KR20130122381A - New lactobacillus plantarum strain, the method of isolating the strain and composition for prevention and treation of colibacillosis using it - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 신규한 락토바실러스 플란타룸, 이의 제조방법 및 이를 이용한 대장균성설사병 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a novel Lactobacillus plantarum, a preparation method thereof, and a pharmaceutical composition for preventing or treating E. coli diarrhea.
2008에 국립축산과학원에서 발행한 자료인 '소의 최근 5년간 사육두수 추이 및 질병발생현황(2001~2008년간 질병 발생 소 11,533두 분석자료)'에 의하면, 조사기간 동안 유방염(Mastitis)이 7,440마리로 가장 빈번하게 발생하였고, 그리고 대장균성설사병(colibacillosis)이 1,320마리, 살모넬라증(salmonellosis)이 110마리로서 두 소화기성 질병 또한 많은 비중을 차지하였다. 신생 한우의 폐사율은 5~6%정도이며, 신생우의 설사가 다발적으로 발생하는 경우에는 폐사율이 50%를 넘기도 한다. 성장 시기별 발병 비율을 보면 포유기(1~60일령) 중 질병발병률은 70.9%이고 그중 폐사율은 16.1%, 육성기(61~180일령) 중 질병발병률은 27.9%이고 그 중 폐사율은 2.3%이다(고영두, 2006).According to the data published by the National Institute of Animal Science in 2008, the number of heads of cattle breeding and disease outbreaks in the last five years (analytical data from 11,533 cows in 2001-2008) was 7,440 mastitis during the survey period. The most frequent occurrence was 1,320 colibacillosis and 110 Salmonellosis. The mortality rate of newly born Korean cattle is about 5-6%, and in the case of multiple occurrences of new diarrhea, mortality may exceed 50%. According to the growth rate, the disease incidence is 70.9% among mammals (1 ~ 60 days old), mortality is 16.1%, disease incidence is 27.9% during the growing season (61 ~ 180 days old), and mortality is 2.3% (high youngdu) , 2006).
이렇게 축우산업에 큰 피해를 주는 이러한 질병들을 예방 또는 치료 그리고 성장을 촉진하려는 목적으로 많은 양의 항생제가 쓰이고 있다. 특히 사료에 항생제가 많이 들어가는데 그 이유는 성장을 촉진하기 위해서 그리고 질병을 예방 또는 치료하기 위함이다. 여러 분야에서 항생제가 유용하게 사용되고 있지만, 한편으로 항생제의 남용으로 인한 심각한 부작용이 문제가 되고 있다. 내성균주가 생성되어 질병 발생시 치료가 어려워지고 항생제 과다사용으로 인한 설사와, 축산물에 항생제 잔류되는 문제점과, 그리고 가축에서 생성된 내성균주가 사람으로 전파되는 문제점이 있다. 그래서 전 세계적으로 항생제 사용이 점점 규제되고 있다. 스웨덴(1986년)을 필두로 유럽 4개 국가가 1996년 이후 사료 내 성장촉진용 항생제 (AGP, antimicrobial growth promotors) 첨가를 전면금지 하였고, 2006년 유럽에서의 가축에 대한 사료 첨가용 항생제 사용이 전면 금지되었다. 국내의 경우 배합사료제조용 동물용의약품 허가품목이 53종 (2004) 18종 (2009) 으로 점점 감축되었고, 2011년 7월에는 항생제의 사료혼합이 전면금지 되었다. 기업 또한 항생제 사용 자제 흐름에 적극 참여하고 있다. 맥도날드는 2003년 고기를 공급하는 축산업자에게 가축사료에 포함되는 항생제 투여를 줄이도록 요구한 바 있다. 이러한 예에서 보았듯이, 항생제 사용의 문제점에 대처하기 위해서, 국내외적으로 항생제 사용 규제가 강화되고 있는 실정이다. A large amount of antibiotics is used to prevent or treat these diseases that are causing serious damage to the cattle industry and to promote growth. In particular, the diet contains a lot of antibiotics to promote growth and to prevent or treat disease. Antibiotics are useful in many fields, but serious side effects from abuse of antibiotics are a problem. Resistant strains are generated, making it difficult to treat when disease occurs, diarrhea due to overuse of antibiotics, antibiotic residues in livestock products, and resistant strains generated in livestock are spread to humans. So antibiotic use is increasingly regulated around the world. Beginning in Sweden (1986), four European countries have banned the addition of antimicrobial growth promotors (AGP) in feeds since 1996. Prohibited. In Korea, the number of licensed veterinary drug products for formulated feed was gradually reduced to 53 (2004) and 18 (2009). In July 2011, the mixing of antibiotics was prohibited. Companies are also actively involved in the flow of antibiotics. McDonald's required meat producers in 2003 to reduce the use of antibiotics in livestock feed. As seen in these examples, in order to cope with the problem of using antibiotics, the use of antibiotics is being tightened at home and abroad.
오랫동안 항생제는 축우산업에서 유용하게 사용되었는데, 항생제 사용 규제가 강화됨으로써 항생제 대체제 개발이 시급해졌다. 그리고 항생제 대체제 개발의 기타 필요성에는 다음과 같다. 새로운 항생제를 개발하는데 드는 막대한 비용을 절감하고, FTA 및 국제 곡물 가격 상승과 같은 축산 경영 환경의 악화로 인하여 가격 및 품질 경쟁력 확보가 절실하게 요구되고, 그리고 항생제가 사용된 축산물은 국제 교역상의 어려움이 있기 때문이다. 항생제 대체제 후보에는 면역 조절제, 효소제, 광물질 제제, 허브 또는 식물 추출물, 유기산, 유산균 생균제가 있는데, 유산균 생균제 (probiotic)가 가장 각광을 받고 있다.For a long time, antibiotics have been useful in the cattle industry, and the tightening of antibiotic use regulations has led to the development of antibiotic substitutes. Other needs for the development of antibiotic substitutes include: Reducing the enormous costs of developing new antibiotics, deteriorating the livestock management environment such as FTAs and rising international grain prices are urgently needed to secure price and quality competitiveness, and livestock products that use antibiotics are difficult to trade internationally. Because there is. Candidates for antibiotic replacement include immunomodulators, enzymes, mineral preparations, herbal or plant extracts, organic acids, and lactic acid bacteria probiotics, the most prolific of which are probiotic.
본 발명은 대장균성설사병에 대해 저해활성을 나타내는 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주를 제공하고자 하며, 이를 포함하는 대장균성설사병 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 사료용 조성물을 제공하고자 한다. The present invention is to provide a novel Lactobacillus plantarum strain exhibiting inhibitory activity against E. coli diarrhea, and to provide a pharmaceutical composition and feed composition for preventing or treating E. coli diarrhea.
또한, 본 발명은 대장균성설사병에 대해 저해활성을 나타내는 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주의 제조방법을 제공하고자 한다. In addition, the present invention is to provide a method for producing a novel Lactobacillus plantarum strain exhibiting inhibitory activity against E. coli diarrhea.
본 발명은 대장균성설사병에 대해 저해활성을 나타내는 락토바실러스 플란타룸 GS1 (Lactobacillus plantarum GS1, 수탁번호 KCTC18230P)을 제공한다.The present invention provides Lactobacillus plantarum GS1 (Accession No. KCTC18230P) showing inhibitory activity against E. coli diarrhea.
상기 대장균성설사병은 E. coli K99에 의해 야기될 수 있다.The E. coli diarrhea may be caused by E. coli K99.
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 GS1 (Lactobacillus plantarum GS1, 수탁번호 KCTC18230P)을 유효성분으로 함유하는 대장균성설사병 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.The present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating E. coli diarrhea disease containing Lactobacillus plantarum GS1 (Accession No. KCTC18230P) as an active ingredient.
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 GS1 (Lactobacillus plantarum GS1, 수탁번호 KCTC18230P)을 유효성분으로 함유하는 대장균성설사병 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.The present invention provides a feed composition for preventing or improving E. coli diarrhea disease containing Lactobacillus plantarum GS1 (Accession No. KCTC18230P) as an active ingredient.
본 발명은 뉴클레오티드 단위로 야생형 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) 177을 돌연변이 시키는 제 1단계; 상기 돌연변이된 락토바실러스 플란타룸을 병원균인 E. coli K99와 공배양시키는 제 2단계; 상기 공배양을 통해 선별된 락토바실러스 플란타룸 돌연변이체에 E. coli K99에 대한 항균력 검사를 수행하여 항균력이 우수한 균주를 선별하는 제 3단계; 상기 선별된 균주들 간에 원형질체를 융합하여 유전자들간에 상동재조합을 일으켜 돌연변이를 유발하는 제 4단계; 상기 돌연변이된 락토바실러스 플란타룸을 병원균인 E. coli K99와 공배양시키는 제 5단계; 및 상기 공배양을 통해 선별된 락토바실러스 플란타룸 돌연변이체에 E. coli K99에 대한 항균력 검사를 수행하여 항균력이 우수한 균주를 선별하는 제 6단계;를 포함하는 대장균성설사병에 대해 저해활성을 나타내는 락토바실러스 플란타룸 GS1 (Lactobacillus plantarum GS1, 수탁번호 KCTC18230P)의 제조방법을 제공한다.The present invention comprises a first step of mutating wild-type Lactobacillus plantarum 177 in nucleotide units; Co-culturing the mutated Lactobacillus plantarum with a pathogen E. coli K99; Performing a antimicrobial test against E. coli K99 on the Lactobacillus plantarum mutant selected through the co-culture, and selecting a strain having excellent antimicrobial activity; A fourth step of fusing protoplasts between the selected strains to cause homologous recombination between genes to cause mutations; Co-culturing the mutated Lactobacillus plantarum with a pathogen E. coli K99; And a sixth step of selecting the strain having excellent antimicrobial activity by performing an antimicrobial test against E. coli K99 on the Lactobacillus plantarum mutant selected through the coculture. Provided is a method for preparing Lactobacillus plantarum GS1 (Accession No. KCTC18230P).
