KR20130120032A - Microfluidic perfusion device for cell culture and the application study and fabrication method therof - Google Patents

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KR20130120032A
KR20130120032A KR1020120042983A KR20120042983A KR20130120032A KR 20130120032 A KR20130120032 A KR 20130120032A KR 1020120042983 A KR1020120042983 A KR 1020120042983A KR 20120042983 A KR20120042983 A KR 20120042983A KR 20130120032 A KR20130120032 A KR 20130120032A
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유영재
박혜선
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포항공과대학교 산학협력단
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Abstract

A micropipe element, which is utilized for observing the biological activity of biologically active substances and the growth of cells or biological tissues, and a manufacturing method thereof are disclosed. The micropipe element includes a cell culture medium pipe supplying a cell culture medium from the outside; a cell culture unit which is connected to the cell culture medium pipe and which cultures cells by utilizing the cell culture medium supplied from the cell culture medium pipe; a cell injection pipe which is connected to the cell culture unit and which injects the cells into the cell culture unit; and an opening unit which opens and closes the cell injection pipe for separating the cell culture unit and the cell injection pipe from each other. The manufacturing method of the micropipe element includes a step of preparing a cell culture layer on which the cell culture medium pipe supplying the cell culture medium, the cell culture unit which cultures the cells by using the cell culture medium supplied from the cell culture medium pipe, and the cell injection pipe injecting cells into the cell culture unit are formed inside; a step of preparing a pipe opening layer on which the opening unit which opens and closes the cell injection pipe is formed inside; and a step of joining the cell culture layer and the pipe opening layer.

Description

세포 배양 및 응용연구를 위한 미세 관류 소자 및 그 제조방법 {Microfluidic perfusion device for cell culture and the application study and fabrication method therof}Microfluidic perfusion device for cell culture and the application study and fabrication method therof}

본 발명은 세포 또는 생체 조직의 성장과 생리활성 물질에 대한 생리활성을 관찰하는 데 사용되는 미세 관류 소자 및 그 제조방법에 관한 것이다.TECHNICAL FIELD The present invention relates to a microfluidic device used for observing the growth of a cell or biological tissue and a physiological activity against a physiologically active substance, and a method for producing the same.

관류 배양기는 세포 또는 생체 조직(이하, '세포'라함)의 성장과 생리활성 물질에 대한 생리활성을 관찰하는 데 사용되는 기기로서, 일반적으로, 세포를 일정한 지지층에 부착시키거나 끈이나 그물 등의 물리적 방법으로 일정 공간에 가두는 세포 배양부, 및 세포 배양부에 배양액을 계속적으로 흘려주는 배양액 공급부를 구비한다. 이러한 관류 배양기는 생리활성 물질과 신약개발을 위해 사용된다. BACKGROUND ART A perfusion culture apparatus is a device used for observing the growth of cells or biological tissues (hereinafter, referred to as "cells") and physiological activities against physiologically active substances. Generally, the cells are attached to a certain support layer, A cell culture section which is enclosed in a predetermined space by a physical method, and a culture medium supply section which continuously flows the culture medium into the cell culture section. These perfusion incubators are used for the development of physiologically active substances and new drugs.

하지만, 생리활성 물질과 신약개발을 위해 일반적인 관류 배양기를 사용하면, 요구되는 생리활성 물질 또는 신약 후보 물질의 양과 세포 배양 규모가 대단히 커진다. 이러한 단점을 보완하기 위해 세포 배양 규모를 마이크로미터 수준으로 낮추는 세포칩(cell chip)에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 세포칩은 접착성 세포의 특성을 이용하여 세포 배양부의 바닥을 세포가 붙을 수 있는 수백 마이크로미터 두께의 물질로 개질하거나 부유성 세포가 부착될 수 있는 알긴산염, 한천, 생체친화성 고분자 방울을 이용한다.However, the use of a general perfusion incubator for the development of physiologically active substances and new drugs greatly increases the amount of required physiologically active substances or candidate substances and cell culture scale. In order to overcome these disadvantages, studies on cell chips that reduce the cell culture scale to the micrometer level have been actively conducted. The cell chip utilizes the characteristics of the adherent cell to modify the bottom of the cell culture into a material with a thickness of several hundreds of micrometers that can attach the cell, or to use an alginate, an agar, or a biocompatible polymer droplet to which the floating cell can adhere .

최근, 유체를 미세 도관으로 흐르게 하는 미세 유체기술을 세포칩에 접목하는 세포배양 연구도 활발히 진행되고 있다. 미세 유체기술은 미세 식각기술을 이용하여 미세 도관을 금속, 실리콘 및 유리 등의 재료로 여러 가지 모양으로 만들어 배양액 등과 같은 유체의 혼합, 입자 흐름의 조절, 미세방울의 조절 등을 가능하게 한다. 또한, 폴리메틸메타아크릴레이트(polymethylmethaacrylate)나 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane; PDMS) 등의 고분자 재료는 낮은 공정비용과 단순 제작공정으로 원하는 미세 세포칩의 제작을 가능하게 한다.In recent years, cell culture studies have been actively carried out in which a microfluidic technique for flowing a fluid into a microconduit is applied to a cell chip. Microfluidic technology uses fine etching technology to make various kinds of microcavities such as metal, silicon, and glass to make mixing of fluid such as culture fluid, control of particle flow, and control of fine droplet. In addition, polymer materials such as polymethylmethacrylate and polydimethylsiloxane (PDMS) enable the production of desired microcellular chips with low process cost and simple fabrication process.

미세 유체기술을 이용한 세포배양 관련 기술로는 간세포를 배양하는 M.Y. Zhang 등의 논문“Microfluidic environment for high density hepatocyte culture”(Biomed Microdevices, 2008, 10p:117-121), 접착성 세포를 배양하는 P.J. Lee 등의 논문 “Nanoliter scale microbioreactor array for quantitative cell biology”(Biotechnology and Bioengineering, 2006, 94p:5-14), 동물세포 배양에 필요한 환경 요인을 조절할 수 있는 소자를 접목하는 국내 공개특허공보 제10-2009-0059448호의 “휴대용 소형 동물 세포 배양기 및 그 제조 방법”, 다른 높이의 배양 공간에 서로 다른 종류의 세포들을 함께 배양하는 국내 공개특허공보 제10-2011-0068170호의“바이오 칩의 미세환경 내에서 세포를 공배양하는 방법”, 미세구술을 세포 배양기에 넣어 세포 자극체로 사용하는 국내 공개특허공보 제10-2009-0083679호의“자극체를 이용한 세포 배양기 및 세포 배양 방법”, 세포를 배양하면서 기계적인 자극을 인가할 수 있는 국내 공개특허공보 제10-2010-0067298호의“세포자극기, 세포자극 및 배양장치, 세포자극 및 배양시스템”, 부유성 세포를 피코리터의 미세우물에 넣어 키우는 미국 공개특허 US2009/0111141호의“Method and device for studying floating, living cells”등이 있다.Techniques related to cell culture using microfluidic technology include M.Y. Zhang et al., "Microfluidic environment for high density hepatocyte culture" (Biomed Microdevices, 2008, 10p: 117-121), P.J. Lee, et al., "Nanoliter scale microbioreactor array for quantitative cell biology" (Biotechnology and Bioengineering, 2006, 94p: 5-14), Korean Patent Laid- 2009-0059448 entitled " Portable Small Animal Cell Culture Machine and Method for Producing the Same ", Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-2011-0068170, which co-cultivates different kinds of cells together in a different culture space, Cell culture incubator using a stimulator and cell culture method "of Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-2009-0083679, which uses micro-dope as a cell stimulator in cell culture, &Quot; Cell stimulator, cell stimulation and culture apparatus, cell stimulation and culture system ", Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-2010-0067298, Include raising the fine to put the well of picoliter US Patent Publication US2009 / 0111141 heading "Method and device for studying floating, living cells".

그러나, 대부분의 종래 기술은 접착성 세포의 배양에 한정되어 있으며, 배양액의 흐름으로 인해 세포에 큰 전단 스트레스가 가해지는 문제점이 있다. 또한, 관류 배양을 응용한 미세 배양기의 경우, 세포 주입 도관과 세포 배양부가 분리되지 않으므로, 세포 배양을 위한 별도 공간이 확보되지 않을 뿐 아니라 세포 배양부의 부피 정의도 불가능하다. 따라서, 생리활성 물질의 영향을 확인하는 실험 시는 세포 배양부에 공급되는 생리활성 물질의 정확한 농도를 알 수 없고, 세포 배양액의 조성 변화에 따른 세포의 반응을 확인하는 실험 시는 세포 배양부의 미세 환경을 빠르게 변화시킬 수 없는 문제점이 있다.However, most conventional techniques are limited to the cultivation of adherent cells, and there is a problem that a large shearing stress is applied to the cells due to the flow of the culture fluid. In addition, in the case of the micro-culture system using the perfusion culture, since the cell-injecting duct and the cell culture unit are not separated, a separate space for cell culture can not be secured and the volume of the cell culture unit can not be defined. Therefore, it is impossible to know the exact concentration of the physiologically active substance supplied to the cell culture section during the experiment to confirm the influence of the physiologically active substance. In the experiment to confirm the cell reaction according to the composition change of the cell culture liquid, There is a problem that the environment can not be changed quickly.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 창안된 것으로, 세포 주입 도관과 세포 배양부를 독립적으로 분리할 수 있고 필요에 따라 세포 배양부에 대한 세포의 출입을 통제할 수 있는 미세 관류 소자 및 그 제조방법을 제공하는 데 그 목적이 있다. Disclosure of the Invention The present invention has been made to solve the above problems, and it is an object of the present invention to provide a microfluidic device capable of independently separating a cell injection conduit and a cell culture unit, The purpose is to provide a method.

본 발명의 또 다른 목적은 세포 배양액 도관과 세포 배양부 사이를, 배양액과 액상의 생체활성 조절물질은 자유로이 통과할 수 있지만 세포는 통과할 수 없도록 구성하여 접착성 세포는 물론 부유성 세포도 배양할 수 있게 한 미세 관류 소자 및 그 제조방법을 제공하는 데 있다. It is a further object of the present invention to provide a method for culturing a cell culture fluid and a cell culture medium in which a culture solution and a liquid bioactive substance can freely pass between the cell culture liquid conduit and a cell culture section, And a method of manufacturing the same.

상술한 바와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위한 일 실시 양상에 따르면, 미세 관류 소자는, 외부로부터 세포 배양액을 공급하는 세포 배양액 도관, 세포 배양액 도관과 연결되고 세포 배양액 도관으로부터 공급되는 세포 배양액에 의해 세포를 배양하는 세포 배양부, 세포 배양부와 연결되고 세포 배양부에 세포를 주입하는 세포 주입 도관, 및 세포 배양부와 세포 주입 도관을 분리하도록 세포 주입 도관을 개폐하는 개폐부를 포함하는 것을 특징으로 한다. According to one embodiment of the present invention, the micro-perfusion device includes a cell culture fluid conduit for supplying a cell culture fluid from the outside, a cell culture fluid connected to the cell culture fluid conduit and supplied from the cell culture fluid conduit A cell culture section for culturing the cells, a cell injection conduit connected to the cell culture section for injecting cells into the cell culture section, and an opening / closing section for opening and closing the cell injection conduit so as to separate the cell culture section and the cell injection conduit do.

