KR20130100908A - 항체 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항-약물 항체의 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 치료적 항체 치료를 겪는 환자의 모니터링 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 상기 방법의 실행에 적합한 키트에 관한 것이다.

Description

항체 검출 방법{METHODS FOR DETECTING ANTIBODIES}
본 발명은 항-약물 항체의 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 치료적 항체 치료를 겪는 환자의 모니터링 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 상기 방법의 실행에 적합한 키트에 관한 것이다.
치료적 항체는 면역학적 장애, 염증성 장애, 암 또는 감염성 질환과 같은 다양한 장애의 치료에 점점 더 사용된다. 상기 치료적 항체는 전형적으로 다양한 종으로부터 유래된 단일클론 항체, 또는 키메라성 또는 인간화 항체이다(예를 들어, Levene et al., 2005, J. Royal Soc. Med. 98, pp 145-152 참조). 질환에 따라, 하기 뚜렷한 표적 항원에 대항하는 치료적 항체가 사용되었다: 예를 들어, TNFα, VEGF, HER2, CD20, IGF-I 수용체, EGFR, 또는 IL-6 수용체.
항-TNFα 치료적 항체는 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 크론 질환 또는 강직성 척추염을 포함하는 다양한 염증성 또는 자가면역 질환 환자를 치료하는데 널리 사용된다. 이러한 항-TNFα 제제의 예에는 에타네르셉트, 골리무마브, 세르톨리주마브 페골, 아달리무마브, 또는 인플릭시마브가 포함된다. 에타네르셉트는 유형 1 인간 면역글로불린(IgG1)의 Fc 절편에 연결된, 인간 p75 TNFα 수용체의 2개의 세포외 도메인으로 이루어진 이량체성 융합 단백질이다. 골리무마브는 인간 항-TNFα 단일클론 항체이다. 세르톨리주마브 페골은 단일클론 항체, 더욱 정확하게는 인간화 항-TNFα 단일클론 항체의 PEG-화 Fab' 절편이다. 아달리무마브는 인간화 항-TNFα 단일클론 항체이고, 인플릭시마브는 키메라성 항-TNFα 단일클론 항체이다(Perdriger A, Infliximab in the treatment of rheumatoid arthritis. Biologics: Targets & Therapy 2009:3 183-191). 상기 항체는 TNFα에 결합하고 이의 염증 작용을 차단한다.
치료적 항체의 추가 예에는 제한 없이 WO2004/096274에 기재된 항-IL-6R 단일클론 항체 및 예를 들어 WO2005/005635에 기재된 항-IGF-IR 항체가 포함된다.
치료적 항체로의 치료 동안, 그러나, 치료적 항체 그 자체에 대항하는 면역 반응이 상승될 수 있고, 환자는 종종 치료 과정 동안 약물 그 자체("항-약물 항체")에 대항하는 항체를 발달시킨다. 그 결과, 치료적 항체의 혈장 속도가 감소되고 동시에 또는 이어서, 질환 증상이 재발하거나 증가한다. 상기 항-약물 항체("ADA")는 그러므로 치료적 항체의 효과를 감소시키거나 전적으로 중화시킨다 (예를 들어, Wolbink GJ, et al. Development of Anti-Inflximab antibodies and relationship to clinical response in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatism, 2006 54(3): 711-715; G.M. Bartelds, et al. High levels of human antibodies to adalimumab in a patient not responding to adalimumab treatment. Anna Rheum Dis 2006;65:1249-1250 참조). 대상으로부터의 샘플에서 상기 ADA의 검출은 그러므로 치료 과정 동안 환자를 모니터링하는 방법을 나타낼 수 있다.
ADA의 검출 방법은 당업계에, 예를 들어 WO2008/137885, WO2007/101661, 또는 WO2009/091240에 보고되어 있다. 상기 출원에 언급된 방법은 포획 및 라벨 항체를 사용하는 면역학적 방법이다. ADA 측정과 관련된 추가의 방법 및 추천은 문헌 (Anthony R. Mire-Sluis, et al., Journal of Immunological Methods, 333 (2008) 1-9; Eugen Koren, et al., Journal of Immunological Methods, 289 (2004) 1-16)에 보고되어 있다. Wolbink et al(Arthritis & Rheumatism 54 (2006) 711-715)이 또한 류마티스 관절염 환자에서 항-인플릭시마브 항체의 임상적 타당성을 논의한다. 상기 방법 중 어느 것도 동시에 ADA 및 관련 항원을 평가하는 것을 제안하지 않는다. 상기 방법 중 어느 것도 다양한 파라미터의 조합된 측정의 타당성을 인정하지 않는다.
Patton et al(J. Immunol. Methods 304 (2005) 189-195)은 단백질에 대항하는 항체를 검출하기 위한 ELISA 방법에 관한 것이다.
본 발명은 ADA의 검출 및 치료적 항체 치료를 겪는 환자의 모니터링의 개선된 방법에 관한 것이다.
본 발명은 항-약물 항체의 개선된 면역학적 검출 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 치료적 항체 치료를 겪는 환자의 모니터링 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 상기 방법의 실행에 적합한 키트에 관한 것이다.
더욱 구체적으로는, 본 발명의 목적은 하기 단계를 포함하는 샘플 내(인 비트로) 항-약물 항체(Anti-Drug Antibody: ADA)(의 존재 또는 양)의 면역-검출 방법으로서, 약물이 표적 항원에 대항하는 치료적 항체인 방법에 관한 것이다:
a) 샘플 내 항원의 존재를 입증하는 단계;
b) 존재하는 경우, 샘플 내 항원을 중화시키는 단계; 및
c) 상기 샘플 내 상기 ADA(의 존재 또는 양)를 면역-검출하는 단계.
본 출원인은 샘플 중의 항원의 존재가 상응하는 ADA를 검출하는 능력을 상당히 저해한다는 것을 발견하였다. 따라서, 이러한 이전 중화 단계가 없으면, 샘플 중의 ADA의 신뢰성 있는 검출이 수득될 수 없다.
본 발명의 추가의 목적은 하기 단계를 포함하는 샘플 내(인 비트로) 항-약물 항체(ADA)의 면역-검출 방법으로서, 약물이 표적 항원에 대항하는 치료적 항체인 방법이다:
a) 존재할 수 있는 항원을 중화하기 위해 샘플을 처리하는 단계; 및
b) 상기 샘플 중의 상기 ADA의 존재 또는 양을 면역-검출하는 단계.
본 발명은 또한 환자 프로파일을 수득하기 위해 환자로부터의 샘플에서, 하기의 존재 또는 양을 측정하는 것을 포함하며, 환자 프로파일이 치료에 대한 반응성을 나타내는, 치료적 항체 치료에 대한 환자의 반응성 검출 방법으로서, 치료적 항체가 표적 항원에 대항하는 방법에 관한 것이다:
- 치료적 항체,
- 항원, 및
- 상기 치료적 항체에 대항하는 항-약물 항체.
바람직하게는, 상기 방법에서, 항원이 샘플에 존재하는 경우, 상기 ADA의 존재를 측정하는 추가의 단계가 항원을 중화시키기 위한 샘플의 처리 단계 후에 실시된다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하고, 이에 의해 환자 프로파일을 수득하며, 환자 프로파일이 치료에 대한 반응성을 나타내는, 치료적 항체 치료에 대한 환자의 반응성 검출 방법으로서, 치료적 항체가 표적 항원에 대항하는 방법에 관한 것이다:
(a) 환자로부터의 샘플에서, 하기의 존재 또는 양을 측정하는 단계:
- 치료적 항체,
- 항원, 및
- 상기 치료적 항체에 대항하는 항-약물 항체;
(b) 항원이 단계 (a) 중의 샘플에서 검출되는 경우, 항원을 중화시키기 위해 대상의 추가 샘플을 처리하고, 상기 처리된 샘플 중의 상기 ADA의 존재를 다시 측정하는 단계.
상기 방법은 바람직하게는 환자의 치료 과정 동안의 상이한 시점에 수행하여, 환자의 반응성, 또는 치료 효능을 모니터링할 수 있고 적합한 경우 치료를 조정할 수 있다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 또한 환자로부터의 샘플에서, 비활성 TNF알파의 존재 또는 양을 측정하는 것을 포함하는 치료적 항체 치료에 대한 환자의 반응성 검출 방법으로서, 치료적 항체가 TNF알파에 대한 것이고, 상기 존재 또는 양이 상기 치료에 대한 환자의 낮은 또는 감소하는 반응성의 지표인 방법에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 방법은 또한 환자 프로파일을 수득하기 위한 치료적 항체 및 상기 치료적 항체에 대항하는 항-약물 항체의 존재 또는 양의 검출을 포함하고, 환자 프로파일은 상기 치료에 대한 반응성을 나타낸다.
본 발명은 또한 환자에게 유효량의 표적 항원에 대항하는 치료적 항체를 투여하는 단계 및 상기 기재된 상기 치료적 항체 치료에 대한 환자의 반응성을 평가하는 단계를 포함하는, 환자의 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 샘플에서 하기의 존재 또는 양을 측정하기 위한 시약을 포함하는 키트에 관한 것이다:
- 표적 항원에 대항하는 치료적 항체,
- 항원, 및
- 상기 치료적 항체에 대항하는 항-약물 항체.
방법은 바람직하게는 ELISA 또는 면역-포획에 의해 수행되고, 항원은 바람직하게는 TNFα이다.
도 1: ADA 정량화. HRP(Horse Radish Peroxidase): 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, SA(Streptavidin): 스트렙타비딘 ; B(Biotin):비오틴.
도 2: ADA 측정에 대한 항원의 영향.
도 3: TNFα 정량화.
도 4: 항-TNFα 정량화.
