm; Au 작업전극 너비, 20 μm; 총 길이, 1.6 cm; 유효 길이, 1.2 cm; 작동 완충액(running buffer), 25 mM 붕산나트륨; 검출 전위, +0.15 V 대 Ag/AgCl/KCl (3 M) 기준전극.
도 9는 PGSB 가까이에 위치한 Au 전극을 사용하여 검출한 1.5 μM K₃Fe(CN)₆의 전기영동도이다. 수행 조건은 다음과 같다: 모세관 전기영동장 세기, -150 V/cm; Au 작업전극 너비, 20 μm; 총 길이, 1.6 cm; 유효 길이, 1.2 cm; 작동 완충액(running buffer), 25 mM 붕산나트륨; 검출 전위, +0.15 V 대 Ag/AgCl/KCl (3 M) 기준전극.
도 10은 PGSB-집적 마이크로칩을 이용하여 얻은 높은 전기장 하에서 카테콜(150 μM)과 도파민(100 μM)의 전기영동도이다. 수행 조건은 다음과 같다: Au 작업전극 너비, 20 μm; 총 길이, 5.4 cm; 유효 길이, 5 cm; 작동 완충액(running buffer), 25 mM MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid); 검출 전위, +0.05 V 대 Ag/AgCl/KCl (3 M) 기준전극.
도 11은 본 발명에 따른 등전위구조물 및 이에 의해 형성되는 등전위공간을 개략적으로 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 화합물 및 시약

2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판술폰산(2-acrylamido-2-methyl-1-propanesulfonic acid; AMPSA)의 2.5 M 수용액을 광개시제로 1% 2-히드록시-4'-(2-히드록시에톡시)-2-메틸프로피오페논(2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone)과 고분자 전해질성 겔을 제조하기 위한 가교제로 0.5% N,N'-메틸렌비스아크릴아미드(N,N'-methylenebisacrylamide)와 조합하여 사용하였다. 3-(트리메톡시실릴)프로필메타아크릴리에트(3-(trimethoxysilyl)propylmethacrylate; TMSMA) 무수 메탄올 용액을 채널 표면 상에 고분자 전해질 겔을 부착시키기 위한 코팅 물질로 사용하였다. 전위차 측정을 위한 지지 전해질로서는 100 mM 질산칼륨으로 다양한 농도의 페리시안화 칼륨(potassium ferricyanide) 원액을 제조하였다. 25 mM 붕산 나트륨(sodium borate)을 페리시안화 칼륨의 전기영동 완충용액으로 사용하였다. pH 6.5의 25 mM 2-(N-몰포리노)에탄술폰산(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid; MES) 완충용액으로 도파민(dopamine) 및 카테콜(catechol)과 같은 신경전달물질을 포함하는 용액을 제조하였다. 모든 시약은 Sigma-Aldrich(USA)로부터 구입하였다.

실시예 2: PGSB ( polyelectrolytic gel salt bridge )가 집적된 마이크로칩의 제조

전통적인 사진평판술, UV 에폭시 접착 및 UV 노출에 의한 고분자 전해질성 겔 플러그의 신규한 광중합을 이용하여 마이크로칩 전기영동(microchip electrophoresis; MCE) 장치를 제조하는 방법을 도 1에 도시하였다. 채널 및 금 전극의 패턴화는 본 발명자들이 이전에 이전 연구와 유사하게 제조하였다. 간략히, 미세채널 패턴을 형성하기 위하여, 먼저 피라냐 용액(piranha solution; H₂SO₄:H₂O₂=3:1)을 이용하여 유리 커버 슬라이드(glass cover slide; Cat. No. 1000412, Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Germany)를 세척하였다(주의: 피라냐 용액은 유기 화합물과 격렬히 반응하는 강한 산화제이므로 특별히 주의하여 취급하여야만 한다.). 포토레지스트(photoresist; AZ4620, Clariant, Switzerland)를 7000 rpm으로 30초간 유리 슬라이드에 스핀코팅하였다. 이어서, 소프트 베이킹(soft baking), UV 노출(UV exposure), 현상(development), 하드 베이킹(hard baking) 및 습식 식각법(wet etching)을 포함하는 사진평판술 과정으로 순차적으로 처리하였다.