본 발명의 미세 관류 소자는, 세포 배양액 도관과 세포 배양부 사이를 연결하고 세포 배양액과 액상의 생체활성 조절물질은 자유로이 통과할 수 있지만 세포는 통과할 수 없는 연결 틈을 포함하는 틈새부를 더 포함할 수 있다. 이때, 연결 틈은 배양하고자 하는 세포의 크기에 따라 1 ~ 100 ㎛ 범위의 높이를 가지도록 형성될 수 있다. The micro-perfusion device of the present invention further includes a gap portion that connects between the cell culture liquid conduit and the cell culture portion and includes a connection gap through which the cell culture fluid and the liquid bioactive substance can freely pass but the cell can not pass through . At this time, the connection gap may be formed to have a height ranging from 1 to 100 mu m depending on the size of the cell to be cultured.

틈새부는 연결 틈이 변형 등에 의해 짓눌려 폐쇄되지 않도록 연결 틈 내에 일정 간격을 두고 배치된 복수 개의 지지기둥을 더 포함할 수 있다. 이때, 지지기둥은 원기둥 형태, 삼각 기둥 형태, 사각기둥 형태, 또는 다각형 기둥 형태로 형성될 수 있다. 또한, 지지기둥 사이의 간격은 정밀 노광기술을 이용하여 1 ~ 50 ㎛의 범위로 형성될 수 있다. 즉, 지지기둥 사이의 간격은 연결 틈이 변형 등에 의해 짓눌려 폐쇄되지 않도록 하기 위해 세포의 크기가 커서 연결 틈의 높이가 높은 경우에는 5 ~ 50 ㎛의 범위로 넓게 형성되고, 반대로 세포의 크기가 작아 미세 틈의 높이가 낮은 경우에는 1 ~ 5 ㎛의 범위로 좁게 형성될 수 있다. The clearance portion may further include a plurality of support pillars spaced apart from each other at a predetermined interval in the connection gap so that the connection gap is not crushed by deformation or the like. At this time, the supporting column may be formed in a cylindrical shape, a triangular columnar shape, a square columnar shape, or a polygonal columnar shape. In addition, the distance between the support pillars can be formed in the range of 1 to 50 mu m using a precision exposure technique. That is, the gap between the support pillars is formed to be wide in the range of 5 to 50 μm when the cell gap is high and the height of the connection gap is wide in order to prevent the connection gap from being crushed by the deformation or the like, When the height of the fine gap is low, it can be formed narrowly in the range of 1 to 5 mu m.

개폐부는 세포 배양부와 연결되는 세포 주입 도관의 부분에 배치되어 세포 주입 도관을 통한 세포 흐름을 차단하거나 개방하는 개폐밸브를 포함할 수 있다. 이때, 개폐밸브는 세포 주입 도관의 상기 부분에 인접하게 배치되고 외부로부터 공급되는 공기압에 의해 팽창하거나 수축하여 세포 주입 도관을 통한 세포 흐름을 차단하거나 개방하는 공기밸브 채널, 세포 주입 도관의 상기 부분에 인접하게 배치되고 세포 주입 도관을 변형을 유발하는 압전소자, 또는 세포 주입 도관의 상기 부분에 배치되고 세포 주입 도관을 개폐하는 솔레노이드 밸브를 포함할 수 있다. 이때, 공기밸브 채널은 0.2 ~ 0.5 MPa 범위의 공기압에 견딜 수 있도록 형성된다. The opening and closing part may include an open / close valve disposed at a portion of the cell-injecting conduit connected to the cell culture section to block or open the cell flow through the cell-injecting conduit. At this time, the opening / closing valve is disposed adjacent to the portion of the cell injection conduit, and includes an air valve channel that expands or contracts by the air pressure supplied from the outside to block or open the cell flow through the cell injection conduit, A piezoelectric device disposed adjacent to and causing deformation of the cell injection conduit, or a solenoid valve disposed in the portion of the cell injection conduit and opening and closing the cell injection conduit. At this time, the air valve channel is formed to withstand the air pressure in the range of 0.2 to 0.5 MPa.

본 발명의 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시 양상에 따르면, 미세 관류 소자는, 지지층; 지지층 위에 배치되고, 세포 배양액을 공급하는 세포 배양액 도관, 세포 배양액 도관으로부터 공급되는 세포 배양액에 의해 세포를 배양하는 세포 배양부, 및 세포 배양부에 세포를 주입하는 세포 주입 도관이 내부에 형성된 세포 배양층과, 세포 주입 도관을 개폐하는 개폐부가 내부에 형성된 도관 개폐층을 포함하는 관류배양층; 및 관류 배양층을 지지층에 접합하는 접합층을 포함하는 것을 특징으로 한다. According to another aspect of the present invention, there is provided a microfluidic device including: a support layer; A cell culture fluid conduit disposed on the support layer and supplying the cell culture fluid, a cell culture section for culturing the cells by a cell culture fluid supplied from the cell culture fluid conduit, and a cell culture medium in which a cell injection conduit for injecting cells into the cell culture section is formed And a conduit opening / closing layer in which an opening and closing part for opening and closing the cell injection conduit is formed; And a bonding layer for bonding the perfusion culture layer to the supporting layer.

지지층은 유리기판 또는 투명한 플라스틱 기판을 포함할 수 있다. The support layer may comprise a glass substrate or a transparent plastic substrate.

세포 배양층은 세포 배양액 도관과 세포 배양부 사이를 연결하고 세포 배양액과 액상의 생체활성 조절물질은 자유로이 통과할 수 있지만 세포는 통과할 수 없는 연결 틈을 포함하는 틈새부를 더 포함할 수 있다. 이때, 틈새부는 연결 틈이 변형 등에 의해 짓눌려 폐쇄되지 않도록 연결 틈 내에 일정 간격을 두고 배치된 복수 개의 지지기둥을 더 포함할 수 있다.The cell culture layer may further include a gap portion that connects between the cell culture liquid conduit and the cell culture portion and includes a connection gap through which the cell culture liquid and the liquid bioactive substance can freely pass but the cell can not pass through. At this time, the gap portion may further include a plurality of support pillars arranged at predetermined intervals in the connection gap so that the connection gap is not crushed due to deformation or the like.

개폐부는 세포 배양부와 세포 주입 도관 사이에 배치되어 세포 주입 도관을 통한 세포 흐름을 차단하거나 개방하는 개폐밸브를 포함할 수 있다. The opening and closing part may include an open / close valve disposed between the cell culture unit and the cell injection conduit to block or open the cell flow through the cell injection conduit.

또한, 세포 배양층, 도관 개폐층, 및 접합층은 탄성 고분자 재료, 예를 들면, PDMS로 형성될 수 있다.Further, the cell culture layer, the conduit opening layer, and the bonding layer may be formed of an elastic polymer material, for example, PDMS.

본 발명의 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시 양상에 따르면, 미세 관류 소자의 제조방법은, 세포 배양액을 공급하는 세포 배양액 도관, 세포 배양액 도관으로부터 공급되는 세포 배양액에 의해 세포를 배양하는 세포 배양부, 및 세포 배양부에 세포를 주입하는 세포 주입 도관이 내부에 형성된 세포 배양층을 준비하는 단계; 세포 주입 도관을 개폐하는 개폐부가 내부에 형성된 도관 개폐층을 준비하는 단계; 및 세포 배양층과 도관 개폐층을 접합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a method of manufacturing a microfluidic device including: a cell culture fluid conduit for supplying a cell culture fluid; a cell culture section for culturing the cells by a cell culture fluid supplied from the cell culture fluid conduit; Preparing a cell culture layer in which a cell-injecting duct for injecting cells into the cell culture unit is formed; Preparing a conduit opening / closing layer in which an opening / closing part for opening / closing a cell injection conduit is formed; And bonding the cell culture layer and the conduit opening / closing layer to each other.

세포 배양층을 준비하는 단계는 세포 배양액 도관, 세포 배양부, 및 세포 주입 도관에 대응하는 문양을 갖는 제1 주형을 제작하는 단계, 탄성 고분자 재료, 예를 들면, PDMS를 사용하여 제1 주형에 의해 세포 배양층을 형성하는 단계, 및 형성된 세포 배양층을 일정 시간 방치하여 반 경화시킨 후 세포 배양층의 세포 배양액 도관과 세포 주입 도관을 각각 외부의 세포 배양액 소스와 세포 소스에 연결하기 위한 연결관을 고정하는 입구 및 출구들을 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 이때, 제 1주형은, 세포 배양액 도관과 세포 배양부 사이를 연결하고 세포 배양액과 액상의 생체활성 조절물질은 자유로이 통과할 수 있지만 세포는 통과할 수 없는 연결 틈을 포함하는 틈새부에 대응하는 문양을 더 포함할 수 있다. The step of preparing the cell culture layer may include the steps of preparing a first template having a pattern corresponding to the cell culture liquid conduit, the cell culture section, and the cell injection conduit, preparing a first template by using an elastic polymer material such as PDMS, Forming a cell culture layer on the cell culture medium, and semi-curing the formed cell culture layer for a predetermined time, and then connecting the cell culture medium conduit and the cell injection conduit of the cell culture layer to the external cell culture medium source and the cell source, Lt; RTI ID = 0.0 > and / or < / RTI > At this time, the first template connects the cell culture fluid conduit and the cell culture section, and the cell culture fluid and the liquid bioactivity control substance can be freely passed through, but the cell can not pass through the gap, As shown in FIG.

도관 개폐층을 준비하는 단계는 공기압에 의해 팽창하거나 수축하여 세포 주입 도관을 통한 세포 흐름을 차단하거나 개방하는 개폐부의 공기밸브 채널에 대응하는 문양을 갖는 제2 주형을 제작하는 단계, PDMS를 사용하여 제2 주형에 의해 도관 개폐층을 형성하는 단계, 및 형성된 도관 개폐층을 일정 시간 방치하여 반 경화시킨 후 도관 개폐층의 개폐부의 공기밸브 채널을 외부의 압축공기 소스와 배출제어부와 연결하기 위한 연결관을 고정하는 입구 및 출구를 형성하는 단계를 포함할 수 있다.Preparing a second mold having a pattern corresponding to an air valve channel of an opening / closing part for expanding or contracting by air pressure to block or open a cell flow through a cell injection conduit; Forming a conduit opening / closing layer by a second mold and connecting the air valve channel of the opening and closing part of the conduit opening / closing layer to the outside compressed air source and the discharge control part after leaving the formed conduit opening / And forming an inlet and an outlet for securing the tube.

세포 배양층과 도관 개폐층을 접합하는 단계는 세포 배양층과 도관 개폐층을 서로 겹쳐 놓은 후 일정 온도로 가열하여 완전 경화시키는 단계를 포함할 수 있다.The step of joining the cell culture layer and the conduit opening / closing layer may include a step of superimposing the cell culture layer and the conduit opening / closing layer on each other, and then heating to a certain temperature to completely cure.