도 5: 환자 모니터링
도 6: 대표 모니터링 점수 값
본 발명은 ADA를 검출하기 위한 그리고 치료적 항체 치료를 겪고 있는 환자의 모니터링을 위한 조성물, 키트 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 신뢰성 있는 데이터 및 정보를 제공하는 개선된 ADA 측정 방법을 기재한다. 본 출원인은 샘플에 존재하는 임의의 항원을 중화시키기 위해 샘플을 전처리하는 것이 신뢰성 있는 ADA 평가를 위해 필수적이라는 것을 보여준다. 본 출원인은 또한 3가지 파라미터(ADA, 항원, 약물)의 대상으로부터의 샘플 중의 동시 검출이 치료에 대한 반응 및 환자 진전의 예측 프로파일을 제공한다는 것을 입증하였다. 본 발명은 그러므로 치료적 항체 치료를 겪는 환자의 효과적인 모니터링 방법을 제공하고, 치료 섭생의 적합하고 효과적인 조정을 가능하게 한다.
본 발명은 하기 정의를 참조로 하여 가장 잘 이해될 것이다:
정의
본 발명에 따른 용어 "치료적 항체"는 활성제로서 대상에게 투여될 수 있는 임의의 항체를 나타낸다. 이러한 치료적 항체의 특정 예는 류마티스 관절염 또는 골관절염과 같은 염증성 장애의 치료에 사용되는 항체이다. 이것은 구체적으로 항-TNFα 항체를 포함한다. 용어 "치료적 항체"는 또한 표적 항원에 선택적으로 결합되는, 항체 Fab 절편, 또는 항체 Fc 절편, 합성 수용체, 가용성 수용체, 등과 같은 항체 유도체 또는 항원-특이적 리간드 분자를 포함한다.
용어 "ADA" 또는 "항-약물-항체(Anti-Drug-Antibody)"는 대상에서 치료적 항체에 결합하는 항체를 지칭한다. ADA는 가변 영역 또는 불변 영역을 포함하는 치료적 항체 중의 다양한 에피토프에 결합할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "대상" 또는 "환자"는 임의의 포유류 대상 또는 환자, 바람직하게는 인간 대상 또는 환자를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "조합된" 측정은 명시된 마커가 샘플에서 동시에 또는 순차적으로 평가되는 것을 나타낸다. 수반 평가는, 바람직하고 더욱 편리하지만 요구되지는 않는다.
용어 "샘플"은 항체를 포함하기 쉬운 임의의 샘플을 의미한다. 상기 용어는 바람직하게는 생물학적 유체, 예컨대 혈청, 혈장 또는 총 혈액, 또는 이의 유도체(예를 들어, 생물학적 유체의 희석, 전처리, 농축, 용리 등으로부터 야기됨)를 지칭한다. 샘플은 바람직하게는 혈장, 혈액 또는 혈청 샘플 또는 이의 희석물이다.
ADA 측정
본 발명은 샘플 내 ADA의 개선된 측정 방법에 관한 것이다. 본 발명의 상기 양상은 특히 항원 그 자체가 샘플 내 ADA의 정량 측정에 영향을 준다는 발견으로부터 기원한다. 실시예에서 볼 수 있듯이, 시험된 샘플 내 항원의 존재 하에, ADA의 측정된 양은 상당히 과대평가되어 시험이 쓸모없고 신뢰성 없게 된다. 본 발명은 샘플 내 항원을 먼저 중화함으로써, 신뢰성 있는 측정값이 수득될 수 있다는 것을 보여준다. 그러므로 본 발명은 하기 단계를 포함하는 샘플 내(인 비트로) 항-약물 항체(Anti-Drug Antibody: ADA)의 면역-검출 방법으로서, 약물이 표적 항원에 대항하는 치료적 항체인 방법에 관한 것이다:
a) 샘플 내 항원의 존재를 입증하는 단계;
b) 존재하는 경우, 샘플 내 항원을 중화시키는 단계; 및
c) 상기 샘플 내 상기 ADA의 존재 또는 양을 면역-검출하는 단계.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 샘플 내 항-약물 항체(ADA)의 면역-검출 방법으로서, 약물이 표적 항원에 대항하는 치료적 항체인 방법에 관한 것이다:
a) 존재할 수 있는 항원을 중화하기 위해 샘플을 처리하는 단계; 및
b) 상기 샘플 내 상기 ADA의 존재 또는 양을 면역-검출하는 단계.
항원의 중화 단계는 상이한 기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는, 항원은 샘플의 산 처리(일반적으로 산의 중화가 후속됨)에 의해, 샘플 내 항원의 감손 또는 포획에 의해, 또는 면역-중화에 의해 중화된다.
산 처리를 위해, 샘플은 바람직하게는 pH를 4 미만, 더욱 바람직하게는 약 2.5 내지 3.5의 범위로 감소시키기 위해 처리된다. 이것은 반응 전에 pH를 상기 바람직한 범위로 감소시키는데 적합한 조건 하에서(예를 들어, 농도 및 강도) 샘플에 산 용액을 첨가함으로써 달성될 수 있다. 적합한 산의 예에는 카르복실산, 예컨대 아세트산, 염산 또는 황산이 포함된다. 바람직하게는, 산 처리 후, 샘플의 pH 를 적어도 부분적으로는 ADA의 검출 전에 중화한다. 상기 중화는 샘플에 염기성 용액을 첨가함으로써 수득될 수 있다. 그러므로 산 처리는 전형적으로 하기 단계를 포함한다:
- 반응 전에, pH를 약 4 미만으로 감소시키기 위해 샘플에 산 용액을 첨가하는 단계;
- 실온에서 산성화된 샘플을 인큐베이션하는 단계; 및
- 산을 중화하고 pH를 4 초과, 전형적으로는 5 내지 9, 더욱 전형적으로는 6 내지 8로 복구하기 위해 반응 전에 산성화된 샘플에, 염기성 용액, 예컨대 TRIS 완충액, 또는 인산염 완충액, 또는 탄산염 완충액, 또는 보레이트 완충액을 첨가하는 단계.
항원은 또한 임의의 적합한 친화성 시약을 사용하는 포획 또는 감손에 의해 중화될 수 있다. 전형적으로는, 샘플은 항원에 특이적인 결합 시약으로 코팅된 또는 이를 함유하는 지지체와 접촉된다. 통과 또는 접촉 시, 항원은 지지체에 의해 고정되거나 보유되고, 수집된 또는 산출된 샘플에는 자유 항원이 상당히 제거된다. 샘플은 항원에 특이적인 항체로 코팅된 컬럼을 통해 처리될 수 있다. 대안적으로, 그러한 항체로 코팅된 비이드를 샘플에 첨가하고 임의로 후속하여 매질로부터 분리하거나 제거할 수 있다.
면역-중화는 단일클론 또는 폴리클론 항체에 의해 실시될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 항원은 산 처리에 의해 중화된다.
ADA의 면역검출은 제한 없이, ELISA, 면역포획, 마이크로어레이(단백질 칩), 유세포 분석(예를 들어, Fidis 포함), 또는 멀티플렉스 도트를 포함하는 상이한 유형 또는 플랫폼의 면역-검정에 의해 실시될 수 있다.
바람직한 구현예에서, ADA는 ELISA 또는 면역포획에 의해 면역검출된다. 이러한 방법에서, 포획 시약은 지지체 상에 고정되고, 시험된 샘플은 지지체 상에 증착되고, 지지체와 샘플의 ADA 사이에 면역 복합체의 형성은 존재하는 경우 추적 시약을 사용하여 측정된다. 전형적으로는, ADA 측정을 위해, 코팅된 또는 고정된 포획 시약은 약물 그 자체(즉, 치료적 항체)이다. 추적 시약은 임의의 항-ADA 또는 ADA-특이적 시약, 예컨대 항체(예를 들어, 염소 또는 토끼 항-인간 Ig 항체), 또는 다시 약물일 수 있다. 추적 시약은 그 자체로 표지될 수 있고, 또는 노출제(revealing agent)(스트렙타비딘/비오틴; 페록시다아제; 효소 라벨, 발광 라벨 등)을 통해 검출가능할 수 있다.
특정 구현예에서, 포획 시약은 약물 그 자체이고 추적 시약은 비오틴화 약물이고, 이것은 라벨링된 스트렙타비딘의 인큐베이션시 검출될 수 있다(도 1 참조).
포획 시약은 제한 없이 흡착, 물리적 연결, 또는 화학 결합과 같은 당업계에 단독으로 공지된 다양한 기술에 의해 지지체 상에 고정될 수 있다. 화학 결합은 예를 들어, N-말단 및/또는 측면 아미노기를 통해, 및/또는 고정되어야 하는 시약(예를 들어, 약물 또는 항체)의 페놀 작용기 또는 당 알코올 기를 통해 달성될 수 있다.
지지체는 임의의 적합한 장치, 예컨대 플레이트(예를 들어, 다중벽 적정 플레이트), 슬라이드, 디쉬, 튜브, 컬럼 등일 수 있다. 지지체는 또한 비이드로 제조될 수 있다.
또다른 구현예에서, 반응은 용액에서 실시된다. 본 구현예에서, 시약은 지지체 상에 고정되지 않고 용액 내에 직접 혼합된다.
실시예에 설명되는 바와 같이, 본 발명에 따라 처리된 샘플에서 측정된 ADA의 수준은 신뢰성 있고 안정한 반면, 항원을 중화시키기 위해 전처리 없이, 수득된 값은 거짓이고 신뢰성이 없다(도 2 참조).
본 발명은 대상에서 항-TNF 약물에 대항하여 ADA의 존재를 평가하는데 특히 적합하다. 더욱 더 구체적으로, 본 발명은 제한 없이 인플리미마브, 에타네르셉트, 아달리무마브, 골리무마브 및 세르톨리주마브 페골을 포함하는 항-TNFα 치료적 항체에 대항하는 ADA를 검출하는데 특히 적합하다.
환자 모니터링
항-약물 항체("ADA")는 치료적 항체의 효과를 소실, 감소 또는 중화시킨다. 따라서, 대상으로부터의 샘플 내 상기 ADA의 검출은 치료 과정 동안 환자를 모니터링하는 방법 뿐 아니라 요법 개선 방법을 나타낸다. ADA 적정농도가 증가되었을 때, 약물의 치료 효과는 감소하거나 중화될 것으로 예상될 수 있다. 이러한 상황에서, 예를 들어, 구별되는 약물을 사용하기 위해 치료 프로토콜을 변화시키는 것이 권고된다.