상기 대장균성설사병에 대해 저해활성을 나타내는 락토바실러스 플란타룸 GS1 (Lactobacillus plantarum GS1, 수탁번호 KCTC18230P)의 제조방법의 일례로, 자외선을 조사하여 뉴클레오티드 단위로 야생형 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) 177을 돌연변이 시키는 제 가단계; 상기 돌연변이된 락토바실러스 플란타룸을 병원균인 E. coli K99와 공배양시키는 제 나단계; 상기 가단계 및 나단계를 2 내지 6회 반복하는 제 다단계; 상기 다단계를 통해 선별된 락토바실러스 플란타룸 돌연변이체에 E. coli K99에 대한 병원균-탑아가분석 (pathogen topagar assay)을 수행하여, 락토바실러스 플란타룸 돌연변이체 콜로니 지름에 대한 콜로니 주변의 투명환의 지름으로 항균력이 우수한 균주를 선별하는 제 라단계; 상기 선별된 균주들을 라이소자임 (lysozyme) 및 뮤타노리신 (mutanolysin)을 처리하여 원형질체를 형성하고, PEG (polyethyleneglycol)을 이용하여 원형질체들을 융합하여 유전자들 간의 상동재조합을 통해 돌연변이를 일으키는 제 마단계; 상기 돌연변이된 락토바실러스 플란타룸을 병원균인 E. coli K99와 공배양 시키는 제 바단계; 상기 마단계 및 바단계를 2 내지 6회 반복하는 제 사단계; 및 상기 제 사단계를 통해 선별된 락토바실러스 플란타룸 돌연변이체에 E. coli K99에 대한 병원균-탑아가분석 (pathogen topagar assay)을 수행하여, 락토바실러스 플란타룸 돌연변이체 콜로니 지름에 대한 콜로니 주변의 투명환의 지름으로 항균력이 우수한 균주를 선별하는 제 아단계;를 포함하는 대장균성설사병에 대해 저해활성을 나타내는 락토바실러스 플란타룸 GS1 (Lactobacillus plantarum GS1, 수탁번호 KCTC18230P)의 제조방법이 포함될 수 있다.As an example of the production method of Lactobacillus plantarum GS1 (Accession No. KCTC18230P) exhibiting inhibitory activity against the E. coli diarrhea, wild-type Lactobacillus plantarum in nucleotide units by irradiation with nucleotides 177 An additional step of mutating the compound; Co-culturing the mutated Lactobacillus plantarum with a pathogen E. coli K99; A multi-step of repeating the temporary step and the second step two to six times; A pathogen topagar assay for E. coli K99 was performed on the Lactobacillus plantarum mutant selected through the multi-step, and the transparent ring around the colonies for Lactobacillus plantarum mutant colony diameter. Selecting a strain having excellent antimicrobial activity in diameter; The selected strains are treated with lysozyme and mutanolysin to form protoplasts, and fusion of protoplasts using polyethyleneglycol (PEG) to cause mutations through homologous recombination between genes; Co-culturing the mutated Lactobacillus plantarum with a pathogen E. coli K99; Sacrificial step of repeating the step and the bar step 2 to 6 times; And performing a pathogen topagar assay for E. coli K99 on the Lactobacillus plantarum mutants selected through the fourth step, and surrounding colonies for Lactobacillus plantarum mutant colony diameters. The first step of selecting a strain having excellent antimicrobial activity by the diameter of the transparent ring of; Lactobacillus plantarum GS1 (Lactobacillus plantarum GS1, Accession No. KCTC18230P) showing the inhibitory activity against E. coli diarrhea, including; .
본 발명의 항균력이 증진된 유산균의 육종방법은 종래의 뉴클레오티드 단위의 돌연변이 유발법보다 직접적인 진화를 유도하고 여러 특징에 걸쳐 포괄적으로 다양한 돌연변이를 발생시킴으로 야생형 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum)에 비해 우수한 E. coli K99 저항성을 지닌 락토바실러스 플란타룸 GS1 돌연변이체를 생산할 수 있으며, 이를 포함한 조성물을 대장균설사병 예방 및 치료용 약학 조성물 및 사료용 조성물로 활용할 수 있다.Lactobacillus breeding method of the antimicrobial activity of the present invention is enhanced compared to wild-type Lactobacillus plantarum by inducing direct evolution and generating a variety of mutations over a variety of characteristics than the conventional nucleotide-based mutagenesis method It is possible to produce Lactobacillus plantarum GS1 mutant having E. coli K99 resistance, and the composition including the same can be used as a pharmaceutical composition and feed composition for the prevention and treatment of E. coli diarrhea.
도 1은 본 발명의 자외선 돌연변이 (UV mutagenesis)와 원형질체 융합법을 결부한 방법을 이용하여 항균력이 우수한 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum)을 육종하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 항균력테스트의 개념도와 CC ratio 측정 방법을 나타낸 것이다.
도 3은 락토바실러스 살리바리우스 29 (Lactobacillus salavarius 29), 페디오코커스 아시딜랙티아 175 (Pediococcus acidilactia 175), 락토바실러스 플란타룸 177 (Lactobacillus plantarum 177)의 항균력 테스트 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 항균활성 표준 표 (Antipathogenic ability standard index)를 나타낸 것이다.
도 5는 락토바실러스 플란타룸 UV 돌연변이체들 (Lactobacillus plantarum UV mutants)과 E. coli K99와 16시간 공배양 후 E. coli K99의 생균수를 측정한 것이다.
도 6은 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum)과 E. coli K99와 25시간 공배양 후 E. coli K99의 생균수를 측정한 결과를 나타낸 것이다. Figure 1 is a schematic diagram showing the process of breeding Lactobacillus plantarum excellent antimicrobial activity by using the UV mutagenesis and protoplast fusion method of the present invention.
Figure 2 shows a conceptual diagram of the antimicrobial activity test and CC ratio measurement method.
Figure 3 shows the results of the antimicrobial test of Lactobacillus salavarius 29, Pediococcus acidilactia 175, Lactobacillus plantarum 177 ( Lactobacillus plantarum 177) .
Figure 4 shows the antipathogenic ability standard index (Antipathogenic ability standard index).
FIG. 5 shows the viable cell count of E. coli K99 after 16 hours co-culture with Lactobacillus plantarum UV mutants and E. coli K99.
Figure 6 shows the results of measuring the viable cell count of E. coli K99 after co-culture with Lactobacillus plantarum ( Lactobacillus plantarum) and E. coli K99 for 25 hours.
본 발명은 대장균성설사병에 대해 저해활성을 나타내는 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주 및 이의 제조방법을 제공하며, 이를 포함하는 대장균성설사병 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 사료용 조성물을 제공한다.
The present invention provides a novel Lactobacillus plantarum strain exhibiting inhibitory activity against E. coli diarrhea and a method for preparing the same, and provides a pharmaceutical composition and feed composition for preventing or treating E. coli diarrhea.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail.
종래부터 항생제의 남용으로 인한 심각한 부작용 즉, 내성균주가 생성되어 질병 발생시 치료가 어려워지고 항생제 과다사용으로 인한 설사와, 축산물에 항생제 잔류되는 문제점, 그리고 가축에서 생성된 내성균주가 사람으로 전파되는 문제점이 있어 왔기에, 본 발명에서는 대장균성설사병에 대한 항생제 대체체를 찾고자 노력한 결과, 본 발명의 신규 균주를 이용할 경우 상기 문제점을 해결하며 대장균성설사병에 뛰어난 저해활성을 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하였다. Conventionally, there are serious side effects due to the abuse of antibiotics, that is, resistant strains are generated, making it difficult to treat when diseases occur, diarrhea due to overuse of antibiotics, antibiotic residues in livestock products, and resistant strains produced in livestock to humans. Since, in the present invention, an effort to find an antibiotic substitute for E. coli diarrheal disease, using the novel strain of the present invention solved the above problems and confirmed that it exhibits excellent inhibitory activity against E. coli diarrhea disease and completed the present invention.
본 발명은 대장균성설사병에 대해 저해활성을 나타내는 락토바실러스 플란타룸 GS1 (Lactobacillus plantarum GS1, 수탁번호 KCTC18230P)을 제공한다.The present invention provides Lactobacillus plantarum GS1 (Accession No. KCTC18230P), which exhibits inhibitory activity against E. coli diarrhea.
상기 대장균성설사병은 한우의 주된 폐사 원인인 설사를 일으키는 소화기 질병으로, 이를 일으키는 원인 균주는 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 E. coli K99에 의해 야기될 수 있다.The E. coli diarrhea disease is a digestive disease causing diarrhea, which is the main cause of death of Korean cattle, the strain causing this is not particularly limited, but may be caused by E. coli K99.
상기 락토바실러스 플란타룸 GS1는 야생형 락토바실러스 플란타룸 177에 비해 뛰어난 E. coli K99 저항성을 나타내는 유산균주일 수 있다.The Lactobacillus plantarum GS1 may be a lactic acid strain that exhibits superior E. coli K99 resistance compared to wild-type Lactobacillus plantarum 177.