상기 미세채널의 디자인과 전극 이미지는 오토캐드를 사용하여 제작하였다(도 2(a)). 채널 및 전극 패턴의 오토캐드 도면으로부터 작성된 필름 포토-마스크를 이용하여 기존에 보고된 바와 같이 사진평판술 과정을 통해 마이크로칩을 제작하였다(Joo, S.; Kim, K. H.; Chung, T. D., Biosens. Bioelectron., 2010, 25: 1509-1515). 도 2(b) 및 2(c)는 제작된 마이크로칩 구조물의 사진을 도시한 것이다. 마이크로칩은 채널이 패턴화된 유리기질 및 Au-침착된 유리기질로 구성된다. 마이크로칩 도안과 제작결과물을 도 2에 나타내었다. Au 전극은 도 2에 나타난 전극 규모와 더불어 다양한 전기영동장 조건 하에서 전기화학적 연구를 위해 다양한 크기로 제작되어 사용될 수 있다.

바닥 유리 슬라이드도 유사한 사진평판술 프로토콜을 적용하여 제작하였다. 피라냐 용액으로 유리 슬라이드를 세척하고 헥사메틸디실라잔(hexamethyldisilazane; HMDS, Clariant, Switzerland)로 코팅한 후, AZ5214(Clariant, Switzerland)로 4000 rpm에서 30초간 스핀코팅하였다. 100℃에 1분간 프리 베이킹한 후 17 mJ/cm²에 5초간 일차 노출시키고, 100℃에 5분간 전환 베이킹(reversal baking)한 후 17 mJ/cm²에 5초간 전면노광(flood exposure)시켜 AZ300MIF(Clariant, Switzerland)를 이용하여 현상하였다. DC/RF 전자관 스퍼터(magnetron sputter; Atek, Korea)를 이용하여 패턴화된 유리에 금속필름을 스퍼터시켰다. 약 350 Å 두께로 티타늄(titanium; Ti) 접착층을 스퍼터시키고 그 위에 5000 Å 두께 및 10 내지 20 μm 너비의 금(gold; Au) 박막을 5 Å/s로 침착시켰다. 금-패턴화된 유리는 아세톤(J.T. Baker, USA)에 담구어 패턴화된 Au/Ti 층의 잔여물을 제거하였다. 이어서 접착 과정과 PGSB 집적을 위해 UV 노출을 이용하였다. 피라냐 용액으로의 세척 및 공기 분사(air blowing) 후 금 전극 패턴을 UV 경화 수지(UV curing resin; LOT No. A10K01, ThreeBond Co., Ltd., Japan)로 1500 rpm에서 30초간 스핀코팅하였다. 기질을 17 mJ/cm²에서 12초간 365 nm 파장의 자외선에 노출시켰다. 이후 채널은 아세톤으로 30초간 씻어내었다. 바닥 유리 슬라이드는 +1.0과 +0.2 V 사이의 순환전위로 0.5 M 황산용액에서 Ag/AgCl와 백금선을 각각 기준전극 및 상대전극으로 사용하여 전기화학적으로 세척하였다. 마이크로칩의 패턴 고안 및 제조된 칩의 광학적 이미지는 도 2에 나타내었다.

최종 칩은 커버와 바닥 유리 슬라이드를 접착시켜 제조하였다. 황산으로 세척 후, 미세채널에 노출된 금 전극의 표면적을 금 박막이 전극으로서 작용하며 안정한지 실험적으로 확인하였다. 금 표면적은 5 mM K₃Fe(CN)₆ 용액에서 순환 전압전류법으로 측정하였고 이는 비디오 현미경 시스템(ICS-305B, Sometech, Korea)를 이용하여 측정한 면적과 일치하였다. 채널 내에 PGSB는 UV 노출을 이용하여 제작하였다. 간략히, 미세유체칩 내부 채널을 0.1 M TMSMA 용액으로 채우고 실온에 20분간 방치하였다. 이후, 진공으로 용액을 제거하고 무수 메탄올로 세척한 후, 2.5 M AMPSA 단량체 용액을 채우고 포토마스크를 통해 17 mJ/cm²로 35초간 미세유체칩을 자외선에 노출시켜 경화시켰다. 마지막으로, 금 표면을 재현성 있는 순환 전압전류도가 얻어질 때까지 0.5 M 황산용액에서 Ag/AgCl 전극에 대하여 +1.0과 +0.2 V 사이에서 전위를 순환시킴으로 전기화학적으로 세척하였다. 황산으로 금 전극 표면을 세척한 효과를 확인하기 위하여, TMSMA-변형 금 기질을 대조군으로 사용하여 전기화학적 거동을 관찰하였다. 순환 전압전류도를 확인하여 금 표면이 황산 세척에 의해 정화되었음을 나타내었다.