본 발명의 미세 관류 소자의 제조방법은 접합된 세포 배양층과 도관 개폐층을 지지층 상에 접합시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 지지층에 접합시키는 단계는 지지층 상에 얇은 PDMS층을 올려 놓은 후 제1 온도로 가열하여 PDMS층을 반 경화시키는 단계, 접합된 세포 배양층과 도관 개폐층을 반 경화된 PDMS층이 있는 지지층 상에 올려 놓은 후 제2 온도로 가열하여 완전 경화시키는 단계를 포함할 수 있다. The method of manufacturing a microfluidic device of the present invention may further comprise the step of bonding the cell culture layer and the conduit opening / closing layer on the supporting layer. The step of bonding to the support layer comprises the steps of placing a thin PDMS layer on a support layer and then heating to a first temperature to semi-cure the PDMS layer, and bonding the cell culture layer and the conduit opening layer onto a support layer having a semi-cured PDMS layer Followed by heating to a second temperature to complete curing.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 미세 관류 소자는 세포 주입 도관과 세포 배양부를 독립적으로 분리할 수 있고 필요에 따라 세포 배양부에 대한 세포의 출입을 통제할 수 있는 개폐부를 구비하므로, 세포 배양을 위한 별도 공간의 확보가 가능할 뿐 아니라 세포 배양부의 부피 정의도 가능하다. 따라서, 적은 양의 시약을 사용하여 세포의 반응성을 확인할 수 있고, 그 결과, 새로운 생리활성 저해제나 활성화제의 탐색이 더 용이해 진다. 또한, 생리활성 물질의 영향을 확인하는 실험 시는 세포 배양부에 공급되는 생리활성 물질의 정확한 농도를 쉽게 알 수 있고, 세포 배양액의 조성 변화에 따른 세포의 반응을 확인하는 실험 시는 세포 배양부의 미세 환경을 빠르게 변화시킬 수 있다.      As described above, the micro-perfusion device according to the present invention has an opening / closing part that can independently separate the cell-injecting duct and the cell culture part and can control the entry / exit of the cell into / from the cell culture part, It is possible not only to secure a separate space for the cell culture part but also to define the volume of the cell culture part. Therefore, it is possible to confirm the reactivity of cells using a small amount of reagent, and as a result, it becomes easier to search for a new bioactivity inhibitor or activator. In addition, in the experiment for confirming the influence of the physiologically active substance, it is easy to know the exact concentration of the physiologically active substance supplied to the cell culture section. In the experiment for confirming the cell reaction according to the composition change of the cell culture liquid, The micro-environment can be rapidly changed.

또한, 본 발명에 따른 미세 관류 소자는 세포 배양액 도관과 세포 배양부 사이에 세포 배양액과 액상의 생체활성 조절물질은 자유로이 통과할 수 있지만 세포는 통과할 수 없도록 하는 연결 틈을 포함하는 틈새부를 배치하므로, 세포 배양부에서 배양되는 세포가 세포 배양액 또는 액상의 생체활성 조절물질과 함께 세포 배양부로부터 세포 배양액 도관으로 빠져나가는 것을 방지할 수 있고, 이에 따라, 접착성 세포 외에도 부유성 세포까지 미세 배양이 가능하다. 또한, 세포 배양부로 유입되는 배양액의 흐름이 틈새부에 의해 어느 정도 억제되므로, 배양액의 흐름으로 인해 세포에 큰 전단 스트레스가 가해지는 종래의 문제점이 해소될 수 있다. In addition, the micro-perfusion device according to the present invention includes a gap portion including a cell gap between the cell culture liquid conduit and the cell culture portion, the cell culture liquid and the liquid bioactivity regulator being able to freely pass through but not allowing the cells to pass therethrough , It is possible to prevent the cells cultured in the cell culture section from escaping from the cell culture section to the cell culture medium conduit together with the cell culture fluid or the liquid bioactivity regulating substance, It is possible. Further, since the flow of the culture fluid flowing into the cell culture section is suppressed to some extent by the clearance part, the conventional problem that a large shear stress is applied to the cells due to the flow of the culture solution can be solved.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 관류 소자를 도시하는 사시도,
도 2는 도 1에 도시된 미세 관류 소자의 주요 구성부분을 예시하는 부분 평면도,
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 실제로 제작된 미세 관류 소자의 주요 구성부분을 예시하는 주사전자현미경 사진,
도 4는 도 1에 도시된 미세 관류 소자의 세포 배양층을 예시하는 사시도,
도 5는 도 1에 도시된 미세 관류 소자의 도관 개폐층을 예시하는 사시도,
도 6은 도 1에 도시된 미세 관류 소자의 관류 배양층을 예시하는 사시도,
도 7은 도 1에 도시된 미세 관류 소자의 지지층을 예시하는 사시도,
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 관류 소자의 제조프로세스를 예시하는 흐름도,
도 9는 본 발명의 따라 실제로 제작된 미세 관류 소자의 일 예의 구조를 예시하는 도면,
도 10는 본 발명의 따라 실제로 제작된 미세 관류 소자의 다른 예를 예시하는 현미경 사진,
도 11은 본 발명의 미세 관류 소자를 이용하여 단세포 녹조류 클라미도모나스(Chlamydomonas)를 배양한 결과를 예시하는 사진,
도 12는 본 발명의 미세 관류 소자의 세포 배양액 도관에 형광물질 용액을 흘려주었을 때 시간에 따른 세포 배양부로의 형광물질의 이동을 보여주는 그래프, 및
도 13은 본 발명의 미세 관류 소자에 단세포 녹조류 두날리엘라(Dunaliella)를 세포 배양부에 넣고 세포 배양액 도관에 고장액을 흘렸을 때 세포의 반응을 보여주는 사진이다.1 is a perspective view illustrating a microfluidic device according to an embodiment of the present invention;
FIG. 2 is a partial plan view illustrating a main component of the microfluidic device shown in FIG. 1;
FIG. 3 is a scanning electron microscope photograph illustrating a major constituent part of a microfluidic device actually manufactured according to an embodiment of the present invention,
FIG. 4 is a perspective view illustrating a cell culture layer of the micro-perfusion device shown in FIG. 1,
FIG. 5 is a perspective view illustrating a conduit opening / closing layer of the microfluidic device shown in FIG. 1;
FIG. 6 is a perspective view illustrating a perfusion culture layer of the microfluidic device shown in FIG. 1;
FIG. 7 is a perspective view illustrating a support layer of the microfluidic device shown in FIG. 1;
8 is a flow chart illustrating a manufacturing process of a microfluidic device according to an embodiment of the present invention,
9 is a diagram illustrating a structure of an example of a microfluidic device actually manufactured according to the present invention,
10 is a micrograph illustrating another example of a microfluidic device actually manufactured according to the present invention,
11 is a photograph illustrating the result of culturing a single cell green alga Clamidomonas using the micro-perfusion device of the present invention,
12 is a graph showing the movement of the fluorescent substance to the cell culture portion over time when the fluorescent substance solution is flowed into the cell culture liquid conduit of the micro-perfusion device of the present invention, and
Fig. 13 is a photograph showing the reaction of cells when a single cell green alga Dunaliella is put into a microfluidic device of the present invention, and a fluid is poured into a cell culture liquid conduit.

이하, 본 발명의 양호한 실시예에 따른 미세 관류 소자 및 그 제조방법을 첨부 도면을 참조하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENT Hereinafter, a microfluidic device and a method of manufacturing the same according to preferred embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.

도 1 및 도 2는 각각 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 관류 소자를 사시도 및 평면도로 예시한다. 1 and 2 illustrate a microfluidic device according to an embodiment of the present invention in a perspective view and a plan view, respectively.

도 1 및 도 2를 참조하면, 미세 관류 소자(1)는 세포(또는 생체 조직)의 성장과 생리활성 물질에 대한 생리활성을 관찰하는 데 사용되는 미세 관류 배양기로서, 세포 배양액 도관(10), 세포 배양부(20), 세포 주입 도관(30), 및 개폐부(40)를 포함한다.1 and 2, a micro-perfusion device 1 is a micro-perfusion culture device used for observing the growth of a cell (or a living body tissue) and a physiological activity against a physiologically active substance, and includes a cell culture liquid conduit 10, A cell culture unit 20, a cell injection conduit 30, and an opening / closing unit 40.

세포 배양액 도관(10)은 외부의 세포 배양액 소스(도시하지 않음)로부터 생체활성 조절물질를 포함하는 세포 배양액을 유입시켜 세포 배양부(20)로 공급한다. The cell culture liquid conduit 10 introduces a cell culture liquid containing a bioactivity regulating substance from an external cell culture liquid source (not shown) and supplies the cell culture liquid to the cell culture section 20.

이를 위해, 세포 배양액 도관(10)은 배양액 도관 입구(11) 및 배양액 도관 출구(12)에 연결된 고무관과 같은 배양액 도관 연결관들(14)을 통해 세포 배양액 소스의 입구와 출구에 연결된다. 본 실시예에서, 배양액 도관 입구(11)와 배양액 도관 출구(12)는 0.1 mm 내지 0.5 mm의 직경을 가지도록 형성된다.To this end, the cell culture fluid conduit 10 is connected to the inlet and outlet of the cell culture source via culture fluid conduit connections 14, such as a rubber tube connected to the culture fluid inlet 11 and the culture fluid outlet 12. In this embodiment, the culture medium conduit inlet 11 and the culture conduit outlet 12 are formed to have a diameter of 0.1 mm to 0.5 mm.

또한, 세포 배양액 도관(10)은 세포 배양부(20) 둘레에서는 세포 배양부(20)를 감싸는 형태로 형성된 굴곡부(15)를 갖는다. The cell culture liquid conduit 10 has a bend 15 formed around the cell culture unit 20 so as to surround the cell culture unit 20.

이러한 세포 배양액 도관(10)은 세포 배양부(20) 둘레에 위치한 굴곡부(15)와 그 외의 부분에서 각각 10 ~ 500 ㎛ 범위의 폭으로 형성될 수 있다.The cell culture liquid conduit 10 may be formed to have a width in the range of 10 to 500 mu m at the bent portion 15 located at the periphery of the cell culture portion 20 and other portions.

본 실시예에서, 굴곡부(15)에서는 약 50 ㎛의 폭으로 형성되고 그외 부분에서는 약 100 ㎛의 폭으로 형성된다. 여기서, 굴곡부(15)의 폭이 다른 부분 보다 좁게 형성하는 이유는 세포 배양액 도관(10)이 굴곡부(15)에서 후술하는 틈새부(17)을 통해 세포 배양부(20)와 연결되기 때문에, 세포 배양액이 굴곡부(15)를 통과할 때 다른 부분과 거의 동등한 속도로 굴곡부(15)를 통과할 수 있도록 하기 위해서이다. 또한, 세포 배양액이 세포 배양부(20)와 연결된 굴곡부(15)를 신속히 통과하도록 하고자 할 경우, 굴곡부(15)의 유입부쪽 폭을 줄이고 배출부쪽 폭을 늘리는 것에 의해 굴곡부(15)의 유입부와 배출부 사이의 압력차를 유도하여 세포 배양액이 굴곡부(15)를 신속히 통과하도록 할 수 있다. In this embodiment, the bent portion 15 is formed with a width of about 50 mu m and the other portion is formed with a width of about 100 mu m. The width of the bent portion 15 is narrower than other portions because the cell culture liquid conduit 10 is connected to the cell culture portion 20 through the gap portion 17 described later in the bent portion 15, So that the culture liquid can pass through the bending portion 15 at substantially the same speed as the other portions when the culture liquid passes through the bending portion 15. [ When the cell culture liquid is to be passed quickly through the bending portion 15 connected to the cell culture portion 20, the width of the inflow portion of the bending portion 15 is reduced and the width of the discharge portion is increased, It is possible to induce a pressure difference between the discharge portions so that the cell culture liquid can pass through the bending portion 15 quickly.