상기 락토바실러스 플란타룸 GS1은 병원균에 대해 항균물질을 생산할 수 있는데, 일례로 pH를 저하시켜 장속의 병원균 생존을 억제할 수 있는 유산 (lactic acid; pKa 3.86)을 생성하고, 과산화수소 (hydrogen peroxide), 박테리오신 (Bacteriocin), 다이아세틸 (Diacetyl; 2,3-butanedione), 류테리신 (Reutericin; 3-hydroxypropionaldehyde) 또한 분비하여 병원균의 성장을 억제할 수 있다. 또한, 상기 균주는 장 상피 세포의 adhesion receptors에 미리 점유하여 콜로니 (colony)를 형성함으로써 병원균 부착을 감소시키는 경쟁적인 배제 (competitive exclusion) 효과를 가지며, 동물의 장내 면역 시스템을 자극하여 면역을 활성화시켜 동물에 이로운 효과를 낼 수 있다.The Lactobacillus plantarum GS1 can produce an antimicrobial agent against pathogens. For example, the Lactobacillus plantarum GS1 produces lactic acid (pKa 3.86) capable of inhibiting viable pathogen survival by lowering pH and generating hydrogen peroxide (hydrogen peroxide). Bacteriocin, Diacetyl; 2,3-butanedione, and Reutericin 3-hydroxypropionaldehyde may also be secreted to inhibit the growth of pathogens. In addition, the strain has a competitive exclusion effect that reduces the adhesion of pathogens by preoccupying colonies by preoccupying the adhesion receptors of intestinal epithelial cells, and stimulating the intestinal immune system of animals to activate immunity. It can have a beneficial effect on animals.
병원균인 E. coli K99 에 대한 저항성을 강화된 락토바실러스 플란타룸 GS1의 제조방법은 특별히 한정된 것은 아니나, 일례로 자외선 조사에 의한 돌연변이 유발, 병원균과의 공배양, 병원균-탑아가 분석에 의한 항균력이 증진된 균주의 선별 및 항균력이 우수한 균주들간의 원형질체 융합으로 상동재조합을 유발하는 돌연변이유발기술을 결부함으로 락토바실러스 플란타룸 GS1을 제조할 수 있다.The method for producing Lactobacillus plantarum GS1, which has enhanced resistance to the pathogen E. coli K99, is not particularly limited, but for example, anti-mutation by UV irradiation, co-cultivation with pathogens, and antibacterial activity by pathogen-to-germ analysis Lactobacillus plantarum GS1 can be prepared by combining mutagenesis techniques that induce homologous recombination by protoplast fusion between strains with excellent selection and enhanced antimicrobial activity.
본 발명은 뉴클레오티드 단위로 야생형 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) 177을 돌연변이 시키는 제 1단계; 상기 돌연변이된 락토바실러스 플란타룸을 병원균인 E. coli K99와 공배양시키는 제 2단계; 상기 공배양을 통해 선별된 락토바실러스 플란타룸 돌연변이체에 E. coli K99에 대한 항균력 검사를 수행하여 항균력이 우수한 균주를 선별하는 제 3단계; 상기 선별된 균주들 간에 원형질체를 융합하여 유전자들간에 상동재조합을 일으켜 돌연변이를 유발하는 제 4단계; 상기 돌연변이된 락토바실러스 플란타룸을 병원균인 E. coli K99와 공배양시키는 제 5단계; 및 상기 공배양을 통해 선별된 락토바실러스 플란타룸 돌연변이체에 E. coli K99에 대한 항균력 검사를 수행하여 항균력이 우수한 균주를 선별하는 제 6단계;를 포함하는 대장균성설사병에 대해 저해활성을 나타내는 락토바실러스 플란타룸 GS1 (Lactobacillus plantarum GS1, 수탁번호 KCTC18230P)의 제조방법을 제공한다 (도 1).The present invention comprises a first step of mutating wild-type Lactobacillus plantarum 177 in nucleotide units; Co-culturing the mutated Lactobacillus plantarum with a pathogen E. coli K99; Performing a antimicrobial test against E. coli K99 on the Lactobacillus plantarum mutant selected through the co-culture, and selecting a strain having excellent antimicrobial activity; A fourth step of fusing protoplasts between the selected strains to cause homologous recombination between genes to cause mutations; Co-culturing the mutated Lactobacillus plantarum with a pathogen E. coli K99; And a sixth step of selecting the strain having excellent antimicrobial activity by performing an antimicrobial test against E. coli K99 on the Lactobacillus plantarum mutant selected through the coculture. It provides a method for producing Lactobacillus plantarum GS1 ( Lactobacillus plantarum GS1, accession number KCTC18230P) (Fig. 1).
본 발명에서는 동물 분변에서 선발한 유산균 중에서, 내산성 (acid-resistance), 내담즙성 (bile-resistance), 항균력 (antagonism against pathogens)이 좋다고 판명된 락토바실러스 살리바리우스 29 (Lactobacillus salavarius 29), 페디오코커스 아시딜락티시 175 (Pediococcus acidilactici 175), 락토바실러스 플랜타룸 177 (Lactobacillus plantarum 177)을 육종 대상 유산균으로 선발하고 이들 간의 항균력을 비교한 결과 락토바실러스 플랜타룸 177 (Lactobacillus plantarum 177)이 E. coli K99에 대한 가장 우수한 항균력을 나타냄을 확인할 수 있다.In the present invention, among the lactic acid bacteria selected from animal feces, Lactobacillus salavarius 29 ( Lactobacillus salavarius 29), pedioo , which have been found to have good acid-resistance, bile-resistance, and antibacterial activity Lactococcus know when dill rakti 175 (Pediococcus acidilactici 175), Lactobacillus plan tarum 177 (Lactobacillus plantarum 177) the result of lactic acid bacteria starter to the six kinds of target and compares the antimicrobial activity between these Lactobacillus plan tarum 177 (Lactobacillus plantarum 177) the E. coli It can be seen that it shows the best antibacterial activity against K99.
본 발명은 균주들간 원형질체 융합을 통한 상동재조합을 유발하기 이전에 우선적으로 야생형 락토바실러스 플랜타룸 177에 뉴클레오티드 수준의 돌연변이를 일으킴으로, 다양한 뉴클레오티드 (nucleotide) 수준의 돌연변이가 유발된 균주들 간에 원형질체 융합을 통한 상동재조합으로 전 유전자 (whole gene) 수준의 돌연변이가 유발되어 E. coli K99에 대해 더욱 강력한 항균활성을 나타내는 돌연변이 균주를 얻을 수 있다. The present invention preferentially causes nucleotide-level mutations in wild-type Lactobacillus plantarum 177 prior to inducing homologous recombination through protoplast fusion between strains, thereby protoplast fusion between strains that result in mutations of various nucleotide levels. Through homologous recombination, mutations of whole gene levels are induced, resulting in a mutant strain that exhibits stronger antimicrobial activity against E. coli K99.
상기 뉴클레오 수준의 돌연변이를 야기하는 방법은 특별히 한정된 것은 아니며, 자외선 조사 (UV irradiation), NTG (nitrosoguanidine), 디에틸설페이트 (diethylsulfate) 등으로 사용할 수 있지만, 바람직하게는 자외선 조사에 의해 야기될 수 있다.The method for causing the nucleo level mutation is not particularly limited, and may be used as UV irradiation, NTG (nitrosoguanidine), diethylsulfate, or the like, but preferably may be caused by UV irradiation. have.
상기 락토바실러스 플란타룸 177로부터 자외선 돌연변이를 일으킬 수 있는데, 이와 같이 균주에 자외선을 조사하면 세균이 자외선을 흡수하여, 여러 메커니즘에 의해 결국 DNA에 손상 (damage)를 입힐 수 있다. 이러한 손상 (damage)에 의해 대부분의 세균이 죽고, 일부가 살아남을 수 있는데, 살아남은 일부는 DNA damage가 repair 되었거나, DNA damage를 받지 않은 것이거나, 생명에는 지장이 없을 정도의 돌연변이 (mutation)가 형성된 것으로, 이러한 것들 중에 돌연변이들 (UV mutants)은 세균의 여러 가지 특징에 걸쳐서 특정 성질이 변형되어 항균력이 증진된 것을 얻을 수 있다.Ultraviolet mutations may be induced from the Lactobacillus plantarum 177. As such, when the strain is irradiated with ultraviolet rays, bacteria may absorb ultraviolet rays and eventually damage DNA by various mechanisms. This damage can cause most bacteria to die and some survive, with some remaining DNA repaired, undamaged DNA, or life-threatening mutations. Among these, mutations (UV mutants) can be obtained by the modification of certain properties over the various characteristics of the bacteria to increase the antimicrobial activity.
상기 락토바실러스 플란타룸 177의 자외선 돌연변이체를 E. coli K99와 공배양을 하여, 사멸기 (death phase) 말기에 살아있는 락토바실러스 플란타룸을 선별 (selection)함으로 병원균에 대한 생존력이 우수한 균주를 확보할 수 있다. The UV mutant of Lactobacillus plantarum 177 was co-cultured with E. coli K99 to select a live Lactobacillus plantarum at the end of the death phase, thereby selecting a strain having excellent viability against pathogens. It can be secured.