특정 양상에서, 본 발명은 그러므로 환자로부터의 샘플에서, 상기 기재된 방법을 사용하는 상기 치료적 항체에 대항하는 항-약물 항체의 존재 또는 양을 측정하는 것을 포함하는 치료적 항체 치료에 대한 환자의 반응성의 검출 방법으로서; 샘플 내 ADA의 증가 또는 이의 존재가 대상의 반응성 상실의 지표인 방법에 관한 것이다.
또다른 양상에서, 본 발명은 환자로부터의 샘플에서, 상기 기재된 방법을 사용하는 상기 치료적 항체에 대항하는 항-약물 항체의 존재 또는 양을 측정하는 것을 포함하는 치료적 항체 치료를 겪는 환자를 모니터링하기 위한 방법으로서; 참조 값 또는 처리 초기 단계에서 측정된 값에 비해 샘플 내 ADA의 증가 또는 이의 존재가 치료에 대한 대상의 반응성의 상실의 지표인 방법에 관한 것이다.
대상을 모니터링하거나 대상의 반응성을 평가하기 위해, ADA 뿐 아니라, 샘플 내 약물 및 항원을 측정하는 것이 본 발명에 따라 더욱 더 바람직하다. 게다가, 본 출원은 이러한 조합된 측정이 대상의 상태의 예측 지표를 제공하는 것을 보여준다.
따라서, 본 발명은 또한 환자 프로파일을 수득하기 위해 환자로부터의 샘플에서, 하기의 존재 또는 양을 측정하는 것을 포함하며, 환자 프로파일이 치료에 대한 반응성을 나타내는, 치료적 항체 치료에 대한 환자의 반응성 검출 방법으로서, 치료적 항체가 표적 항원에 대항하는 방법에 관한 것이다:
- 치료적 항체,
- 항원, 및
- 상기 치료적 항체에 대항하는 항-약물 항체.
바람직하게는, 본 발명에 언급된 바와 같이, ADA 측정은 항원을 중화하기 위한 샘플 처리 후에 실시되어야만 한다. 따라서, 상기 방법에서, 항원이 샘플에서 검출되는 경우, 상기 ADA의 존재를 측정하는 추가 단계가 항원을 중화하기 위한 샘플 처리 후 수행된다.
ADA 수준 및/또는 항원의 수준이 참조 값에 비해 또는 처리 초기 단계에서 대상에서 측정된 값에 비해 증가되는 경우; 그리고 치료적 항체 수준이 참조 값에 비해 또는 처리 초기 단계에서 대상에서 측정된 값에 비해 감소되는 경우, 환자가 더이상 치료에 잘 반응하지 않고 치료가 조정되어야만 한다는 것으로 추론될 수 있다. 모니터링 점수는 또한 치료가 환자에게 여전히 적응되는지를 측정값으로부터 직접 추론하기 위해, 하기 기재된 바와 같이 사용될 수 있다.
방법은 바람직하게는 환자의 치료 과정 동안 상이한 시점에서 수행되어, 환자의 반응성, 또는 치료 효능이 모니터링될 수 있고 적합한 경우 치료가 조정될 수 있도록 한다. 특정 구현예에서, 검출은 치료적 항체의 각각의 투여 전에 수행될 수 있다. 대안적으로는, 검출은 1개월 간격으로 3회 수행될 수 있다. 장 기간(예를 들어, 9개월 이상) 동안 치료적 항체 치료를 받은 대상의 경우, 본 발명에 따른 단일 검출은 환자를 반응자 또는 비-반응자로서 정하는데 충분할 것이다.
도 5는 어떻게 프로파일이 환자의 반응성을 나타내고, 어디서 치료가 비효과적인 것으로 고려되어 변경되어야만 하는지를 나타낸다. 도 5로부터 측정될 수 있듯이, 3가지 주요 상황이 구별될 수 있다:
T0: 대상은 아프고 치료되지 않는다.
T1-T2: 대상은 치료되고 치료에 대해 반응한다. 본 출원인에 의해 시험된 샘플은 대부분 치료된 환자가 상기 카테고리 내에 있음을 보여준다.
T3부터: 환자는 치료되나 반응하지 않는다. 치료적 항체는 ADA에 의해 중화된다. 치료는 효과적이지 않고 변화되어야만 한다.
치료적 항체, 항원, 및 ADA는 ADA 측정을 위해 상기 기재된 바와 같은 ELISA, 면역포획, 마이크로어레이(단백질 칩), 유세포 분석(예를 들어, Fidis 포함), 또는 멀티플렉스 도트와 같은 임의의 면역검출법을 포함하는 상이한 기술에 의해 측정될 수 있다. 전형적으로는, 모든 3개의 마커는 동시에(예를 들어, 동일한 소자 상에서) 시험된다. 그러나, 측정은 별도로 또는 이어서 행해질 수 있다.
본 발명은 특히 항-TNFα 치료를 겪는 환자를 모니터링하는데 적합하다. 이러한 환자는 전형적으로는 자가면역 또는 염증성 질환, 예컨대 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 크론 질환, 건선 등을 앓는다. 모니터링은 치료 효능의 규칙적인 평가를 가능하게 하고 치료가 추진될 수 있을지 또는 조정되어야만 하는지를 담당의가 결정할 수 있다.
이와 관련하여, 평가는 바람직하게는 대상에서 TNFα, ADA, 및 항-TNFα 치료적 항체의 수준을 평가함으로써 이루어진다. 수득된 값은 정량적 또는 정성적일 수 있다. 참조 값 또는 처리 초기 단계에서 동일한 대상에 대해 등록된 수준과 비교할 수 있다. 특정 구현예에서, 값은 환자의 직접 모니터링을 가능하게 하는 "점수표"를 사용하여 평가된다.
제 1 단계에서, 환자로부터의 샘플을 3개 마커: TNFα, 항-TNFα 및 ADA의 수준을 정량하기 위해 상기 기재된 바와 같이 시험한다. 제 2 단계에서, "점수표"를 사용하여, 각각의 파라미터의 속도를 점수와 연관시킨다. 이후 각각의 파라미터로부터의 점수의 합: 모니터링 점수 = TNF 점수 + 항-TNF 점수 + ADA 점수로 이루어진, 모니터링의 전반적인 점수가 수득된다.
모니터링 점수는 환자의 상태를 제공하는, 모니터링 척도와 비교(또는 판독)할 수 있다. 이와 관련하여, 본 출원인은 상기 마커 값을 평가하는데 적합한 모니터링 척도를 성립하였다. 상기 척도는 항-TNF 요법과 관련하여 하기에 제시된다. 추가의 점수 척도는 실시예에 기재된다:
각각의 파라미터에 대한 점수표
Figure pct00001
모니터링 척도:
Figure pct00002
예로서, 인플릭시마브로 치료된 류마티스 관절염 환자로부터의 혈청 샘플을 본 발명에 따라 시험한다. TNFα, 항-TNFα, 및 ADA의 속도는 각각 50pg/ml, <0,1μg/ml, 및 6600ng/ml이다.
TNFα의 속도를 점수 2와 연관시킨다. 항-TNF의 속도를 점수 5와 연관시킨다. ADA의 속도를 점수 22와 연관시킨다.
모니터링 점수는 그러므로 29이고, 환자에 대한 권고는 또다른 치료로 전환하는 것이다.
실시예에는 항-TNF알파 요법을 받고 있는 환자로부터의 300개 초과의 인간 혈청 샘플에 대해 본 출원인에 의해 수행된 시험 결과를 보고한다. 이들은 상기 방법에 따라, 환자 상태는 쉽게 측정될 수 있고 비-반응자 상태로의 이들의 진행이 검출되고 예상될 수 있다는 것을 보여준다. 그러므로 본 발명은 처음으로 환자의 모니터링 및 이의 치료 조정을 위한 신뢰성 있는 방법을 제공한다.
부가적인 반응 마커
추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 시험을 추가로 개선하기 위해 측정 또는 수집될 수 있는(예를 들어, 임상 기록으로부터), 상기 값 또는 점수를 부가적인 환자 데이터와 조합하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 그러므로 사이토카인, 호르몬 및 성장 인자, 류마티스 인자, 및 특정 항체로부터 선택될 수 있는, 하나 또는 여러 부가적인 항원의 존재 또는 양을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 부가적인 인자의 구체적인, 바람직한 예는 하기를 포함한다:
- 사이토카인 및 케모카인: IL1, IL6, IL8, IL10, ILK12, IL17, IL23, GM-CSF, IFN감마, ProMPP1 및/또는 ProMPP3;
- 자가면역 항체: 항핵 항체(이중 가닥 DNA(dsDNA)에 대한 ANA 항체)
- 생물학적 파라미터 및 혈액학적 파라미터: C-반응성 단백질(CRP), RF 류마티스 인자, 혈청 아밀로이드 A, IgG, IgA, IgM, 헤모글로빈, 적혈구 침강 속도 (ESR), 백혈구 및 혈소판 계수, CD19-B 세포의 수, CD3_, CD4_, CD8_, CD4_,CD25_, 및/또는 CD8_,HLA-DR_ T 세포의 수
- 환자 파라미터: 예컨대 성별, VS, 연령 또는 DAS28. 체중,
- 치료 파라미터: 약량학
정량적 면역검정을 사용하여 바이오마커 농도(TNF, 항-TNF 및 ADA)를 측정하고 임상 데이터 세트로부터의 부가적인 파라미터와 조합하여 모니터링 점수를 생성한다. 알고리즘은 치료 효능을 평가하기 위해 상이한 가중치(Wn)를 사용한다(모니터링 점수). 산출된 모니터링 점수를 척도화하여 각각의 시험 결과가 1 내지 10의 십진수가 되도록한다. 예로서, 모니터링 점수의 알고리즘은 하기와 같다:
모니터링 점수 = W1 x {TNF}+ W2 x {항-TNF} + W3 x {ADA} + W4 x {CRP} + W5 x {ESR}.
Wn : 이는 치료 영향에 대한 상기 파라미터의 중요도에 따른 각각의 파라미터에 대한 가중치이다.
{TNF} : TNF의 점수 인자. TNF는 측정된 TNF의 농도에 따라, 모니터링 점수에 대해 영향을 준다.