세포 배양부(20)는 틈새부(17)를 통해 세포 배양액 도관(10)과 연결되고, 세포 배양액 도관(10)으로부터 틈새부(17)를 통해 공급되는 생체활성 조절물질를 포함하는 세포 배양액에 의해 세포를 배양한다. 세포 배양부(20)는 접착성 세포 외에도, 임상연구에서 많이 사용하는 동물성 세포나 식물성 세포, 적당한 크기의 단세포 광합성(algae)나 작은 크기의 미세 조류(microalgae), 곰팡이, 원생생물, 박테리아 등과 같은 부유성 세포를 주입하여 배양할 수 있다. The cell culture unit 20 is connected to the cell culture liquid conduit 10 via the gap portion 17 and is supplied with the cell culture liquid containing the bioactivity regulating substance supplied from the cell culture liquid conduit 10 through the gap portion 17 Cells are cultured. The cell culture unit 20 can be used in a variety of fields such as an animal cell or a vegetable cell used in clinical research, a single-cell algae or small-sized microalgae of appropriate size, a mold, a protozoan, They can be cultured by injecting pseudo-cells.

이러한 세포 배양부(20)는 배양하고자 하는 세포의 크기와 목적에 따라 높이, 크기, 및 모양을 조절할 수 있다. 즉, 세포 배양부(20)는 사각형, 원형, 타원형, 삼각형 등의 다양한 형태로 형성되고, 폭은 10~1000 ㎛, 높이는 5 ~ 100 ㎛의 범위를 가지도록 형성될 수 있다. 본 실시예에서, 세포 배양부(20)는 모서리부가 라운드진 사각형 형태로 형성되고, 폭과 높이는 각각 약 120 ㎛와 약 25 ㎛로 형성된다. The cell culture unit 20 can control the height, size, and shape according to the size and purpose of the cell to be cultured. That is, the cell culture unit 20 may be formed in various shapes such as a quadrangle, a circle, an ellipse, and a triangle, and may have a width ranging from 10 to 1000 탆 and a height ranging from 5 to 100 탆. In this embodiment, the cell culture unit 20 is formed in a rectangular shape with corners rounded, and the width and height are formed to be about 120 탆 and about 25 탆, respectively.

틈새부(17)는 세포 배양액 도관(10)과 세포 배양부(20) 사이를 연결하는 연결 틈(18)을 포함한다. 연결 틈(18)은 세포 배양액과 액상의 생체활성 조절물질은 자유로이 통과할 수 있지만 세포는 통과할 수 없도록 형성된다. 이를 위해, 연결 틈(18)은 배양하고자 하는 세포의 크기에 따라 1 ~ 100 ㎛ 범위의 높이를 가지도록 형성될 수 있다. 예를 들면, 해양 단세포 녹조류인 두날리엘라 또는 클라미도모나스를 배양하는 경우, 연결 틈(18)은 약 2 ㎛의 높이를 가지도록 형성될 수 있다. The gap portion 17 includes a connection gap 18 connecting between the cell culture liquid conduit 10 and the cell culture portion 20. [ The connection gap 18 is formed such that the cell culture liquid and the liquid bioactive substance can pass freely but the cell can not pass through. For this purpose, the connection gap 18 may be formed to have a height in the range of 1 to 100 [mu] m depending on the size of the cell to be cultured. For example, in the case of culturing a marine unicellular green alga, dunalella or clamidomonas, the connection gap 18 can be formed to have a height of about 2 mu m.

틈새부(17)는 연결 틈(18)이 변형 등에 의해 짓눌려 폐쇄되지 않도록 연결 틈(18) 내에 일정 간격을 두고 배치된 복수 개의 미세 지지기둥(19)을 더 포함할 수 있다. 미세 지지기둥(19)은 원기둥, 사각기둥, 다각형 기둥 등의 다양한 형태로 형성될 수 있다. 또한, 미세 지지기둥(19) 사이의 간격은 배양하고자 하는 세포의 크기에 따라 정밀 노광기술을 이용하여 1 ~ 50 ㎛의 범위로 형성될 수 있다. 예를 들면, 미세 지지기둥(19) 사이의 간격은 연결 틈(18)이 변형 등에 의해 짓눌려 폐쇄되지 않도록 하기 위해 세포의 크기가 커서 연결 틈(18)의 높이가 높게 설계되는 경우에는 5 ~ 50 ㎛의 범위로 넓게 형성되고, 반대로 세포의 크기가 작아 미세 틈의 높이가 낮게 설계되는 경우에는 1 ~ 5 ㎛의 범위로 좁게 형성될 수 있다. The gap portion 17 may further include a plurality of fine support columns 19 arranged at regular intervals in the connection gap 18 so that the connection gap 18 is not crushed by deformation or the like. The fine support column 19 may be formed in various shapes such as a column, a square column, a polygonal column, and the like. In addition, the interval between the fine support pillars 19 can be formed in the range of 1 to 50 탆 according to the size of the cells to be cultured using a precision exposure technique. For example, when the height of the connection gap 18 is designed to be so large that the size of the cell is large in order to prevent the connection gap 18 from being crushed by deformation or the like, the gap between the fine support pillars 19 is preferably 5 to 50 Mu] m. On the contrary, when the cell size is small and the height of the fine gap is designed to be low, it can be formed narrowly in the range of 1 to 5 [mu] m.

본 실시예에서, 미세 지지기둥(19)은 원기둥 형태로 형성되고, 약 10 ㎛의 간격를 가지도록 형성된다.In this embodiment, the fine support pillars 19 are formed in a cylindrical shape and are formed to have an interval of about 10 mu m.

세포주입 도관(30)은 세포 배양부(20)와 연결되어 세포 배양부(20)에 세포를 주입한다. 이를 위해, 세포주입 도관(30)은 세포주입 도관 입구(31) 및 세포주입 도관 출구(32)에 연결된 고무관과 같은 세포주입 도관 연결관들(34)을 통해 세포 소스(도시하지 않음)의 입구와 출구에 연결된다. 본 실시예에서, 세포주입 도관 입구(31)와 세포주입 도관 출구(32)는 세포 배양액 도관(10)의 배양액 도관 입구(11) 및 배양액 도관 출구(12)와 마찬가지로, 0.1 mm 내지 0.5 mm의 직경을 가지도록 형성된다. The cell injection conduit 30 is connected to the cell culture unit 20 to inject cells into the cell culture unit 20. To this end, the cell injection conduit 30 is connected to the inlet (not shown) of a cell source (not shown) through cell injection conduit connectors 34 such as a rubber tube connected to the cell injection conduit inlet 31 and the cell injection conduit outlet 32 And the outlet. In this embodiment, the cell-injection-conduit inlet 31 and the cell-injection-conduit outlet 32 are, as with the culture-liquid conduit inlet 11 and the culture-liquid conduit outlet 12 of the cell culture liquid conduit 10, Diameter.

세포 주입 도관(30)은 주입하는 세포의 크기에 따라 10 ~ 500 ㎛ 범위의 폭을 가지도록 형성될 수 있다. 본 실시예에서, 세포 주입 도관(30)은 약 100 ㎛의 폭을 가지도록 형성된다.The cell injection conduit 30 can be formed to have a width in the range of 10 to 500 [mu] m depending on the size of the cells to be injected. In this embodiment, the cell injection conduit 30 is formed to have a width of about 100 mu m.

또한, 세포 주입 도관(30)은 장시간 사용에 따른 파손 없이 개폐부(40)의 동작이 원활히 이루어지도록 세포 배양부(20)와 만나는 분기부(33)의 끝단(33a)에서 곡면으로 라운드지게 형성될 수 있다. The cell injection conduit 30 is formed to be rounded to the curved surface at the end 33a of the branching portion 33 that meets the cell culture unit 20 so that the operation of the opening and closing unit 40 can be smoothly performed without breakage due to long- .

이와 같은 구성된 세포 배양액 도관(10), 세포 배양부(20), 틈새부(17) 및 세포 주입 도관(30)은 세포 배양층(6) 내부에 배치된다. 세포 배양층(6)은 도 4 및 도 8과 관련하여 후술하는 바와 같이, PDMS와 같은 얇은 탄성 고분자 재료에 의해 내부에 세포 배양액 도관(10), 세포 배양부(20), 틈새부(17) 및 세포 주입 도관(30)을 내장하도록 형성된다. 도 3은 실제로 제작된 세포 배양층(6)을 찍은 주사전자현미경 사진을 예시한다.The cell culture medium conduit 10, the cell culture section 20, the gap section 17, and the cell injection conduit 30 are arranged inside the cell culture layer 6. The cell culture layer 6 includes a cell culture medium conduit 10, a cell culture section 20, a gap section 17, and a cell culture medium conduit 10 by a thin elastic polymer material such as PDMS, as described later with reference to FIGS. And a cell-injecting conduit 30. FIG. 3 illustrates a scanning electron microscope photograph of a cell culture layer 6 actually produced.

개폐부(40)는 세포 배양부(20)에 연결되는 세포 주입 도관(30)의 분기부(33)에 배치되어 세포 주입 도관(30)을 통한 세포 흐름을 차단하거나 개방하는 개폐밸브(41)를 포함할 수 있다. The opening and closing part 40 is disposed in the branching part 33 of the cell injection conduit 30 connected to the cell culture part 20 and is provided with an opening and closing valve 41 for blocking or opening the cell flow through the cell injection conduit 30 .

개폐밸브(41)는 세포 주입 도관(30)의 분기부(33) 아래에서 분기부(33)와 인접하게 배치된 공기밸브 채널로 구성될 수 있다. 공기밸브 채널은 공급되는 공기압에 의해 팽창하거나 수축하여 세포 주입 도관(30)의 분기부(33)을 변형하는 것에 의해 세포 주입 도관(30)을 통한 세포 흐름을 차단하거나 개방한다. 이를 위해, 공기밸브 채널은 채널 입구(42) 및 채널 출구(43)에 연결된 고무관과 같은 세포주입 도관 연결관들(44)을 통해 외부의 압축공기 소스(도시하지 않음)의 출구와 공기밸브 채널 내의 압축공기의 배출을 제어할 수 있는 배출 제어부(도시하지 않음)와 연결된다. 여기서, 배출 제어부는, 필요에 따라 공기밸브 채널 내의 압축공기의 배출량을 제어할 수 있는 유압 또는 유량제어밸브일 수 있다. 또한, 공기밸브 채널은 공기밸브 채널이 내장되는 후술하는 도관 개폐층(7)의 두께에 따라 다르지만, 0.2 ~ 0.5 MPa 범위의 공기압에 견딜 수 있도록 형성된다.The opening and closing valve 41 may be composed of an air valve channel disposed adjacent to the branching section 33 below the branching section 33 of the cell injection conduit 30. The air valve channel expands or contracts by the supplied air pressure to block or open the cell flow through the cell injection conduit 30 by deforming the branch 33 of the cell injection conduit 30. To this end, the air valve channel is connected to the outlet of an external compressed air source (not shown) through the cell inlet conduit connection tubes 44, such as a rubber tube connected to the channel inlet 42 and the channel outlet 43, (Not shown) capable of controlling the discharge of the compressed air in the discharge chamber. Here, the discharge control section may be a hydraulic or flow control valve capable of controlling the discharge amount of the compressed air in the air valve channel, if necessary. The air valve channel is formed so as to withstand the air pressure in the range of 0.2 to 0.5 MPa, though it depends on the thickness of the duct opening / closing layer 7 in which the air valve channel is built in.