상기 단계에서, 락토바실러스 플란타룸 돌연변이체(Lactobacillus plantarum mutants)와 E. coli K99를 공배양하면 락토바실러스 플란타룸 돌연변이체는 E. coli K99와 경쟁을 하는 과정에서 E. coli K99와의 경쟁에서 우위에 설수 있는 능력을 가지는 돌연변이(mutation) 또는 E. coli K99의 성장을 억제할 수 있는 능력을 가지는 돌연변이, 또는 E. coli K99를 사멸시키는 능력이 향상되는 돌연변이를 확보할 수 있을 뿐만 아니라, 유산균과 병원균의 접촉 빈도를 높여줌으로서, 유산균이 환경에 유리하게 적응하는 방향으로 adaptive mutation이 유도될 수 있다. 또한, 사멸기 (death phase) 말기에 살아남은 락토바실러스 플란타룸 돌연변이체 (Lactobacillus plantarum mutants)를 선별하는 과정에서, 영양소가 고갈되었고, 대사노폐물이 축적되었으며, pH가 낮으며 그리고 전반적으로 기타 미생물이 성장하기에 부적절한 환경인 사멸기 (death phase) 말기에 살아남아 그 부적절한 환경에 적응 능력이 강할 수 있다.In this step, when Lactobacillus plantarum mutants and E. coli K99 are co-cultured, the Lactobacillus plantarum mutants compete with E. coli K99 in the process of competing with E. coli K99. as well as to secure a mutant that is capable to kill the improvement has the ability to inhibit the mutant has the ability to stand on edge (mutation) or the growth of E. coli K99 mutant, or E. coli K99, Lactobacillus By increasing the frequency of contact with pathogens, adaptive mutations can be induced in the direction of lactic acid bacteria to favor the environment. In addition, during the screening of Lactobacillus plantarum mutants that survived the late phase of the death phase, nutrients were depleted, metabolic waste was accumulated, pH was low and overall other microorganisms It may survive late death phases, which are inappropriate environments for growth, and may be able to adapt to them.
또한, 상기 돌연변이체들 (mutants)과 병원균을 공배양하는 다른 이유는 돌연변이 유발원에 의해 형성된 많은 돌연변이체 (mutants)를 일일이 항균력 검사를 통해 감별 (screening)하기엔 많은 시간이 소요되기 때문에, 이렇게 병원균과의 공배양을 통해 살아남은 것만 가지고 항균력 검사를 수행함으로, 전체 뉴클레오티드 단위 돌연변이들을 일일이 검사하는 것보다 효율성을 높일 수 있다.In addition, the other reason for co-culture of the mutants and pathogens is that it takes a long time to screen a large number of mutants formed by the mutagens by antimicrobial testing, Antimicrobial testing can be performed only by surviving coculture with the fruit, resulting in greater efficiency than full-nucleotide mutations.
선택적으로, 상기 공배양하여 생존력이 우수한 돌연변이체를 다시, 자외선 조사 등으로 뉴클레오티드 단위로 돌연변이 시키고 이를 병원균과 공배양 시키는 과정을 반복할 수 있다.Optionally, the co-cultured mutant having excellent viability may be mutated to nucleotide units again by UV irradiation and co-cultured with a pathogen.
상기 제 1 단계 및 제 2단계의 반복횟수는 특별히 한정된 것은 아니며, 일례로 2 내지 6회를 반복할 수 있다.The number of repetitions of the first and second steps is not particularly limited, and may be repeated two to six times as an example.
상기 공배양에서 사멸기 (death phase) 말기에 살아남은 유산균을 가지고 항균력 검사를 수행하여 항균력이 우수한 균주를 선별할 수 있는데, 상기 우수한 항균력을 지닌 균주의 선별방법은 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 병원균-탑아가분석 (pathogen topagar assay)을 이용할 수 있다.In the co-culture, a strain having excellent antimicrobial activity can be selected by performing an antimicrobial activity test with lactic acid bacteria surviving at the end of the death phase, but a method of selecting a strain having excellent antimicrobial power is not particularly limited, but preferably pathogens. Pathogen topagar assays can be used.
종래에 항균력을 정량화하는 방법으로서 agar well diffusion assay, agar disk diffusion assay를 사용하였는데 이는 균주 (strain)을 배양한 후 그 배양액을 사용해야 되며, 사용하는 배양액의 양의 차이에 의한 오류, 그리고 그 배양액을 disk 및 well에 주입할 때 확산능력에 의한 오류가 있을 수 있으며, 콜로니 (colony) 단위로 실험을 하는 것이 아니기 때문에 돌연변이체 균주 (mutant strain)간의 미묘한 항균력 차이를 감별하기에 무리가 있을 수 있다. 반면에, 본 발명의 병원균-탑아가분석 (pathogen topagar assay)은 개별 콜로니 (colony)들 간의 항균력을 비교적 쉽고 빠르게 비교할 수 있는데, 투명환 (clear zone) 지름의 절대값의 차이가 아닌, 돌연변이체 콜로니 (mutants colony) 지름에 대한 투명환 (clear zone)의 지름의 비인 CC 비율 (ratio)을 항균력의 척도로 사용하여 항균력 차이를 분별하는 능력을 강화시킬 수 있다. 따라서, C/C ratio(Clearing zone diameter/Colony diameter)가 증가된 돌연변이체를 최종 항균능력이 증진된 돌연변이체로 선발할 수 있다.Conventionally, agar well diffusion assay and agar disk diffusion assay were used as a method for quantifying antimicrobial activity, which should be used after incubating strains. There may be errors due to diffusion capacity when injected into disks and wells, and because it is not experimented in colony units, it may be difficult to discriminate the subtle antimicrobial differences between mutant strains. On the other hand, the pathogen topagar assay of the present invention can compare the antimicrobial activity between individual colonies relatively easily and quickly, and is not a difference in the absolute value of the clear zone diameter, but a mutant. The CC ratio, which is the ratio of the diameter of the clear zone to the diameter of the colonies, can be used as a measure of antimicrobial activity to enhance the ability to discern differences in antimicrobial activity. Therefore, mutants having an increased C / C ratio (Clearing zone diameter / Colony diameter) can be selected as mutants having enhanced final antimicrobial ability.
이와 같이 항균능력이 증진된 돌연변이체는, 야생형에 비해 항미생물질 (antimicrobial substance)의 분비능이 증진되거나, 관련 항균물질의 구조 변화로 그 활성이 더 증진된다거나, 세포 자체의 생육속도 증가로 인한 단위 시간당 항균물질의 분비능이 증가된 것일 수 있다.As described above, the mutant having enhanced antimicrobial activity is enhanced by the secretion ability of antimicrobial substance compared to the wild type, the activity is further enhanced by the structural change of related antimicrobial substance, or the growth rate of the cell itself is increased. The secretion capacity of the antimicrobial agent per unit time may be increased.
즉, 본 발명의 제 1단계의 뉴클레오티드 수준의 돌연변이체 pool과 병원균과의 제 2단계의 공배양 과정을 도입함으로서, E. coli K99와 공존하는 환경에서 생존능력이 우수한 돌연변이체를 선발할 수 있고, 병원균에 대한 생존능력 자체가 우수한 돌연변이체라고 한다면, 그만큼 병원균과의 경쟁에서 더 오래 살아남아, 장기간 항균 물질을 분비할 수 있기 때문에, 실제 field에 적용했을 때에도 좋은 항균효과를 유지할 수 있는 돌연변이체 (mutants)를 선발할 수 있다. 또한 공배양 과정을 통해 선발된 mutants pool은 제 3단계의 병원균-탑아가 오버레이 (pathogen-top agar overlay) 방법을 거치기 때문에, 병원균에 대한 생존력 우수 및 항균 물질의 분비능이 증가된 이중의 phenotype을 확보할 수 있다. That is, by introducing the second stage co-culture process between the nucleotide-level mutant pool and the pathogen of the first step of the present invention, mutants having excellent viability in the environment coexisting with E. coli K99 can be selected. If a mutant has excellent viability against a pathogen, the mutant can maintain a good antimicrobial effect even when applied to a field because it can survive longer in competition with the pathogen and secrete long-term antimicrobial substances. mutants can be selected. In addition, the mutants pool selected through the co-culture process goes through the pathogen-top agar overlay method of the third stage, thus securing a double phenotype with excellent viability against the pathogens and increased secretion of antimicrobial substances. can do.
상기 선별된 균주들간의 원형질체 융합을 통한 상동재조합을 통하여 돌연변이를 일으킬 수 있는데, 이는 세포의 표현형 (phenotype)을 급속히 증진시킬 수 있다. Mutations can be caused through homologous recombination through protoplast fusion between the selected strains, which can rapidly enhance the phenotype of the cells.
본 발명에서는 상기 제 4단계의 원형질체 융합을 통한 상동재조합을 통하여 돌연변이를 제조하는 과정을 게놈 셔플링 (Genome shuffling)이라 칭할 수 있다.In the present invention, the process of preparing a mutation through homologous recombination through the protoplast fusion of the fourth step may be referred to as genome shuffling.
상기 게놈 셔플링의 제조방법은 특별히 한정된 것은 아니나, 일례로 상기 선별된 균주들을 라이소자임 (lysozyme) 및 뮤타노리신 (mutanolysin)을 처리하여 원형질체를 형성하고, PEG (polyethyleneglycol)을 이용하여 원형질체들을 융합하여 유전자들 간의 상동재조합을 일으키므로 돌연변이체를 제조할 수 있다. 상동재조합을 통해 다양한 유전적 조합을 가지는 게놈 셔플링 돌연변이체를 재생배지 (regeneration media)에서 세포벽 (cell wall)을 재생시킬 수 있다.The method of preparing the genome shuffling is not particularly limited, but, for example, the selected strains are treated with lysozyme and mutanolisin to form protoplasts, and the protoplasts are fused by using polyethyleneglycol (PEG). Mutations can be prepared by causing homologous recombination between genes. Homologous recombination allows genome shuffling mutants with various genetic combinations to regenerate cell walls in regeneration media.