{항-TNF} : 항-TNF의 점수 인자. 항-TNF는 측정된 항-TNF의 농도에 따라, 모니터링 점수에 대해 영향을 준다. 항-TNF의 점수 인자는 "약량학" 의존적이다(임상 데이터 세트에서 이용가능한 정보).
{ADA} : ADA의 점수 인자. ADA는 측정된 ADA의 농도에 따라, 모니터링 점수에 대해 영향을 준다.
{CRP}: CRP의 점수 인자. CRP는 임상 데이터 세트에 의해 제공된 C-반응성 단백질에 따라, 모니터링 점수에 대해 영향을 준다.
{ESR} : ESR의 점수 인자. ESR은 임상 데이터 세트에 의해 제공된 적혈구 침강 속도에 따라, 모니터링 점수에 대해 영향을 준다. 침강 속도는 "연령 및 성별" 의존적이다(임상 데이터 세트 중의 정보).
모니터링 점수는 치료 과정에 대한 담당의의 결정을 돕기 위해 전 임상 데이터 세트와 함께 사용되는 것으로 의도된다.
모니터링 점수는 1 내지 10의 수이다. 모니터링 점수에 따라, 예를 들어, 도 6에 제시되는 바와 같이, 치료 효능 해석을 수행할 수 있다.
치료 전환 마커로서의 비활성 TNF 알파
치료에 반응하지 않는 환자에서 검출된 TNF알파의 생물학적 활성을 측정하였다(도 5의 영역 T3 및 T4 참조). TNF알파 샘플에 노출 시 표적 세포 용리를 평가함으로써 활성을 검출하였다. 결과는 놀랍게도 상기 TNF알파가 생물학적으로 비활성이라는 것을 보여준다. 상기 결과는 완전히 예상 밖의 것이었고, 항-TNF알파 치료를 겪는 환자가 순환 비활성 TNF알파를 가지고 있음을 보고한 적은 없었다. 결과는 추가로 비활성 TNF알파 수준이 항-TNF 치료에 대한 환자의 응답 결여와 연관되어 있음을 보여준다. 이러한 비활성 TNF알파의 존재는 흥미롭다. TNF알파가 먼저 항-TNA알파 치료적 항체에 의해 포획되고, 이어서 ADA가 치료적 항체 분자에 결합될 때 방출된다는 가설을 세웠다. ADA로부터 방출된 TNF알파는 ADA 결합에 의해 야기된 형태학적 또는 구조적 변형(들)의 결과로서 비활성일(또는 비활성화될) 것이다.
항-TNF 요법을 겪는 환자에서 비활성 TNF알파의 투여는 그러므로 환자 반응성을 결정하고, 치료를 조정하기 위한(예를 들어 또다른 치료적 항체에 대한 치료 또는 또다른 계열의 치료로의 전환) 신규하고 매우 신뢰성 있는 수단을 나타낸다.
특정 구현예에서, 그러므로 본 발명은 환자로부터의 샘플에서, 비활성 TNF알파의 존재 또는 양을 측정하는 것을 포함하는, 치료적 항체 치료에 대한 환자의 반응성 검출 방법으로서, 치료적 항체가 TNF알파에 대항하고, 상기 존재 또는 양이 상기 치료에 대한 환자의 낮은 또는 감소하는 반응성의 지표인 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 또한 환자로부터의 샘플에서, 비활성 TNF알파의 존재 또는 양을 측정하는 것을 포함하는, 항-TNF알파 치료를 겪는 환자의 모니터링 방법으로서, 상기 존재 또는 양이 상기 치료에 대한 환자의 반응성의 지표인 방법에 관한 것이다. 비활성 TN알파의 출현은 대상이 치료를 벗어나기 시작한다는 지표이다. 이러한 비활성 TNF알파의 증가하는 수준은 환자가 또다른 치료로 전환해야만 한다는 것을 나타낸다.
"비활성 TNF알파"는 본 문맥에서, 인 비트로 표적 세포 용리를 유발하지 않는 TNF알파를 지칭한다. 비활성 TNF알파는 더욱 구체적으로는 비활성화된 TNF알파, 예를 들어, 항체-비활성화 TNF알파를 포함한다. 상기 구현예에서, 방법은 시험된 샘플 내의 TNF알파의 생물학적 활성을 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로는, 방법은 비활성 TNF알파 분자의 구조를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 방법은 또한 환자 프로파일을 수득하기 위해 항-TNF알파 치료적 항체 및 항-약물 항체의 존재 또는 양을 측정하는 것을 포함하며, 환자 프로파일이 상기 치료에 대한 반응성을 나타낸다. 추가의 바람직한 구현예에서, 방법은 추가로 상기 명시된 바와 같은 부가적인 파라미터를 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가의 목적은 하기를 포함하는 키트이다:
- 샘플에서, 치료적 항체에 대항하는 항-약물 항체의 존재 또는 양을 측정하기 위한 하나 또는 여러 개의 시약;
- 샘플에서 상기 치료적 항체의 표적 항원을 중화하기 위한 하나 또는 여러 개의 시약.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 인간 혈청 샘플에서 인간 TNFα, 항-TNFα 약물(바람직하게는 인플릭시마브, 에타네르셉트, 아달리무마브, 골리무마브 또는 세르톨리주마브 페골) 및 상응하는 ADA의 조합된 정량 측정을 위한 효소 연결 면역검정(ELISA) 키트 또는 방법에 관한 것이다. 상기 키트는 담당의가 환자 혈청에서 상기 3가지 파라미터의 속도의 전진을 모니터링할 수 있게 한다.
본 발명의 추가의 양상 및 장점은 하기 실시예에 기재될 것이고, 이것은 단지 예시로서 고려되어야만 한다.
실시예
실시예에서, 모든 용량은 표준에 대해 정량화, 교정된다. TNF의 용량 (pg/ml)은 국제 표준의 도움으로 정해진다. 약물의 용량(μg/ml)은 제약회사에 의해 제시된 농도 값 덕에 정해진다. ADA의 용량(ng/ml)은 표준으로서 토끼 폴리클론 항체를 사용하여 정해진다. 토끼(기원 Hyla)는 항-TNF 면역글로불린의 Fab 또는 Fab'2 절편으로 또는 인간 P75 TNF 수용체로 면역화된다. ADA 인간 표준의 정량은 뷰렛 방법에 의해 수득된다(비색법에 의한 단백질의 용량).
실시예 A - ADA 측정 방법
약물을 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅한다.
· 먼저, 산 용액, 예컨대 아세트산 용액을 샘플에 첨가한다. 산성화된 샘플을 실온에서 대략 5분 동안 인큐베이션한다.
· 이후, TRIS 용액과 같은 염기성 용액을 산성화된 샘플에 첨가하여 산 용액을 중화하였다.
· 이후, 샘플(희석된 또는 아닌)을 항체 코팅된 웰에 첨가하고, 이것이 결합되게 둔다. 인큐베이션 후, 비결합된 단백질을 세정에 의해 제거한다.
· 비오틴화 약물을 첨가한다. 인큐베이션 후, 비결합된 항체를 세정에 의해 제거한다.
· 이후 호스래디쉬 퍼옥시다아제 라벨링 스트렙타비딘을 첨가한다. 스트렙타비딘은 비오틴화 약물과 형성된 착물에 결합한다. 인큐베이션 후, 웰을 다시 세정하여 임의의 과량의 공액체를 제거한다.
· 결합된 효소를 기질 TMB(3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘)의 첨가에 의해 노출시킨다. 색상 강도는 항-에타네르셉트 항체의 양에 비례한다.
· H2SO4(0.25M)의 첨가로 효소 반응을 중지시킨다.
· H2SO4(0.25M)에 의해 반응을 중지시킨 후, 450nm에서 분광측정기에 의해 광학 밀도를 판독한다.
교정 범위는 ng/mL로 표현된 각각의 환자 샘플의 항-약물 항체의 양을 정의할 수 있게 한다.
시험 원리는 도 1에 명시된다. 결과는 도 2에 제시된다.
결과는 놀랍게도,항원이 샘플에 존재하는 경우, ADA의 정량이 대폭 과대평가된다는 것을 보여준다. 반대로, 산 처리에 의한 항원의 중화 후, ADA의 정량은 올바르고 신뢰성 있다. ADA의 투여 동안 항원의 존재는 ADA 중의 잘못된 투여를 수반하고, 이것은 잘못된 양성 결과를 유발할 수 있다. 따라서, 항원에서의 양성 투여 동안, ADA의 올바른 결과를 수득하기 위한 중화 후 두번째 시험 ADA를 진행하는 것이 필수적이다.
실시예 B - 에타네르셉트로 치료된 환자를 모니터링하기 위한 방법 및 키트
시험은 혈청 또는 혈장 상에서 수행된다. TNFα는 용액에서 불안정하므로, 혈액 채취 후 즉시 샘플을 사용하는 것이 바람직하다. 측정이 즉시 수행되지 않는 경우, 샘플은 동결되어야만 한다. 임의의 비-특이적 결합을 피하기 위해, 6개월 초과 동안 동결되어 있거나 흐려진 샘플은 원심분리 및 여과되어야만 한다.
1. TNF α의 투여
단일클론 항-TNFα 항체를 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트(8개 웰의 4개 스트립) 상에 코팅한다.
· 먼저, 희석된 샘플을 항체 코팅 웰에 첨가하고, 이것이 결합되게 둔다. 인큐베이션 후, 비결합된 단백질을 세정에 의해 제거한다.
· 항-TNFα 비오틴화 항체를 첨가한다. 인큐베이션 후, 비결합된 항체를 세정에 의해 제거한다.
· 이후 호스래디쉬 퍼옥시다아제 라벨링 스트렙타비딘을 첨가한다. 스트렙타비딘은 비오틴화 항-TNFα 항체와 형성된 복합체에 결합한다. 인큐베이션 후, 웰을 다시 세정하여 임의의 과량의 공액체를 제거한다.
· 결합된 효소를 기질 TMB(3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘)의 첨가에 의해 노출시킨다. 색상 강도는 TNFα의 양에 비례한다.
· H2SO4(0.25M)의 첨가로 효소 반응을 중지시킨다.