실시예 3: 기기

Ag/AgCl 및 백금선을 각각 기준전극 및 상대전극으로 사용하는 종래의 일정전위기(potnetiostat; Model CHI660A, CH Instruments Inc.)를 사용하여 침 상의 금 전극의 전기화학적 실험을 수행하였다. LabVIEW 소프트웨어 버전 8.2(National Instruments, Austin, TX)으로 쓰여진 6-채널 전압 조절 프로그램에 의해 작동되는 DBHV-100 고전압 공급기(high voltage supplier; Digital Bio Technology, Korea)를 이용하여 전기영동을 수행하였다. 일정전위기는 일정전위기의 내부 전력 모듈의 출력 전압을 일치시키기 위하여 DC 9V 배터리로부터 DC +5, +15 및 -15V로 전환시키는 직접 제작한 DC 전력 공급기에 의해 외부 전기 전원(outlet)으로부터 격리되었다. 피코앰프 부스터(picoamp booster; Model CHI200, CH Instruments Inc.)를 장착한 패러데이 케이지에서 전류측정에 의한 검출을 수행하였다.

실시예 4: 전기영동

미세채널의 표면조건을 최적화하기 위하여, 유리 칩 채널을 하기의 과정으로 처리하였다. 먼저, 채널을 탈이온수, 0.1 M HCl, 0.1 M NaOH 및 25 mM Na₂B₄O₇(또는 25 mM MES)로 각 10분간 세척하였다. PGSB에 상대적인 금 작업전극의 위치의 효과를 페리시안화 종(ferricyanide species)의 전기영동 분리를 통하여 평가하였다. 200 μM 페리시안화 칼륨(potassium ferricyanide) 용액을 시료 저장소(sample reservior)에 위치시키고 시료 폐액 저장소(sample waste reservoir)에 20초간 +150 V를 적용하여 pinched injection 모드로 부하하였다; 완충액과 폐액 저장소는 모두 유동적(floating)인 반면 시료 저장소는 접지되었다(grounded). 시료 주입 및 분리를 위하여, +250 및 +100 V의 전압을 각각 완충액-폐액 저장소 및 시료 저장소/시료-폐액 저장소에 적용하였으며, 완충액 저장소는 접지되었다. 도 3에 나타난 바와 같이, PGSB 너머 챔버 내에 위치한 Ag/AgCl/KCl (3M) 기준전극에 대하여 +0.15 V의 검출전위를 분리하는 동안 금 작업전극에 적용하였다.

높은 전기장 하에서 성공적인 전기영동 및 전류측정에 의한 검출을 확인하기 위하여, 두 가지 생물학적 화합물 즉, 100 μM 도파민과 150 μM 카테콜을 25 mM MES 완충용액에 혼합하여 사용하였다. 페리시안화물을 부하하고 분리하는데 사용된 방법과 유사하게 pinched injection을 이용하여 시료 및 시료 폐액 저장소 사이에 +150 V를 20초간 적용하여 시료 플러그를 부하하였다. 분리는 다양한 전기장(50 내지 500 V/cm) 하에서 수행되었다.