이후, 상기 돌연변이된 락토바실러스 플란타룸을 병원균인 E. coli K99와 공배양시킬 수 있다. The mutated Lactobacillus plantarum may then be co-cultured with the pathogen E. coli K99.
선택적으로, 상기 공배양하여 생존력이 우수한 돌연변이체를 다시, 게놈 셔플링 (Genome shuffling)으로 돌연변이 시키고 이를 병원균과 공배양 시키는 과정을 반복할 수 있다. 상기 제 4 단계 및 제 5단계의 반복횟수는 특별히 한정된 것은 아니며, 일례로 2 내지 6회를 반복할 수 있다.Optionally, the co-cultured mutant with superior viability can be mutated again with genome shuffling and co-cultured with the pathogen. The number of repetitions of the fourth and fifth steps is not particularly limited and may be repeated two to six times as an example.
상기 공배양을 통해 선별된 락토바실러스 플란타룸 돌연변이체에 항균력 검사를 수행하여 항균력이 우수한 균주를 선별할 수 있다. Antimicrobial activity can be selected by screening the Lactobacillus plantarum mutant selected through the co-culture, and strains having excellent antimicrobial activity can be selected.
상기 우수한 항균력을 지닌 균주의 선별방법은 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 병원균-탑아가분석 (pathogen topagar assay)을 이용하여, C/C ratio(Clearing zone diameter/Colony diameter)가 다른 돌연변이체에 비해 증가되거나 야생형 유산균 또는 자외선 조사한 돌연변이체에 비해 가장 증가한 돌연변이체를 최종 항균능력이 증진된 돌연변이체로 선발할 수 있다. The selection method of the strain having the excellent antimicrobial activity is not particularly limited, but preferably using a pathogen topagar assay, the C / C ratio (Clearing zone diameter / Colony diameter) is higher than that of other mutants. The most increased mutants compared to wild type lactic acid bacteria or ultraviolet irradiated mutants can be selected as mutants with enhanced final antimicrobial ability.
상기와 같은 항균력 검사 결과, 본 발명에서는 종래에 내산성, 내담즙성, 항균력이 우수하다고 알려진 락토바실러스 플란타룸 177에 비해 더욱 우수한 항균력을 지니는 락토바실러스 플란타룸 GS1 (Lactobacillus plantarum GS1, 수탁번호KCTC18230P)을 제조할 수 있다.As a result of the above antimicrobial test results, in the present invention, Lactobacillus plantarum GS1 (Lactobacillus plantarum GS1, Accession No. KCTC18230P), which has more superior antimicrobial activity than Lactobacillus plantarum 177, which is conventionally known to be excellent in acid resistance, bile resistance, and antimicrobial activity. ) Can be prepared.
본 발명의 대장균성설사병에 대해 저해활성을 나타내는 락토바실러스 플란타룸 GS1 (Lactobacillus plantarum GS1, 수탁번호 KCTC18230P)의 제조방법의 일례로, 자외선을 조사하여 뉴클레오티드 단위로 야생형 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) 177을 돌연변이 시키는 제 가단계; 상기 돌연변이된 락토바실러스 플란타룸을 병원균인 E. coli K99와 공배양시키는 제 나단계; 상기 가단계 및 나단계를 2 내지 6회 반복하는 제 다단계; 상기 다단계를 통해 선별된 락토바실러스 플란타룸 돌연변이체에 E. coli K99에 대한 병원균-탑아가분석 (pathogen topagar assay)을 수행하여, 락토바실러스 플란타룸 돌연변이체 콜로니 지름에 대한 콜로니 주변의 투명환의 지름으로 항균력이 우수한 균주를 선별하는 제 라단계; 상기 선별된 균주들을 라이소자임 (lysozyme) 및 뮤타노리신 (mutanolysin)을 처리하여 원형질체를 형성하고, PEG (polyethyleneglycol)을 이용하여 원형질체들을 융합하여 유전자들 간의 상동재조합을 통해 돌연변이를 일으키는 제 마단계; 상기 돌연변이된 락토바실러스 플란타룸을 병원균인 E. coli K99와 공배양 시키는 제 바단계; 상기 마단계 및 바단계를 2 내지 6회 반복하는 제 사단계; 및 상기 제 사단계를 통해 선별된 락토바실러스 플란타룸 돌연변이체에 E. coli K99에 대한 병원균-탑아가분석 (pathogen topagar assay)을 수행하여, 락토바실러스 플란타룸 돌연변이체 콜로니 지름에 대한 콜로니 주변의 투명환의 지름으로 항균력이 우수한 균주를 선별하는 제 아단계;를 포함할 수 있다. Lactobacillus plantarum GS1 ( Lactobacillus plantarum GS1, Accession No. KCTC18230P) showing an inhibitory activity against E. coli diarrhea of the present invention, Lactobacillus plantarum (wild type Lactobacillus plantarum in nucleotide units by irradiation with ultraviolet light) C) mutating 177; Co-culturing the mutated Lactobacillus plantarum with a pathogen E. coli K99; A multi-step of repeating the temporary step and the second step two to six times; A pathogen topagar assay for E. coli K99 was performed on the Lactobacillus plantarum mutant selected through the multi-step, and the transparent ring around the colonies for Lactobacillus plantarum mutant colony diameter. Selecting a strain having excellent antimicrobial activity in diameter; The selected strains are treated with lysozyme and mutanolysin to form protoplasts, and fusion of protoplasts using polyethyleneglycol (PEG) to cause mutations through homologous recombination between genes; Co-culturing the mutated Lactobacillus plantarum with a pathogen E. coli K99; Sacrificial step of repeating the step and the bar step 2 to 6 times; And performing a pathogen topagar assay for E. coli K99 on the Lactobacillus plantarum mutants selected through the fourth step, and surrounding colonies for Lactobacillus plantarum mutant colony diameters. The first step of selecting a strain having excellent antimicrobial power by the diameter of the transparent ring; may include.
일 실시예에 나타난 바와 같이, 야생형 락토바실러스 플란타룸 177과 E. coli K99를 공배양한 실험구에서 E. coli K99의 수는 E. coli K99만 단독 배양한 대조구에 비하여 12.6 % 였던 점에 반해, 본 발명의 제조방법에 따라 육종된 락토바실러스 플란타룸 GS1과 E. coli K99를 공배양한 실험구에서 E. coli K99의 수는 E. coli K99만 단독 배양한 대조구에 비하여 3.6 % 수준으로, 락토바실러스 플란타룸 GS1는 대장균성설사병의 원인균인 E. coli K99에 대한 항균력이 약 9% 향상되었음을 확인할 수 있다.
As shown in one embodiment, the wild-type Lactobacillus Planta room 177 and a co-culture experiment the E. coli K99, obtain the number of E. coli K99 is a point was 12.6% compared to the control only one single culture E. coli K99 in contrast, in the experimental group co-cultured for six kinds of Lactobacillus Planta room GS1 and E. coli K99 according to the production method of the present invention, the number of E. coli K99 is 3.6% level compared to the control only one single culture E. coli K99 As a result, Lactobacillus plantarum GS1 can be confirmed that the antibacterial activity against E. coli K99, the causative agent of E. coli diarrhea, was improved by about 9%.
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 GS1 (Lactobacillus plantarum GS1, 수탁번호 KCTC18230P)을 유효성분으로 함유하는 대장균성설사병 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. The present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of E. coli diarrhea disease containing Lactobacillus plantarum GS1 (Accession No. KCTC18230P) as an active ingredient.
본 발명의 대장균성설사병 예방 또는 치료용 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 락토바실러스 플란타룸 GS1을 109 live cells/kg 로 포함하나 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.The pharmaceutical composition for preventing or treating Escherichia coli diarrhea of the present invention includes the Lactobacillus plantarum GS1 at 10 9 live cells / kg based on the total weight of the composition, but the scope of the present invention is not limited thereto.
본 발명의 약학 조성물은 그 대상에 있어서 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 동물의 약학 조성물로 사용될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 소의 약학 조성물로 사용될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited in the subject, but may be preferably used as an animal pharmaceutical composition, and more preferably as a bovine pharmaceutical composition.
본 발명의 상기 락토바실러스 플란타룸 GS1 (Lactobacillus plantarum GS1, 수탁번호 KCTC18230P)을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있고, 이들은 경구로 투여될 수 있다. 본 발명의 약학조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 제조방법 (예: 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 최신판; Mack Publishing Company, Easton PA)을 참조할 수 있다. The pharmaceutical composition comprising the Lactobacillus plantarum GS1 (Accession No. KCTC18230P) of the present invention further comprises a suitable carrier, excipient and diluent, which are commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions, powders, granules, tablets. , Capsules and the like can be prepared and used, and they can be administered orally. The pharmaceutical composition of the present invention may be referred to a manufacturing method commonly prepared in the art (eg, Remington's Pharmaceutical Science, latest edition; Mack Publishing Company, Easton PA).
상기 대장균성설사병 예방 또는 치료용 조성물의 유효 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도 등에 따라 적절히 선택될 수 있다.
The effective dosage of the composition for preventing or treating E. coli diarrhea may be appropriately selected depending on the absorption rate, inactivation rate and excretion rate of the active ingredient in the body, age, sex and condition, the severity of the disease to be treated.
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 GS1 (Lactobacillus plantarum GS1, 수탁번호 KCTC18230P)을 유효성분으로 함유하는 대장균성설사병 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다. The present invention provides a feed composition for preventing or improving E. coli diarrhea disease containing Lactobacillus plantarum GS1 ( Lactobacillus plantarum GS1, Accession No. KCTC18230P) as an active ingredient.