· H2SO4(0.25M)에 의해 반응을 중지시킨 후, 450nm에서 분광측정기에 의해 광학 밀도를 판독한다.
교정 범위는 pg/mL로 표현된 각각의 환자 샘플의 TNFα의 양을 정의할 수 있게 한다.
2. 에타네르셉트의 투여
TNFα를 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트(8개 웰의 4개 스트립) 상에 코팅한다.
· 먼저, 희석된 샘플을 항체 코팅 웰에 첨가하고, 이것이 결합되게 둔다. 인큐베이션 후, 비결합된 단백질을 세정에 의해 제거한다.
· 항-인간 IgG 비오틴화 항체를 첨가한다. 인큐베이션 후, 비결합된 항체를 세정에 의해 제거한다.
· 이후 호스래디쉬 퍼옥시다아제 라벨링 스트렙타비딘을 첨가한다. 스트렙타비딘은 비오틴화 항-IgG 항체와 형성된 복합체와 결합한다. 인큐베이션 후, 웰을 다시 세정하여 임의의 과량의 공액체를 제거한다.
· 결합된 효소를 기질 TMB(3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘)의 첨가에 의해 노출시킨다. 색상 강도는 에타네르셉트의 양에 비례한다.
· H2SO4(0.25M)의 첨가로 효소 반응을 중지시킨다.
· H2SO4(0.25M)에 의해 반응을 중지시킨 후, 450nm에서 분광측정기에 의해 광학 밀도를 판독한다.
교정 범위는 μg/mL로 표현된 각각의 환자 샘플의 에타네르셉트의 양을 정의할 수 있게 한다.
3. 항- 에타네르셉트의 투여
에타네르셉트를 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트(8개 웰의 4개 스트립) 상에 코팅한다.
· 먼저, 희석된 샘플을 항체 코팅 웰에 첨가하고, 이것이 결합되게 둔다. 인큐베이션 후, 비결합된 단백질을 세정에 의해 제거한다.
· 비오틴화 에타네르셉트를 첨가한다. 인큐베이션 후, 비결합된 항체를 세정에 의해 제거한다.
· 이후 호스래디쉬 퍼옥시다아제 라벨링 스트렙타비딘을 첨가한다. 스트렙타비딘은 비오틴화 에타네르셉트와 형성된 복합체에 결합한다. 인큐베이션 후, 웰을 다시 세정하여 임의의 과량의 공액체를 제거한다.
· 결합된 효소를 기질 TMB(3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘)의 첨가에 의해 노출시킨다. 색상 강도는 항-에타네르셉트 항체의 양에 비례한다.
· H2SO4(0.25M)의 첨가로 효소 반응을 중지시킨다.
· H2SO4(0.25M)에 의해 반응을 중지시킨 후, 450nm에서 분광측정기에 의해 광학 밀도를 판독한다.
교정 범위는 ng/mL로 표현된 각각의 환자 샘플의 항-에타네르셉트 항체의 양을 정의할 수 있게 한다.
4. 결과
치료 과정 동안, 3개의 파라미터(TNF, 에타네르셉트, 항-에타네르셉트)의 속도 진전을 인간 대상에서 본 발명에 따라 모니터링하였다. 류마티스 환자(환자1)로부터의 혈청 샘플을 에타네르셉트의 제 1 주입 전에 시험하였다. 결과를 하기에 나타낸다:
Figure pct00003
상기 결과는 TNF의 수준 및 에타네르셉트의 수준이 치료 과정 동안 증가한 것을 보여준다.
실시예 C - 아달리무마브로 치료된 환자를 모니터링하기 위한 방법 및 키트
시험을 혈청 또는 혈장에 대해 실시하였다. TNFα는 용액에서 불안정하므로, 혈액 채취 후 즉시 샘플을 사용하거나 동결하였다. 임의의 비-특이적 결합을 피하기 위해, 6개월 초과 동안 동결되어 있거나 흐려진 샘플은 원심분리 및 여과하였다.
1. TNF α의 투여
단일클론 항-TNFα 항체를 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트(8개 웰의 4개 스트립) 상에 코팅한다.
· 먼저, 희석된 샘플을 항체 코팅 웰에 첨가하고, 이것이 결합되게 둔다. 인큐베이션 후, 비결합된 단백질을 세정에 의해 제거한다.
· 항- TNFα 비오틴화 항체를 첨가한다. 인큐베이션 후, 비결합된 항체를 세정에 의해 제거한다.
· 이후 호스래디쉬 퍼옥시다아제 라벨링 스트렙타비딘을 첨가한다. 스트렙타비딘은 비오틴화 항-TNFα 항체와 형성된 복합체에 결합한다. 인큐베이션 후, 웰을 다시 세정하여 임의의 과량의 공액체를 제거한다.
· 결합된 효소를 기질 TMB(3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘)의 첨가에 의해 노출시킨다. 색상 강도는 TNFα의 양에 비례한다.
· H2SO4(0.25M)의 첨가로 효소 반응을 중지시킨다.
· H2SO4(0.25M)에 의해 반응을 중지시킨 후, 450nm에서 분광측정기에 의해 광학 밀도를 판독한다.
교정 범위는 pg/mL로 표현된 각각의 환자 샘플의 TNFα의 양을 정의할 수 있게 한다.
2. 아달리무마브의 투여
TNFα를 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트(8개 웰의 4개 스트립) 상에 코팅한다.
· 먼저, 희석된 샘플을 항체 코팅 웰에 첨가하고, 이것이 결합되게 둔다. 인큐베이션 후, 비결합된 단백질을 세정에 의해 제거한다.
· 항-인간 IgG 비오틴화 항체를 첨가한다. 인큐베이션 후, 비결합된 항체를 세정에 의해 제거한다.
· 이후 호스래디쉬 퍼옥시다아제 라벨링 스트렙타비딘을 첨가한다. 스트렙타비딘은 비오틴화 항-IgG 항체와 형성된 복합체와 결합한다. 인큐베이션 후, 웰을 다시 세정하여 임의의 과량의 공액체를 제거한다.
· 결합된 효소를 기질 TMB(3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘)의 첨가에 의해 노출시킨다. 색상 강도는 아달리무마브의 양에 비례한다.
· H2SO4(0.25M)의 첨가로 효소 반응을 중지시킨다.
· H2SO4(0.25M)에 의해 반응을 중지시킨 후, 450nm에서 분광측정기에 의해 광학 밀도를 판독한다.
교정 범위는 μg/mL로 표현된 각각의 환자 샘플의 아달리무마브의 양을 정의할 수 있게 한다.
3. 항- 아달리무마브의 투여
아달리무마브를 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트(8개 웰의 4개 스트립) 상에 코팅한다.
· 먼저, 희석된 샘플을 항체 코팅 웰에 첨가하고, 이것이 결합되게 둔다. 인큐베이션 후, 비결합된 단백질을 세정에 의해 제거한다.
· 비오틴화 아달리무마브를 첨가한다. 인큐베이션 후, 비결합된 항체를 세정에 의해 제거한다.
· 이후 호스래디쉬 퍼옥시다아제 라벨링 스트렙타비딘을 첨가한다. 스트렙타비딘은 비오틴화 아달리무마브와 형성된 복합체에 결합한다. 인큐베이션 후, 웰을 다시 세정하여 임의의 과량의 공액체를 제거한다.
· 결합된 효소를 기질 TMB(3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘)의 첨가에 의해 노출시킨다. 색상 강도는 항-아달리무마브 항체의 양에 비례한다.
· H2SO4(0.25M)의 첨가로 효소 반응을 중지시킨다.
· H2SO4(0.25M)에 의해 반응을 중지시킨 후, 450nm에서 분광측정기에 의해 광학 밀도를 판독한다.
교정 범위는 ng/mL로 표현된 각각의 환자 샘플의 항-아달리무마브 항체의 양을 정의할 수 있게 한다.
4. 결과
치료 과정 동안, 3개의 파라미터(TNF, 아달리무마브, 항-아달리무마브)의 속도 진전을 본 발명을 사용하여 모니터링하였다.
류마티스 관절염 환자(환자2)로부터의 혈청 샘플을 아달리무마브의 제 1 주입(W0) 전 및 아달리무마브의 후속 주입(W6, W21, W30, W39) 전에 시험하였다.
Figure pct00004
상기 표는 아달리무마브 수준이 수준 약 17μg/ml에 도달하기 위한 처리 과정 동안 상기 환자에서 증가되었음을 보여준다. TNF의 수준 및 항-아달리무마브의 수준은 증가하지 않았다.
실시예 D - 인플릭시마브로 치료된 환자를 모니터링하기 위한 방법 및 키트
시험을 혈청 또는 혈장에 대해 실시하였다. TNFα는 용액에서 불안정하므로, 혈액 채취 후 즉시 샘플을 사용하거나 동결하였다. 임의의 비-특이적 결합을 피하기 위해, 6개월 초과 동안 동결되어 있거나 흐려진 샘플은 원심분리 및 여과하였다.
1. TNF α의 투여
단일클론 항-TNFα 항체를 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트(8개 웰의 4개 스트립) 상에 코팅한다.
· 먼저, 희석된 샘플을 항체 코팅 웰에 첨가하고, 이것이 결합되게 둔다. 인큐베이션 후, 비결합된 단백질을 세정에 의해 제거한다.
· 항-TNFα 비오틴화 항체를 첨가한다. 인큐베이션 후, 비결합된 항체를 세정에 의해 제거한다.
· 이후 호스래디쉬 퍼옥시다아제 라벨링 스트렙타비딘을 첨가한다. 스트렙타비딘은 비오틴화 항-TNFα 항체와 형성된 복합체에 결합한다. 인큐베이션 후, 웰을 다시 세정하여 임의의 과량의 공액체를 제거한다.
· 결합된 효소를 기질 TMB(3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘)의 첨가에 의해 노출시킨다. 색상 강도는 TNFα의 양에 비례한다.
· H2SO4(0.25M)의 첨가로 효소 반응을 중지시킨다.
· H2SO4(0.25M)에 의해 반응을 중지시킨 후, 450nm에서 분광측정기에 의해 광학 밀도를 판독한다.
교정 범위는 pg/mL로 표현된 각각의 환자 샘플의 TNFα의 양을 정의할 수 있게 한다.