본 실시예에서, 채널 입구(42)와 채널 출구(43)는 세포 배양액 도관(10)의 배양액 도관 입구(11) 및 배양액 도관 출구(12)와 마찬가지로, 0.1 mm 내지 0.5 mm의 직경을 가지도록 형성된다. In this embodiment, the channel inlet 42 and the channel outlet 43 are formed so as to have a diameter of 0.1 mm to 0.5 mm, like the culture liquid inlet 11 and the culture liquid outlet 12 of the cell culture liquid conduit 10 .

공기밸브 채널은 세포 주입 도관(30)의 분기부(33)를 압축 또는 수축시킬 수 있도록 세포 주입 도관(30)의 폭에 대응하는 10 ~ 500 ㎛ 범위의 폭을 가지도록 형성될 수 있다. 본 실시예에서, 공기밸브 채널은 약 100 ㎛의 폭을 가지도록 형성된다.The air valve channel may be formed to have a width in the range of 10 to 500 [mu] m corresponding to the width of the cell injection conduit 30 to compress or contract the branch 33 of the cell injection conduit 30. [ In this embodiment, the air valve channel is formed to have a width of about 100 [mu] m.

이와 같은 구성된 개폐밸브(41)는 도관 개폐층(7) 내에 배치된다. 도관 개폐층(7)은 도 5 및 도 8과 관련하여 후술하는 바와 같이, PDMS와 같은 얇은 탄성 고분자 재료에 의해 내부에 도관 개폐층(7)을 내장하도록 형성된다. The thus constituted on / off valve 41 is disposed in the conduit opening / closing layer 7. The conduit opening / closing layer 7 is formed so as to embed the conduit opening / closing layer 7 therein by a thin elastic polymer material such as PDMS, as described later with reference to Figs. 5 and 8.

도 6에 도시된 바와 같이, 도관 개폐층(7)과 세포 배양층(6)은 함께 접합되어 관류 배양층(5)를 형성한다. 도관 개폐층(7)과 세포 배양층(6)은 모두 탄성 고분자 재료로 형성되므로, 서로 겹쳐 놓은 후 일정 온도, 예를 들면 130℃로 가열하여 완전 경화시키는 것에 의해 서로 접합된다. As shown in FIG. 6, the conduit opening / closing layer 7 and the cell culture layer 6 are joined together to form a perfusion culture layer 5. Since both the conduit opening / closing layer 7 and the cell culture layer 6 are formed of an elastic polymer material, they are bonded to each other by superimposing them on each other and then heating them to a predetermined temperature, for example, 130 ° C to complete curing.

이와 같이 형성된 관류 배양층(5)은 접합층(4)에 의해 지지층(3) 상에 접합되어 지지된다. 지지층(3)은 현미경 슬라이드의 덮개 유리 (cover slip) 또는 슬라이드 유리 (slide glass)와 같은 약 0.01 mm - 1.5 mm의 두께를 갖는 유리기판, 또는 아크릴, 폴리스타이렌, 폴리카아보네이트, 폴리설포네이트 등과 같은 재질의 투명한 플라스틱 기판으로 구성되고, 접합층(4)은 PDMS로 형성될 수 있다. The thus formed perfusion culture layer 5 is bonded and supported on the support layer 3 by the bonding layer 4. The support layer 3 may be a glass substrate having a thickness of about 0.01 mm to 1.5 mm, such as a cover slip of a microscope slide or a slide glass, or an acrylic, polystyrene, polycarbonate, polysulfonate, A transparent plastic substrate of the same material, and the bonding layer 4 may be formed of PDMS.

관류 배양층(5)과 지지층(3)은 도 7에 도시한 바와 같이 지지층(3) 상에 PDMS로 형성된 접합층(4)을 올려 놓은 후 제1 일정 온도, 예를 들면 70℃로 가열하여 반 경화상태로 만든 다음, 관류 배양층(5)을 접합층(4)에 올려 놓고 제2 일정 온도, 예를 들면 130℃로 가열하여 완전 경화시키는 것에 의해 서로 접합될 수 있다.The perfusion culture layer 5 and the support layer 3 are formed by placing a bonding layer 4 formed of PDMS on a supporting layer 3 and heating the same at a first predetermined temperature, Cured state, and then the perfusion culture layer 5 is placed on the bonding layer 4 and heated to a second predetermined temperature, for example, 130 캜 to be completely cured, thereby bonding the two together.

이상에서, 개폐부(40)의 개폐밸브(41)는 공기밸브 채널로 구성된 것으로 예시 및 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 개폐밸브(41)는 세포 주입 도관(30)의 분기부(33) 아래에서 분기부(33)와 인접하게 배치되어 세포 주입 도관(30)을 변형을 유발하여 세포 주입 도관(30)을 통한 세포 유출입을 제어하는 압전소자(도시하지 않음), 또는 세포 주입 도관의 분기부(33)에 배치되어 세포 주입 도관(30)을 통한 세포 유출입을 제어하는 솔레노이드 밸브(도시하지 않음)를 포함할 수 있다. In the above, the opening and closing valve 41 of the opening and closing part 40 is exemplified and configured as an air valve channel, but the present invention is not limited thereto. For example, the opening and closing valve 41 is disposed adjacent to the branching portion 33 below the branching portion 33 of the cell injection conduit 30 to induce deformation of the cell injection conduit 30, Or a solenoid valve (not shown) disposed in the branching portion 33 of the cell injection conduit to control cell inflow and outflow through the cell injection conduit 30 .

또한, 개폐밸브(41)는 세포 주입 도관(30)의 분기부(33) 아래에 배치된 것으로 예시 및 설명하였지만, 세포 주입 도관(30)의 분기부(33) 위에 배치될 수 있다. 이 경우, 내부에 개폐밸브(41)가 내장된 도관 개폐층(7)은 세포 배양층(6) 위에 배치된다. The opening and closing valve 41 may be disposed above the branching portion 33 of the cell injection conduit 30 as illustrated and described as being disposed below the branching portion 33 of the cell injection conduit 30. In this case, the conduit opening / closing layer 7 in which the on-off valve 41 is incorporated is disposed on the cell culture layer 6.

이상과 같이 구성된 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 관류 소자(1)는 세포 주입 도관(30)과 세포 배양부(20)를 독립적으로 분리할 수 있고 필요에 따라 세포 배양부(20)에 대한 세포의 출입을 통제할 수 있는 개폐부(40)를 구비하므로, 세포 배양을 위한 별도 공간의 확보가 가능할 뿐 아니라 세포 배양부의 부피 정의도 가능하다. 따라서, 적은 양의 시약을 사용하여 세포의 반응성을 확인할 수 있고, 그 결과, 새로운 생리활성 저해제나 활성화제의 탐색이 더 용이해 진다. 또한, 생리활성 물질의 영향을 확인하는 실험 시는 세포 배양부(20)에 공급되는 생리활성 물질의 정확한 농도를 쉽게 알 수 있고, 세포 배양액의 조성 변화에 따른 세포의 반응을 확인하는 실험 시는 세포 배양부(20)의 미세 환경을 빠르게 변화시킬 수 있다.The micro-perfusion device 1 according to an embodiment of the present invention configured as described above can independently separate the cell injection conduit 30 and the cell culture unit 20, Since the opening and closing part 40 for controlling the entry and exit of the cells is provided, not only a separate space for cell culture can be secured, but also the volume of the cell culture part can be defined. Therefore, it is possible to confirm the reactivity of cells using a small amount of reagent, and as a result, it becomes easier to search for a new bioactivity inhibitor or activator. In the experiment for confirming the influence of the physiologically active substance, it is easy to know the exact concentration of the physiologically active substance supplied to the cell culture unit 20, and in the experiment for confirming the cell reaction according to the composition change of the cell culture liquid The micro environment of the cell culture unit 20 can be rapidly changed.

또한, 본 발명의 미세 관류 소자(1)는 세포 배양액 도관(10)과 세포 배양부(20) 사이에 세포 배양액과 액상의 생체활성 조절물질은 자유로이 통과할 수 있지만 세포는 통과할 수 없도록 하는 연결 틈(18)을 포함하는 틈새부(17)를 배치하므로, 세포 배양부(20)에서 배양되는 세포가 배양액 또는 액상의 생체활성 조절물질과 함께 세포 배양부(20)로부터 세포 배양액 도관(10)으로 빠져나가는 것을 방지할 수 있고, 이에 따라, 접착성 세포 외에도 부유성 세포까지 미세 배양이 가능하다. 또한, 세포 배양부(20)로 유입되는 배양액의 흐름이 틈새부(17)에 의해 어느 정도 억제되므로, 배양액의 흐름으로 인해 세포에 전단 스트레스가 가해지는 문제점이 해소될 수 있다. In addition, the micro-perfusion device 1 of the present invention is characterized in that the cell culture liquid and the liquid bioactivity regulating material can pass freely between the cell culture liquid conduit 10 and the cell culture section 20, The cells incubated in the cell culture unit 20 are supplied from the cell culture unit 20 to the cell culture liquid conduit 10 together with the culture liquid or the liquid bioactivity control substance, And thus it is possible to carry out micro-cultivation in addition to adherent cells. Further, since the flow of the culture fluid flowing into the cell culture section 20 is suppressed to some extent by the gap section 17, the problem that shear stress is applied to the cells due to the flow of the culture liquid can be solved.

다음으로, 이상과 같이 구성된 본 발명의 미세 관류 소자(1)의 제조방법을 도 4 내지 도 8을 참조하여 상세히 설명하면 다음과 같다. Next, a manufacturing method of the micro-peristaltic device 1 of the present invention constructed as described above will be described in detail with reference to FIGS. 4 to 8. FIG.

먼저, 도 4에 도시된 바와 같이, 세포 배양액 도관(10), 세포 배양부(20), 틈새부(17), 및 세포 주입 도관(30)이 내부에 형성된 세포 배양층(6)이 준비된다(S1). First, as shown in FIG. 4, a cell culture layer 6 in which a cell culture liquid conduit 10, a cell culture section 20, a clearance section 17, and a cell injection conduit 30 are formed is prepared (S1).