본 발명의 사료 조성물은 그 대상에 있어서 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 동물의 사료로 사용될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 소의 사료로 사용될 수 있다.The feed composition of the present invention is not particularly limited in the subject, but may be preferably used as an animal feed, and more preferably as a bovine feed.
본 발명의 사료 조성물은 당업계에 통상적으로 제공되는 사료 조성물을 락토바실러스 플란타룸 GS1로 발효시킨 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 사료 조성물은 락토바실러스 플란타룸 GS1을 함유하는 외에 다른 성분, 예를 들어 탄수화물, 아미노산, 지질, 비타민, 미네랄 및/또는 비금속 성분물 등과 여러 가지 향미제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. The feed composition of the present invention may be a fermented feed composition commonly provided in the art with Lactobacillus plantarum GS1. In addition, the feed composition of the present invention contains Lactobacillus plantarum GS1, in addition to other components, such as carbohydrates, amino acids, lipids, vitamins, minerals and / or non-metallic components and various flavors, etc. as additional components can do.
상기 외에 본 발명의 사료조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.In addition to the above, the feed composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents, coloring agents and neutralizing agents, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloid thickeners, pH regulators, stabilizers , Preservatives, glycerin, alcohol and the like. These components can be used independently or in combination.
상기 균주는 오래전부터 많이 사용되어 안전성과 효능이 입증된 유산균주로 사료에 첨가함으로 E. coli K99와 같은 병원성 균주에 대한 저항력을 강화시킬 뿐 아니라, 사료를 발효시키는 과정에서 고분자구조의 영양소를 저분자구조로 분해하여 영양분 흡수율을 높일 수 있고, 발효과정을 통해 원래 없던 다양한 생리활성물질이 생성되어 신체 조절기능을 갖고 면역체계를 강화할 수 있는 이점이 있다.The strain is a lactic acid strain that has been widely used for a long time and has been proved to be safe and effective. Therefore, the strain not only enhances resistance to pathogenic strains such as E. coli K99, but also has a low molecular structure of macromolecules in the process of fermenting the feed. By decomposing to increase the absorption rate of nutrients, through the fermentation process, there is a variety of bioactive materials that were not originally generated has the advantage of body control and strengthen the immune system.
본 발명의 사료조성물은 가축의 사료 자체로 쓰일 수 있으며, 영양제 형태로 기존의 사료에 첨가될 수 있는 등 다양한 방법으로 활용될 수 있다.
The feed composition of the present invention can be used as a livestock feed itself, can be used in various ways, such as can be added to the existing feed in the form of nutrients.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시한 것으로 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited by the following examples.
<실시예><Examples>
실시예 1. 균주의 선택Example 1 Selection of Strains
1-1. 육종 대상 유산균의 선발1-1. Selection of lactic acid bacteria targeted for breeding
동물 분변에서 선발한 유산균 중에서, 내산성 (acid-resistance), 내담즙성 (bile-resistance), 항균력 (antagonism against pathogens)이 좋다고 판명된 락토바실러스 살리바리우스 29 (Lactobacillus salavarius 29), 페디오코커스 아시딜랙티아 175 (Pediococcus acidilactia 175), 락토바실러스 플란타룸 177 (Lactobacillus plantarum 177)을 육종 대상 유산균으로 선발하였다. 육종 대상 유산균은 API TEST, 16s gene sequencing, 그람염색 (gram staining)을 하여 동정 (identification)을 하였다.
Among the lactic acid bacteria selected from animal feces, Lactobacillus salavarius 29 and pediococcus asidilact , which have been found to have good acid-resistance, bile-resistance, and anti-antagonism against pathogens. Pediococcus acidilactia 175 and Lactobacillus plantarum 177 were selected as lactic acid bacteria for breeding. Lactobacillus for breeding was identified by API TEST, 16s gene sequencing and gram staining.
1-2. 목적 병원균 선택1-2. Pathogen selection
축우산업에서 빈번하게 발생하는 대장균성설사병의 원인균인 E. coli K99를 목적 병원균으로 선정하였다. E. coli K99, the causative agent of Escherichia coli diarrhea that occurs frequently in the cattle industry, was selected as the target pathogen.
E. coli K99 (KCTC 2617)는 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양을 받았고, 상기 병원균은 그람염색과 16s 유전자 시퀀싱 (gene sequencing)을 하여 동정하였다.
E. coli K99 (KCTC 2617) was distributed at the Korea Institute of Bioscience and Biotechnology, and the pathogens were identified by gram staining and 16s gene sequencing.
실시예 2. 항균력 정량 및 비교Example 2. Antimicrobial Activity Quantification and Comparison
2-1. 병원균-탑아가분석 (Pathogen-topagar-assay)2-1. Pathogen-topagar-assay
병원균에 대한 유산균의 항균력을 정량하는 방법이다. 실험방법은 우선 유산균이 자랄 수 있는 배지인 MRS 아가 (agar)에 한 플레이트에 약 10개의 유산균을 spreading 하였다. 그 다음 병원균이 섞인 아가 (agar)를 그 위에 부어 일정 시간 배양하였다. 그러면 MRS agar에는 유산균 콜로니가 형성되고, 병원균이 섞인 아가를 처리한 층에는 병원균 론 (pathogen lawn)을 형성하였다. 유산균은 항균물질을 분비하기 때문에 유산균 콜로니 (colony) 주변은 병원균이 자라지 못하여 투명환 (clear zone)을 형성하였다. (도 3). 그 투명환 (clear zone)의 지름을 측정하여 항균력을 정량화하였다. 이 연구에서는 투명환 (clear zone)의 절대값이 아닌, 유산균 콜로니 (colony) 지름에 대한 투명환 (clear zone)의 지름의 비인 CC 비율 (clear zone diameter/colony diameter)를 측정하여 좀 더 정확하게 항균력을 정량화하였다 (도 2).
It is a method to quantify the antibacterial activity of lactic acid bacteria against pathogens. In the experimental method, first, about 10 lactic acid bacteria were spread on a plate in MRS agar, which is a medium in which lactic acid bacteria can grow. Then, agar mixed with pathogens was poured on it and incubated for a while. Then, lactic acid bacteria colony was formed in MRS agar, and pathogen lawn was formed in the layer treated with agar mixed with pathogens. Because lactic acid bacteria secrete antimicrobial substances, pathogens cannot grow around the colony of lactic acid bacteria to form a clear zone. (FIG. 3). The diameter of the clear zone was measured to quantify the antimicrobial activity. In this study, the antimicrobial activity was more accurately determined by measuring the ratio of the clear zone diameter / colony diameter, which is the ratio of the diameter of the clear zone to the diameter of the lactic acid bacteria colony, not the absolute value of the clear zone. Was quantified (FIG. 2).
도 3은 E. coli K99에 대한 상기 세 균주의 항균력테스트 결과를 나타낸 것이다. Figure 3 shows the antimicrobial activity test results of the three strains for E. coli K99.
2-2. 목적 병원균에 대한 육종 대상 유산균의 기본 항균력 정량 및 비교2-2. Quantification and comparison of basic antimicrobial activity of lactic acid bacteria targeted for breeding pathogens
야생형 (Wild type) 유산균의 목적 병원균에 대한 항균력을 정량화하기 위하여 병원균-탑아가분석 (pathogen-topagar-assay)을 수행하여, 항균력 비교표 (antipahogenic ability standard index)를 작성하였다. 항균력 비교표를 분석한 결과 락토바실러스 플란타룸 177 (Lactobacillus plantarum 177)과 페디오코커스 아시딜랙티아 175 (Pediococcus acidilactia 175)가 락토바실러스 살리바리우스 29 (Lactobacillus salavarius 29)보다 항균력이 더 높았고 높은 것 둘 중에서는 락토바실러스 플란타룸 177 (Lactobacillus plantarum 177)이 약간 더 높았다. 이 결과를 토대로 하여 자외선 돌연변이 육종 대상균으로 락토바실러스 플란타룸 177 (Lactobacillus plantarum 177)을 선정하였다.
Pathogen-topagar-assay was performed to quantify the antimicrobial activity of wild-type lactic acid bacteria against the target pathogen, and an antipahogenic ability standard index was prepared. Lactobacillus plantarum 177 and Pediococcus acidilactia 175 showed higher antimicrobial activity and higher among Lactobacillus salavarius 29 than Lactobacillus salavarius 29. Lactobacillus plantarum 177 was slightly higher. Based on these results, Lactobacillus plantarum 177 was selected as a target for UV mutant breeding.
2-3. 항균능력 표준 표 (Antipahogenic ability standard index)2-3. Antitipogenic ability standard index
병원균-탑아가분석(Pathogen-topagar-assay)를 반복수행하여 항균능력 표준 표 (Antipathogenic ability standard index)를 상자도표 (boxplot)로 나타내었다 (도 4).
Pathogen-topagar-assay was repeated to show the antipathogenic ability standard index as a boxplot (FIG. 4).
실시예 3. 자외선 돌연변이 육종 (UV mutagenesis)Example 3 UV Mutation Breeding (UV mutagenesis)
3-1. 자외선 돌연변이 조사 (UV mutagenesis)방법3-1. UV mutagenesis method
MRS 아가 플레이트 (MRS agar plate)에 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum)를 spreading을 한 후, 살균램프 (germicidal lamp)를 이용하여 UV를 조사 (irradiation)시켰다. 그리고 나서 37℃ 배양기에서 배양하여 형성된 콜로니 (colony)들을 수합하였다 (도 1).