<실험결과>

외부 전기장 하에서 개방회로전위

다양한 전기장 하에서 금 작업전극과 PGSB 사이의 개방회로전위(open circuit potential; OCP)를 측정하였다. 도 4는 금 작업전극과 PGSB 사이에 -0, 100, 200 및 400 μm의 공간을 두고 얻어진 OCP 데이터를 나타낸다. 전기영동 분리를 위해 미세채널을 따라 적용되는 전기장 구배(ΔV _s)를 30으로부터 400 V/cm까지 변화시켰다. OCP 데이터는 금 작업전극과 PGSB 간의 거리뿐 아니라 명백히 ΔV _s에 의존적이었다. OCP는 ΔV _s와 거리가 증가함에 따라 증가되었다. 상기 결과는 전기영동을 위해 높은 전기장이 가해지는 미세채널의 중간에 위치하는 전극을 사용하는 전기화학적 검출을 수행하기 위하여 해결되어야 할 중요한 문제점이 존재함을 나타낸다.

두 가지 주된 문제점은 하기와 같다: 전극 상에서 전기화학적 전위의 양극성 차이 및 부정확한 전류측정에 의한 검출. 첫 번째 이슈는 전극이 가파른 전기장 구배에 노출되었을 때 관찰되는 양극성 효과와 밀접하게 관련된다. 이러한 양극성 전극 거동은 전극으로부터의 전기화학적 신호를 왜곡하고 작업전극 표면에 해를 끼칠 수 있다. 용액상(solution phase)에서 외부 전기장의 가파른 구배는 전극 말단 사이의 전기화학적 전위(ΔV _edge)에 상당한 차이를 유발할 수 있다. 그러나, 전극을 통한 페르미 레벨은 장 구배에 크게 영향받지 않을 것이다. 이러한 전극 표면 상의 이질적인 전기화학적 전위는 미세유체칩 상에서 전극의 너비 및 위치의 함수로 나타난다. 좁은 미세채널 내에서 PGSB로부터 보다 멀리 위치한 보다 넓은 전극에 대해 더 큰 ΔV _edge 값이 관찰되었다. 전기영동 분리를 위해 미세채널에 적용될 수 있는 최대 전압은 외부 전기장 구배로 인한 양극성 전기화학적 반응이 일어나지 않는 조건으로 제한된다. 상기 조건을 만족시키기 위하여, ΔV _edge 값은 주어진 용액과 전극 물질에 대한 전기화학적 전위창(electrochemical potential window)보다 낮아야만 한다.

전위창은 용액 내에 전기장 구배 부재시 얻어지는 순환 전압전류도를 통해 결정된다. 예를 들어, 400 V/cm의 세기를 갖는 전기장은 10 μm 및 20 μm 너비의 금 전극 말단 사이에서 각각 0.4 V 및 0.8 V의 최대값 차이를 야기한다. 본 발명에 사용된 0.1 M KNO₃ 및 MES 완충액에서 금 전극의 전위창은 1 V 보다 넓으므로, 전기영동 분리를 위해 요구되는 외부 전기장으로 인한 금 전극 상에서의 전기화학적 반응은 무시할 만하다. 나아가, 도 5에 나타난 바와 같이, 전기적 전위 구배는 매우 낮은 저항을 갖는 기준전극 시스템에 연결된 PGSB 앞에서 최소일 것으로 예상된다. 전극이 PGSB 바로 직전에 위치시킨다면, PGSB 근처에서 전기적 전위 구배의 감소는 최소한의 양극성 효과 즉, ΔV _edge의 억제를 유발할 것이다. 이는 도 4(a)에 나타난 바와 같이 OCP 변동의 현저한 감소에 의해 확인되었다.