2. 인플릭시마브의 투여
TNFα를 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트(8개 웰의 4개 스트립) 상에 코팅한다.
· 먼저, 희석된 샘플을 항체 코팅 웰에 첨가하고, 이것이 결합되게 둔다. 인큐베이션 후, 비결합된 단백질을 세정에 의해 제거한다.
· 항-인간 IgG 비오틴화 항체를 첨가한다. 인큐베이션 후, 비결합된 항체를 세정에 의해 제거한다.
· 이후 호스래디쉬 퍼옥시다아제 라벨링 스트렙타비딘을 첨가한다. 스트렙타비딘은 비오틴화 항-IgG 항체와 형성된 복합체와 결합한다. 인큐베이션 후, 웰을 다시 세정하여 임의의 과량의 공액체를 제거한다.
· 결합된 효소를 기질 TMB(3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘)의 첨가에 의해 노출시킨다. 색상 강도는 인플릭시마브의 양에 비례한다.
· H2SO4(0.25M)의 첨가로 효소 반응을 중지시킨다.
· H2SO4(0.25M)에 의해 반응을 중지시킨 후, 450nm에서 분광측정기에 의해 광학 밀도를 판독한다.
교정 범위는 μg/mL로 표현된 각각의 환자 샘플의 인플릭시마브의 양을 정의할 수 있게 한다.
3. 항-인플릭시마브의 투여
인플릭시마브를 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트(8개 웰의 4개 스트립) 상에 코팅한다.
· 먼저, 희석된 샘플을 항체 코팅 웰에 첨가하고, 이것이 결합되게 둔다. 인큐베이션 후, 비결합된 단백질을 세정에 의해 제거한다.
· 비오틴화 인플릭시마브를 첨가한다. 인큐베이션 후, 비결합된 항체를 세정에 의해 제거한다.
· 이후 호스래디쉬 퍼옥시다아제 라벨링 스트렙타비딘을 첨가한다. 스트렙타비딘는 비오틴화 인플릭시마브와 형성된 복합체에 결합한다. 인큐베이션 후, 웰을 다시 세정하여 임의의 과량의 공액체를 제거한다.
· 결합된 효소를 기질 TMB(3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘)의 첨가에 의해 노출시킨다. 색상 강도는 항-인플릭시마브 항체의 양에 비례한다.
· H2SO4(0.25M)의 첨가로 효소 반응을 중지시킨다.
· H2SO4(0.25M)에 의해 반응을 중지시킨 후, 450nm에서 분광측정기에 의해 광학 밀도를 판독한다.
교정 범위는 ng/mL로 표현된 각각의 환자 샘플의 항-인플릭시마브 항체의 양을 정의할 수 있게 한다.
4. 결과
치료 과정 동안, 3개의 파라미터(TNF, 인플릭시마브, 항-인플릭시마브)의 속도 진전을 인간 대상에서 모니터링하였다.
첫번째 류마티스 관절염 환자(환자 3)에서, 혈청 샘플을 인플릭시마브의 제 2 주입(W2) 전 및 인플릭시마브의 후속 주입(W6, W14, W28, W42, W56) 전에 시험하였다.
Figure pct00005
결과는 항-인플릭시마브의 수준이 치료 과정 동안 증가하여 높은 수준(>100ng/ml)에 도달하였음을 보여준다. TNF의 수준 및 항-인플릭시마브의 수준은 검출불가능하였다.
또다른 류마티스 환자(환자4)에서, 혈청 샘플을 인플릭시마브의 제 2 주입(W2) 전 및 인플릭시마브의 제 3 주입(W5) 전에 시험하였다.
Figure pct00006
결과는 항-인플릭시마브의 수준이 치료 과정 동안 증가하여 높은 수준(>100ng/ml)에 도달하였음을 보여준다. TNF의 수준은 50pg/ml로 증가하고 인플릭시마브의 수준은 0.1μg/ml 미만으로 떨어진다.
실시예 E - 세르톨리주마브로 치료된 환자를 모니터링하기 위한 방법 및 키트
시험을 혈청 또는 혈장에 대해 실시하였다. TNFα는 용액에서 불안정하므로, 혈액 채취 후 즉시 샘플을 사용하거나 동결하였다. 임의의 비-특이적 결합을 피하기 위해, 6개월 초과 동안 동결되어 있거나 흐려진 샘플은 원심분리 및 여과하였다.
1. TNF α의 투여
단일클론 항-TNFα 항체를 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트(8개 웰의 4개 스트립) 상에 코팅한다.
· 먼저, 희석된 샘플을 항체 코팅 웰에 첨가하고, 이것이 결합되게 둔다. 인큐베이션 후, 비결합된 단백질을 세정에 의해 제거한다.
· 항- TNFα 비오틴화 항체를 첨가한다. 인큐베이션 후, 비결합된 항체를 세정에 의해 제거한다.
· 이후 호스래디쉬 퍼옥시다아제 라벨링 스트렙타비딘을 첨가한다. 스트렙타비딘은 비오틴화 항-TNFα 항체와 형성된 복합체에 결합한다. 인큐베이션 후, 웰을 다시 세정하여 임의의 과량의 공액체를 제거한다.
· 결합된 효소를 기질 TMB(3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘)의 첨가에 의해 노출시킨다. 색상 강도는 TNFα의 양에 비례한다.
· H2SO4(0.25M)의 첨가로 효소 반응을 중지시킨다.
· H2SO4(0.25M)에 의해 반응을 중지시킨 후, 450nm에서 분광측정기에 의해 광학 밀도를 판독한다.
교정 범위는 pg/mL로 표현된 각각의 환자 샘플의 TNFα의 양을 정의할 수 있게 한다.
2. 세르톨리주마브의 투여
TNFα를 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트(8개 웰의 4개 스트립) 상에 코팅한다.
· 먼저, 희석된 샘플을 항체 코팅 웰에 첨가하고, 이것이 결합되게 둔다. 인큐베이션 후, 비결합된 단백질을 세정에 의해 제거한다.
· 비오틴화 항-PEG 항체를 첨가한다. 인큐베이션 후, 비결합된 항체를 세정에 의해 제거한다.
· 이후 호스래디쉬 퍼옥시다아제 라벨링 스트렙타비딘을 첨가한다. 스트렙타비딘은 비오틴화 항-PEG 항체와 형성된 복합체에 결합한다. 인큐베이션 후, 웰을 다시 세정하여 임의의 과량의 공액체를 제거한다.
· 결합된 효소를 기질 TMB(3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘)의 첨가에 의해 노출시킨다. 색상 강도는 인플릭시마브의 양에 비례한다.
· H2SO4(0.25M)의 첨가로 효소 반응을 중지시킨다.
· H2SO4(0.25M)에 의해 반응을 중지시킨 후, 450nm에서 분광측정기에 의해 광학 밀도를 판독한다.
교정 범위는 μg/mL로 표현된 각각의 환자 샘플의 세르톨리주마브의 양을 정의할 수 있게 한다.
3. 항- 세르톨리주마브의 투여
세르톨리주마브를 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트(8개 웰의 4개 스트립) 상에 코팅한다.
· 먼저, 희석된 샘플을 항체 코팅 웰에 첨가하고, 이것이 결합되게 둔다. 인큐베이션 후, 비결합된 단백질을 세정에 의해 제거한다.
· 비오틴화 세르톨리주마브를 첨가한다. 인큐베이션 후, 비결합된 항체를 세정에 의해 제거한다.
· 이후 호스래디쉬 퍼옥시다아제 라벨링 스트렙타비딘을 첨가한다. 스트렙타비딘은 비오틴화 세르톨리주마브와 형성된 복합체에 결합한다. 인큐베이션 후, 웰을 다시 세정하여 임의의 과량의 공액체를 제거한다.
· 결합된 효소를 기질 TMB(3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘)의 첨가에 의해 노출시킨다. 색상 강도는 항-인플릭시마브 항체의 양에 비례한다.
· H2SO4(0.25M)의 첨가로 효소 반응을 중지시킨다.
· H2SO4(0.25M)에 의해 반응을 중지시킨 후, 450nm에서 분광측정기에 의해 광학 밀도를 판독한다.
교정 범위는 ng/mL로 표현된 각각의 환자 샘플의 항-세르톨리주마브 항체의 양을 정의할 수 있게 한다.
4. 항- 세르톨리주마브의 투여(대안)
세르톨리주마브를 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트(8개 웰의 4개 스트립) 상에 코팅한다.
· 먼저, 희석된 샘플을 항체 코팅 웰에 첨가하고, 이것이 결합되게 둔다. 인큐베이션 후, 비결합된 단백질을 세정에 의해 제거한다.
· 비오틴화 항-인간 IgG 및 비오틴화 항-인간 IgM을 첨가한다. 인큐베이션 후, 비결합된 항체를 세정에 의해 제거한다.
· 이후 호스래디쉬 퍼옥시다아제 라벨링 스트렙타비딘을 첨가한다. 스트렙타비딘은 비오틴화 항-인간 IgG 및 항-인간 IgM과 형성된 복합체에 결합한다. 인큐베이션 후, 웰을 다시 세정하여 임의의 과량의 공액체를 제거한다.
· 결합된 효소를 기질 TMB(3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘)의 첨가에 의해 노출시킨다. 색상 강도는 항-인플릭시마브 항체의 양에 비례한다.
· H2SO4(0.25M)의 첨가로 효소 반응을 중지시킨다.
· H2SO4(0.25M)에 의해 반응을 중지시킨 후, 450nm에서 분광측정기에 의해 광학 밀도를 판독한다.
교정 범위는 ng/mL로 표현된 각각의 환자 샘플의 항-세르톨리주마브 항체의 양을 정의할 수 있게 한다.
실시예 F - 골리무마브로 치료된 환자를 모니터링하기 위한 방법 및 키트
시험을 혈청 또는 혈장에 대해 실시하였다. TNFα는 용액에서 불안정하므로, 혈액 채취 후 즉시 샘플을 사용하거나 동결하였다. 임의의 비-특이적 결합을 피하기 위해, 6개월 초과 동안 동결되어 있거나 흐려진 샘플은 원심분리 및 여과하였다.