After spreading Lactobacillus plantarum on the MRS agar plate ( Lactobacillus plantarum) , UV was irradiated using a germicidal lamp (irradiation). Then colonies formed by incubating in a 37 ° C. incubator were collected (FIG. 1).
3-2. 공배양 방법 및 항균성분석3-2. Coculture Method and Antimicrobial Analysis
3-1에서 수행한 바와 같이, 자외선 돌연변이 (UV mutation)를 통해 획득한 UV 돌연변이체들과 E. coli K99와 공배양하여, 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) 측면에서 사멸기의 말기에 살아남은 UV 돌연변이체들을 분리한 후 증식시키는 과정을 3회 반복하였다. 3회째 공배양 과정에서 최종적으로 획득한 돌연변이체를 대상으로 병원균 탑아가분석 (pathogen topagar assay)를 하여 22개 UV 돌연변이체 (mutants)를 분리해내었다 (도 1).
As performed in 3-1, UV mutants obtained through UV mutations and co-culture with E. coli K99 survived at the end of the extinct phase in terms of Lactobacillus plantarum. UV mutants were isolated and propagated three times. Twenty-two UV mutants were isolated by pathogen topagar assay on the mutants finally obtained in the third coculture process (FIG. 1).
3-3. 자외선 돌연변이 (UV mutagenesis)에 의해 육종된 자외선 돌연변이체 (UV mutants)의 항균력 검정결과3-3. Antimicrobial Activity Assay of UV Mutants Breed by UV Mutagenesis
야생형과 자외선 돌연변이 (UV mutagenesis)으로 선발된 22개의 UV 돌연변이체 중에서 대표적인 균주 (strain)을 가지고 항균력을 검정하였다. 그 방법은 UV 돌연변이체와 E. coli K99와의 공배양을 16시간 한 후 E. coli K99의 생균수를 측정하였다. Antibacterial activity was assayed with a representative strain of 22 UV mutants selected as wild type and UV mutagenesis. The method measured the viable cell number of E. coli K99 after 16 hours of coculture with UV mutants and E. coli K99.
표 1 및 도 5는 락토바실러스 플란타룸 UV 돌연변이체들과 E. coli K99와 16시간 공배양 후 E. coli K99의 생균수를 측정한 결과를 나타낸 것이다.Table 1 and Figure 5 shows the results of measuring the viable cell count of E. coli K99 after 16 hours co-culture with Lactobacillus plantarum UV mutants and E. coli K99.
야생형 락토바실러스 플란타룸 (wild type Lactobacillus plantarum)과 E. coli K99와 공배양한 것과, 자외선 돌연변이 (UV mutagenesis)에 의해 육종된 락토바실러스 플란타룸 UV 돌연변이체들 (Lactobacillus plantarum UV mutants)과 E. coli K99와 공배양한 실험군에서, E. coli K99만 단독배양한 대조군보다 E. coli K99 생균수가 훨씬 낮았다. 야생형 락토바실러스 플란타룸 (Wild type Lactobacillus plantarum)과 E. coli K99와 공배양한 것과, 자외선 돌연변이 (UV mutagenesis)에 의해 육종된 락토바실러스 플란타룸 자외선 돌연변이체들 (Lactobacillus plantarum UV mutants)과 E. coli K99와 공배양한 실험군을 비교해보면, 자외선 돌연변이 (UV mutagenesis)에 의해 육종된 것의 항균력이 야생형보다 항균력이 더 좋다는 것을 알 수 있다.
Co-culture with wild type Lactobacillus plantarum and E. coli K99, and Lactobacillus plantarum UV mutants bred by UV mutagenesis and E In the experimental group co-cultured with coli K99, the E. coli K99 viable cell count was much lower than the control group incubated with E. coli K99 alone. Wild-type Lactobacillus Planta room (Wild type Lactobacillus plantarum) and E. coli K99 and the co-culture as one, a UV mutant of the Lactobacillus Planta room UV mutant six kinds by (UV mutagenesis) (Lactobacillus plantarum UV mutants) and E Comparing the coli K99 with the co-culture, the antimicrobial activity of those bred by UV mutagenesis is better than that of the wild type.
실시예 4. 원형질체 융합에 의한 돌연변이 제조방법Example 4 Mutation Preparation by Protoplast Fusion
4-1. 원형질체 융합에 의한 돌연변이 제조방법4-1. Method for producing mutations by protoplast fusion
(1) 자외선 돌연변이체들의 선배양 (Preincubation of UV mutants)(1) Preincubation of UV mutants
자외선 돌연변이 (UV mutagenesis)에 의해 육종된 22개의 UV 돌연변이체를 배양한 후 원심분리 (centrifuge)시키고 상층액은 버렸다.
Twenty-two UV mutants bred by UV mutagenesis were incubated and then centrifuge and the supernatant was discarded.
(2) 원형질체 형성 (Protoplast formation)(2) Protoplast formation
4㎖ LBP (lactobacillus protoplasting buffer; 10 mM Tris HCl, pH 6.3, 20 mM CaCl2, 0.5 M sucrose, 10㎎/㎖ of lysozyme, 30 ㎍/㎖ of mutanolysin)을 넣고, 37℃ 배양기 (incubator)에서 2시간 동안 배양시켜 정상세포를 원형질체 (protoplast)로 전변시켰다. LBP에 포함되어 있는 lysizyme과 mutanolysin은 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum)의 세포벽 (cell wall)의 성분인 펩티도글리칸 (peptidoglycan)의 β-N-acetylmuramyl-(14)-N-acetylglucosamine linkage를 가수분해 (hydrolysis)시켜 세포벽 (cell wall)을 제거시켰다. 배양(incubation) 후 배양물을 원심분리 (centrifuge) 시켰다.
Add 4 ml LBP (lactobacillus protoplasting buffer; 10 mM Tris HCl, pH 6.3, 20 mM CaCl 2 , 0.5 M sucrose, 10 mg / ml of lysozyme, 30 μg / ml of mutanolysin), and incubate at 37 ° C. in an incubator. Normal cells were transformed into protoplasts by incubating for hours. The lysizyme and mutanolysin contained in the LBP are the β-N-acetylmuramyl- (14) -N-acetylglucosamine linkage of peptidoglycan, a component of the cell wall of Lactobacillus plantarum . The cell wall was removed by hydrolysis. After incubation, the cultures were centrifuged.
(3) 원형질체 융합 (Protoplast fusion)(3) Protoplast fusion
100㎕의 PB (Protoplast buffer; 10 mM Tris HCl, pH 6.3, 20 mM CaCl2, 0.5 M sucrose)를 넣어, 희석한 다음 900㎕의 60 % PEG6000을 넣고, 상온에서 30분간 배양 (incubation)하여 원형질체 융합 (protoplast fusion)을 형성시켰다. 음전하를 띄는 PEG는 2가 양이온인 칼슘과 이온결합을 하고 결국 음전하 또는 양전하를 띄는 세포막 (plasma lemma)의 성분과 결합하였다. 그 다음에 PEG는 세포막 성분 (plasma lemma components)에 결합하여 세포막 성분 (plasma lemma components)를 뽑아내면서, 세포막 기관 (plasma lemma organisation)을 분산시키면서, 원형질체 (protoplast)들 간의 융합 (fusion)을 유도하였다.
Add 100 μl of PB (Protoplast buffer; 10 mM Tris HCl, pH 6.3, 20 mM CaCl 2 , 0.5 M sucrose), dilute, add 900 μl of 60% PEG6000, incubate at room temperature for 30 minutes, and incubate for 30 minutes. Protoplast fusions were formed. Negatively charged PEG ions bound to calcium, a divalent cation, and eventually to negatively charged or positively charged plasma membranes. PEG then induces the fusion between the protoplasts, dispersing the plasma lemma organisation, binding to the plasma lemma components and extracting the plasma lemma components. .
(4) 융합된 원형질체 재생 (Regeneration of fused protoplast)(4) Regeneration of fused protoplasts
원심분리 (centrifuge) 후 10㎖ RM broth (Regeneration media broth; MRS broth without Tween80, 0.5 M sucrose, 20 mM MgCl2, gelatin 2.5 %, bovine serum albumin (heat-inactivated, 0.5 %))를 넣었다. 그리고 혐기챔버 (anaerobic chamber)에 넣은 후 37℃ 배양기 (incubator)에서 밤새 배양 (overnight incubation) 하였다. 이 과정에서 융합된 원형질체 (protoplast)가 정상세포로 재생되었다.
After centrifugation, 10 ml RM broth (Regeneration media broth; MRS broth without Tween 80, 0.5 M sucrose, 20 mM MgCl 2 , gelatin 2.5%, bovine serum albumin (heat-inactivated, 0.5%)) was added. After incubation in an anaerobic chamber (overnight incubation) at 37 ℃ incubator (incubator). In this process, the fused protoplasts were regenerated into normal cells.
4-2. 공배양 방법 및 항균성분석4-2. Coculture Method and Antimicrobial Analysis
원형질체 융합 돌연변이 (Genome shuffling mutation)를 통해 획득한 원형질체 융합 돌연변이체와 E. coli K99와 공배양을 하여, 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) 측면에서 사멸기의 말기에 살아남은 원형질체 융합 돌연변이체들을 분리한 후 증식시키는 과정을 3회 반복하였다. 3회째 공배양 단계에서 최종적으로 획득한 돌연변이체 (mutants)을 가지고 병원균 탑아가분석 (pathogen topagar assay)을 하여 항균력이 뛰어난 최종 1개의 돌연변이체를 획득하였다. Co-culture with protoplast fusion mutants obtained through the genome shuffling mutation and E. coli K99 to isolate protoplast fusion mutants surviving at the end of the dead phase in terms of Lactobacillus plantarum. After the growth was repeated three times. The final one mutant with excellent antibacterial activity was obtained by pathogen topagar assay with the mutants finally obtained in the third coculture step.