보다 상세히 설명하면, 세포 배양층(6)은 다음의 단계로 형성된다. 먼저, 유연광석판기술(soft photolithography)을 사용하여 실리콘 기판으로 세포 배양액 도관(10), 세포 배양부(20), 틈새부(17), 및 세포 주입 도관(30)에 대응하는 문양을 가지는 제1 주형(도시하지 않음)이 제작된다. 이때, 제1 주형은 유연광석판기술을 이용하는 대신, 미세 절삭가공 기술을 이용하여 제작할 수도 있다. 유연광석판기술을 이용할 경우, 세포 주입 도관(30)과 세포 배양부(20)이 만나는 분기부(33)의 끝단(33a)의 곡면 부분의 주형은 다른 부분 보다 유리화 온도가 상대적으로 낮은 광감제를 사용하여 제작할 수 있다. 이어서, 탄성 고분자 재료, 예를 들면, PDMS를 사용하여 제1 주형에 의해 내부에 세포 배양액 도관(10), 세포 배양부(20), 틈새부(17), 및 세포 주입 도관(30)을 가지는 세포 배양층(6)이 성형 형성된다. 형성된 세포 배양층(6)을 일정 시간 방치하여 반 경화시킨 후, 세포 배양층(60)의 세포 배양액 도관(10)과 세포 주입 도관(30)을 각각 외부의 세포 배양액 소스와 세포 소스에 연결하기 위한 연결관들(14, 34)을 고정하는 입구 및 출구들(11, 12; 31, 32)이 주사 바늘 등과 같은 천공기로 뚫는 것에 의해 세포 배양액 도관(10)과 세포 주입 도관(30)의 양단부의 상응하는 위치에 각각 형성된다. More specifically, the cell culture layer 6 is formed by the following steps. First, using soft photolithography, a silicon substrate is immersed in a culture medium having a pattern corresponding to the cell culture liquid conduit 10, the cell culture section 20, the gap section 17, and the cell injection conduit 30 1 mold (not shown) is produced. At this time, instead of using the flexible ore plate technique, the first mold may be manufactured using a fine cutting technique. The mold of the curved portion of the end 33a of the branching portion 33 where the cell injection conduit 30 and the cell culture portion 20 meet is used as a light absorbing material whose vitrification temperature is relatively lower than other portions . ≪ / RTI > Subsequently, the cell culture medium conduit 10, the cell culture section 20, the gap section 17, and the cell injection conduit 30 are provided with the first template using the elastic polymer material, for example, PDMS, The cell culture layer 6 is formed by molding. After the formed cell culture layer 6 is semi-cured by leaving it for a predetermined time, the cell culture liquid conduit 10 and the cell injection conduit 30 of the cell culture layer 60 are connected to the external cell culture source and the cell source, The inlet and outlet ports 11 and 12 and 31 and 32 for fixing the connection tubes 14 and 34 for the cell culture liquid conduit 10 and the cell injection conduit 30 are pierced by a perforator such as an injection needle, Respectively.

다음으로, 도 5에 도시된 바와 같이, 세포 주입 도관(30)을 개폐하는 개폐부(17)가 내부에 형성된 도관 개폐층(7)이 준비된다(S2).Next, as shown in FIG. 5, a conduit opening / closing layer 7 having an opening / closing portion 17 for opening / closing the cell injection conduit 30 is prepared (S2).

보다 상세히 설명하면, 도관 개폐층(7)은 다음의 단계로 형성된다. 먼저, 세포 배양층(6)과 마찬가지로, 유연광석판기술을 사용하여 실리콘 기판으로 개폐밸브(41)에 대응하는 문양을 가지는 제2 주형(도시하지 않음)이 제작된다. 이어서, 탄성 고분자 재료, 예를 들면, PDMS를 사용하여 제2 주형에 의해 내부에 개폐밸브(41)를 가지는 도관 개폐층(7)이 성형 형성된다. 그 다음, 형성된 도관 개폐층(7)을 일정 시간 방치하여 반 경화시킨 후 개폐밸브(41)의 공기밸브 채널을 외부의 압축공기 소스와 배출제어부와 연결하기 위한 연결관(44)을 고정하는 입구 및 출구(42, 43)가 주사 바늘 등과 같은 천공기로 뚫는 것에 의해 형성된다. More specifically, the conduit opening / closing layer 7 is formed in the following steps. First, as in the cell culture layer 6, a second mold (not shown) having a pattern corresponding to the opening / closing valve 41 is fabricated from a silicon substrate by using a flexible ore plate technique. Then, a duct opening / closing layer 7 having an on-off valve 41 is formed by a second mold using an elastic polymer material, for example, PDMS. Thereafter, the formed conduit opening / closing layer 7 is allowed to stand for a predetermined time to be semi-cured. Thereafter, an inlet for fixing the connecting pipe 44 for connecting the air valve channel of the opening / closing valve 41 to the outside compressed air source and the discharge controlling section And the outlets 42 and 43 are pierced by a perforator such as a needle or the like.

그 다음, 도 6에 도시된 바와 같이, 준비된 세포 배양층(6)과 도관 개폐층(7)은 서로 접합되어 관류 배양층(5)이 형성된다(S3). 이때, 도관 개폐층(7)과 세포 배양층(6)은 서로 겹쳐 놓은 후 일정 온도, 예를 들면 130℃로 가열하여 완전 경화시키는 것에 의해 서로 접합된다. Next, as shown in FIG. 6, the prepared cell culture layer 6 and the conduit opening / closing layer 7 are bonded to each other to form a perfusion culture layer 5 (S3). At this time, the conduit opening / closing layer 7 and the cell culture layer 6 are bonded to each other by superimposing them on each other and then heating them to a constant temperature, for example, 130 DEG C to complete curing.

관류 배양층(5)은 접합층(4)에 의해 지지층(3) 상에 접합된다(S4). 보다 상세히 설명하면, 관류 배양층(5)과 지지층(3)은 도 7에 도시된 바와 같이 지지층(3) 상에 PDMS로 형성된 접합층(4)을 올려 놓은 후 제1 일정 온도, 예를 들면 70℃로 가열하여 반 경화상태로 만든 다음, 관류 배양층(5)을 접합층(4)에 올려 놓고 제2 일정 온도, 예를 들면 130℃로 가열하여 완전 경화시키는 것에 의해 서로 접합된다. The perfusion culture layer 5 is bonded onto the support layer 3 by the bonding layer 4 (S4). More specifically, the perfusion culture layer 5 and the support layer 3 are formed by placing a bonding layer 4 formed of PDMS on a support layer 3 as shown in Fig. 7, Cured by heating at 70 ° C, and then the perfusion culture layer 5 is placed on the bonding layer 4 and heated to a second predetermined temperature, for example, 130 ° C to be completely cured.

본 출원인은 본 발명의 미세 관류 소자(1)의 제조방법을 사용하여 미세 관류 소자(1)를 다음과 같이 실제로 제작하였다. The Applicant has actually manufactured the microfluidic device 1 using the manufacturing method of the microfluidic device 1 of the present invention as follows.

[예 1] [Example 1]

미세 관류 소자는 유리기판 위에 각 미세도관을 갖는 PDMS 층을 접착하여 제작하였다. 먼저, 광식각법으로 실리콘 기판으로 도 1 및 도 2에 도시된 세포 배양액 도관(10), 세포 배양부(20), 지지기둥(19)이 없는 연결 틈(18), 세포 주입 도관(30) 및 세포 배양액 도관(10)의 분기부(33)에 대응하는 문양을 가지는 주형을 만들었다. 즉, SU8-2 감광제로 실리콘 기판에 2 ㎛ 높이의 연결 틈(18)에 대응하는 문양을 만들고, 그 위에 희석된 SU8-50 감광제로 약 25 ㎛ 높이의 세포 배양액 도관(10), 세포 배양부(20), 및 세포 주입 도관(30)에 대응하는 문양을 제작하였다. 다시, 그 위에 세포 배양액 도관(10)의 분기부(33)를 AZ4650 감광제로 제작하였다. 이와 같은 다층 문양 구조를 갖는 실리콘 기판을 약 135℃에서 열처리하여 직각 모양의 AZ4650 문양을 곡면으로 바꾸었다. 따라서, 세포 배양액 도관(10), 세포 배양부(20), 지지기둥(19)이 없는 연결 틈(19), 세포 주입 도관(30) 및 세포 배양액 도관(10)의 분기부(33)의 문양을 찍어낼 수 있는 한 개의 실리콘 기판 주형을 완성하였다. 다른 한 개의 실리콘 기판으로 도 1 및 도 2에 도시된 개폐부(40)를 위한 주형을 높이 약 10 ㎛로 제작하였다. 10:1로 섞은 미합중국 다우 코닝사(Dow Corning, USA) 제품의 PDMS를 이용하여 첫 번째 주형에 의해 약 5 mm의 PDMS 세포 배양층을 만들었다. 중간정도 경화시킨 후, 22G 주사바늘로 각 도관에 고무관을 연결할 수 있도록 입구 및 출구용 구멍을 뚫었다. 개폐부(40)를 위한 주형에 의해서는 20:1로 섞은 미합중국 다우 코닝사 제품의 PDMS를 이용하여 약 25 ㎛의 PDMS 도관 개폐층을 만들었다. 마찬가지로, 중간정도 경화시킨 후, PDMS 도관 개폐층에 주사바늘로 고무관과 연결할 구멍을 뚫었다. PDMS 도관 개폐층에 첫 번째 만든 5 mm PDMS 세포 배양층을 올려놓고 130 ℃에서 완전히 경화시켜 접착하여 PDMS 관류 배양층을 형성하였다. 이 PDMS 관류 배양층을 반쯤 경화된 얇은 PDMS 층이 있는 유리기판 위에 올려놓고 다시 130℃로 가열하여 완전히 경화시켰다. 각 구멍에 고무관을 연결하여 도 9에 도시된 것과 같은 지지기둥이 없는 미세 관류 소자를 완성하였다.The microfluidic device was fabricated by adhering a PDMS layer having fine conduits on a glass substrate. First, the cell culture liquid conduit 10, the cell culture section 20, the connection gap 18 without the support pillars 19, the cell injection conduit 30, A mold having a pattern corresponding to the branching portion 33 of the cell culture liquid conduit 10 was made. That is, a pattern corresponding to the connection gap 18 of 2 탆 height was made on the silicon substrate with the SU8-2 photosensitizer, and a cell culture liquid conduit 10 having a height of about 25 탆 with the diluted SU8-50 photosensitizer, (20), and a cell injection conduit (30). Again, the branched portion 33 of the cell culture liquid conduit 10 was made of AZ4650 photosensitizer. The silicon substrate having such a multi-layer pattern structure was heat-treated at about 135 ° C to convert the rectangular-shaped AZ4650 pattern into a curved surface. Therefore, the pattern of the cell culture liquid conduit 10, the cell culture section 20, the connection gap 19 without the support pillars 19, the cell injection conduit 30, and the branching section 33 of the cell culture liquid conduit 10 A silicon substrate mold was prepared. A mold for the opening and closing part 40 shown in Figs. 1 and 2 was fabricated to have a height of about 10 mu m with another silicon substrate. A PDMS cell culture layer of about 5 mm was made by the first template using PDMS from Dow Corning (USA), a 10: 1 mixture. After a medium cure, the inlet and outlet holes were drilled to connect the rubber tubing to each conduit with a 22G needle. A PDMS conduit opening / closing layer of about 25 탆 was made using the PDMS of Dow Corning Incorporated, USA, mixed at a ratio of 20: 1 by the mold for the opening / closing part 40. Likewise, after the medium hardening, a hole was drilled in the PDMS conduit opening / closing layer to be connected to the rubber tube with an injection needle. The first 5 mm PDMS cell culture layer was placed on the PDMS conduit opening layer and completely cured at 130 ° C to adhere to form a PDMS perfusion culture layer. This PDMS perfusion culture layer was placed on a glass substrate with a semi-cured thin PDMS layer and heated again to 130 ° C to fully cure. And a rubber tube was connected to each hole to complete a microporous membrane element having no support column as shown in Fig.