다른 문제점은 전류측정에 의한 검출을 위한 금 전극에 적용되는 전기화학적 전위의 정확성이다. 이는 또한 ΔV _edge와 전극과 PGSB 사이의 전위 강하의 함수이다. 보다 가파른 외부 전기장 하에서 작업 및 기준전극 사이의 보다 높은 저항은 미세채널 내에서 용액에 따른 보다 큰 전위 강하를 야기한다. 따라서, 마이크로칩 상에서 전기영동을 수행하는 동안 성공적인 전류측정에 의한 검출을 위해 PGSB에 대한 작업전극의 위치를 조절할 필요가 있다. 실질적으로, 미세채널 내에서 ΔV _s에 의해 야기되는 작업 및 기준전극 사이의 전위 이동은 유체역학적 전압저류도(hydrodynamic voltammogram)를 이용하여 보정될 수 있다. 그러나, PGSB로부터 현저히 소원하게 존재하는 미세채널 내에서의 위치도 여전히 문제가 있다. 첫째로, 전기영동 전기장에 기인한 전기화학적 전위차 ΔV _s는 전류검출을 위한 작업-기준전극 간에 적용되는 전위 차이보다 훨씬 더 크다. 따라서, ΔV _s의 작은 변동도 전류검출에 필요한 작업-기준 전극 간의 전기화학적 전위에 심각한 이동을 야기할 수 있다. 나아가, 상기 시스템은 양극성 효과 즉, ΔV _edge에 의한 영향을 받는다. PGSB 근처에서 현저히 감소된 전기적 전위 구배로 인해 PGSB와 전기적으로 연결되도록 존재하는 작업전극은 PGSB와 거의 등전위면 상에 존재하는 것으로 예측된다. 따라서, PGSB 근처에 위치하는 작업전극에서 용액 전위는 기준전극의 전위와 크게 다르지 않다(도 5). 이는 OCP(ΔV _F)에서의 전위 변동이 400 V/cm의 높은 외부 전기장(ΔV _s) 하에서 조차도 5 mV 보다 낮다는 사실에 의해 뒷받침 된다(표 1). 상기 결과는 등전위면 상에서 획득한 OCP 데이터에 대해 Klett가 보고한 바와 일치한다. 상기 결과는 전류측정에 의한 검출을 위한 전위 바이어스(electrical potential bias)가 적용되지 않을 때, PGSB 직전에 위치한 작업전극이 기준전극과 동일한 전위를 가짐을 나타낸다. 전위 변동을 최소화하고 노이즈 수준을 효과적으로 억제하였다. 따라서, 전극이 PGSB와 전기적으로 연결되도록 위치한다면, ΔV _s의 효과를 보상하기 위해 검출 전위를 보정할 필요가 없다. 그 결과, PGSB에 근접하게 작업전극을 위치시킴으로 전기영동 채널의 중간에서 전기화학적 전위를 정확히 인가할 수 있고, 전기영동을 수행하는 동안 연속적인 전류측정이 가능하다.

다양한 전기장 하에서 순환 전압전류법

미세채널 중간에서 전기적 전위 구배는 마이크로칩 채널 상에서 관심 영역의 저항에 비례한다. PGSB 영역에서의 국부 저항은 PGSB가 이온의 자유로운 이동을 가능하게 하고 기준전극에 연결되어 있는 전기적 전도체이므로 미세채널의 다른 부분에서 보다 현저히 낮다. PGSB 근처에서 전위 강하는 그 외 미세채널 영역(remainder) 내에서의 급격한 전위 강하에서 벗어나 변형될 것으로 예상된다. 이는 도 4에 나타난 PGSB 앞에 배치된 전극으로부터 얻어진 외부 전위 구배의 영향으로부터 거의 자유로운 OCP 데이터에 의해 확인되었다. 전위차를 측정하는 동안 생성되는 노이즈는 외부 전기장(ΔV _s)에 비례하여 증가하였다. 그럼에도 불구하고, 노이즈 수준은 패러데이 케이지 내에서 5 pA 미만이었다. 도 6에 나타난 순환전압전류도는 전극에서 페리시안화 이온의 전기화학적 산화환원 거동이 400 V/cm에 달하는 전기장 하에서 수십 mV 미만의 전위 이동과 약간의 전류 감소를 제외하고는 변화없이 유지됨을 나타낸다. 이는 주어진 범위의 ΔV _s로부터 야기되는 전위 이동과 노이즈가 마이크로칩 상에서 전기영동 분리를 수행하는 동안 채널-내 전기화학적 검출에 대해 허용될 수 있는 수준임을 뒷받침한다.

작업전극과 PGSB 사이의 거리가 증가함에 따라, EC 측정은 심한 노이즈 및 전극의 부정확한 전기화학적 전위가 심화되고, 궁극적으로 작업전극에 손상을 입힐 수 있다(도 7). 따라서, PGSB 가까이에 작업전극을 배치하는 것은 전류측정에 의한 전기영동을 수행함에 있어 검출기 위치에 대한 제약을 극복하여 다양한 디자인의 미세유체칩을 고안할 수 있도록 한다.