최종 선발한 돌연변이체는 락토바실러스 플란타룸 GS1 (LP GS1)이었다. 이를 기탁기관 한국생명공학연구원에 기탁하여 기탁번호 KCTC18230P를 부여받았다.The final selected mutant was Lactobacillus plantarum GS1 (LP GS1). This was deposited with the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, and was assigned the deposit number KCTC18230P.
4-3. 원형질체 융합 (Genome shuffling)에 의해 육종된 락토바실러스 플란타룸의 항균력 검정 결과4-3. Antimicrobial Activity Test Results of Lactobacillus Planta Room Breed by Progenome Shuffling
원형질체 융합방법을 이용하여 육종되어 최종 선발된 1개의 돌연변이체를 가지고 항균력 검정하였다. 그 방법은 원형질체 융합 돌연변이법으로 육종된 락토바실러스 플란타룸 GS1 (Lactobacillus plantarum GS1 mutants)와 E. coli K99와의 공배양을 25시간 동안 한 후 E. coli K99의 생균수를 측정하였다.
Antimicrobial activity was assayed with one mutant that was bred and finally selected using the protoplast fusion method. The method was performed for 25 hours after co-culture of Lactobacillus plantarum GS1 mutants ( Lactobacillus plantarum GS1 mutants) and E. coli K99 bred by protoplast fusion mutagenesis to determine the number of viable cells of E. coli K99 .
표 2 및 도 6에서 나타난 바와 같이, 야생형 락토바실러스 플란타룸 (wild type Lactobacillus plantarum)과 E. coli K99와 공배양한 것과, UV 돌연변이 (mutagenesis)에 의해 육종된 락토바실러스 플란타룸 자외선 돌연변이체 (Lactobacillus plantarum UV mutants)와 E. coli K99와 공배양한 실험군 그리고 원형질체 융합에 의해 육종된 락토바실러스 플란타룸 GS1 (Lactobacillus plantarum GS mutant)와 E. coli K99와 공배양한 실험군에서, E. coli K99만 단독배양한 대조군보다 E. coli K99생균수가 훨씬 낮다. 야생형 락토바실러스 플란타룸 (Wild type Lactobacillus plantarum)과 E. coli K99와 공배양한 것과, 원형질체 융합에 의해 육종된 락토바실러스 플란타룸 GS1 (Lactobacillus plantarum GS mutant)과 E. coli K99와 공배양한 실험군을 비교해보면, 원형질체 융합에 의해 육종된 것의 항균력이 야생형 (wild type)보다 항균력이 더 우수하였다.As shown in Table 2 and Figure 6, co-cultured with wild type Lactobacillus plantarum and E. coli K99, Lactobacillus plantarum ultraviolet mutants bred by UV mutations (Lactobacillus plantarum UV mutants) and E. coli K99 and the ball on the six kinds by a culture and protoplast fusion experiment Lactobacillus Planta room GS1 (Lactobacillus plantarum GS mutant) and E. coli K99 and the co-culture experiment, E. coli The number of E. coli K99 viable cells was much lower than that of K99 alone. Co-cultured with wild type Lactobacillus plantarum and E. coli K99, and co-cultured with Lactobacillus plantarum GS mutant and E. coli K99 bred by protoplast fusion. Comparing the experimental group, the antimicrobial activity of the breeding by protoplast fusion was superior to the wild type (wild type).
Claims (6)
상기 돌연변이된 락토바실러스 플란타룸을 병원균인 E. coli K99와 공배양시키는 제 2단계;
상기 공배양을 통해 선별된 락토바실러스 플란타룸 돌연변이체에 E. coli K99에 대한 항균력 검사를 수행하여 항균력이 우수한 균주를 선별하는 제 3단계;
상기 선별된 균주들 간에 원형질체를 융합하여 유전자들간에 상동재조합을 일으켜 돌연변이를 유발하는 제 4단계;
상기 돌연변이된 락토바실러스 플란타룸을 병원균인 E. coli K99와 공배양시키는 제 5단계; 및
상기 공배양을 통해 선별된 락토바실러스 플란타룸 돌연변이체에 E. coli K99에 대한 항균력 검사를 수행하여 항균력이 우수한 균주를 선별하는 제 6단계;를 포함하는 대장균성설사병에 대해 저해활성을 나타내는 락토바실러스 플란타룸 GS1 (Lactobacillus plantarum GS1, 수탁번호 KCTC18230P)의 제조방법.Mutating the wild-type Lactobacillus plantarum 177 by nucleotide unit;
Co-culturing the mutated Lactobacillus plantarum with a pathogen E. coli K99;
Performing a antimicrobial test against E. coli K99 on the Lactobacillus plantarum mutant selected through the co-culture, and selecting a strain having excellent antimicrobial activity;
A fourth step of fusing protoplasts between the selected strains to cause homologous recombination between genes to cause mutations;
Co-culturing the mutated Lactobacillus plantarum with a pathogen E. coli K99; And
Lactobacillus showing inhibitory activity against E. coli diarrhea, comprising: step 6 of screening the strain Lactobacillus plantarum mutant selected through the co-cultivation E. coli K99 antibacterial activity screening excellent strains; Method for producing Bacillus plantarum GS1 ( Lactobacillus plantarum GS1, Accession No. KCTC18230P).
자외선을 조사하여 뉴클레오티드 단위로 야생형 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) 177을 돌연변이 시키는 제 가단계;
상기 돌연변이된 락토바실러스 플란타룸을 병원균인 E. coli K99와 공배양시키는 제 나단계;
상기 가단계 및 나단계를 2 내지 6회 반복하는 제 다단계;
상기 다단계를 통해 선별된 락토바실러스 플란타룸 돌연변이체에 E. coli K99에 대한 병원균-탑아가분석 (pathogen topagar assay)을 수행하여, 락토바실러스 플란타룸 돌연변이체 콜로니 지름에 대한 콜로니 주변의 투명환의 지름으로 항균력이 우수한 균주를 선별하는 제 라단계;
상기 선별된 균주들을 라이소자임 (lysozyme) 및 뮤타노리신 (mutanolysin)을 처리하여 원형질체를 형성하고, PEG (polyethyleneglycol)을 이용하여 원형질체들을 융합하여 유전자들 간의 상동재조합을 통해 돌연변이를 일으키는 제 마단계;
상기 돌연변이된 락토바실러스 플란타룸을 병원균인 E. coli K99와 공배양 시키는 제 바단계;
상기 마단계 및 바단계를 2 내지 6회 반복하는 제 사단계; 및
상기 제 사단계를 통해 선별된 락토바실러스 플란타룸 돌연변이체에 E. coli K99에 대한 병원균-탑아가분석 (pathogen topagar assay)을 수행하여, 락토바실러스 플란타룸 돌연변이체 콜로니 지름에 대한 콜로니 주변의 투명환의 지름으로 항균력이 우수한 균주를 선별하는 제 아단계;를 포함하는 대장균성설사병에 대해 저해활성을 나타내는 락토바실러스 플란타룸 GS1 (Lactobacillus plantarum GS1, 수탁번호 KCTC18230P)의 제조방법.
6. The method of claim 5,
A step of mutating the wild-type Lactobacillus plantarum 177 on a nucleotide basis by irradiation with ultraviolet rays;
Co-culturing the mutated Lactobacillus plantarum with a pathogen E. coli K99;
A multi-step of repeating the temporary step and the second step two to six times;
A pathogen topagar assay for E. coli K99 was performed on the Lactobacillus plantarum mutant selected through the multi-step, and the transparent ring around the colonies for Lactobacillus plantarum mutant colony diameter. Selecting a strain having excellent antimicrobial activity in diameter;
The selected strains are treated with lysozyme and mutanolysin to form protoplasts, and fusion of protoplasts using polyethyleneglycol (PEG) to cause mutations through homologous recombination between genes;
Co-culturing the mutated Lactobacillus plantarum with a pathogen E. coli K99;
Sacrificial step of repeating the step and the bar step 2 to 6 times; And
A pathogen topagar assay for E. coli K99 was performed on the Lactobacillus plantarum mutants selected through the fourth step, and the colony around the colony for the Lactobacillus plantarum mutant colony diameter. A method for producing Lactobacillus plantarum GS1 (Accession No. KCTC18230P) showing inhibitory activity against Escherichia coli diarrhea, comprising: a first step of selecting a strain having excellent antimicrobial activity by the diameter of the transparent ring;
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| KR100585391B1 (en) * | 2002-01-24 | 2006-06-01 | 주식회사 프로바이오닉 | Acid tolerant probiotic Lactobacillus plantarum Probio-38 that can suppresses the growth of pathogenic microorganisms and TGE coronavirus |
-
2012
- 2012-04-30 KR KR1020120045662A patent/KR101378673B1/en active IP Right Grant
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112111433A (en) * | 2020-09-30 | 2020-12-22 | 兰州大学 | Lactobacillus plantarum LZU-J-QA85 with acid-resistant and bile salt-resistant activities and application thereof |
| CN112111433B (en) * | 2020-09-30 | 2022-02-01 | 兰州大学 | Lactobacillus plantarum LZU-J-QA85 with acid-resistant and bile salt-resistant activities and application thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR101378673B1 (en) | 2014-03-27 |
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