1. TNF α의 투여
단일클론 항-TNFα 항체를 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트(8개 웰의 4개 스트립) 상에 코팅한다.
· 먼저, 희석된 샘플을 항체 코팅 웰에 첨가하고, 이것이 결합되게 둔다. 인큐베이션 후, 비결합된 단백질을 세정에 의해 제거한다.
· 항- TNFα 비오틴화 항체를 첨가한다. 인큐베이션 후, 비결합된 항체를 세정에 의해 제거한다.
· 이후 호스래디쉬 퍼옥시다아제 라벨링 스트렙타비딘을 첨가한다. 스트렙타비딘은 비오틴화 항-TNFα 항체와 형성된 복합체에 결합한다. 인큐베이션 후, 웰을 다시 세정하여 임의의 과량의 공액체를 제거한다.
· 결합된 효소를 기질 TMB(3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘)의 첨가에 의해 노출시킨다. 색상 강도는 TNFα의 양에 비례한다.
· H2SO4(0.25M)의 첨가로 효소 반응을 중지시킨다.
· H2SO4(0.25M)에 의해 반응을 중지시킨 후, 450nm에서 분광측정기에 의해 광학 밀도를 판독한다.
교정 범위는 pg/mL로 표현된 각각의 환자 샘플의 TNFα의 양을 정의할 수 있게 한다.
2. 골리무마브의 투여
TNFα를 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트(8개 웰의 4개 스트립) 상에 코팅한다.
· 먼저, 희석된 샘플을 항체 코팅 웰에 첨가하고, 이것이 결합되게 둔다. 인큐베이션 후, 비결합된 단백질을 세정에 의해 제거한다.
· 항-인간 IgG 비오틴화 항체를 첨가한다. 인큐베이션 후, 비결합된 항체를 세정에 의해 제거한다.
· 이후 호스래디쉬 퍼옥시다아제 라벨링 스트렙타비딘을 첨가한다. 스트렙타비딘은 비오틴화 항-IgG 항체와 형성된 복합체와 결합한다. 인큐베이션 후, 웰을 다시 세정하여 임의의 과량의 공액체를 제거한다.
· 결합된 효소를 기질 TMB(3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘)의 첨가에 의해 노출시킨다. 색상 강도는 인플릭시마브의 양에 비례한다.
· H2SO4(0.25M)의 첨가로 효소 반응을 중지시킨다.
· H2SO4(0.25M)에 의해 반응을 중지시킨 후, 450nm에서 분광측정기에 의해 광학 밀도를 판독한다.
교정 범위는 μg/mL로 표현된 각각의 환자 샘플의 골리무마브의 양을 정의할 수 있게 한다.
3. 항- 골리무마브의 투여
인플릭시마브를 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트(8개 웰의 4개 스트립) 상에 코팅한다.
· 먼저, 희석된 샘플을 항체 코팅 웰에 첨가하고, 이것이 결합되게 둔다. 인큐베이션 후, 비결합된 단백질을 세정에 의해 제거한다.
· 비오틴화 골리무마브를 첨가한다. 인큐베이션 후, 비결합된 항체를 세정에 의해 제거한다.
· 이후 호스래디쉬 퍼옥시다아제 라벨링 스트렙타비딘을 첨가한다. 스트렙타비딘은 비오틴화 골리무마브와 형성된 복합체에 결합한다. 인큐베이션 후, 웰을 다시 세정하여 임의의 과량의 공액체를 제거한다.
· 결합된 효소를 기질 TMB(3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘)의 첨가에 의해 노출시킨다. 색상 강도는 항-인플릭시마브 항체의 양에 비례한다.
· H2SO4(0.25M)의 첨가로 효소 반응을 중지시킨다.
· H2SO4(0.25M)에 의해 반응을 중지시킨 후, 450nm에서 분광측정기에 의해 광학 밀도를 판독한다.
교정 범위는 ng/mL로 표현된 각각의 환자 샘플의 항-골리무마브 항체의 양을 정의할 수 있게 한다.
실시예 G: TNF 알파의 생물학적 활성
TNF 활성을 L929 세포독성 검정을 사용하여 평가하였다(Bloquel C. et al . (2004) Hum Gene Ther . 15:189-201). TNF 혈청 샘플의 연속 희석물을 L929 세포와 인큐베이션하고 생존 세포의 수를 MTT 염색 검정에 의해 측정하였다.
결과는 치료된 환자로부터의 TNF알파는 비활성인, 즉, L929 세포의 상당한 용리를 야기하지 않는다는 것을 보여준다.
실시예 H - 300명 초과의 인간 환자의 코호트에 대한 방법 입증
시험을 혈청 또는 혈장에 대해 실시하였다. TNFα는 용액에서 불안정하므로, 혈액 채취 후 즉시 샘플을 사용하거나 동결하였다. 임의의 비-특이적 결합을 피하기 위해, 6개월 초과 동안 동결되어 있거나 흐려진 샘플은 원심분리 및 여과하였다. 각각의 환자에 대해, 치료 동안 상이한 시점에서 검출을 실시하였다.
1. TNF α의 투여
단일클론 항-TNFα 항체를 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트(8개 웰의 4개 스트립) 상에 코팅한다.
· 먼저, 희석된 샘플을 항체 코팅 웰에 첨가하고, 이것이 결합되게 둔다. 인큐베이션 후, 비결합된 단백질을 세정에 의해 제거한다.
· 항- TNFα 비오틴화 항체를 첨가한다. 인큐베이션 후, 비결합된 항체를 세정에 의해 제거한다.
· 이후 호스래디쉬 퍼옥시다아제 라벨링 스트렙타비딘을 첨가한다. 스트렙타비딘은 비오틴화 항-TNFα 항체와 형성된 복합체에 결합한다. 인큐베이션 후, 웰을 다시 세정하여 임의의 과량의 공액체를 제거한다.
· 결합된 효소를 기질 TMB(3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘)의 첨가에 의해 노출시킨다. 색상 강도는 TNFα의 양에 비례한다.
· H2SO4(0.25M)의 첨가로 효소 반응을 중지시킨다.
· H2SO4(0.25M)에 의해 반응을 중지시킨 후, 450nm에서 분광측정기에 의해 광학 밀도를 판독한다.
교정 범위는 pg/mL로 표현된 각각의 환자 샘플의 TNFα의 양을 정의할 수 있게 한다.
2. 인플릭시마브의 투여
TNFα를 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트(8개 웰의 4개 스트립) 상에 코팅한다.
· 먼저, 희석된 샘플을 항체 코팅 웰에 첨가하고, 이것이 결합되게 둔다. 인큐베이션 후, 비결합된 단백질을 세정에 의해 제거한다.
· 항-인간 IgG 비오틴화 항체를 첨가한다. 인큐베이션 후, 비결합된 항체를 세정에 의해 제거한다.
· 이후 호스래디쉬 퍼옥시다아제 라벨링 스트렙타비딘을 첨가한다. 스트렙타비딘은 비오틴화 항-IgG 항체와 형성된 복합체와 결합한다. 인큐베이션 후, 웰을 다시 세정하여 임의의 과량의 공액체를 제거한다.
· 결합된 효소를 기질 TMB(3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘)의 첨가에 의해 노출시킨다. 색상 강도는 인플릭시마브의 양에 비례한다.
· H2SO4(0.25M)의 첨가로 효소 반응을 중지시킨다.
· H2SO4(0.25M)에 의해 반응을 중지시킨 후, 450nm에서 분광측정기에 의해 광학 밀도를 판독한다.
교정 범위는 μg/mL로 표현된 각각의 환자 샘플의 인플릭시마브의 양을 정의할 수 있게 한다.
3. 항-인플릭시마브의 투여
인플릭시마브를 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트(8개 웰의 4개 스트립) 상에 코팅한다.
· 먼저, 희석된 샘플을 항체 코팅 웰에 첨가하고, 이것이 결합되게 둔다. 인큐베이션 후, 비결합된 단백질을 세정에 의해 제거한다.
· 비오틴화 인플릭시마브를 첨가한다. 인큐베이션 후, 비결합된 항체를 세정에 의해 제거한다.
· 이후 호스래디쉬 퍼옥시다아제 라벨링 스트렙타비딘을 첨가한다. 스트렙타비딘은 비오틴화 인플릭시마브와 형성된 복합체에 결합한다. 인큐베이션 후, 웰을 다시 세정하여 임의의 과량의 공액체를 제거한다.
· 결합된 효소를 기질 TMB(3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘)의 첨가에 의해 노출시킨다. 색상 강도는 항-인플릭시마브 항체의 양에 비례한다.
· H2SO4(0.25M)의 첨가로 효소 반응을 중지시킨다.
· H2SO4(0.25M)에 의해 반응을 중지시킨 후, 450nm에서 분광측정기에 의해 광학 밀도를 판독한다.
교정 범위는 ng/mL로 표현된 각각의 환자 샘플의 항-인플릭시마브 항체의 양을 정의할 수 있게 한다.
4. 부가적인 파라미터
- [CRP] : CRP 농도, mg/L로 표현됨
- ESR : 적혈구 침강 속도, mm/h로 표현됨
- 약량학 : 약량학이 정상인 경우, 또는 약량학이 정상 약량학보다 높은 경우 알려짐.
- 연령, 성별, 체중.
5. 점수 인자 :
{TNF} : 측정된 TNF의 농도에 따른 TNF의 점수 인자. 예를 들어:
10pg/ml 미만의 측정된 샘플에 대한 점수 인자: 1
10 내지 100pg/ml의 측정된 샘플에 대한 점수 인자: 4
100pg/ml 초과의 측정된 샘플에 대한 점수 인자: 10.
{항-TNF} : 측정된 항-TNF의 농도에 따른 항-TNF의 점수 인자.