[예 2][Example 2]

도 1 및 도 2의 세포 배양액 도관(10), 세포 배양부(20), 틈새부(17)의 연결틈(18)/지지기둥(19), 세포 주입 도관(30) 및 세포 배양액 도관(10)의 분기부(33)의 문양을 찍어내는 실리콘 기판 주형에 PDMS를 부어 굳힌 다음, PDMS 세포 배양층을 떼어 금 박막을 입힌 다음, 주사전자현미경으로 세부 구조를 확인하였다(도 10 참조). 지지기둥(19)은 볼록한 낮은 원주로 만들어 졌다. 지지기둥(19) 사이의 공간은 연결 틈(18)이 되었다. 이 연결 틈(18)의 깊이는 약 2 ㎛이며 세포 배양액 도관(10)과 세포 배양부(20)를 물리적으로 연결하는 통로가 된다. 개폐부(40)와 세포 주입 도관(30)이 겹치는 세포 주입 도관(30)의 분기부(33)는 세포 배양부(20)의 입구이며, 곡면으로 제작하였다.The cell culture liquid conduit 10, the cell culture section 20, the connection gap 18 / support column 19 of the clearance section 17, the cell injection conduit 30, and the cell culture liquid conduit 10 The PDMS cell culture layer was peeled off and a gold thin film was formed thereon. Then, a detailed structure was confirmed by a scanning electron microscope (see FIG. 10). The support column 19 is made of a convex lower circumference. The space between the support pillars (19) became the connection gap (18). The depth of the connection gap 18 is about 2 탆, which is a path for physically connecting the cell culture liquid conduit 10 and the cell culture section 20. The branched portion 33 of the cell injection conduit 30 in which the opening and closing unit 40 and the cell injection conduit 30 overlap overlaps the entrance of the cell culture unit 20 and is formed as a curved surface.

또한, 본 출원인은 본 발명의 미세 관류 소자(1)를 사용하여 다음과 같이 실제로 세포를 배양하는 실험믈 하였다. In addition, the Applicant has experimented to actually cultivate cells using the microfluidic device 1 of the present invention as follows.

[실험예 1][Experimental Example 1]

상기 예 1에 따라 미세 관류 소자를 제작하고, 이 미세 관류 소자에 단세포 녹조류 클라미도모나스를 주입하고 그 성장을 관찰하였다. TAP 배지(D.S. Gorman과 R.P. Levine (1965) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 54, 1665-1669)로 클라미도모나스를 배양하였다. 개폐밸브의 공기밸브 채널에 약 0.1 MPa의 압력을 가하여, 세포 주입 도관과 세포 배양부의 연결을 차단한 다음, 공기밸브 채널에 고무관으로 연결된 1 mL 주사기를 이용하여 클라미도모나스를 세포 주입 도관으로 주입하였다. 그 외의 공간은 세포 배양액 도관에 TAP 배지를 주입하였다. 공기밸브 채널의 압력을 완화하여 세포 주입 도관을 열어 일정수의 클라미도모나스 세포를 세포 배양부에 주입하고, 다시 공기밸브 채널에 압력을 가하여 세포 주입 도관을 닫았다. 세포 배양액 도관에 TAP 배지를 1μL/min의 유속으로 흘려주며, 클라미도모나스를 배양하였다. 일정 시간 간격으로 사진을 찍어 그 성장정도를 확인하였다. 도 11에 도시된 바와 같이, 처음 40시간 동안 클라미도모나스 세포수는 크게 늘지 않았으나, 그 후 60 시간에는 배양된 세포에 의해 미세 배양부 공간의 반 정도를 채웠다. 마지막으로 80 시간 후에는 세포 배양부는 클라미도모나스로 꽉 찼다. 세포 배양액 도관으로부터 새로운 배지가 연결 틈(도 1의 18)을 통해 계속 세포 배양부로 유입되므로 클라미도모나스 세포의 성장에 필요한 영양분이 충분히 공급되었다. A microfluidic device was prepared according to Example 1, and a single cell green algae clamidomonas was injected into the microfluidic device, and the growth was observed. Clamidomonas were cultured in TAP medium (D.S. Gorman and R.P. Levine (1965) Proc. Natl. Acad Sci. USA 54, 1665-1669). After applying a pressure of about 0.1 MPa to the air valve channel of the opening / closing valve, the connection between the cell injection conduit and the cell culture section is cut off, and then the clamidomonas is injected into the cell injection conduit using a 1 mL syringe connected to the air valve channel by a rubber tube Respectively. The other space was filled with TAP medium in cell culture fluid conduit. The pressure of the air valve channel was relaxed to open the cell infusion catheter, and a certain number of the clamidomonas cells were injected into the cell culture section, and the cell infusion catheter was closed by applying pressure to the air valve channel again. The TAP medium was flowed into the cell culture fluid conduit at a flow rate of 1 μL / min, and the clamidomonas was cultured. The photographs were taken at regular intervals and their growth was confirmed. As shown in Fig. 11, the number of the clamidomonas cells did not increase greatly during the first 40 hours, but then filled up to half of the microfabrication space by the cultured cells at 60 hours. Finally, after 80 hours, the cell culture was filled with clamidomonas. Fresh medium from the cell culture fluid conduit was continuously introduced into the cell culture section through the connection gap (18 in FIG. 1), so that the nutrients necessary for the growth of the clamidomonas cells were sufficiently supplied.

[실험예 2][Experimental Example 2]

세포 배양액 도관을 제외한 부분을 상기 예 1에 따라 미세 관류 소자를 제작하고, 세포 배양액 도관으로부터 세포 배양부로 물질의 이동 속도를 조사하였다(도 12 참조). 미세 관류 소자는 이동 속도를 빠르게 하기 위해 세포 배양부 둘레에 비대칭적 세포 배양액 도관을 배치하여, 세포 배양액 도관의 굴곡부의 유입부와 유출부 사이에 압력차가 생기도록 하였다. 즉, 유입부의 폭을 30 ㎛로 하고 유출부의 너비를 90 ㎛로 제작하였다. 전 공간을 증류수로 채운 다음, 개폐부의 공기밸브 채널에 0.1 MPa의 기압을 가하여 세포 배양부와 세포 주입 도관 사이를 차단하고, 주사기를 이용하여, 도 12에 삽입된 그림의 왼쪽에서 오른쪽으로 증류수를 1 μL/min의 유속으로 주입하였다. 일정시간 경과 후 주입액을 형광물질 플루오르세인(fluorescein)이 든 증류수로 교체하고, 형광현미경사진을 일정시간 간격으로 찍었다. 저장한 형광사진의 배양액 도관부와 세포 미세 배양부의 형광세기를 시간에 따라 도 12의 그래프로 나타냈다. 두 부분의 시간에 따른 형광세기는 큰 차이가 없었다. 따라서, 이 미세 관류 소자를 사용하면, 세포 배양액 도관에 주입되는 배양액 조성을 바꾸는 것에 의해 세포 배양부의 조성을 시간 지체 없이 바로 조절할 수 있음이 확인되었다.Parts other than the cell culture liquid conduit were prepared according to the above Example 1, and the moving speed of the substance from the cell culture liquid conduit to the cell culture portion was examined (see FIG. 12). Asymmetric cell culture fluid conduits were placed around the cell culture section to increase the speed of movement of the microfluidic device so that there was a pressure difference between the inflow and outflow of the bend of the cell culture fluid conduit. That is, the width of the inflow portion was set to 30 μm and the width of the outflow portion was set to 90 μm. After the entire space was filled with distilled water, a pressure of 0.1 MPa was applied to the air valve channel of the opening and closing part to block the cell culture part and the cell injection conduit. Using a syringe, distilled water At a flow rate of 1 μL / min. After a certain period of time, the injection solution was replaced with distilled water containing fluorescein, and fluorescence microscopic photographs were taken at regular intervals. Fluorescence intensities of the cultured liquid portion of the stored fluorescence photograph and the cell micro-culture portion are shown in the graph of FIG. 12 as a function of time. There was no significant difference in the intensity of fluorescence between the two portions. Therefore, it was confirmed that, by using this microfluidic device, the composition of the cell culture portion can be controlled immediately without time delay by changing the composition of the culture fluid injected into the cell culture fluid conduit.

[실험예 3][Experimental Example 3]

상기 예 1에 따라 미세 관류 소자를 제작하고, 세포 배양액 조성에 따른 세포 미세 배양부에 주입한 세포의 반응을 조사하였다. 인공해수 배지(C.S. Weldy와 M. Huesemann (2008) J. Undergrad. Res. 115-122)로 해양 단세포 녹조류인 두날리엘라를 배양하였다. 개폐부의 공기밸브 채널에 약 0.1 MPa의 압력을 가하여, 세포 주입 도관과 세포 배양부의 연결을 차단한 다음, 세포 주입 도관에 고무관으로 연결된 1 mL 주사기를 이용하여 두날리엘라를 세포 주입 도관에 주입하였다. 그 외의 공간은 세포 배양액 도관를 통하여 인공해수 배지를 주사기로 주입하였다. 공기밸브 채널의 압력을 완화하여 세포 주입 도관을 열어 일정수의 두날리엘라 세포를 세포 배양부에 주입하고, 다시 공기밸브 채널에 압력을 가하여 공기밸브 채널을 닫았다. 세포 배양액 도관에 인공해수 배지를 0.5 μL/min의 유속으로 흘려주며, 두날리엘라를 배양하였다. 세포 배양액의 조성 변화에 따른 세포의 반응을 관찰하기 위하여 일정 시간 간격으로 사진을 찍었다. 일정 시간 경과후 4 M 염화나트륨을 함유하는 인공해수 배지를 세포 배양액 도관에 흘려주면서 세포의 반응을 관찰하였다. 세포 배양액 도관의 배양액이 등장액에서 고장액으로 바뀌면서, 두날리엘라 세포의 한쪽 끝은 녹색의 작은 구로 변하고, 다른 반대편은 옅은 색을 띄면서 뾰족하게 바뀌어, 전체 모양은 발아하는 씨앗모양이 되었다. 이러한 변화는 도 13에 도시된 바와 같이 2분 사이에 관찰되었으며, 세포 배양액 도관의 염류 농도가 고장액 주입에 따라 높아지면서 세포 미세 배양부의 염류 농도가 높아지고, 이에 따라, 두날리엘라 세포의 탈수 현상으로 생겼다.Microfluidic devices were fabricated according to the above Example 1, and the reaction of cells injected into the cell microflora according to the cell culture composition was examined. Dawnaliella, a marine unicellular green alga, was cultured in artificial seawater medium (C.S. Weldy and M. Huesemann (2008) J. Undergrad. Res. 115-122). A pressure of about 0.1 MPa was applied to the air valve channel of the opening and closing part to cut off the connection between the cell-injecting duct and the cell culture part, and then the Dna nullella was injected into the cell-injecting duct using a 1 mL syringe connected to the cell- . The other space was injected into the syringe through an artificial seawater culture medium through a cell culture fluid conduit. The pressure of the air valve channel was relaxed to open the cell infusion catheter to inject a certain number of double null cells into the cell culture section, and then the air valve channel was closed by applying pressure to the air valve channel again. The artificial seawater culture was flowed into the cell culture fluid conduit at a flow rate of 0.5 μL / min, and the dNaliella cells were cultured. Photographs were taken at regular intervals to observe the cell response to changes in the composition of the cell culture medium. After a certain period of time, an artificial seawater culture medium containing 4 M sodium chloride was poured into the cell culture liquid conduit and the cell response was observed. As the culture medium of the cell culture fluid conduit was changed from isotonic solution to hypertonic solution, one end of the Dnaliella cell was transformed into a green small sphere and the other side was changed to a pointed shape with a light color, and the whole shape became a germinating seed shape. This change was observed within 2 minutes as shown in FIG. 13, and the concentration of salt in the cell culture fluid conduit increased with the injection of the hypertonic solution, so that the salt concentration in the cell microculture was increased, Respectively.