PGSB 가 집적된 마이크로칩 상에서의 분리

분리 효율과 전류측정 반응을 통한 분리와 검출 수행능을 확인하기 위하여 PGSB가 집적된 마이크로칩 상에서 전기영동을 수행하였다. 도 8은 PGSB로부터 (a) 0 및 (b) 50 μm에 위치한 금 미세띠 전극으로부터의 전기영동도를 나타낸다. 상기 전기영동도는 150 V/cm에서 PGSB-집적 마이크로칩 상에서 200 μM 페리시안화 칼륨 용액의 분리로부터 얻어졌다. 이론단수 즉, 분리효율은 10700 /m (a) 및 11500 /m (b)이고, 피크 전류는 17 nA (a) 및 8.0 nA (b)이다. 고분자 전해질성 겔의 또 다른 역할은 분리채널의 완충용액이 기준전극이 존재하는 저장소로 누출되는 것을 방지하는 것이다.

고분자 전해질성 겔은 유리와는 명백히 다른 물질임에도 불구하고, 분리효율이라는 측면에서 두 영역 간의 차이는 눈에 띄지 않는다. 예를 들어, PGSB 앞에 위치한 전극을 사용하여 측정되는 이론단수는 PGSB로부터 50 μm 거리에 위치한 다른 전극으로부터의 것과 유사하다. 한편, PGSB 앞에 위치한 전극에 대한 피크 전류는 PGSB로부터 50 μm 거리에 위치한 전극의 것보다 2배 더 높다. 도 8은 PGSB에 위치한 전극으로부터의 전기영동도의 피크 모양이 유리 미세채널 중간에 위치한 전극으로부터의 것과 매우 유사함을 보여준다. 검출한계(S/N=2)는 -150 V/cm 하에서 페리시안화물에 대해 1.5 μM로 결정되었다(도 9).

본 발명에서 제안된 전기영동에 의한 신경전달물질의 분리를 위한 PGSB를 장착된 마이크로칩 시스템의 기능성을 도 10에 나타내었다. 도파민(100 μM)과 카테콜(150 μM)로 구성되는 신경전달물질 혼합물의 전기영동도는 50 내지 500 V/cm 범위의 전기장 하에서 분리될 수 있음을 나타내었다. 상기 도 10에 나타난 결과는 전기장 세기가 분리 효율 결정에 주요한 변수임을 보여준다. 가장 높은 분리 효율은 200 V/cmc의 전기장 하에서 관찰되었다(카테콜, 10500 /m 및 도파민, 8500 /m). 50 V/cm으로부터 500 V/cm으로 전기장이 증가함에 따라, 모든 화합물에 대한 이동 시간(migration time)은 감소하였다. PGSB가 집적된 마이크로칩 상에서 전기영동의 재현성을 확인하기 위하여 7회 반복하여 분리를 수행하였다. 도파민과 카테콜에 대한 평균 이동 시간은 각각 32±0.8초 및 36±1.2초이고 피크 전류는 750±40 pA 및 920±35 pA로 관찰되었다. 상기 전기영동 결과는 PGSB-기반 검출 시스템을 이용하여 높은 전기장 하에서 재현가능한 분리를 확인하였다.