정상(normal) 약량학을 가진 환자의 경우 :
0.1μg/ml 미만의 측정된 샘플에 대한 점수 인자: 10
0.1 내지 0.5μg/ml의 측정된 샘플에 대한 점수 인자: 6
0.5 내지 1.8μg/ml의 측정된 샘플에 대한 점수 인자: 4
1.8μg/ml 초과의 측정된 샘플에 대한 점수 인자: 1
증가된(augmented) 약량학을 가진 환자의 경우 :
0.1μg/ml 미만의 측정된 샘플에 대한 점수 인자: 12.5
0.1 내지 0.5μg/ml의 측정된 샘플에 대한 점수 인자: 10
0.5 내지 1.8μg/ml의 측정된 샘플에 대한 점수 인자: 7.5
1.8μg/ml 초과의 측정된 샘플에 대한 점수 인자: 1.25
{ADA} : 측정된 ADA의 농도에 따른 ADA의 점수 인자.
10ng/ml 미만의 측정된 샘플에 대한 점수 인자: 1
10 내지 200ng/ml의 측정된 샘플에 대한 점수 인자: 5
200ng/ml 초과의 측정된 샘플에 대한 점수 인자: 10
{CRP}: 임상 데이터 세트에 의해 제공되는 C-반응성 단백질의 농도에 따른 CRP의 점수 인자.
6mg/L 미만의 측정된 샘플에 대한 점수 인자: 1
6 내지 50mg/L의 측정된 샘플에 대한 점수 인자: 4
50mg/L 초과의 측정된 샘플에 대한 점수 인자: 10
{ESR} : 임상 데이터 세트에 의해 제공되는 적혈구 침강 속도에 따른 ESR의 점수 인자. 침강 속도는 "연령 및 성별" 의존성임).
15mm/h 미만의 측정된 샘플에 대한 점수 인자: 1
15 내지 20mm/h의 측정된 샘플에 대한 점수 인자: 4
20mm/h 초과의 측정된 샘플에 대한 점수 인자: 10
6. 가중치
각각의 파라미터로부터의 모든 점수 인자를 치료에 대한 상기 파라미터의 영향에 따라 가중 인자(Wn)와 연관시킨다.
예를 들어:
TNF의 가중 인자: 15%
항-TNF의 가중 인자: 30%
ADA의 가중 인자: 35%
CRP의 가중 인자: 10%
CRP의 가중 인자: 10%
7. 결과 :
7.1. 인플릭시마브로 치료된 류마티스 관절염 환자의 분석
치료 과정 동안 상이한 시간에 인플릭시마브로 치료된 류마티스 관절염 환자로부터의 혈청 샘플을 시험하였다. 하기 표 A에서의 도면은 각각의 환자에 대해 하기를 제시한다:
- TNF, 항-TNF(인플릭시마브), 및 ADA(항-인플릭시마브)의 측정된 수준.
- 임상 데이터 세트 : CRP, ESR 및 약량학으로부터의 정보,
- 각각의 파라미터에 대한 점수 인자
- 각각의 파라미터에 대한 가중 인자.
- 모니터링 점수 결과
- 전 임상 데이터 세트에 따른 치료에 대한 환자 반응: 반응(R), 무반응 또는 불완전 반응(NR), 치료 시작(T0).
각각의 환자에 대한 연속 결과는 치료 동안 상이한 지점에서의 측정값을 나타낸다.
표 A
Figure pct00007
Figure pct00008
상기 표 A에 제시된 결과는 (i) 낮은 또는 검출불가능한 TNF알파, (ii) 검출가능 항-TNF 수준, 및 (iii) 본질적으로 낮은 또는 없는 ADA 수준을 조합한 환자가 치료에 대해 반응성이라는 것을 보여준다. 상기 점수 및 가중 인자를 사용하여, 3 미만의 점수를 갖는 환자는 반응자로서 분류될 수 있다. 이러한 환자의 경우, 치료가 지속될 수 있다(용량은 조절될 수 있을지라도).
5 초과의 점수 값을 갖는 모든 환자는 "이탈자", 즉, 항-TNF 치료가 효과적이나 비-반응자가 되는 환자로서 분류된다. 상기 환자에서, 치료는 관절의 비가역적인 퇴행을 피하기 위해 빠르게 전환되어야만 한다.
3 내지 5 사이의 환자는 주의 깊게 모니터링해야만 한다. 상기 환자는 점진적으로 비-반응자가 된다. 치료는 조정되어야만 하고(예를 들어, 용량 또는 투여 적기), 가능한 전환은 진행에 따라 고려되어야만 한다.
3 미만의 점수를 가진 1명의 환자만(환자 #89) 비-반응자였다. 사실상, 상기 환자는 일차적 비-반응자이다, 즉, 항-TNF 치료가 전혀 효과가 없었던 환자이다. 이러한 환자는 본 발명을 사용하여 쉽게 환인될 수 있다: 이들은 반응자와 비슷한 점수를 가지지만, 아픈 환자의 모든 임상적 징후를 갖는다. 이들의 치료는 변경되어야만 한다.
7.2. 인플릭시마브로 치료된 염증 질환 환자의 분석
염증 질환(강직성 척추염, 크론 질환, 건선 등)으로부터의 혈청 샘플을 시험하였다. 환자를 인플릭시마브로 치료하였다. 샘플을 치료 과정 동안 상이한 시간에 분석하였다. 하기 표 B에서의 도면은 각각의 환자에 대해 하기를 제시한다:
- TNF, 항-TNF(인플릭시마브), 및 ADA(항-인플릭시마브)의 측정된 수준.
- 임상 데이터 세트 : CRP, ESR 및 약량학으로부터의 정보,
- 각각의 파라미터에 대한 점수 인자
- 각각의 파라미터에 대한 가중 인자.
- 모니터링 점수 결과
- 전 임상 데이터 세트에 따른 치료에 대한 환자 반응: 반응(R), 무반응 또는 불완전 반응(NR), 치료 시작(T0).
각각의 환자에 대한 연속 결과는 치료 동안 상이한 지점에서의 측정값을 나타낸다.
표 B
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
상기 표 B에 제시된 결과는 (i) 낮은 또는 검출불가능한 TNF알파, (ii) 검출가능 항-TNF 수준, 및 (iii) 본질적으로 낮은 또는 없는 ADA 수준을 조합한 환자가 치료에 대해 반응성이라는 것을 보여준다. 상기 점수 및 가중 인자를 사용하여, 3 미만의 점수를 갖는 환자는 반응자로서 분류될 수 있다. 결과는 하기 표에 요약된다.
Figure pct00014
* 환자 24, 32, 40 및 80 을 참조. 이러한 일차 비-반응자의 경우, TNF는 질환 활성에서 미미한 병원성 역할을 한다는 것으로 추측된다.
결과는 반응자 및 비-반응자가 구별될 수 있음을 보여준다. 결과는 추가로, 환자의 반응자에서 비-반응자 상태로의 진행이 예상될 수 있으므로, 상당히 개선된 치료 섭생의 실행을 가능하게 한다는 것을 보여준다.

Claims (16)

  1. 하기 단계를 포함하는 샘플 내 항-약물 항체(Anti-Drug Antibody: ADA)의 면역-검출 방법으로서,
    상기 약물은 표적 항원에 대항하는 치료적 항체인 방법:
    a) 샘플 내 상기 항원의 존재를 입증하는 단계;
    b) 샘플 내 상기 항원이 존재하는 경우, 항원을 중화시키는 단계; 및
    c) 상기 샘플 내 항-약물 항체의 존재 또는 양을 면역-검출하는 단계.
  2. 치료적 항체 치료에 대한 환자의 반응성의 검출 방법으로서,
    환자로부터의 샘플에서 하기의 존재 또는 양을 측정하여 환자 프로파일을 획득하는 단계를 포함하고, 상기 치료적 항체는 표적 항원에 대항하는 것이고, 상기 환자 프로파일은 상기 치료에 대한 반응성을 나타내는 것인 방법:
    - 치료적 항체,
    - 항원, 및
    - 상기 치료적 항체에 대항하는 항-약물 항체.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 측정은 면역검정, 바람직하게는 ELISA 또는 면역-포획에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원은 TNFα인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 약물은 인플릭시마브, 에타네르셉트, 아달리무마브, 골리무마브 및 세르톨리주마브 페골로부터 선택된 항-TNFα 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 환자는 자가면역 또는 염증성 질환을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 환자로부터의 샘플에서 C-반응성 단백질(C-reactive protein: CRP) 또는 적혈구 침강 속도(Erythrocyte sedimentation rate: ESR)의 존재 또는 양을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 환자의 치료를 모니터링 또는 조절하기 위한 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 샘플은 체액 샘플, 바람직하게는 혈액 혈청 또는 혈장 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    환자로부터의 샘플에서 하기의 존재 또는 양을 측정하여 환자 프로파일을 획득하는 단계를 포함하고, 상기 환자 프로파일은 환자가 상기 치료에 반응하는지 여부를 나타내어, 치료의 조정을 가능하게 하는, 항-TNA알파 치료를 받는 환자를 모니터링하기 위한 방법:
    - 치료적 항체,
    - 항원, 및
    - 상기 치료적 항체에 대항하는 항-약물 항체.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 TNF알파 수준이 10pg/ml 미만이고, 상기 치료적 항체 수준이 1μg/ml 초과이고, 상기 항-약물 항체 수준이 50 ng/ml 미만인 경우, 상기 환자는 반응성이고 상기 치료는 지속되거나 또는 감소되어야 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    비활성 TNF알파의 수준이 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 비활성 TNF알파의 수준이 10pg/ml 초과인 경우, 상기 환자는 상기 치료에 대해 비-반응성인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 치료적 항체 치료에 대한 환자의 반응성의 검출 방법으로서,
    환자로부터의 샘플에서 비활성 TNF알파의 존재 또는 양을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 치료적 항체는 TNF알파에 대항하는 것이고, 상기 존재 또는 양은 상기 치료에 대한 환자의 낮은 반응성 또는 감소하는 반응성의 지표인 방법.
  15. 항-TNF알파 치료를 받는 환자의 모니터링 방법으로서,
    환자로부터의 샘플에서 비활성 TNF알파의 존재 또는 양을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 존재 또는 양은 상기 치료에 대한 환자의 반응성의 지표인 방법.
  16. 샘플에서 하기의 존재 또는 양을 검출하기 위한 시약을 포함하는 키트:
    - 표적 항원에 대항하는 치료적 항체,
    - 항원, 및
    - 상기 치료적 항체에 대항하는 항-약물 항체.
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