이상에서, 본 발명은 원리를 예시하기 위한 실시예와 관련하여 설명하고 도시하였으나, 본 발명은 그와 같이 도시되고 설명된 구성 및 작용으로 한정되지 않는다. 또, 첨부된 특허청구범위의 사상 및 범주를 벗어 나지 않고 본 발명에 대한 다양한 변경과 수정이 가능함은 당업자들에게는 잘 이해될 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명에 대한 모든 적절한 변경 및 수정과 균등물들도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 간주 되어야 할 것이다.While the present invention has been described with reference to exemplary embodiments, it is to be understood that the invention is not limited to the disclosed exemplary embodiments. It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made in the present invention without departing from the spirit or scope of the appended claims. It is therefore intended that all reasonable modifications and equivalents to the present invention be within the scope of the present invention.

1: 관류 배양 소자 3: 지지층
4: 접합층 5: 관류 배양층
6: 세포 배양층 7: 도관 걔폐층
10: 세포 배양액 도관 17: 틈새부
18: 연결 틈 19: 지지기둥
20: 세포 배양부
30: 세포 주입 도관 40: 개폐부
41: 개폐밸브1: Perfusion culture element 3: Support layer
4: Bonding layer 5: Perfusion culture layer
6: cell culture layer 7: catheter poultice layer
10: cell culture liquid conduit 17:
18: connection gap 19: supporting column
20: cell culture unit
30: cell injection conduit 40: opening / closing part
41: opening / closing valve

Claims (14)

외부로부터 세포 배양액을 공급하는 세포 배양액 도관;
상기 세포 배양액 도관과 연결되고 상기 세포 배양액 도관으로부터 공급되는 상기 세포 배양액에 의해 세포를 배양하는 세포 배양부;
상기 세포 배양부와 연결되고 상기 세포 배양부에 세포를 주입하는 세포 주입 도관; 및
상기 세포 배양부와 상기 세포 주입 도관을 분리하도록 상기 세포 주입 도관을 개폐하는 개폐부를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세 관류 소자. A cell culture fluid conduit for supplying a cell culture fluid from the outside;
A cell culture unit connected to the cell culture liquid conduit and cultured by the cell culture liquid supplied from the cell culture liquid conduit;
A cell injection conduit connected to the cell culture unit and injecting cells into the cell culture unit; And
And an opening and closing portion for opening and closing the cell injection conduit to separate the cell culture section and the cell injection conduit. 제 1항에 있어서,
상기 세포 배양액 도관과 상기 세포 배양부 사이를 연결하고 상기 세포 배양액과 액상의 생체활성 조절물질은 자유로이 통과할 수 있지만 상기 세포는 통과할 수 없는 연결 틈을 포함하는 틈새부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 미세 관류 소자. The method of claim 1,
The cell culture conduit is connected between the conduit and the cell culture, and the cell culture medium and the liquid bioactive regulator further comprises a gap including a connection gap that can pass freely, but the cell cannot pass through. Microperfusion element. 제 2항에 있어서,
상기 연결 틈은 1 ~ 100 ㎛ 범위의 높이를 가지도록 형성되는 것을 특징으로 하는 미세 관류 소자. 3. The method of claim 2,
Wherein the connection gap is formed to have a height ranging from 1 to 100 mu m. 제2항에 있어서,
상기 틈새부는 상기 연결 틈 내에 일정 간격을 두고 배치된 복수 개의 지지기둥을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 미세 관류 소자. 3. The method of claim 2,
The clearance part further comprises a plurality of support pillars disposed at regular intervals in the connection gap. 제1항에 있어서,
상기 개폐부는 상기 세포 배양부와 연결되는 상기 세포 주입 도관의 부분에 배치되어 상기 세포 주입 도관을 통한 세포 흐름을 차단하거나 개방하는 개폐밸브를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세 관류 소자. The method of claim 1,
Wherein the opening / closing part is disposed at a part of the cell injection conduit connected to the cell culture part, and opens / closes the cell flow through the cell injection conduit. 제 5항에 있어서,
상기 개폐밸브는 상기 세포 주입 도관의 상기 부분에 인접하게 배치되고 외부로부터 공급되는 공기압에 의해 팽창하거나 수축하여 상기 세포 주입 도관을 통한 세포 흐름을 차단하거나 개방하는 공기밸브 채널과, 상기 세포 주입 도관의 상기 부분에 인접하게 배치되고 상기 세포 주입 도관을 변형을 유발하는 압전소자와, 상기 세포 주입 도관의 상기 부분에 배치되고 상기 세포 주입 도관을 개폐하는 솔레노이드 밸브 중에서 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세 관류 소자. 6. The method of claim 5,
Wherein the open / close valve comprises an air valve channel disposed adjacent to the portion of the cell injection conduit and expanding or contracting due to the air pressure supplied from the outside to block or open the cell flow through the cell injection conduit, A piezoelectric element disposed adjacent to the portion and causing deformation of the cell injection conduit and a solenoid valve disposed in the portion of the cell injection conduit and opening and closing the cell injection conduit. device. 지지층;
상기 지지층 위에 배치되고, 세포 배양액을 공급하는 세포 배양액 도관, 상기 세포 배양액 도관으로부터 공급되는 상기 세포 배양액에 의해 세포를 배양하는 세포 배양부, 및 상기 세포 배양부에 세포를 주입하는 세포 주입 도관이 내부에 형성된 세포 배양층과, 상기 세포 주입 도관을 개폐하는 개폐부가 내부에 형성된 도관 개폐층을 포함하는 관류 배양층; 및
상기 관류 배양층을 상기 지지층에 접합하는 접합층을 포함하는 것을 특징으로 하는 미세 관류 소자. Supporting layer;
A cell culture liquid conduit disposed on the support layer for supplying a cell culture liquid, a cell culture section for culturing the cells by the cell culture liquid supplied from the cell culture liquid conduit, and a cell injection conduit for injecting cells into the cell culture section, And a conduit opening / closing layer in which an opening / closing part for opening / closing the cell injection conduit is formed; And
And a bonding layer bonding the perfusion culture layer to the support layer. 제7항에 있어서,
상기 지지층은 유리기판 또는 투명한 플라스틱 기판을 포함하는 것을 특징으로 하는 미세 관류 소자. The method of claim 7, wherein
Wherein the support layer comprises a glass substrate or a transparent plastic substrate. 제 7항에 있어서,
상기 세포 배양층은 상기 세포 배양액 도관과 상기 세포 배양부 사이를 연결하고 상기 세포 배양액과 액상의 생체활성 조절물질은 자유로이 통과할 수 있지만 세포는 통과할 수 없는 연결 틈을 포함하는 틈새부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 미세 관류 소자. 8. The method of claim 7,
The cell culture layer further comprises a gap that connects between the cell culture conduit and the cell culture part and includes a connection gap through which the cell culture fluid and the liquid bioactive regulator can pass freely, but not through the cell. Microperfusion element, characterized in that. 제 9항에 있어서,
상기 틈새부는 상기 연결 틈 내에 일정 간격을 두고 배치된 복수 개의 지지기둥을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 미세 관류 소자. The method of claim 9,
The clearance part further comprises a plurality of support pillars disposed at regular intervals in the connection gap. 제7항에 있어서,
상기 세포 배양층, 상기 도관 개폐층, 및 상기 접합층은 탄성 고분자 재료로 형성되는 것을 특징으로 하는 미세 관류 소자. The method of claim 7, wherein
Wherein the cell culture layer, the conduit opening and closing layer, and the bonding layer are formed of an elastic polymeric material. 세포 배양액을 공급하는 세포 배양액 도관, 상기 세포 배양액 도관으로부터 공급되는 세포 배양액에 의해 세포를 배양하는 세포 배양부, 및 상기 세포 배양부에 세포를 주입하는 세포 주입 도관이 내부에 형성된 세포 배양층을 준비하는 단계;
상기 세포 주입 도관을 개폐하는 개폐부가 내부에 형성된 도관 개폐층을 준비하는 단계; 및
상기 세포 배양층과 상기 도관 개폐층을 접합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세 관류 소자의 제조방법. A cell culture fluid conduit for supplying a cell culture fluid, a cell culture section for culturing cells by a cell culture fluid supplied from the cell culture fluid conduit, and a cell culture layer in which a cell injection conduit for injecting cells into the cell culture section is prepared ;
Preparing a conduit opening / closing layer in which an opening / closing part for opening / closing the cell injection conduit is formed; And
Method for producing a micro-perfusion element, comprising the step of bonding the cell culture layer and the conduit opening and closing layer. 제 12항에 있어서,
상기 세포 배양층은 상기 세포 배양액 도관과 상기 세포 배양부 사이를 연결하고 상기 세포 배양액과 액상의 생체활성 조절물질은 자유로이 통과할 수 있지만 상기 세포는 통과할 수 없는 연결 틈을 포함하는 틈새부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 미세 관류 소자의 제조방법. 13. The method of claim 12,
The cell culture layer further comprises a gap connecting the cell culture conduit and the cell culture part and including a connection gap through which the cell culture fluid and the liquid bioactive regulator can pass freely but the cell cannot pass therethrough. Method for producing a micro-perfusion element, characterized in that. 제 12항에 있어서,
상기 접합된 세포 배양층과 도관 개폐층을 지지층 상에 접합시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 미세 관류 소자의 제조방법. 13. The method of claim 12,
And bonding the cell culture layer and the conduit opening / closing layer on the supporting layer.
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