Claims

양단부 사이에 전압이 걸려있고 상기 전압에 의해 시료 중 분석물질들이 이동하면서 이동속도 차이에 의해 분석물질을 분리하는 유체채널을 구비하는 전기영동칩에 있어서,
유체채널 내의 일 지점에 분석물질의 전기화학적 특성을 검출하기 위한 작업전극이 구비되어 있고, 채널의 적어도 일 벽면에 상기 작업전극과 전기적으로 연결된 등전위구조물이 구비되고, 상기 등전위구조물을 통로로 하여 유체채널과 인접해 있는 채널 외부에 지지전해질 용액으로 채위지고 상기 등전위구조물에 의해 형성된 등전위공간에 상대전극이 구비되어 작업전극과 상대전극 사이의 전기화학적 신호를 측정하는 것이 특징인 전기영동칩.
제1항에 있어서,
상기 전기화학적 신호는 전류, 전도도 또는 전위차인 것인 전기영동칩.
제1항에 있어서,
상기 등전위구조물은 이온의 이동을 허용하는 것이 특징인 전기영동칩.
제1항에 있어서,
상기 등전위구조물은 고분자 전해질 겔 염다리인 것인 전기영동칩.
제4항에 있어서,
상기 고분자 전해질 겔 염다리는 이온전도성 고분자인 것인 전기영동칩.
제4항에 있어서,
상기 고분자 전해질 겔 염다리는 고분자 단량체(monomer) 또는 이량체 내지 십량체에 빛을 조사하여 경화시킴으로 형성되는 겔 형태로 제조되는 것인 전기영동칩.
제6항에 있어서,
상기 고분자 단량체는 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판술폰산(2-acrylamido-2-methyl-1-propanesulfonic acid; AMPSA) 또는 염화 디알릴디메틸암모늄(diallyldimethylammonium chloride; DADMAC)를 단위체로 하는 것인 전기영동칩.
제7항에 있어서,
상기 고분자 단량체는 광개시제가 결합된 것이거나 추가적으로 별도의 광개시제를 포함하는 것인 전기영동칩.
제8항에 있어서,
상기 광개시제는 2-히드록시-4'-(2-히드록시에톡시)-2-메틸프로피오페논(2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone)인 것인 전기영동칩.
제6항에 있어서,
가교제를 추가로 포함하는 것인 전기영동칩.
제10항에 있어서,
상기 가교제는 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드(N,N'-methylenebisacrylamide)인 것인 전기영동칩.
제1항에 있어서,
상기 전기영동칩의 재질은 유리, 석영, 실리콘, 폴리디메틸실록산(poly(dimethylsiloxane); PDMS), 폴리메틸메타아크릴레이트(poly(methyl methacrylate); PMMA), 폴리카보네이트(polycarbonate; PC), 폴리스티렌(polystyrene), 셀룰로스아세테이트(cellulose acetate) 및 폴리에틸렌테레프탈레이트(poly(ethylene terephthalate; PETP)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 전기영동칩.
제1항에 있어서,
상기 작업전극은 금, 백금, 탄소, ITO(indium tin oxide) 및 반도체성 물질로 구성된 군으로부터 선택되는 전극인 것인 전기영동칩.
제1항에 있어서,
상기 전기영동칩은 추가적으로 기준전극을 구비한 것이 특징인 전기영동칩.
제1항에 있어서,
유체채널 중 대향하는 채널 내벽 간의 거리를 A, 등전위구조물과 대향하는 유체채널 내벽으로부터 상대전극까지의 거리를 B라고 할 때,
B는 A의 1.5배 이상인 것이 특징인 전기영동칩.
제1항에 있어서,
유체채널 일 벽면에 위치한 등전위구조물의 길이를 C라고 할 때,
상기 등전위구조물은 1 μm 내지 10 μm의 길이(C)를 갖고, 이에 의해 채널로부터 분리된 등전위공간의, C에 평행인 너비(D)는 C의 1 내지 10배인 것이 특징인 전기영동칩.
제1항에 있어서,
상기 전기영동칩은 작업전극이 형성된 제1기판과 미세유로가 형성된 제2기판을 접착시켜 제조되는 것인 전기영동칩.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 전기영동칩은 전기영동용 마이크로칩인 것이 특징인 전기영동칩.
전기장이 인가된 유체채널 내의 일 지점에 구비된 작업전극을 통해 상기 전기장의 간섭없이 전기화학적 신호를 모니터링하는 방법으로서,
상기 작업전극과 상대전극 사이의 전기화학적 신호를 측정하는 단계를 포함하며,
이때, 상기 유체채널의 적어도 일 벽면에 형성되고 상기 작업전극과 전기적으로 연결되어 있는 등전위구조물에 의해 등전위공간이 형성되고,
상기 상대전극은 상기 등전위구조물에 의해 채널과 분리된 등전위공간에 배치되어 있는 것이 특징인 방법.
제19항에 있어서,
상기 전기장은 시료의 주입, 이동, 혼합, 반응, 검출 및 사후분석으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 과정을 위해 외부에서 인가되는 것인 방법.
제19항에 있어서,
상기 전기장은 0 V/cm 이상 10000 V/cm 이하인 것인 방법.